CN114409809A - 一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法和用途 - Google Patents

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recombinant
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郭慧芳
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Abstract

本发明属于多肽药物技术领域，涉及一种重组融合蛋白TAT‑mAIDA‑CD47及其制备方法和用途，所述重组融合蛋白TAT‑mAIDA‑CD47的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的重组融合蛋白TAT‑mAIDA‑CD47能够作用于小鼠肥胖模型，达到减脂减重的目的，为制备减肥药物提供了理论依据。

Description

一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于多肽药物技术领域，涉及一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法和用途。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)反式转录激活因子(trans-activator of transcription,TAT)富含碱性氨基酸序列，能够高效介导外源多肽及蛋白质等生物大分子通过膜性结构，如细胞质膜和血脑屏障等。将TAT与靶蛋白共价相连，可以使靶蛋白直接穿过细胞膜，进入细胞或在周围细胞间传递，该过程不依赖于受体与转运蛋白，被转导入细胞内的外源蛋白保留其原有的生物活性与功能，与温度等无关，对宿主细胞几乎无毒性。这种由TAT携带靶蛋白跨过细胞膜，进入细胞质的过程称为蛋白质转导(protein transduction)，是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的技术。
CD47也称为整联素关联蛋白(integrin-associated protein,IAP)，属于免疫球蛋白超家族，其分子结构由细胞外免疫球蛋白可变样结构域(IgⅤ)、跨膜结构域和可选剪接的细胞质尾组成。CD47是机体内宿主细胞的“自我”标志，广泛表达于细胞表面，在细胞增殖、黏附、迁移、凋亡和吞噬等功能中起重要作用。CD47可以与表达于巨噬细胞的信号调节蛋白α(signal regulator protein alpha,SIRPα)结合避免巨噬细胞的吞噬清除，因此，它可以作为一种抵抗巨噬细胞吞噬的标志物，以确保健康的自体细胞不会被吞噬，造血干细胞、祖细胞和红细胞都高表达CD47以避免被清除。
脂肪储存效率的一个决定性因素是肠粘膜细胞对脂肪的吸收率，而小肠中三酰甘油合成酶的浓度直接影响脂肪吸收效率。体轴发育抑制因子相互作用和背侧发育相关蛋白(AIDA)基因是一种“浪费基因”。
肥胖症是指体内贮积的脂肪量超过理想体重20％以上，是一种由遗传因素、环境因素等多种原因相互作用而引起的慢性代谢性疾病，其发生机制是因为能量摄入超过能量消耗，导致体内脂肪过度蓄积和体重超常。肥胖症已成为全球最大的慢性疾病。因此，减肥不仅是为了审美还为了身体健康，寻找到科学合理且有效的减肥方式极为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供了一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法和用途，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47能够作用于小鼠肥胖模型，达到减脂减重的目的。
本发明提供了一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，包括如下步骤：
S1，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47原核表达载体的构建：
从Genebank获得TAT、mAIDA和部分CD47的cDNA序列，按照原核密码子系统进行优化，合成重组TAT-mAIDA-CD47 cDNA序列，两端分别含有BamH I和Sal I的酶切位点，限制性核酸内切酶BamH I作用的回文结构序列为GGATCC，限制性核酸内切酶Sal I作用的回文结构序列为TAAGTCGAC，用BamH I和Sal I分别对重组的TAT-mAIDA-CD47 cDNA片段和线性pET-28a载体进行双酶切，通过T4 DNA连接酶将TAT-mAIDA-CD47 cDNA片段连接到线性pET-28a上，获得pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体，将获得的pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，进行扩增后提取pET-28a-TAT-mAIDA-CD47重组表达载体；
S2，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的诱导表达；
取S1中得到的重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47转化入BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞，转化后涂布在含卡那霉素的LB培养板中，37℃培养过夜，获得单克隆菌株，挑取单克隆菌株到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD600值为0.8时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃诱导表达4小时，取出1ml诱导后的菌液，离心获得菌体，洗涤后超声裂解细菌，释放蛋白；
S3，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47亲和纯化：
取S2中得到的含重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47的大肠杆菌BL21-DE3扩大培养，收集后破碎菌体，离心取上清，过滤，向过滤后的上清中加入咪唑，使终浓度为40mM，用100ml含40mM咪唑的洗涤液平衡Ni-NTA柱，将获得的上清液上样，流速控制为20～30ml/h，用100ml含40mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤重组融合蛋白，除去杂蛋白，用15～25ml含250mM咪唑洗脱缓冲液洗脱重组融合蛋白，收集纯化后的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47。
进一步的，S1中，所述pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞时按照1μg:100μL的用量比。
进一步的，S2中，所述重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47转化入BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞时按照1μg:100μL的用量比。
进一步的，S2中，所述LB培养板和LB液体培养基中卡那霉素的工作浓度均为100mg/L。
进一步的，S2中，超声裂解细菌的条件为：功率为300W，工作15S再停10S，共10分钟。
进一步的，S3中，离心条件为：4℃11000rpm离心15min。
本发明还提供了所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在制备减肥药物中的用途。
进一步的，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47能够用于制备肠道脂肪吸收抑制剂。
进一步的，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47能够用于制备治疗伴随高脂或肥胖症状疾病的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明中制备的重组蛋白TAT-mAIDA-CD47减脂减重效果十分显著，应用重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47组的小鼠较应用生理盐水组的小鼠体重明显较轻并且脂肪含量少，具有显著差异。
2、本发明中的重组蛋白TAT-mAIDA-CD47能够作用于小鼠肥胖模型，达到减脂减重的目的；
其中TAT多肽可以介导该重组融合蛋白顺利通过细胞膜/血脑屏障，CD47多肽可以使该重组融合蛋白不被免疫系统的巨噬细胞清除，少量重组融合蛋白就可以有效发挥减脂/减重作用；
重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47既可以应用于单纯肥胖症，降低体脂，也可以应用于代谢综合征、糖尿病等伴随高脂或肥胖症状的疾病。
3、AIDA与内质网共定位，可通过内质网相关蛋白降解系统引起三酰甘油合成相关的酶类降解，进而下调机体对脂肪的吸收效率；AIDA介导的ERAD系统可能代表了一种抗节俭机制，其作用于肠道脂肪吸收和全身脂肪储存的酶，达到减肥的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中构建的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47表达质粒示意图；
图2为本发明中重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R250染色1h，用脱色液充分脱色至背景为无色的条带结果；
图3为本发明中小鼠静脉注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47后，该蛋白在小鼠血液中的浓度变化；
图4为本发明中小鼠尾静脉注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47后，该蛋白在小鼠肠系膜脂肪脂肪组织中的浓度；
图5为本发明中建立肥胖小鼠模型时，分别腹腔注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47与生理盐水12周，两组小鼠体重变化图。
图6为本发明中建立肥胖小鼠模型时，分别腹腔注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47与生理盐水12周后，两组小鼠的体脂对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一、重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法。
所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，包括如下步骤：
S1，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47原核表达载体的构建
(1)从Genebank获得TAT、mAIDA和部分CD47的cDNA序列，所述TAT的cDNA序列如SEQID No.3所示，所述mAIDA的cDNA序列如SEQ ID No.4所示，所述部分CD47的cDNA序列如SEQID No.5所示；
SEQ ID No.3：TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA
SEQ ID No.5：
GGAAACTACACTTGTGAAGTAACAGAATTAACCAGAGAAGGTGAAACGATCATCGAGCTAAAA
按照原核密码子系统进行优化TAT、mAIDA和部分CD47的cDNA序列，优化后的TAT序列如SEQ ID No.6所示，优化后的mAIDA序列如SEQ ID No.7所示，优化后的部分CD47序列如SEQ ID No.8所示，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成重组TAT-mAIDA-CD47 cDNA序列(SEQ ID No.2)，两端分别含有BamH I和Sal I的酶切位点，限制性核酸内切酶BamH I作用的回文结构序列为GGATCC，限制性核酸内切酶Sal I作用的回文结构序列为TAAGTCGAC，；
(2)用BamH I和Sal I分别对重组的TAT-mAIDA-CD47 cDNA片段和线性pET-28a载体进行双酶切，通过T4 DNA连接酶将TAT-mAIDA-CD47 cDNA片段连接到线性pET-28a上，构建pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体，如图1所示；
(3)取pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体1μg，于冰水浴中加入到100μLDH5α大肠杆菌感受态细胞，冰浴静置30min，将离心管置于42℃水浴加热90s，冰浴冷却2-3min，向离心管加入900μL LB培养基(不含抗生素)(配方：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，加蒸馏水至1L)，37℃摇床震荡培养45min，取100μL转化菌液涂布在含卡那霉素(100mg/L)的LB培养板中(配方：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，加蒸馏水至1L,临用前加卡那霉素至终浓度为100mg/L)，37℃培养12-16h；挑取单克隆菌株到5ml含卡那霉素(100mg/L)的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，提取扩增后的pET-28a-TAT-mAIDA-CD47重组表达载体；
S2，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的诱导表达
(1)取步骤S1中得到的重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47 1μl于100μl大肠杆菌BL21-DE3感受态细胞中进行转化，步骤同S1，取100μL转化菌液涂布在含卡那霉素(100mg/L)的LB培养板中，37℃培养过夜，获得单克隆菌株；
(2)挑取单克隆菌株接种到5ml含卡那霉素(100mg/L)的LB培养基中，37℃震荡培养，当OD值约为0.8时，加IPTG至终浓度1mmol/L，于30℃诱导表达4小时，获得诱导后的菌液；
(3)取出1ml(2)中诱导后的菌液，8000rpm，4℃离心15min，弃上清收集菌体；PBS洗涤菌体后用超声(功率为300W，工作15S再停10S，共10分钟)裂解细菌，释放蛋白；
(4)取(3)中裂解后未诱导菌液全菌、裂解后诱导后菌液全菌、裂解后诱导后菌液上清与沉淀，SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R250染色，鉴定重组融合蛋白表达情况；
(5)结果如图2所示：重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47大小为39KD，在BL21细胞中获得高效表达，且该蛋白为可溶性表达；
S3，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47亲和纯化
(1)取S2中得到的含重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47的大肠杆菌BL21-DE3扩大培养，收集后冰浴超声破碎菌体，4℃11000rpm离心15min，取上清，用0.22μm滤膜过滤,向过滤后的上清中加入咪唑，使终浓度为40mM；
(2)用100ml含40mM咪唑的洗涤液平衡Ni-NTA柱，将(1)中获得的上清液上样，流速控制为20～30ml/h；
(3)用100ml含40mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤重组融合蛋白，除去非特异结合的杂蛋白；
(4)用15～25ml含250mM咪唑洗脱缓冲液洗脱重组融合蛋白，收集纯化后的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47。
二、重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的鉴定与定量测定
(1)取纯化的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47，倒入透析袋中用PBS透析8-12小时；
(2)取(1)中透析后的蛋白，SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R250染色，结果如图2所示；融合蛋白分子量为39KD，与目标蛋白一致，说明表达并纯化的蛋白是目标蛋白；蛋白定量分析试剂盒测定重组蛋白浓度，小量分装后-20℃保存。
三、重组融合蛋白应用
1、重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在血液中的浓度变化检测
取7周龄雄性C57小鼠12只，分两组，一组尾静脉注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47(2mg/kg)，另一组尾静脉注射对照蛋白TAT-mAIDA(2mg/kg)，分别在给药后0.5，2，6，12，24，48剪尾取血，ELISA法检测血液中所注射蛋白的浓度。
结果显示：尾静脉注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47后血液中该蛋白浓度变化如图5所示。重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在血液中存在时间及浓度明显高于对照蛋白TAT-mAIDA。
2、重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的穿膜效果检测
取7周龄雄性C57小鼠16只，分两组，一组尾静脉注射重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47(2mg/kg)，另一组尾静脉注射对照蛋白mAIDA-CD47(2mg/kg)，分别在给药后0，0.5，2，12，24，48，72h麻醉小鼠，生理盐水灌注后取肠系膜脂肪组织，制备脂肪组织匀浆，ELISA法检测匀浆中蛋白的浓度。
结果显示：匀浆中蛋白的浓度变化如图4所示。重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47穿膜效果明显高于对照蛋白mAIDA-CD47。
3、重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的减脂效果检测
取4周龄雄性C57小鼠28只用高脂饲料喂养，分两组，其中一组定期腹腔注射融合蛋白TAT-mAIDA-CD47，另一组注射等量的生理盐水。每周检测小鼠体重变化情况。12周后，对两组小鼠的体重和脂肪值进行测量。
结果显示：重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的减脂减重效果十分显著。应用重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47组的小鼠较应用生理盐水组的小鼠体重明显较轻并且脂肪含量少，具有显著差异(如图5，图6所示)。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 西安医学院
<120> 一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47及其制备方法和用途
<141> 2022-01-22
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ser Gly Pro Gly Met
1 5 10 15
Ser Glu Val Thr Arg Ser Leu Leu Gln Arg Trp Gly Ala Ser Leu Arg
20 25 30
Arg Gly Ala Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Leu Val Glu Ala Ile Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Ile Leu Ala Arg His Leu Gln Lys Glu Ala Gln Ala Gln
50 55 60
His Asn Asn Ser Glu Phe Thr Glu Glu Gln Lys Lys Thr Ile Gly Lys
65 70 75 80
Ile Ala Thr Cys Leu Glu Leu Arg Ser Ala Ala Leu Gln Ser Thr Gln
85 90 95
Ser Gln Glu Glu Phe Lys Leu Glu Asp Leu Lys Lys Leu Glu Pro Ile
100 105 110
Leu Lys Asn Ile Leu Thr Tyr Asn Lys Glu Phe Pro Phe Asp Val Gln
115 120 125
Pro Ile Pro Leu Arg Arg Ile Leu Ala Pro Gly Glu Glu Glu Asn Leu
130 135 140
Glu Phe Glu Glu Asp Glu Glu Gly Gly Ala Gly Ala Gly Pro Pro Asp
145 150 155 160
Ser Phe Ser Ala Arg Val Pro Gly Thr Leu Leu Pro Arg Leu Pro Ser
165 170 175
Glu Pro Gly Met Thr Leu Leu Thr Ile Arg Ile Glu Lys Ile Gly Leu
180 185 190
Lys Asp Ala Gly Gln Cys Ile Asp Pro Tyr Ile Thr Val Ser Val Lys
195 200 205
Asp Leu Asn Gly Ile Asp Leu Thr Pro Val Gln Asp Thr Pro Val Ala
210 215 220
Ser Arg Lys Glu Asp Thr Tyr Val His Phe Asn Val Asp Ile Glu Leu
225 230 235 240
Gln Lys His Val Glu Arg Leu Thr Lys Gly Ala Ala Ile Phe Phe Glu
245 250 255
Phe Lys His Tyr Lys Pro Lys Lys Arg Phe Thr Ser Thr Lys Cys Phe
260 265 270
Ala Phe Met Glu Met Asp Glu Ile Lys Pro Gly Pro Ile Val Ile Glu
275 280 285
Leu Tyr Lys Lys Pro Thr Asp Phe Lys Arg Lys Lys Leu Gln Leu Leu
290 295 300
Thr Lys Lys Pro Leu Tyr Leu His Leu His Gln Ser Leu His Lys Glu
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg
325 330 335
Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
340 345
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgttctg gtccgggtat gtctgaagtt 60
acccgttctc tgctgcagcg ttggggtgct tctctgcgtc gtggtgctga cttcgactct 120
tggggtcagc tggttgaagc tatcgacgaa taccagatcc tggctcgtca cctgcagaaa 180
gaagctcagg ctcagcacaa caactctgaa ttcaccgaag aacagaaaaa aaccatcggt 240
aaaatcgcta cctgcctgga actgcgttct gctgctctgc agtctaccca gtctcaggaa 300
gaattcaaac tggaagacct gaaaaaactg gaaccgatcc tgaaaaacat cctgacctac 360
aacaaagaat tcccgttcga cgttcagccg atcccgctgc gtcgtatcct ggctccgggt 420
gaagaagaaa acctggaatt cgaagaagac gaagaaggtg gtgctggtgc tggtccgccg 480
gactctttct ctgctcgtgt tccgggtacc ctgctgccgc gtctgccgtc tgaaccgggt 540
atgaccctgc tgaccatccg tatcgaaaaa atcggtctga aagacgctgg tcagtgcatc 600
gacccgtaca tcaccgtttc tgttaaagac ctgaacggta tcgacctgac cccggttcag 660
gacaccccgg ttgcttctcg taaagaagac acctacgttc acttcaacgt tgacatcgaa 720
ctgcagaaac acgttgaacg tctgaccaaa ggtgctgcta tcttcttcga attcaaacac 780
tacaaaccga aaaaacgttt cacctctacc aaatgcttcg ctttcatgga aatggacgaa 840
atcaaaccgg gtccgatcgt tatcgaactg tacaaaaaac cgaccgactt caaacgtaaa 900
aaactgcagc tgctgaccaa aaaaccgctg tacctgcacc tgcaccagtc tctgcacaaa 960
gaatctggtc cgggtggtaa ctacacctct gaagttaccg aactgacccg tgaaggtgaa 1020
accatcatcg aactgaaa 1038
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tatggcagga agaagcggag acagcgacga aga 33
<210> 4
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atgtcggagg tgacccggag tctgctgcag cgctggggcg ccagtcttag gagaggcgcc 60
gacttcgact cttggggcca gctggtggag gcgatagacg agtatcagat attagcaaga 120
cacttacaga aggaggccca agctcaacac aataattctg aatttacaga agaacaaaag 180
aaaaccatag gcaaaattgc gacatgtttg gaattgcgaa gtgcagcatt acagtccaca 240
cagtcccaag aagagtttaa actggaggac ctgaagaagc tagaaccaat cctgaagaat 300
attcttacat ataataaaga attcccattt gatgttcagc ctattccatt aagacgtatt 360
ttagcacctg gtgaagaaga gaatttggaa tttgaagaag atgaagaagg tggtgctgga 420
gcagggcctc ctgattcttt ctctgctaga gttcctggta ctttattgcc acggttgcca 480
tcggaaccag ggatgacgtt actcaccatc aggattgaga aaattggttt gaaagatgcg 540
gggcagtgca tcgatcccta catcacagtc agcgtgaaag atttgaatgg catagattta 600
actcccgtac aagacactcc tgtggcttca aggaaagaag atacttacgt tcactttaat 660
gtggacattg agctccagaa acacgttgaa aggttaacca aaggtgcggc cattttcttt 720
gaattcaaac attacaagcc taaaaagagg tttaccagca ctaagtgttt tgccttcatg 780
gagatggatg aaattaaacc tgggccaatc gtaatagaac tatacaagaa acccactgac 840
tttaaaagaa agaaattgca attgttgacc aagaaaccac tttatcttca tctacatcaa 900
agtttgcaca aggaa 915
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggaaactaca cttgtgaagt aacagaatta accagagaag gtgaaacgat catcgagcta 60
aaa 63
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tacggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgt 33
<210> 7
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
atgtctgaag ttacccgttc tctgctgcag cgttggggtg cttctctgcg tcgtggtgct 60
gacttcgact cttggggtca gctggttgaa gctatcgacg aataccagat cctggctcgt 120
cacctgcaga aagaagctca ggctcagcac aacaactctg aattcaccga agaacagaaa 180
aaaaccatcg gtaaaatcgc tacctgcctg gaactgcgtt ctgctgctct gcagtctacc 240
cagtctcagg aagaattcaa actggaagac ctgaaaaaac tggaaccgat cctgaaaaac 300
atcctgacct acaacaaaga attcccgttc gacgttcagc cgatcccgct gcgtcgtatc 360
ctggctccgg gtgaagaaga aaacctggaa ttcgaagaag acgaagaagg tggtgctggt 420
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gaattcaaac actacaaacc gaaaaaacgt ttcacctcta ccaaatgctt cgctttcatg 780
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ttcaaacgta aaaaactgca gctgctgacc aaaaaaccgc tgtacctgca cctgcaccag 900
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ggtaactaca cctctgaagt taccgaactg acccgtgaag gtgaaaccat catcgaactg 60
aaa 63

Claims (10)

1.一种重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47，其特征在于，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种权利要求1所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47原核表达载体的构建：
从Genebank获得TAT、mAIDA和部分CD47的cDNA序列，按照原核密码子系统进行优化，合成重组TAT-mAIDA-CD47 cDNA序列，两端分别含有BamH I和Sal I的酶切位点，用BamH I和Sal I分别对重组的TAT-mAIDA-CD47cDNA片段和线性pET-28a载体进行双酶切，通过T4 DNA连接酶将TAT-mAIDA-CD47 cDNA片段连接到线性pET-28a上，获得pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体，将获得的pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，进行扩增后提取pET-28a-TAT-mAIDA-CD47重组表达载体；
S2，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的诱导表达；
取S1中得到的重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47转化入BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞，转化后涂布在含卡那霉素的LB培养板中，37℃培养过夜，获得单克隆菌株，挑取单克隆菌株到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD600值为0.8时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃诱导表达4小时，取出1ml诱导后的菌液，离心获得菌体，洗涤后超声裂解细菌，释放蛋白；
S3，重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47亲和纯化：
取S2中得到的含重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47的大肠杆菌BL21-DE3扩大培养，收集后破碎菌体，离心取上清，过滤，向过滤后的上清中加入咪唑，使终浓度为40mM，用100ml含40mM咪唑的洗涤液平衡Ni-NTA柱，将获得的上清液上样，流速控制为20～30ml/h，用100ml含40mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤重组融合蛋白，除去杂蛋白，用15～25ml含250mM咪唑洗脱缓冲液洗脱重组融合蛋白，收集纯化后的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，S1中，所述pET-28a-TAT-mAIDA-CD47载体转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞时按照1μg:100μL的用量比。
4.根据权利要求3所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，S2中，所述重组表达载体pET-28a-TAT-mAIDA-CD47转化入BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞时按照1μg:100μL的用量比。
5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，S2中，所述LB培养板和LB液体培养基中卡那霉素的工作浓度均为100mg/L。
6.根据权利要求5所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，S2中，超声裂解细菌的条件为：功率为300W，工作15S再停10S，共10分钟。
7.根据权利要求6所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47的制备方法，其特征在于，S3中，离心条件为：4℃11000rpm离心15min。
8.一种权利要求1所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在制备减肥药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在制备减肥药物中的用途，其特征在于，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47能够用于制备肠道脂肪吸收抑制剂。
10.根据权利要求8所述的重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47在制备减肥药物中的用途，其特征在于，所述重组融合蛋白TAT-mAIDA-CD47能够用于制备治疗伴随高脂或肥胖症状疾病的药物。
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