JP3273314B2

JP3273314B2 - 抗菌ペプチド及びこれを有効成分とする抗菌剤

Info

Publication number: JP3273314B2
Application number: JP23943598A
Authority: JP
Inventors: 稔山川; 純石橋; 寿子坂中
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2002-04-08
Anticipated expiration: 2018-08-12
Also published as: EP0979831A3; JP2000063400A; DE69908509T2; EP0979831A2; DE69908509D1; EP0979831B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗菌性ペプチド乃
至抗菌性物質を有効成分とする抗菌剤に関する技術分野
の発明である。

【０００２】

【従来の技術】「清潔で快適な生活を送りたい」とい
う、生活者の清潔・快適志向は、最近の病原性大腸菌Ｏ
−１５７等の影響により、さらに拡大しつつある。その
一方で、ＭＲＳＡ等の薬剤耐性菌が、抗生物質の大量使
用等により発生し、今後の動向が危惧されている。

【０００３】現在までに、抗生物質を含め、様々な抗菌
剤が提供されており、医療用のみならず、様々な「抗菌
グッズ」において用いられている。これらの抗菌剤開発
の流れの一つとして、「抗菌ペプチド」が着目されきて
いる。この抗菌ペプチドは、哺乳動物等の精液や血清中
に存在し、幅広い抗菌スペクトルを有するペプチドであ
り、安全性が高く、かつ、その使用によっても薬剤耐性
菌が出現しにくいことが想定される等の点から、現在、
最も着目されている抗菌成分の一つである。

【０００４】そして、このような抗菌ペプチドの一種と
して、昆虫の体液に由来する抗菌ペプチドの存在が知ら
れている。すなわち、昆虫に、細菌や異種の血球を接種
したり、昆虫の体表に、傷をつける等の刺激を与える
と、これらの昆虫の体液中に、様々な抗菌ペプチドが誘
導されることが知られている。

【０００５】例えば、ゴミムシダマシ科の一種（Zophob
as atratus）幼虫体液中に誘導される活性ペプチドとし
て、抗菌活性をもつペプチド（J.Biol.Chem.２６６巻、
２４５５−２４５２５頁、１９９１年）などが同定され
ている。また、コレオプテリシン（Coleoptericin ）と
命名された抗菌ペプチドも、その理化学的性質が明らか
にされている。さらに、鱗翅目の一種（Hyalophora cec
ropia ）の幼虫体液から得られ、セクロピングループに
属する抗菌ペプチドが、その理化学的性質と共に、知ら
れている。これらの昆虫における抗菌ペプチドは、幅広
い抗菌スペクトルを有することからも、抗体産性能をも
たない昆虫の生体防御にとって重要な関わりがあるもの
と考えられている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記の抗菌ペプチドに
関する問題点の一つとして、「免疫原性」が挙げられ
る。すなわち、上記の抗菌ペプチドは、いずれもその分
子量が小さくないために、これを抗菌剤として血中に投
与した場合に、体内の免疫システムに捕獲されてしまう
ために、その抗菌作用が早期に失われてしまう傾向が強
い。

【０００７】また、抗菌スペクトルが比較的広いといっ
ても、ある程度の偏りがあることは否めず、グラム陽性
細菌とグラム陰性細菌の双方に対して、十分に広く有効
な抗菌ペプチドが提供されているとはいいがたい。さら
に、昆虫における抗菌ペプチドに関しては、これを哺乳
動物に適用すると、何らかの細胞毒性を伴う可能性を全
く否定することはできない。

【０００８】そこで、本発明が解決すべき課題は、上記
の問題点を克服した、抗菌ペプチドを用いた抗菌手段を
提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題を
解決するために、上述の昆虫由来の抗菌ペプチドとし
て、コガネムシ科、ゴミダマシムシ科等の鞘翅目に属す
る昆虫、特にコガネムシ科のコカブトムシの一種である
タイワンカブトムシ（Oryctesrhinoceros)における抗菌
ペプチドの構造と機能に着目し、鋭意検討を重ねた。

【００１０】すなわち、傷害等の刺激を与えることによ
り、体液中に抗菌ペプチドを生ずることが知られている
タイワンカブトムシの幼虫の遺伝子から、タイワンカブ
トムシの幼虫における抗菌ペプチドをコードする遺伝子
（以下、天然型抗菌ペプチド遺伝子という）の塩基配列
を決定した。ここで決定した抗菌ペプチド遺伝子の塩基
配列から、タイワンカブトムシに由来する抗菌ペプチド
（以下、特に断わらない限り、天然型抗菌ペプチドとい
う）のアミノ酸配列を推定し、このアミノ酸配列につい
ての情報を基にして、新たな抗菌ペプチドの創製を目指
した。

【００１１】（１）天然型抗菌ペプチド遺伝子の塩基配
列の決定について天然型抗菌ペプチド遺伝子の塩基配列の決定は、通常公
知の遺伝子の塩基配列の決定法に従って行った。

【００１２】つまり、タイワンカブトムシの幼虫から
天然型抗菌ペプチドを抽出・精製し、この天然型抗菌ペ
プチドのＮ末端のアミノ酸配列を決定し、さらにすでに
そのアミノ酸配列が公知である、タイワンカブトムシ以
外の他の昆虫に由来する抗菌ペプチドのＣ末端のアミノ
酸配列を基にして、これらのＮ末端とＣ末端のアミノ酸
配列をコードし得るヌクレオチド鎖を調製し、これらのヌクレオチド鎖を遺伝子増幅用のプライマー
として、タイワンカブトムシの遺伝子における抗菌ペプ
チドをコードしていると考えられる部分の遺伝子増幅操
作（ＰＣＲ法）を行い、得られた遺伝子の増幅産物における塩基配列を決定し
た。

【００１３】上記の操作において、天然型抗菌ペプチ
ドのＮ末端を決定するために行う、タイワンカブトムシ
の幼虫からの天然型抗菌ペプチドの分離・精製は以下の
ようにして行った。

【００１４】すなわち、１０匹のタイワンカブトムシの
三令幼虫を、氷上に数分間置いて、その動きを鈍くして
から、皮下針を貫通させて、傷害を与えた。次いで、こ
の傷害を与えたタイワンカブトムシの幼虫を、腐葉土の
入った２５℃に保った容器中で、２４〜４８時間飼育し
た。その後、幼虫の脚部を切断し、腹部を押さえてしぼ
り出しを行うことで、氷上のチューブ中に、傷害を与え
たタイワンカブトムシの幼虫の体液滴を採取した。

【００１５】その結果、一匹のタイワンカブトムシの幼
虫当り、約１．５mLの体液が得られた。このようにし
て、得られた体液を、遠心分離（３９０００×ｇ）に５
０分間付して、血球成分を除き、得られた上清を−２０
℃で保存した。次いで、この上清１５mLを、溶媒Ａ（２
０％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢酸）で
平衡化しておいた、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ18カートリッジ
（Waters Associates 社製）にアプライし、溶媒Ａでカ
ラムを洗浄後、３０％アセトニトリル／０．０５％トリ
フルオロ酢酸で、抗菌活性物質（活性画分）を溶出させ
た。

【００１６】この活性画分から、アセトニトリルを除去
するために凍結乾燥を行い、得られた乾燥粉末を、０．
０５％トリフルオロ酢酸に溶解し、０．０５％ヘプタフ
ルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）で平衡化した、Ｒｅｓｏｕｒｃ
ｅＲＰＣカラム（Pharmacia 社製、１mL）にアプライ
した。

【００１７】０．０５％ＨＦＢＡでカラムを洗浄後、０
％→２０％アセトニトリル／０．０５％トリフルオロ酢
酸（１．２５分間）、同溶液２０％→４０％（１０分
間）及び４０％→１００％（１．２５分間）の条件で、
グラジエント溶出を行った。

【００１８】その結果、アセトニトリル３８〜４０％画
分に、抗菌活性が認められた。ここで、抗菌活性は、次
の手法で確かめた。すなわち、ブイヨン培地：０．９９
ｍL 〔牛肉エキス： 1ｇ (Difco 社製) 、Ｂａｃｔｏ−
ペプトン：２ｇ (Difco 社製) 、Ｎａｃｌ：１ｇを２０
０ｍL の水に溶かす〕に細菌懸濁液：１０μL 〔黄色ブ
ドウ球菌（Staphylococcus aureus）をブイヨン培地に
一晩培養したもの〕を加え、対数増殖期まで培養する。
その培養液：２００μL をブイヨン寒天培地( ブイヨン
培地に寒天を１．５重量％加えたもの) に加えてシャー
レに注いで固める。その後、固めたブイヨン寒天培地に
ゲルパンチャー（Pharmacia 社製 )で直径２ｍｍの穴を
あける。その穴に５μL の水に溶解したアセトニトリル
３８〜４０％画分（試料）を注入し、３７℃で一晩培養
した。そして生じた阻止円の形成を観察した。以下、同
様である。

【００１９】この活性画分から、アセトニトリルを除去
するために、再び凍結乾燥を行い、得られた乾燥粉末
を、上記の溶媒Ａに溶解し、μＲＰＣＣ２／Ｃ１８
ＰＣ３．２／３カラム（Pharmacia 社製、３．２×３０
mm）にアプライした。次いで、溶媒Ａでカラムを洗浄
後、２０％→４０％アセトニトリル／０．０５％トリフ
ルオロ酢酸（４０分間）という緩やかなグラジエント条
件で溶出を行った。その結果、アセトニトリル２３〜２
４％画分に、抗菌活性が認められた。

【００２０】このようにして得られた天然型抗菌ペプチ
ド画分を、上記の溶媒Ａで平衡化しておいた逆相カラム
（２．１×１００mm、Pharmacia 社製 μＲＰＣＣ２
／Ｃ１８ＳＣ２．１／１０）にアプライした。

【００２１】この逆相カラムをファルマシア社製ＳＭＡ
ＲＴシステムに連結させて、溶媒Ａでカラムを洗浄後、
緩やかなグラジエント条件〔０％→２０％アセトニトリ
ル／０．０５％トリフルオロ酢酸（５分間）、２０％→
４０％（４０分間）及び４０％→１００％（５分間）〕
で溶出を行った。

【００２２】２００μL ずつ分画し、アセトニトリルを
除去するために、凍結乾燥を行ない、各々の画分につい
て抗菌活性を測定した。その結果、抗菌活性は、第１図
に示すように、蛋白のピークに一致する単一なピークと
して溶出した。

【００２３】そして、この抗菌活性画分を、質量分析
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果、単一の分子量
４４８９（Ｍ＋Ｎａ）⁺を示した（第２図）。

【００２４】このようにして得られた天然型抗菌ペプチ
ドと考えられる画分をエドマン分解して、天然型抗菌ペ
プチドのＮ末端に相当すると考えられる、ＰＴＨ−アミ
ノ酸残基１５個の配列（配列番号１）： Leu Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala 1 5 10 15 が判明した。

【００２５】なお、この天然型抗菌ペプチドの抗菌活性
を、被験液５０μｌ中のタンパク量を、０〜０．８μｇ
／mLと変化させて測定した結果を、第３図に示す。

【００２６】第３図により、上記のように得られた天然
型抗菌ペプチドの抗菌活性が、確かに黄色ブドウ球菌に
対して認められることが判明した。また、この天然型抗
菌ペプチドを、１００℃で５〜１０分間熱処理したが、
この熱処理後も、もとの抗菌活性を保持していた。

【００２７】また、上記の操作において、天然型抗菌
ペプチドのＮ末端をコードし得るヌクレオチド鎖を、上
記の配列番号１に記載されたアミノ酸配列から推定され
る塩基配列のヌクレオチド鎖を合成して得て、これを以
下の工程において、一方のＰＣＲプライマーとして用い
た。

【００２８】さらに、天然型抗菌ペプチドのＣ末端をコ
ードし得るヌクレオチド鎖を、他の昆虫に由来する公知
の抗菌ペプチドのＣ末端の保存領域（他の昆虫の体液に
おいて、すでにそのアミノ酸配列が知られている抗菌ペ
プチドのＣ末端は、極めて種間における保存性が高いこ
とが知られている）のアミノ酸配列を基にしたヌクレオ
チド鎖を合成して得て、これを以下の工程において、他
方のＰＣＲプライマーとして用いた。

【００２９】大腸菌を感作させたタイワンカブトムシの
三令幼虫の脂肪体のｍＲＮＡを鋳型として、制限酵素Ｎ
ｏｔＩサイトが付加されたプライマーを用いて合成した
ファーストストランドｃＤＮＡに対して、上記のように
して調製したＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法による
遺伝子増幅を行った。

【００３０】その結果、約１２０bpの長さの遺伝子の増
幅産物が得られた。この遺伝子の増幅産物の塩基配列を
決定し、この塩基配列を基にして、新たにプライマーを
合成し、上記のファーストストランドｃＤＮＡの合成時
に付加した、制限酵素ＮｏｔＩサイトに対して相補的な
プライマーとの間で、さらにＰＣＲ法による遺伝子増幅
を行い、この遺伝子増幅産物の３’末端側の塩基配列を
明らかにした。さらに、この明らかになった塩基配列を
基にして合成したプライマーを用いて、上記の大腸菌を
感作させたタイワンカブトムシの三令幼虫の脂肪体のｍ
ＲＮＡを鋳型として、ファーストストランドｃＤＮＡを
合成した。

【００３１】次いで、このｃＤＮＡの５’末端にpolyＣ
配列を付加し、これを鋳型として、polyＧ配列を有する
プライマーと上記の明らかになった塩基配列を基にして
合成したプライマーとをＰＣＲプライマーとして用い
て、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った。これにより得
られた遺伝子増幅産物の５’側の塩基配列を決定した。

【００３２】これらの操作により、順次明らかになった
塩基配列についての情報を組み合わせて、タイワンカブ
トムシに由来する天然型抗菌ペプチドをコードする遺伝
子（ｃＤＮＡ）の塩基配列を明らかにした（配列番号
２）。なお、この配列番号２に示す塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列を、同じく配列番号２において示す。

【００３３】このようにして得た配列番号２に記載した
塩基配列を有するＤＮＡを、遺伝子導入用ベクター（ｐ
ＣＲ２・１：Invitrogen社製）に組み込み、これを大腸
菌ＪＭ１０９に導入して形質転換を行った。この形質転
換体は、ｐＣＲＯＡＤ（受託番号ＦＥＲＭＰ−１６８
００）として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。

【００３４】配列番号２において表される推定アミノ酸
配列を、上記の配列番号１における天然型抗菌ペプチド
のＮ末端側のアミノ酸配列と比較すると、この配列番号
２において推定されているアミノ酸配列のうち、１番目
のアミノ酸残基（Met ）から３６番目のアミノ酸残基
（Arg ）までが、細胞外への分泌用のシグナルペプチド
及びプロペプチドであり、３７番目のアミノ酸残基（Le
u ）から、終止コドン前のアミノ酸残基(Arg）までが、
実際に抗菌活性を有する、成熟型の天然型抗菌ペプチド
であることが判明した。

【００３５】このようにして、アミノ酸配列が判明した
天然型抗菌ペプチドは、４３アミノ酸残基からなる、上
述のように、優れた抗菌活性を有する抗菌ペプチドであ
る。

【００３６】（２）新たな抗菌ペプチドの創製についてしかしながら、この４３アミノ酸残基というアミノ酸残
基数のペプチドは、生体内の免疫システムにおいて免疫
原となるのに十分な大きさを有している。

【００３７】すなわち、天然型抗菌ペプチドを生体に投
与しても、生体内の免疫システムにより、早期に不活化
されてしまう可能性が強いという欠点が想定される。ま
た、この天然型抗菌ペプチドは、グラム陽性細菌にのみ
抗菌スペクトルを有し、グラム陰性菌に対しては、殆ど
抗菌活性を発揮しないという面がある。

【００３８】そこで、本発明者は、上記の天然型抗菌ペ
プチドのアミノ酸配列の内容について鋭意検討を行い、
その結果、上記のアミノ酸配列の第６２番目のアミノ酸
残基（Ala ）から第６９番目のアミノ酸残基（Ala ）ま
でが、天然型抗菌ペプチドの抗菌活性を司っている部分
であることを突き止めた。そして、かかる活性中心部分
のみを抗菌ペプチドとすることにより、これを体内に投
与しても体内の免疫システムによる失活を、小分子故に
免れることが可能であると考えた。

【００３９】また、本発明者は、この活性中心部分のア
ミノ酸配列を改変することにより、グラム陽性菌のみな
らず、グラム陰性菌にも抗菌スペクトルを広げることが
可能であるのではないかと考えた。

【００４０】本発明者は、このような方針のもと、さら
に検討を重ねた結果、Ｃ末端がアミド化している特定の
アミノ酸配列をコア部分とするペプチドは、小分子であ
っても、グラム陽性菌と、グラム陰性菌の双方に対して
優れた抗菌活性を有することを突き止め、本発明を完成
した。

【００４１】すなわち、本発明者は、下記式（Ｉ）Ｘ-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （Ｉ）（式中、Ｘは１個のアミノ酸残基又は２個以上のアミノ
酸残基がペプチド結合してなるペプチドであり、Arg-NH
₂は、このArg のカルボキシル基がアミド化しているこ
とを示す）で表される、抗菌ペプチドを、本願において
提供する。また、この抗菌ペプチドを有効成分とする抗
菌剤、特に消化管摂取が可能な可食性抗菌剤を提供す
る。

【００４２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明に係わる抗菌ペプチド（以下、本発
明抗菌ペプチドという）は、上述のように、下記式
（Ｉ）Ｘ-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （Ｉ）（式中、Ｘは１個のアミノ酸残基又は２個以上のアミノ
酸残基がペプチド結合してなるペプチドであり、Arg-NH
₂は、このArg のカルボキシル基がアミド化しているこ
とを示す）で表される、抗菌ペプチドである。なお、こ
の抗菌ペプチドは、Ｌ型及びＤ型の光学異性体を含むも
のである。

【００４３】本発明抗菌ペプチドの、「Ala-Ile-Arg-Ly
s-Arg 」の部分は、本発明抗菌ペプチドが抗菌活性を発
揮するための必須の構成であり、この部分を除外した場
合は、本発明抗菌ペプチドは、所望する抗菌活性を発揮
することが困難である。

【００４４】また、上記の定義のように、Arg-NH₂は、
このArg のカルボキシル基がアミド化していることを示
す。このアミド化の要件も、本発明抗菌ペプチドが所望
する抗菌活性を十分に発揮するために必須の要素であ
り、仮に、上記の「Ala-Ile-Arg-Lys-Arg 」を、そのＣ
末端に有するペプチドであっても、所望する抗菌活性を
発揮することは困難である。

【００４５】Ｘは、上記の定義のように、１個のアミノ
酸残基又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合して
なるペプチドであり、このＸの構成は、本発明抗菌ペプ
チドが、所望する抗菌活性を発揮し得る限り、特に限定
されるものではない。

【００４６】６この「抗菌活性」という要素に着目する
と、Ｘにおけるアミノ酸残基数は３個以上であることが
好ましく、特に３個又は４個であることが好ましく、さ
らに４個であることが極めて好ましい。このＸにおける
アミノ酸残基数が２個以下であると、本発明抗菌タンパ
ク質の抗菌活性が低下する傾向が現れる。

【００４７】このように、本発明で好適であるＸにおけ
るアミノ酸残基数は、３個又は４個であり、特定機能を
有するペプチドとしては極めて低分子である。かかる低
分子のペプチドは、生体の免疫システムの作用を受けに
くいので、上述した「免疫原性」という観点からも、本
発明抗菌ペプチドは好適である。

【００４８】さらに、Ｘのアミノ酸残基数が４個である
場合には、Ｘの配列は、 Ala-Xaa¹-Xaa²-Leu (II) （式中、Xaa¹及び Xaa²は、同一でも異なってもよい、
酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基である）であること
が、幅広く、かつ、優れた抗菌活性を発揮させ得るとい
う点において好ましい。なお、上記のアミノ酸残基（Xa
a¹及び Xaa²）から除外される酸性アミノ酸のアミノ酸
残基としては、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残
基を例示することができる。

【００４９】かかる式(II)の具体的組み合わせとして
は、例えば、Ala-Leu-Arg-Leu 、Ala-Leu-Leu-Leu 、Al
a-Trp-Leu-Leu 、Ala-Leu-Tyr-Leu 又はAla-Leu-Trp-Le
u 等を例示することができる。

【００５０】本発明抗菌ペプチドは、通常公知のペプチ
ド合成法等を用いて製造することができる。すなわち、
固相合成法、液相合成法等の通常公知の方法を用いて、
本発明抗菌ペプチドを合成することができる。市販のペ
プチド合成自動装置を用いて合成することも勿論可能で
ある。

【００５１】また、本発明抗菌ペプチドのＣ末端に位置
するアルギニン(Arg) のカルボキシル基のアミド化も、
通常公知のアミド化法を用いて行うことができる。すな
わち、例えば、上記の固相合成法によるペプチド合成に
おいて用いる固相担体として、担体樹脂にアミノ基を導
入した固相担体を選択すること等により、上記のArg の
カルボキシル基をアミド化することができる。

【００５２】このようにして、本発明抗菌ペプチドを製
造することが可能である。本発明抗菌ペプチドは、短鎖
の修飾ペプチドであり、その製造工程として、例えば、
所望するペプチドをコードする遺伝子を製造して、これ
を適切な宿主において発現させることにより生産する等
の、遺伝子工学的な手法を用いることなく、化学合成を
全面的に用いることが可能できる。このように、その製
造方法が、相対的に極めて容易であるにもかかわらず
（遺伝子工学的手法により生産させることも勿論可能で
あり、かかる遺伝子工学的な手法による本発明抗菌ペプ
チドの製造について、本発明者は認識している）、本発
明抗菌ペプチドは、グラム陽性菌とグラム陰性菌双方に
対して広い範囲で抗菌活性を有するという、驚くべき特
徴を有している。

【００５３】本発明抗菌ペプチドは、これを有効成分と
して医薬用途に有用な医薬製剤にすることができる（以
下、本発明抗菌剤ともいう）。本発明抗菌剤は、本発明
抗菌ペプチドと共に、適当な医薬製剤担体を配合して製
剤組成物の形態に調製され得る。この製剤担体として
は、製剤の具体的な形態に応じて、公知の製剤担体を適
宜選択して用いることができる。かかる製剤担体として
は、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊
剤、界面活性剤等の賦形剤や希釈剤等を例示することが
できる。

【００５４】本発明抗菌剤の具体的形態は、本発明の所
期の効果である、抗菌作用を発揮し得る形態であれば特
に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等
の固形剤であってもよいが、液剤、懸濁剤、乳剤等の注
射剤形態であってもよい。また、使用前に適当な担体の
添加によって液状となし得る乾燥品とすることも可能で
ある。

【００５５】本発明抗菌剤による、本発明抗菌ペプチド
の投与量は、本発明抗菌剤の具体的な剤形、対象となる
疾患の種類、症状等を勘案して、適宜選択すべきもので
あり、特に限定されるべきものではない。

【００５６】本発明抗菌ペプチドは、必須アミノ酸から
なるので、経口摂取しても、ヒトに対する毒性は殆ど認
められないと考えられる。従って、本発明抗菌ペプチド
は、ヒト乃至動物用の食品や飼料等としても利用するこ
とが可能である。すなわち、本発明抗菌ペプチドは、食
品や飼料添加物としての抗菌剤、すなわち、可食性抗菌
剤としても有用である。

【００５７】

【実施例】次に本発明を実施例に挙げて具体的に説明す
るが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【００５８】本発明抗菌ペプチドの製造本実施例において用いた、下記の本発明抗菌ペプチド
〜は、市販のペプチド合成機、具体的には、"Peptide
Synthesizer 9050 plus"(PerSeptive Biosystems 製）
を用いて製造した。また、Ｃ末端をアミド化するため
に、固相担体として、"Fmoc-PAL-Polyethylen(PEG-PS)
樹脂" を用いた（このアミド化のために用いたアミノ酸
は、Fmoc-L-アミノ酸である）。

【００５９】本発明抗菌ペプチド：Ala-Leu-Arg-Leu-
Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （配列番号３）

【００６０】本発明抗菌ペプチド：Ala-Leu-Leu-Leu-
Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （配列番号４）

【００６１】本発明抗菌ペプチド：Ala-Trp-Leu-Leu-
Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （配列番号５）

【００６２】本発明抗菌ペプチド：Ala-Leu-Tyr-Leu-
Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （配列番号６）

【００６３】本発明抗菌ペプチド：Ala-Leu-Trp-Leu-
Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （配列番号７）

【００６４】試験例（有効性試験）上記の本発明抗菌ペプチド〜の各々について、黄色
ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、大腸菌及
び緑膿菌に対して、最小阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。
その結果を、第１表に示す。

【００６５】第１表 ──────────────────────────────────── 抗菌ペプチド黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ大腸菌緑膿菌 ──────────────────────────────────── 抗菌ペプチド５ − ４＞１５抗菌ペプチド４４０６４抗菌ペプチド３２５５４抗菌ペプチド２３０４４抗菌ペプチド４４０１０１０ ──────────────────────────────────── （表中、ＭＩＣの単位は、μg ／mLである）

【００６６】この結果より、本発明抗菌ペプチドは、優
れた抗菌活性を有し、かつ、広い抗菌スペクトルを有す
ることが明らかになった。

【００６７】試験例（安全性試験）上記の本発明抗菌ペプチド〜について、マウスに対
する腹腔内注射毒性のＬＤ₅₀値を求めた。その結果、こ
れらの抗菌ペプチドのＬＤ₅₀は、１５０mg/Kg より大き
く、本発明抗菌ペプチドの温血動物に対する毒性は極め
て低いことが明らかになった。

【００６８】製剤例以下、本発明抗菌剤の製剤例を記載する。（１）注射剤本発明抗菌ペプチド〜を、それぞれ１００mg秤量し
て、生理食塩水１００mLに溶解し、得られた溶液を無菌
的に2.5 ml容のアンプルに充填、封入し、注射液製剤と
した。

【００６９】（２）顆粒剤本発明抗菌ペプチド〜を、それぞれ５００mg秤量し
て、結晶セルロース50mg及び乳糖450mg からなる混合物
に、エタノールと水の混液１mLを加え練合した。この練
合物を常法に従って造粒して、顆粒剤とした。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、安全性に優れると共に、
優れた抗菌活性と広い抗菌スペクトルを有し、かつ、分
子量が小さく、これを投与した場合に、体内の免疫シス
テムの作用の影響が少ない抗菌ペプチド、及び、この抗
菌ペプチドを有効成分とする抗菌剤が提供される。

【００７１】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源：タイワンカブトムシ（Oryctes rhinoceros) 配列 Leu Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala 15

【００７２】配列番号：２配列の長さ：３１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Complementary DNA (ｃDNA) 配列 TGACTCATAC AACAAATCGC AGAGCTTACG ACAAG ATG TCG AGG TTT ATC GTA 53 Met Ser Arg Phe Ile Val 6 TTT GCT TTC ATC GTA GCC ATG TGC ATT GCA CAC AGT TTA GCT GCG CCA 101 Phe Ala Phe Ile Val Ala Met Cys Ile Ala His Ser Leu Ala Ala Pro 22 GCA CCA GAA GCG CTT GAA GCT AGC GTC ATA AGA CAA AAG AGA CTG ACG 149 Ala Pro Glu Ala Leu Glu Ala Ser Val Ile Arg Gln Lys Arg Leu Thr 38 TGC GAT CTT CTG AGT TTC GAA GCT AAG GGT TTT GCT GCC AAT CAC AGC 197 Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala Asn His Ser 54 CTG TGC GCT GCT CAT TGC CTA GCT ATT GGA CGC AAA GGT GGT GCT TGT 245 Leu Cys Ala Ala His Cys Leu Ala Ile Gly Arg Lys Gly Gly Ala Cys 70 CAA AAT GGG GTT TGT GTG TGC AGA AGA TAG ATCTGTTATA GTTTTTTTTT 295 Gln Asn Gly Val Cys Val Cys Arg Arg 79 AATAGATCAT TTTTTTTATT T 316

【００７３】配列番号：３配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Leu Arg Leu Ala Ile Arg Lys Arg

【００７４】配列番号：４配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Leu Leu Leu Ala Ile Arg Lys Arg

【００７５】配列番号：５配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Trp Leu Leu Ala Ile Arg Lys Arg

【００７６】配列番号：６配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Leu Tyr Leu Ala Ile Arg Lys Arg

【００７７】配列番号：７配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Leu Trp Leu Ala Ile Arg Lys Arg

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、天然型抗菌ペプチドの逆相カラムクロ
マトグラフィー（ＳＭＡＲＴシステム）による最終精製
プロファイルと黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性作用を
示す図である。

【図２】図２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、天
然型抗菌ペプチドの質量分析を示す図である。

【図３】図３は、黄色ブドウ球菌増殖に及ぼす天然型抗
菌ペプチドの濃度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/435 ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（Ｉ）Ｘ−Ala-Ile-Arg-Lys-Arg-NH₂ （Ｉ）〔式中、Ｘは、Ala-Xaa¹-Xaa²-Leu （Xaa¹及びXaa²は、
同一でも異なってもよい酸性アミノ酸以外のアミノ酸残
基である）で表されるペプチドであり、Arg-NH₂は、こ
のArg のカルボキシル基がアミド化していることを示
す〕で表される抗菌ペプチド。
【請求項２】Ｘが、Ala-Leu-Arg-Leu 、Ala-Leu-Leu-Le
u 、Ala-Trp-Leu-Leu 、Ala-Leu-Tyr-Leu 及びAla-Leu-
Trp-Leu からなる群から選ばれる、いずれかのアミノ酸
配列のペプチドである、請求項１記載の抗菌ペプチド。
【請求項３】請求項１又は２記載の抗菌ペプチドを有効
成分とする抗菌剤。
【請求項４】抗菌剤が、可食性抗菌剤である、請求項３
記載の抗菌剤。