CN107987144B

CN107987144B - 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用

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Publication number: CN107987144B
Application number: CN201711339873.5A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 杨仕隆; 罗雷
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN107987144A

Abstract

本发明涉及一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用，属于生物医学技术领域。本发明提供了一种蜈蚣多肽SLP_SsTx，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸全序列为如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx具有抑制KCNQ家族通道并介导心血管系统、神经系统和呼吸系统的功能，能作为探究KCNQ通道探针模板和解释蜈蚣叮咬临床症状。

Description

一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用。

背景技术

少棘蜈蚣是我国的一种传统中药，有败毒抗癌、息风解痉之功效。

少棘蜈蚣(S.subspinipes mutilans L.Koch)是模棘蜈蚣的近似种，主要分布于中国和日本，在我国长江中下游常见。蜈蚣的第一对脚经过长期的进化，形成钩状、锐利、钩端有毒腺口、外有坚硬的甲壳质包裹的螯。蜈蚣的毒螯中有用于分泌和储存毒液的毒腺，毒腺呈囊泡状分布，周围的小泡可以理解为亚毒腺，这有利于毒腺细胞在胞外寻求更大的贮藏毒液的空间。蜈蚣毒素是指毒腺分泌的无色透明的黏稠液体，注入猎物体内能使其麻痹甚至死亡。它们已经进化出适应捕食猎物的能力，如鱼类、昆虫、爬行动物、软体动物、两栖动物、甚至哺乳动物都是它们的捕食对象(Undheim，E.A.，and King，G.F.(2011)On thevenom system of centipedes(Chilopoda)，a neglected group of venomousanimals.Toxicon 57，512-524；Yang，S.，Liu，Z.，Xiao，Y.，Li，Y，Rong，M.，Liang，S.，Zhang，Z.，Yu，H.，King，G.F.，and Lai，R.(2012)Chemical punch packed in venomsmakes centipedes excellent predators.Molecular&cellular proteomics：MCP 11，640-650)。被蜈蚣致伤后的特征主要有疼痛、烧灼感、痒、红斑、充血、发炎、发疱、皮下出血、水肿、表皮坏死和脱皮，严重者有头痛、恶心、呕吐、发热、心率和呼吸不规则、淋巴炎、组织坏死、血管痉挛和昏迷等，甚至导致死亡。有报道指出蜈蚣毒素也会导致横纹肌溶解症、心肌缺血，甚至心肌梗死(Yildiz，A.，Biceroglu，S.，Yakut，N.，Bilir，C.，Akdemir，R.，andAkilli，A.(2006)Acute myocardial infarction in a young man caused by centipedesting.Emergency medicine joumal：EMJ 23，e30)。

尽管人们遇到蜈蚣并遭遇其伤害，但有关蜈蚣毒液的组成及作用机制却少有深入研究，毒液中存在什么物质能够产生上述阐述的生理反应？所以探究蜈蚣毒液的功能活性分子有助于我们理解临床症状的发病原因，发病机理，可以让我们有针对性的对蜈蚣叮咬进行干预，从而规避其伤害。国内外对蜈蚣毒的研究大多都停留在粗毒的研究水平上，对其有效成分以及药理学活性的研究仍有待于深入。蜈蚣毒液含有极其复杂的化学成分，主要可分为蛋白类和非蛋白类，蛋白质类可进一步分为酶类和非酶类。另外还含有大量的多肽类物质，这些多肽物质在蜈蚣捕食和防御过程中发挥重要作用。

KCNQ钾通道是一种电压门控型(Kv)离子通道，该家族包括5个家族成员：KCNQ1-5。KCNQ1主要表达在外周组织和心脏，而KCNQ2-5在神经系统、肌肉系统和心血管系统等广泛表达。目前的研究发现，KCNQ的五个亚家族成员中，四个KCNQ通道的突变和疾病相关。其中KCNQ1的突变和长QT综合症相关，有些还伴随着耳聋，而长QT综合症最明显的表现是心电图QT间隔的延长，因此该突变还伴随着心律不齐和心源性猝死等。KCNQ2通道和KCNQ3的突变则会导致良性家族性婴儿惊厥，有些还伴随着外周神经的过度兴奋，而良性家族性婴儿惊厥一般在婴儿出生后2-4天，故又名“第三天惊厥”，有11％的患者会在以后出现癫痫等神经系统疾病(Bal，M.，Zhang，J.，Hernandez，C.C.，Zaika，O.，and Shapiro，M.S.(2010)Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ(M-Type)K+channels.TheJournal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience30，2311-2323；Brown，D.A.，and Passmore，G.M.(2009)Neural KCNQ(Kv7)channels.British journal of pharmacology 156，1185-1195)。KCNQ4通道的突变则会引起先天性的耳聋，这是一种在婴儿出生时或者出生后出现的听力障碍。只有KCNQ5通道还未有报道和疾病相关，但是有报道指出KCNQ5和静息电位的形成相关(Brueggemann，L.I.，Haick，J.M.，Neuburg，S.，Tate，S.，Randhawa，D.，Cribbs，L.L.，and Byron，K.L.(2014)KCNQ(Kv7)potassium channel activators as bronchodilators：combination with abeta2-adrenergic agonist enhances relaxation of rat airways.American journalof physiology.Lung cellular and molecular physiology 306，L476-486)。

鉴于KCNQ家族在负责氯化物分泌和心脏动作电位复极(KCNQ1)、冠状循环和反应性充血(KCNQ4)和大脑神经元兴奋(KCNQ2，3，4)等多种生理功能中发挥重要作用(Jentsch，T.J.(2000)Neuronal KCNQ potassium channels：physiology and role indisease.Nature reviews.Neuroscience 1，21-30)，而蜈蚣叮咬的临床病例报告中描述的一些症状，例如组织坏死、血管痉挛、急性高血压和心肌缺血等(Undheim，E.A.，and King，G.F.(2011)On the venom system of centipedes(Chilopoda)，a neglected group ofvenomous animals.Toxicon 57，512-524；Yildiz，A.，Biceroglu，S.，Yakut，N.，Bilir，C.，Akdemir，R.，and Akilli，A.(2006)Acute myocardial infarction in a young mancaused by centipede sting.Emergency medicine journal：EMJ 23，e30；Kuhn-Nentwig，L.(2003)Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods.Cellularand molecular life sciences：CMLS 60，2651-2668；Ozsarac，M.，Karcioglu，O.，Ayrik，C.，Somuncu，F.，and Gumrukcu，S.(2004)Acute coronary ischemia followingcentipede envenomation：case report and review of the literature.Wilderness&environmental medicine 15，109-112；Senthilkumaran，S.，Meenakshisundaram，R.，Michaels，A.D.，Suresh，P.，and Thirumalaikolundusubramanian，P.(2011)Acute ST-segment elevation myocardial infarction from a centipede bite.Journal ofcardiovascular disease research 2，244-246)，这和KCNQs功能紊乱导致的临床症状高度相似，我们推断这些临床病例报告中描述的症状和可能与KCNQs通道的活性有关。但现有技术并没有对蜈蚣毒素与KCNQs的关系进行详细报道，也没有针对KCNQs家族通道进行作用的蜈蚣毒素的相关报道。蜈蚣叮咬的临床症状和治疗的研究受到了阻碍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用。本发明提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx具有抑制KCNQ家族通道并介导心血管系统、神经系统和呼吸系统的功能，能作为探究KCNQ通道探针模板和解释蜈蚣叮咬临床症状，进一步开发缓解蜈蚣叮咬药物模板的应用。

本发明提供了一种蜈蚣多肽SLP_SsTx，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸全序列为如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

优选的是，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明还提供了上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因的扩增方法，包括以下步骤：

1)以少棘蜈蚣毒液腺为模板，提取总RNA；

2)从步骤1)得到的总RNA中对mRNA进行纯化，得到mRNA；

3)将步骤2)得到的mRNA进行反转录，得到cDNA文库；

4)以cDNA文库为模板，使用第一简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的扩增；以cDNA文库为模板，使用第二简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx信号肽部分相应基因的扩增；获得蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因的全序列；

所述第一简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

所述第二简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

其中，第一简并引物对序列中的R＝A或G，Y＝C或T，N＝A或C或G或T。

本发明还提供了一种KCNQ家族通道抑制剂，所述抑制剂包括上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx和辅料。

优选的是，所述辅料包括0.9％氯化钠无菌水溶液。

本发明还提供了上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx在制备缓解蜈蚣叮咬药物中的应用。

本发明提供了一种蜈蚣多肽SLP_SsTx。本发明提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx是少棘蜈蚣基因编码的一条单链多肽，分子量为6017.6道尔顿。蜈蚣多肽SLP_SsTx由53个氨基酸组成，其全序列为：EVIKKDTPYKKRKFPYKSECLKACATSFTGGDESRIQEGKPGFFKCTCYFTTG。本发明提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx无论是天然合成的还是人工合成的SLP_SsTx都具有抑制KCNQ家族通道并介导心血管系统、神经系统和呼吸系统的功能，能作为探究KCNQ通道探针模板和解释蜈蚣叮咬临床症状，进一步开发缓解蜈蚣叮咬药物模板的应用，并且还具有序列简单、合成方便的优点。

附图说明

图1为本发明实施例1蜈蚣多肽SLP_SsTx的cDNA、氨基酸序列以及多肽三级结构，其中，图1中的A为SLP_SsTx的cDNA序列，氨基酸序列；图1中的B为质谱检测结果和二硫键配对；图1中的C为溶液状态三级结构；

图2为本发明实施例4提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx对KCNQ家族通道抑制活性结果图，其中，图2中的A为SLP_SsTx抑制人源KCNQ4通道；图2中的B为SLP_SsTx抑制KCNQ家族通道的浓效依赖曲线；

图3为本发明实施例4提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx对胸主动脉血管收缩性的影响结果图；其中，图3中的A为粗毒、苯甲肾上腺素和乙酰胆碱对胸主动脉血管收缩性的影响；图3中的B为不含SsTx的粗毒、苯甲肾上腺素和乙酰胆碱；图3中的C为SsTx、苯甲肾上腺素和乙酰胆碱；图3中的D为粗毒和瑞替加滨(RTG)；图3中的E为SsTx和RTG；图3中的F在5μM SsTx条件下，RTG对KCNQ4的浓效曲线；

图4为本发明实施例4提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx导致心血管系统疾病结果图；其中，图4中的A为尾静脉注射生理盐水和蜈蚣粗毒(30mg/kg)对小鼠收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的影响；图4中的B为生理盐水和SsTx(0.5mg/kg)；图4中的C为静脉注射SsTx(0.1mg/kg，0.01mg/kg)对猕猴收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的影响；图4中的D为SsTx(0.1mg/kg)和RTG；图4中的E为猕猴注射生理盐水或SsTx后代表性心电图；

图5为本发明实施例4提供的蜈蚣多肽SLP_SsTx影响神经系统和呼吸系统结果图；图5中的A为(A)SsTx(10μM)处理前后CA1锥体神经元的神经放电反应；图5中的B为SsTx(10μM)和Linopirdine(100μM)处理对神经元的放电影响；图5中的C为SsTx(10μM)和Linopirdine(100μM)处理对海马乙酰胆碱释放影响图5中的D为SsTx(2mg/kg)处理对大鼠呼吸影响；图5中的E为SsTx处理对大鼠呼吸频率影响；图5中的F为SsTx处理对大鼠呼吸幅度影响；图5中的G为粗毒和RTG对肺支气管收缩性的影响；图5中的H为SsTx和RTG对肺支气管收缩性的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种蜈蚣多肽SLP_SsTx，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸全序列为如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx是少棘蜈蚣基因编码的一条单链多肽，分子量6017.6道尔顿，蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸全序列具体为：

本发明还提供了编码上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。在本发明中，编码所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因对应的cDNA由228个核苷酸组成，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，其自5’端至3’端序列为：

在本发明中，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，其自5’端至3’端序列为：

即成熟肽对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.2序列的第70～228位核苷酸：SEQ IDNO.3。SLP_SsTx成熟肽的翻译后修饰剪除了信号肽部分(atggagaaaaaaattattttcctggttttccttgttgcgcttttggcacttccgggattcatttcaact)。本发明编码蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因SEQ ID NO.2在生物合成蜈蚣多肽SLP_SsTx过程中，剪除信号肽，得到蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽。

1)以少棘蜈蚣毒液腺为模板，提取总RNA；

2)从步骤1)得到的总RNA中对mRNA进行纯化，得到mRNA；

3)将步骤2)得到的mRNA进行反转录，得到cDNA文库；

4)以cDNA文库为模板，使用第一简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的扩增；以cDNA文库为模板，使用第二简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx信号肽部分相应基因的扩增；获得上述技术方案所述基因的全序列；

所述第一简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4(5’GARGTNATHAARAARGAYACN3’)和SEQ ID NO.5(5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT 3’)所示；

所述第二简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6(5’CGTTTTTGAAAAGTTGTAGTA3’)和SEQ ID NO.7(5’TGTTATTTTACCACTGGTTAA 3’)所示；

本发明对总RNA的提取、mRNA的纯化、mRNA的反转录、cDNA文库的构建方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规试剂盒实现上述操作即可。本发明对基因扩增体系和条件也没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基因扩增体系或者常规试剂盒说明书说明的反应体系和条件即可。

本发明对蜈蚣多肽SLP_SsTx的合成方法没有特殊的限定，包括生物合成和化学合成方法，本发明所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的生物合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规蛋白表达系统即可，如采用大肠杆菌原核表达系统、酵母或昆虫细胞真核表达系统；所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的化学合成采用PerSeptive生物合成系统，结合Fmoc/tert-butyl策略和HOBt/TBTU/NMM方法合成线性SLP_SsTx。

在本发明中，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx化学合成方法及溶液条件折叠方法优选包括以下步骤：根据蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，AppliedBiosystems)合成其全序列。通过反向高效液相色谱(RP-HPLC)反向柱C18层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。利用氧化型谷胱甘肽(GSSG)在溶液条件下折叠线性SLP_SsTx，使其二硫键氧化形成天然的三级构象。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。具有天然三级结构的SLP_SsTx用于功能检测。本发明所述蜈蚣多肽SLP_SsTx三级结构紧密，存在明显的极性，12位精氨酸和13位赖氨酸形成明显的正电荷表面，且该多肽的C端相对柔性。

在本发明中，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的三级结构检测方法优选包括以下步骤：

600MHz高场核磁共振(600-MHz Bruker AV600)用于研究蜈蚣多肽SLP_SsTx的三级结构。样品制备条件为500μL 4mM SLP_SsTx，溶液条件为pH 6.5的90％PBS/10％D₂O。获得的所有核磁数据用NMRPipe/NMRDraw software和Sparky program分析。Discoverystudio用于展示最后的三维结构图。

在本发明中，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的分离纯化方法优选包括以下步骤：

收集的少棘蜈蚣毒液，凝胶层析柱Sephadex G-50初步分离纯化，收集10000Da的多肽神经毒素组分，冻干。利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)配合C18柱分离多肽神经毒素组分，纯化得到蜈蚣多肽SLP_SsTx。在本发明中，所述凝胶层析柱Sephadex G-50的分离纯化优选采用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，层析速度优选为3ml/10min；在本发明中，所述多肽神经毒素组分的分离条件优选为以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为0.7ml/min。

本发明还提供了一种KCNQ家族通道抑制剂，所述抑制剂包括上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_SsTx和辅料。在本发明中，所述辅料优选包括0.9％氯化钠无菌水溶液。在本发明中，所述抑制剂中SLP_SsTx的半数抑制浓度优选为2.52±0.17微摩尔。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

少棘蜈蚣多肽SLP_SsTx基因克隆：

I.少棘蜈蚣毒腺总RNA提取：

A.取出少棘蜈蚣毒腺组织，放入液氮中保存，取出冻存的毒腺组织500mg，加入10mL总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司)，置于20mL玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为少棘蜈蚣毒腺总RNA。

II.少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：

少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的

mRNAIsolation Systems试剂盒。

取少棘蜈蚣毒腺500μg总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3mL，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15mL DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的少棘蜈蚣毒腺mRNA。

加入1/10体积3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

III.少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNALibrary Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

在0.5ml无菌的离心管加入1μl少棘蜈蚣毒腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μlCDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇(DTT)、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。

混合离心管中试剂并离心，在42℃保温1小时。

将离心管置于冰上中止第一链的合成。

从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

95℃预热PCR仪。

将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2 PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃ 20秒钟

②22个循环：

95℃ 5秒钟

68℃ 6分钟

循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2。

4. 16,000g离心5分钟。

5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。

7. 16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mL LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50mL聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50mL初始培养物用2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μl TakarapMD18-T载体、4μl少棘蜈蚣cDNA双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

3. 16℃反应2小时。

4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5. 42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5mL LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

IV.蜈蚣多肽SLP_SsTx基因克隆：

第一简并引物(5’GARGTNATHAARAARGAYACN 3’，5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT3’)用于扩增蜈蚣多肽SLP_SsTx的成熟肽部分，第二简并引物(5’CGTTTTTGAAAAGTTGTAGTA3’，5’TGTTATTTTACCACTGGTTAA 3’)用于扩增SLP_SsTx的信号肽部分。

由此获得编码蜈蚣多肽SLP_SsTx的cDNA全序列：

PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒，60℃30秒和72℃45秒，35个循环。

实施例2

蜈蚣多肽SLP_SsTx的分离纯化：

I.Sephadex G-50凝胶过滤层析：

将200mg冻干的蜈蚣毒液溶于20ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，12000rpm离心10分钟，取上清用已平衡好的Sephadex G-50凝胶过滤柱(26×100cm)进行初步分离纯化，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3ml/管/10min,于280nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有镇痛活性的部分，冻干，-20℃保存备用。

II.反向高压液相层析(RP-HPLC)：

将Sephadex G-50凝胶过滤层析所得到的活性峰用2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)重新溶解，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为0.7ml/min。收集蜈蚣多肽SLP_SsTx，冻干，-20℃保存。Edman降解法对其纯化所得的蜈蚣多肽SLP_SsTx纯品进行N-端测序(model 491，ABI)。飞行质谱(MOLIDI-TOF)测定多肽SLP_SsTx分子量。

实施例3

蜈蚣多肽SLP_SsTx的化学合成及三级结构测定：

I.蜈蚣多肽SLP_SsTx的化学合成方法：根据编码蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸测序，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。

II.纯化的蜈蚣多肽SLP_SsTx的分子量和纯度鉴定，采用飞行质谱法(MOLDI-TOF)和反相高相液相色谱法(RP-HPLC)进行分析。

III.600MHz高场核磁共振(600-MHz Bruker AV600)用于研究蜈蚣多肽SLP_SsTx的三级结构。样品制备条件为500μl 4mM SLP_SsTx，溶液条件为pH 6.5的90％PBS/10％D2O。获得的所有核磁数据用NMRPipe/NMRDraw software和Sparky program分析。PyMol用于展示最后的三维结构图。

蜈蚣多肽SLP_SsTx是少棘蜈蚣基因编码的一种单链多肽，分子量为6017.6道尔顿。其蛋白序列全长为：EVIKKDTPYKKRKFPYKSECLKACATSFTGGDDSRIQEGKPGFFKCTCYFTTG(图1中的A)。三级结构显示SLP_SsTx是一个由两对分子内二硫键连接成的结构紧密的多肽毒素(图1中的B)，N端呈现柔性结构，C端结构保守(图1中的C)。

实施例4

蜈蚣多肽SLP_SsTx的药理学功能：

KCNQ通道抑制剂活性：

瞬转过表达小鼠KCNQ通道的HEK293细胞，用于研究SLP_SsTx与KCNQ家族通道之间的相互作用。

倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20-25℃条件下进行膜片钳实验。选用WPI 0.86mm薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(P-97，Shutter)上经5步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5-3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5-2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为0mV，细胞稳定10分钟使用适宜的脉冲电压(80/-80mV)开始记录电流。药物使用Biolab RS200进行灌流，药物之间的切换速度为50ms。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5-8MΩ的范围之内维持不变，系统串联电阻补偿一般在30-60％之间。实验数据用Patch Master软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件。所有结果均采用平均值(Average)±标准误(SEM)的形式表示，n代表实验的数据个数。

SLP_SsTx抑制KCNQ4通道呈现浓度依赖关系(图2中的A)，其IC50为2.52±0.17μM(n＝10)(图2中的B)。

SLP_SsTx通过抑制KCNQ通道对胸主动脉血管收缩性的影响。

SsTx和蜈蚣粗毒对心血管系统的体内影响：分别在5mg/ml和10mg/ml的毒素的作用下，冠状动脉的收缩力分别增加约1.6(80％)和约2.1g(105％)，而阳性对照组饱和苯肾上腺素约增加2.2g(110％)(图3中的A)。为了确定SsTx是否是引起血管紊乱的毒液的关键成分，我们对SsTx存在和缺失(cv-SsTx free，cv-SF)的粗毒的血管活性进行了比较。如图3中的B所示，粗毒液在没有SsTx的情况下显著降低收缩动脉活性。与10mg/ml粗毒诱导的血管收缩反应相比，10mg/ml cv-SF仅增加约7.5％的血管收缩，表明SsTx是影响血管活性的主要活性成分。如预期结果相同，1μM和5μM SsTx分别增加了约50.3和约105％的冠状动脉的收缩力(图3中的C)。根据SsTx的生物学机制，瑞替加滨可以显著降低蜈蚣粗毒和SsTx诱导的血管毒性(图3中的D-F)。

SLP_SsTx抑制KCNQ家族通道导致心血管系统疾病：

与预期结果相同，静脉注射(IV)注射粗蜈蚣粗毒导致小鼠急性高血压(图4中的A)。此外，1.0mg/kg的SsTx进一步引起小鼠的血压显著升高[收缩压升高了30.4％，舒张压升高了40±6.3％](图4中的B)。与小鼠相似，SsTx对猕猴造成血管痉挛和急性高血压，而阿托品和瑞替加滨则抑制SsTx活性(图4中的C&D)。静脉注射瑞替加滨(1mg/kg)逆转SsTx引起的高血压(0.1mg/kg)，血压从～196mmhg降至正常范围(图4中的D)。在注射SsTx后，小鼠在死亡前不断抽搐和抖动，LD50为～0.85mg/kg，消除半衰期为4.5h。这种致命的活性可能是由于冠状动脉引起的心肌缺血，因为静脉注射SsTx后5分钟后，我们观察到猴子的倒置T波(图4中的E)。T波倒置是一种典型的心肌缺血综合征表征，而瑞替加滨则逆转T波倒置(图4中的E)。因此，SsTx诱发的冠状动脉痉挛在心肌缺血中起着关键作用，如果缺血症状延长，通常会进展为心力衰竭。

SLP_SsTx抑制KCNQ家族通道影响神经系统和呼吸系统：

神经KCNQ通道(包括KCNQ2、3和5)是M电流的分子基础。M电流减少25％可导致人类的新生儿癫痫，而小鼠的KCNQ2敲除是致命的。我们的研究表明，SsTx是KCNQ2、KCNQ3和KCNQ5的强效抑制剂(图2中的B)。因此，我们推断，在动物的海马注射SsTx可能会引起严重的神经紊乱。在海马注射1μl 20μl的SsTx后，小鼠立刻发生痉挛，10～20分钟后死亡。我们进一步对小鼠脑片进行了记录。在10μM SsTx的浓度下，SsTx诱发的脉冲频率为～20(“～表示大约”)，明显高于未处理的神经元(～8)(图5中的A&B)。在1μl 10μM SsTx和100μMlinopirdine(一种已知的KCNQ通道抑制剂)处理后，小鼠海马乙酰胆碱浓度分别增加了～63.6％和81.8％(图5中的C)。

鉴于KCNQ在呼吸系统中的重要作用，随后研究了粗毒和SsTx对大鼠呼吸功能的影响(图5中的D)。静脉注射SsTx后，呼吸频率明显降低，呼吸幅度增加。在给药2mg/kg SsTx后1.5小时，呼吸率降低75％，呼吸幅度增加150％(图5中的D-F)。粗毒和SsTx引起的支气管环收缩(图5中的G&H)再次被瑞替加滨阻断。我们的结果表明，SsTx和蜈蚣粗毒不仅对心血管系统，而且对神经和呼吸系统造成紊乱。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Ile Lys Lys Asp Thr Pro Tyr Lys Lys Arg Lys Phe Pro Tyr

1 5 10 15

Lys Ser Glu Cys Leu Lys Ala Cys Ala Thr Ser Phe Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Asp Ser Arg Ile Gln Glu Gly Lys Pro Gly Phe Phe Lys Cys Thr Cys

35 40 45

Tyr Phe Thr Thr Gly

50

<210> 2

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagaaaa aaattatttt cctggttttc cttgttgcgc ttttggcact tccgggattc 60

atttcaactg aagttattaa aaaagatact ccatataaaa aaagaaaatt tccttataaa 120

agtgagtgtt tgaaggcctg cgcaacttct tttacaggag gagatgaaag tagaatacaa 180

gaaggaaaac ctgggttctt caaatgtacc tgttatttta ccactggt 228

<210> 3

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaagttatta aaaaagatac tccatataaa aaaagaaaat ttccttataa aagtgagtgt 60

ttgaaggcct gcgcaacttc ttttacagga ggagatgaaa gtagaataca agaaggaaaa 120

cctgggttct tcaaatgtac ctgttatttt accactggt 159

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gargtnatha araargayac n 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcagtggt atcaacgcag agtact 26

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtttttgaa aagttgtagt a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttatttta ccactggtta a 21

Claims

1.一种抑制KCNQ家族通道的蜈蚣多肽SLP_SsTx，其特征在于，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的氨基酸全序列为如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因，其特征在于，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求2所述蜈蚣多肽SLP_SsTx的基因的扩增方法，包括以下步骤：

1)以少棘蜈蚣毒液腺为模板，提取总RNA；

2)从步骤1)得到的总RNA中对mRNA进行纯化，得到mRNA；

3)将步骤2)得到的mRNA进行反转录，得到cDNA文库；

4)以cDNA文库为模板，使用第一简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx成熟肽部分相应基因的扩增；以cDNA文库为模板，使用第二简并引物对进行蜈蚣多肽SLP_SsTx信号肽部分相应基因的扩增；获得权利要求2所述基因的全序列；所述第一简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；所述第二简并引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示；其中，第一简并引物对序列中的R＝A或G，Y＝C或T，N＝A、C、G或T。

5.一种KCNQ家族通道抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1所述蜈蚣多肽SLP_SsTx和辅料。

6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述辅料包括0.9％氯化钠无菌水溶液。

7.权利要求1所述蜈蚣多肽SLP_SsTx在制备缓解蜈蚣叮咬药物中的应用。