WO2013013639A1

WO2013013639A1 - 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用

Info

Publication number: WO2013013639A1
Application number: PCT/CN2012/079233
Authority: WO
Inventors: 周兵; 周宇; 姜静
Original assignee: 山东先声麦得津生物制药有限公司; 江苏先声药物研究有限公司
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2013-01-31
Also published as: US20140206843A1; US9403892B2; CN102898526A

Abstract

公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA序列、含有该DNA序列的载体、含该载体的宿主细胞或者转基因动物、该融合蛋白的制备方法以及该融合蛋白的应用，其中所述融合蛋白包含：（1）人源亮氨酸拉链结构域；（2）人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。

Description

一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用本申请要求于 2011 年 7 月 28 日提交中国专利局、申请号为 201110213943.9、发明名称为"一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用"的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用。背景技术

肿瘤是一类严重威胁人类健康与生命的疾病，肿瘤的治疗已经成为日益迫切需要解决的重大公共卫生问题。近年来尽管抗肿瘤药物研究已经有了很大的发展，但仍存在着针对性差，对正常细胞也产生杀伤作用等缺陷，使之应用受到很大限制。因此，研制靶向性杀伤肿瘤细胞的基因工程药物仍具有重大的社会效益与经济效益。

1995年， Wiley SR等报道从人表达标签序列文库（ EST,expressed sequence tag ) 中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体 (tumor necrosis factor-relate

d apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 又称凋亡素 ²配体 (Apo2L), 属于肿瘤坏死因子超家族 ( Wiley SR, et al, Immunity 3:673-682, 1995 )。 TRAIL与 DR4或 DR5受体结合后， DR4和 DR5的死亡结构域传导凋亡的信号通过 FADD和依赖 caspase 8 机制在细胞内途径和细胞外途径实现的。 TRAIL对于大多数恶性肿瘤有抑制细胞生长和细胞毒效应，而人体的正常细胞则对 TRAIL诱导的凋亡耐受 ( Ashkenazi A,et al" J Clin Invest 104: 155-162, 1999 )。因其特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞没有显著细胞毒性的特点，因此 TRAIL在肿瘤治疗中具有良好的前景，自发现以来一直被作为肿瘤治疗研究的热点。 TRAIL 虽然在体内体外实验以及临床实验中均显示了很显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有 40分钟，严重影响了 TRAIL蛋白在体内的疗效。发明内容

本发明的目的是提供一种 TRAIL融合蛋白，此种融合蛋白可以显著的增加蛋白稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果。

本发明提供的 TRAIL融合蛋白包括：（ 1 )人源亮氨酸拉链结构域；（2 ) 人源 TRAIL蛋白、人源 TRAIL蛋白胞外区或人源 TRAIL蛋白胞外区的片段。

TRAIL (肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）是一种在本技术领域内被熟知的蛋白。 TRAIL核苷酸序列 GenBank登录号 NM— 003810。 TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体 DR4(TRAIL-RI)和死亡受体 DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源 TRAIL蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:6所示，其胞外区是从 N端开始的第 41位至第 281位氨基酸，氨基酸序列如 SEQ ID NO:7所示.

依照本发明，一种 TRAIL融合蛋白从 N端至 C端具有如下序列：（ 1 )人源亮氨酸拉链序列；（2 )根据情况可有一不多于 10个氨基酸的连接区；（3 ) 人源 TRAIL蛋白、人源 TRAIL蛋白胞外区或人源 TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体 DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体 DR5(TRAIL-RII)相结合。

基于本发明的目的，融合蛋白中的人源 TRAIL 多肽可以是天然 TRAIL 蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体 DR4(TRAIL-RI)和死亡受体 DR5(TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的 TRAIL多肽可以是 TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源 TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。更加优选的是融合蛋白中的 TRAIL多肽是一种 TRAIL蛋白的可溶性片段，包含 TRAIL 蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源 TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中的人源 TRAIL多肽含有如 SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

作为优选，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人 c-fos, c-jun, c-myc, max 、 mdxl或人 matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。

在本发明的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

在一种实施方案中，其中所述 TRAIL融合蛋白包含 SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明也提供了包含 3 个融合蛋白分子的寡聚体，这种寡聚体的形成是通过亮氨酸拉链结构域进行加强的。

本发明也涵盖了编码融合蛋白的 DNA分子。在一种实施方案中，所述 DNA分子含有 SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了包括转录起始区，受转录起始区调控的编码本发明所述的融合蛋白的 DNA分子以及转录中止区的表达盒以及重组了编码所述融合蛋白 DNA分子的表达载体。作为优选，所述表达载体为质粒或病毒。

此外，本发明进一步提供了重组了编码本发明所述的融合蛋白的 DNA分子以及表达所述的融合蛋白的细胞和转基因动物。该细胞可以是哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母或者细菌。转基因动物可以是转基因羊，牛，等等。

在本发明的实施例中，具体提供一种重组了编码本发明所述的融合蛋白的 DNA分子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于 2011年 6月 14 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.4953。

另外，本发明也提供了所述融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：含有编码本发明所述的融合蛋白的 DNA分子的细胞或转基因动物，该细胞或转基因动物表达所述融合蛋白以及分离所述融合蛋白。

在又一个方面，本发明提供了所述的融合蛋白的应用，即生产用于治疗一种疾病的药物，例如，由不可控制的细胞生长导致的人类疾病如，肿瘤，银屑病，自身免疫性疾病等。

动物试验显示，人源 TRAIL蛋白对照组对肿瘤的抑制率为 35.8%, 而本发明所述融合蛋白组肿瘤完全消失，且棵鼠状态明显好于给予人源 TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与 TRAIL相比，本发明所述融合蛋白毒性更低。另外，本发明所述融合蛋白的体内消除速度明显低于 TRAIL蛋白，说明融合蛋白与 TRAIL相比半衰期明显延长。生物保藏说明菌株 LZ-TRAIL95CS , 分类命名：大肠埃希氏菌， Escherichia coli.于 20U 年 6月 14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC Νο·4953。附图说明

图 1显示的是融合蛋白结构示意图。

Α -人源亮氨酸拉链结构域

B -连接区

C - TRAIL胞外区

图 2显示的是 LZ-TRAIL蛋白的表达与纯化的 SDS-PAGE鉴定结果。

泳道 1 : 未诱导的细胞裂解物；

泳道 2: 0.2mM IPTG诱导后的细胞裂解物；

泳道 3 : 蛋白分子量标准；

泳道 4：金属亲和层析纯化后的 LZ-TRAIL蛋白；

泳道 5 : 离子交换层析纯化后的 LZ-TRAIL蛋白。

箭头所示为目标蛋白。

图 3显示的是纯化后的 LZ-TRAIL蛋白（未突变）的还原与非还原 SDS-PAGE 鉴定结果。

泳道 1 : 非还原 SDS-PAGE鉴定结果；

泳道 2: 蛋白分子量标准；

泳道 3 : 还原 SDS-PAGE鉴定结果。

箭头所示为目标蛋白。

图 4显示的是纯化后的 LZ-TRAIL蛋白（突变后）的还原与非还原 SDS-PAGE 鉴定结果。

泳道 1 : 还原 SDS-PAGE鉴定结果；

泳道 2: 蛋白分子量标准；

泳道 3 : 非还原 SDS-PAGE鉴定结果。

箭头所示为目标蛋白。图 5显示乳腺癌细胞 MDA-MB231棵鼠荷瘤模型的肿瘤生长曲线。图 6显示乳腺癌细胞 MDA-MB231棵鼠荷瘤模型的体重变化曲线。

图 7显示的是融合蛋白和人源 TRAIL蛋白给药后小鼠体内血药浓度变化曲线。具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白、编码该融合蛋白的 DNA、表达载体、细胞、转基因动物及其制备方法和其在医药领域的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

依照本发明，一种 TRAIL融合蛋白从 N端至 C端具有如下序列：（ 1 )人源亮氨酸拉链序列；（2 )人源 TRAIL蛋白、人源 TRAIL蛋白胞外区或人源 TRAIL 蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体 DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体 DR5(TRAIL-RII)相结合。

亮氨酸拉链 (leucine zipper)是一种可以自发形成多聚体的结构域，存在于多种天然蛋白中。此类结构一般呈卷曲螺旋结构，通过特征 α-螺旋的相互作用自发形成多聚体。例如 Haudenschild等人 (Haudenschild DR, et al.， J Biol Chem 270:23150-23154, 1995)描述一种结締组织蛋白 martrilin, 又称为软骨基质蛋白 ( CMP ), 其三个蛋白分子在 C端的亮氨酸拉链结构域的作用下，形成同源三聚体。亮氨酸拉链结构域可以进一步稳定 TRAIL三聚体的结构。

本发明所述融合蛋白中的人源亮氨酸拉链结构域可以来源于任何人源蛋白。在本技术领域中已为人所熟知的是，在多种天然蛋白中发现有亮氨酸拉链结构域的存在。亮氨酸拉链结构域可以相互作用形成二体或者三体。因此，本发明所述融合蛋白中包含的亮氨酸拉链结构域可以促进融合蛋白的寡聚化因而能够增加稳定性，突变 2个半胱氨酸后蛋白的结构更加稳定均一。优选的是选择可以促进融合蛋白形成三聚体的人源亮氨酸拉链。适合的人源亮氨酸拉链结构 i或例如人 c-fos, c-jun, c-myc, max 和 mdxl 蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。优选的是来自人 matrilin蛋白的人源亮氨酸拉链结构域。在一个优选实施方案中，融合蛋白中的人源亮氨酸拉链结构域含有如 SEQ IDD ΝΟ:1所述的氨基酸序列。

本发明所述融合蛋白的各部分氨基酸序列可以直接由肽键连接到一起。在一个优选实施方案中，本发明所述融合蛋白含有如 SEQ IDD NO:3所述的氨基酸序列。

另外，本发明也提供了包含 3 个本发明所述的融合蛋白结合形成的寡聚体。寡聚体的形成是依赖人源 TRAIL多肽的三聚化，以及通过亮氨酸拉链结构域的分子间相互作用。在寡聚体中的融合蛋白的稳定性和半衰期都有所加强。

本发明的另一方面也提供了编码本发明上述的融合蛋白的 DNA分子。由于密码子的筒并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码含有如 SEQ ID NO:3所述氨基酸序列的融合蛋白的 DNA分子。在一个优选实施方案中， DNA分子含有如 SEQ ID NO:4所述的核苷酸序列。

为了生产本发明的融合蛋白和寡聚体，编码融合蛋白的 DNA分子被整合至表达盒中，随后表达盒被插入合适的表达载体。然后，这一表达载体被转入宿主细胞或者动物用于重组蛋白表达。

表达盒至少包括以下几个内容：（1 )转录起始区，（2 )编码本发明所述融合蛋白的 DNA分子，该转录是在在转录起始区的调控下进行的，以及（3 ) 转录中止区。根据用于蛋白表达的宿主细胞的不同，转录起始区和转录中止区可以是天然存在或者人工构建的序列，该序列适合于真核或者原核细胞中的基因转录。此类序列在本技术领域内已为人所熟知。适当的含有转录起始序列的 DNA片与适当的含有转录中止区的 DNA片段与编码融合蛋白的 DNA片段相连接。这种连接方法在本技术领域内已为人所熟知，比如，选择适当的限制性内切酶酶切以及连接。

表达盒可以被整合插入表达载体，随后这一表达载体被转入宿主细胞或者动物。一般情况下，表达载体还要包括复制起始序列，以及筛选标记，例如，对于细菌的蛋白表达，质粒是一种很有用途的载体。本技术领域内有很多种为人所熟知的可以用于此目的的质粒载体，包括，但是不仅限于，pET25b, pET15b 等等。如果通过酵母细胞来重组表达融合蛋白，酵母表达载体，比如 pPIC9, pA0815 , pPICZ 等等，可以作为表达载体。如果通过哺乳动物细胞来进行蛋白表达，也有很多合适的重组蛋白表达载体。用于哺乳动物细胞表达蛋白的表达载体包含的 DNA序列，需要适合以同源重组方式整合插入宿主细胞染色体。哺乳动物细胞表达载体，比如 pcDNA3.1,pSI等等。对于通过动物来表达融合蛋白，用于生产含有表达盒的转基因动物（转基因羊，牛，等等）的技术手段, 在本技术领域内已为人所熟知。比如 pBLG等等,可以作为转基因动物表达的载体。

获得转化的宿主细胞或者转基因动物后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下表达出融合蛋白。通过其理化性质和其它特性的差别运用各种分离方法分离纯化融合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，例如：常规的变性复性处理、离心、超声破碎、超滤膜过滤、金属亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、透析、高效液相层析等常规纯化方法及这些方法的结合。

下面将结合最佳实施例的详细描述和附图，进一步说明本发明前述的和其他的优点和特点。实施例 1 :

发明人经过大量实验发现，构建的融合蛋白 LZ-TRAIL95治疗肿瘤可达到完全消失的效果，且棵鼠状态明显好于给予人源 TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与 TRAIL相比，融合蛋白 LZ-TRAIL95毒性更低。另外，融合蛋白的体内半衰期为 218 分钟，显著高于人源 TRAIL蛋白。

融合蛋白 LZ-TRAIL95含有 3部分：交联区、 LZ (亮氨酸拉链)和 TRAIL 胞外区。其中交联区含有 2个半胱氨酸，在活性形式三聚体结构中，两两形成分子间二硫键，起到加固 TRAIL三聚体的用，其序列如下：

RKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTK NDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

LZ-TRAIL95蛋白遇到的最大问题是二硫键错配，在非还原电泳表现为不均一条带。经 Western blotting以及肽图证明各条带均为 LZ-TRAIL95蛋白。添加多种药用辅料抗氧剂均不能解决这一问题。

为了解决 LZ-TRAIL95二硫键错配的问题，将 LZ片段 N端两个 Cys突变为 Ser,构建 LZ-TRAIL95CS蛋白的表达载体，其表达的 LZ-TRAIL95CS蛋白序列如 SEQ ID No.3所示，结果表明突变可以大大緩解 LZ-TRAIL95的不均一化问题。

完全去除 DTT前后， C18反相色谱柱检测图谱如下，纯度 90%。与 LZ-TRAIL95相比，蛋白均一程度明显改善。分子筛鉴定表明， LZ-TRAIL95CS 蛋白在分子筛中的保留时间要比 BSA单体（68KD )保留时间短，见表 1 , 说明 LZ-TRAIL95CS的分子量大于 68KD, 是以活性形式三聚体存在。

表 1： LZ-TRAIL95CS与 BSA在 SEC-HPLC保留时间对比结果

实施例 2. 构建融合蛋白表达载体

以上海旭冠生物科技发展有限公司合成的亮氨酸拉链（LZ, 人源亮氨酸拉链结构域，密码子优化使之适合于在大肠杆菌内表达）片段为模板，通过 PCR方法扩增出所需的 DNA片段，在引物中所用引物 LZ1和 LZ2由上海生工生物工程技术有限公司合成。其中 LZ1将第 6位和第 8位半胱氨酸突变为丝氨酸； LZ2除含有 LZ片段的 3，末端序列，还在其 3，末端后加入编码 GlySer 接头肽的序列。

LZ1 : 5' TTTC

LZ2: 5， CGCGGATCCGACAACGGTGTTTTCCAGG TRAIL片段是截取 TRAIL全序列第 95 ~ 281位氨基酸，用 PCR方法从人胎肝库 cDNA文库（购自 Clontech Lanoratories Inc. USA )扩增，所用引物 TRAIL1和 TRAIL2由上海生工生物工程技术有限公司合成。经序列分析，所得 DNA序列与 GenBank登记的序列（ NM— 003810 )所显示的 TRAIL编码序列一致，即获得了 TRAIL的 DNA序列。

TRAIL 1： 5， CGGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG

TRAIL2: 5， GGGAATTCTCATTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

以 Ndel和 BamHI酶切 LZ片段 PCR扩增产物（工具酶皆购自 Takara公司；)，以 BamHI和 EcoRI酶切 TRAIL序列 PCR扩增产物，以 Ndel和 EcoRI 酶切 pET25b空质粒（购自 Novage公司）。上述酶切片段均以琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用 T4 DNA连接酶连接各片段，所得的重组质粒即为 TRAIL 融合蛋白的表达载体，命名为 pET-LZ-TRAIL。融合蛋白结构如图 1所示。

按常规方法将上述获得的 pET-LZ-TRAIL质粒转化大肠杆菌 BL21 , [基因型： F-, ompT, hsdS ( rBB-mB - ) , gal, dcm ( DE3 ) ] (购自北京全式金生物技术有限公司 ), 从氨苄抗性菌落中分离质粒 DNA, 酶切鉴定，测序确认，所得的阳性克隆即为表达相应蛋白的工程菌 LZ-TRAIL95CS, 分类命名：大肠埃希氏菌， foc i 'c i a co/ .于 2011年 6月 14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.4953。实施例 3: 制备融合蛋白

将重组质粒 pET-LZ-TRAIL转化的大肠杆菌 BL21克隆加在含 LB培养基的培养瓶中培养（37°C ),待细菌密度达到 OD600 0.8,向培养基中加入 0.2mM 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG )进行诱导表达。约 6个小时后，以 5,000xg ( 30分钟）收获菌体。

将收获的菌体重悬于 Tris緩沖液（pH8.0 ) 中，超声破碎菌体。破菌后以 10,000xg离心 30分钟收集上清。将如上方法获得的破碎上清上样于 Ni NTA(Qiagen公司）进行金属亲和层析， 40mM咪唑洗脱重组蛋白。洗脱液再过 Q sepharose HP(GE公司）进行离子交换层析进一步纯化，即可得到高纯度的重组蛋白 LZ-TRAIL95CS蛋白。结果见图 2。

纯化后蛋白的还原与非还原 SDS-PAGE鉴定结果与突变前的融合蛋白（第 6位和第 8位半胱氨酸突变为丝氨酸）的结果对比，突变前非还原 SDS-PAGE 有 2条蛋白条带，说明突变前的蛋白溶液中有 2种二硫键形成方式，蛋白状态不均一，而突变后则明显解决了这一问题。结果见图 3、图 4。实施例 4: 体内药疲实验

皮下接种乳腺癌细胞 MDA-MB231建立棵鼠荷瘤模型，模型建立后进行实验。实验分阴性对照组、阳性对照组 (人源 TRAIL蛋白的胞外区，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 5所示）与试验低剂量组（ LZ-TRAIL, 即为 LZ-TRAIL95CS 蛋白 5mg/kg )、试验高剂量组（LZ-TRAIL, 10mg/kg )。每组 7只棵鼠，肿瘤组织接种后长至 0.1cm³每天皮下给药，按等摩尔剂量给药，给药剂量分别为 lOOug/只 /次（ LZ-TRAIL低剂量组）、 200ug/只 /次（ LZ-TRAIL高剂量组 )以及 146ug/只 /次（TRAIL, 与高剂量组等摩尔给药），共给药 10次。停药后观察 5 天，处死棵鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤种和抑瘤率。抑瘤率以下式计算。

° 丄， , 、 ¾†昭日平 ½1痫實 -給 ¾ί 日平 ½1痫實

抑瘤率％ = ^_{D7? /n} ^^ ^ l 00%

对照组平均瘤重结果为 TRAIL组抑制率为 35.8%,而相应剂量的 LZ-TRAIL组肿瘤完全消失，低剂量组也达到了 94.5%的抑制率。肿瘤生长曲线以及棵鼠体重变化见图 5、图 6。实施例 5： TRAIL的体内半衰期检测

体内半衰期检测分为对照组（TRAIL )与试验组（LZ-TRAIL, 即为

LZ-TRAIL95CS蛋白），每组 2只小鼠，采取尾静脉注射 240 g蛋白。注射后按照给药后 Omin , 1 Omin, 3 Omin, 60min, 120min, 240min, 1440min时间点才匡内取血 100μ1。血中 TRAIL/LZ-TRAIL浓度通过 ELISA法进行鉴定。血药浓度曲线见图 7。以上结果显示，本发明所述 TRAIL融合蛋白 LZ-TRAIL95CS蛋白可以显著降低蛋白在体内的清除速度，可以增加蛋白在体内的稳定性，显著的提高治疗效果，具有广泛的应用前景。本发明提出的一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用已通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的精神、范围和内容中。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东先声麦得津生物制药有限公司；江苏先声药物研究有限公司

<120> 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用 <130> OP120361

<160> 7

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Glu Asp Pro Ser Ala Ser Glu Ser Leu Val Lys Phe Gin Ala

1 5 10 15

Lys Val Glu Gly Leu Leu Gin Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val

20 25 30

Ser Lys Arg Leu Ala lie Leu Glu Asn Thr Val Val

35 40

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Ser Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gin Glu Lys Gin Gin Asn lie

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie

20 25 30 Ι¾Λ ^IV ^ηΐ9 ^η^ s^l ¾ν 丄 ^η3Ί ^IV ^UID ^η^ ^η^ ^ΐθ ^ηΐ9 ΐ^Λ ς\ οι ς ι m s^l ΐ¾Λ WO m oid *V WO \o

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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1 5 10 15

20 25 30

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35 40 45

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Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser

20 25 30 Met Asn Ser Pro Cys Trp Gin Val Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val

35 40 45

Arg Lys Met lie Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gin

50 55 60

Glu Lys Gin Gin Asn He Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin 65 70 75 80

Arg Val Ala Ala His He Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn

100 105 110 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His

115 120 125

Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val He His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr He

130 135 140

Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr 145 150 155 160

Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr

165 170 175

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180 185 190 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe

195 200 205

Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His

210 215 220

Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 225 230 235 240

Gly

Claims

权利要求

1 一种融合蛋白，包括：（ 1 )人源亮氨酸拉链结构域；（2 )人源 TRAIL 蛋白、人源 TRAIL蛋白胞外区或人源 TRAIL蛋白胞外区的片段。

2、如权利要求 1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含由不多于 10个氨基酸组成的连接区。

3、如权利要求 1或 2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人 c-fos, c-jun, c-myc, max 、 mdxl或人 matrilin蛋白含有的亮氨酸拉链结构域。

4、如权利要求 1或 2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序列。

5、如权利要求 1或 2所述的融合蛋白 ,其特征在于，其中所述人源 TRAIL 蛋白胞外区的片段的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

6、如权利要求 1或 2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如 SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

7、一种寡聚体，其特征在于，该寡聚体是由三个权利要求 1-6任一项所述融合蛋白形成。

8 、编码权利要求 1-6任一项所述融合蛋白的 DNA序列。

9 、根据权利要求 8所述的 DNA序列，其特征在于，含有如 SEQ ID NO:4 所示的核苷酸序列。

10、一种表达盒，包括：转录起始区；受转录起始区调控的编码权利要求 1-6任一项所述融合蛋白的 DNA分子；以及转录中止区。

11、重组了编码权利要求 1-6任一项所述融合蛋白 DNA分子的表达载体。

12、如权利要求 11所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒或病毒。

13、重组了编码权利要求 1-6任一项所述融合蛋白的 DNA分子的细胞。

14、如权利要求 13 所述的细胞，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌或细菌。

15、根据权利要求 14所述的细胞，其特征在于，所述细胞属大肠杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC Νο·4953。

16、一种转基因动物，其特征在于，转染了编码权利要求 1-6任一项所述融合蛋白的 DNA分子且表达所述融合蛋白。

17、权利要求 1-6任一项所述融合蛋白的制备方法，包括：

提供权利要求 13-16任一项所述细胞或权利要求 16所述转基因动物；使细胞或者转基因动物表达所述融合蛋白；以及

分离所述融合蛋白。

18、如权利要求 1-6任一项所述融合蛋白在制造治疗细胞过度增生导致的疾病或免疫系统疾病的药物中的用途。

19、如权利要求 18所述的用途，其特征在于，所述疾病为癌症或自身免疫 <!"生疾病。