WO2005049819A1 - 抗菌ペプチド及びその利用 - Google Patents

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WO2005049819A1
WO2005049819A1 PCT/JP2004/015803 JP2004015803W WO2005049819A1 WO 2005049819 A1 WO2005049819 A1 WO 2005049819A1 JP 2004015803 W JP2004015803 W JP 2004015803W WO 2005049819 A1 WO2005049819 A1 WO 2005049819A1
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sequence
amino acid
acid residues
seq
peptide
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PCT/JP2004/015803
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French (fr)
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Tetsuhiko Yoshida
Yoshinao Yamada
Masayoshi Kume
Hiroki Kourai
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Toagosei Co., Ltd.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an antimicrobial oligopeptide or polypeptide (hereinafter referred to as "antimicrobial peptide") consisting of an independent peptide chain in a form that does not exist in nature, and its use. It relates to an antibacterial agent (composition) as a main component.
  • Antimicrobial peptides are generally considered to be broad! / It has an antibacterial spectrum, and it is considered that drug-resistant bacteria are unlikely to appear! Therefore, prevention and treatment of bacterial and infectious diseases of humans and animals, or food It is expected to be used for imparting antibacterial properties to articles such as materials. To date, many antimicrobial peptides have been isolated from various animals and plants.
  • the present invention is not limited to the previous approach to developing antimicrobial agents containing antimicrobial peptides.
  • Another object of the present invention is to provide an antimicrobial peptide which exists and functions as an antimicrobial peptide and has an artificially designed amino acid sequence different from that of a peptide, and a polynucleotide encoding the peptide.
  • Another object is to provide an antibacterial agent (pharmaceutical composition) containing such an antibacterial peptide as a main component.
  • the antimicrobial peptide provided by the present invention is a peptide developed by a different approach from the previously known antimicrobial peptide. That is, it is an antimicrobial peptide created using an amino acid sequence contained in a polypeptide different from a polypeptide that exists as an antimicrobial peptide in nature.
  • One non-naturally occurring artificially designed antimicrobial peptide disclosed herein has at least six consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence that constitutes a laminin binding site (LBS).
  • LBS laminin binding site
  • the total number of amino acid residues is 100 or less.
  • another artificially designed, non-naturally occurring antibacterial peptide disclosed herein has at least 6 amino acids selected from the amino acid sequence constituting the laminin binding site (LBS). Having a sequence consisting of two consecutive amino acid residues or a sequence in which one or more amino acid residues of the sequence are conservatively substituted, and which is adjacent to the N-terminal side and the Z- or C-terminal side of the sequence.
  • the sequence is composed of three or more consecutive amino acid residues, and the majority of the amino acid residues constituting the sequence are peptides having a highly basic partial sequence of lysine or arginine.
  • the total number of amino acid residues is 100 or less.
  • antimicrobial peptide that does not exist in nature
  • the “antimicrobial peptide” is a term indicating an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds exhibiting antimicrobial activity against at least one kind of microorganism, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain. Oligopeptides with up to about 10 amino acid residues Polypeptides consisting of more or more amino acid residues are also encompassed by the antimicrobial peptides herein.
  • amino acid residue is a term including the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • the present inventor has proposed a part of the amino acid sequence of a part known as a laminin binding site (LBS) in a protein that functions as a receptor (receptor one) for laminin, which is a non-collagenous glycoprotein;
  • LBS laminin binding site
  • the predetermined sequence that is, an amino acid sequence capable of expressing antibacterial activity against the at least one bacterium or fungus, and Z or the highly basic partial sequence (hereinafter, these are collectively referred to as “antibacterial-related sequences” t).
  • antibacterial-related sequences antibacterial-related sequences
  • laminin binding site used herein is not limited to a specific biological origin and a specific amino acid sequence unless otherwise specified, and is not limited to amino acids known as amino acid sequences that constitute the laminin binding site of the laminin receptor. Refers to the whole specified by the sequence.
  • the antimicrobial peptide of the present invention comprises, as a major component, at least six consecutive amino acid residues selected from “amino acid sequences constituting LBS (ie, amino acid sequences known to constitute LBS)”.
  • a gram-negative bacterium, a Z- or a gram-negative bacterium by including a base sequence or a sequence in which one or more amino acid residues of the sequence are conservatively substituted. It can exhibit high antibacterial activity against Gram-positive bacteria or fungi.
  • a preferred antimicrobial peptide has a sequence comprising at least six consecutive amino acid residues.
  • LBS sequence 1S It is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 119 or a sequence containing the amino acid sequence.
  • the sequences shown in these SEQ ID NOs are norindrome sequences that are known to be deeply involved in binding to laminin (for example, SEQ ID NO: 1) or similar sequences having a similar laminin binding function (the non- See Patent Document 1).
  • LBS sequence containing these sequences which may be a sequence in which one or more amino acid residues are conservatively substituted
  • the antimicrobial-related sequence dram-negative bacteria and Z or gram-positive It can exert particularly high antibacterial activity against bacteria or fungi.
  • an antibacterial peptide having a powerful structure include the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 10 to 30 or a sequence in which one or more amino acid residues in the sequence are replaced by the same type, or the sequence strength is also obtained. There are peptides.
  • the antimicrobial peptide preferably has at least one amino acid residue amidated. Amidation of the carboxyl group of an amino acid residue (typically, the C-terminal amino acid residue of a peptide chain) can improve the structural stability (eg, protease resistance) of an antimicrobial peptide.
  • the antimicrobial peptide preferably has a total number of amino acid residues constituting the peptide chain of 20 or less.
  • Such a peptide having a short chain length can be easily synthesized chemically and can easily provide an antimicrobial peptide.
  • the present invention also provides a method for producing the antimicrobial peptide disclosed herein. That is, one method for producing an antimicrobial peptide provided by the present invention comprises a sequence comprising at least six consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence constituting LBS (ie, a sequence known as LBS), Or determining a sequence in which one or more amino acid residues in the sequence are conservatively substituted; and a peptide having the determined sequence and an amino acid sequence capable of expressing antibacterial activity against at least one kind of bacteria or fungi. It involves designing a chain and synthesizing the designed peptide chain.
  • Another method for producing an antimicrobial peptide comprises a sequence consisting of at least six consecutive amino acid residues selected from a sequence known as an amino acid sequence constituting LBS (ie, a sequence known as LBS), or Determining a sequence in which one or more amino acid residues in the sequence are conservatively substituted; and determining the determined sequence and at least three or more partial sequences adjacent to the N-terminal and Z or C-terminal thereof. And designing a peptide chain having a highly basic partial sequence in which the majority of the amino acid residues constituting the sequence is lysine or arginine, and synthesizing the designed peptide chain. Is included.
  • a peptide chain having 100 or less total amino acid residues is designed.
  • Antibacterial peptides having a short chain length can be easily produced and purified by, for example, a general chemical synthesis method.
  • the present invention also relates to an antimicrobial agent comprising at least one antimicrobial peptide disclosed in the present specification and a pharmaceutically acceptable carrier (typically, a composition that can be used in the medical or hygiene field). Things).
  • An antibacterial agent containing an antibacterial peptide having 100 or less (more preferably 20 or less) total amino acid residues as a main component is preferable.
  • An antibacterial agent containing such a short-chain peptide ie, an antibacterial peptide having a relatively low molecular weight
  • the present invention also includes a nucleotide sequence encoding any of the antimicrobial peptides disclosed herein and Z or a nucleotide sequence complementary to the sequence, or is substantially constituted by such a sequence.
  • a non-naturally occurring artificially designed polynucleotide is a term indicating a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by a phosphate diester bond, and is not limited by the number of nucleotides. DNA and RNA fragments of various lengths are encompassed by the polynucleotides herein.
  • “artificially designed polynucleotide that does not exist in nature” means that the nucleotide chain (full length) does not exist in nature by itself or by chemical synthesis or biosynthesis (that is, production based on genetic engineering). Polynucleotides synthesized artificially! , U.
  • the polynucleotide is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 10 to 30 (or a sequence obtained by conservatively replacing one or more amino acid residues in the sequence) and Z or There are polynucleotides that comprise or consist essentially of nucleotide sequences complementary to the sequences.
  • An antimicrobial peptide having a primary structure comprising the LBS sequence and the antimicrobial-related sequence provided by the present invention can exhibit high antimicrobial activity against various gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, and fungi. Therefore, the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a main component of an antimicrobial agent. Further, an antibacterial agent containing such an antibacterial peptide can be used in vivo or in vitro.
  • SEQ ID NO: 10 designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 11 designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 13 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 14 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the 15 terminus
  • SEQ ID NO: 16 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 17 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 18 terminus Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminal of SEQ ID NO: 19 (Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminal of SEQ ID NO: 20)
  • Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the end of SEQ ID NO: 22 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the end of SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 26 Designed antimicrobial peptide containing amide group at terminal
  • SEQ ID NO: 28 Designed antimicrobial peptide containing amide group at terminal
  • SEQ ID NO: 30 Designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminus
  • SEQ ID NO: 31 Designed peptide containing an amide group at the terminus.
  • SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 Designed peptide containing an amide group at the terminus SEQ ID NO: 34 Designed peptide containing an amide group at the terminus SEQ ID NO: 34 Designed peptide containing an amide group at the terminus SEQ ID NO: 35 Designated peptide containing an amide group at the terminus Designed peptide SEQ ID NO: 36 Designed peptide containing an amide group at the terminus SEQ ID NO: 37 Designed peptide containing an amide group at the terminus SEQ ID NO: 38 A designed antimicrobial peptide containing an amide group at the terminal (Best Mode for Carrying Out the Invention)
  • a preferred embodiment of the present invention will be described.
  • the antimicrobial peptide disclosed herein is an artificially designed peptide that does not exist in nature and is a short polypeptide or oligopeptide having an LBS sequence and an antimicrobial-related sequence. That is, the antimicrobial peptide of the present invention is clearly distinguished from various naturally occurring polypeptides (peptide chains) in that it is a peptide fragment in which the LBS sequence and the antimicrobial-related sequence are located close to each other. Is a substance.
  • the ratio of the LBS sequence and the antimicrobial-related sequence to the entire amino acid sequence is at least 40% by number, and this ratio is more preferably at least 70% by weight of all the amino acids constituting the peptide chain, and at least 90% by number. Is particularly preferred.
  • the antimicrobial peptide of the present invention is preferably one in which all amino acid residues are L-type amino acids, as long as part or all of the amino acid residues are substituted with D-type amino acids, as long as the antibacterial activity is not lost. It may be.
  • the chain length (number of amino acid residues) of the antimicrobial peptide of the present invention is not particularly limited since it may vary depending on the length of the LBS sequence and Z or the antimicrobial-related sequence contained therein. Preferred are those composed of 100 or less, for example, about 10-100 amino acid residues. 10 More preferred are those composed of about 1-50 amino acid residues. About 12-20 amino acids. Those composed of residues are particularly preferred.
  • the conformation (steric structure) of the peptide is not particularly limited as long as it exhibits antibacterial properties in the environment in which it is used, but it is difficult to become an immunogen (antigen).
  • V and perspective power
  • a linear or helix-shaped one is preferred. It is difficult for such a peptide to form an epitope.
  • the antimicrobial peptide applied to the antimicrobial agent preferably has a linear structure and a relatively low molecular weight (typically, the number of amino acid residues is 10 to 30, for example, the number of amino acids is 10 to 20). It is.
  • an amino acid sequence conventionally known from various organisms eukaryotes or prokaryotes
  • a sequence constituting a laminin binding site has been known.
  • LMW WML SEQ ID NO: 1
  • LMWWLL SEQ ID NO: 2
  • CLFWLL SEQ ID NO: 3
  • LIWYLL SEQ ID NO: 4
  • VVYWLL SEQ ID NO: 5
  • LYLGAV SEQ ID NO: 6
  • LITSKM SEQ ID NO: 7
  • FFYMVI SEQ ID NO: 8
  • LLTAKM SEQ ID NO: 9
  • Peptides containing one or more of these as an LBS sequence (or part thereof) are preferred.
  • an antimicrobial peptide having any one of SEQ ID NOS: 19 to LBS as it is as shown in SEQ ID NOS: 10 to 30 (Table 1) described below as a preferable specific example is preferable.
  • LBS sequence not only a native type sequence, but also an LBS sequence subjected to various partial modifications as long as the antibacterial property is not impaired can be used.
  • modified sequences of this type include those in which several (eg, 13) amino acid residues in the sequence have been conservatively substituted, and at least 6 amino acid sequences selected from the amino acid sequences constituting natural LBS. N-terminal and Z- or C-terminal to which one or a few amino acids are added, the C-terminal amino acid (ie, the C-terminal amino acid of the peptide chain). ) Wherein the carboxyl group is amidated.
  • the antimicrobial-related sequence for constructing the antimicrobial peptide of the present invention includes an amino acid sequence capable of expressing antimicrobial activity against at least one kind of bacteria or fungi, or a sequence of three or more consecutive amino acid residues. It suffices that the amino acid sequence constituting the sequence is an amino acid sequence (highly basic partial sequence) in which a majority of the amino acid residues are basic amino acids (that is, lysine or arginine), and is not limited to a specific amino acid sequence.
  • the amino acid sequence capable of expressing antibacterial activity against at least one kind of bacteria or fungi all or a part of the amino acid sequence of a conventional antibacterial peptide having a known primary structure can be used.
  • a relatively short antibacterial peptide generally called a defensin and composed of a peptide chain.
  • a defensin and composed of a peptide chain.
  • the majority of the partial sequence (3 or more amino acid residues) adjacent to the ⁇ -terminal and ⁇ or C-terminal of the LBS sequence is a basic amino acid residue (ie, lysine).
  • Arginine residue or arginine residue It is composed of 4 amino acid residues or more (more preferably 5 amino acid residues or more) adjacent to the N-terminal side and Z- or C-terminal side of the LBS sequence, and the 3Z4 (75% by number) or more amino acid residues are lysine or
  • a highly basic partial sequence that is any of arginine is preferred.
  • a highly basic partial sequence consisting of 5 amino acid residues or more and having 4Z5 (80% by number) or more amino acid residues (more preferably all of the amino acid residues) being either lysine or arginine, respectively. Particularly preferred.
  • the antimicrobial peptide of the present invention may include a partial sequence that is neither an LBS sequence nor an antimicrobial-related sequence, as long as the antimicrobial properties are not lost.
  • a partial sequence is preferably a sequence capable of maintaining the three-dimensional shape of the LBS sequence portion and the antimicrobial-related sequence portion in the peptide chain.
  • the antimicrobial peptide disclosed herein are those in which the total number of amino acid residues is 100 or less, and all the amino acids that constitute a peptide chain by one or more LBS sequences and one or more antimicrobial-related sequences 80% or more, more preferably 90% or more of the residues are occupied. Alternatively, those composed of these sequences and a linker portion (preferably consisting of one or several amino acid residues) interposed between the sequences are also suitable.
  • the antimicrobial peptides shown in SEQ ID NOS: 10 to 30 do not mean that preferred peptides, which are preferable specific examples of the antimicrobial peptides disclosed herein, are not limited to those having these amino acid sequences. For example, one or more amino acid residues of the sequence shown in SEQ ID NOS: 10-30 Conservatively substituted sequences are also preferred as antimicrobial peptides of the present invention.
  • antimicrobial peptides disclosed in the present specification those having a relatively short peptide chain can be easily produced according to a general chemical synthesis method.
  • a deviation from the known solid-phase synthesis method or liquid-phase synthesis method may be employed.
  • the solid-phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or iFmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for the amino group is preferable.
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be prepared by a solid-phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (for example, commercially available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.), the desired amino acid sequence, modification (C-terminal amidation). Etc.) can be synthesized.
  • a commercially available peptide synthesizer for example, commercially available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.
  • the desired amino acid sequence, modification C-terminal amidation
  • Etc. can be synthesized.
  • the antimicrobial peptide of the present invention may be biosynthesized based on genetic engineering techniques! / ⁇ .
  • This approach is suitable for producing a polypeptide having a relatively long peptide chain. That is, a DNA having a nucleotide sequence (including an ATG initiation codon) encoding the amino acid sequence of the desired antimicrobial peptide is synthesized.
  • the DNA and various regulatory elements for expressing the amino acid sequence in host cells including a promoter, a ribosome binding site, a terminator, an enhancer, and various cis elements for controlling the expression level).
  • a recombinant vector having the expression gene construct is constructed depending on the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell) by a general technique, and the host cell or a tissue containing the cell is obtained under a predetermined condition. And cultivate the individual. This allows the target polypeptide to be expressed and produced in the cell. Then, by isolating and purifying the polypeptide from the host cell (in the medium if secreted), the desired antimicrobial peptide can be obtained.
  • a predetermined host cell eg, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (eg, a yeast, an insect cell, a plant cell, or a mammalian cell) by a general technique, and under the predetermined conditions, the host cell or a tissue or individual containing the cell. Is cultured. This allows the target polypeptide to be expressed and produced in the cell. By isolating and purifying the polypeptide from the host cells (in the medium if secreted), the desired antimicrobial peptide can be obtained. it can.
  • a predetermined host cell eg, a yeast, an insect cell, a plant cell, or a mammalian cell
  • the method of constructing the recombinant vector and the method of introducing the constructed recombinant vector into host cells can be achieved by directly adopting the methods conventionally used in the art.
  • a fusion protein expression system can be used for efficient mass production in host cells. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the desired antimicrobial peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is expressed in an appropriate fusion protein expression vector (for example, the pET series and Amersham provided by Novagen).
  • GST Glutathione
  • pGEX series provided by BioScience
  • S-transferase fusion protein expression vector
  • a host cell typically, Escherichia coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare a target fusion protein.
  • the protein is extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the liberated target peptide fragment (designed antimicrobial peptide) is recovered by a method such as affinity-mouth chromatography.
  • a conventionally known fusion protein expression system for example, the GSTZHis system provided by Amersham Biosciences
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be produced.
  • type III DNA ie, a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of an antimicrobial peptide
  • a cell-free protein synthesis system is constructed, and various compounds necessary for peptide synthesis (ATP, RNA polymerase, Amino acids, etc.) and the so-called cell-free protein synthesis system can be used to synthesize the desired polypeptide in vitro.
  • various compounds necessary for peptide synthesis ATP, RNA polymerase, Amino acids, etc.
  • the so-called cell-free protein synthesis system can be used to synthesize the desired polypeptide in vitro.
  • the cell-free protein synthesis system see, for example, Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001)), Madin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2), 559-564 (2000)).
  • the desired antimicrobial peptide can be easily produced by the cell-free protein synthesis system according to the amino acid sequence.
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be easily produced based on Pure System (registered trademark) of Japan Post Genome Research Institute.
  • Single- or double-stranded polynucleotides containing the nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide of the present invention and Z or a nucleotide sequence complementary to the sequence can be easily produced by a conventionally known method (synthesis). can do. That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the antimicrobial peptide is easily determined and provided. Once the nucleotide sequence has been determined, a polynucleotide (single-stranded) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, the obtained double-stranded DNA can be obtained by using the obtained single-stranded DNA as type III and employing various enzymatic synthesis means (typically PCR).
  • the polynucleotide provided by the present invention may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA).
  • the DNA can be provided in double stranded or single stranded. When provided on a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a sequence complementary thereto.
  • the polynucleotide provided by the present invention can be used as a material for constructing a recombinant gene (expression cassette) for producing an antimicrobial peptide in various host cells or in a cell-free protein synthesis system. Can be used.
  • Some of the polynucleotides provided by the present invention encode antibacterial peptides having a novel amino acid sequence.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is 100 or less (preferably 50 or less, particularly preferably 20 or less), and SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, arrangement Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30, or one or more (eg, 2-3) amino acid residues of the sequence are conservatively substituted
  • a non-naturally occurring non-naturally occurring nucleic acid sequence comprising (or consisting essentially of) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence containing the amino acid sequence formed and a Z or a nucleotide sequence complementary
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21
  • SEQ ID NO: 22 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30, or one or more of said sequence
  • the antimicrobial peptide of the present invention has high antimicrobial activity, preferably has a relatively broad antimicrobial spectrum, and is suitably used as a main component of an antimicrobial agent.
  • an antimicrobial agent for example, it is used for the treatment of bacterial infections, disinfection of wound surfaces, prevention of eye diseases, mouthwashing (gargle), preservation and freshness preservation of foods, deodorization, sterilization or bacteriostatic of furniture and sanitary equipment surfaces.
  • the carrier contained in the antimicrobial agent that is, a secondary component (typically pharmaceutically acceptable depending on the application) may vary depending on the application and form of the antimicrobial agent. , Various fillers, extenders, binders, humectants, surfactants, excipients, dyes, fragrances and the like.
  • the antibacterial agent there is no particular limitation on the form of the antibacterial agent.
  • typical forms of internal or external preparations include ointments, solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, and capsules.
  • physiological saline or an appropriate buffer (eg, PBS) or the like to prepare a lyophilized product or granule for preparing a drug solution.
  • PBS physiological saline or an appropriate buffer
  • the process itself of preparing various forms of drugs (compositions) using the antimicrobial peptide (main component) and various carriers (subcomponents) as materials can be performed according to conventionally known methods. It does not characterize the present invention! A detailed source of information on treatment is, for example, Comprehensive Medicinal Chemistry, supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990).
  • the antibacterial agent provided by the present invention can be used in a method and dosage depending on its form and purpose.
  • the antimicrobial peptides disclosed herein maintain high antimicrobial activity even in systems where relatively high concentrations of salts (eg, salted sodium) or organic substances such as serum are present. I get it. Therefore, it is also suitable for use in a system (field) where salts, serum, and the like are present.
  • the antimicrobial agent provided by the present invention can be administered as a liquid to a patient by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or intraperitoneal injection or ileum.
  • solid forms such as tablets can be administered orally.
  • a liquid containing a relatively large amount of antimicrobial peptide e.g., 11 mg / ml
  • the surface of the object may be wiped with a cloth or paper wet with the liquid agent.
  • the antimicrobial peptides disclosed herein can exhibit high antimicrobial activity against bacteria that cause infection (eg, Staphylococcus aureus). Therefore, the antimicrobial peptide of the present invention is useful as a main component of an antimicrobial agent.
  • the polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material for so-called gene therapy.
  • a gene typically, a DNA segment or an RNA segment
  • an antimicrobial peptide is inserted into an appropriate vector and introduced into a target site, so that the antimicrobial peptide according to the present invention is always in vivo (cells). Can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antimicrobial peptide of the present invention can cause bacterial infection to the above patients and the like. It is useful as a preventive or therapeutic agent.
  • the antimicrobial peptide disclosed in the present specification has extremely low toxicity to mammalian cells and tissues (see Examples described later), and exhibits an antimicrobial activity selectively to bacteria. Therefore, it is extremely useful as an agent for preventing bacterial infection of cultured organs and the like.
  • organs or the like during culture can be added by adding an antimicrobial peptide of the present invention alone or an antimicrobial agent containing the peptide as a main component to a culture solution at an appropriate concentration. Bacterial infection can be prevented.
  • a polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material for gene therapy in cultured cells or tissues.
  • a gene encoding the antimicrobial peptide of the present invention typically, a DNA segment or an RNA segment
  • a gene encoding the antimicrobial peptide of the present invention is inserted into an appropriate vector and introduced into a target cultured tissue, so that the cultured tissue is always or at a desired time. It is possible to express the antimicrobial peptide according to the present invention in (cells). Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antimicrobial peptide of the present invention provided by the present invention is useful as an agent for preventing bacterial infection of cultured tissues.
  • polypeptides A total of 27 types of polypeptides (samples 121 and comparative samples 117) were produced using a peptide synthesizer described later. Table 1 lists the amino acid sequences of these polypeptides.
  • each of Samples 112 has an LBS sequence consisting of 6 amino acid residues shown in any of SEQ ID NOs: 119 (underlined portions in Table 1). You. It also has an antimicrobial-related sequence consisting of 410 amino acid residues adjacent to the C-terminal side and the Z- or N-terminal side of these LBS sequences. In Table 1, it is the part shown in italics. That is, the samples 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 and 21 are located on the N-terminal side of the LBS sequence. It has a highly basic partial sequence consisting of 9 amino acid residues. Samples 4, 5, 17 and 20 have 411 amino acid residues at the C-terminal side of the LBS sequence.
  • sample 17 has a highly basic partial sequence consisting of 4 amino acid residues on both the C-terminal side and the N-terminal side of the LBS sequence.
  • sample 20 has the ability to have a highly basic part distribution sequence with as much as 10 amino acid residues on the C-terminal side of the LBS sequence.
  • the three amino acid residues at the C-terminus ⁇ VGR '' are the known antimicrobial peptide ⁇ Protedarin 1
  • an amino acid sequence capable of expressing antibacterial activity against the at least one kind of bacteria or fungi according to the present example.
  • Sample 21 has 3 amino acid residues “KPV” on the C-terminal side of the LBS sequence. This KPV sequence corresponds to the C-terminal sequence of ⁇ -MSH, and is a preferred example of an amino acid sequence capable of expressing antibacterial activity against the at least one kind of bacteria or fungi.
  • 1,6,7,8,9,10,11,12,14,16 and 18 at the C-terminus of the peptide chain 1 or 2 amino acid residues that are neither LBS sequence nor antibacterial related sequence Being done.
  • antimicrobial properties can be improved by adding R to the C-terminus of the peptide chain.
  • Comparative Sample 1 is an 11 amino acid residue peptide having an LBS sequence (SEQ ID NO: 1) but no antimicrobial-related sequence.
  • Comparative sample 2 is a 4-amino acid residue peptide having neither the LBS sequence nor the antimicrobial-related sequence.
  • Comparative sample 3 is a 6 amino acid residue peptide consisting of only the LBS sequence (SEQ ID NO: 1).
  • Comparative sample 4 is a 12 amino acid residue peptide having an LBS sequence (SEQ ID NO: 6) but no antimicrobial-related sequence.
  • Comparative sample 5 is a 14 amino acid residue peptide having two LBS sequences (SEQ ID NOs: 1 and 9) in tandem but no antimicrobial-related sequence.
  • Comparative samples 6 and 7 are peptides of 12 amino acid residues each having an antimicrobial-related sequence (highly basic partial sequence) but no LBS sequence.
  • polypeptides (all having 20 amino acid residues or less) was synthesized by a solid phase synthesis method (Fmoc method) using a commercially available peptide synthesizer (PEPTIDE SYNTHESIZER 9050, manufactured by PerSeptive Biosystems).
  • HATU Applied Biosystems
  • the resins and amino acids used in the solid phase synthesis were purchased from NOVA biochem. It was.
  • "Rink Amide resin (100-200 mesh) was used as a solid phase carrier.
  • the Fmoc-amino acid force that binds to the resin by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction according to the synthesis program of the above peptide synthesizer also extends the peptide chain, and the synthetic peptide having the desired chain length is obtained.
  • Fmoc which is an amino protecting group for amino acids
  • DMF piperidine Z-dimethylformamide
  • 4 eq of each Fmoc-amino acid (OH) was reacted, and the operation of washing with DMF was repeated.
  • the Fmoc group was cleaved with 20% piperidine ZDMF, and the reaction product was washed in the order of DMF and methanol.
  • the synthesized peptide chain was transferred to a centrifuge tube together with the resin, and 1.8 mL of ethanediol, 0.6 mL of m-talesol, 3.6 mL of thioanol and 24 mL of trifluoroacetic acid were added, and the mixture was added at room temperature. Stir for 2 hours. Thereafter, the resin bound to the peptide chain was removed by filtration.
  • a precolumn product of Nippon Waters Co., Ltd., Guard-Pak Delta-pak C18 A300
  • a CI 8 reverse phase column product of Nippon Waters Co., Ltd., XTerra (registered trademark) column, MS C18, 5 / zm , 4.6 ⁇ 150 mm
  • MS C18, 5 / zm product of Nippon Waters Co., Ltd., XTerra (registered trademark) column, MS C18, 5 / zm , 4.6 ⁇ 150 mm
  • the molecular weight of each eluted polypeptide was determined using MALDI-TOF / MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry: matrix-assisted laser ionization, time-of-flight mass spectrometry using Voyager DE RP (trademark) manufactured by PerSeptive Biosystems). Analysis). As a result, it was confirmed that the target polypeptide was synthesized and purified.
  • the antimicrobial peptide (sample 120) of the present invention has antibacterial activity (minimum inhibitory concentration) against Gram-negative bacteria (Escherichia coli: E. coli IFO 3972) and Gram-positive bacteria (S. aureus IFO 12732). : MIC) was determined by a liquid medium dilution method using a 96-well (Pell) microplate.
  • a drug (synthetic polypeptide) solution having a concentration 40 times higher than the highest test concentration is prepared in sterile distilled water, and the drug concentration is 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.1. , 1.6 and 0.8 M liquid broth medium (ie, a medium prepared by adjusting the cations of DIFCO's product "Mueller Hinton Broth” as follows: CaCl.2 ⁇ 03.68 g purified
  • the polypeptide having the C-terminal amidated (Sample 1) exhibited higher antibacterial activity than the polypeptide having the same sequence in which the C-terminal was not amidated (Sample 16). From the results shown in Table 2, it was confirmed that the antibacterial peptide of the present invention had excellent antibacterial activity and a broad antibacterial spectrum.
  • the antimicrobial activity (MIC) against Gram-positive bacteria (S. aureus) in the presence of serum was examined by the same method as in Example 2. That is, first, a drug (synthetic polypeptide) solution having a concentration 40 times higher than the highest test concentration is prepared in sterile distilled water, and the drug concentration is 50, 25, 12.5, 6.3, 3.1, 1.6. And a liquid broth medium to which 0.8M and 10%, 20% or 50% by mass of the whole medium are added with poma serum (filtered and sterilized by Nippon Biotest Co., Ltd.) In the same manner as in Example 2, Muller Hinton Processes) in which cations were adjusted in advance were produced.
  • Example 3 shows the results.
  • Sample X in the table is a sample obtained by mixing sample 1 and sample 16 at a mass ratio of 1: 1. -In the table indicates unmeasured.
  • the polypeptide of the present invention is higher than the polypeptide of the comparative control even in the presence of serum! (4) It was confirmed that the antibacterial activity could be maintained. Therefore, the antimicrobial peptide of the present invention is suitable for use in a system in which an organic substance such as serum is present in a relatively large amount (for example, in blood).
  • Sample 21 containing both an amino acid sequence capable of exhibiting antibacterial activity against the at least one kind of bacteria or fungi (here, a KPV sequence) and a highly basic partial sequence together with the LBS sequence as an antibacterial-related sequence is particularly highly antibacterial. Activity was shown.
  • the antibacterial activity of the antibacterial peptide according to the present invention against fungi was examined as follows in accordance with a general antifungal susceptibility test.
  • a slant or a plate medium (a “potato 'dextrose agar” product manufactured by DIFCO, which is used as a standard medium) that has been cultured in advance and on which spores (conidia) have formed, A. niger (IFO 6341; for JIS) Test strain) with a disposable loop (1 ⁇ L), removing the medium surface from the bottom to the top by four to five times, and collecting the PBS (Mg) containing 0.05% surfactant (Tween (registered trademark) 80). , Ca-free) solution in 25 mL. Then, pipetting was performed using a pipette or the like so that the mass of black spores was completely eliminated.
  • a slant or a plate medium a “potato 'dextrose agar” product manufactured by DIFCO, which is used as a standard medium
  • PBS PBS
  • Tween registered trademark
  • the spore suspension is diluted appropriately with the above-mentioned surfactant-containing PBS solution to give a spore concentration of about 2.5 ⁇ 10 5 ZmL.
  • the two synthesized polypeptides (samples 1 and 3) and benzalco-chloride for comparison of antifungal activity were each dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.0), and the drug concentration was 2.OmgZmL.
  • a stock solution was prepared. These were sequentially diluted to prepare various reagents having drug (each polypeptide or benzalco-chloride) concentration of 400, 200, 100, 50, 25, 5, and 0.5 gZmL.
  • drug each polypeptide or benzalco-chloride
  • each of the above concentrations of the drug was added to a 96-well (well) microplate at 40 L / well.
  • the surplus drug was stored in a refrigerator (4 ° C) for use in the mycelial growth inhibition test performed later.
  • RPMI1640 medium RPMI1640 (product of Irvine Scientific) containing 2 parts by mass of Alamar Blue Fluorescent Reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.165 M MOPS per 10 parts by mass of the above spore suspension 5.2 After dissolving 2g and NaHCO 1.Og in 450mL of sterile distilled water,
  • the bacterial solution was added in 160 L portions to the wells to which the above-mentioned drug had been added.
  • 160 L of added calo was added to empty wells to which no drug was added for the mycelium growth inhibition test. After the addition, the cells were cultured in a humid environment in a 30 ° C incubator for 16 hours.
  • the plate was removed from the incubator, and the presence or absence of hyphal growth (growth) was checked microscopically for each well for the mycelial growth inhibition test (that is, the well filled with only the test bacterial solution).
  • the wells with confirmed hyphal growth (growth) were stored in the above refrigerator (4 ° C) and 40 ⁇ L of each of the drugs was added. After the addition, the plate was returned to the incubator at 30 ° C. in a humid environment, and the culture was continued.
  • the polypeptide according to the present invention was able to exhibit high antibacterial activity against fungi such as A. niger (power plants, yeasts).
  • fungi such as A. niger (power plants, yeasts).
  • the present invention provides an antifungal agent containing any of the antimicrobial peptides disclosed herein for use in vivo or in vitro.
  • Example 22 a polypeptide having an amino acid sequence of LKRKLQRWYWLL (sample 22) consisting of a total of 13 amino acid residues was synthesized.
  • the carboxyl group (one COOH) of the C-terminal amino acid of this polypeptide is amidated (one CONH)! /.
  • the C-terminal sequence “WYWLL” of this synthetic polypeptide constitutes the same LBS sequence as in sample 9, and is N-terminal to the LBS sequence.
  • the sequence “LKRKLQR” constitutes an antimicrobial-related sequence (highly basic partial sequence) similar to that of samples 15 and 18! /.
  • amphotericin B a product of Bristol-Myers
  • tetracycline a product of Bristol-Myers
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • an antibacterial agent prepared by suspending a test substance ie, the polypeptide of Sample 22
  • a 10% gum arabic solution was orally administered.
  • the dose of the suspension was 100 mgZkg.
  • There were five test mice per test group (each test group), and the test was conducted in a total of five groups.
  • an antibacterial agent prepared by suspending vancomycin in a 10% gum arabic solution was orally administered to test mice under the same conditions.
  • test mice were sacrificed, the contents of the intestinal tract were collected, and the number of MRSA bacteria was examined. That is, 1.8 mL of physiological saline was added to about 0.2 g of intestinal tract contents and stirred. An aliquot was spread on a Mannit agar medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical) containing gentamicin (GM) at a concentration of 20 ⁇ mZmL, and cultured at 37 ° C. for 3 days. Then, the number of bacteria that appeared on the medium was counted. Table 5 shows the results.
  • the drug containing the polypeptide of sample 22 according to the present example showed an effect equivalent to that of the drug containing vancomycin as a comparison.
  • Table 5 MR SA bacteria of intestinal contents of each administration group (X 10 3 cells / g)

Abstract

　本発明によって提供される抗菌ペプチドは、天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチドであって、ラミニン結合部位（ＬＢＳ）を構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち１若しくは複数のアミノ酸残基を同類置換した配列を有し、且つ、少なくとも１種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列を有る。好ましくは、全アミノ酸残基数が１００以下である。

Description

明 細 書
抗菌ペプチド及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、天然には存在しない形態の独立したペプチド鎖から成る抗菌性を有す るオリゴペプチド又はポリペプチド（以下「抗菌ペプチド」という。）及びその利用、特 に該抗菌ペプチドを主成分とする抗菌剤 (組成物）に関する。
背景技術
[0002] 抗菌ペプチドは一般に幅広!/、抗菌スペクトルを有し、薬剤耐性菌が出現し難!、と 考えられていることから、ヒト及び動物の細菌感染性疾患の予防や治療、或いは、食 材等の物品に抗菌性を付与する目的での利用が期待されている。これまでに多くの 抗菌ペプチドが種々の動植物から単離されて 、る。
[0003] 例えば、国際公開第 W098Z51794号パンフレット、国際公開第 W099Z2697 1号パンフレット、国際公開第 WOOOZ09553号パンフレット、国際公開第 WOOOZ 59527号パンフレツ卜、国際公開第 WO01Z09175号パンフレツ卜、特開 2000— 63 400号公報、特開 2001— 186887号公報、エレナ 'ァルディ一二ら（Elena Ardini et al.)、「発生過程において二つの機能を得たリボソームタンパク質起源の 67kDaラミ -ンレセプタ ~~ (The 67- kDa Laminin Receptor Originated from a Ribosomal Protein that Acquired a Dual Function During Evolution)」、モレキュフ ~~ 'ノィォロン1 ~~ '了 ンド.エボリユーシヨン（Molecular Biology and Evolution)、 15卷 8号、 1998年、 p. 10 17— 1025等に記載の抗菌ペプチドが知られている。
[0004] 上記の各公報に記載の抗菌ペプチドは、何れも自然界にお!/、て元々抗菌ペプチド として存在して ヽるものを発見し単離したもの（或いは単離した天然型抗菌ペプチド のアミノ酸配列を一部改変したペプチド)である。これら本来的に抗菌ペプチドとして 存在するペプチドを主成分とする限り、自然界にお 、て元来そのペプチドが奏して!/ヽ た抗菌活性や抗菌スぺ外ルを上回る抗菌性能を有する抗菌剤を開発することは困 難である。
本発明は、従前の抗菌ペプチド含有抗菌剤の開発アプローチによらず、自然界に ぉ 、て抗菌ペプチドとして存在し機能して 、るペプチドとは異なる人為的に設計され たアミノ酸配列力 成る抗菌ペプチド及び該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを 提供することを目的の一つとする。また、そのような抗菌ペプチドを主成分とする抗菌 剤 (薬学上の組成物)の提供を目的の一つとする。
発明の開示
[0005] 本発明によって提供される抗菌ペプチドは、従前知られて!/、る抗菌ペプチドとは異 なるアプローチにより開発されたペプチドである。すなわち、自然界において抗菌べ プチドとして存在するポリペプチドとは異なるポリペプチドに含まれるアミノ酸配列を 利用して創出された抗菌ペプチドである。
本明細書に開示される一つの天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチド は、ラミニン結合部位 (laminin binding site : LBS)を構成するアミノ酸配列から選択さ れる少なくとも 6個の連続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しく は複数のアミノ酸残基を同類置換した配列を有し、且つ、少なくとも 1種の細菌又は 真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列を有するペプチドである。好ましくは、 全アミノ酸残基数が 100以下である。
[0006] また、本明細書に開示される他の一つの天然に存在しない人為的に設計された抗 菌ペプチドは、ラミニン結合部位 (LBS)を構成するアミノ酸配列から選択される少な くとも 6個の連続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数の アミノ酸残基を同類置換した配列を有し、且つ、前記配列の N末端側及び Z又は C 末端側に隣接する部分配列であって、 3個以上の連続するアミノ酸残基から成り該配 列を構成するアミノ酸残基の過半数はリジン又はアルギニンである高塩基性部分配 列を有するペプチドである。好ましくは、全アミノ酸残基数が 100以下である。
[0007] ここで「天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチド」とは、そのペプチド鎖 がそれのみで独立して自然界に存在するものではなぐ人為的な化学合成或いは生 合成 (即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され得るペプチド断片をいう。ここ で「抗菌ペプチド」とは、少なくとも一種の微生物に対して抗菌活性を示す複数のぺ プチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるァミノ 酸残基の数によって限定されない。アミノ酸残基数が 10程度までのオリゴペプチド或 いはそれ以上のアミノ酸残基力 成るポリペプチドも本明細書における抗菌ペプチド に包含される。なお、ここで「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ぺプチ ド鎖の N末端アミノ酸及び C末端アミノ酸を包含する用語である。
[0008] 本発明者は、非コラーゲン性糖タンパク質であるラミニンに対する受容体 (レセプタ 一）として機能するタンパク質中のラミニン結合部位 (LBS)として知られて 、る部分の アミノ酸配列の一部と、前記所定の配列すなわち前記少なくとも 1種の細菌又は真菌 に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列及び Z又は前記高塩基性部分配列（以下 これらを総称して「抗菌関連配列」 t 、う。 )とを合わせて設計したペプチド鎖が種々 の微生物に対して高い抗菌活性を発揮し得ることを見出し、本発明を完成するに至 つた。ここでラミニン結合部位というときは、特に言及している場合を除き、特定の生 物起源、特定のアミノ酸配列に限定されず、ラミニンレセプターのラミニン結合部位を 構成するアミノ酸配列として知られているアミノ酸配列によって特定されるもの全般を 指す。
本発明の抗菌ペプチドは、主要構成要素として「LBSを構成するアミノ酸配列 (即 ち LBSを構成するものとして知られているアミノ酸配列）のうちから選択される少なくと も 6個の連続するアミノ酸残基力 成る配列または該配列のうち 1若しくは複数のアミ ノ酸残基を同類置換した配列」（以下「LBS配列」と略称する。）を包含することによつ て、グラム陰性細菌及び Z又はグラム陽性細菌或いは真菌に対して高い抗菌活性を 発揮し得る。
[0009] 好ましい抗菌ペプチドは、前記少なくとも 6個の連続するアミノ酸残基から成る配列
(即ち LBS配列） 1S 配列番号 1一 9のいずれかに示されるアミノ酸配列であるか或い は該アミノ酸配列を含む配列であることを特徴とする。これら配列番号に示される配 列は、ラミニンとの結合に深く関与することが知られているノ リンドローム配列（例えば 配列番号 1)又は同様のラミニン結合機能を有する同類の配列である（上記非特許文 献 1参照)。これら配列 (該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を同類置換した配 列であり得る。）を含む LBS配列と、前記抗菌関連配列とを有することによって、ダラ ム陰性細菌及び Z又はグラム陽性細菌或いは真菌に対して特に高い抗菌活性を発 揮し得る。 力かる構成の抗菌ペプチドとして特に好ましいものに、配列番号 10— 30のいずれ かに示されるアミノ酸配列または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を同類置 換した配列を含む又は該配列力も成るペプチドがある。
[0010] また、抗菌ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミドィ匕されているものが好 ま ヽ。アミノ酸残基 (典型的にはペプチド鎖の C末端アミノ酸残基)のカルボキシル 基のアミドィ匕により、抗菌ペプチドの構造安定性 (例えばプロテアーゼ耐性)を向上さ せ得る。
また、抗菌ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 20以下であるも のが好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に抗 菌ペプチドを提供することができる。
[0011] また、本発明は、本明細書に開示される抗菌ペプチドの製造方法を提供する。すな わち、本発明によって提供される一つの抗菌ペプチド製造方法は、 LBSを構成する アミノ酸配列（即ち LBSとして知られる配列）から選択される少なくとも 6個の連続する アミノ酸残基力 成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を同類 置換した配列を決定することと、前記決定した配列と少なくとも 1種の細菌又は真菌 に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列とを有するペプチド鎖を設計することと、該 設計したペプチド鎖を合成することとを包含する。
また、他の一つの抗菌ペプチド製造方法は、 LBSを構成するアミノ酸配列として知 られる配列（即ち LBSとして知られる配列）力 選択される少なくとも 6個の連続するァ ミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を同類置 換した配列を決定することと、前記決定した配列と、その N末端側及び Z又は C末端 側に隣接する部分配列であって 3個以上の連続するアミノ酸残基力 成り該配列を 構成するアミノ酸残基の過半数はリジン又はアルギニンである高塩基性部分配列と を有するペプチド鎖を設計することと、該設計したペプチド鎖を合成することとを包含 する。
好ましくは、前記ペプチド鎖の設計において、全アミノ酸残基数が 100以下である ペプチド鎖を設計する。鎖長が短!、抗菌ペプチドは例えば一般的な化学合成法によ つて容易に製造及び精製することができる。 [0012] また、本発明は、本明細書に開示される少なくとも一つの抗菌ペプチドと、薬学的 に許容され得る担体とを含む抗菌剤 (典型的には医療分野又は衛生分野において 使用し得る組成物）を提供する。全アミノ酸残基数が 100以下（更に好ましくは 20以 下）の抗菌ペプチドを主成分とする抗菌剤が好まし 、。このような鎖長の短 ヽぺプチ ド (即ち比較的低分子量の抗菌ペプチド)を含む抗菌剤は取扱いが容易であり、生 体内及び Z又は生体外での利用に好適な抗菌剤となり得る。
[0013] また、本発明は、本明細書に開示されるいずれかの抗菌ペプチドをコードするヌク レオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むか或いはそれら 配列により実質的に構成される、天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレオ チドを提供する。ここで「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステ ル結合で結ばれたポリマー (核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定 されない。種々の長さの DNAフラグメント及び RNAフラグメントが本明細書における ポリヌクレオチドに包含される。また、「天然に存在しない人為的に設計されたポリヌク レオチド」とは、そのヌクレオチド鎖 (全長）がそれ単独で自然界に存在するものでは なぐ化学合成或いは生合成 (即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合 成されるポリヌクレオチドを！、う。
好まし 、ポリヌクレオチドとして、配列番号 10— 30の!、ずれかに示されるアミノ酸配 列 (または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を同類置換した配列）をコード するヌクレオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むか或い はそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチドがある。
[0014] 本発明により提供される LBS配列と前記抗菌関連配列とを含む一次構造の抗菌べ プチドは、種々のグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌に対して高い抗菌活性を発揮し 得る。このため、本発明の抗菌ペプチドは抗菌剤の主構成要素として利用することが できる。また、そのような抗菌ペプチドを含む抗菌剤は、生体内或いは生体外におい て使用することができる。
[0015] <配列表フリーテキスト >
配列番号 10 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド。
配列番号 11 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド。 配列番号 12 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 13 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 14 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 15 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 16 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 17 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 18 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 19 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 20 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 21 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 22 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 23 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 24 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 25 設計された抗菌ペプチド。
配列番号 26 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 27 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 28 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 29 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 30 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 配列番号 31 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 32 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 33 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 34 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 35 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 36 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 37 末端にアミド基を含む、設計されたペプチド。 配列番号 38 末端にアミド基を含む、設計された抗菌ペプチド ( 発明を実施するための最良の形態 [0016] 以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及し て 、る事項 (例えば抗菌ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の 実施に必要な事柄 (例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチドを成分とす る抗菌剤 (薬剤組成物)の調製に関するような一般的事項)は、有機化学、生化学、 遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、薬学、医学、衛生学等の分野における 従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開 示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。 なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸を IUPAC-IUBガイドラインで示された アミノ酸に関する命名法に準拠した 1文字表記 (但し配列表では 3文字表記)で表す
[0017] 本明細書において開示される抗菌ペプチドは、天然に存在しない人為的に設計さ れたペプチドであり、 LBS配列と抗菌関連配列とを有する短 、ポリペプチドまたはォ リゴペプチドである。すなわち、本発明の抗菌ペプチドは、 LBS配列と抗菌関連配列 とが相互に近接して存在しているペプチド断片という点で、天然に存在する種々のポ リペプチド (ペプチド鎖）と明確に区別される物質である。
好ましくは、全体のアミノ酸配列に対する LBS配列及び抗菌関連配列の占める割 合が 40個数％以上であり、この割合がペプチド鎖を構成する全アミノ酸の 70個数％ 以上が更に好ましぐ 90個数％以上が特に好ましい。
本発明の抗菌ペプチドは、全てのアミノ酸残基が L型アミノ酸であるものが好ましい 力 抗菌活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部が D型アミノ酸 に置換されて 、るものであってもよ 、。
[0018] 本発明の抗菌ペプチドの鎖長 (アミノ酸残基数）は、含有する LBS配列及び Z又は 抗菌関連配列の長さに応じて異なり得るので特に限定されないが、全アミノ酸残基数 力 S 100以下、例えば 10— 100個程度のアミノ酸残基で構成されるものが好ましぐ 10 一 50個程度のアミノ酸残基で構成されるものがさらに好ましぐ 12— 20個程度のアミ ノ酸残基で構成されるものが特に好まし 、。
また、ペプチドのコンホメーシヨン（立体構造）については、使用する環境下で抗菌 性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原 (抗原）になり難 V、と 、う観点力 直鎖状又はへリックス状のものが好まし 、。このような形状のぺプチ ドはェピトープを構成し難い。かかる観点から、抗菌剤に適用する抗菌ペプチドとし ては、直鎖状であり比較的低分子量 (典型的にはアミノ酸残基数： 10— 30、例えば アミノ酸数： 10— 20)のものが好適である。
[0019] 抗菌ペプチドを構成するための LBS配列としては、従来、各種の生物 (真核生物又 は原核生物)から発見され、ラミニン結合部位を構成する配列として知られて 、るアミ ノ酸配列（天然タイプ: native type)力 選択される少なくとも 6個の連続するアミノ酸 残基力 成る配列の何れかをその配列のまま利用することができる。具体例としては 、上記非特許文献 1にお 、ても紹介されて ヽる LBSを構成するアミノ酸配列として知 られる配列から選択される 6個の連続アミノ酸残基から成る以下の 9種の配列: LMW WML (配列番号 1)； LMWWLL (配列番号 2)； CLFWLL (配列番号 3)； LIWYLL (配列番号 4)； VVYWLL (配列番号 5)； LYLGAV (配列番号 6)； LITSKM (配列 番号 7)； FFYMVI (配列番号 8)； LLTAKM (配列番号 9)が挙げられる。これらのう ちの 1種類或いは 2種類以上を LBS配列（又はその一部）として含むペプチドが好ま しい。例えば、好適な具体例として後述する配列番号 10— 30 (表 1)に示すような、 配列番号 1一 9の何れかをそのまま LBS配列とする抗菌ペプチドが好ましい。
LBS配列としては、天然タイプ (native type)の配列のみならず、抗菌性を損なわな い限りにおいて、種々の部分的な改変が施された LBS配列を用い得る。例えば、こ の種の改変配列としては、配列中の数個（例えば 1一 3個）のアミノ酸残基が同類置 換されたもの、天然タイプの LBSを構成するアミノ酸配列から選択された少なくとも 6 個の連続するアミノ酸残基から成る配列の N末端及び Z又は C末端に 1個又は 2— 3 個のアミノ酸が付加されたもの、 C末端アミノ酸 (即ちペプチド鎖の C末端アミノ酸に相 当する。 )のカルボキシル基がアミドィ匕されたもの等が挙げられる。
[0020] 本発明の抗菌ペプチドを構築するための抗菌関連配列としては、少なくとも 1種の 細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列、或いは 3個以上の連続す るアミノ酸残基カゝら成り該配列を構成するアミノ酸残基の過半数が塩基性アミノ酸 (即 ちリジンかアルギニン)であるアミノ酸配列（高塩基性部分配列)であればよく、特定の アミノ酸配列に限定されな 、。 少なくとも 1種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列として、一 次構造既知である従来の抗菌ペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を利用するこ とができる。一般にディフェンシンと呼ばれる比較的短 、ペプチド鎖から成る抗菌べ プチドの利用が好ましい。例えば、ザルコトキシンのような種々の昆虫由来の抗菌べ プチド、或いは α メラノサイト 刺激ホルモン（ α— MSH)、プロテグリン 1のような 哺乳類由来の抗菌性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部の使用が 好ま 、 (後述する実施例参照)。
[0021] 一方、上記高塩基性部分配列としては、 LBS配列の Ν末端側及び Ζ又は C末端側 に隣接する部分配列 (但し 3アミノ酸残基以上)の過半数が塩基性アミノ酸残基 (即ち リジン残基又はアルギニン残基）となるように構成されればよぐ特定のアミノ酸配列 に限定されな ヽ。 LBS配列の N末端側及び Z又は C末端側に隣接する 4アミノ酸残 基以上 (より好ましくは 5アミノ酸残基以上)で構成され、その 3Z4 (75個数％)以上 のアミノ酸残基がそれぞれリジンかアルギニンのいずれかである高塩基性部分配列 が好ましい。 5アミノ酸残基以上で構成され且つその 4Z5 (80個数％)以上のァミノ 酸残基 (より好ましくはその全てのアミノ酸残基）がそれぞれリジンかアルギニンのい ずれかである高塩基性部分配列が特に好ましい。
[0022] 本発明の抗菌ペプチドは、抗菌性を失わない限りにおいて、 LBS配列と抗菌関連 配列の何れでもない部分配列を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部 分配列としてはペプチド鎖における LBS配列部分及び抗菌関連配列部分の 3次元 形状を維持し得る配列が好まし ヽ。
ここで開示される抗菌ペプチドとして好ま ヽものに、全アミノ酸残基数が 100以下 であり、 1又は 2以上の LBS配列と、 1又は 2以上の抗菌関連配列とによりペプチド鎖 を構成する全アミノ酸残基の 80個数％以上、更に好ましくは 90個数％以上が占めら れるものが挙げられる。あるいはこれら配列と該配列間に介在するリンカ一部分 (好ま しくは 1一数個のアミノ酸残基から成る）とから構成されて 、るものも好適である。 配列番号 10— 30に示す抗菌ペプチドは、ここで開示される抗菌ペプチドの好適な 具体例である力 好適なペプチドがこれらアミノ酸配列のものに限定されることを意味 しない。例えば、配列番号 10— 30に示す配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基を 同類置換した配列もまた本発明の抗菌ペプチドとして好ましい。
[0023] 本明細書に開示される抗菌ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般 的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合 成法又は液相合成法の!/、ずれを採用してもよ ヽ。ァミノ基の保護基として Boc ( t— butyl oxycarbonyl)或 ヽ i Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) 適用した固ネ目合 成法が好適である。
本発明の抗菌ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、 PerSeptive Biosystems 社、 Applied Biosystems社等力 入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望 するアミノ酸配列、修飾 (C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することが できる。
[0024] 或 、は、遺伝子工学的手法に基づ!/、て本発明の抗菌ペプチドを生合成してもよ!/ヽ 。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適で ある。すなわち、所望する抗菌ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ ATG開始コドンを含む。）の DNAを合成する。そして、この DNAと該アミノ酸配列を 宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結 合部位、ターミネータ一、ェンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメント を包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞 に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞 (例えばイースト、昆 虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類)細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細 胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞 (分泌された場合は培地中） 力もポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の抗菌ペプチドを得ることが できる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞 (例えばィー スト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細 胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞 (分泌された場合は培地中） 力もポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の抗菌ペプチドを得ることが できる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導 入方法等は、当該分野で従来力 行われている方法をそのまま採用すればよぐ 力る方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する 例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システ ムを利用することができる。すなわち、 目的の抗菌ペプチドのアミノ酸配列をコードす る遺伝子 (DNA)を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用べク ター（例えばノバジェン社カも提供されて 、る pETシリーズおよびアマシャムバイオサ ィエンス社から提供されて 、る pGEXシリーズのような GST (Glutathione
S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該 ベクターにより宿主細胞 (典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体 を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製 する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ)で切断し、 遊離した目的のペプチド断片 (設計した抗菌ペプチド)をァフィ-テイク口マトグラフィ 一等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（ 例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供される GSTZHisシステムを利用し 得る。）を用いることによって、本発明の抗菌ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の铸型 DNA (即ち抗菌ペプチドのァミノ 酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合 成に必要な種々の化合物 (ATP、 RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆ る無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成する ことができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えば Shimizuらの論文（ Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751— 755(2001))、 Madinらの餘文（Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に 記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチド の受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、 日本の東洋 紡績（株）から入手可能な PROTEIOS (商標） Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
従って、上述のようにしてひとたび抗菌ペプチドのアミノ酸配列を決定 ·設計しさえ すれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の抗 菌ペプチドを容易に生産することができる。例えば、 日本の (株)ポストゲノム研究所 のピュアシステム (登録商標）に基づ 、て本発明の抗菌ペプチドを容易に生産するこ とがでさる。
[0026] 本発明の抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び Z又は該配列と相補的な ヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法に よって容易に製造 (合成)することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成 する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗菌ペプチドのァミノ 酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとた びヌクレオチド配列が決定されれば、 DNA合成機等を利用して、所望するヌクレオ チド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得ら れた一本鎖 DNAを铸型として用い、種々の酵素的合成手段 (典型的には PCR)を 採用して目的の二本鎖 DNAを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、 DNAの形態であってもよぐ RNA( mRNA等）の形態であってもよい。 DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一 本鎖で提供される場合は、コード鎖 (センス鎖)であってもよぐそれと相補的な配列 の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよ 、。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で 又は無細胞タンパク質合成システムにて、抗菌ペプチド生産のための組換え遺伝子 (発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
[0027] 本発明によって提供されるポリヌクレオチドのいくつかは、新規なアミノ酸配列の抗 菌ペプチドをコードする。
例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 100以下 (好ましくは 50以下、 特に好ましくは 20以下)であって、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番 号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列 番号 19、配列番号 20、配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配 列番号 25、配列番号 26、配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29又は配列番号 3 0で示されるアミノ酸配列或いは該配列の 1若しくは複数 (例えば 2— 3個）のアミノ酸 残基が同類置換されて形成されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするヌク レオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む (又はそれら配 列から実質的に構成された)天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレオチド が提供される。
また、配列番号 10、配列番号 11、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列 番号 15、配列番号 16、配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19、配列番号 20、配 列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24、配列番号 25、配列番号 26、 配列番号 27、配列番号 28、配列番号 29又は配列番号 30で示されるアミノ酸配列或 いは該配列の 1若しくは複数 (例えば 2— 3個）のアミノ酸残基が同類置換されて形成 されたアミノ酸配列力 実質的に構成される抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配 列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む (又はそれら配列力 実質 的に構成された)天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレオチドが提供され る。
[0028] 本発明の抗菌ペプチドは高い抗菌活性を有し、好ましいものでは更に比較的広い 抗菌スペクトルを有しており、抗菌剤の主成分として好適に用いられる。例えば、細 菌感染症の治療、創傷面の消毒、眼病予防、口腔内洗浄 (うがい)、食品の防腐や 鮮度保持、脱臭、家具や衛生機器表面の殺菌又は静菌等の目的に用いられる。 抗菌ペプチドの他、抗菌剤に含まれる担体すなわち副次的成分 (典型的には用途 に応じて薬学的に許容され得るもの）としては、抗菌剤の用途や形態に応じて適宜異 なり得るが、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素、 香料等が挙げられる。
[0029] 抗菌剤の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤若しくは外用剤の典型的 な形態として、軟膏、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠 剤、カプセルが挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又 は適当な緩衝液 (例えば PBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造 粒物とすることちでさる。 なお、抗菌ペプチド（主成分)及び種々の担体 (副成分)を材料にして種々の形態 の薬剤 (組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよぐかかる 製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもな!/ヽため詳細な説明は省略する。処 方に関する詳細な情報源として、例えば Comprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修， Pergamon Press刊（1990)が挙げられる。
[0030] 本発明によって提供される抗菌剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使 用することができる。
本明細書に開示される抗菌ペプチドは、比較的高い濃度の塩類 (例えば塩ィ匕ナトリ ゥム）或 ヽは血清のような有機物が存在する系にお 、ても高 ヽ抗菌活性を維持し得 る。従って、塩類や血清等が存在する系（場)での使用にも好適である。例えば、本 発明によって提供される抗菌剤は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しく は腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。
或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表 面の消毒 (殺菌)や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量 (例えば 1一 lOOmg/ml)の抗菌ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、 或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にす ぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等 と同じ形態、使用方法を適用することができる。
例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者にとって、細菌感染症の 予防及び治療は重大な関心事である。本明細書に開示される抗菌ペプチドは、感染 症の原因たる細菌（例えば黄色ブドウ球菌）に対して高い抗菌作用を示し得る。この ため、本発明の抗菌ペプチドは、抗菌剤の主成分として有用である。
[0031] また、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療 に使用する素材として用い得る。例えば、抗菌ペプチドをコードする遺伝子 (典型的 には DNAセグメント、或いは RNAセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的と する部位に導入することにより、常時生体 (細胞）内で本発明に係る抗菌ペプチドを 発現させることが可能である。従って、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレ ォチド (DNAセグメント、 RNAセグメント等）は、上述した患者等に対し、細菌感染を 予防し又は治療する薬剤として有用である。
[0032] 再生医療の分野にお!、て、皮膚、骨、各種の臓器の培養時の細菌感染を防止する ことは重要である。本明細書に開示される抗菌ペプチドは、哺乳動物細胞及び組織 に対する毒性が極めて低く（後述する実施例参照）、細菌に選択的に抗菌作用を示 す。このため、培養臓器等の細菌感染を防止する薬剤として極めて有用である。例え ば、後述する実施例に示すように、適当な濃度で本発明の抗菌ペプチド単独又は当 該ペプチドを主成分の一つとする抗菌剤を培養液中に添加することにより、培養中の 臓器等の細菌感染を防止することができる。
また、培養細胞や培養組織に対して、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌク レオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の 抗菌ペプチドをコードする遺伝子 (典型的には DNAセグメント又は RNAセグメント） を適当なベクターに組み込み、目的とする培養組織に導入することにより、常時或い は所望する時期に培養組織 (細胞）内で本発明に係る抗菌ペプチドを発現させること が可能である。従って、本発明によって提供される本発明の抗菌ペプチドをコードす るポリヌクレオチド (DNAセグメント、 RNAセグメント等）は、培養組織の細菌感染を 防止する薬剤として有用である。
[0033] 以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に 示すものに限定することを意図したものではない。
[0034] <実施例 1：抗菌ペプチドの合成 >
計 27種類のポリペプチド（サンプル 1一 21、比較サンプル 1一 7)を後述するぺプチ ド合成機を用いて製造した。表 1には、これらポリペプチドのアミノ酸配列を列挙して いる。
[0035] [表 1] 試料 No. ァミノ酸配列 総ァミノ酸残基数 サン/ル 1
Figure imgf000017_0001
(配列番号 10) 14 サンプル 2 RKKKRKVLMWWMhj NU (配列番号 1 1) 13 サンダル 3 (SR列番号 1 ) 13 サン ル 4
Figure imgf000017_0002
(ff1列番号 13) 13 サンフ'ル 5 LMWWMLRKKKRKV^n^ (配列番号 14) 1 3 サン ル 6 (配列番号 15) 15 サンフ。ル 7
Figure imgf000017_0003
(配列番 16 ) 15 サン ル 8 ^JlKKmKVLMWWMLR (配列番号 17) 14 サンフ'ル 9 RKKKRKWWYWLL rnr^-, (配列番号 18) . 14 サンフ。ル 10 (配列番号 19) 14 サンフ'ル 1 1 （配列番号 20) 14 サンフ。ル 12
Figure imgf000017_0004
(配歹1 J番号 21) 14 サンフ'ル 13 RKRKRKRIM SiML-comn (配列番号 22) 13 サンフ。ル 14 RKKLRLMWWMLLr n^ (配列番号 23) 14 サンプル 15 Z i/tiaQ/tIMWMdL-coNH2 (配列番号 24) 13 サンフ。ル 16 RKKKRKVLMWWMLR^nnu (配列番号 25) 14 サンフ' レ 17 列番号 26) 14 サン: 7'ル 18 列番号 27) 14 サンフ'ル 19 (配列番号 28) 15 サンフ°ル 20
Figure imgf000017_0005
(ffi列番 29) 16 サン,ル 21 RKKKRKVLMWWMLKPKrn (配列番号 30) 16 サンダル 22 LKRKLQRY∑YWLL-co 2 (配列番号 38) 13 比較サンフ'ル 1 RGDLMWWMLAR (配列番号 31) 1 1 比較サン ル 2 TGTG_C0NH2 (配列番号 32 ) 4 比較サンフ'ル 3
Figure imgf000017_0006
(配列番号 33 ) 6 比較サンフ'ル 4 RAVTLYLGAVAA (¾P,列番号 34 ) 12 比較サンアル 5 RTlTAKMLMWWMLR (配列番 ^35) 14 比較サンフ'ノレ 6 RIRKKLRYlGSicoNH2 (配列番号 36) 12 比較サンフ'ル 7 RKKKRKVYlGSTLcam (配列番号 37) 12
表 1に示すように、サンプル 1一 21は、いずれも配列番号 1一 9のいずれかに示す 6 アミノ酸残基から成る LBS配列（表 1にお 、てアンダーラインが付された部分)を有す る。また、それら LBS配列の C末端側及び Z又は N末端側に隣接して 4一 10アミノ酸 残基から成る抗菌関連配列を有する。表 1にお 、てイタリック体で示す部分である。 すなわち、サンプル 1, 2, 3, 6， 7, 8， 9, 10, 11, 12， 13， 14, 15, 16, 17, 18, 1 9及び 21は、 LBS配列の N末端側に 4一 9アミノ酸残基から成る高塩基性部分配列 を有する。サンプル 4, 5, 17及び 20は、 LBS配列の C末端側に 4一 10アミノ酸残基 から成る高塩基性部分配列を有する。このうちサンプル 17は、 LBS配列の C末端側 と N末端側の両方にそれぞれ 4アミノ酸残基から成る高塩基性部分配列を有する。ま た、サンプル 20は LBS配列の C末端側に 10アミノ酸残基力も成る高塩基性部分配 列を有する力 その C末端の 3アミノ酸残基「VGR」は、既知の抗菌ペプチド「プロテ ダリン 1」の C末端配列に相当し、本実施例に係る前記少なくとも 1種の細菌又は真 菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列でもある。また、サンプル 21は LBS配列 の C末端側に 3アミノ酸残基「KPV」を有する。この KPV配列は α— MSHの C末端配 列に相当し、前記少なくとも 1種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ 酸配列の好適例である。
サンプノレ 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16及び 18ίま、ペプチド鎖の C末端に: L BS配列及び抗菌関連配列の何れでもない 1又は 2アミノ酸残基が付加されて 、る。 一般にペプチド鎖の C末端に Rを付加することによって抗菌性を向上させ得る。
[0037] 一方、比較サンプル 1は LBS配列（配列番号 1)を有するが抗菌関連配列を有さな い 11アミノ酸残基のペプチドである。比較サンプル 2は LBS配列及び抗菌関連配列 の何れも有さない 4アミノ酸残基のペプチドである。比較サンプル 3は LBS配列（配列 番号 1)のみ力 成る 6アミノ酸残基のペプチドである。比較サンプル 4は LBS配列（ 配列番号 6)を有するが抗菌関連配列を有さない 12アミノ酸残基のペプチドである。 比較サンプル 5は 2つの LBS配列（配列番号 1, 9)をタンデムに有するが抗菌関連配 列を有さない 14アミノ酸残基のペプチドである。比較サンプル 6及び 7は抗菌関連配 列（高塩基性部分配列）を有するが LBS配列を有さないそれぞれ 12アミノ酸残基の ペプチドである。
表 1に示すように、サンプル 16を除き、 C末端アミノ酸のカルボキシル基 (一 COOH) はアミドィ匕 (一 CONH )されている。また、サンプル 8の N末端のアミノ基はァセチル化
2
(一 Ac)されている。
[0038] 上述した各ポリペプチド (何れも 20アミノ酸残基以下）は、市販のペプチド合成機 ( PEPTIDE SYNTHESIZER 9050、 PerSeptive Biosystems社製品）を用いて固相合成 法（Fmoc法）により合成した。なお、縮合剤として HATU (Applied Biosystems社製 品）を使用し、固相合成法に用いた榭脂及びアミノ酸は NOVA biochem社から購入し た。アミノ酸配列の C末端をアミド化する場合には、固相担体として「Rink Amide resin (100— 200 mesh)」を使用した。
而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反 応を反復して榭脂に結合する Fmoc—アミノ酸力もペプチド鎖を伸長していき、 目的 の鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、 20%ピぺリジン Zジメチルホルムアミド（ DMF) (ペプチド合成用グレード、関東ィ匕学 (株)製品）によって、アミノ酸のアミノ保 護基である Fmocを切断除去し、 DMFで洗浄し、 Fmoc -アミノ酸 (一 OH)各 4eqを反 応させ、 DMFで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終 了した後、 20%ピぺリジン ZDMFにより Fmoc基を切断し、 DMF、メタノールの順で 上記反応物を洗浄した。
[0039] 固相合成後、合成したペプチド鎖を榭脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール 1. 8 mL、 m—タレゾール 0. 6mL、チオア-ノール 3. 6mL及びトリフルォロ酢酸 24mLを 加え、室温で 2時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた榭脂を濾過して除 去した。
次いで、濾液に冷却エタノールをカ卩え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。 その後、遠心分離（2500rpmで 5分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジェ チルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行つ た。この撹拌と遠心分離の処理を計 3回反復して行った。
[0040] 得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ (Waters 600：
Waters社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本ウォーターズ (株）製品、 Guard- Pak Delta- pak C18 A300)及び CI 8逆相カラム（日本ウォーターズ (株)製品、 XTerra (登録商標)カラム、 MS C18、 5 /z m、 4.6 X 150mm)を使用し、 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液と 0. 1%トリ フルォロ酢酸ァセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。すなわち、溶離液に 含まれる上記トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ (容 積比で 10%から 80%への濃度勾配を設ける）、 1. 5mLZ分の流速で上記カラムを 用いて 30— 40分間の分離精製を行った。なお、逆相カラム力も溶離したペプチドは 紫外線検出器 (490E Detector： Waters社製品）を用いて波長： 220nmで検出され、 記録チャート上にピークとして示される。
また、溶離した各ポリペプチドの分子量を PerSeptive Biosystems社製の Voyager DE RP (商標）を用いて MALDI-TOF/MS (Matrix- Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry:マトリックス支援レーザーイオン化 飛行時間型 質量分 析)に基づいて決定した。その結果、目的のポリペプチドが合成'精製されていること が確認された。
[0041] <実施例 2 :合成ポリペプチドの抗菌活性（1) >
本発明に係る抗菌ペプチド (サンプル 1一 20)について、グラム陰性細菌（大腸菌： E. coli IFO 3972)及びグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌： S. aureus IFO 12732)に対 する抗菌活性 (最小阻止濃度： MIC)を 96穴（ゥエル)マイクロプレートを用いた液体 培地希釈法により求めた。
すなわち、先ず、滅菌蒸留水で最高試験濃度の 40倍の濃度の薬剤 (合成ポリぺプ チド)溶液を調製し、薬剤濃度が 100、 50、 25、 12. 5、 6. 3、 3. 1、 1. 6及び 0. 8 Mとなる液体肉汁培地（即ち、 DIFCO社製品「ミューラーヒントンブロス (Mueller Hinton Broth)」のカチオンを以下のように調整した培地： CaCl · 2Η 03. 68gを精製
2 2
水 100mLに溶解（ 1 Omg · Ca2+/mL)した後、その 500 Lをミューラーヒントンブロ ス lOOm 【こ添カ卩し、且つ、 MgCl · 6Η 08. 36gを精製水 lOOm 【こ溶解（10mg-
2 2
Mg2+/mL)した後、その 250 μ Lを該ミューラーヒントンブロス lOOmLに添カ卩したも の）をそれぞれ作製した。次いで、上記各濃度の薬剤含有液体肉汁培地を 96穴マイ クロプレートに lOOmLずつ充填した。
[0042] 一方、 37°Cで 18時間培養した寒天平板 (DIFCO社製品「ミューラーヒントン寒天
(Mueller Hinton Agar)」）上の被験菌体をループで搔き取り、滅菌生理食塩水に懸濁 した。 2 X 107cells/mL相当に調整した菌液 5 μ Lを上記マイクロプレートの各ゥエル に充填されている薬剤溶液にそれぞれ接種した (試験菌数： 1 X 106cells/mL) o接 種後、 37°Cの恒温器内で培養を開始し、 24時間後の濁度により菌発生の有無を調 ベた。その計測時における菌による濁度の増加が認められない最小薬剤濃度 (ポリ ペプチド濃度）を本実施例における MIC (単位： μ Μ)と定めた。結果を表 2に示す。 なお、比較対照としてポリミキシン Βを使用して同様に MICを求めた。 [表 2] 抗菌活性 (M I C : μ Μ)
Figure imgf000021_0001
E. coh Λ aureus
、、、
サンフ。 1 6.3 3.1
サンフ。 'レ 2 12.5 3.1
サンフ。 'レ 3 6.3 3.1
サンフ。 'レ 4 6.3 3.1
サンフ。レ 5 50 3.1
サンフ。 'レ 6 12.5 6.3
サンフ' 'レ 7 6.3 3.1
サンフ' 8 12.5 3.1
サンフ。 'レ 9 12.5 3.1
サンフ° レ 1 0 50 12.5
'U 1 6.3 3.1 η° 'レ 1 2 50 12.5
η° 'レ 1 3 6.3 3.1
η° 'レ 1 4 6.3 3.1
'す 'レ 1 5 12.5 3.1
η" レ 1 6 12.5 3.1
η" 'レ 1 7 6.3 3.1
η° U 8 12.5 6.3
/ズ 'レ 1 9 12.5 6.3
η° 2 0 6.3 3.1 比較サンフ'ル 1 >100 >100
比較サンフ'ル >100 >100
比較サンダル 3 >100 >100
比較サンフ' /レ 4 >100 >100
比較サンダル 5 >100 12.5
比較サンフ°ル 6 >100 50
比較サンフ。ル 7 100 12.5 ホ 'リミキシン Β 1.6 6.3 表 2に示す結果から明らかなように、本発明に係るポリペプチド (サンプル 1一 20) は、比較対照のポリペプチド (比較サンプル 1一 7)と比べ、いずれも高い抗菌活性を 示した。
特に、 LBS配列として配列番号 1に示すパリンドローム配列「LMWWML」を有す るポリペプチドは高い抗菌活性が認められた。また、 C末端がアミドィ匕されたポリぺプ チド (サンプル 1)は、 C末端がアミド化されていない同配列のポリペプチド (サンプル 16)よりも高い抗菌活性を示すことが確かめられた。表 2に示す結果より、本発明の 抗菌ペプチドが優れた抗菌活性と広 、抗菌スペクトルとを有することが確かめられた
[0045] <実施例 3：合成ポリペプチドの抗菌活性 (2) >
血清存在下におけるグラム陽性細菌（S. aureus)に対する抗菌活性 (MIC)を実施 例 2と同様の手法により調べた。すなわち、先ず、滅菌蒸留水で最高試験濃度の 40 倍の濃度の薬剤 (合成ポリペプチド)溶液を調製し、薬剤濃度が 50、 25、 12. 5、 6. 3、 3. 1、 1. 6及び 0. 8 Mであり且つ質量比で培地全体の 10%、 20%又は 50% となるようにゥマ血清（日本バイオテスト社製品の濾過滅菌したもの）を添加した液体 肉汁培地 (即ち実施例 2と同様にして予めカチオンを調整したミューラーヒントンプロ ス)をそれぞれ作製した。次いで、各濃度の薬剤及び血清含有液体肉汁培地を 96 穴マイクロプレートに lOOmLずつ充填し、実施例 2と同様の手法で MICを求めた。 結果を表 3に示す。表中のサンプル Xは、サンプル 1とサンプル 16を質量比 1 : 1で混 合したサンプルである。表中の-は未測定を示す。
表 3に示す結果から明らかなように、本発明に係るポリペプチドは、比較対照のポリ ペプチドと比べ、血清存在下であっても高！ヽ抗菌活性を維持し得ることが確かめられ た。従って、本発明の抗菌ペプチドは、血清のような有機物が比較的大量に存在す る系（例えば血液中）での用途にも好適である。 LBS配列とともに抗菌関連配列とし て前記少なくとも 1種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列 (ここ では KPV配列）と高塩基性部分配列の両方を含むサンプル 21は、特に高い抗菌活 性を示した。
[0046] [表 3] S. aureusに対する抗菌活性 (M I C : μ M)
ゥマ血清濃度 1 0 % 2 0 % 5 0 % サンフ。 IV 1 3.1 3.1 3.1
サンフ。 /レ 3 3.1 一 ―
サンフ。 /レ 4 6.3 ― ―
サンフ。 /レ 6 3.1 3.1 1.6
サンプル 7 3.1 6.3 6.3
サンフ 8 3.1 ― 6.3
サン/ル 1 4 6.3 一 ―
サンフ。ル 1 5 6.3 ― ―
サンフ。ル 1 6 3.1 ― 一
サン, ,レ 2 1 1.6 ―
サン, /レ X 6.3 ― ― 比較サンフ'ル 1 >50 ― 一
ホ。リミキシン B 6.3 6.3 3.1 <実施例 4：合成ポリペプチドの抗菌活性 (3) >
本発明に係る抗菌ペプチドの真菌 (Aspergillus niger IFO 6341)に対する抗菌活性 を一般的な抗真菌剤感受性試験に準じて以下のようにして調べた。
すなわち、予め培養し、胞子 (分生子）が着生しているスラント又は平板培地（ DIFCO社製品「ポテト'デキストロース寒天」培地を標準的に使用した。）から A. niger (IFO 6341； JIS用試験菌株）を 1 μ Lデイスポーザブルループで培地面を下から上に 4一 5搔きして採取し、 0. 05%の界面活性剤 (Tween (登録商標） 80)含有 PBS (M g, Caフリー)溶液 25mL中に入れた。そして、黒い胞子の固まりが完全になくなるよう にメスピペット等を用いてピペッティングした。こうして調製した胞子浮遊液の胞子濃 度を血球計算盤を用いて測定しつつ、上記界面活性剤含有 PBS溶液で適宜希釈し て、胞子濃度が約 2. 5 X 105個 ZmLの胞子浮遊液を得た。
一方、上記合成した 2つのポリペプチド (サンプル 1 , 3)及び抗真菌活性の比較対 照とする塩化ベンザルコ-ゥムをそれぞれ 10mMの HEPESバッファー（pH7. 0)に 溶かし、薬剤濃度 2. OmgZmLの原溶液を調製した。これらを順次希釈していき、薬 剤（各ポリペプチド又は塩化ベンザルコ-ゥム）濃度が 400、 200、 100、 50、 25、 5 及び 0. 5 gZmLとなる各種の供試薬剤を調製した。 [0048] 上記調製した薬剤及び胞子浮遊液を用いて、以下のように胞子発芽阻害試験及 び菌糸成長阻害試験を行った。
先ず、胞子発芽阻害試験のため、上記各濃度の薬剤を 96穴（ゥエル)マイクロプレ ートに 1ゥエルあたり 40 Lずつ添加した。余った薬剤は後日行う菌糸成長阻害試験 に使用するため、冷蔵庫 (4°C)で保存した。
次に、上記胞子浮遊液 10質量部に対し、アラマ一ブルー蛍光試薬 (和光純薬 (株) 製品）を 2質量部、及び 0. 165Mの MOPSを含む RPMI1640培地（RPMI1640 ( Irvine Scientific社製品） 5. 2g及び NaHCO 1. Ogを滅菌蒸留水 450mLに溶解後、
3
MOPS17. 12gをカ卩えて撹拌し、 NaOHを添カ卩して pH7. 0に調整した後、滅菌蒸 留水をカ卩えて 500mLにフィルアップしたもの）を 8質量部加えて調製した供試菌液を 、上記薬剤を添加してあるゥエルに 160 Lずつ添加した。更に、菌糸成長阻害試験 用として薬剤を添カ卩していない空のゥエルにも 160 Lずつ添カロした。添加後、湿潤 環境下、 30°Cのインキュベータ内で 16時間培養した。
培養開始力 16時間後、プレートをインキュベータ力 取り出し、菌糸成長阻害試 験用の各ゥエル (即ち上記供試菌液のみ充填されたゥエル）について顕微鏡で菌糸 の発生 (成長）の有無を確認した。菌糸発生 (成長）の確認されたゥエルにつ!ヽて上 記冷蔵庫 (4°C)で保存してお!、た薬剤の ヽずれかを 40 μ Lずつ添加した。添加後、 湿潤環境下、 30°Cのインキュベータ内にプレートを戻し、培養を継続した。
[0049] そして、培養開始力も 24時間後及び 48時間後に、胞子発芽阻害試験用ゥエル及 び菌糸成長阻害試験用ゥエルの培地の色を観察した。ここで、培地中に含まれるァ ラマーブルーが青色 (酸化型）のままのものは抗菌活性有りとし、桃色 (還元型）のも のは抗菌活性無しと判断した。而して、酸ィ匕型 (青色)と認められた最小薬剤濃度を 本実施例に係る胞子発芽阻害試験及び菌糸成長阻害試験における MIC (最小発 育阻害濃度)とした。結果を表 4に示す。
[0050] [表 4] A rに対する抗菌活性 （M I C : μ g /m L )
胞子発芽阻害試験結果 菌糸成長阻害試験結果
2 4時間後 4 8時間後 2 4時間後
5 0 5 0 1 0 0
1 0 0 1 0 0 1 0 0
2 5 2 5 2 5
[0051] 表 4に示す結果から明らかなように、本発明に係るポリペプチドは、 A. nigerのような 真菌 (力ビ、酵母類）に対しても高い抗菌活性を発揮し得ることが確かめられた。従つ て、本発明によって、本明細書に開示される抗菌ペプチドのいずれかを主成分とす る生体内或いは生体外で使用される抗真菌剤が提供される。
[0052] <実施例 5 :顆粒剤の調製 >
サンプル 1のポリペプチド 50mgと結晶化セルロース 50mg及び乳糖 400mgとを混 合した後、エタノールと水の混合液 lmLを力卩ぇ混練した。この混練物を常法に従って 造粒し、抗菌ペプチドを主成分とする顆粒剤 (顆粒状抗菌剤)を得た。
[0053] <実施例 6：マウスに対する治療効果試験 >
実施例 1と同様のプロセスによって、アミノ酸配列が LKRKLQRWYWLLである 計 13アミノ酸残基カゝら成るポリペプチド (サンプル 22)を合成した。このポリペプチド の C末端アミノ酸のカルボキシル基 (一 COOH)はアミド化（一 CONH )されて!/、る。
2
また、このアミノ酸配列から明らかなように、この合成ポリペプチド (サンプル 22)の C 末端側の配列「WYWLL」はサンプル 9と同様の LBS配列を構成しており、該 LBS 配列よりも N末端側の配列「LKRKLQR」はサンプル 15及び 18と同様の抗菌関連 配列 (高塩基性部分配列)を構成して!/、る。
[0054] 合成して得られたサンプル 22の細菌（MRSA)感染マウスに対する治療効果を評 価するために以下の試験を行った。
すなわち、試験開始 1週間前力もアムホテリシン B (AMPH :ブリストル 'マイヤーズ 社製品）及びテトラサイクリンを、濃度がそれぞれ gZmL (AMPH)及び 2000 μ gZmL (テトラサイクリン）となるように飲み水に混ぜて飼育するとともに試験開始 4 日前から 3日間は 200mgZkgとなる量のシクロフォスアミドを腹腔内に投与して免疫 が減弱したマウス (ICR、 SLC、雄、 5週齢)を作製した。
このマウスに対し、 10% (w/v)ムチン液にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ methicillin— resistant Staphylococcus aureus ; MRS A、 No. 164株)を懸淘させて調 製した菌懸濁液を、菌投与量がマウス 1個体あたり約 108セル（108cellsZmouse)とな るように経口摂取させ、 MRSA感染を惹起した。
かかる菌接種の 1時間後、 10%アラビアゴム溶液に供試物質 (即ちサンプル 22の ポリペプチド)を懸濁させて調製した抗菌剤を経口投与した。懸濁液の投与量は 100 mgZkgとした。被験マウスは試験 1群 (各試験群)あたり 5匹とし、計 5群で試験した。 比較のため、 10%アラビアゴム溶液にバンコマイシンを懸濁させて調製した抗菌剤を 、同様の条件で被験マウスに経口投与した。
[0055] 薬剤投与後、約 24時間後に被験マウスを屠殺し、腸管の内容物を採取し、 MRSA の菌数を調べた。すなわち、約 0. 2gの腸管内容物に 1. 8mLの生理食塩水をカロえ て撹拌した。そのうちの一定量を 20 μ mZmL濃度のゲンタマイシン (GM)を含むマ ンニット寒天培地（日水製薬社製品）に塗抹し、 37°Cで 3日間培養した。そして培地 上に出現した菌数をカウントした。結果を表 5に示す。
この表に示す結果から明らかなように、本実施例に係るサンプル 22のポリペプチド を含む薬剤は、比較としてのバンコマイシンを含む薬剤と同等の効果を示した。
[0056] [表 5] 表 5 ：各投与群の腸管内容物の MR S A菌量 ( X 103cells/g)
Figure imgf000026_0001
* ) 薬剤投与量： 1 0 O m g / k g 以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の 範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した 具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
また、本明細書に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組み合わせによつ て技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組み合わせに限定さ れるものではない。また、本明細書に例示した技術は複数目的を同時に達成するも のであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものであ る。

Claims

請求の範囲
[1] 天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチドであって、
ラミニン結合部位 (LBS)を構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 6個の連 続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基 を同類置換した配列を有し、且つ、
少なくとも 1種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るアミノ酸配列を有し、 全アミノ酸残基数が 100以下であることを特徴とする、抗菌ペプチド。
[2] 天然に存在しな!、人為的に設計された抗菌ペプチドであって、
ラミニン結合部位 (LBS)を構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 6個の連 続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基 を同類置換した配列を有し、且つ、
前記配列の N末端側及び Z又は C末端側に隣接する部分配列であって、 3個以上 の連続するアミノ酸残基から成り該配列を構成するアミノ酸残基の過半数はリジン又 はアルギニンである高塩基性部分配列を有し、
全アミノ酸残基数が 100以下であることを特徴とする、抗菌ペプチド。
[3] 前記少なくとも 6個の連続するアミノ酸残基力 成る配列力 配列番号 1一 9のいず れかに示されるアミノ酸配列を含む配列である、請求項 1又は 2に記載の抗菌べプチ ド、。
[4] 前記少なくとも 6個の連続するアミノ酸残基力 成る配列力 配列番号 1一 9のいず れかに示されるアミノ酸配列である、請求項 1又は 2に記載の抗菌ペプチド。
[5] ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 20以下である、請求項 1一 4のいずれか に記載の抗菌ペプチド。
[6] 配列番号 10— 30のいずれかに示されるアミノ酸配列または該配列のうち 1若しくは 複数のアミノ酸残基を同類置換した配列を含む、請求項 2に記載の抗菌ペプチド。
[7] 配列番号 10— 30のいずれかに示されるアミノ酸配列または該配列のうち 1若しくは 複数のアミノ酸残基を同類置換した配列力も成る、請求項 2に記載の抗菌ペプチド。
[8] 少なくとも一つのアミノ酸残基がアミドィ匕されている、請求項 1一 7のいずれかに記 載の抗菌ペプチド。
[9] 請求項 1一 8のいずれかに記載の抗菌ペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを 含む抗菌剤。
[10] 請求項 1一 8のいずれかに記載の抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に設計 されたポリヌクレオチド。
[11] 抗菌ペプチドの製造方法であって：
ラミニン結合部位 (LBS)を構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 6個の連 続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基 を同類置換した配列を決定すること；
前記決定した配列と少なくとも 1種の細菌又は真菌に対して抗菌性を発現し得るァ ミノ酸配列とを有するペプチド鎖を設計すること;及び
該設計したペプチド鎖を合成すること；
を包含する方法。
[12] 抗菌ペプチドの製造方法であって：
ラミニン結合部位 (LBS)を構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 6個の連 続するアミノ酸残基から成る配列、または該配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸残基 を同類置換した配列を決定すること；
前記決定した配列と、その N末端側及び Z又は C末端側に隣接する部分配列であ つて 3個以上の連続するアミノ酸残基から成り該配列を構成するアミノ酸残基の過半 数はリジン又はアルギニンである高塩基性部分配列とを有するペプチド鎖を設計す ること;及び
該設計したペプチド鎖を合成すること；
を包含する方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008032777A1 (fr) * 2006-09-14 2008-03-20 Toagosei Co., Ltd. Peptide antibactérien et son utilisation
WO2008032783A1 (fr) * 2006-09-14 2008-03-20 Toagosei Co., Ltd. Peptide antibactérien artificiel et utilisation de celui-ci
WO2010101237A1 (ja) * 2009-03-06 2010-09-10 アンジェスＭｇ株式会社 ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
US8969311B2 (en) 2009-05-25 2015-03-03 Anges Mg, Inc. Polypeptide having antibacterial activity and angiogenesis-inducing activity and wound-healing drug containing said polypeptide
US9376470B2 (en) 2008-11-28 2016-06-28 Funpep Inc. Polypeptide having angiogenesis-inducing activity and antibacterial activity, and use thereof for medical purposes

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006088010A1 (ja) * 2005-02-15 2006-08-24 Toagosei Co., Ltd. 抗菌ペプチド及びその利用
WO2010080819A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 C3 Jian, Inc. Targeted antimicrobial moieties

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1171399A (ja) * 1997-08-20 1999-03-16 Adriel Dell Calpio Carlos 抗菌性マルチプルチアンチゲンペプチド
WO2002008266A2 (en) * 2000-07-19 2002-01-31 Pharmacia & Upjohn Company Complete nucleotide sequence of staphylococcus aureus ribosomal protein s16 gene and methods for the identification of antibacterial substances
WO2002036612A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Cambridge University Technical Services Limited Antibacterial agents comprising conjugates of glycopeptides and peptidic membrane-associating elements
WO2002094868A2 (en) * 2001-03-27 2002-11-28 Chiron Srl. Staphylococcus aureus proteins and nucleic acids

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547939A (en) 1991-06-14 1996-08-20 The Regents Of The University Of California Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use
PT651805E (pt) 1992-07-17 2007-02-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Método de ligação intracelular de moléculas-alvo
US5789542A (en) 1994-04-22 1998-08-04 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Amphipathic peptides
US5807746A (en) 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
US5834184A (en) 1995-05-17 1998-11-10 Harada; Kazuo In vivo selection of RNA-binding peptides
JP3860838B2 (ja) 1995-08-23 2006-12-20 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 抗微生物性陽イオン性ペプチドおよびそのスクリーニング方法
US6180604B1 (en) 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
US5962415A (en) 1996-09-20 1999-10-05 Bristol-Myers Squibb Co. Compositions comprising a peptide inhibitor of nuclear protein translocation and an immunosuppressant and methods of use thereof
US5877282A (en) 1996-09-20 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Peptide inhibitors of nuclear protein translocation having nuclear localization sequences and methods of use thereof
WO1998051794A1 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Human Genome Sciences, Inc. Antimicrobial peptide
AUPP051497A0 (en) 1997-11-24 1997-12-18 University Of Melbourne, The Antimicrobial peptides
US6221355B1 (en) 1997-12-10 2001-04-24 Washington University Anti-pathogen system and methods of use thereof
US6426191B1 (en) * 1998-04-03 2002-07-30 Hyseq, Inc. Assays involving an IL-1 receptor antagonist
US6303575B1 (en) 1998-05-12 2001-10-16 The Regents Of The University Of California Indolicidin analogs and methods of using same
US6348185B1 (en) 1998-06-20 2002-02-19 Washington University School Of Medicine Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US6476189B1 (en) 1998-08-12 2002-11-05 National Institute Of Agrobiological Sciences Antibacterial peptides and antibacterial agents containing such peptides as an effective ingredient
JP3273314B2 (ja) 1998-08-12 2002-04-08 独立行政法人農業生物資源研究所 抗菌ペプチド及びこれを有効成分とする抗菌剤
JP2002522556A (ja) 1998-08-14 2002-07-23 バイオネブラスカ，インコーポレイテッド アメリカカエルの皮膚から単離された抗菌性ペプチド
US6388056B1 (en) * 1998-10-26 2002-05-14 Paula Sundstrom Inhibition of transglutaminase-mediated microbial interaction with a mammalian host
US6887846B2 (en) 1999-03-24 2005-05-03 Zengen, Inc. Antimicrobial amino acid sequences derived from alpha-melanocyte-stimulating hormone
JP4767418B2 (ja) 1999-03-24 2011-09-07 エムエスエイチ ファーマ，インコーポレイテッド アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン由来の抗菌性アミノ酸配列
GB9918156D0 (en) 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Synthetic peptides
JP2001186887A (ja) 2000-01-06 2001-07-10 Suntory Ltd サソリ毒由来の抗菌ペプチド
EP1305333A4 (en) 2000-07-31 2006-04-12 Active Motif ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS BY PEPTIDE MEDIATION
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
AU2002317071B2 (en) * 2001-06-22 2008-01-31 The Hospital For Sick Children Antimicrobial peptides
US6939846B2 (en) 2001-12-17 2005-09-06 Zengen, Inc. Use of a polypeptide for treatment of pruritis in animals

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1171399A (ja) * 1997-08-20 1999-03-16 Adriel Dell Calpio Carlos 抗菌性マルチプルチアンチゲンペプチド
WO2002008266A2 (en) * 2000-07-19 2002-01-31 Pharmacia & Upjohn Company Complete nucleotide sequence of staphylococcus aureus ribosomal protein s16 gene and methods for the identification of antibacterial substances
WO2002036612A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Cambridge University Technical Services Limited Antibacterial agents comprising conjugates of glycopeptides and peptidic membrane-associating elements
WO2002094868A2 (en) * 2001-03-27 2002-11-28 Chiron Srl. Staphylococcus aureus proteins and nucleic acids

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARDINI E. ET AL.: "The 67-kDa laminin receptor originated from a ribosomal protein that acquired a dual function during evolution", MOL. BIOL. EVOL., vol. 15, no. 8, 1998, pages 1017 - 1025, XP003016349 *
BANDYOPADHYAY K. ET AL.: "Role of 67 kDa cell surface laminin binding protein of Leishmania donovani in pathogenesis", J. BIOCHEM., vol. 130, no. 1, 2001, TOKYO, pages 141 - 148, XP003016350 *
CASTRONOVO V. ET AL.: "Functional domains of the 67-kDa laminin receptor precursor", J. BIOL. CHEM., vol. 266, no. 30, 1991, pages 20440 - 20446, XP003016351 *
GOSH A. ET AL.: "Isolation of a laminin-binding protein from the protozoan parasite Leishmania donovani that may mediate cell adhesion", BIOCHEM. J., vol. 337, no. 3, 1999, pages 551 - 558, XP003016348 *
KOBAYASHI N. ET AL.: "Peptide-kei kokin busshitsu no bunshi sekkei", THE SOCIETY FOR ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL NENJI TAIKAI YOSHISHU, vol. 30, 25 May 2003 (2003-05-25), pages 137 - 144, XP009083927 *
PEI L. ET AL.: "Functional studies of fibrinogen binding protein from Staphylococcus epidermidis", INFECT IMMUN., vol. 67, no. 9, 1999, pages 4525 - 4530, XP002955255 *
See also references of EP1688486A4 *
VALKONEN K.H. ET AL.: "Binding of basement-membrane laminin by Escherichia coli", MOL. MICROBIOL., vol. 5, no. 9, 1991, pages 2133 - 2141, XP009082592 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008032777A1 (fr) * 2006-09-14 2008-03-20 Toagosei Co., Ltd. Peptide antibactérien et son utilisation
WO2008032783A1 (fr) * 2006-09-14 2008-03-20 Toagosei Co., Ltd. Peptide antibactérien artificiel et utilisation de celui-ci
US9376470B2 (en) 2008-11-28 2016-06-28 Funpep Inc. Polypeptide having angiogenesis-inducing activity and antibacterial activity, and use thereof for medical purposes
WO2010101237A1 (ja) * 2009-03-06 2010-09-10 アンジェスＭｇ株式会社 ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
JPWO2010101237A1 (ja) * 2009-03-06 2012-09-10 アンジェスＭｇ株式会社 ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
US8470765B2 (en) 2009-03-06 2013-06-25 Anges Mg, Inc. Polypeptides and antibacterial or antiseptic use of same
JP2015038108A (ja) * 2009-03-06 2015-02-26 アンジェスＭｇ株式会社 ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
JP5750765B2 (ja) * 2009-03-06 2015-07-22 株式会社ファンペップ ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
JP2016104726A (ja) * 2009-03-06 2016-06-09 株式会社ファンペップ ポリペプチド及びその抗菌または消毒用途
US8969311B2 (en) 2009-05-25 2015-03-03 Anges Mg, Inc. Polypeptide having antibacterial activity and angiogenesis-inducing activity and wound-healing drug containing said polypeptide
US9695219B2 (en) 2009-05-25 2017-07-04 Funpep Inc. Polypeptide having antibacterial activity and angiogenesis-inducing activity and wound-healing drug containing said polypeptide

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