CN105367663A - 一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域。提供了一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法，本发明解决的关键技术问题是在延长白细胞介素-1受体拮抗剂的体内半衰期的同时保持其活性，降低免疫原性。本发明的重组融合蛋白是由N-端白细胞介素-1受体拮抗剂与C-端天然存在的亲水性无重复序列多肽融合的重组蛋白；其能减少白细胞介素-1受体拮抗剂的免疫原性，延长白细胞介素-1受体拮抗剂在体内的半衰期；该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单，可用于大规模的药物级融合蛋白的生产和制备。进一步用于制备治疗类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化及炎症和神经退行性疾病的药物。

Description

一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属生物制药技术领域。涉及基因工程长效细胞因子及其制备方法，具体涉及一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法，和在用于制备治疗类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化及炎症和神经退行性疾病的药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1receptorantagonist,IL-1Ra)，与IL-1α、IL-1β三者共同属于IL-1家族成员，也是由单核细胞、巨噬细胞等产生(GarlandaC,DinarelloCA,MantovaniATheinterleukin-1family:backtothefuture.Immunity.2013Dec12；39(6):1003-18.doi:10.1016/j.immuni.2013.11.010.)。IL-1Ra是IL-1α、IL-1β共同的拮抗剂，虽然结合后并不激活受体，但能阻断白细胞介素-1与该受体的结合及信号传导，达到特异性地封闭白细胞介素-1活性的目的。研究显示，白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白序列与IL-1α、IL-1β在受体结合部位即C-末端区显著相似。hIL-1Ra的氨基酸序列与小鼠的IL-1Ra有77％的同源性，IL-1Ra的生物学作用没有种属特异性(vandeVeerdonkFL,NeteaMG.NewInsightsintheImmunobiologyofIL-1FamilyMembers.FrontImmunol.2013Jul8；4:167.doi:10.3389/fimmu.2013.00167.eCollection2013.)。不同细胞产生的IL-1Ra分子量差异主要由糖基化程度的不同所致。已有研究证实，糖基化对IL-1Ra的生物学活性没有影响(HannumCH,WilcoxCJ,ArendWP,JoslinFG,DrippsDJ,HeimdalPL,ArmesLG,SommerA,EisenbergSP,ThompsonRC.Interleukin-1receptorantagonistactivityofahumaninterleukin-1inhibitor.Nature.1990Jan25；343(6256):336-40.MalyakM,SmithMFJr,AbelAA,ArendWP.Peripheralbloodneutrophilproductionofinterleukin-1receptorantagonistandinterleukin-1beta.JClinImmunol.1994Jan；14(1):20-30.)。

研究发现，白细胞介素-1由机体对炎症刺激反应产生，并介导炎症反应；IL-1受体信号传导的紊乱可引起类风湿性关节炎、糖尿病等严重的病况；白细胞介素-1受体拮抗剂能特异性地与IL-1受体结合，从而拮抗IL-1的各种生物学效应。在临床上广泛应用于治疗IL-1参与病理变化过程的相关疾病(ArendWP.ThebalancebetweenIL-1andIL-1Raindisease.CytokineGrowthFactorRev.2002Aug-Oct；13(4-5):323-40.)。2001年11月美国食品药品监督管理局批准了由美国Amgen公司研制的rhIL-1Ra，用于减轻年满18周岁，曾经一种或多种缓解病情的抗风湿药治疗失败患者的中至重度风湿性关节炎症状，是第一个以抑制IL-1为靶点的类风湿性关节炎治疗药物，成为类风湿性关节炎生物学治疗领域的研究热点(FleischmannR,SternR,IqbalI.Anakinra:aninhibitorofIL-1forthetreatmentofrheumatoidarthritis.ExpertOpinBiolTher.2004Aug；4(8):1333-44.)。还有研究显示，IL-1Ra的临床用量很大，需单次给药剂量高达100mg，由于IL-1Ra的分子量小，易被肾小球的滤过作用清除，其在血浆中的终末半衰期相对较短，只有4-6小时，为了维持体内有效的血药浓度，通常需要每天注射一次。延长IL-1Ra的血浆半衰期可带来广泛的临床益处，如，允许更低频率地给药，减轻注射部位的反应，减轻病人的痛苦等，因此，提供长效化的IL-1Ra将具有重要的社会意义和商业价值。

有关蛋白质的重组多肽修饰研究公开了重组多肽的氨基酸序列由天然存在的亲水性氨基酸组成，因而可生物降解且没有免疫原性，采用分子遗传操作将重组多肽与治疗性目的蛋白进行融合表达，可显著延长治疗性蛋白的半衰期(SchellenbergerV,WangCW,GeethingNC,SpinkBJ,CampbellA,ToW,ScholleMD,YinY,YaoY,BoginOetal:Arecombinantpolypeptideextendstheinvivohalf-lifeofpeptidesandproteinsinatunablemanner.NatBiotechnol2009,27(12):1186-1190)。目前已有研究证实重组多肽与人生长激素形成的融合蛋白、与胰高血糖素形成的蛋白均能有效延长目的蛋白的半衰期；与胰高血糖素样肽2相比，重组多肽与其融合形成的重组蛋白在小鼠、大鼠及猴子体内的半衰期分别为34h、38h和120h(ClelandJL,GeethingNC,MooreJA,RogersBC,SpinkBJ,WangCW,AltersSE,StemmerWP,SchellenbergerV:Anovellong-actinghumangrowthhormonefusionprotein(VRS-317):enhancedinvivopotencyandhalf-life.JPharmSci2012,101(8):2744-2754；AltersSE,McLaughlinB,SpinkB,LachinyanT,WangCW,PodustV,SchellenbergerV,StemmerWP:GLP2-2G-XTEN:apharmaceuticalproteinwithimprovedserumhalf-lifeandefficacyinaratCrohn'sdiseasemodel.PLoSOne2012,7(11):e50630)。此外，重组多肽与治疗性蛋白融合基因可通过大肠杆菌工程菌实现原核表达，与人血清白蛋白和人免疫球蛋白IgGFc片段真核表达相比，更具有产业化优势。

本申请的发明人拟提供一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，利用其生物相容性及生物可降解性的特点，延长相关药物蛋白的半衰期。

发明内容

本发明的目的是提供一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法，和在用于制备治疗类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化及炎症和神经退行性疾病的药物中的用途。本发明解决的关键技术问题是在延长白细胞介素-1受体拮抗剂的体内半衰期的同时保持其活性，降低免疫原性。

本发明提供了一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，该重组融合蛋白是由N-端白细胞介素-1受体拮抗剂与C-端天然存在的亲水性无重复序列多肽融合制成的重组蛋白；所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂能减少白细胞介素-1受体拮抗剂的免疫原性，延长白细胞介素-1受体拮抗剂在体内的半衰期；该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单，可用于大规模的药物级融合蛋白的生产和制备。

本发明中，所述天然存在的亲水性无重复序列多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；其编码的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；本发明中优选适合于大肠杆菌原核表达的编码的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；

SEQIDNo.1

GlyThrSerThrProGluSerGlySerAlaSerProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaProGlySerThrSerSerThrAlaGluSerProGlyProGlySerThrSerGluSerProSerGlyThrAlaProGlySerThrSerSerThrAlaGluSerProGlyProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerThrProGluSerGlySerAlaSerProGlySerThrSerSerThrAlaGluSerProGlyProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaPro

SEQIDNo.3

GGTACTTCTACTCCGGAAAGCGGTTCCGCATCTCCAGGTACTTCTCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACTGCTCCAGGTTCTACCAGCTCTACCGCTGAATCTCCTGGCCCAGGTTCTACCAGCGAATCCCCGTCTGGCACCGCACCAGGTTCTACTAGCTCTACCGCAGAATCTCCGGGTCCAGGTACTTCCCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTACTCCGGAAAGCGGCTCCGCATCTCCAGGTTCTACTAGCTCTACTGCTGAATCTCCTGGTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGCGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACCGCTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGTGAATCTTCTACCGCACCATGA

SEQIDNo.4

GGTACCTCTACGCCGGAATCTGGCAGTGCATCCCCGGGTACCTCACCGAGCGGTGAAAGCAGCACCGCTCCGGGTACGAGCCCGTCTGGTGAATCTAGTACCGCCCCGGGTTCCACCAGCAGCACCGCAGAATCACCGGGTCCGGGTAGTACCAGCGAATCACCGAGCGGTACCGCACCGGGTTCTACCAGCAGCACCGCTGAAAGTCCGGGTCCGGGTACCAGCCCGAGCGGCGAATCTAGCACCGCACCGGGTACCAGCACGCCGGAAAGTGGTAGCGCCTCACCGGGCAGCACCAGCAGCACCGCCGAAAGCCCGGGTCCGGGTACCTCGCCGTCTGGCGAAAGCAGCACCGCACCGGGCACGTCTCCGAGTGGCGAATCGTCCACCGCTCCGGGCACCAGTCCGTCGGGCGAATCCTCCACCGCTCCGTAA

本发明中，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述白细胞介素-1受体拮抗剂包括但不限于人白细胞介素-1受体拮抗剂原型及其突变型；

SEQIDNo.2

MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE

本发明中，编码上述制得的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；

SEQIDNo.5

ATGCGACCCTCTGGGAGAAAATCCAGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACAACCAACTAGTTGCCGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATGTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGTCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACCTGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCACCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTTCCAGGAGGACGAGAATTCAGGTACTTCTACTCCGGAAAGCGGTTCCGCATCTCCAGGTACTTCTCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACTGCTCCAGGTTCTACCAGCTCTACCGCTGAATCTCCTGGCCCAGGTTCTACCAGCGAATCCCCGTCTGGCACCGCACCAGGTTCTACTAGCTCTACCGCAGAATCTCCGGGTCCAGGTACTTCCCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTACTCCGGAAAGCGGCTCCGCATCTCCAGGTTCTACTAGCTCTACTGCTGAATCTCCTGGTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGCGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACCGCTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGTGAATCTTCTACCGCACCATGA

本发明中，所述的亲水性无重复序列多肽可以以SEQIDNo.1所述氨基酸序列为单位进行重复组合，与白细胞介素-1受体拮抗剂的N-端或C-端进行融合，其组合方式包括但不限于N-端白细胞介素-1受体拮抗剂和C-端亲水性无重复序列多肽的组合；

本发明中，所述白细胞介素-1受体拮抗剂与亲水性无重复序列多肽之间或亲水性无重复序列多肽之间进行间接融合所需氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；

SEQIDNo.6

GSSGSSGSSGSSG

本发明还提供了含有所述的编码亲水性无重复序列多肽的核苷酸序列，和编码所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列的载体。

本发明还提供了含有所述的编码亲水性无重复序列多肽的核苷酸序列，和编码所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞。

本发明的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白通过下述方法制备：

(1)获得亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因；

(2)构建亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因表达载体；

(3)构建含有组氨酸标签的亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因表达载体；

(4)表达亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白；

(5)纯化亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白；

(6)鉴定亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白；

(7)测定亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的活性；

(8)检测亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的药代动力学。

结果显示，所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂能减少白细胞介素-1受体拮抗剂的免疫原性，延长白细胞介素-1受体拮抗剂在体内的半衰期；该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单。

进一步的，本发明还提供了所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白在用于制备治疗类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、炎性肠病、红斑狼疮、乳腺癌、黑色素瘤、阿尔兹海默病、多发性硬化等神经退行性疾病、感染性疾病、恶性肿瘤的药物中的用途。

附图说明

图1，编码亲水性非重复序列多肽的目的基因PCR产物.

图2，编码亲水性非重复序列多肽的目的基因测序结果。

图3，编码白细胞介素-1受体拮抗剂的目的基因PCR产物。

图4，编码白细胞介素-1受体拮抗剂目的基因的测序结果。

图5，编码亲水性非重复序列多肽目的基因回收产物及pET28a-白细胞介素1受体拮抗剂、pET24b-白细胞介素1受体拮抗剂回收产物。

图6，编码重组人白细胞介素-1受体拮抗剂与亲水性非重复序列多肽融合蛋白目的基因的测序结果。

图7，编码白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽的目的基因PCR产物。

图8，白细胞介素-1受体拮抗剂与白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽融合蛋白的表达情况。

图9，白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽融合蛋白的纯化结果。

图10，白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽融合蛋白的鉴定结果。

图11，白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽融合蛋白活性测定结果。

图12，白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽融合蛋白药代动力学检测结果。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例进一步说明本发明，以下实施例仅起说明的作用，不能也不应将它们视为对本发明范围或精神的限制。本领域技术人员可以理解对于本发明的目的而言，可使用其他变化或替代形式。而本发明的目的仅由本说明书和所附权利要求书定义。

实施例1、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因的获得

人工化学合成亲水性非重复序列多肽编码基因序列，并将其克隆至pUC57质粒载体中。

首先以该质粒中的编码基因序列为模板，采用Primer设计引物，上游引物为：5’-cgatgaattcaggtacttctactccgg-3’,其中加下划线处为EcoRI酶切位点；下游引物：5’-agtctcgagtcatggtgcggtagaagat-3’,其中加下划线处为XhoI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。

采用PCR方法克隆含有EcoRI和XhoI酶切位点的亲水性非重复序列多肽编码基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示；PCR产物在500bp左右，与亲水性非重复序列多肽编码基因的预期大小(435bp)相符。

PCR反应I：在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀：

2XTaqMix25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；pUC57-融合蛋白编码基因质粒1μl；超纯水20μl；

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；72℃，30min。一共进行30个循环反应；

将克隆到的PCR产物连接pMD19-Tsimple载体，挑取阳性克隆，送至上海英骏贸易有限公司进行测序，测序结果如图2所示，经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致；

白细胞介素-1受体拮抗剂编码基因的获得：人外周血单核细胞在含有5μg/ml的脂多糖的RPMI1640培养基中培养18小时。采用Trizol进行RNA的提取，并采用逆转录试剂盒进行RNA的反转，最终获得cDNA；

以反转录获得的cDNA为模板，采用Primer设计引物，其中上游引物为：5’-cggcccatatgcgaccctctgggag-3’,其中下划线处为NdeI酶切位点；下游引物为：5’-atcgaattctcgtcctcctggaagtag-3’,其中下划线处为EcoRI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成；

采用PCR方法克隆含有NdeI和EcoRI酶切位点的白细胞介素-1受体拮抗剂基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果如图3所示：PCR产物的大小在500bp左右，与白细胞介素-1受体拮抗剂的目的基因大小(462bp)相符；

PCR反应II：在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀：

2XTaqMix25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；cDNA1μl；超纯水20μl；

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min。一共进行30个循环反应。最后，72℃，30min；

将克隆到的PCR产物连接pMD19-Tsimple载体，挑取阳性克隆，送至上海英骏贸易有限公司进行测序，测序结果如图4所示，经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致。

实施例2、构建亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因表达载体

取pET24b表达载体及pMD19-T-白细胞介素-1受体拮抗剂编码基因质粒，采用NdeI和EcoRI限制性核酸内切酶进行双酶切。双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，NdeI1ul，EcoRI1ul，2XbufferTango4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离。采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET24b表达载体回收5000bp左右的片段，pMD19-白细胞介素-1受体拮抗剂回收约500p的片段；

连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET24b表达载体酶切片段与白细胞介素-1受体拮抗剂基因目的片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒。将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成；

取构建成功的pET24b-白细胞介素-1受体拮抗剂和pMD19-亲水性非重复序列多肽编码基因质粒，采用EcoRI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，XhoI1ul，EcoRI1ul，2XbufferTango4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，实验结果如图5所示。采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET24b-白细胞介素-1受体拮抗剂表达载体回收5800bp左右的片段，pMD19-亲水性非重复序列多肽编码基因回收约500p的片段；

连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET24b-白细胞介素-1受体拮抗剂基因目的片段与亲水性非重复序列多肽编码基因片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒。将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成。

实施例3、构建含有组氨酸标签的亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白编码基因表达载体

取pET28a表达载体及pMD19-T-白细胞介素-1受体拮抗剂编码基因质粒，采用NdeI和EcoRI限制性核酸内切酶进行双酶切。双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，NdeI1ul，EcoRI1ul，2XbufferTango4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离。采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET28a表达载体回收5000bp左右的片段，pMD19-白细胞介素-1受体拮抗剂回收约500p的片段；

连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET28a表达载体酶切片段与白细胞介素-1受体拮抗剂基因目的片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒。将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成；

取构建成功的pET28a-白细胞介素-1受体拮抗剂和pMD19-亲水性非重复序列多肽编码基因质粒，采用EcoRI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，XhoI1ul，EcoRI1ul，2XbufferTango4ul,无菌水4ul。37℃酶切5h。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，实验结果如图5所示。采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET28a-白细胞介素-1受体拮抗剂表达载体回收5800bp左右的片段，pMD19-亲水性非重复序列多肽编码基因回收约500p的片段；

连接反应在T4DNA连接酶催化下进行，pET28a-白细胞介素-1受体拮抗剂基因目的片段与亲水性非重复序列多肽编码基因片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶1ul，10XT4DNA连接酶缓冲液2.5ul，16℃连接过夜；

连接产物转化感受态大肠杆菌Top10，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒。将扩大培养的菌液采用pET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成，测序结果如图6所示。

采用PCR方法克隆含有NdeI和XhoI酶切位点的白细胞介素-1受体拮抗剂-亲水性非重复序列多肽基因，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果如图7所示：PCR产物的大小在900bp左右，与白细胞介素-1受体拮抗剂的目的基因大小(897bp)相符；

PCR反应II：在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀：

2XTaqMix25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；cDNA1μl；超纯水20μl。

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min。一共进行30个循环反应。最后，72℃，30min。

实施例4、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的表达

将测序正确的pET28a-亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白编码基因质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)condonplus，涂布于硫酸卡那霉素和氯霉素抗性LB平板，37℃培养过夜。随机挑取平板上4个单菌落，扩大培养，按1％的比例转接至3ml新鲜LB试管中，37℃震荡培养至OD600≈0.6时，分别取样加入终浓度为0.5mM和1mM的IPTG，继续震荡培养3小时，取1ml菌液离心收集菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。实验结果如图8所示，与未经IPTG诱导对照组相比，IPTG诱导的实验组在40KDa附近有目的蛋白表达，大小与预期相符。

实施例5、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的纯化

取诱导后的大肠杆菌，8000rpm离心15min收集菌体。将菌体用生理盐水进行洗涤后，按每g菌体加入5ml生理盐水，将菌体重悬，进行超声破碎，其中破碎时间2s，间隔2s，共进行8次循环，每次破碎4min。将破碎的菌液8000rpm离心15min，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。取破碎后的上清上样至生理盐水平衡的镍柱，并采用含不同浓度咪唑的生理盐水进行梯度洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测。实验结果如图9所示。将纯化到的目的蛋白溶液置于生理盐水中透析，除去其中的咪唑，获得亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白。

实施例6、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的鉴定

融合蛋白采用免疫印迹方法进行鉴定。取纯化的融合蛋白样品5μg上样于点样孔中，100V电压恒压电泳。电泳结束后，取出凝胶进行电转，100mA恒流转膜120min。转膜后，将PVDF膜取出，用TBS漂洗3次，每次5min；漂洗之后加入适量的3％牛血清白蛋白，封闭处理1h；弃去封闭液，用TBST快速漂洗3次，随后用TBST洗膜3次，每次10min。加入抗白细胞介素-1受体拮抗剂单克隆抗体，4℃反应过夜；用TBST洗膜3次，每次10min；室温孵育二抗1h。将膜用TBST漂洗3次，每次10min。使用化学发光试剂盒进行显色，曝光拍照。实验结果如图10所示：抗白细胞介素-1受体拮抗剂抗体可与目的条带特异性结合，且信号较强。说明基因工程构建的亲水性非重复序列多肽-白细胞介素-1受体拮抗剂大肠杆菌工程菌表达出的蛋白质为亲水性非重复序列多肽-白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白。

实施例7、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的活性测定

亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的活性测定采用A375.S2细胞杀伤中和试验进行。取白细胞介素1受体拮抗剂参考品，以1ml无血清的MEM培养基(含4ng/ml的白细胞介素-1β)完全溶解，并预稀释至100Au/ml。采用同样的方法稀释待检样品，将预稀释的参考品和待检样品以上述培养液于96孔培养板上进行3倍系列稀释，同稀释8个稀释度，每个稀释度设3个复孔。A375.S2细胞以含10％胎牛血清的MEM培养基在37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养生长成单层时传代，48小时后消化收集细胞，制成8.0X10⁴个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。再加入稀释好的参考品和待检样品，每孔100μl，于37℃，5％CO₂及饱和湿度下继续培养72小时，加入CCK-8，放置30分钟，并于450nm吸光值下进行测定，绘制细胞存活曲线。实验结果如图11所示：亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的活性与原型的白细胞介素-1受体拮抗剂活性相似，无显著差异。

实施例8、亲水性非重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白的药代动力学实验

取雄性ICR小鼠5只，按16mg/kg剂量皮下注射给药，眼眶取血采集每个时间点的血样，再将血样离心30min后分离血清，-20℃保存。具体采血时间点为0,5,15，30min，1,2,4,8,12,24h。采用人IL1RA检测试剂盒检测血样浓度；按照试剂盒要求准备好所有溶液和标准工作液以及条板，检测结果如图12所示。

SEQUENCELISTING

<110>复旦大学

<120>一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法和用途

<160>5

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>144

<212>PRT

<213>天然存在的亲水性无重复序列多肽

<400>1

GlyThrSerThrProGluSerGlySerAlaSerProGlyThrSerPro

151015

SerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSer

202530

SerThrAlaProGlySerThrSerSerThrAlaGluSerProGlyPro

354045

GlySerThrSerGluSerProSerGlyThrAlaProGlySerThrSer

505560

SerThrAlaGluSerProGlyProGlyThrSerProSerGlyGluSer

65707580

SerThrAlaProGlyThrSerThrProGluSerGlySerAlaSerPro

859095

GlySerThrSerSerThrAlaGluSerProGlyProGlyThrSerPro

100105110

SerGlyGluSerSerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSer

115120125

SerThrAlaProGlyThrSerProSerGlyGluSerSerThrAlaPro

130135140

<210>2

<211>153

<212>PRT

<213>白细胞介素-1受体拮抗剂

<400>2

MetArgProSerGlyArgLysSerSerLysMetGlnAlaPheArgIle

151015

TrpAspValAsnGlnLysThrPheTyrLeuArgAsnAsnGlnLeuVal

202530

AlaGlyTyrLeuGlnGlyProAsnValAsnLeuGluGluLysIleAsp

354045

ValValProIleGluProHisAlaLeuPheLeuGlyIleHisGlyGly

505560

LysMetCysLeuSerCysValLysSerGlyAspGluThrArgLeuGln

65707580

LeuGluAlaValAsnIleThrAspLeuSerGluAsnArgLysGlnAsp

859095

LysArgPheAlaPheIleArgSerAspSerGlyProThrThrSerPhe

100105110

GluSerAlaAlaCysProGlyTrpPheLeuCysThrAlaMetGluAla

115120125

AspGlnProValSerLeuThrAsnMetProAspGluGlyValMetVal

130135140

ThrLysPheTyrPheGlnGluAspGlu

145150

<210>3

<211>435

<212>DNA

<213>天然存在的亲水性无重复序列

<400>3

ggtacttctactccggaaagcggttccgcatctccaggtacttctcctagcggtgaatct60

tctactgctccaggtacctctcctagcggcgaatcttctactgctccaggttctaccagc120

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tctaccgcaccatga435

<210>4

<211>435

<212>DNA

<213>大肠杆菌原核表达的编码

<400>4

ggtacctctacgccggaatctggcagtgcatccccgggtacctcaccgagcggtgaaagc60

agcaccgctccgggtacgagcccgtctggtgaatctagtaccgccccgggttccaccagc120

agcaccgcagaatcaccgggtccgggtagtaccagcgaatcaccgagcggtaccgcaccg180

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agcaccgccgaaagcccgggtccgggtacctcgccgtctggcgaaagcagcaccgcaccg360

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tccaccgctccgtaa435

<210>5

<211>899

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>

<400>5

atgcgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaac60

cagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgccggatacttgcaaggaccaaat120

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acctctactccggaaagcggctccgcatctccaggttctactagctctactgctgaatct780

cctggtccaggtacctcccctagcggcgaatcttctactgctccaggtacctctcctagc840

ggcgaatcttctaccgctccaggtacctcccctagcggtgaatcttctaccgcaccatg899

Claims (11)

1.一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白是由N-端白细胞介素-1受体拮抗剂与C-端天然存在的亲水性无重复序列多肽融合制成；

所述天然存在的亲水性无重复序列多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；

所述白细胞介素-1受体拮抗剂的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

2.根据权利要求1所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂选自人白细胞介素-1受体拮抗剂原型及其突变型。

3.根据权利要求1所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，编码所述的亲水性无重复序列多肽的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。

4.根据权利要求1所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，编码所述的亲水性无重复序列多肽的适合于大肠杆菌原核表达的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

5.编码权利要求1、3、4任一项所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQIDNo.5所示。

6.根据权利要求1所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，所述的亲水性无重复序列多肽以SEQIDNo.1所述氨基酸序列为单位进行重复组合，与白细胞介素-1受体拮抗剂的N-端或C-端进行融合，其组合方式为N-端白细胞介素-1受体拮抗剂和C-端亲水性无重复序列多肽的组合。

7.根据权利要求6所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，所述的亲水性无重复序列多肽与白细胞介素-1受体拮抗剂之间或多肽之间的融合为直接融合或间接融合。

8.根据权利要求7所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白，其特征在于，所述白细胞介素-1受体拮抗剂与亲水性无重复序列多肽之间或亲水性无重复序列多肽之间进行间接融合所需氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。

9.含有所述的编码亲水性无重复序列多肽的核苷酸序列，和编码所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列的载体。

10.含有所述的编码亲水性无重复序列多肽的核苷酸序列，和编码所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞。

11.权利要求1～8任一项所述的长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白在制备治疗类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、炎性肠病、红斑狼疮、乳腺癌、黑色素瘤,阿尔兹海默病、多发性硬化等神经退行性疾病、感染性疾病或恶性肿瘤药物中的用途。