CN112574286A

CN112574286A - 多肽及其应用

Info

Publication number: CN112574286A
Application number: CN202011619232.7A
Authority: CN
Inventors: 李利佳; 古想娣; 吴都; 郭林峰; 李晓平; 胡育龙; 李宇晟; 李玉; 许玲华; 李静; 陈小锋; 李文佳
Original assignee: Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co ltd
Current assignee: Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-03-30
Also published as: WO2021136521A1

Abstract

本发明提出了一种多肽。所述多肽与具有下列氨基酸序列的多肽相比，其N端具有修饰，所述修饰包括选自N端氨基酸的增加、甲基化、甲酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化的至少之一，(1)具有SEQ ID NO：1‑6所示氨基酸序列的多肽；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或(3)与(1)相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽。根据本发明实施例的多肽既保持了BefA蛋白促进β细胞增殖的活性，又具有更高的稳定性，不易降解的特性，并且具有降糖、减重及保护肝脏的潜能。

Description

多肽及其应用

优先权信息

本发明请求于2020年1月2日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号CN202010003240.2、申请名称为“多肽及其应用”的中国专利申请的优先权，并且其全部内容通过引用并入本发明。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及多肽及其应用，更具体地，本发明涉及多肽、提高BefA蛋白稳定性或制备BefA蛋白突变体的方法、融合蛋白、核酸、重组细胞和药物组合物及其在糖尿病等代谢疾病领域的应用。

背景技术

胰岛素分泌细胞的缺失一直被认为是I型糖尿病的病因之一。在I型糖尿病中，免疫系统错误地攻击和破坏β细胞。近年来，研究者发现，缺乏具有功能的β细胞也是II型糖尿病的一个重要诱因，II型糖尿病病人晚期胰岛功能逐渐下降。因此，开发能够增加健康β细胞数量的药物对于解决I型糖尿病或II型糖尿病晚期是非常重要的，是糖尿病研究的主要重点。同时，糖尿病病人常伴随着肥胖、脂肪肝、肝功能受损等代谢综合征，所以，开发临床获益更多的药物，如减重，保护肝功等的药物，也是非常必要的。目前市场上的降糖生物药主要包括：胰岛素及其类似物、GLP-1和GLP-1类似物，如利拉鲁肽，杜拉糖肽。胰岛素及其类似物作用机制是一个针对I型糖尿病的直接补充胰岛素(或类似物)作用，达到胰岛素降糖的作用，但是存在低血糖风险，且其没有降低2型糖尿病患者体重，保护肝功能的作用。GLP-1及其类似物，是GLP-1的受体激动剂，通过激动GLP-1的受体而发挥降糖作用。GLP-1的作用方式是增加胰岛素的分泌，抑制高血糖素的分泌、延缓胃排空，减少进食量。但该类药物半衰期短，有恶心、呕吐等消化道不良反应。以上药物，虽能起到降糖作用，但是无法完全逆转受损的胰岛，患者往往需要长期给药，增加了医药支出和降低了患者用药体验，长期服药也有可能导致药物耐受现象。

为了改善现有降糖药物的治疗效果，减少副作用，开发出具有改善或者逆转受损胰岛组织的药物，从根本上逆转糖尿病的发展，显得尤为关键，治疗糖尿病的药物仍需要进一步开发。

Jennifer Hampton Hill等在研究斑马鱼早期幼虫发育过程中，发现胰腺β细胞群的正常扩增需要肠道微生物群，而特定的细菌可以恢复β细胞数量到正常水平。经过实验筛查发现这些细菌共享一类以前未被描述的蛋白质，命名为BefA(β细胞增殖因子A)。BefA蛋白可以促进斑马鱼幼虫发育过程中β细胞增殖的活性，故对BefA蛋白进行研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

现有技术中，体外原核细胞表达的BefA蛋白具有促进β细胞增殖的活性，但BefA容易降解，难以得到高纯度的完整分子量的BefA蛋白，因此大大限制了BefA蛋白的体内外药效研究以及临床应用。本申请的研发人员在BefA蛋白药物的开发过程中意外而惊喜地发现，对BefA蛋白的N端进行修饰，包括在N端增加氨基酸，或使N端氨基酸甲基化、甲酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化，可大幅提高BefA蛋白的稳定性，纯化后BefA蛋白纯度可达95％以上，且获得的该BefA蛋白突变体具有促进β细胞增殖的活性。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述与具有下列氨基酸序列的多肽相比，其N端具有修饰，所述修饰包括选自N端氨基酸的增加、甲基化、甲酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化的至少之一。

(1)具有SEQ ID NO：1-6所示氨基酸序列的多肽；或

(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或

(3)与(1)相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽。

DWAKVKAAATELGNAVSDTSKEAWQSVTDFSKATWASVSQWGSEAFNTAGAWTDKSVATGKEWLAVADKKLDEMLEPKTADEARLALNTMADTALVRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRATGKHTYMKMFGAGLAAGLGGKFYQQVILFEDKARFDAFVSQGWEATSEVGAVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWVDKDLTR(SEQ ID NO:1)。

DWAKLKAAASDLGAAVSETSKEVWQDVSDFSKKSWASISAWGEEAFNTAGVWTDKSIATGKEWLKAADKELNEMLNPKTAKEARIAINTMADTALIRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRKTGKHTYMKMFGAGLAAGIGGKFYQQVILFEDKARFDAFVTQGWEATSEVGVVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWIDKDLTETSR(SEQ ID NO:2)。

DWAKLKAAASDLGAAVSETSKEVWQDVSDFSKKSWASISAWGEDAFNTAGVWTDKSIATGKEWLKAADKELNEMLNPKTAKEARIALNTMADTALIRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRKTGKHTYMKMFGAGLAAGIGGKFYQQVILFEDKARFDAFVTQGWEATSEVGVVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWIDKDLTETSR(SEQ ID NO:3)。

DWAKVKAAATELGNAVSDTSKEAWQSVTDFSKATWASVSQWGEEAFNTAGAWTDKSVATGKEWLAVADKKLDEMLEPKTADEARLALNTMADTALVRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRATGKHTYMKMFGAGLAAGLGGKFYQQVILFEDKARFDAFVSQGWEATSEVGAVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWVDKDLTR(SEQ ID NO:4)。

GCSAQGDTASQQRASIQKMRNETLTKLYTLQPEARSDIQHAKGYAVFANNSSKILLFGFGSGYGVVRDTASGKDTYMKMAQGGAGLGIGIKQQRTVLVFHDKAALDRFIRQGYMVGADANAAAKYDDKGIAPIAASANGVAKDTSSLPSKVNVYEITDKGLAAQAMVNGYKYWPDDELNP(SEQ ID NO:5)。

SWEEIKKAASDLGQKVSEGSKKAWEDVTDFSETWDSVSEWGEDAFNTAGEWTDASIEKGKEWLEAGEAKLNEMLEPETPEEARLALDTMSDTALVRLFNEEPSAKLLFDTAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVDRKTGKRTYMKMFGGLALGLGGKFYQQLIFFEDKKTFDSFVKDGWEATSEAGAVAGTESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWVDEDLTQ(SEQ ID NO:6)。

根据本发明实施例的多肽保持了BefA蛋白促进β细胞增殖的活性，相比于具有(1)、(2)或(3)序列的多肽，具有更高的稳定性。

根据本发明的实施例，上述多肽还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述N端氨基酸的增加包括N端增加一个或一个以上的氨基酸，且增加的氨基酸至少有一个甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

根据本发明的实施例，所述的N端氨基酸的增加为N端增加一个氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

根据本发明的实施例，所述多肽具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

GDWAKVKAAATELGNAVSDTSKEAWQSVTDFSKATWASVSQWGSEAFNTAGAWTDKSVATGKEWLAVADKKLDEMLEPKTADEARLALNTMADTALVRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRATGKHTYMKMFGAGLAAGLGGKFYQQVILFEDKARFDAFVSQGWEATSEVGAVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWVDKDLTR(SEQ ID NO:7)。

根据本发明实施例的上述具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的多肽，稳定性高、不易降解，纯化后的纯度可达99％。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种提高BefA蛋白稳定性或制备BefA蛋白突变体的方法。根据本发明的实施例，对BefA蛋白氨基酸序列的N端进行修饰，所述修饰包括选自N端氨基酸的增加、甲基化、甲酰化，氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化的至少之一。根据本发明实施例的方法大幅提高了BefA蛋白的稳定性，且制备得到的BefA蛋白突变体不仅稳定性高，又保持了BefA蛋白显著促进β细胞增殖的活性。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述BefA蛋白具有(1)SEQ ID NO：1～6所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的；或(3)与(1)相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，使BefA蛋白氨基酸序列的N端增加一个或一个以上的氨基酸可通过基因克隆的方式实现，以便获得BefA蛋白突变体。例如，本领域技术人员可通过预先合成能够表达N端增加一个或一个以上的氨基酸的BefA蛋白突变体的核酸，进而将该核酸导入受体细胞中进行表达，获得N端增加一个或一个以上氨基酸的BefA蛋白突变体。根据本发明再一实施例，所述BefA蛋白突变体还可进一步通过连接肽与伴侣蛋白连接，所述连接肽适于被蛋白酶切割，以便再次形成游离的BefA蛋白突变体。BefA蛋白突变体进一步通过连接肽与伴侣蛋白连接，可显著提高了BefA蛋白突变体的产量，但之后还需要再在适宜蛋白酶的作用下，将伴侣蛋白和连接肽完全切除，以再次形成游离的BefA蛋白突变体。

根据本发明的实施例，使BefA蛋白氨基酸序列的N端增加一个或一个以上的氨基酸可通过基因克隆和酶切引入的方式实现，以便获得BefA蛋白突变体。例如，本领域技术人员可通过预先合成能够表达N端增加了部分氨基酸的第一BefA蛋白突变体的核酸，进而将该核酸导入受体细胞中进行表达，获得N端增加了部分氨基酸的第一BefA蛋白突变体；将该第一BefA蛋白突变体进一步通过连接肽与伴侣蛋白连接，此时伴侣蛋白和连接肽需要设置于第一BefA蛋白突变体的N端，所述连接肽适于被蛋白酶切割，进而在适宜蛋白酶的酶切作用下，将伴侣蛋白和部分连接肽切除，以便在第一BefA蛋白突变体的N端再多保留部分氨基酸，此时，酶切后剩余的部分连接肽以及最先通过基因克隆方式增加的部分氨基酸共同构成了BefA蛋白的N端增加的氨基酸。

根据本发明的实施例，使BefA蛋白氨基酸序列的N端增加一个或一个以上的氨基酸也可通过酶切引入的方式实现。例如，本领域技术人员可直接构建伴侣蛋白与所述BefA蛋白的融合蛋白，所述伴侣蛋白与所述BefA蛋白之间设置有连接肽，所述连接肽的N端与所述伴侣蛋白的C端连接，所述连接肽的C端与所述BefA蛋白的N端连接，所述连接肽适于被蛋白酶切割，以便形成游离的目标蛋白，所述游离的目标蛋白的N端相比于所述BefA蛋白，增加了一个或多个氨基酸，该游离的目标蛋白即为BefA蛋白突变体。也就是说游离的目标蛋白的N端所增加的氨基酸为连接肽上的至少部分氨基酸。换句话说，通过引入了具有酶切位点的连接肽的方式在BefA蛋白的N端引入了新的氨基酸。

根据本发明实施例的上述使BefA蛋白氨基酸序列的N端增加一个或一个以上的氨基酸的方法，成功实现了在BefA蛋白的N端连接至少一个氨基酸。

根据本发明的实施例，所述伴侣蛋白包括选自麦芽糖结合蛋白、CBP、GST、SUMO、Trx、NusA的至少之一，任选地，所述伴侣蛋白含有或不含有His标签、Flag标签。

根据本发明的实施例，所述蛋白酶为烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、肠激酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶、人鼻病毒3C蛋白酶、SUMO酶或KEX-2。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

MEIKTGARILALSALTTMMFSASALAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGHHHHHHHHHHENLYFQGDWAKVKAAATELGNAVSDTSKEAWQSVTDFSKATWASVSQWGSEAFNTAGAWTDKSVATGKEWLAVADKKLDEMLEPKTADEARLALNTMADTALVRLFNEQPSAKLLFDKAYGYAVFDSRKFSLMLHTNQGAGVAVNRATGKHTYMKMFGAGLAAGLGGKFYQQVILFEDKARFDAFVSQGWEATSEVGAVAGKESAELTAKYNGGMAIYQIGEKGLLLDANISGSKYWVDKDLTR(SEQ ID NO:8)。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括伴侣蛋白、连接肽以及BefA蛋白，所述连接肽的N端与所述伴侣蛋白的C端相连，所述连接肽的C端与所述BefA蛋白的N端相连，所述连接肽适于被蛋白酶切割，以便形成游离的BefA蛋白突变体，所述游离的BefA蛋白突变体的N端相比于BefA蛋白，增加了一个或多个氨基酸。根据本发明实施例的融合蛋白表达量高，且在适宜消化酶的作用下，可成功获得N端至少增加一个氨基酸的BefA蛋白突变体。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

在本发明的第四方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白。

根据本发明的实施例，所述核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列。

GGAGATTGGGCAAAAGTGAAAGCCGCCGCAACCGAACTGGGCAATGCAGTGAGCGATACCAGTAAAGAAGCATGGCAGAGCGTGACCGATTTTAGCAAAGCCACCTGGGCCAGCGTGAGCCAGTGGGGTAGCGAAGCATTTAATACCGCAGGTGCCTGGACCGATAAAAGTGTTGCAACCGGTAAAGAATGGCTGGCAGTTGCCGATAAAAAACTGGATGAAATGCTGGAACCGAAAACCGCAGATGAAGCCCGCCTGGCCCTGAATACAATGGCTGATACCGCACTGGTTCGTCTGTTTAATGAACAGCCGAGCGCCAAACTGCTGTTTGATAAAGCCTATGGTTATGCCGTGTTTGATAGCCGTAAATTTAGCCTGATGCTGCATACCAATCAGGGTGCCGGCGTGGCCGTGAATCGTGCAACCGGTAAGCATACCTATATGAAAATGTTTGGCGCAGGCCTGGCAGCCGGCCTGGGTGGTAAATTTTATCAGCAGGTTATTCTGTTTGAGGATAAAGCACGTTTTGATGCATTTGTTAGCCAGGGTTGGGAAGCAACCAGTGAAGTGGGCGCCGTGGCCGGCAAAGAAAGTGCAGAACTGACCGCAAAATATAATGGTGGTATGGCCATTTATCAGATTGGTGAAAAAGGTCTGCTGCTGGATGCCAATATTAGCGGTAGCAAATATTGGGTTGATAAAGATCTGACCCGTTAA(SEQ ID NO:9)。

ATGGAAATAAAAACAGGTGCACGCATCCTCGCATTATCCGCATTAACGACGATGATGTTTTCCGCCTCGGCTCTCGCCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGATTGGGCAAAAGTGAAAGCCGCCGCAACCGAACTGGGCAATGCAGTGAGCGATACCAGTAAAGAAGCATGGCAGAGCGTGACCGATTTTAGCAAAGCCACCTGGGCCAGCGTGAGCCAGTGGGGTAGCGAAGCATTTAATACCGCAGGTGCCTGGACCGATAAAAGTGTTGCAACCGGTAAAGAATGGCTGGCAGTTGCCGATAAAAAACTGGATGAAATGCTGGAACCGAAAACCGCAGATGAAGCCCGCCTGGCCCTGAATACAATGGCTGATACCGCACTGGTTCGTCTGTTTAATGAACAGCCGAGCGCCAAACTGCTGTTTGATAAAGCCTATGGTTATGCCGTGTTTGATAGCCGTAAATTTAGCCTGATGCTGCATACCAATCAGGGTGCCGGCGTGGCCGTGAATCGTGCAACCGGTAAGCATACCTATATGAAAATGTTTGGCGCAGGCCTGGCAGCCGGCCTGGGTGGTAAATTTTATCAGCAGGTTATTCTGTTTGAGGATAAAGCACGTTTTGATGCATTTGTTAGCCAGGGTTGGGAAGCAACCAGTGAAGTGGGCGCCGTGGCCGGCAAAGAAAGTGCAGAACTGACCGCAAAATATAATGGTGGTATGGCCATTTATCAGATTGGTGAAAAAGGTCTGCTGCTGGATGCCAATATTAGCGGTAGCAAATATTGGGTTGATAAAGATCTGACCCGTTAA(SEQ ID NO:10)。

具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的核酸编码具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的多肽，具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的核酸编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的融合蛋白。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸。根据本发明实施例的重组细胞可表达前面所述的多肽或融合蛋白。

根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述重组细胞为大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的多肽。根据本发明实施例的药物组合物可用于糖尿病的治疗或预防。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅剂。进而所述药物组合物可制备成特定的药物制剂，通过特定的方式给与患者。

在本发明的第七方面，本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于促进β细胞增殖。

在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防糖尿病或保护肝功。

本发明所述的BefA蛋白是指β细胞增殖因子A(Beta Cell Expansion Factor A,BefA)。

附图说明

图1是根据本发明实施例的重组表达质粒pET28a-BefA的示意图；

图2是根据本发明实施例的pET28a-BefA阳性克隆PCR鉴定示意图；

图3是根据本发明实施例的重组表达质粒pET28a-MBP-BefA的示意图；

图4是根据本发明实施例的pET28a-MBP-BefA阳性克隆PCR鉴定的示意图；

图5A是根据本发明实施例的BefA镍柱亲和层析样品SDS-PAGE图谱；

图5B是根据本发明实施例的BefA镍柱亲和层析样品质谱检测结果；

图5C是根据本发明实施例的BefA离子交换层析样品SDS-PAGE图谱；

图6A是根据本发明实施例的BefA突变体SDS-PAGE的示意图；

图6B是根据本发明实施例的BefA突变体质谱检测结果；

图7是根据本发明实施例的BefA蛋白促INS-1细胞增殖的示意图；

图8是根据本发明实施例的BefA突变体促INS-1细胞增殖的示意图；

图9是根据本发明实施例的注射BefA蛋白后ob/ob小鼠随机血糖变化曲线；

图10是根据本发明实施例的注射BefA蛋白后ob/ob小鼠体重变化曲线；

图11是根据本发明实施例的注射BefA蛋白后ob/ob小鼠肝绝对重量的示意图；

图12是根据本发明实施例的注射BefA蛋白后ob/ob小鼠谷草转氨酶(AST)活性的示意图；

图13是根据本发明实施例的注射BefA蛋白后ob/ob小鼠谷丙转氨酶(ALT)活性的示意图；

图14是根据本发明实施例的注射BefA蛋白突变体后db/db小鼠随机血糖变化曲线的示意图；

图15是根据本发明实施例的注射BefA蛋白突变体后db/db小鼠体重变化曲线；

图16是根据本发明实施例的注射BefA蛋白突变体后db/db小鼠肝绝对重量的示意图；

图17是根据本发明实施例的注射BefA蛋白突变体后db/db小鼠谷丙转氨酶(ALT)活性的示意图；

图18是根据本发明实施例的注射BefA蛋白突变体后db/db小鼠谷草转氨酶(AST)活性的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“肽键”是指在氨基酸相互连接形成蛋白质时，各个氨基酸之间相互连接的那个化学键，就称为肽键，换句话说，肽键是在两个氨基酸连接时,由一个氨基酸的羧基(-COOH)与另一个氨基酸的氨基(－NH₂)相互连接所形成的化学键(-NH-CO-)。多肽中以羧基结尾的端叫C端，以氨基结尾的端叫N端。

本申请所述的多肽与多肽的“相连”或“连接”，既可以是直接相连，也可是间接相连。例如，当采用间接相连时，多肽与多肽之间可通过短肽或氨基酸相连。

根据文献(Jennifer Hampton Hill，A conserved bacterial protein inducespancreatic beta cell expansion during zebrafish development，elifesciences,Dec.2016)的氨基酸序列，重组工程菌经诱导表达纯化得到的BefA蛋白出现严重的降解。

本发明克服了上述BefA蛋白易降解以及应用研究范围小等问题，提供了一种高纯度BefA蛋白的制备方法。即通过构建BefA融合蛋白，并在融合蛋白内设计蛋白酶切位点，具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣MBP(麦芽糖结合蛋白)蛋白基因，B为编码包含TEV(烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶)酶切位点和连接肽的核苷酸序列，C为BefA蛋白基因。重组工程菌经诱导表达后，融合蛋白纯化后经TEV蛋白酶酶切，可以获得N端多一个甘氨酸(G)的BefA突变体，纯化后蛋白纯度达95％以上，经检测具备生物活性。

BefA蛋白以及BefA突变体在体外均具有一定程度地促进INS-1(大鼠胰岛素瘤细胞)细胞增殖的作用，BefA蛋白能改善ob/ob小鼠的肝功能，且BefA突变体能改善db/db小鼠的肝功能。

实施例1重组表达质粒pET28a-BefA，pET28a-MBP-B的构建

1、β细胞增殖因子A(BefA)，MBP伴侣蛋白的全基因合成

根据文献(Jennifer Hampton Hill，A conserved bacterial protein inducespancreatic beta cell expansion during zebrafish development，elifesciences,Dec.2016)公布的人肠道微生物Enterococcus gallinaru菌株分泌的BefA氨基酸序列(共258aa)，按照大肠杆菌(BL21(DE3))的优化原则，对核酸序列进行优化。同时对序列中的酶切位点进行严格限定，序列3＇端添加终止密码子(TAA)，获得编码基因BefA，最终交给基因合成公司进行全基因合成(pUC57-BefA)。

MBP伴侣基因与编码包含TEV(烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶)酶切位点和连接肽(共425aa)，按照大肠杆菌(BL21(DE3))的优化原则，对核酸序列进行优化，获得编码基因MBP，最终交给基因合成公司进行全基因合成(pET28a-MBP)。

2、重组pET28a-BefA表达菌株构建

以合成的质粒pUC57-BefA为模板，通过上游引物F1：GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAGATCCGTTTTCTGG，含有XbaI酶切位点；下游引物R1：CCGCTCGAGTT AATGGTGATGATGATGATGAC，含有XhoI酶切位点和6×His标签。加入其它反应液进行PCR，扩增得到含有BefA的片段A(844bp)。片段A经XhoI和XbaI双酶切获得片段B(792bp)，片段B与pET28a质粒经XhoI和XbaI双酶切回收的载体片段(5236bp)进行连接，得到质粒pET28a-BefA，见图1。质粒pET28a-BefA通过化学转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)。在卡那抗生素平板上对克隆进行抗性筛选，挑选的克隆，通过引物F1和R1为模板进行PCR扩增，得到与理论大小(792bp)相符的DNA片段，见图2。利用BefA基因片段的两端设计引物进行测序，测序结果显示克隆基因片段与理论一致。

3、重组pET28a-MBP-BefA表达菌株构建

以合成的质粒pET28a-MBP为模板，通过上游引物F2：CATGCCATGGAAATAAAAACAGGTGCACG，含有NcoI酶切位点；下游引物R2：GCTTTCACTTTTGCCCAATCTCCCTGAAAATACAGGTTTT。加入其它反应液进行PCR，扩增得到含有MBP的片段B(1301bp)，以合成质粒pUC57-BefA为模板，通过上游引物F3：AAAACCTGTATTTTCAGGGAGATTGGGCAAAAGTGAAAGC，下游引物R3：CCGCTCGAGTTAACGGGTCAGATCTTTAT，含有XhoI酶切位点。加入其它反应液进行PCR，扩增得到含有BefA的片段C(743bp)。以PCR扩增获得的片段B和片段C为模板，通过上游引物F2，下游引物R3，加入其它反应液进行Overlap PCR，扩增得到含有MBP-BefA的片段(约2000bp)。片段MBP-BefA与pET28a质粒经NcoI和XhoI双酶切回收的载体片段(5231bp)进行连接，得到质粒pET28a-MBP-BefA，见图3。质粒pET28a-MBP-BefA通过化学转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，在卡那抗生素平板上对克隆进行抗性筛选，挑选的克隆，通过引物F2和R3为模板进行PCR扩增，得到与理论大小相符的DNA片段，见图4。利用MBP-BefA基因片段的两端设计引物进行测序，测序结果显示克隆基因片段与理论一致。

实施例2工程细胞表达生产BefA/BefA突变体

1、摇瓶发酵BefA/MBP-BefA蛋白

以筛选与鉴定得到的阳性菌株甘油管，按0.2％接种量接种至5mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃250rpm活化过夜；按2％接种量接种至含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的2000mL三角瓶中，装液量20％，37℃250rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃250rpm诱导表达4～6h；发酵液经过离心(8000rpm 10min)，收集菌体。菌体用纯化水重悬后，破碎菌体(超声波破碎或匀浆破碎)，破碎液经过低温高速离心(12000rpm 30min 4℃),获得上清液进行纯化。

2、纯化BefA蛋白

BefA蛋白使用镍柱亲和层析和离子交换层析，BefA蛋白均发生了降解，均未能得到纯度较高的BefA蛋白。

方法一：BefA破碎液上清镍柱亲和层析具体纯化步骤如下：

HisTrap FF column(GE)使用5个柱体积的20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，100mM～200mM NaCl缓冲液冲洗柱子，将破碎液上清上柱，使用20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，100mM～200mM NaCl，30mM咪唑缓冲液洗去未结合的杂质，接着用20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，0～200mM NaCl，50mM～500mM咪唑缓冲液将目的蛋白洗脱下来。

镍柱亲和层析得到的样品进行SDS-PAGE检测和MS分析，其结果如图5A和图5B所示以及表1所示。根据图5A SDS-PAGE结果可以看出，纯化得到的样品除主条带(26KD)外，还有一些杂带；根据图5B可以看出主峰分子量为26489，与BefA蛋白理论分子量一致，说明纯化得到的样品主要成分是BefA蛋白。根据表1可以看出，纯化样品中BefA蛋白约占66％，其余大部分为BefA蛋白降解产物。说明使用镍柱亲和层析未能得到高纯度的BefA蛋白。

表1：

方法二：BefA破碎液上清阳离子交换层析具体纯化步骤如下：

SP550C(博格隆)使用5个柱体积的20mM～50mM乙酸-乙酸钠，pH3.0～5.0缓冲液冲洗柱子，菌体使用20mM～50mM乙酸-乙酸钠，pH3.0～5.0缓冲液重悬后破碎，将破碎液上清上柱，使用20mM～50mM乙酸-乙酸钠，pH3.0～5.0，100mM～500mM NaCl缓冲液咪唑缓冲液洗去未结合的杂质，用20mM～50mM乙酸-乙酸钠，pH3.0～5.0，500mM～1M NaCl缓冲液将目的蛋白洗脱下来。离子交换层析得到的样品进行SDS-PAGE检测，其结果如图5C所示。

根据图5C可以看出，离子交换层析得到的样品，除主要条带(约25KD)，还存在较多的杂带，说明纯化得到的BefA蛋白纯度较低，使用离子交换层析未能得到高纯度的BefA蛋白。说明BefA蛋白稳定性较差。

3、纯化MBP-BefA蛋白突变体

MBP-BefA破碎液上清经过亲和层析一-酶切-亲和层析二-离子交换层析，得到BefA突变体，其结果见图6。具体纯化步骤如下：

(1)亲和层析一

HisTrap FF column(GE)使用5个柱体积的20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，0～200mM NaCl缓冲液冲洗柱子，将MBP-BefA破碎液上清上柱，使用20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，0～200mM NaCl，10～100mM咪唑缓冲液洗去未结合的杂质，接着用20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，0～200mM NaCl，200mM～500mM咪唑缓冲液将目的蛋白MBP-BefA洗脱下来。将MBP-BefA蛋白透析换液至20mM～50mM Tris，pH7.4～8.5缓冲液。

(2)TEV酶酶切

1mg重组TEV蛋白酶在4℃～30℃，20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5，0～0.5mM EDTA，0～1M DTT条件下4～15h，可以完全切割100mg MBP-BefA融合蛋白。

(3)镍柱亲和层析二

HisTrap FF column(GE)使用5个柱体积的20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5缓冲液冲洗柱子，将MBP-BefA酶切样品上柱，收集穿透液进行离子交换层析。

(4)离子交换层析

Q Sepharose FF(博格隆)使用5个柱体积的20mM～50mM Tris，pH7.0～8.5缓冲液冲洗柱子，将亲和层析二穿透液上柱，收集穿透液，得到BefA突变体。纯化得到的样品进行SDS-PAGE检测和MS分析结果如图6A和6B以及表2所示。

根据图6A SDS-PAGE结果可以看出，纯化得到的样品(约25KD)仅有一条条带，说明得到的蛋白纯度很高；根据图6B可以看出纯化得到的样品分子量为25724，与BefA突变体理论分子量一致，说明纯化得到的样品为BefA突变体；根据表2可以看出，纯化得到的BefA突变体纯度约99％。

结论：与BefA蛋白相比，纯化得到的BefA蛋白突变体降解较少，蛋白纯度较高。说明BefA蛋白突变体稳定性较好。

表2：

实施例3 BefA及BefA突变体活性检测

1、INS-1细胞增殖实验

INS-1(大鼠胰岛细胞瘤细胞)细胞按3*10⁴～6*10⁴cells/mL,按100μL/well铺板至96孔板，37℃，5％CO₂培养48h。换液至无糖1640+0.1％BSA，饥饿24h。弃去饥饿培养基，加入1640+1％FBS培养基稀释至10^-9M～10^-7M的BefA蛋白(或BefA突变体BefA modification)刺激，100μL/well。37℃，5％CO₂培养72h。加入CCK8试剂，10μL/well，37℃，5％CO₂培养箱培养2h后，检测OD₄₅₀。结果见图7-8。BefA蛋白及BefA突变体均能显著促进INS-1细胞的增殖。

2、小鼠药效实验

(1)BefA蛋白ob/ob小鼠药效实验

ob/ob小鼠分2组，每组8只动物，分别皮下注射30mg/kg的BefA蛋白和PBS缓冲液，每天给药1次，给药4周，其中在给药第7天进行口服糖耐量OGTT测试，即动物禁食16h，D7给药的同时灌胃给予葡萄糖2g/kg，在给予葡萄糖前以及给药葡萄糖后15min、30min、1h及2h检测动物血糖水平。实验过程中监测动物体重变化，在实验结束的当天动物取全血制备血浆检测血浆ALT/AST水平，动物解剖取其肝脏称重。BefA蛋白对ob/ob小鼠的糖耐量、体重、肝重、肝脏指标ALT、AST的影响见图9-13。图9结果显示：试验结果显示，BefA蛋白能够显著降低给糖后的血糖水平，改善糖耐量；图10～11结果显示：BefA蛋白对ob/ob小鼠体重在不同的天具有显著降低效应，且对肝绝对重量也具有明显的降低效应；图12～13结果显示：BefA蛋白对ob/ob小鼠的肝功指标ALT、AST有显著降低。

(2)BefA突变体db/db小鼠药效实验

自发性糖尿病db/db小鼠分2组，每组8只动物，分别皮下注射30mg/kg的BefA突变体及对照组皮下注射PBS缓冲液，给药4周，其中实验第一天检测给药前及给药后1、2、4、6、8和24h随机血糖。实验过程中监测动物体重变化，在实验结束的当天动物取全血制备血浆检测血浆ALT/AST水平，动物解剖取其肝脏称重。见图14-18。图14结果显示，在给药的第一天BefA突变体在给药后4-6h能够显著降低动物随机血糖水平；图15～16结果显示：BefA突变体对db/db小鼠体重具有一定降低趋势，对肝绝对重量具有明显的降低效应；图17～18结果显示：BefA突变体对db/db小鼠的肝功指标ALT、AST有显著降低。

结论：BefA蛋白及BefA突变体均能显著促进INS-1细胞的增殖，明显降低血糖或改善糖耐量；BefA蛋白及BefA突变体均能降低体重或具有降低体重趋势；BefA蛋白及BefA突变体均能降低动物绝对肝、降低肝ALT/AST水平。BefA蛋白及BefA突变体均具有降低血糖，降低体重且具有肝功保护功能，即BefA突变体保留了BefA蛋白的药理活性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市东阳光生物药研发有限公司

<120> 多肽及其应用

<130> PIDC4200328

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450 455 460

Gln Trp Gly Ser Glu Ala Phe Asn Thr Ala Gly Ala Trp Thr Asp Lys

465 470 475 480

Ser Val Ala Thr Gly Lys Glu Trp Leu Ala Val Ala Asp Lys Lys Leu

485 490 495

Asp Glu Met Leu Glu Pro Lys Thr Ala Asp Glu Ala Arg Leu Ala Leu

500 505 510

Asn Thr Met Ala Asp Thr Ala Leu Val Arg Leu Phe Asn Glu Gln Pro

515 520 525

Ser Ala Lys Leu Leu Phe Asp Lys Ala Tyr Gly Tyr Ala Val Phe Asp

530 535 540

Ser Arg Lys Phe Ser Leu Met Leu His Thr Asn Gln Gly Ala Gly Val

545 550 555 560

Ala Val Asn Arg Ala Thr Gly Lys His Thr Tyr Met Lys Met Phe Gly

565 570 575

Ala Gly Leu Ala Ala Gly Leu Gly Gly Lys Phe Tyr Gln Gln Val Ile

580 585 590

Leu Phe Glu Asp Lys Ala Arg Phe Asp Ala Phe Val Ser Gln Gly Trp

595 600 605

Glu Ala Thr Ser Glu Val Gly Ala Val Ala Gly Lys Glu Ser Ala Glu

610 615 620

Leu Thr Ala Lys Tyr Asn Gly Gly Met Ala Ile Tyr Gln Ile Gly Glu

625 630 635 640

Lys Gly Leu Leu Leu Asp Ala Asn Ile Ser Gly Ser Lys Tyr Trp Val

645 650 655

Asp Lys Asp Leu Thr Arg

660

<210> 9

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 核酸的核苷酸序列

<400> 9

ggagattggg caaaagtgaa agccgccgca accgaactgg gcaatgcagt gagcgatacc 60

agtaaagaag catggcagag cgtgaccgat tttagcaaag ccacctgggc cagcgtgagc 120

cagtggggta gcgaagcatt taataccgca ggtgcctgga ccgataaaag tgttgcaacc 180

ggtaaagaat ggctggcagt tgccgataaa aaactggatg aaatgctgga accgaaaacc 240

gcagatgaag cccgcctggc cctgaataca atggctgata ccgcactggt tcgtctgttt 300

aatgaacagc cgagcgccaa actgctgttt gataaagcct atggttatgc cgtgtttgat 360

agccgtaaat ttagcctgat gctgcatacc aatcagggtg ccggcgtggc cgtgaatcgt 420

gcaaccggta agcataccta tatgaaaatg tttggcgcag gcctggcagc cggcctgggt 480

ggtaaatttt atcagcaggt tattctgttt gaggataaag cacgttttga tgcatttgtt 540

agccagggtt gggaagcaac cagtgaagtg ggcgccgtgg ccggcaaaga aagtgcagaa 600

ctgaccgcaa aatataatgg tggtatggcc atttatcaga ttggtgaaaa aggtctgctg 660

ctggatgcca atattagcgg tagcaaatat tgggttgata aagatctgac ccgttaa 717

<210> 10

<211> 1989

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 核酸的核苷酸序列

<400> 10

atggaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt 60

tccgcctcgg ctctcgccaa aatcgaagaa ggtaaactgg taatctggat taacggcgat 120

aaaggctata acggtctcgc tgaagtcggt aagaaattcg agaaagatac cggaattaaa 180

gtcaccgttg agcatccgga taaactggaa gagaaattcc cacaggttgc ggcaactggc 240

gatggccctg acattatctt ctgggcacac gaccgctttg gtggctacgc tcaatctggc 300

ctgttggctg aaatcacccc ggacaaagcg ttccaggaca agctgtatcc gtttacctgg 360

gatgccgtac gttacaacgg caagctgatt gcttacccga tcgctgttga agcgttatcg 420

ctgatttata acaaagatct gctgccgaac ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg 480

ctggataaag aactgaaagc gaaaggtaag agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg 540

tacttcacct ggccgctgat tgctgctgac gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc 600

aagtacgaca ttaaagacgt gggcgtggat aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc 660

ctggttgacc tgattaaaaa caaacacatg aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa 720

gctgccttta ataaaggcga aacagcgatg accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac 780

atcgacacca gcaaagtgaa ttatggtgta acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca 840

tccaaaccgt tcgttggcgt gctgagcgca ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag 900

ctggcaaaag agttcctcga aaactatctg ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat 960

aaagacaaac cgctgggtgc cgtagcgctg aagtcttacg aggaagagtt ggcgaaagat 1020

ccacgtattg ccgccactat ggaaaacgcc cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg 1080

cagatgtccg ctttctggta tgccgtgcgt actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt 1140

cagactgtcg atgaagccct gaaagacgcg cagactaatt cgagctcgaa caacaacaac 1200

aataacaata acaacaacct cgggcaccat caccatcacc atcaccatca ccatgaaaac 1260

ctgtattttc agggagattg ggcaaaagtg aaagccgccg caaccgaact gggcaatgca 1320

gtgagcgata ccagtaaaga agcatggcag agcgtgaccg attttagcaa agccacctgg 1380

gccagcgtga gccagtgggg tagcgaagca tttaataccg caggtgcctg gaccgataaa 1440

agtgttgcaa ccggtaaaga atggctggca gttgccgata aaaaactgga tgaaatgctg 1500

gaaccgaaaa ccgcagatga agcccgcctg gccctgaata caatggctga taccgcactg 1560

gttcgtctgt ttaatgaaca gccgagcgcc aaactgctgt ttgataaagc ctatggttat 1620

gccgtgtttg atagccgtaa atttagcctg atgctgcata ccaatcaggg tgccggcgtg 1680

gccgtgaatc gtgcaaccgg taagcatacc tatatgaaaa tgtttggcgc aggcctggca 1740

gccggcctgg gtggtaaatt ttatcagcag gttattctgt ttgaggataa agcacgtttt 1800

gatgcatttg ttagccaggg ttgggaagca accagtgaag tgggcgccgt ggccggcaaa 1860

gaaagtgcag aactgaccgc aaaatataat ggtggtatgg ccatttatca gattggtgaa 1920

aaaggtctgc tgctggatgc caatattagc ggtagcaaat attgggttga taaagatctg 1980

acccgttaa 1989

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽与具有下列氨基酸序列的多肽相比，其N端具有修饰，所述修饰包括选自N端氨基酸的增加、甲基化、甲酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化的至少之一，

(1)具有SEQ ID NO：1-6所示氨基酸序列的多肽；或

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述N端氨基酸的增加包括N端增加一个或一个以上的氨基酸，且增加的氨基酸至少有一个甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述的N端氨基酸的增加为N端增加一个氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

5.一种提高BefA蛋白稳定性或制备BefA蛋白突变体的方法，其特征在于，对BefA蛋白氨基酸序列的N端进行修饰，所述修饰包括选自N端氨基酸的增加、甲基化、甲酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、环化、丙酰化、十六烷酰化、十四烷化和乙酰化的至少之一。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述BefA蛋白具有

(1)SEQ ID NO：1-6所示氨基酸序列；或

(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的序列；或

(3)与(1)相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述N端氨基酸的增加包括N端增加一个或一个以上的氨基酸，且增加的氨基酸至少有一个甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的N端氨基酸的增加为N端增加一个氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸或脯氨酸；优选甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；更优选甘氨酸。

9.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括伴侣蛋白、连接肽以及BefA蛋白，所述连接肽的N端与所述伴侣蛋白的C端相连，所述连接肽的C端与所述BefA蛋白的N端相连，所述连接肽适于被蛋白酶切割，以便形成游离的BefA蛋白突变体，所述游离的BefA蛋白突变体的N端相比于BefA蛋白，增加了一个或多个氨基酸。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述伴侣蛋白包括选自麦芽糖结合蛋白、CBP、GST、SUMO、Trx、NusA的至少之一，任选地，所述伴侣蛋白含有或不含有His标签、Flag标签；

任选地，所述蛋白酶为烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、肠激酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶、人鼻病毒3C蛋白酶、SUMO酶或KEX-2；

任选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

11.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1～4中任一项所述的多肽或权利要求9～10中任一项所述的融合蛋白。

12.根据权利要求11所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

13.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求11或12所述的核酸。

14.根据权利要求13所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞。

15.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述的多肽。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学上可接受的辅剂。

17.权利要求1～4中任一项所述的多肽或权利要求15或16所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于促进β细胞增殖。

18.权利要求1～4中任一项所述的多肽或权利要求15或16所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防糖尿病、肥胖或保护肝功。