CN111154742B

CN111154742B - 一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽

Info

Publication number: CN111154742B
Application number: CN202010083064.8A
Authority: CN
Inventors: 秦志华; 段佳燚; 张林林; 白玉; 王新; 单虎
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: CN111154742A

Abstract

本发明提供一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽，所述的蛋白肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还提供所述的蛋白肽在治疗冠心病或血管疾病中的应用。本发明所提供的蛋白肽可以有效治疗ApoE‑/‑小鼠内膜粗糙、增厚的现象，可用于老年宠物中来预防或治疗冠心病。

Description

一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽。

背景技术

随着社会的不断发展和人均收入水平的不断提高，人们的消费水平也逐渐增长，各式各样的宠物业逐渐暴露在人们的视野之中，宠物行业也逐渐规范化，产业化。人们收入的增长增加了减压，排遣孤独的消费，养宠物的行为也越来越平民化，大众化，而随着低欲望社会的来临，90后、95后都市空巢青年更为宠物市场补充了源源不断的消费生力军。

在我国广泛流行养宠物犬已有近二十年了，最初养殖的宠物犬已逐渐进入老年，导致宠物的老年病也逐渐增加。通常来说年龄在8岁以上的宠物犬已进入老年。

在常见的宠物犬老年病中，冠心病是老年宠物犬的常见病、多发病。犬冠心病在临床上以气滞血瘀型多见。冠心病发生的主要原因为动脉粥样硬化，血管壁斑块破裂与血栓的形成。

发明内容

本发明的目的是提供一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽，可以有效的治疗宠物犬冠心病，从而弥补现有技术的不足。

本发明的目的是提供一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽，所述的蛋白肽包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白肽；

2)在1)中的序列基础上，取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)衍生的蛋白肽；

本发明所提供的蛋白肽，还包含从小鼠主动脉细胞中分离的，与氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白肽具有80％或以上同源性的蛋白肽；

所述的同源性，优选为90％；

更优选的，同源性为95％或以上；

本发明还提供编码上述蛋白肽的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供所述的蛋白肽在治疗冠心病或血管疾病中的应用。

本发明还提供所述的蛋白肽在制备宠物药品或食品中的应用，

所述的药品为心血管疾病的宠物药品。

本发明所提供的蛋白肽可以有效治疗ApoE-/-小鼠内膜粗糙、增厚的现象，可用于老年宠物中来预防或治疗冠心病。

附图说明

图1：RNA提取电泳图，其中M为marker，泳道1为实验组，泳道2为对照组；

图2：消减文库克隆电泳图；

图3：Salvia-86在实验组RNA样品和对照组RNA样品中的表达量图；

图4：Salvia-86的重组表达蛋白电泳图；

图5：实验小鼠主动脉切片图，其中图A为正常小鼠组、图B为ApoE-/-小鼠模型组、图C为阳性药物Vc组、图D为Salvia-86蛋白肽组。

具体实施方式

在之前的研究中，将丹参水提取物加入到小鼠皮肤的血管内皮细胞株的培养基中，结果发现丹参提取物能调控血管生成过程。为了研究丹参提取物对小鼠血管内皮细胞株内基因表达的影响，使用抑制消减杂交技术构建处理组和对照组的基因差异表达文库，筛选在小鼠血管中受丹参提取物影响表达的基因。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：蛋白肽的筛选及检测

抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridizati-on,SSH)是对消减杂交进一步改进后建立在抑制性PCR基础上的一种高效的消减杂交技术的简便而高效的筛选差异表达基因的方法，通过连接接头，在第一次消减杂交使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致后，通过第二次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA而实现差异表达cDNA片段的扩增；在进行两轮抑制性PCR后，实现非特异片段的抑制。这样既利用了消减杂交技术的差减富集，又利用了抑制PCR技术进行了富集，因而能够筛选到低表达量的相关基因。

本实施例的具体步骤如下：

1、对照组和实验组

将生药丹参用蒸馏水进行水煎成每毫升含生药原料丹参1.0g的药液，然后经0.45μm滤膜过滤后作为丹参提取液；

将提取的丹参提取液按1:30-50的体积比加入到用于培养源于C57小鼠心肌主动脉的C57小鼠主动脉细胞(Mouse Aortic Endothelial cells)的Hams F12培养基(北京派瑞金公司，编号GK1273)做为实验组的培养基；而对照组还是使用Hams F12培养基。

2、丹参提取液培养小鼠主动脉细胞

使用添加了丹参提取液的Hams F12培养基作为实验组，实验组中丹参提取液的添加比例分别为1:30、1:40、1:50，设定3个实验组。而不添加丹参提取液的Hams F12培养基作为对照组，对照组设立3个平行；

细胞的培养方法如下：

1)首先取出25cm²培养瓶，75％酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱中静置2-3h，以稳定细胞状态；

2)吸出培养基后，在实验组和对照组分别加入对应的培养基，再进行培养过夜，待细胞达到80％汇合时进行传代培养；

3)准备传代培养的培养瓶的细胞用pbs溶液清洗后，用0.125％胰蛋白酶消化液1ml至培养瓶中，37℃温浴3min左右，再分别加入完全培养液终止消化；

4)用吸管吹打均匀，按1:3的比例在对应的培养基中进行传代培养；待细胞完全贴壁后，收集实验组和对照组的细胞准备提取RNA；

3、提取RNA样品及纯化

用Trizol方法分别取实验组细胞和对照组细胞的RNA,提取的RNA样品经核酸蛋白仪和琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量，检测后OD260/OD280在1.8～2.0之间,提取的样品进行mRNA纯化置于-80℃保存(图1)。

采用宝生物的Oligotex^TM mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化，纯化后采用醋酸钠、酒精沉淀的方法进行mRNA的浓缩达到合成cDNA所需的浓度。

4、cDNA的合成及纯化

采用宝生物的cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成，合成后的产物经切胶纯化，电泳检测合格后-20℃保存。

5、构建SSH cDNA文库

使用Clontech的PCR Select^TM cDNA Subtraction试剂盒进行cDNA的酶切，酶切产物切胶回收后，连接接头后进行抑制消减杂交，其中正向消减杂交文库构建以实验组cDNA酶切产物作为driver，对照组cDNA酶切产物tester；反向消减杂交文库构建以对照组cDNA酶切产物作为driver，实验组cDNA酶切产物作为tester。

经过两次抑制消减杂交，杂交后进行巢式PCR扩增，PCR产物经纯化后连接到T-载体，并转化到DH5ɑ感受态细胞中，37℃条件下在涂在含x-Gal和IPTG的LB培养基上涂布培养13h后，挑取白色单菌落进行培养增殖，经菌液PCR反应，产物进行琼脂糖电泳检测后挑选目的片段大小不同的单克隆进行测序(图2)。

6、分析筛选的单克隆序列

从实验组和对照组的消减文库中分别随机筛选200个阳性克隆进行测序。

结果从实验组得到182条序列，从对照组获得了153条序列。测得的序列去除载体、接头序列，并人工去除低质量的测序，最终获得长度超过100bp的ESTs。其中实验组消减文库为126个contings，对照组消减文库获得92个contings。

首先对上述的序列通过DNAMAN软件进行alignment分析，排除了两个消减文库中有部分重复的序列，再通过NCBI的blastx进行同源性比较。结果实验组消减文库中同源性(高于80％)的ESTs有76个(表1)，7个同源性低于80％；而对照组消减文库中具有高同源性的ESTs有56个，3个同源性低于80％。

表1：ESTs部分序列的同源性比较结果

对未查找到高同源性的ESTs片段设计引物，在实验组和对照组的mRNA进行表达量的检测，结果发现一个ESTs片段在实验组中的表达量明显提高(图3)。

对该ESTs片段命名为Salvia-86，该片段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

accatgaaagataccaggcAgacggcactggaaactgatgtaccatctgtccccagaacagcctggtcgtggccctactgcagaggtgtgcaaaccttcagcacacgtcctggagcccacacagcagagatgaaagagagaatggaccagttagccaacatgaaagagctggagctgatgctggacgacgacggtctgggtgtgcgggatgacgtgacagcccgggatggagcccacctcaattctgcacaccctatgctttaccatctgtccgttgattatcaccctgagaccaactcgcagccggtattgcacatcctggacagcccgggcacgagccacacgacaaccacctct。

其编码蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

TMKDTRQTALETDVPSVPRTAWSWPYCRGVQTFSTRPGAHTAEMKERMDQLANMKELELMLDDDGLGVRDDVTARDGAHLNSAHPMLYHLSVDYHPETNSQPVLHILDSPGTSHTTTTS。

实施例2：Salvia-86蛋白肽的重组表达

为了研究Salvia-86蛋白肽的相关功能，将该蛋白肽进行重组表达。通过将获得的目的基因片段连接入质粒片段pET28a(+)进中，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并均匀涂布于带有氨苄霉素(20μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养。

挑取单菌落，用pET系列载体的通用引物T7及T7ter进行PCR扩增，阳性菌落再进行测序确定。

将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，并均匀涂布带有卡那抗性(30μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接入含有卡那抗性(30μg/ml)的LB培养基中，37℃、220rpm培养12h。按1％～2％的接种量接到LB培养基中，在37℃培养过夜，4℃，12000rpm离心10min，收集菌体。

利用亲和层析原理，采用Ni柱纯化含有2个组氨酸的标签表达载体的蛋白。先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)重悬细胞沉淀并超声破碎。在4℃、8000×g条件下离心20min除去细胞碎片并收集含有粗酶的上清液。将粗酶加到用缓冲液A(50mM Tris-HCl，5mM咪唑和500mM NaCl)预平衡的Ni-NTA柱(8×1cm)上，然后加入缓冲液B(50mM Tris-HCl，50mM咪唑和500mM NaCl)洗脱以除去结合力较弱的蛋白质或杂质，然后，用缓冲液C(50mMTris-HCl，100mM咪唑和500mM NaCl)洗脱含有甲壳素酶活性的组分，并使用30kDa超滤管浓缩，收集截留液，即得到重组表达蛋白。通过SDS-PAGE鉴定条带，分子大小约为19kDa，如图4所示。

实施例3：Salvia-86蛋白肽对小鼠血管壁的效果

以动脉粥样硬化的模型ApoE-/-小鼠作为实验对象，饲喂标准西方膳食，饲喂2周后，随机分为空白对照组、阳性药物组，蛋白肽组进行饲养。饲养期间不控制饮食饮水，自由采食。每天采用灌胃给药的方式进行给药，其中阳性药物为VC，每次给药量为78mg/kg，蛋白肽为实施例2中重组表达纯化的Salvia-86蛋白肽，每次给药量为50-80mg/kg。

在给药六周后，取实验小鼠的主动脉进行切片，并进行HE染色，具体步骤如下：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。

2、苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

3、伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

4、脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。

切片的结果如图5所示，正常小鼠组可见主动脉结构完整，层次清晰，内膜光滑；而ApoE-/-小鼠模型组可见主动脉内膜粗糙、增厚、有大量增生，出现纤维蛋白。阳性药物Vc组对比模型组可见主动脉内膜光滑、有少量增生；而低浓度Salvia-86蛋白肽组(50mg/kg)相对模型组可见主动脉内膜光滑，少量增生出现；高浓度Salvia-86蛋白肽组(80mg/kg)对主动脉内膜治疗效果更明显。上述结果表明本发明的Salvia-86蛋白肽能够用于治疗小鼠的动脉粥样硬化，以及导致的冠心病，可用于预防治疗宠物的冠心病。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accatgaaag ataccaggca gacggcactg gaaactgatg taccatctgt ccccagaaca 60

gcctggtcgt ggccctactg cagaggtgtg caaaccttca gcacacgtcc tggagcccac 120

acagcagaga tgaaagagag aatggaccag ttagccaaca tgaaagagct ggagctgatg 180

ctggacgacg acggtctggg tgtgcgggat gacgtgacag cccgggatgg agcccacctc 240

aattctgcac accctatgct ttaccatctg tccgttgatt atcaccctga gaccaactcg 300

cagccggtat tgcacatcct ggacagcccg ggcacgagcc acacgacaac cacctct 357

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Met Lys Asp Thr Arg Gln Thr Ala Leu Glu Thr Asp Val Pro Ser

1 5 10 15

Val Pro Arg Thr Ala Trp Ser Trp Pro Tyr Cys Arg Gly Val Gln Thr

20 25 30

Phe Ser Thr Arg Pro Gly Ala His Thr Ala Glu Met Lys Glu Arg Met

35 40 45

Asp Gln Leu Ala Asn Met Lys Glu Leu Glu Leu Met Leu Asp Asp Asp

50 55 60

Gly Leu Gly Val Arg Asp Asp Val Thr Ala Arg Asp Gly Ala His Leu

65 70 75 80

Asn Ser Ala His Pro Met Leu Tyr His Leu Ser Val Asp Tyr His Pro

85 90 95

Glu Thr Asn Ser Gln Pro Val Leu His Ile Leu Asp Ser Pro Gly Thr

100 105 110

Ser His Thr Thr Thr Thr Ser

115

Claims

1.一种受丹参调节的血管壁修复相关的蛋白肽，其特征在于，所述的蛋白肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的蛋白肽。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.权利要求1所述的蛋白肽在制备用于治疗宠物心血管疾病的制品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的制品为药品或食品。

6.一种用于预防治疗犬冠心病的药物，其特征在于，所述的药物中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的蛋白肽。

7.一种用于预防治疗犬冠心病的饲料，其特征在于，所述的饲料中添加有权利要求1所述的蛋白肽。