DE69908509T2

DE69908509T2 - Antibakterielle Peptide und diese als wirksamen Bestandteil enthaltende antibakterielle Mittel

Info

Publication number: DE69908509T2
Application number: DE1999608509
Authority: DE
Inventors: Minoru Tsukuba-shi Yamakawa; Jun Tsukuba-shi Ishibashi; Hisako Ushiku-shi Sakanaka
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: JP3273314B2; EP0979831B1; DE69908509D1; EP0979831A2; JP2000063400A; EP0979831A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antibakterielle Peptide und antibakterielle Agenzien, die solche Peptide als einen wirksamen Bestandteil beinhalten.
Der Vorsatz, unsere Lebensumgebung sauber und behaglich zu halten, ist durch die aufsehenerregende Verbreitung pathogener Escherichia coli 0-157 etc. verstärkt worden. Auf der anderen Seite haben sich Medikamenten-resistente Mikroben wie z. B. MRSA als eine Folge der exzessiven Verwendung von Antibiotika entwickelt, was einen Schatten des Unbehagens wirft.
Verschiedene Arten antibakterieller Agenzien, einschließlich Antibiotika, sind zur Verfügung gestellt worden und wurden nicht nur für medizinische Zwecke verwendet, sondern als eine Auswahl sogenannter antibakterieller Artikel.
Antibakterielle Peptide sind im Zusammenhang mit der Entwicklung antibakterieller Agenzien bekannt geworden.
Die oben erwähnten Peptide sind im Samen oder Blutserum von Säugetieren vorhanden und werden aufgrund eines breiteren antibakteriellen Spektrums und einer hohen Sicherheit, ebenso wie eines unregelmäßigen Erscheinens Medikamenten-resistenter Mikroben bei ihrer Verwendung, als eine der am meisten beachtenswerten antibakteriellen Bestandteile betrachtet.
Das Vorhandensein eines antibakteriellen Peptids, das aus der Körperflüssigkeit von Insekten stammte, war als eines solcher Peptide bekannt. Des weiteren war bekannt, daß verschiedene Arten antibakterieller Peptide in Körperflüssigkeiten von Insekten auftreten, wenn Insekten mit Bakterien oder unterschiedlichen Blukörperchen inokuliert werden oder eine Körperoberfläche durch Verwundung etc. stimuliert wird.
Es wurde zum Beispiel ein antibakteriell aktives Peptid identifiziert, das aus der Körperflüssigkeit einer Larve des Zophobas astratus, einem Insekt der Tenebriodinae (siehe J. Biol. Chem., Ausgabe 266, S. 24.524 bis 24.525, 1991) stammt.
Des weiteren wurden physikalische und chemische Eigenschaften eines antibakteriellen Peptids mit dem Namen Coleoptericin untersucht.
Auf der anderen Seite ist ein antibakterielles Peptid der Cecropin-Gruppe, welches aus der Körperflüssigkeit der Larve von Hyalophora cecropia, einem Insekt der Lepidoptera, stammt, selbst und die physikalischen und chemischen Eigenschaften desselben gefunden und untersucht worden.
Antibakterielle Peptide, die aus diesen Insekten stammen, haben ein breites antibakterielles Spektrum und werden dementsprechend so eingeschätzt, daß sie eine wichtige Beziehung zur biologischen Verteidigung solcher Insekten aufweisen, welchen die Bildungsfähigkeit von Antikörpern fehlt.
Eines der Probleme im Zusammenhang mit diesen antibakteriellen Peptiden umfaßt die Antigenität. Jedes der antibakteriellen Peptide hat ein nicht so geringes Molekulargewicht und kann im Körper als Antigen wirken, wenn es vaskulär als ein antibaktrielles Agens verabreicht wird.
Aufgrund des breiten aber etwas unausgewogenen antibakteriellen Spektrums werden nicht notwendigerweise antibakterielle Peptide zur Verfügung gestellt, die sowohl gegen Grampositive als auch Gram-negative Bakterien ausreichend wirksam sind.
Weiterhin gibt es keine abstreitbare mögliche Entwicklung einer gewissen Cytotoxizität, wenn diese antibakteriellen Peptide aus Insekten an Säugetiere verabreicht werden.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine antibakterielle Maßnahme durch die Verwendung antibakterieller Peptide zur Verfügung zu stellen, die die herkömmlichen, oben beschriebenen Probleme überwindet.
Um die herkömmlichen Probleme zu lösen, wurden die Struktur und die Funktionen eines antibakteriellen Peptids, das aus Insekten von Lepidoptera stammt, wie z. B. Scarabaeidae, Tenebriodae, etc., insbesondere Oryctes rhinoceros, das ein Insekt der Eophileurus chinensis der Scarabaeidae ist, als ein aus Insekten stammendes Peptid durch den vorliegenden Erfinder untersucht.
Es ist bekannt, daß ein antibakterielles Peptid in der Körperflüssigkeit der Larve von Oryctes rhinoceros induzieri wird, wenn sie durch z. B. Verwundung stimulieri wird. Unter Verwendung von cDNA der Larve des Oryctes rhinoceros ist die Nukleotidsequenz, die für ein antibakterielles Peptid (im folgenden als ein natürliches antibakterielles Peptid-Gen bezeichnet) kodieri, identifiziert worden.
Dann wurde die Aminosäuresequenz eines antibakteriellen Peptids, abgeleitet von Oryctes rhinoceros (im folgenden als ein natürliches antibakterielles Peptid bezeichnet, soweit nicht anderweitig angegeben) mit Hilfe der Nukleotidsequenz ermittelt und somit identifiziert. Die Entwicklung neuer antibakterieller Peptide wurde auf Grundlage der Information von solch einer Aminosäuresequenz durchgeführt.
[1] Die Identifizierung der Nukleotidsequenz von cDNA des natürlichen antibakteriellen Peptids
Die Nukleotidsequenz der natürlichen antibakteriellen Peptid-cDNA wurde mit Hilfe eines herkömmlichen bekannten Verfahrens identifizieri, wie im folgenden beschrieben.

(1) Das natürliche antibakterielle Peptid wurde aus der Larve des Oryctes rhinoceros extrahiert und gereinigt, um die N-terminale Aminosäuresequenz desselben zu bestimmen. Basierend auf der Aminosäuresequenz wurde ein degenerierter Primer synthetisiert. Zusätzlich wurde ein weiterer degenerierter Primer synthetisieri, der auf der konservierten Aminosäuresequenz der C-terminalen Region der zur Verteidigung bestimmten antibakteriellen Peptidfamilie der Insekten basiert.
(2) Die Verwendung dieser Oligonukleotide als Primer, ein Teil, der die cDNA des antibakteriellen Peptids kodieren würde, wurde der Manipulation durch Gen-Amplifikation (PCR-Verfahren) unterworfen.
(3) Die Nukleotidsequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt.

Um den N-Terminus des natürlichen antibakteriellen Peptids in dem oben erwähnten Verfahren (1) zu identifizieren, wurde die Trennung und Reinigung des natürlichen antibakteriellen Peptids aus der Larve des Orcytes rhinoceros wie im folgenden dargestellt durchgeführt.
Zehn Larven des Oryctes rhinoceros im dritten Larvenstadium wurden für mehrere Minuten auf Eis gelegt, um ihre Bewegungen zu verlangsamen, und sie wurden durch Einstechen mit einer Injektionsnadel verwundet. Die so verwundeten Larven wurden für 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 25°C mit Blattschimmel in einer Zuchtbox gehalten.
Nach dem Abschneiden der Beine der verwundeten Larven von Oryctes rhinoceros wurden Tropfen ihrer Körperflüssigkeit herausgedrückt und in einem Gefäß auf Eis durch Pressen des Abdomens derselben gesammelt. Als Ergebnis wurden ungefähr 1,5 ml der Körperflüssigkeit von jeder Larve erhalten.
Nachdem die oben erwähnte Körperflüssigkeit einer zentrifugalen Trennung (39.000 × g) für 50 Minuten unterworfen worden war, wurde ein Blutkörperchen-Bestandteil entfernt und der so erhaltene Überstand bei einer Temperatur von 20°C aufbewahrt. Dann wurden 15 ml des Überstandes auf eine Sep-Pak C18-Cartridge (zu beziehen von Waters Associates Co., Ltd.) aufgebracht, die mit einem Lösungsmittel A, enthaltend 20% Acetonitril, äquilibriert worden war, gefolgt vom Waschen der Säule mit dem Lösungsmittel A, um eine antibakteriell aktive Substanz (aktive Fraktion) mit einer 20%-Acetonitrl/0,05%-Trifluoressigsäure-Lösung zu eluieren.
Die aktive Fraktion wurde gefriergetrocknet, um Acetonitril zu entfernen und ein trockenes Pulver zu bilden, das in einer 0,05%-Trifluoressigsäure-Lösung gelöst wurde, um sie auf eine Resowce RPC-Säule (1 ml; zu beziehen von Pharmacia Co., Ltd.) aufzubringen, die zuvor mit einer 0,05%-Heptafluorbuttersäure (HFBA)-Lösung äquilibriert worden war.
Die Säule wurde mit der 5%-HFBA-Lösung gewaschen, gefolgt von einer Gradienten-Elution unter der Bedingung von 0% bis 20%-Acetonitril/0,05%-Trifluoessigsäure-Lösung für 1,25 Minuten; ebenso eine 20% bis 40%-Lösung für 10 Minuten und eine 40% bis 100%-Lösung für 1,25 Minuten. Es wurde beobachtet, daß eine 38 bis 40%-Acetonitril-Fraktion antibakteriell aktiv ist.
Die antibakterielle Aktivität wurde wie im folgenden beschrieben beobachtet.
Zu 0,99 ml eines Bouillon-Mediums, hergestellt durch Lösen von 1 g Rinderextrakt (zu beziehen von Difco Co., Ltd.), 2 g Bacto-Pepton (zu beziehen von Difco Co., Ltd.) und 1 g NaCl in 200 ml Wasser, wurden 10 μl Bakteriensuspension, hergestellt durch Kultivieren von Staphylococcus aureus in Bouillon-Medium über Nacht, hinzugegeben und bis zur logarithmischen Vervielfältigungsphase kultiviert.
Zu Bouillon-Agar-Medium, hergestellt durch Hinzufügen von 1,5 Gew.-% Agar zum Bouillon-Medium, wurden 200 μl der so erhaltenen Kulturlösung hinzugegeben und in eine Laborschale gegossen, um zu gelieren. Dann wurde ein Well von 2 mm im Durchmesser auf dem gelierten Bouillon-Agar-Medium mit Hilfe eines Gelstanzers (zu beziehen von Pharmacia Co., Ltd.) gebildet. 5 μl der 38 bis 40%-Acetonitril-Fraktion (Probe), gelöst in Wasser, wurden in das Well gegeben und über Nacht bei einer Temperatur von 37°C kultiviert, um ein darauf gebildetes Loch zu beobachten.
Ein wie oben beschriebenes Verfahren wurde in gleicher Weise wiederholt.
Die aktive Fraktion wurde weiterhin gefriergetrocknet, um Acetonitril zu entfernen und ein trockenes Pulver zu bilden, was in dem Lösungsmittel A gelöst wurde, um auf eine Säule (3,2 × 30 mm, μ RPC C2/C18 PC3,2/3-Säule, zu beziehen von Pharmacia Co., Ltd.) aufgebracht zu werden. Nachdem die Säule mit dem Lösungsmittel A gewaschen worden war, wurde die Elution unter milden Gradienten-Bedingungen von 20% bis 40%-Acetonitril/0,5%-Trifluoressigsäure für 40 Minuten durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß eine 23 bis 24%-Acetronitril-Fraktion antibakteriell aktiv ist.
Die somit erhaltene Fraktion eines natürlichen antibakteriellen Peptids wurde auf eine Reverse Phase Säule aufgebracht (2,1 × 100 mm, μ RPC C2/C18 SC2,1/10, zu beziehen von Pharmacia Co., Ltd.), die mit dem Lösungsmittel A äquilibriert worden war. Die Reverse Phase Säule wurde an das SMART-System (zu beziehen von Pharmacia Co., Ltd.) angeschlossen und mit Hilfe des Lösungsmittels A gewaschen, gefolgt von der Elution unter einer milden Gradienten-Bedingung 0% bis 20%-Acetonitril/0,05%-Trifluoressigsäure für 5 Minuten; 20% bis 40% für 40 Minuten und 40% bis 100% für 5 Minuten.
Das so erhaltene Eluent wurde in jeweils 200 μl-Fraktionen fraktioniert, welche dann gefriergetrocknet wurden, um die antibakterielle Aktivität einer nach der anderen festzustellen. Die antibakterielle Aktivität wurde als ein einzelner Peak eluiert, vergleichbar mit dem des Proteins, wie in 1 gezeigt. Die Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) der antibakteriellaktiven Fraktion zeigte ein einzelnes Molekulargewicht von 4.489 (M + Na), wie in 2 gezeigt.
Die so erhaltene Fraktion, welche als das natürliche antibakterielle Peptid erachtet wurde, wurde einem Edman-Abbau unterworfen, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Es wurde herausgefunden, daß die Sequenz der 15 PTH-Aminosäurereste (Sequenz Nr. 1), die einem N-Terminus des natürlichen antibakteriellen Peptids entsprechen würde, wie im folgenden dargestellt ist:
Die antibakterielle Aktivität des vorliegenden, natürlichen antibakteriellen Peptids wurde bestimmt, indem die Menge an Protein von 0 bis 0,8 in 50 μl der Testlösung geändert wurde. Das Ergebnis ist in 3 dargestellt, durch das sichergestellt ist, daß die antibakterielle Aktivität des Peptids deutlich gegen Staphylococcus aureus wirksam ist. Des weiteren wurde das natürliche antibakterielle Peptid einer Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 100°C für 5 bis 10 Minuten unterzogen, wobei die ursprüngliche antibakterielle Aktivität beibehalten wurde.
Basierend auf der Aminosäuresequenz der N-terminalen Region des natürlichen antibakteriellen Peptids wurde ein degenerierter Oligonukleotid-Primer synthetisiert, gefolgt von dem oben dargestellten Verfahren (I).
Auf der anderen Seite wurde, basierend auf der Aminosäuresequenz der konservierten C-terminalen Region der eng miteinander verwandten antibakteriellen Peptidfamilie, ein anderer degenerierter Primer synthetisiert.
Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung eines Primers, dem eine Not I-Restriktionsenzymschnittstelle hinzugefügt worden war, mit Fettkörper-mRNA von Escheri chia coli-infizierten Larven des dritten Stadiums von Oryctes rhinoceros als eine Matrize, an der die PCR-Gen-Amplifikation unter Verwendung der oben erwähnten PCR-Primer durchgeführt wurde, hergestellt. Als Ergebnis wurde ein amplifiziertes Genprodukt von ungefähr 120 bp Länge erhalten.
Die Nukleotidsequenz des amplifizierten Genprodukts wurde bestimmt, während weiterhin ein Primer entsprechend der Nukleotidsequenz hergestellt wurde und zusammen mit einem Primer, komplementär zu der Restriktionsenzym-Not I-Schnittstelle, die verwendet worden war, um die Erststrang-cDNA zu erzeugen, in die PCR-Amplifikation eingesetzt wurde. Als Ergebnis wurde die Nukleotidsequenz des amplifizierten Genprodukts am 3'-terminalen Ende aufgeklärt.
Des weiteren wurde die Erststrang-cDNA unter Verwendung des Primers hergestellt, der auf der Basensequenz basiert und dadurch mit Hilfe der Fettkörper-mRNA als eine Matrize von Escherichia coli-infizierten Larven des dritten Stadiums von Oryctes rhinoceros identifiziert. Dann wurde eine poly-C-Sequenz am 5'-terminalen Teil der cDNA angehängt, die als eine Matrize für einen Primer, der eine poly-G-Sequenz hat, verwendet wurde. Unter Verwendung des so hergestellen Primers und des oben erwähnten Primers, der entsprechend der identifizierten Nukleotidsequenz hergestellt wurde, als PCR-Primer, wurde die PCR-Amplifikation durchgeführt. Die Nukleotidsequenz des amplifizierten Genprodukts am 5'-Ende wurde bestimmt.
Die so aufgeklärte Nukleotidsequenzinformation wurde eine nach der anderen zusammengesetzt, um die cDNA-Nukleotidsequenz zu bestätigen, die in der Lage ist, das natürliche antibakterielle Peptid, abgeleitet von Oryctes rhinoceros (siehe Sequenz Nr. 2) zu kodieren. Die von dieser Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der Sequenz Nr. 2 dargestellt.
Die DNA mit der Sequenz Nr. 2 wurde in einen kongenen Vektor (pCR 2·1; zu beziehen von Invitrogen Co., Ltd.) integriert, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Der Transformant ist im National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH) als pCROAD (Hinterlegungsnummer FERM P-16,800) hinterlegt worden.
Als ein Ergebnis des Vergleichs der erwarteten Aminosäuresequenz, dargestellt durch die Sequenz Nr. 2 und der des natürlichen antibakteriellen Peptids im N-Terminus der Sequenz Nr. 1, ist bestätigt worden, daß die Aminosäurereste vom ersten Met bis zum 36. Arg ein Signalpeptid der extrazellulären Sekretion und Propeptid sind, während die Reste vom 37. Leu bis zum Arg vor dem letzten Codon das gereifte, natürliche antibakterielle Peptid, das die eigentliche antibakterielle Aktivität zeigt, sind.
Das natürliche antibakterielle Peptid, dessen Aminosäuresequenz wie oben beschrieben bestätigt worden ist, umfaßt 43 Aminosäurereste und zeigt eine hohe antibakterielle Aktivität.
[2] Herstellung eines neuen Peptids
Die Größe des oben erwähnten Peptids umfaßt 43 Aminosäurereste, ist jedoch groß genug, um als ein Immunogen in einem in vivo-Immunsystem zu funktionieren. Natürlich ist es unerwünscht, daß das natürliche antibakterielle Peptid das Immunsystem aktivieren könnte, wenn solch ein Peptid dem Organismus verabreicht wird.
Ferner hat das natürliche antibakterielle Peptid ein antibakterielles Wirkspektrum nur gegen Gram-positive Bakterien, zeigt aber eine geringe Aktivität gegen Gram-negative Bakterien.
Dementsprechend hat der vorliegende Erfinder die Aminosäuresequenz des natürlichen antibakteriellen Peptids im Detail untersucht und herausgefunden, daß die Reste vom 62. Ala bis zum 69. Ala der oben erwähnten Aminosäuresequenz für die antibakterielle Aktivität verantwortlich sind. Es wird somit in Erwägung gezogen, daß die Aktivierung des Wirts-Immunsystems, verursacht durch das natürliche antibakterielle Peptid, reduziert werden kann, wenn ein Teil des aktiven Zentrums hiervon als ein antibakterielles Agens verwendet wird.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß eine Veränderung der Aminosäuresequenz um den Teil des aktiven Zentrums herum zu einer Verbesserung des antibakteriellen Spektrums nicht nur gegenüber Gram-positiven sondern auch Gram-negativen Bakterien führen kann.
Es ist schließlich herausgefunden worden, daß ein bestimmtes Peptid, das eine spezifische Aminosäuresequenz umfaßt, die einen amidierten C-Terminus als einen Kernteil hat, eine hohe antibakterielle Aktivität gegen sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien aufweist, obwohl die molekulare Größe desselben relativ gering ist. Auf Grundlage dieser Information ist die vorliegende Erfindung vervollständigt worden.
Die vorliegende Erfindung stellt antibakterielle Peptide, dargestellt durch die folgende Formel, zur Verfügung: X-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ (I)wobei X ein Peptid ist, bei dem drei oder vier Aminosäurereste über eine Peptidbindung miteinander verbunden sind und Arg-NH₂ bedeutet, daß die Carboxylgruppe des Arg amidiert ist.
Es werden auch antibakterielle Agenzien zur Verfügung gestellt, die das antibakterielle Peptid als einen wirksamen Bestandteil enthalten und insbesondere eßbare antibakterielle Agenzien, die in den Verdauungstrakt aufgenommen werden können.
1 ist ein Reverse Phase Säulenchromatogramm (SMART-System) eines natürlichen antibakteriellen Peptids, das antibakterielle Aktivität des schließlich gereinigten Profils desselben gegen Staphylococcus aureus zeigt.
2 ist ein Massenspektrogramm (MALDI-TOF-MS) eines natürlichen antibakteriellen Peptids.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von steigenden Konzentrationen eines natürlichen antibakteriellen Peptids auf das Wachstum von Staphylococcus aureus zeigt.
Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden bevorzugten Ausführungsform genauer dargestellt.
Antibakterielle Peptide der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Formel dargestellt: X-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ (I) wobei X ein Peptid ist, in dem drei oder vier Aminosäurereste über eine Peptidbindung miteinander verbunden sind und Arg-NH₂ bedeutet, daß die Carboxylgruppe des Arg amidiert ist.
Die vorliegenden antibakteriellen Peptide beinhalten L- und D-optische Isomere.
Ein Teil von „Ala-Ile-Arg-Lys-Arg" ist eine wesentliche Struktur für die antibakteriellen Peptide, um antibakterielle Aktivität zu zeigen oder, mit anderen Worten, die erwünschte Aktivität ist ohne diesen Teil kaum zu erwarten.
Wie oben beschrieben, bedeutet Arg-NH₂, daß die Carboxylgruppe desselben amidiert ist. Solch eine Amidierung ist auch eine notwendige Voraussetzung für die antibakteriellen Peptide der vorliegenden Erfindung, um ausreichend ihre antibakterielle Aktivität zu zeigen. Wenn ein bestimmtes Peptid die Struktur „Ala-Ile-Arg-Lys-Arg" am C-Terminus umfaßt, ist es schwierig, die erwünschte antibakterielle Aktivität zu erhalten.
Wie oben beschrieben, stellt X Peptide dar, in denen drei oder vier Aminosäurereste über eine Peptidbindung miteinander verbunden sind und ist nicht auf ein spezifisches Peptid beschränkt, es sei denn, die vorliegenden antibakteriellen Peptide zeigen keine Aktivität. Die Anzahl der Aminosäurereste, die in X enthalten sind, beträgt drei oder vier und vom Standpunkt der „antibakteriellen Aktivität" aus am meisten bevorzugt vier. Wenn die Anzahl der Aminosäurereste zwei oder weniger ist, neigt die antibakterielle Aktivität dazu, abzusinken.
Wenn die Anzahl an Aminosäureresten, die in X enthalten ist, bevorzugt 3 oder 4 ist, dann ist die Größe oder das Molekulargewicht als ein Peptid mit spezifischen Funktionen relativ gering. Solch ein Peptid mit geringem Molekulargwicht wird selten durch ein in vivo-Immunsystem angegriffen, was nahelegt, daß die vorliegenden antibakteriellen Peptide von einem „immunogenen" Standpunkt aus hochwirksam sind.
Beträgt die Anzahl der Aminosäurereste von X vier, wird die Sequenz von X durch die folgende Formel dargestellt: Ala-Xaa¹-Xaa²-Leu (II) wobei Xaa¹ und Xaa² dieselben oder verschieden sein können und ein anderer Aminosäurerest sind als ein saurer. Solche Struktur zeigt bevorzugt eine breitere und höhere antibakterielle Aktivität.
Aminosäurereste, die von solchen Resten von Xaa¹ und Xaa² ausgeschlossen sind, sind z. B. Asparagin- und Glutaminreste.
Das durch die Formel (II) dargestelle Peptid X beinhaltet eine praktische Kombination von Aminosäureresten wie z. B. Ala-Leu-Arg-Leu, Ala-Leu-Leu-Leu, Ala-Trp-Leu-Leu, Ala-Leu-Try-Leu oder Ala-Leu-Trp-Leu.
Die vorliegenden antibakteriellen Peptide können mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren zur Herstellung von Peptiden erzeugt werden. Solche gut bekannten Verfahren beinhalten Festphasensynthese, Flüssigphasensynthese etc.. Ein kommerziell zur Verfügung stehendes, automatisches Peptid-Synthesesystem kann auch als eine Selbstverständlichkeit verwendet werden.
Die Amidierung einer Carboxylgruppe des Arginins (Arg), lokalisieri am C-Terminus des vorliegenden antibakteriellen Peptids, kann mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren durchgeführt werden. So kann z. B. für die oben erwähnte Festphasenpeptidsynthese als ein Festphasenträger ein fester Harzträger, bei dem eine Aminogruppe eingeführt ist, verwendet werden, um solch eine Carboxylgruppe des Arg zu amidieren.
Die vorliegenden antibakteriellen Peptide können leicht in der oben dargestellten Art und Weise hergestellt werden. Die vorliegenden antibakteriellen Peptide umfassen eine modifizierie Kurzkette und können somit durch vollständige chemische Synthese hergestellt werden, ohne auf ein gentechnisches Verfahren angewiesen zu sein, in dem z. B. ein erwünschtes Peptid-kodierendes Gen hergestellt und dann die Genexpression desselben in einem geeigneten Wiri durchgeführt wird.
Obwohl ein Verfahren zur Herstellung der vorliegenden antibakteriellen Peptide relativ einfach ist, wie oben beschrieben, ist es ein bemerkensweries Charakteristkum, daß die so hergestellten Peptide eine breite antibakterielle Aktivität gegen sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien zeigen. Als eine Selbstverständlichkeit kann die Gentechnik in der vorliegenden Erfindung als eine optionale Technik verwendet werden.
Die vorliegenden antibakteriellen Peptide können als ein aktiver Bestandteil verwendet werden, um brauchbare Antibiotika herzustellen (im folgenden als die vorliegenden antibakteriellen Agenzien bezeichnet).
Die vorliegenden antibakteriellen Agenzien können als eine Arzneistoffzusammensetzung durch Vermischen der vorliegenden antibakteriellen Peptide und Arzneistoffträgern hergestellt werden.
Die Arzneistoffträger können passend aus den bekannten Produkten in Abhängigkeit von einer praktischen Form, die hergestellt werden soll, ausgewählt werden. Solche Träger beinhalten formgebende oder verdünnende Materialien wie z. B. Füllstoffe, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Tenside, etc..
Die vorliegenden antibakteriellen Agenzien sind nicht auf eine bestimmte Arzneistofform beschränkt, solange die erwünschte antibakterielle Aktivität wirksam gezeigt ist und können entweder in Form eines Feststoffs wie z. B. Tablette, Pulver und Pille oder einer Injektion wie z. B. flüssig, Suspension, Emulsion vorliegen.
Die in den antibakteriellen Agenzien vorhandene Dosis an dem vorliegenden Peptid sollte sorgsam durch die Arten der Dosisformen, Krankheiten oder Symptome, die zu behandeln sind, etc. kontrolliert werden und ist nicht auf eine bestimmte Menge beschränkt.
Da die antibakteriellen Peptide essentielle Aminosäuren umfassen, wird davon ausgegangen, daß eine Toxizität derselben im Menschen nur selten durch die orale Aufnahme beobachtet wird.
Die vorliegenden antibakteriellen Peptide können für Nahrungsmittel oder Futter für Mensch oder Tier verwendet werden. Das heißt, diese Peptide sind als Nahrungsmittel- und Futterzusätze verwendbar.
Beispiel
Das folgende Beispiel dient dazu, die vorliegende Erfindung weiter zu beschreiben und ist nicht dazu gedacht, sie einzuschränken.
Herstellung der vorliegenden antibakteriellen Peptide
Unter Verwendung eines kommerziell zur Verfügung stehenden Peptid-Synthesesystems „Peptide Synthesizer 9050 Plus" (zu beziehen von PerSeptive Biosystems Co., Ltd.) wurden die vorliegenden Peptide (1) bis (5), wie im folgenden beschrieben, hergestellt. „Fmoc PAL-Polyethylen(PEG-PS)-Harz" wurde als ein Festphasenträger verwendet, um den C-Terminus zu amidieren (die zu amidierende Aminosäure war die Fmoc-L-Aminosäure).
Testbeispiel (Wirksamkeit)
Es wurde eine minimale Inhibitionskonzentration (MIC) der antibakteriellen Peptide (1) bis (5) gegenüber Staphylococcus aureus, Methicillin-restenten Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Das Ergebnis zeigt deutlich, daß die vorliegenden Peptide eine hohe antibakterielle Aktivität und auch ein breites antibakterielles Spektrum aufweisen.
Testbeispiel (Sicherheit)
Die peritoneale Injektionstoxizität der vorliegenden antibakteriellen Peptide (1) bis (5) wurde untersucht, um die LD₅₀ bei Mäusen zu bestimmen. Als Ergebnis war die LD₅₀ dieser Peptide höher als 150 mg/kg, was zeigt, daß die Toxizität derselben bei warmblütigen Tieren relativ gering ist.
Beispiel zur Zubereitung
Beispielhafte Zubereitungen, die die vorliegenden antibakteriellen Peptide enthalten, werden im folgenden beschrieben.
(1) Injektion
Jedes der vorliegenden antibakteriellen Peptide (1) bis (5) wurde in einer Menge von 100 mg in jeweils 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst, welche dann in 2,5 ml-Ampullen aufgeteilt und unter sterilen Bedingungen zur Herstellung einer Injektion verschlossen wurden.
(2) Granulat
Jedes der vorliegenden antibakteriellen Peptide (1) bis (5) in einer Menge von 500 mg wurde mit 50 mg kristalliner Zellulose und 450 mg Laktose vermischt, gefolgt vom Zusammenmischen mit 1 ml eines Ethanol-Wassergemischs. Die so erhaltene Mischung wurde in üblicher Weise granuliert, um ein Granulat herzustellen.
Wirkung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt antibakterielle Peptide einer hohen Sicherheit, einer verbesserten antibakteriellen Aktivität, eines breiten antibakteriellen Spektrums und niedrigen Molekulargewichts und antibakterielle Agenzien, die solche Peptide als einen wirksamen Bestandteil beinhalten, deren Wirkungen im in vio-Immunsystem aufgrund des niedrigen Molekulargwichts derselben gering ist, wenn sie verabreicht werden, zur Verfügung.
Sequenzprotokoll
Die in der vorangegangenen Beschreibung, in den Ansprüchen und/oder den begleitenden Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in jeder Kombination derselben als Material zur Verwirklichung der Erfindung in unterschiedlichen Formen derselben verwendet werden.

Claims

Antibakterielle Peptide, dargestellt durch die folgende Formel: X-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ wobei X ein Peptid ist, bestehend aus drei oder vier Aminosäureresten, verbunden über eine Peptidbindung und Arg-NH₂ bedeutet, daß die Carboxylgruppe des Arg amidiert ist.
Antibakterielle Peptide nach Anspruch 1, in denen das Peptid X aus vier Aminosäureresten besteht.
Antibakterielle Peptide nach Anspruch 2, in denen X Ala-Xaa¹-Xaa²-Leu ist, wobei Xaa¹ und Xaa² dieselben oder verschiedene Aminosäurereste mit Ausnahme von einer sauren Aminosäure sind.
Antibakterielle Peptide nach Anspruch 2, in denen X ein Peptid aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala-Leu-Arg-Leu, Ala-Leu-Leu-Leu, Ala-Trp-Leu-Leu, Ala-Leu-Tyr-Leu und Ala-Leu-Trp-Leu, ist.
Antibakterielle Peptide nach einem der vorangehenden Ansprüche, die antibakteriellen Peptide einschließlich L- und D-optische Isomere.
Antibakterielle Agenzien, die antibakterielle Peptide nach den Ansprüchen 1 bis 5 als einen wirksamen Bestandteil enthalten.
Verwendung antibakterieller Peptide nach den Ansprüchen 1 bis 5 als Nahrungsmittel und Nahrungsmittelzusatz.