CN102250254A - 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA序列、含有该DNA序列的载体、含该载体的宿主细胞或者转基因动物、该融合蛋白的制备方法以及该融合蛋白的应用。本发明所述TRAIL融合蛋白从N端至C端包括交联区、人源亮氨酸拉链序列以及人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以显著增加稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用。
背景技术
肿瘤是一类严重威胁人类健康与生命的疾病，肿瘤的治疗已经成为日益迫切需要解决的重大公共卫生问题。近年来尽管抗肿瘤药物研究已经有了很大的发展，但仍存在着针对性差，对正常细胞也产生杀伤作用等缺陷，使之应用受到很大限制。因此，研制靶向性杀伤肿瘤细胞的基因工程药物仍具有重大的社会效益与经济效益。
1995年，Wiley SR等报道从人表达标签序列文库(EST，expressedsequence tag)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素2配体(Apo2L)，属于肿瘤坏死因子超家族(Wiley SR，et al.，Immunity 3：673-682，1995)。TRAIL与DR4或DR5受体结合后，DR4和DR5的死亡结构域传导凋亡的信号通过FADD和依赖caspase 8机制在细胞内途径和细胞外途径实现的。TRAIL对于大多数恶性肿瘤有抑制细胞生长和细胞毒效应，而人体的正常细胞则对TRAIL诱导的凋亡耐受(Ashkenazi A，et al.，JClin Invest 104：155-162，1999)。因其特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞没有显著细胞毒性的特点，因此TRAIL在肿瘤治疗中具有良好的前景，自发现以来一直被作为肿瘤治疗研究的热点。TRAIL虽然在体内体外实验以及临床实验中均显示了很显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有40分钟，严重影响了TRAIL蛋白在体内的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种TRAIL融合蛋白，此种融合蛋白可以显著的增加蛋白稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果。
本发明提供的TRAIL融合蛋白包括：(1)包含至少二个半胱氨酸的交联区；(2)人源亮氨酸拉链结构域；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。
TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是一种在本技术领域内被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示.
依照本发明，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：(1)交联区，其中包括至少二个半胱氨酸可以形成分子间二硫键；(2)人源亮氨酸拉链序列；(3)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；(4)人源TRAIL多肽或其胞外区，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体DR5(TRAIL-RII)相结合。
基于本发明的目的，融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。
作为优选，所述交联区为不少于3个但不多于30个氨基酸的氨基酸序列，
更优选地，所述交联区含有不多于10个氨基酸的人源氨基酸序列。
在本发明的具体实施例中，其中所述交联区含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
作为优选，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdx1或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。
在本发明的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在一种实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
本发明也提供了包含3个融合蛋白分子的寡聚体，这种寡聚体的形成是通过融合蛋白中的二硫键以及亮氨酸拉链结构域进行加强的。
本发明也涵盖了编码融合蛋白的DNA分子。在一种实施方案中，所述DNA分子含有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了包括转录起始区，受转录起始区调控的编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子以及转录中止区的表达盒以及重组了编码所述融合蛋白DNA分子的表达载体。作为优选，所述表达载体为质粒或病毒。
此外，本发明进一步提供了重组了编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子以及表达所述的融合蛋白的细胞和转基因动物。该细胞可以是哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母或者细菌。转基因动物可以是转基因羊，牛，等等。
在本发明的实施例中，具体提供一种重组了编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于2010年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3837。
另外，本发明也提供了所述融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：含有编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子的细胞或转基因动物，该细胞或转基因动物表达所述融合蛋白以及分离所述融合蛋白。
在又一个方面，本发明提供了所述的融合蛋白的应用，即生产用于治疗一种疾病的药物，例如，由不可控制的细胞生长导致的人类疾病如，肿瘤，银屑病，自身免疫性疾病等。
动物试验显示，人源TRAIL蛋白对照组对肿瘤的抑制率为80.34％，而本发明所述融合蛋白组肿瘤完全消失，且裸鼠状态明显好于给予人源TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与TRAIL相比，本发明所述融合蛋白毒性更低。另外，本发明所述融合蛋白的体内半衰期为218分钟。人源TRAIL蛋白的体内半衰期为42分钟，本发明所述融合蛋白的体内半衰期大约是TRAIL的5倍左右。
生物保藏说明
分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3837。
附图说明
图1显示的是融合蛋白结构示意图。
A-交联区
B-人源亮氨酸拉链结构域
C-连接区
D-TRAIL胞外区
图2显示的是LZ-TRAIL蛋白的表达与纯化的SDS-PAGE鉴定结果。
泳道1：未诱导的细胞裂解物；
泳道2：1mM IPTG诱导后的细胞裂解物；
泳道3：蛋白分子量标准；
泳道4：金属亲和层析纯化后的LZ-TRAIL蛋白；
泳道5：离子交换层析纯化后的LZ-TRAIL蛋白。
箭头所示为目标蛋白。
图3显示乳腺癌细胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的肿瘤生长曲线。
图4显示乳腺癌细胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的体重变化曲线。
图5显示的是人源TRAIL蛋白给药后小鼠体内血药浓度变化曲线。
图6显示的是本发明所述融合蛋白给药后小鼠体内血药浓度变化曲线。
具体实施方式：
本发明公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA、表达载体、细胞、转基因动物及其制备方法和其在医药领域的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：(1)交联区，其中包括至少二个半胱氨酸可以形成分子间二硫键；(2)人源亮氨酸拉链序列；(3)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；(4)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体DR5(TRAIL-RII)相结合。
亮氨酸拉链(leucine zipper)是一种可以自发形成多聚体的结构域，存在于多种天然蛋白中。此类结构一般呈卷曲螺旋结构，通过特征α-螺旋的相互作用自发形成多聚体。例如Haudenschild等人(Haudenschild DR，et al.，J Biol Chem 270：23150-23154，1995)描述一种结缔组织蛋白martrilin，又称为软骨基质蛋白(CMP)，其三个蛋白分子在C端的亮氨酸拉链结构域的作用下，形成同源三聚体。分子间二硫键的形成可以进一步稳定这种三聚体的结构。
本发明所述融合蛋白中的人源亮氨酸拉链结构域可以来源于任何人源蛋白。在本技术领域中已为人所熟知的是，在多种天然蛋白中发现有亮氨酸拉链结构域的存在。亮氨酸拉链结构域可以相互作用形成二体或者三体。因此，本发明所述融合蛋白中包含的亮氨酸拉链结构域可以促进融合蛋白的寡聚化因而能够增加稳定性。优选的是选择可以促进融合蛋白形成三聚体的人源亮氨酸拉链。适合的人源亮氨酸拉链结构域例如人c-fos，c-jun，c-myc，max和mdx1蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。优选的是来自人matrilin蛋白的人源亮氨酸拉链结构域。在一个优选实施方案中，融合蛋白中的人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ IDD NO：2所述的氨基酸序列。
交联区可以是包括不少于3个但不多于30个氨基酸的氨基酸序列。上述氨基酸序列至少含有二个半胱氨酸可以形成分子间二硫键。交联区至少含有二个半胱氨酸可以形成分子间二硫键，这一点对进一步稳定本发明所述融合蛋白的寡聚体，优选的是三聚体，是至关重要的。优选的是交联区含有大约3至20个氨基酸，更加优选的是含有大约3至10个氨基酸。在一个优选实施方案中，融合蛋白交联区含有如SEQ IDD NO：1所述的氨基酸序列。
本发明所述融合蛋白的各部分氨基酸序列可以直接由肽键连接到一起。视需要而定，连接区可以有2至10个氨基酸连接亮氨酸拉链与人源TRAIL多肽。在一个实施方案中，连接区有两个氨基酸：甘氨酸-丝氨酸-。
在一个优选实施方案中，本发明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO：4所述的氨基酸序列。
另外，本发明也提供了包含3个本发明所述的融合蛋白结合形成的寡聚体。寡聚体的形成是依赖人源TRAIL多肽的三聚化，以及通过亮氨酸拉链结构域的分子间相互作用和交联区形成的分子间二硫键得到加强。在寡聚体中的融合蛋白的稳定性和半衰期都有所加强。
本发明的另一方面也提供了编码本发明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码含有如SEQ IDD NO：4所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子。在一个优选实施方案中，DNA分子含有如SEQ IDD NO：5所述的核苷酸序列。
为了生产本发明的融合蛋白和寡聚体，编码融合蛋白的DNA分子被整合至表达盒中，随后表达盒被插入合适的表达载体。然后，这一表达载体被转入宿主细胞或者动物用于重组蛋白表达。
表达盒至少包括以下几个内容：(1)转录起始区，(2)编码本发明所述融合蛋白的DNA分子，该转录是在在转录起始区的调控下进行的，以及(3)转录中止区。根据用于蛋白表达的宿主细胞的不同，转录起始区和转录中止区可以是天然存在或者人工构建的序列，该序列适合于真核或者原核细胞中的基因转录。此类序列在本技术领域内已为人所熟知。适当的含有转录起始序列的DNA片与适当的含有转录中止区的DNA片段与编码融合蛋白的DNA片段相连接。这种连接方法在本技术领域内已为人所熟知，比如，选择适当的限制性内切酶酶切以及连接。
表达盒可以被整合插入表达载体，随后这一表达载体被转入宿主细胞或者动物。一般情况下，表达载体还要包括复制起始序列，以及筛选标记，例如，对于细菌的蛋白表达，质粒是一种很有用途的载体。本技术领域内有很多种为人所熟知的可以用于此目的的质粒载体，包括，但是不仅限于，pET25b，pET15b等等。如果通过酵母细胞来重组表达融合蛋白，酵母表达载体，比如pPIC9，pAO815，pPICZ等等，可以作为表达载体。如果通过哺乳动物细胞来进行蛋白表达，也有很多合适的重组蛋白表达载体。用于哺乳动物细胞表达蛋白的表达载体包含的DNA序列，需要适合以同源重组方式整合插入宿主细胞染色体。哺乳动物细胞表达载体，比如pcDNA3.1，pSI等等。对于通过动物来表达融合蛋白，用于生产含有表达盒的转基因动物(转基因羊，牛，等等)的技术手段，在本技术领域内已为人所熟知。比如pBLG等等，可以作为转基因动物表达的载体。
获得转化的宿主细胞或者转基因动物后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下表达出融合蛋白。通过其理化性质和其它特性的差别运用各种分离方法分离纯化融合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，例如：常规的变性复性处理、离心、超声破碎、超滤膜过滤、金属亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、透析、高效液相层析等常规纯化方法及这些方法的结合。
下面将结合最佳实施例的详细描述和附图，进一步说明本发明前述的和其他的优点和特点。
实施例1.构建融合蛋白表达载体
以上海旭冠生物科技发展有限公司合成的亮氨酸拉链(LZ，包含交联区与人源亮氨酸拉链结构域)片段为模板，通过PCR方法扩增出所需的DNA片段，所用引物LZ1和LZ2由上海生工生物工程技术有限公司合成。其中引物LZ2除含有LZ片段的3’末端序列，还在其3’末端后加入编码GlySer接头肽的序列。
LZ1：5’CATGCCATGGCCCATATGGAGGAAGACCCGTGTGC
LZ2：5’CGGGATCCGACAACTGTGTTCTCCAGGATG
TRAIL片段是截取TRAIL全序列第95～281位氨基酸，用PCR方法从人胎肝库cDNA文库(购自Clontech Lanoratories Inc.USA)扩增，所用引物TRAIL1和TRAIL2由上海生工生物工程技术有限公司合成。经序列分析，所得DNA序列与GenBank登记的序列(NM_003810)所显示的TRAIL编码序列一致，即获得了TRAIL的DNA序列。
TRAIL1：5’CGGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG
TRAIL2：5’GGGAATTCTCATTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
以NdeI和BamHI酶切LZ片段PCR扩增产物(工具酶皆购自Takara公司)，以BamHI和EcoRI酶切TRAIL序列PCR扩增产物，以NdeI和EcoRI酶切pET25b空质粒(购自Novage公司)。上述酶切片段均以琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4DNA连接酶连接各片段，所得的重组质粒即为TRAIL融合蛋白的表达载体，命名为pET-LZ-TRAIL。融合蛋白结构如图1所示。
按常规方法将上述获得的pET-LZ-TRAIL质粒转化大肠杆菌Rosetta，[基因型：F-omp T hsd SB(rB-mB-)gal dcm lacY1(DE3)pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(Cmr)](购自北京全式金生物技术有限公司)，从氨苄抗性菌落中分离质粒DNA，酶切鉴定，测序确认，所得的阳性克隆即为表达相应蛋白的工程菌。
实施例2：制备融合蛋白
将重组质粒pET-LZ-TRAIL转化的大肠杆菌Rosetta克隆加在含LB培养基的培养瓶中培养(37℃)，待细菌密度达到OD600≈0.8，向培养基中加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。约6个小时后，以5,000×g(30分钟)收获菌体。
将收获的菌体重悬于Tris缓冲液(pH8.0)中，超声破碎菌体。破菌后以10,000×g离心30分钟收集上清。将如上方法获得的破碎上清上样于Ni sepharose 6 Fast flow(GE公司)进行金属亲和层析，40mM咪唑洗脱杂蛋白，再以120mM咪唑洗脱重组蛋白。洗脱液再过Qsepharose Fast flow(GE公司)进行离子交换层析进一步纯化，即可得到高纯度的重组蛋白。结果见图2。
实施例3：体内药效实验
皮下接种乳腺癌细胞MDA-MB231建立裸鼠荷瘤模型，模型建立后进行实验。实验分阴性对照组、阳性对照组(人源TRAIL蛋白的胞外区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)与试验组(LZ-TRAIL)。每组6只裸鼠，肿瘤组织接种后长至0.1cm3每天皮下给药，按等摩尔剂量给药，给药剂量分别为300ug/只/次(TRAIL)以及450ug/只/次(LZ-TRAIL)，共给药14次。停药后观察6天，处死裸鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤种和抑瘤率。抑瘤率以下式计算。
结果为TRAIL组抑制率为80.34％，而LZ-TRAIL组肿瘤完全消失。肿瘤生长曲线以及裸鼠体重变化见图3、图4。另外，LZ-TRAIL组裸鼠状态明显好于给予TRAIL的阳性对照组，表明与TRAIL相比LZ-TRAIL的毒性更低。
实施例4：TRAIL的体内半衰期检测
体内半衰期检测分为对照组(TRAIL)与试验组(LZ-TRAIL)，每组2只小鼠，采取尾静脉注射100μl蛋白。注射后按照给药后0min，5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，24h时间点框内取血100μl。血中TRAIL/LZ-TRAIL浓度通过ELISA法进行鉴定。血药浓度曲线见图5和图6。
血药浓度-时间曲线经DAS软件分析，该药在体内代谢过程符合三室模型，在实验条件下，TRAIL的体内半衰期为42分钟，具体数据结果见表1和表2。
表1TRAIL给药组血药浓度检测结果
| 时间(t)-min | 血药浓度(C)-ug/L | C拟合值 | 绝对误差 | 相对误差 | ln(C) | ln(C)拟合值 |
| 15 | 29504.92 | 29502.286 | 2.634 | 0 | 10.292 | 10.292 |
| 30 | 13577.71 | 13593.93 | -16.22 | -0.001 | 9.516 | 9.517 |
| 60 | 7331.007 | 7275.829 | 55.178 | 0.008 | 8.9 | 8.892 |
| 120 | 3028.734 | 3092.179 | -63.445 | -0.021 | 8.016 | 8.037 |
| 240 | 2042.38 | 1994.015 | 48.365 | 0.024 | 7.622 | 7.598 |
表2TRAIL体内动力学参数分析结果(三室模型：权重系数：1)
| 房室参数 | 单位 | 参数值 | 统计矩参数 | 单位 | 参数值 |
| T1/2α | min | 2.509 | AUC(0-t) | ug/L*min | 1774249.421 |
| T1/2β | min | 27.126 | AUC(0-∞) | ug/L*min | 1799452.359 |
| T1/2γ | min | 710725.613 | AUMC(0-t) | 97717879.35 | |
| V1 | L/kg | 0 | AUMC(0-∞) | 105303994.6 | |
| CL | L/min/kg | 0 | MRT(0-t) | min | 55.076 |
| AUC(0-t) | ug/L*min | 1996186.94 | MRT(0-∞) | min | 58.52 |
| AUC(0-∞) | ug/L*min | 2640264.191 | VRT(0-t) | min^2 | 4037.754 |
| K10 | 1/min | 0.266 | VRT(0-∞) | min^2 | 4868.524 |
| K12 | 1/min | 0.069 | Zeta | 1/min | 0.016 |
| K21 | 1/min | 0.035 | Zeta回归尾点 | 234 | |
| K31 | 1/min | 0.001 | Cz(尾点回归值) | ug/L | 413.155 |
| K13 | 1/min | -0.068 | t1/2z | min | 42.274 |
| Tmax | min | 15 | |||
| Vz | L/kg | 0.001 | |||
| CLz | L/min/kg | 0 | |||
| Cmax | ug/L | 29504.92 |
根据DAS分析软件分析结果，在实验条件下，LZ-TRAIL的体内半衰期为218分钟。TRAIL的体内半衰期为42分钟。从实验结果可以得知，LZ-TRAIL的体内半衰期大约是TRAIL的5倍左右，结果见表3和表4。
表3LZ-TRAIL给药组血药浓度检测结果
| 时间(t) | 浓度(C) | C拟合值 | 绝对误差 | 相对误差 | ln(C) | ln(C)拟合值 |
| 15 | 32702.81 | 32701.376 | 1.434 | 0 | 10.395 | 10.395 |
| 30 | 16862.72 | 16966.906 | -104.186 | -0.006 | 9.733 | 9.739 |
| 60 | 11781.55 | 11381.947 | 399.603 | 0.034 | 9.374 | 9.34 |
| 120 | 6517.472 | 7497.637 | -980.165 | -0.15 | 8.782 | 8.922 |
| 240 | 6154.013 | 4858.839 | 1295.174 | 0.21 | 8.725 | 8.489 |
| 480 | 1452.233 | 2263.572 | -811.339 | -0.559 | 7.281 | 7.725 |
| 1440 | 337.1226 | 107.326 | 229.797 | 0.682 | 5.82 | 4.676 |
表4LZ-TRAIL体内动力学参数分析结果
| 房室参数 | 单位 | 参数值 | 统计矩参数 | 单位 | 参数值 |
| t1/2α | min | 2.291 | AUC(0-t) | ug/L*h | 4421009.554 |
| t 1/2β | min | 21.315 | AUC(0-∞) | ug/L*h | 4553018.683 |
| t1/2γ | min | 218.255 | AUMC(0-t) | 1038054958 | |
| V1 | L/kg | 0 | AUMC(0-∞) | 1280551393 | |
| CL | L/min/kg | 0 | MRT(0-t) | min | 234.8 |
| AUC(0-t) | ug/L*min | 4882205.534 | MRT(0-∞) | min | 281.253 |
| AUC(0-∞) | ug/L*min | 5463514.36 | VRT(0-t) | min^2 | 83053.52 |
| K10 | 1/min | 0.189 | VRT(0-∞) | min^2 | 157481.732 |
| K12 | 1/min | 0.05 | Zeta | 1/min | 0.003 |
| K21 | 1/min | 0.038 | Zeta回归尾点 | 135 | |
| K31 | 1/min | 0.006 | Cz(尾点回归值) | ug/L | 332.544 |
| K13 | 1/min | 0.055 | t1/2z | min | 275.098 |
| Tmax | min | 15 | |||
| Vz | L/kg | 0.002 | |||
| CLz | L/min/kg | 0 | |||
| Cmax | ug/L | 32702.81 |
以上结果显示，本发明所述TRAIL融合蛋白可以显著增加稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果，具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>江苏先声药物研究有限公司
<120>肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用
<130>MP1002178
<160>8
<170>Patent In version 3.3
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sa piens
<400>1
Met Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser
1 5 10
<210>2
<211>34
<212>PRT
<213>Homo sa piens
<400>2
Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr
1 5 10 15
Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr
20 25 30
Val Val
<210>3
<211>187
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile
1 5 10 15
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile
20 25 30
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
35 40 45
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
50 55 60
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
65 70 75 80
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe
85 90 95
Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met
100 105 110
Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
115 120 125
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 155 160
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210>4
<211>233
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Met Glu Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala
1 5 10 15
Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val
20 25 30
Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val Gly Ser Thr Ser
35 40 45
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
50 55 60
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
85 90 95
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
100 105 110
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
115 120 125
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
130 135 140
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
145 150 155 160
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
165 170 175
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
180 185 190
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
195 200 205
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
210 215 220
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
225 230
<210>5
<211>708
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>5
atggcccata tggaggaaga cccgtgtgcc tgcgagtccc tggtgaaatt
ccaagccaaa 60
gtggaggggc tgctgcaggc cctgaccagg aaactggaag ctgtgagtaa
gcggctggcc 120
atcctggaga acacagttgt cggatccacc tctgaggaaa ccatttctac
agttcaagaa 180
aagcaacaaa atatttctcc cctagtgaga gaaagaggtc ctcagagagt
agcagctcac 240
ataactggga ccagaggaag aagcaacaca ttgtcttctc caaactccaa
gaatgaaaag 300
gctctgggcc gcaaaataaa ctcctgggaa tcatcaagga gtgggcattc
at tcctgagc 360
aacttgcact tgaggaatgg tgaactggtc atccatgaaa aagggtttta
ctacatctat 420
tcccaaacat actttcgatt tcaggaggaa ataaaagaaa acacaaagaa
cgacaaacaa 480
atggtccaat atatttacaa atacacaagt tatcctgacc ctatattgtt
gatgaaaagt 540
gctagaaata gttgttggtc taaagatgca gaatatggac tctattccat
ctatcaaggg 600
ggaatatttg agcttaagga aaatgacaga atttttgttt ctgtaacaaa
tgagcacttg 660
atagacatgg accatgaagc cagttttttc ggggcctttt tagttggc
708
<210>6
<211>168
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80
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Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
130 135 140
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165
<210>7
<211>281
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
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1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
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Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
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195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
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Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
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<210>8
<211>241
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys
1 5 10 15
Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser
20 25 30
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His
210 215 220
Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val
225 230 235 240
Gly
Claims (22)
1.一种融合蛋白，包括：(1)包含至少二个半胱氨酸的交联区；(2)人源亮氨酸拉链结构域；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含由不多于10个氨基酸组成的连接区。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述交联区为不少于3个但不多于30个氨基酸的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述交联区含有不多于10个氨基酸的人源氨基酸序列。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述交联区含有如SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
6.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdx1或人matrilin蛋白含有的亮氨酸拉链结构域。
7.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源TRAIL蛋白胞外区的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
9.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
10.一种寡聚体，其特征在于，该寡聚体是由三个权利要求1-8任一项所述融合蛋白形成。
11.编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白的DNA序列。
12.根据权利要求11所述的DNA序列，其特征在于，含有如SEQ ID NO：5 所示的核苷酸序列。
13.一种表达盒，包括：转录起始区；受转录起始区调控的编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白的DNA分子；以及转录中止区。
14.重组了编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白DNA分子的表达载体。
15.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒或病毒。
16.重组了编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白的DNA分子的细胞。
17.如权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌或细菌。
18.根据权利要求17所述的细胞，其特征在于，所述细胞属大肠杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.3837。
19.一种转基因动物，其特征在于，转染了编码权利要求1-9任一项所述融合蛋白的DNA分子且表达所述融合蛋白。
20.权利要求1-9任一项所述融合蛋白的制备方法，包括：
提供权利要求16-19任一项所述细胞或权利要求19所述转基因动物；
使细胞或者转基因动物表达所述融合蛋白；以及
分离所述融合蛋白。
21.如权利要求1-9任一项所述融合蛋白在制造治疗细胞过度增生导致的疾病或免疫系统疾病的药物中的用途。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
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