CN105085646A - 蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx及其基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx及其基因和应用，蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，由SEQ？ID？NO：1中的氨基酸序列组成。编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx基因序列为：如SEQ？ID？NO：2所示。蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx作为TRPV1通道激动剂介导TRPV1脱敏反应药物的应用。蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx通过激活TRPV1介导TRPV1热激活通路的失活，产生镇痛活性，作为制备镇痛药物的应用。优点：该镇痛肽可以激活并随之失活TRPV1通道，特异性地失活TRPV1热激活通路，从而产生强效的镇痛功能，同时并不影响体温调节系统的平衡。另外该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、起效迅速，镇痛活性强等特点，是以TRPV1作为镇痛药物靶点的优秀候选药物分子，具有重要的镇痛药物开发应用的前景。

Description

蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx及其基因和应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx及其基因及cDNA和应用。
背景技术：
少棘蜈蚣是我国的一种传统中药，有败毒抗癌、息风解痉之功效。少棘蜈蚣(S.subspinipesmutilansL.Koch)是模棘蜈蚣的近似种。主要分布于中国和日本。在长江中下游常见。白天潜伏在石块下或乱石间，黑夜四出捕食昆虫(如蟀蟋、蚱蜢、金龟子和各种蛾类)，也能用毒颚杀死小型的脊椎动物(如麻雀、蜥蜴、蛇等)。对于人类而言，少棘蜈蚣的叮咬会产生剧烈的疼痛，这种疼痛类似于高温灼烧感。这样的生理现象可能是由于TRPV1通道被激活导致的。
TRPV1是一种重要的痛觉感受器，化学或物理刺激都可以将它激动。典型的化学刺激比如辣椒素(Capsaicin)，质子，2APB等，物理刺激比如损伤性热刺激，这些化学或物理刺激能使得TRPV1从关闭状态转化为开放状态，造成阳离子内流，改变可兴奋性细胞的细胞膜兴奋性。阳离子尤其是Ca2+作为细胞第二信使，会带来一系列后续的生理现象。这些生理现象最让人熟知的便是辣椒带来的灼痛感和高温刺激带来的灼烧感。
TRPV1作为重要的痛觉感受器，被科研工作者们作为镇痛药物靶点进行研究。这些研究着重于开发TRPV1通道的阻断剂，认为阻断了TRPV1的活动就能有效地切断痛觉的传导。但是阻断TRPV1会导致体温的上升，随着体温的上升，一些列机体的生理功能将产生紊乱。于是科研工作者放弃了将TRPV1抑制剂作为镇痛药物的想法。
对于TRPV1门控机制的研究使我们认识到TRPV1的门控通路中，辣椒素，电压以及质子的激活是三个相互独立的门控方式。基于这样的认识，如果选择性地抑制其中1-2个门控通路就可以极大降低对体温调节系统的影响。
利用外源的热刺激，TRPV1会发生失活，而这种失活是单单针对热刺激而言的。被热刺激激活随之失活的TRPV1会丧失再次被热刺激激动的能力，但是失活后的TRPV1通道仍然保持着对辣椒素和质子的敏感性。这说明了类似这样的失活与药物阻断的本质完全不同，失活的TRPV1通道并非完全不能行使生理功能，它依然保持着其他门控调节的特性，这可能是我们开发以TRPV1作为镇痛靶点的新型药物的契机。遗憾的是，目前科研工作者还没能发掘一个能选择性阻断其中某个TRPV1门控通路的失活剂。
发明内容
本发明的目的是为弥补上述TRPV1门控通路的失活剂的空白，提供一种蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，还提出编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx成熟序列，还有SLP_RhTx的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx是少棘蜈蚣基因编码的一条单链多肽，分子量为2967.3道尔顿。其蛋白序列全长为：LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE。SLP_RhTx是一个由两对分子内二硫键连接成的结构紧密的多肽毒素，N端呈现柔性结构，C端结构保守
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx基因的克隆包括:
少棘蜈蚣毒液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法克隆SLP_RhTx基因。一对简并引物(5’ATGATGYTNAARWSNTTYTGY3’、5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N3’)用于扩增蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的成熟肽部分，另一对简并引物(5’CGTTTTTGAAAAGTTGTAGTA3’、5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3’)用于扩增SLP_RhTx的信号肽部分。
由此获得编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的cDNA全序：
atggtgttgtttctggcgaaatttcctgatctctgctcgggtgaagaaatctctccattgaaaatagtggttcgaaattcgaaatacttaaacaatccatgtaatggtgtcacatgtcccagtggttacagatgtagtatagtcgataagcaatgtataaaaaaagaaaaatga
其中下划线部分的片段编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的成熟肽。可以看到的是，SLP_RhTx成熟太的翻译后修饰除了剪切信号肽和前导肽部分，还需要将末尾的一个赖氨酸(K)剪切掉。获得编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的基因后可利用基因工程的方法来制备蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的分离纯化方法：收集的少棘蜈蚣毒液，凝胶层析柱SephadexG-50初步分离纯化，收集10000Da的多肽神经毒素组分，冻干。利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)配合C18柱分离多肽神经毒素组分，纯化得到蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的三级结构检测方法：
600MHz高场核磁共振(600-MHzBrukerAV600)用于研究蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的三级结构。样品制备条件为500μl4mMSLP_RhTx，溶液条件为pH6.5的90％PBS/10％D2O。获得的所有核磁数据用NMRPipe/NMRDrawsoftware和Sparkyprogram分析。PyMol用于展示最后的三维结构图。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的化学合成及溶液条件折叠方法：
根据蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列。通过反向高效液相色谱(RP-HPLC)反向柱C18层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。利用氧化型谷胱甘肽(GSSG)在溶液条件下折叠线性SLP_RhTx，使其二硫键氧化形成天然的三级构象。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。具有天然三级结构的SLP_RhTx用于功能检测。
蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx作为TRPV1通道激动剂介导TRPV1脱敏反应药物的应用。
蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx通过激活TRPV1介导TRPV1热激活通路的失活，产生镇痛活性，作为制备镇痛药物的应用。
蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx作为制备镇痛药物模板的应用。
本发明的有益效果在于:
分离纯化得到蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx,并克隆得到其cDNA序列。该镇痛肽可以激活并随之失活TRPV1通道，特异性地失活TRPV1热激活通路，从而产生强效的镇痛功能，同时并不影响体温调节系统的平衡。另外该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、起效迅速，镇痛活性强等特点，是以TRPV1作为镇痛药物靶点的优秀候选药物分子，具有重要的镇痛药物开发应用的前景。
附图说明：
图1蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的溶液状态三级结构图,其中图1-A为两对分子内二硫键连接成的结构紧密的多肽毒素示意图，图1-B为N端与C端结构图；
图2蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx激动小鼠TRPV1通道曲线图；
图3蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx和辣椒素在小鼠TRPV1上的浓效依赖关系曲线图；
图4蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx促进TRPV1的热敏感激活过程，其中图4-A由左至右依次为43.8度、39.1度、34.4度曲线图，39.1度、34.4度、29.7度图，39.1度、34.4度、29.7度图，图4-B为RhTx、Cap变化曲线图；
图5降低温度可特异性阻断SLP_RhTx介导的TRPV1激活，其中图5-C为不同温度、不同大小RhTx、Cap变化图，图5-D左图为不同温度RhTx变化图，右图为不同温度Cap变化图；
图6蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx介导TRPV1的失活曲线图；
图7蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx特异性地介导的失活使TRPV1丧失对热刺激失去敏感性曲线图，其中上图为Standardpipettesolution曲线图，下图为pipettesolutioncontainingRhTx曲线图；
图8蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx介导体内TRPV1的失活产生镇痛活性与加入量关系柱状图。
具体实施方式:
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的分离纯化：
I.SephadexG-50凝胶过滤层析：
将200mg冻干的蜈蚣毒液溶于20ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0),12000rpm离心10分钟，取上清用已平衡好的SephadexG-50凝胶过滤柱(26×100cm)进行初步分离纯化，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3ml/管/10min,于280nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有镇痛活性的部分，冻干，-20℃保存备用。
II.反向高压液相层析(RP-HPLC)：
将SephadexG-50凝胶过滤层析所得到的活性峰用2ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)重新溶解，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为0.7ml/min。收集蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx，冻干，-20℃保存。Edman降解法对其纯化所得的蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx纯品进行N-端测序(model491,ABI)。飞行质谱(MOLIDI-TOF)测定镇痛肽SLP_RhTx分子量。
少棘蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx基因克隆：
I.少棘蜈蚣毒腺总RNA提取：
A.取出少棘蜈蚣毒腺组织，放入液氮中保存，取出冻存的毒腺组织500mg，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司)，置于20m1玻璃匀浆器中匀浆30分钟。
B.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
C.上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为少棘蜈蚣毒腺总RNA。
II.少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：
少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolationSystems试剂盒。
A.取少棘蜈蚣毒腺500μg总RNA溶于500μlDEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。
C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.lmlDEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的少棘蜈蚣毒腺mRNA。
D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μlDEPC水中。
III.少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建：采用CLONTECH公司CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit质粒cDNA文库构建试剂盒。
A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl少棘蜈蚣毒腺mRNA、1μlSMARTIV寡聚核苷酸、1μlCDSIII/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2.混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇(DTT)、1.0μl10mMdNTP混合物、1.0μlPowerScript反转录酶。
3.混合离心管中试剂并离心，在42℃保温1小时。
4.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
5.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链1.95℃预热PCR仪。
2.将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3.在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃20秒钟，22个循环：95℃5秒钟、68℃6分钟。
4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C.PCR产物用PROMEGA公司的WizardSVGelandPCRClean-UpSystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
3.重复步骤2。
4.16,000g离心5分钟。
5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
1.挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2,20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
E.酶切、连接以及连接产物的转化：
1.在微量离心管中加入1μlTakarapMD18-T载体、4μl少棘蜈蚣cDNA双链溶液，全量为5μl。
2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
3.16℃反应2小时。
4.全量(10μl)加入至100μlDH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
8.每个LB平皿用5m1LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
IV.蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx基因克隆：
一对简并引物(5’ATGATGYTNAARWSNTTYTGY3’，5’
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N3’)用于扩增蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的成熟肽部分，另一对简并引物(5’
CGTTTTTGAAAAGTTGTAGTA3’,5’
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3’)用于扩增SLP_RhTx的信号肽部分。
由此获得编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的cDNA全序：
atggtgttgtttctggcgaaatttcctgatctctgctcgggtgaagaaatctctccattgaaaatagtggttcgaaattcgaaatacttaaacaatccatgtaatggtgtcacatgtcccagtggttacagatgtagtatagtcgataagcaatgtataaaaaaagaaaaatga
PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒，60℃30秒和72℃45秒，35个循环。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的化学合成及三级结构测定：
I.蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的化学合成方法：根据编码蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的氨基酸测序，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
II.纯化的蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的分子量和纯度鉴定，采用飞行质谱法(MOLDI-TOF)和反相高相液相色谱法(RP-HPLC)进行分析。
III.600MHz高场核磁共振(600-MHzBrukerAV600)用于研究蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的三级结构。样品制备条件为500μl4mMSLP_RhTx，溶液条件为pH6.5的90％PBS/10％D2O。获得的所有核磁数据用NMRPipe/NMRDrawsoftware和Sparkyprogram分析。PyMol用于展示最后的三维结构图。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx是少棘蜈蚣基因编码的一种单链多肽，分子量为2967.3道尔顿。其蛋白序列全长为：LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE。三级结构显示SLP_RhTx是一个由两对分子内二硫键连接成的结构紧密的多肽毒素(图1-A)，N端呈现柔性结构，C端结构保守(图1-B)。
蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的药理学功能：
TRPV1离子通道激动剂活性：
瞬转过表达小鼠TRPV1通道的HEK293细胞，用于研究SLP_RhTx与TRPV1之间的相互作用。
倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20-25℃条件下进行膜片钳实验。选用WPI0.86mm薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(P-97，Shutter)上经5步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5-3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5-2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为0mV，细胞稳定10分钟使用适宜的脉冲电压(80/-80mV)开始记录电流。药物使用BiolabRS200进行灌流，药物之间的切换速度为50ms。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5-8MΩ的范围之内维持不变，系统串联电阻补偿一般在30-60％之间。实验数据用PatchMaster软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件。所有结果均采用平均值(Average)±标准误(SEM)的形式表示，n代表实验的数据个数。
SLP_RhTx激动TRPV1通道呈现浓度依赖关系(图2)，其IC50为0.52±0.16μM(n＝10)(图3)。
SLP_RhTx通过抑制TRPV1热激活通路失活TRPV1通道：
1441nm激光束用于研究SLP_RhTx对TRPV1热激活反应的促进。冰水灌流实验用于研究温度对SLP_RhTx激动功能的特异性抑制。Inside-out和outside-out膜片钳用于研究SLP_RhTx特异性地失活TRPV1的热激活通路。
低浓度的SLP_RhTx可以显著促进TRPV1的热激活反应(图4A&B)。降低温度能特异性地抑制SLP_RhTx的激动剂功能(图5C&D)。RhTx的与TRPV1结合能引起TRPV1的失活反应(图6)。RhTx能介导TRPV1发生热激活通路的抑制，使其不能被热刺激激活，但不影响其对辣椒素的敏感性(图7)。
SLP_RhTx介导TRPV1脱敏并产生镇痛作用：
试验采用雄性C57B/6小鼠(18-22g)，分为四组(n＝10)。样品溶于无菌生理盐水，采用尾静脉注射方式给药，阴性对照给予同样体积的生理盐水。给药10分钟后，用红外测痛仪研究小鼠尾部对热辐射的反应时间。
在甩尾试验中，由于SLP_RhTx介导TRPV1通道失活，产生显著的镇痛活性，且SLP_RhTx产生的镇痛活性呈现浓度依赖的特性(图8)。

Claims (9)

1.蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，其特征是：由SEQIDNO：1中的氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所示蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的基因序列为：如SEQIDNO：2所示。
3.权利要求1所示的蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx作为TRPV1通道激动剂介导TRPV1脱敏反应药物的应用。
4.权利要求1所示的蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx通过激活TRPV1介导TRPV1热激活通路的失活，产生镇痛活性，作为制备镇痛药物的应用。
5.权利要求1所示的蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx作为制备镇痛药物模板的应用。
6.根据权利要求1所示的蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，其特征是：SLP_RhTx是一个由两对分子内二硫键连接成的结构紧密的多肽毒素，N端呈现柔性结构，C端结构保守。
7.权利要求1所示的蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx分离纯化的方法，其特征是：收集的少棘蜈蚣毒液，凝胶层析柱SephadexG-50初步分离纯化，收集10000Da的多肽神经毒素组分，冻干；利用反向高效液相色谱配合C18柱分离多肽神经毒素组分，纯化得到蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx。
8.权利要求1所示的蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的三级结构检测方法：600MHz高场核磁共振测试蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的三级结构；样品制备条件为500μl4mMSLP_RhTx，溶液条件为pH6.5的90％PBS/10％D2O；获得的所有核磁数据用NMRPipe/NMRDrawsoftware和Sparkyprogram分析；PyMol用于展示最后的三维结构图。
9.权利要求1所示的蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx的化学合成及溶液条件折叠方法：根据蜈蚣镇痛肽SLP_RhTx成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；通过反向高效液相色谱反向柱C18层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％；利用氧化型谷胱甘肽在溶液条件下折叠线性SLP_RhTx，使其二硫键氧化形成天然的三级构象；用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量；具有天然三级结构的SLP_RhTx用于功能检测。
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