CN109890400A - 包含蛋白磷酸酶1抑制肽的血管疾病治疗用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)的血管疾病(vascular diseases)治疗用组合物。本发明的组合物不仅通过抑制蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)‑介导去磷酸化来抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth nuscle cell，VSMCs)的非异常性增殖，而且使血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)激活，从而诱导功能障碍得以恢复，并且可有效利用于包含肺动脉高血压的血管疾病的治疗上。

Description

包含蛋白磷酸酶1抑制肽的血管疾病治疗用组合物
技术领域
本发明为通过在韩国未来创造科学部支持下的课题编号GF01330来完成的，上述课题的研究管理专业机构为韩国研究财团，研究项目名称为“全球性研究室项目”，研究课题名称为“心脏病的信号转导研究及基因治疗”，主管机构为光州科学技术院，研究期限为2013年4月1日～2014年3月31日。
本专利申请要求于2016年10月24日向韩国专利厅提交的韩国专利申请第10-2016-0138612号的优先权，该专利申请的公开内容通过引用并入本文。
本发明涉及包含蛋白磷酸酶1抑制肽的血管疾病治疗用组合物。
背景技术
血管重塑(Vascular remodeling)为由肺动脉高血压、冠状动脉再狭窄、动脉硬化等各种疾病诱导的现象，并因血管损伤或刺激而发展[Pasterkampget al.(2000)Cardiovasc Res 45(4)；843-852]。这种引起血管的结构性变化的现象由细胞增殖、死亡、功能障碍等引起。血管的组成要素中血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VECs)和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)为对损伤及刺激作出反应的关键介质，并主导血管的重塑[Rabinovitch M et al.(2012)J Clin Invest 122(12)；4306-4313]。血管平滑肌细胞(VSMCs)与血管内皮细胞(VECs)的相互作用及各自的作用对于保持血管的紧张/松弛等血管的稳态的方面上是重要的。在这些作用进行异常的病理条件下，发生血管内皮细胞(VECs)的功能障碍及血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖现象等。除了这种因异常增殖而表现出收缩性的特性的内膜的表型以外，因存在于动脉的外膜的多个纤维化细胞而引起的细胞外基质的变化加速了血管纤维化，结果，使动脉僵硬度进一步增加，从而导致高血压(Hypertension)的表型[Harvey A et al.(2016)Can J Cardiol 32(5)：659-668；Michell GF(2014)Hypertension 64(1)：13-18]。
血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常性增殖为如上文提出的肺动脉高血压或大动脉瓣膜再狭窄等的血管增生性疾病的根本原因[Dzau VJ et al.(2002)Nature med 8：1249-1256；Novak K et al.(1998)Nature Med 4：989-990]。当动脉壁受损时，血管平滑肌细胞(VSMCs)向内膜层迁移(migration)，使表型快速从收缩及停滞发生改变，最终引起合成及增殖。具有合成表型的血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常性增殖导致动脉内膜的扩张，这种现象称为新生内膜生长(neointimal growth)[Austin GE et al.(1985)J Am Coll Cardiol6：369-375；Hanke H et al.(1992)Herz 12：300-308]。并且，在肺动脉高血压(Pulmonaryarterial hypertension，PAH)中，用于抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的如一氧化氮(Nitric oxide，NO)、前列环素(Prostacyclin，PGI2)等的血管扩张物质减少，并通过如内皮素-1(Endothelin-1)等的血管收缩物质的影响引起血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖[HoepermMet al.(2000)Engl J Med 342：1866-1870；Giaid A et al.(1993)N Engl JMed 328：1732-1739]。因此，血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的调节为血管增生性疾病的治疗中的重要因素。
血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖与细胞质Ca2+水平的慢性增加有关，这是因如兰尼碱受体(ryanodine receptor)和SERCA2a(sarco/endoplasmic reticulum(SR)Ca2+-ATPase)等的Ca2+处理(handling)蛋白质的损失而引起[Vallot O et al.(2000)Aerterioscler Thromb Vasc Biol 20：1225-1235]。SERCA2a的基因转移介质的修复使VSMC的增殖及新生内膜形成减少[Lipskaia L et al.(2005)Circ Res 97：488-495；Lipskaia L et al.(2013)Gene Ther 20：396-406]。因此，通过调节SERCA2a活性来保持低细胞质Ca2+水平可以为预防及改善血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的合理战略。
通过与受磷蛋白(phospholamban，PLB)之间的直接相互作用来抑制SERCA2a活性。抑制活性通过因蛋白磷酸酶1(phosphatase1，PP1)引起的丝氨酸第16个或苏氨酸第17个的去磷酸化来增加[Steenaart NA et al.(1992)Arch Biochem Biophys 293；17-24；Mattiazzi A et al.(2005)Cardiovasc Res 68：366-375；Schwinger RH et al.(1999)JMol Cell Cardiol 31：479-491；Sande JB et al.(2002)Cardiovasc Res 53：382-391]。因此，受磷蛋白(PLB)的蛋白磷酸酶1(PP1)-介导的去磷酸化的抑制为受损的心脏中上调SERCA2a活性的合理接近法。在以前，本发明人已经证明了作为9-mer肽的ψPLB-SE模拟磷酸化的受磷蛋白(PLB)以起到蛋白磷酸酶1(PP1)的诱饵(decoy)作用[Oh JG et al.(2013)JMol Cell Cardiol 56：63-71]。上述肽在体内(in vitro)及体外(ex vivo)抑制受磷蛋白(PLB)的去磷酸化，从而缺血/再灌注后恢复心脏中的SERCA2a活性。
另一方面，在血管增殖相关心血管疾病中，血管内皮细胞(VECs)的意义不仅仅止于单纯的解剖学上的边界膜。血管内皮细胞(VECs)为分泌用于保持血管的稳态的物质的重要器官之一。各种心血管类疾病的发生与血管内皮细胞(VECs)的功能具有密切相关，尤其在诱发高血压的动脉硬化症的发生和发展中起到重要作用。在肺动脉高血压的情况下，已知血管内皮细胞(VECs)的功能障碍(Endothelial dysfunction)为重要病因，并且实际上从血管内皮细胞(VECs)分泌的各种物质中的一氧化氮(NO)和前列环素(Prostacyclin)起到血管扩张作用，并具有抑制血小板聚集且抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖的作用，此为抑制如肺动脉高血压等的动脉硬化性疾病的发展的重要过程[Giaid A et al.(1995)NEngl J Med 333：214-221；Christman BW et al.(1992)N Engl J Med 327；70-75]。
在肺动脉高血压患者中，经常报道上述血管扩张剂的减少，作为由NO激活的鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)的产物的环鸟苷一磷酸(cyclic guanosinemonophosphate，cGMP)通过磷酸二酯酶5(Phosphodiestarease-5，PDE-5)的激活而被水解。环鸟苷一磷酸(cGMP)具有抑制血管扩张及细胞增殖的功能，磷酸二酯酶5(PDE-5)的活性使环鸟苷一磷酸(cGMP)的作用时间缩短。在这种条理下，现在已经开发出了如西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)等来作为磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂。然而，在肺动脉高血压的情况下，已知磷酸二酯酶5(PDE-5)的活性得以提高，而且丧失了在血管内皮细胞(VECs)中生成NO的能力本身，因此在根本上环鸟苷一磷酸(cGMP)水平也降低，从而仅抑制磷酸二酯酶5(PDE-5)的活性是有限的。事实上，在最近的临床结果中提出了对长期服用的危险性[Siehr SL et al.(2015)Front Pediatr 3：12]。对此，用于从根本上增加NO生成的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达干细胞治疗剂和鸟苷酸环化酶(GC)活性剂正处于临床试验阶段[Wei L et al.(2013)Hypertens Res 36(5)：414-421；Granton J et al(2015)Circ Res 117(7)：645-654]。
另一方面，70-80％的具有家族性的肺动脉高血压患者报告有骨形态发生蛋白受体2(Bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)基因突变，并且出现因骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)的减少而血管内皮细胞(VECs)的炎症反应相关粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(graculocyte macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF)、白细胞介素6(IL-6)以及白细胞介素8等的细胞因子的生成增加的现象。尤其，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的情况下，因真核细胞翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIF2α)的激活而使翻译增加[Sawada H et al(2014)J Exp Med 211(2)：263-280]。目前，利用骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)基因的基因治疗剂的研究正在临床前阶段中积极开展中，作为骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)信号传导类活性剂的他克莫司(FK506，tacrolimus)以肺动脉高血压(PAH)患者作为受试者而处于临床试验阶段[Spiekerkoetter E et al.(2009)Circ Res105：639-647；Spiekerkoetter E et al(2013)Respir Crit Care Med 192：254-257]。
细胞穿透肽(Cell permeable peptide，CPP)为信号信号肽的一种，并且用于使聚合物物质向细胞内渗透的肽。以由大约7-30个左右的序列组成且衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式转录激活因子(TAT)的研究作为开始来正式进行了相关研究。衍生自果蝇的触角足突变(Antennapedia)，衍生自单纯疱疹-1(HSV-1)病毒的VP22，衍生自猿猴空泡病毒40(SV40)大T抗原(large antigen T)的pep-1为第一代细胞穿透肽(CPP)，并且据报告，精氨酸、赖氨酸连续相连接的肽也具有细胞穿透性。但是，这种细胞穿透肽(CPP)并非衍生自人蛋白质的序列，因此内含有细胞毒性、免疫原性的风险。并且，最近与细胞穿透肽(CPP)相结合的生物药物后补物质的临床结果中，难以确定向人体细胞的转移功效或输送(cargo)的效果。其结果，正在进行向提高了人体细胞的转移功效的Hph-1、LPIN3以及dNP2等的衍生自人蛋白质的细胞穿透肽(CPP)的研究[Jung MR et al.(2011)J Control Relase 152(2)：294-302；Lim S et al.(2012)Mol Cells 34(6)577-582；Lim S et al.(2016)PLos One11(5)：e0155689；Lim S et al.(2015)Nat Commun 6：8244]。
在本文全文中引用了多个论文及专利文献并标注有其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容通过引用以其整体并入本文中，并且更清楚地说明本发明所属技术领结构域的水平及本发明的内容。
发明内容
技术问题
本发明人为了开发可调节平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的异常性增殖的新型血管疾病肽治疗剂而进行了锐意研究。其结果，本发明人发现，作为靶向蛋白磷酸酶1(protein phosphatase1，PP1)的肽的ψPLB-SE使球囊损伤(balloon-injured)的大鼠颈动脉的新生内膜生长(neointimal growth)减少，并且确认到ψPLB-SE使SERCA2a激活，从而通过调节作为异常性的Ca2+水平来保护SERCA2a免受血管平滑肌细胞(VSMC)中钙蛋白酶依赖性降解。此外，发现了使血管内皮细胞(VECs)的内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)的活性增加，从而恢复血管内皮细胞(VECs)的功能障碍，并缓解肺动脉高血压的新机制。本发明人通过上述多个效果确认到ψPLB-SE可形成血管增生性疾病的治疗策略的基础，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供血管疾病(vascular diseases)治疗用药物组合物。
本发明的再一目的在于，提供用于缓解或改善血管疾病(vascular diseases)的食品组合物。
本发明的另一目的在于，提供血管疾病(vascular diseases)的治疗方法。
本发明的还一目的在于，提供用于治疗血管疾病(vascular diseases)的用途的药物组合物。
本发明的又一目的及优点通过以下的发明内容、发明要求保护范围及附图而更加明确。
解决问题的手段
根据本发明的一方案，本发明提供包含(a)蛋白磷酸酶1抑制肽(proteinphosphatase 1inhibitory peptides)的药物有效量以及(b)药学上可接受的载体的血管疾病(vascular diseases)治疗用药物组合物。
本发明人为了开发可调节平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的异常性增殖的新型血管疾病肽治疗剂而锐意研究的结果，发现作为靶向蛋白磷酸酶1(protein phosphatase1，PP1)的肽的ψPLB-SE可使球囊损伤(balloon-injured)的大鼠颈动脉的新生内膜生长(neointimal growth)减少，并且确认到ψPLB-SE使SERCA2a激活，从而通过调节异常性的Ca2+水平来保护SERCA2a免受血管平滑肌细胞(VSMC)中钙蛋白酶依赖性降解。此外，发现了使血管内皮细胞(VECs)的内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitricoxide synthase，eNOS)的活性增加，从而恢复血管内皮细胞(VECs)的功能障碍，并缓解肺动脉高血压的新机。本发明人通过上述多个效果确认到ψPLB-SE可形成血管增生性疾病的治疗策略的基础。
在受磷蛋白(phospholamban)的磷酸化形态(序列表第一序列的氨基酸)中，本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)为经磷酸化的第16个氨基酸残基丝氨酸(Serine，Ser)被谷氨酸(glutamic acid，Glu)或天冬氨酸(aspartic acid，Asp)取代的模拟(mimic)肽，对蛋白磷酸酶1具有基质模拟抑制剂(substrate mimetic inhibitor)的作用。丝氨酸残基与极性磷酸基相结合以具有负电荷，利用氨基酸中的带有负电荷的谷氨酸及天冬氨酸具有结构性、电性相似性的特性，来用作经磷酸化的丝氨酸残基的取代模型。通常，在氨基酸中，蛋白磷酸酶1抑制肽与蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)的活性部位位点相结合之后被去磷酸化以分离为基质和酶，但是预计本发明的肽不在PP1酶的活性位点进行分离(irreversible)，因此表现出强抑制作用。
即，本发明的“蛋白磷酸酶1抑制肽”为设计成包含模拟经磷酸化的受磷蛋白(PLB)的连接环的肽序列的肽，与包含经磷酸化的丝氨酸残基的肽相比，可更强地抑制PP1的作用。
在本发明中显示，作为蛋白磷酸酶1抑制肽的“ψPLB-SE”抑制作为血管增生性疾病的再狭窄的新生内膜生长，还可缓解肺动脉高血压的症状。ψPLB-SE通过各自的特征性机制来解决被报道为疾病的表型的血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和血管内皮细胞(VECs)的功能障碍。
首先，在血管平滑肌细胞(VSMCs)中抑制SERCA2a的降解，从而表明ψPLB-SE减弱了大鼠颈动脉的新生内膜生长。在病理条件下，所增加的细胞质Ca2+水平依次诱导用于负责使细胞质Ca2+水平增加的SERCA2a的降解的钙蛋白酶(calpain)的激活。根据本发明，ψPLB-SE抑制所谓的Ca2+水平的增加和SERCA2a水平的减少的恶性循环。
通过血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖来大大促进受损的血管系统中的新生内膜生长(Neointimal growth)，这与SERCA2a(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase)的活性相关。SERCA2a水平的基因转移介质修复使新生内膜的生长和血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖减少。本发明人已经在之先前研究中报道了蛋白磷酸酶1，即，靶向ψPLB-SE的肽使心肌细胞中的SERCA2a活性正常化。在本发明中发现，ψPLB-SE使球囊损伤(balloon-injured)的大鼠颈动脉的新生内膜增殖减少，并且发现了在高血清培养基(合成条件)中培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖及迁移。
与此同时，在合成条件下，ΨPLB-SE在受损的颈动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)中抑制了SERCA2a的降解。钙蛋白酶抑制剂MDL28170也在合成条件下减弱了SERCA2a降解及VSMC增殖，这表明钙蛋白酶降解SERCA2a。Ca2+离子载体(ionophore)A23187在血管平滑肌细胞(VSMCs)中诱导了SERCA2a降解，这被ψPLB-SE或MDL28170阻断。并且，ΨPLB-SE在血管平滑肌细胞(VSMCs)中使因A23187或合成刺激而增加的细胞质Ca2+水平正常化。综上所述，这些数据表明ψPLB-SE激活SERCA2a，从而调节异常性Ca2+，其还在血管平滑肌细胞(VSMCs)中保护SERCA2a免受钙蛋白酶依赖性降解。在肺动脉高血压中血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖也可用相同的机制调节，这可通过确认受磷蛋白的第16个丝氨酸残基的磷酸化并测定SERCA2a的活性来证实，而通过细胞增殖的代表性蛋白质的表达和增殖分析实验来确认了实际上抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖的情况。
并且，除此之外，表明了使血管内皮细胞(VECs)的内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)的活性增加，从而恢复血管内皮细胞(VECs)的功能障碍并缓解肺动脉高血压的新机制。已经证明由野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高血压大鼠和小鼠中ψPLB-SE可缓解作为特征性表型的血管肥厚、血管外膜组织的纤维化或炎症反应。并且，确认了在肺动脉高血压动物模型肺组织中，ψPLB-SE的处理不仅恢复了内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化，而且还恢复了与炎症反应的机制相关的骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)的表达及真核细胞翻译起始因子(eIF2α)的磷酸化水平。
为了查明在血管内皮细胞(VECs)中新机制，确认了蛋白磷酸酶1(PP1)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，与作为已知的高级物质的Akt之间的相互作用，并通过其确认了蛋白磷酸酶1(PP1)与Akt之间直接相互作用而不是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，并确认了通过ψPLB-SE来抑制作用。并且，为了确认是否可通过实际因ψPLB-SE的处理而增加的Akt和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化抑制蛋白磷酸酶1(PP1)来调节，处理作为Akt的高级磷酸化酶的PI3K的抑制剂的LY294002以消除磷酸化并处理ψPLB-SE来确认了Akt-eNOS的磷酸化增加。并且，确认了处理作为Akt抑制剂的抑制剂IV(Inhibitor IV)之后，因ψPLB-SE引起的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化增加效果得以消除。这种因ψPLB-SE引起的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性增加还可通过用野百合碱(MCT)诱导肺动脉高血压的动物组织实验来进行确认。
此外，进行了确认细胞穿透肽(CPP)的细胞穿透功效的实验，通过细胞穿透肽(CPP)的比较实验，证实了多种形态的细胞穿透肽可对ψPLB-SE获得相同效果。本发明人通过这些效果得到了ψPLB-SE可形成血管增生性疾病的治疗策略的基础的结论。
本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)为包含序列表第一序列的氨基酸序列中的第14个至第22个氨基酸序列的模拟(mimic)肽，作为上述序列表第一序列的氨基酸序列中的第16个氨基酸残基的经磷酸化的丝氨酸残基(phosphorylated Serine residue)由被谷氨酸(glutamic acid，Glu)或天冬氨酸(aspartic acid，Asp)取代的氨基酸序列组成。更明确地，在本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽中，上述第16个氨基酸序列并非丝氨酸(serine)或经磷酸化的丝氨酸残基(phosphorylated serine)。
根据本发明一实例，上述蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase1inhibitory peptides)可选自由序列表第二序列至第六序列的氨基酸序列组成的组中。根据本发明的另一实例，上述蛋白磷酸酶1抑制肽由序列表第二序列或第三序列的氨基酸序列组成。韩国授权专利第10-1516791号中对于上述序列表第二序列至第六序列的蛋白磷酸酶1抑制肽具有详细记载。
在本发明的实施例中所使用的蛋白磷酸酶1抑制肽可通过在“Arg-Ala-Ser(P)-Glu-Ile-Glu-Met-Pro-Gln”序列的肽中将经磷酸化的丝氨酸残基被谷氨酸(glutamicacid，Glu)或天冬氨酸(aspartic acid，Asp)取代来制备。
上述序列表第二序列至第六序列如下。由下划线表示的部分为被谷氨酸或天冬氨酸取代的氨基酸位点：
序列表第二序列：Arg-Ala-Glu-Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln。
序列表4序列：Arg-Ala-Asp-Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln。
序列表4序列：Ala-Glu-Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln。
序列表5序列：Arg-Ala-Glu-Thr-Ile-Glu-Met。
序列表第六序列：Arg-Ala-Glu-Thr-Ile-Glu。
根据本发明，本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽可由下式I表示的氨基酸序列组成：
X1-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4(I)
上述X1表示0～20个氨基酸残基，上述X2表示Glu或Asp，上述X3表示Thr、Glu或Asp，上述X4表示0-30个的氨基酸残基。
根据本发明一实例，本发明的通式I的X1为0-20个、0-10个、0-3个或0～1个氨基酸残基。根据本发明一实例，本发明的通式I的X4为0～30个、0～20个、0～10个或0～3个氨基酸残基。
根据本发明的再一实例，上述X1为0～20个氨基酸残基，上述X4为0～20个氨基酸残基。
根据本发明的另一实例，上述X1为0～1个氨基酸残基，上述X4为0～3个氨基酸残基。根据本发明的特定实例，上述X1为Arg。根据本发明的另一特定实例，上述X4为Met、Met-Pro或Met-Pro-Gln。
由上述通式I表示的氨基酸序列可选自由序列表第二序列至第六序列的氨基酸序列组成的组中。
另一方面，在上述通式I中，X1及X4不包含可阻止本发明的肽存在于细胞质中的氨基酸结构域(例如，跨膜结构域(membrane-spanning domain)和/或细胞器-靶向结构域(organelle-targeting domain))。
本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)可包含具有一个以上具有改性的侧链的氨基酸的肽。侧链改性的例包含如还原性烷基化反应、利用甲酰亚氨酸甲酯的酰胺化、利用乙酸酐的烷基化、利用氰酸的氨基的甲氨酰化、利用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基酸的三硝基苄基化、利用琥珀酸酐的氨基的烷基化、吡哆醛-5-磷酸处理后用NaBH4还原的吡哆醛化等的氨基的改性。
精氨酸残基的胍基可通过如2，3-丁二酮、苯基乙二醛、乙二醛等的试剂形成杂环缩合物来改姓。羧基可通过O-酰基异脲的形成来激活碳二亚胺，接着衍生化，例如，通过酰胺化进行衍生化来改性。
巯基可通过碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；半胱氨酸过氧酸氧化；通过其他硫醇化合物混合的二硫化物的形成；通过马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代马来酰亚胺的反应；4苯甲酸氯代汞、4-氯代二苯基磺酸、苯基环丙基氯、2-氯-4-硝基苯酚汞及利用其他汞的汞衍生物的形成；碱性pH中通过氰酸进行的氨基甲酰化等方法来改性。半胱氨酸残基的任何改性不应对形成肽所需的二硫键产生影响。并且，半胱氨酸的巯基可以被硒等价替代物取代，由此可以在肽中的一个以上的二硫键位点处形成二硒键。
色氨酸残基可通过例如，N--溴代琥珀酰亚胺氧化或2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤烷基化吲哚来进行改性。另一方面，酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基松香衍生物来改性。
组氨酸残基的咪唑环的改性可通过碘乙酸衍生物的烷基化或通过焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化作用来进行。
脯氨酸残基可通过例如，4-位点中的硅氢化来得以改性。
本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)使其的氨基酸残基改性，从而进一步提高稳定性。例如，本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)的氨基酸可包含至少一种乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂基或聚乙二醇(PEG)。
根据本发明一实例，本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase1inhibitory peptides)可与乙酰基的保护基相结合。
在本文中的术语“稳定性”不仅指体内稳定性，还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述的保护基具有保护本发明的肽免受在体内的蛋白质裂解酶的攻击。
根据本发明，本发明中可利用的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase1inhibitory peptides)的氨基酸序列被解释为包括与本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽序列实质上具有同一性的肽序列。本文的术语“实质上同一性”是指尽可能对应地比对两个氨基酸序列，利用本领域中常规使用的演算法或视觉检查，如BLAST、GAP或BESTFIT来分析所比对的序列时，至少共享约60％、70％、80％、85％、90％或95％的列同源性。用于序列比较的比对方法为本领域公知的方法。对于比对的多种方法及演算法公开在Smith andWaterman.(1981)Adv.Appl.Math.2；482；Needleman and Wunsch.(1970)J Mol Bio 48：443；Pearson and Lipman.(1988)Methods Mol Biol 24：307-31；Higgins and Sharp.(1988)Gene 73：237-44；Higgins and Sharp.(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet et al.(1988)Nuc Acids Res 16：10881-90；Huang et al.(1992)Comp Appl BioSci 8：155-65and Pearson et al.(1994)Meth Mol Biol 24：307-31。
根据本发明，上述蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitorypeptides)还可与细胞穿透肽(cell penetrating peptide，CPP)相结合。上述细胞穿透肽可与蛋白磷酸酶1抑制肽的N-末端和/或C-末端相结合。
为了将本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitorypeptides)递送到细胞内，上述蛋白磷酸酶1抑制肽需要包含细胞穿透肽或可执行与其相似的功能的运输工具。本文的术语“细胞膜穿透肽”为将特定肽运输到细胞内所必需的肽，并且通常可由10-50个或以上的氨基酸序列组成。
上述细胞膜穿透肽为具有其本身可通过磷脂双层膜的细胞膜的氨基酸序列的肽，并且包含例如，dNP2、Tat-衍生肽、信号肽(例如，细胞穿透肽)、富含精氨酸的肽、转运子或两亲性肽载体等，但不限定于此(Morris，M.C.et al.(2001)Nature Biotechnol.19：1173-1176；Dupont AJ.and Prochiantz A.(2002)CRC Handbook on Cell PenetratingPeptides,Langel,Editor,CRC Press；Chaloin,L.et al.(1997)Biochemistry 36(37)：11179-87；及Lundberg P and Langel U.(2003)J.Mol.Recognit.16(5)：227-233)。并且，除了如上所述的天然序列之外，还已知包含逆反转肽(retroinverso)及D-异构肽的、具有细胞膜穿透性质的多种触足(antennapedia)-基础肽[Brugidou J.et al.(1995)BiochemBiophys Res Commun.214(2)；685-93；Derossi D et al.(1998)Trends Cell Biol.8：84-87]。
根据本发明一实例，本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase1inhibitory peptides)可通过连接肽与细胞穿透肽相连接。上述连接肽可由1个至50个氨基酸形成，并且可由4至20个或4至15个氨基酸形成。并且，上述连接肽可由甘氨酸(glycine，G)、丝氨酸(serine，S)、丙氨酸(alanine，A)或其组合形成。根据本发明一实例，上述连接肽的序列可由(G)n的氨基酸序列形成(但是，上述n及整数1至20)。在本发明的再一实例，上述连接肽可由(G)3至(G)10的氨基酸形成。根据本发明的另一实例，上述连接肽可由(G)3至(G)5的氨基酸形成。根据本发明的特定实例，上述连接肽可由(G)3的氨基酸形成。
在本文中，术语“血管疾病(vascular diseases)”包含心血管疾病(cardiovascular diseases)、肺血管疾病(pulmonary vascular diseases)、脑血管疾病(cerebral vascular diseases)、外周血管疾病(peripheral vascular diseases)、动脉硬化(arteriosclerosis)、血管狭窄(vascular stenosis)或高血压(hypertension)，但不限定于此。
在本文中，术语“高血压(hypertension)”是指多种形态、诊断诊断、水平或阶段(stage)的高血压。根据本发明一实例，上述高血压为肺动脉高压(pulmonaryhypertension)。上述肺动脉高压包含肺动脉高血压(pulmonary arterial hypertension)及肺静脉高压(pulmonary venous hypertension)等，但不限定于此。根据本发明的特定实例，上述高血压为肺动脉高血压。
另一方面，上述高血压(hypertension)可包含高血压性血管疾病(hypertensivevascular disease)、高血压性肺病(hypertensive pulmonary disease)、高血压性脑病(hypertensive encephalopathy)、高血压性心脏病(hypertensive heart disease)、高血压性肾硬化(hypertensive nephrosclerosis)或高血压性视网膜炎(hypertensiveretinitis)等。
在本文中，血管狭窄包含心血管狭窄(cardiovascular stenosis)、颈动脉狭窄(carotid artery stenosis)、脑血管狭窄(cerebral vascular stenosis)、肺动脉狭窄(pulmonary stenosis)、肾动脉狭窄(renal artery stenosis)、股动脉狭窄(femoralartery stenosis)、下肢动脉狭窄(lower limb artery stenosis)及血管再狭窄(vascular restenosis)，但不限定于此。上述血管再狭窄可通过血管手术(vascularsurgery)或血管成形术(angioplasty)发生。
在本文中，术语“血管增生性疾病”为因血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cells，VSMC)的异常性增殖而引起的疾病。血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cells，VSMC)的异常性增殖为如动脉粥样硬化或大动脉瓣膜再狭窄等的各种血管增生性疾病的根本原因。对此，在本发明中利用了通过抑制SERCA2a的降解来上调SERCA2a活性的方法来作为用于抑制血管平滑肌细胞的增殖的机制，具体而言，利用了蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides；PP1inhibitory peptides)。上述蛋白磷酸酶1抑制肽强烈抑制受磷蛋白(PLB)的蛋白磷酸酶1(PP1)-介导的去磷酸化。
在本发明中，血管增生性疾病具体为因具有合成表型(synthetic phenotype)的VSMC的异常性增殖而引起的疾病。根据本发明一实例，在10％胎牛血清(FBS)的高浓度血清培养基(合成条件，synthetic conditions)中培养的大鼠大动脉平滑肌细胞(rat aorticsmooth muscle cells，RASMC)表现出合成表型(synthetic phenotype)。根据本发明的另一实例，在合成条件下，大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)中的SERCA2a水平降低(合成表型的获取)，该SERCA2a降低通过本发明的蛋白磷酸酶1抑制肽(例如，ψPLB-SE)来重新完全抑制(图2b)。
本发明的药物组合物可进行口服(orally)或胃肠外给药(parentally)，在胃肠外给药的情况下，可通过血管内注射、皮下注射、肌肉注射、腹部注射、透皮给药、鼻腔给药/吸入或气道吸入(airway inhalation)进行给药。
通过吸入(inhalation)的药物递送为通过鼻腔或气道经过肺粘膜直接向肺细胞递送药物的非侵入性(non-invasive)方法之一，尤其，在肺疾病的广泛治疗中，可有利利用通过气溶胶(或喷雾)递送的核酸或肽递送。这是因为肺的解剖结构及位置允许即时且非侵入性的接近，既不影响其他器官或可受到肽递送系统的局部适用。因此，作为本发明的治疗组合物，通过气溶胶方式向肺递送肺疾病，尤其肺血管疾病(pulmonary vasculardiseases)相关的(i)结合核酸的核酸递送复合物或(ii)担持有肽的载体(carrier)或粉末粒子时，可预期对于上述疾病的预防或治疗效果。对于吸入给药用剂型可制备成核酸递送复合物或肽递送载体具有纳米粒子的大小。
作为一例，为了制备包含核酸递送复合物有效成分的气溶胶形态的用于呼吸道给药的药物制剂，(i)与共聚物相结合以便上述核酸结构的稳定或(ii)将上述核酸序列插入病毒性/非病毒性病载体中，从而可制备核酸递送复合物。
作为另一例，为了制备包含肽有效成分的气溶胶形态的用于呼吸道给药的药物制剂，可通过将上述肽有效成分收集在稳定的载体(carrier)或赋形剂(vehicle)内并与药学上可接受的水性或非水性液体的悬浮液或溶液或水包油或油包水乳液混合来制备。或者，可制备成含有肽有效成分的透气干燥粒子的固体微粒组合物。含有上述肽有效成分的固体微粒组合物可选择性地包含分散剂以促进气溶胶的形成。
当本发明的组合物用于气溶胶或喷雾形态的鼻腔/呼吸道给药的药物制剂时，可制备成包含呼吸道内或鼻腔吸入/给药装置的试剂盒。该试剂盒可包括气溶胶或喷雾发生器及吸入器。上述吸入器可包括喷雾器(nebulizer)或吹入器(insufflator)。
本文的术语“药物有效量”是指向受试者施用的对血管疾病的治疗充分的量。
本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体在制剂时通常使用，并包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、山梨糖醇、淀粉、金合欢橡胶、磷酸钙、海藻酸钠、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限定于此。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂。适当的药学上可接受的载体及制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences(19thed.，1995)中详细记载。
本发明的药物组合物的适当剂量根据如制剂化方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、反应感应性等多个因素而不同，通常熟练的医生可容易地确定及处方对所需的治疗或预防有效的剂量。根据本发明的优选实例，本发明的药物组合物的一天剂量为0.001-10000mg/kg。
可根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易地实施的方法，利用药学上可接受的载体和/或赋形剂进行制剂化，以单位容量形态制备或内入大容量容器中制备本发明的药物组合物。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或提取剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定化剂。例如，本发明的治疗组合物可将蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitory peptides)或表达其的核酸递送复合物制剂化为吸入给药用剂型(气溶胶剂型)以通过气溶胶递送递送至靶向位点。
根据本发明的再一方案，本发明为用于治疗血管疾病(vascular diseases)的用途的组合物，并提供包含(a)蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitorypeptides)的药物有效量以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的另一方案，本发明提供包含蛋白磷酸酶1抑制肽(proteinphosphatase 1inhibitory peptides)的用于缓解或改善血管疾病(vascular diseases)的食品组合物。
本发明的食品组合物利用与上述的本发明的血管疾病治疗用药物组合物相同的有效成分，为了避免本文的复杂性，其两者之间相同的内容省略其说明。
根据本发明的还一方案，本发明提供包括将包含(a)蛋白磷酸酶1抑制肽(proteinphosphatase 1inhibitory peptides)的药物有效量以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物向受试者(subject)进行给药的步骤的血管疾病(vascular diseases)的治疗方法。
本发明的血管疾病治疗方法为利用上述的本发明的血管疾病治疗用药物组合物，为了避免本文的复杂性，其两者之间相同的内容省略其说明。
在本文中，术语“给药”是指以任意适当的方法向患者提供规定的物质，本发明的药物组合物的给药途径为可通过可到达目的组织的通常的所有途径进行口服或胃肠外给药。并且，本发明的组合物还可利用能够将有效成分递送至靶向细胞的任意装置(例如，纳米粒子喷雾器)进行给药。
在本文中，术语“受试者(subject)”虽然不做特别限定，但是包含例如，人类、猴子、牛马羊猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、鼠、兔子或豚鼠，优选地，为哺乳类，更优选地，为人类。
发明的效果
本发明的特征及要点总结如下：
(a)本发明涉及包含蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase 1inhibitorypeptides)的血管疾病(vascular diseases)治疗用组合物。
(b)本发明人制备了包含序列表第一序列(受磷蛋白)的氨基酸序列中的第14个至第22个氨基酸序列的模拟(mimic)肽(ψPLB-SE)，ψPLB-SE靶向蛋白质去磷酸化酶1(proteinphosphatase 1，PP1)，从而证实了再合成条件(synthetic condition)下的VSMC中均修复SERCA2a的水平和活性。
(c)并且，使血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VECs)内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)的活性增加，从而发现了修复血管内皮细胞(VECs)的功能障碍并缓解肺动脉高血压的新机制。
(d)由此，ψPLB-SE可成为用于治疗血管疾病的治疗策略的基础。
附图说明
图1a-1c：在大鼠颈动脉中诱导了导管诱导球囊损伤。受损的位点用5μl的ψPLB-SE或对照(Con)肽处理了30分钟。图(1a)，切除颈动脉并用苏木精和曙红染色(上部板)，治疗10天后，利用对α-SMA(中间板)及增殖细胞核抗原(PCNA)(下部板)的抗体进行了免疫染色。计算了内膜/培养基比率(n＝8)。比例尺，50μm。图(1b)，将从胸部大动脉(thoracic aorta)分离的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在添加有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养5天，并诱导了收缩性表型(contractile phenotype)之后，在添加有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养24小时，在具有3μM的ψPLB-SE或对照肽的条件下诱导了合成表型(synthetic phenotype)。免疫染色利用对增殖细胞核抗原(PCNA)的抗体(红色)进行。核利用了赫斯特染色(蓝色)。表示了代表合并图像。比例尺，50μm。图(1c)，利用细胞生存能力分析试剂盒对细胞增殖进行了定量。
图2a-2d：图(2a)，切割颈动脉并肽处理10天之后利用对SERCA2a或SERCA2b(红色)及α-SMA(绿色)的抗体进行了免疫染色。表示了合并图像(下方)。a，外膜(adventitia)；ec，内皮细胞层(endothelial cell layer)；m，内层(medial layer)；ni，新生内膜层(neointimal layer)。比例尺，50μm。图(2b)，使从胸部大动脉分离的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在添加有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中收缩5天来诱导收缩性表型(contractile phenotype)之后，在具有3μM的ψPLB-SE或对照肽的条件下，在添加有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养5天以诱导了合成表型。利用对SERCA2a或SERCA2b(绿色)及增殖细胞核抗原(PCNA)(红色)的抗体进行了免疫染色。核利用了赫斯特染色(蓝色)。表示了表示了代表合并图像。比例尺，50μm。图(2c)，细胞提取物的蛋白质印迹分析。图(2d)，利用ψPLB-SE或对照肽进行处理的胸部大动脉的体外(ex vivo)培养。对组织提取物进行了蛋白质印迹。数据以平均±标准偏差表示(n＝3-4；*，P<0.05)。
图3a-3b：图(3a)，在以与图2b中所说明的相同条件下，大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)处理了钙蛋白酶抑制剂MDL28170或二甲基亚砜(DMSO)。利用对SERCA2a或SERCA2b(绿色)及增殖细胞核抗原(PCNA)(红色)的抗体进行了免疫染色。核利用了赫斯特染色(蓝色)。表示了代表合并图像。比例尺，50μm。图(3b)，细胞提取物的蛋白质印迹分析。数据以平均±标准偏差表示(n＝3-4；*，P<0.05)。
图4a-4d：图(4a-4c)，利用3μM的ψPLB-SE和15μM的MDL28170预处理人冠状动脉平滑肌细胞(HCSMC)1小时之后，利用50μM的A23187处理了2小时。图(4a)，利用对SERCA2a及SERCA2b(绿色)的抗体进行了免疫染色。核利用了赫斯特染色(蓝色)。表示了代表合并图像。比例尺，50μm。图(4b)，利用细胞提取物进行了蛋白质印迹分析。数据以平均±标准偏差表示(n＝3-4；*，P<0.05)。图(4c)，基准Ca2+浓度利用IonOptix钙成像系统测定。图(4d)，在与图1B相同的条件下，在大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)中处理了ψPLB-SE或对照肽。基准(baseline)Ca2+浓度利用IonOptix钙成像系统(*，P<0.05)进行了测定。
图5a-5f：图(5a-5b)，在收缩性或合成培养基中培养大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)之后进行了刮擦(scratching)。添加对照组或ψPLB-SE肽并培养了24小时。细胞迁移的相对距离利用相差显微镜进行了测定。红色线表示大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)培养物的边界。表示了代表图像(左侧)及细胞迁移距离(右侧)(n＝4)。比例尺，50μm。图(5c)，在收缩性培养基中培养了大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)，在对照组或ψPLB-SE肽3μM的存在下添加PDGF-BB来诱导了合成表型。免疫染色利用对增殖细胞核抗原(PCNA)的抗体(红色)来进行。核利用了赫斯特染色(蓝色)。表示了代表合并图像。比例尺，50μm。图(5d)，利用细胞生存能力分析试剂盒对细胞增殖进行了定量。图(5e-5f)，在与图5c中所说明的条件相同条件下，大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)进行了刮擦分析。表示代表图像(左侧)和细胞迁移距离(右侧)。比例尺，50μm。
图6a-6b：在存在对照组或ψPLB-SE肽3μM条件下，大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在收缩性或合成培养基中进行了培养。为了防止从头(de novo)合成蛋白质，将环己酰亚胺(Cycloheximide)以5μg/ml的最终浓度添加至培养基中。培养0天、3天及5天之后，获取细胞并对蛋白质提取物进行了蛋白质印迹。数据以平均±标准偏差表示(n＝3-4；*，P<0.05)。
图7：ψPLB-SE使在VSMC中受磷蛋白(PLB)去磷酸化减少。利用图2c所示的蛋白质试样进行了蛋白质印迹。利用了受磷蛋白(PLB)或磷酸化受磷蛋白(PLB)抗体。数据以平均±标准偏差表示(n＝3-4；*，P<0.05)。
图8a-8b：向大鼠注入60mg/kg的野百合碱(MCT)，以1周间隔将肽(ψPLB-SE)向呼吸道内吸入给药4次以确认治疗效果的实验。以胸部开放状态对第4周时的大鼠进行右心导管检查以测定了收缩期末右心室血压(RVESP)、左心室血压(LVESP)、松弛期末右心室血压(RVEDP)、左心室血压(LVEDP)以及心输出量(CO)。(Sham n＝3，MCT n＝5，ψPLB-SE n＝6；*，P<0.05vs sham,)。
图9a-9b：在与图8a-8b相同的条件下，图(9a)，通过苏木精和曙红染色确认了肺动脉的肥厚程度，图(9b)，利用phospho-eNOS和total eNOS以及GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。
图10a-10b：在与图8a-8b相同的条件下，图(10a)，通过Masson-Trichrome染色确认了以确认肺动脉外膜的纤维化程度，图(10b)，利用Vimentin、αSMA、GAPDH抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。
图11a-11d：在与图8a-8b相同的条件下，图(11a)，利用骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)、phospho-eIF2α、eIF2a、GAPDH抗体通过蛋白质印迹对蛋白质表达进行了定量分析，图(11b-11d)，在肺组织中混合细胞因子并利用试剂盒啦测定了炎症反应性细胞因子的含量程度。(Sham n＝3，MCT n＝4，ψPLB-SE n＝6；*，P<0.05vs sham；#，P<0.05vs MCT)
图12a-12b：向小鼠注入600mg/kg的野百合碱(MCT)，从第2周开始以1周间隔将肽(ψPLB-SE)向呼吸道内吸入给药4次并确认治疗效果的实验。图(12a)，通过苏木精和曙红染色，确认了肺动脉的肥厚程度，图(12b)，利用phospho-eNOS和total eNOS、SERCA2a以及GAPDH的抗体，通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。
图13a-13c：在与图12A-12B相同的条件下，图(13a)，通过Masson-Trichrome确认染色肺动脉外膜的纤维化程度，图(13b)，通过蛋白质印迹定量分析了Vimentin、αSMA、GAPDH的蛋白质表达。并且，图(13c)，通过实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)定量分析了TGF-β1、Collagen1、αSMA的信使RNA表达程度。
图14a-14b：在与图12A-12B相同的条件下，图(14a)，通过苏木精和曙红染色确认了如肺组织整体的单核细胞浸润等的炎症反应程度，图(14b)，通过实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)定量分析了TNF-α、IL-1β、F4/80、MCP-1的信使RNA表达程度。(sham，MCT，ψPLB-SE，n＝4；*，P<0.05vs sham；#，P<0.05vs MCT)
图15a-15b：在与图12a-12b相同的条件下，肺组织中混合细胞因子利用试剂盒测定了炎症反应性细胞因子的含量程度。(Sham n＝3，MCT n＝4，ψPLB-SE n＝6；*，P<0.05vssham；#，P<0.05vs MCT)
图16a-16c：图(16a-16b)，用3μM的ψPLB-SE处理PAEC1小时，利用Phospho-eNOS(ser1177)、total eNOS、phospho-Akt(Ser473，Thr308)、total Akt以及GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。图(16c)，通过利用肺组织的溶解物蛋白磷酸酶1(PP1)抗体的免疫沉淀法，并用各个抗体确认了根据是否处理ψPLB-SE的蛋白磷酸酶1(PP1)和eNOS、Akt的相互作用。
图17a-17c：图(17a)，利用50μM的作为PI3K抑制剂的LY294002处理PAEC24小时，并用3μM的ψPLB-SE处理了1小时。利用Phospho-eNOS(ser1177)、total eNOS、phospho-Akt(Ser473，Thr308)、total Akt以及GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。图(17b)，用10μM的作为Akt抑制剂的抑制剂IV(inhibitor IV)处理PAEC2小时，用3μM的ψPLB-SE处理了1小时。利用total eNOS以及GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。图(17c)，用100nM的作为蛋白磷酸酶1(PP1)抑制剂的OA处理PAEC24小时，用3μM的ψPLB-SE处理了1小时。利用Phospho-eNOS(ser1177)、total eNOS、phospho-Akt(ser473，thr308)、total Akt以及GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。
图18a-18b.：在包含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中使PASMC诱导收缩性表型(contractile phenotype)3天之后，在具有3μM的ψPLB-SE条件下，在添加有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养3天以诱导了合成表型(synthetic phenotype)。图(18a)，利用Phospho-PLB(ser16)、totalPLB以及GAPDH抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。数据以±标准偏差表示。(n＝3～4；*，P<0.05vs contractile；#，P<0.05vs Synthetic-con)图(18b)，通过钙重吸收实验测定了SERCA2a的活性。
图19a-19b：在包含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中使PASMCs诱导收缩性表型(contractile phenotype)3天之后，用3μM的dNP2处理了24小时。图(19a)，处理12小时后及24小时后利用增殖细胞核抗原(PCNA)和GAPDH的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。图(19b)，利用EZ细胞活性测定试剂盒(EZ-CyToxCell Viability Assay Kit)进行了细胞增殖分析。
图20a-20b：图(20a)，在PAECs中处理了三种形态(dNP2、linear TAT、cyclic TAT)的3μM的ψPLB-SE1小时，并利用phospho-eNOS、eNOS和phospho-Akt、Akt的抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达。图(20b)，在与图18相同条件下，在PASMC中三种形态(dNP2、linear TAT、cyclic TAT)的3μM的ψPLB-SE存在条件下，利用Phospho-PLB(ser16)、totalPLB以及GAPDH抗体通过蛋白质印迹定量分析了蛋白质表达(liTAT＝linear TAT、cTAT＝cyclic TAT)。
具体实施方式
以下，通过实施例来对本发明进行详细说明。这些实施例仅用于具体说明本发明，根据本发明的目的及要旨，本发明的范围并不受实施例的限定，这对本领域中的普通技术人员而言是显而易见的。
实施例
实验方法
1.伦理声明(Ethics statement)
利用斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠及C57BL/6小鼠的动物实验经首尔大学医院和梨花女子大学以及光州科学技术院动物管理及伦理委员会(IACUC)的批准，根据美国国家保健院(国家学院)发行的实验室动物的管理及使用指南(Press，8th Edition，2011)进行。利用美国查尔斯河(Charles River)的8周龄雄性斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠进行了所有实验。环境条件控制在25±2℃的温度，50±5％的相对湿度及12：12小时的明暗循环。
2.化学物质(Chemicals)及蛋白磷酸酶1抑制肽(protein phosphatase1inhibitory peptides)合成
ΨPLB-SE(RAE16TIEMPQ；序列表第二序列)来源于围绕Ser16磷酸化位点的受磷蛋白(PLB)蛋白质序列。为了易于细胞内流入，使上述肽与细胞穿透性肽dNP2(KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK；序列表第21序列)或TAT(YGRKKRRQRRR；序列表第22序列)相缀合。本发明中所使用的肽为ΨPLB-SE(RAETIEMPQ；序列表第二序列)及对照组肽(RASTIEMPQ；序列表第23序列)。ΨPLB-SE及细胞穿透肽借助连接肽(GGG；序列表第24序列)来连接。将肽(纯度95％以上，AnyGen，光州，韩国)3mM(细胞实验)或2.5mg/ml(大鼠)，500μg/ml(小鼠)储存浓度中重悬于双蒸水或生理盐水中。在大鼠的情况下，处理了1mg/kg的肽，在小鼠的情况下，处理了2mg/kg的肽，大鼠动脉平滑肌细胞(Rat Aortic Smooth MuscleCells，RASMCs)和人冠状动脉平滑肌细胞(Human Coronary Smooth Muscle Cells，HCSMCs)、肺动脉内皮细胞(Pulmonary Arterial Endothelial Cells，PAECs)和肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells，PASMCs)用3μM的肽最终浓度处理了1小时。购入了用于肺动脉内皮细胞(Pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)实验的作为PI3K抑制剂的LY294002(美国密理博(Millipore)公司出品，美国)，作为Akt抑制剂的抑制剂IV(Inhibitor IV，Calbiochem，美国)，作为蛋白磷酸酶1(PP1)抑制剂的冈田酸(okadaic acid，美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品，美国)。野百合碱(monocrotaline)水溶液为将野百合碱粉末(美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品，美国)溶于少量1M盐酸溶液(HCL)中之后用无菌蒸馏水稀释，并添加氢氧化钠(NaOH)调节至pH7.35并进行了稀释。在既定的实验期限内在与对照组相同条件下饲养并观察。并且，钙离子载体A23187、钙蛋白酶I及II抑制剂MDL28170、环己酰亚胺购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)。
3.大鼠颈动脉的球囊诱导损伤(Balloon-induced injury)
利用2F球囊栓子切除导管(2F Fogarty balloon embolectomy catheter)插入来使左颈总动脉(left common carotid artery)受损。例如，将大鼠用异氟烷气体(70％N2O/30％O2)麻醉，暴露左外颈动脉(left external carotid artery)并使分支(branch)血管电凝(electro-coagulated)。通过横向动脉切口，将导管插入颈外动脉约1cm，并沿颈总动脉穿过导管3次以引起内皮剥离。去除导管之后，夹住穿孔区域并注入溶解于200μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的5μg的肽。反应15分钟之后，重新打开密封的颈动脉并恢复血流。除非另有说明，使大鼠恢复10天。为了组织分析而使大鼠麻醉，用含有3.7％(w/v)甲醛的肝素处理的盐水进行经心脏灌注(transcardiac perfusion)后切除了总颈动脉。将样品夹在石蜡中，用Leica RM2255旋转切片机切割石蜡块。从总颈动脉的中心获得两个连续的组织切片(厚度，4μM)，并用苏木精及曙红染色。薄层(lamina)、内弹性层(internal elasticlamina)及外弹性层(external elastic lamina)利用美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)ImageJ软件(版本1.62)来进行了测定。内膜(intimal)与内侧(medial)区域分别由从内弹性薄层区(internal elastic laminal area)除去薄层区域(laminal area)的值以及从外弹性薄层区域(external elastic laminal area)除去内弹性薄层区的值来确定。将每只大鼠两个连续切片的值取平均值。
4.免疫组织化学
在室温下，用4％(w/v)多聚甲醛固定颈动脉48小时之后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗。向石蜡中埋入样品并切割组织块之后，用过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶活性并在抗原修复缓冲液中煮沸。利用对α-SMA(美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)出品)、SERCA2a、SERCA2b(21st Century Biochemical)及增殖细胞核抗原(PCNA，英国艾博抗(Abcam)公司出品)的抗体免疫染色了样品。
5.细胞培养
大鼠动脉平滑肌细胞(Rat Aortic Smooth Muscle Cells，RASMCs)利用胶原酶(50U/mL，美国沃辛顿(Worthington)公司出品)及胰弹性蛋白酶(0.25mg/mL，美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)出品)，在37温度下通过酶反应从雄性斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠(体重，180-200g)的胸部大动脉的内层(medial layer)分离了4小时。获取细胞并重悬于含有20％(v/v)胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中。然后，在涂敷有胶原蛋白I(美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)出品)的玻璃盖板进行涂抹，并在37温度、5％(v/v)CO2及95％(v/v)大气空气下培养。人冠状动脉平滑肌细胞(HCSMCs)、人肺动脉内皮细胞(PAECs)、人肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)购自瑞士龙沙(Lonza)公司，并在含有0.5mg/mL的hEGF、5mg/mL的胰岛素、1mg/mL的hFGF、50mg/mL的庆大霉素/两性霉素-B及5％胎牛血清的EBM、SmBM(Lonza)中进行了培养。所有细胞在37温度、5％(v/v)CO2及95％(v/v)的空气中进行了培养。大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)和人冠状动脉平滑肌细胞(HCSMC)分别以1×104cells/cm2及1×105cells/cm2的密度分注以进行免疫染色及蛋白质印迹实验。在大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)和人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的细胞增殖实验的情况下，去除胎牛血清的的培养基中培养3天之后，还添加血清以诱导增殖。
6.荧光免疫染色
在室温下，用4％(w/v)多聚甲醛固定大鼠动脉平滑肌细胞(Rat Aortic SmoothMuscle Cells，RASMCs)10分钟，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗之后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)下的0.1％(v/v)Triton X-100穿透处理40分钟。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)下的3％(w/v)牛血清白蛋白(闭塞)清洗及封闭之后，处理SERCA2a(1：250)、SERCA2b(1：250)及增殖细胞核抗原(PCNA)(1：50)抗体并在试问下将细胞温育过夜。次日，将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗并将分别与Alexa Fluor 488及594相缀合的抗兔及抗小鼠IgG进行处理之后，在室温下反应1小时。用荧光淬灭剂(FluoroGuard antifade，美国伯乐(Bio-Rad)公司出品，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)处理细胞，并在荧光显微镜下观察了盖玻片。
7.细胞增殖分析
将大鼠动脉平滑肌细胞(Rat Aortic Smooth Muscle Cells，RASMCs)和肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells，PASMCs)(1×104cells/well)分注于96微孔板中并用3μM最终浓度的肽处理了24小时。细胞增殖分析利用EZ细胞活性测定试剂盒(EZ-CyTox Cell Viability Assay Kit，韩国大日(Daeil Lab Services Co.，Ltd.)公司出品)进行。
8.大动脉体外(ex vivo)器官培养
获取大鼠的胸部大动脉，斌工资啊含有20mM的HEPES、2mML的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素及100μg/mL的链霉素的RPMI-1640培养基中进行了培养。去除外膜(adventitia)，纵向切割大动脉之后，固定于树脂(resin)上。含有20％(v/v)FCS的RPMI-1640培养基中培养了组织片段7-10天以研究SERCA2a的降解。每48小时更换一次培养基。
9.蛋白质印迹
在添加有广谱蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)的最小体积的50mM的Tris-HCl、pH7.4条件下对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)进行均质化。用SDS-PAGE分离蛋白质之后，移至聚偏二氟乙烯膜(Schleicher&Schuell)。用5％(w/v)脱脂油封闭1小时并用TBST清洗之后，使膜与SERCA2a、SERCA2b(21st century biochemical)、增殖细胞核抗原(PCNA)(abcam)、GAPDH(美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)出品)、phospho-eNOS、eNOS、phospho-eIF2α、eIF2α(cell signaling)、Vimentin、α-SMA、骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)(Santa cruz)、phospho-Akt，Akt(cell signaling)、phospho-phospholamban(Merck)、Phospholamban(cell signaling)、抗体进行反应。接着，使膜与辣根过氧化物酶-缀合物二抗(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)出品，西格罗夫，宾夕法尼亚州，美国)一同反应，并利用化学发光底物(Dogen)显像。利用LAS软件扫描并定量印迹。
10.细胞内(Intracellular)Ca2+测定
37温度下15分钟，作为Ca2+-敏感指数的0.5μM的Fura2-AM(分子探针(MolecularProbes)公司出品，尤金，美国)加载到VSMC，并测定了细胞内Ca2+水平。荧光利用IonOptix钙成像系统进行了记录。通过340nm或380nm滤光器，通过使VSMC暴露于由75W卤素灯发射的光来进行了刺激。在340nm下0.5秒钟以及记录当中在380nm初始照射之后，通过光电倍增管在480nm至520nm之间检测出荧光发射。在方案结束时重复340nm激发扫描(excitationscan)，并且在两种波长下用Fura2荧光强度的比率来估计了细胞内Ca2+水平的定性变化。
11.体内细胞刮擦(scratch)分析
将从胸部大动脉(thoracic aorta)分离的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在添加有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)(收缩性)或10％(v/v)胎牛血清(FBS)(合成)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中与3μM的对照组肽(Con；序列表第23序列)或ψPLB-SE肽(序列表第二序列)进行了培养。或者将在添加有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在3μM的对照组或ψPLB-SE肽存在的条件下用10ng/ml的PDGF-BB(R&D Systems)(合成)处理。通过用无菌的200μl移液管尖端刮擦板来移除一部分的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)层的区域。培养12小时或24小时细胞之后，在1×80显微镜(日本奥林巴斯(Olympus)出品)下观察。利用MetaMorph软件测定了细胞迁移的距离。
12.SERCA2a稳定性(stability)分析
将大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)在添加有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)(收缩型)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)或在3μM的对照组或ψPLB-SE肽的存在下，在添加有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(合成)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中进行了培养。以5μg/ml的最终浓度将环己酰亚胺(Sigma)添加至培养基中。在培养0天、3天及5天之后收获细胞并对蛋白质提取物进行了蛋白质印迹。
13.肺动脉高血压动物模型
向11只250g-300g之间的斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠(多物科技出品，韩国)通过腹腔注射给药60mg/kg的野百合碱(Monocrotaline，MCT，美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品)，对照组3只给药0.9％的生理盐水。根据给药计划，与野百合碱(MCT)给药的同时，向6只对照组以一周为间隔通过呼吸道内吸入给药稀释于300μl中的ψPLB-SE肽4次。向5只的对照组给药对照组肽。最后肽给药1周后牺牲大鼠并进行了组织分析及分子生物实验。
在小鼠的情况下，向15只25g-30g的C57BL/6小鼠(多物科技出品，韩国)中一周一次处理600mg/kg的野百合碱(MCT)5次，其中向对照组8只将ψPLB-SE肽给药野百合碱(MCT)后从第15天开始以一周间隔给药4次。5只对照组中给药对照组肽。最后给药1周之后牺牲小鼠并进行了组织分析及分子生物实验。
14.用于测定肺动脉压力的大鼠右心导管检查(Right heart catheterization)
为了间接性测定肺动脉压力而进行了右心导管检查，以2008年报道在natureprotocols中的过程为基础进行。麻醉大鼠后，进行气道插管，置于恒温板(homeothermicplate，AD Instruments，Spechbach，Germany以在心脏导管插入术期间维持体温并用动物专用呼吸器(MiniVent type 845，Hugo Sachs Elektronik，March-Hugstetten，Germany)保持呼吸。打开大鼠的胸部，使高保真1.4F微压计/Mikro-Tip压力导管((high-fidelity1.4F micromanometer/Mikro-Tip Pressure catheter，Millar Instruments，Houston，TX)渗透至心贴位点以测定了收缩期和松弛期末的右心室、左心室的压力(RVESP、RVEDP、LVESP、LVEDP)。相关数值及数据通过PowerLab数据采集系统(PowerLab data acquisitionsystem，MPVS-Ultra Single Segment Foundation System，AD Instruments)及适用于Windows软件的LabChart7(LabChart 7for Windows software)收集并分析。
15.组织病理染色(Hematoxylin-Eosin，Masson-Trichrome染色法)
从动物模型取出肺组织之后，在室温下用4％(w/v)多聚甲醛固定5天后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗。将样品埋入石蜡中，将组织块以7μM的厚度切片之后，用确认血管厚度及炎症反应的方法染色苏木精-曙红(美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品)，并马森三色(Masson-Trichrome，美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品)染色后通过光学显微镜观察以确认血管周围纤维化程度。
16.细胞因子分析
获取大鼠及小鼠的肺组织，利用人促炎10丛中尺度诊断板(humanproinflammatory 10plex Meso Scale Diagnostics plates，MSD；Rockville，MD)定量分析了组织的细胞因子水平。
17.定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
利用SYBR premix Ex TaqTM(日本宝生(Takara)公司出品)进行了定量实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，并通过其分析了靶向基因的转录水平。利用Trizol(美国安比昂(ambion)公司出品)将RNA从肺组织分离并将其合成为cDNA。定量实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)条件为40个循环：94℃温度下10秒，59℃温度下30秒及72℃温度下10秒。用于实验的引物的信息如以下表1中所示。
表1
18.钙重吸收实验(Uptake assay)
肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells，PASMCs)在含有40mM的咪唑(imidazole)、10mM的NaF、1mM的EDTA、300mM的蔗糖(sucrose)、0.5mM的DTT的pH7.0的溶液中匀浆，将250μg的溶解物添加至100mM的KCl、5mM的MgCl2、5mM的NaN3、0.5M的EGTA、40mM的咪唑的pH7.0的摄取缓冲液(uptake buffer)中，含放射性同位素的pCa 6钙浓度中进行了吸收实验。处理1μM的钌红(Ruthenium red，美国西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)出品)，在37℃温度下等待3分钟之后，处理5mM的K-oxalate及Mg-ATP(美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)出品)并开始反应，以1分钟为间隔直到4分钟，将500μl的反应物用0.45μM的过滤器(美国密理博(Millipore)公司出品)过滤，并利用闪烁计数(scintillation counter，美国贝克曼库尔特(Beckman)公司出品)测定了每分钟计数cpm(count per minute)。
19.统计分析
所有数据以平均±标准偏差表示。利用StatView5.0软件(SAS Institute，Cary，NC，USA)的Bonferroni post-hoc分析来用Student's t-test或one-way ANOVA确定了统计显著性。p<0.05被视为统计性显著。
实验结果
1.ψPLB-SE抑制VSMC的细胞增殖
本发明人在先前研究中发明了缺血-再灌注损伤期间保存SERCA2a活性以提高心肌细胞收缩性的9-mer肽ψPLB-SE[Oh JG et al.(2013)J Mol Cell Cardiol 56：63-71]。在本发明中实验了上述肽是否可通过相似分子机制来抑制血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)的增殖。通过进行球囊颈动脉成形术来诱导大鼠颈动脉损伤之后，将ψPLB-SE或对照肽向损伤位点进行给药。治疗4周之后，获取动脉，用组织切片进行了苏木精及曙红染色及免疫细胞化学检验。苏木精和曙红染色结果表明用ψPLB-SE处理的动脉中的新生内膜形成(neointimal formation)比用对照肽处理的动脉更能够抑制。受到ψPLB-SE的影响的内膜层用对α-SMA(α-smooth muscle actin)和PCNA(proliferatingcell nuclear antigen)的抗体进行阳性免疫染色。这种结果表示，ψPLB-SE抑制新生内膜的生长与体内(in vivo)血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖(图1a)。
本发明人研究了对大鼠大动脉平滑肌细胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)的ψPLB-SE的效果。添加有低浓度血清(0.1％胎牛血清(FBS))的培养基中培养了大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)时，表现出收缩性表型(contractile phenotype)，但在高浓度血清(10％胎牛血清(FBS))培养基中表现出合成表型(synthetic phenotype)。因此，本发明人将高血清培养条件定义为合成。如大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)表现出明显的增殖细胞核抗原(PCNA)表达，在合成条件下，表现出活泼的细胞分裂，但这被ψPLB-SE完全阻断(图1b)。细胞增殖分析还表现出在合成条件下的大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)的所增加的细胞增殖被ψPLB-SE抑制的情况(图1c)。在合成条件下或PDGF-BB的处理时大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)的所增加的迁移活性(migratory activity)也被ψPLB-SE抑制(图5a-5f)。这些数据表明ψPLB-SE在体内合成条件下明显抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖。
2.ψPLB-SE阻断血管平滑肌细胞(VSMCs)中的SERCA2a降解。
相比于SERCA2a在增殖性血管平滑肌细胞(VSMCs)中快速降解，SERCA2b比较稳定。因基因传导引起的SERCA2a水平的修复抑制在合成条件下的血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖。因此，本发明人推断了ψPLB-SE的抗增殖效果在合成条件下可与SERCA2a水平及活性的保持相关。将从图1a中所示的实验取得的颈动脉切片用对SERCA2a、SERCA2b及α-SMA的抗体进行了免疫染色。SERCA2b蛋白质水平虽然未变，但SERCA2a水平因球囊血管形成-介导的损伤而明显减少，并且这种现象被ψPLB-SE抑制(图2a)。并且，免疫染色在合成条件下大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)中的SERCA2a水平降低，该SERCA2a降低表示因ψPLB-SE而重新完全被抑制(图2b)。并且，确认了在相同条件下，用蛋白质印迹合成条件下，在大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)抑制SERCA2a的降低(图2c)。在用环己酰亚胺阻断从头(de novo)蛋白质合成的条件下测定了大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)中的SERCA2a水平。SERCA2a的稳定性在合成条件下明显减少，ψPLB-SE处理时，几乎恢复为收缩条件下所观察的水平(图6a-6b)。准备了大鼠胸部大动脉的生物体外(ex vivo)培养。由刮擦引发损伤之后，血管平滑肌细胞(VSMCs)的SERCA2a水平降低，这表示合成表型的获取。血管平滑肌细胞(VSMCs)中的SERCA2a的损伤-依赖性降低完全被ψPLB-SE阻断(图2d)。综上所述，这些数据表示ψPLB-SE在VSMCSs中抑制SERCA2a的降解。
3.钙蛋白酶(calpain)参与血管平滑肌细胞(VSMCs)中的SERCA2a降解
细胞质Ca2+水平的增加诱导细胞质蛋白质的钙蛋白酶-介导的降解[Saido TC etal.(1994)Faseb J 8：814-822；Matsumura Y et al.(2001)J Mol Cell Cardiol 33：1133-1142]。钙蛋白酶参与血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖[Ariyoshi H et al.(1998)Arterioscler Thromb Vasc Biol 18：493-498]，因此本发明人研究了在血管平滑肌细胞(VSMCs)的SERCA2a的降解中的钙蛋白酶作用。可从免疫染色结果看出，钙蛋白酶抑制剂MDL28170在合成条件下抑制在大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)中的SERCA2a的降解(图3a)。MDL28170的保护效果还由蛋白质印迹得以确认(图3b)。这些数据表明，钙蛋白酶在合成条件下介导VSMsC中的SERCA2a的降解。因MDL28170而降低的增殖细胞核抗原(PCNA)水平表示持续性(sustained)SERCA2a水平导致血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的阻断(图3a)。
4ψPLB-SE抑制钙蛋白酶-依赖性SERCA2a降解
Ca2+离子载体A23187在人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary smooth musclecells，HCSMCs)中引起了SERCA2a的降解，但SERCA2b未降解，这表示所增加的细胞质Ca2+引发SERCA2a的降解。A23187的效果被MDL28170完全阻断，因此表示细胞质Ca2+的增加时，在血管平滑肌细胞(VSMCs)中钙蛋白酶参与SERCA2a的降解(图4a-4b)。SERCA2a的Ca2+依赖性降解也被ψPLB-SE完全阻断(图4a-4b)。因A23187导致的细胞质Ca2+的提高通过ψPLB-SE来正常化，但未因钙蛋白酶抑制剂而正常化(图4c)。并且，在合成条件下，所提高的细胞质Ca2+水平因ψPLB-SE而降低(图4d)。综上所述，这些数据表示ψPLB-SE在合成条件下使血管平滑肌细胞(VSMCs)中所提高的细胞质Ca2+水平正常化，并抑制SERB2-SE的钙蛋白酶-介导的SERCA2a降解。
5.ψPLB-SE治疗大鼠的肺动脉高血压
在本发明中还进行了上述肽是否可通过相似或新机制来确认对肺动脉高血压的治疗效果的实验。通过向大鼠注入野百合碱(monocrotaline，MCT)来诱导肺动脉高血压并将ψPLB-SE以呼吸道内吸入的方式1周给药1次且总给药4周。肺动脉高血压诱导4周之后，通过右心导管检查测定了右心室收缩期末血压(Right Ventricular End SystolicPressure)。在血压测定结果中可确认，通过野百合碱(MCT)诱导肺动脉高血压的组中右心室收缩期末血压增加(67.4±6.4vs sham＝33.7±1.7)，随着处理ψPLB-SE，对照组的水平降低(33.5±5.8)(图8a-8b)。在肺动脉高血压中特征表现的表型具有因肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞的异常增殖导致的血管壁肥厚的现象，并且具有在血管外膜增加的纤维化(Fibrosis)以及肺组织整体出现的单核细胞浸润及作为细胞因子增加的代表的炎症反应(Inflammation)等[Thompson AA et al.(2017)Trends Mol Med 23(1)：31-45；StenmarkKR et al.(2011)Compr Physiol 1(1)：141-161；Aihara K et al，(2012)Int J Vasc Med2012：596796]。为了通过组织学研究来进行确认，血压测定后，从大鼠取得的肺组织中通过苏木精和曙红染色来确认血管肥厚程度的结果，诱导肺动脉高血压的组中所表现出的血管肥厚增加随着处理ψPLB-SE而降低。(图9a)。并且，通过从肺组织取得的蛋白质定量分析，在肺动脉高血压中特征性表现出的eNOS活性减少现象随着处理ψPLB-SE而增加，这可通过eNOS磷酸化水平增加来确认。(图9b)。并且，为了确认ψPLB-SE对血管外膜纤维化所带来的影响，通过将肺组织利用马森三色(Masson-Trichrome)染色法来确认了肺部胶原沉积程度。可确认到因肺动脉高血压而增加的纤维化程度可通过ψPLB-SE减少(图10a)。并且，通过蛋白质定量分析，已知为纤维化靶向基因的Vimentin、α-SMA的表达增加通过ψPLB-SE处理而减少(图10b)。最终，为了证明ψPLB-SE的炎症反应减少效果，确认作为炎症反应机制相关蛋白质的骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)表达程度及与此相关的作为信号传导类物质的真核细胞翻译起始因子(eIF2α)的磷酸化水平的结果，确认到肺动脉高血压中所减少的表达和活性随着处理ψPLB-SE而得以恢复(图11a)。此时，测定实际细胞因子的水平的结果，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α、IL-17、IL-1β、白细胞介素6(IL-6)、TGF-β等的致炎细胞因子(proinflammatory cytokine)在肺动脉高血压中增加，并且随着处理ψPLB-SE而恢复至接近正常水平(图11b-11d)。
6.ψPLB-SE治疗小鼠的肺动脉高血压
在作为另一动物模型的小鼠模型中确认了大鼠中已确认的肽的恢复效果。通过向小鼠注入野百合碱(monocrotaline，MCT)来诱导肺动脉高血压，并从2周之后利用气道内吸入将ψPLB-SE给药1周1次且总给药4周。ψPLB-SE给药4周之后，在小鼠肺组织进行了除了测定血压之外的相同实验。首先，从小鼠取得的肺组织中，通过苏木精和曙红染色确认了血管肥厚程度。确认到了已诱导肺动脉高血压的组中所表现出的血管肥厚增加随着处理ψPLB-SE而降低(图12a)。并且，通过从肺组织取得的蛋白质定量分析，在肺动脉高血压特征表现的eNOS活性减少现象随着处理ψPLB-SE而增加，这可利用eNOS磷酸化水平增加来进行确认。确认到SERCA2a的表达程度也随着处理ψPLB-SE而增加(图12b)。接着，为了确认ψPLB-SE对血管外膜纤维化所带来的影响，将肺组织通过马森三色(Masson-Trichrome)染色法确认了胶原蛋白沉积程度。确认了因肺动脉高血压而所增加的纤维化程度通过ψPLB-SE减少(图13a)。并且，确认到通过蛋白质定量分析来周知为纤维化靶向基因的TGF-β、Collagen1、Vimentin、α-SMA的蛋白质及信使RNA表达增加通过ψPLB-SE处理而减少(图13b-13c)。最后，为了证明ψPLB-SE的炎症反应减少效果，利用苏木精和曙红染色确认肺组织内单核细胞浸润现象，测定炎症反应相关细胞因子的信使RNA水平的结果，肺动脉高血压中所增加的单核细胞浸润增加通过ψPLB-SE处理而减少(图14a)，并确认到作为炎症反应相关靶向基因的TNF-α、IL-17、IL-1β、F4/80、MCP-1的信使RNA表达水平通过ψPLB-SE的处理而减少(图14b)。最后，与大鼠相同地，在肺组织中测定炎症反应相关细胞因子的水平的结果，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α、IL-17、IL-1β、白细胞介素6(IL-6)、TGF-β等的前炎症性细胞因子(proinflammatory cytokine)在肺动脉高血压中增加，并随着处理ψPLB-SE而恢复到接近正常水平(图15a-15b)。
7.ψPLB-SE通过在肺动脉内皮细胞(PAECs)中诱导蛋白磷酸酶1(PP1)以增加eNOS的活性
因肺动脉高血压中的内皮细胞的功能障碍导致的eNOS的活性降低为众所周知的作为血管扩张剂的NO生成减少[Giaid A et al.(1995)N Engl J Med 333：214-221]。通过本发明人的组织实验确认的结果中，随着处理ψPLB-SE，eNOS的磷酸化水平增加，并进行了用于查明对其的新机制的研究。首先，在PAECs中确认因ψPLB-SE导致的eNOS的活性增加，在PAECs中处理3μM的ψPLB-SE1小时的结果，作为eNOS的活性磷酸化残基的丝氨酸1177号的磷酸化增加，作为抑制性磷酸化残基的苏氨酸495号残基的磷酸化减少。并且，确认到周知的表现出作为eNOS的高级物质的Akt[Michell BJ et al.(1999)Curr Biol 9(15)：845-848]的活性的丝氨酸473号残基与苏氨酸308号残基的磷酸化也增加了(图16a-16b)。并且，当ψPLB-SE被考虑为蛋白磷酸酶1(PP1)的抑制剂的物质时，为了确认实际上这种结果是否可通过蛋白磷酸酶1(PP1)的抑制效果来实现，向肺动脉内皮细胞(Pulmonary ArterialEndothelial Cells，PAECs)中处理作为常见的蛋白磷酸酶1(PP1)抑制剂的100nM的冈田酸(Okadaic acid，OA)并处理ψPLB-SE，确认了eNOS和Akt的磷酸化。其结果，确认到随着处理冈田酸(OA)，eNOS的Akt的磷酸化增加，随着处理肽，磷酸化进一步增加的协同效应。这种结果表示，ψPLB-SE抑制蛋白磷酸酶1(PP1)，从而调节eNOS和Akt的活性(图16c)。
为了深入确认这种蛋白磷酸酶1(PP1)和eNOS、Akt之间的相互关系，在肺组织的溶解物中利用蛋白磷酸酶1(PP1)的抗体进行了免疫沉淀法，沉淀时添加ψPLB-SE来察看对相互作用带来的影响。其结果，确认到在Akt的情况下，不同于eNOS，与蛋白磷酸酶1(PP1)直接相互作用，该作用随着处理ψPLB-SE而削弱。这种结果表示ψPLB-SE抑制蛋白磷酸酶1(PP1)与Akt的相互作用，从而抑制Akt与eNOS的去磷酸化(图17a)。这种通过蛋白磷酸酶1(PP1)与Akt之间的相互作用的抑制的eNOS的激活通过抑制Akt的高级磷酸化酶的实验来修补。将作为Akt的周知的高级磷酸化酶的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)的抑制剂的LY294002用50μM的浓度处理，从而消除Akt的磷酸化条件，处理ψPLB-SE，由此来确认因去磷酸化抑制而导致的Akt及eNOS的磷酸化增加。其结果，因PI3K的抑制而减少的eNOS及Akt的磷酸化随着处理ψPLB-SE而增加(图17b)。最终，为了判断ψPLB-SE的处理效果是否实际通过Akt来表现，将作为Akt抑制剂的抑制剂IV(Inhibitor IV)以10μM的浓度处理之后，处理ψPLB-SE来确认了对eNOS的磷酸化带来的影响。其结果，确认了因Akt抑制剂而减少的eNOS的磷酸化即使处理了ψPLB-SE也不增加(图17c)。这种结果表示ψPLB-SE的eNOS激活效果是因抑制蛋白磷酸酶1(PP1)和Akt的相互作用并阻断Akt去磷酸化且激活Akt而表现出的。
8.ψPLB-SE通过在肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中诱导蛋白磷酸酶1(PP1)调节SERCA2a的活性来抑制细胞增殖。
肺动脉高血压中内皮细胞的功能障碍导致的肺动脉平滑肌细胞(PulmonaryArterial Smooth Muscle Cells，PASMCs)的异常增殖对提高肺动脉的血压起着至关重要的作用。本发明人通过现有研究确认了ψPLB-SE通过控制从大鼠分离的血管平滑肌细胞的SERCA2a活性来抑制异常增殖。为了确认肺动脉平滑肌细胞的相同现象，与用低浓度血清(0.1％胎牛血清(FBS))诱导的收缩性表型(Contractile phenotype)相比，得到了用高浓度血清(10％胎牛血清(FBS))增殖的合成表型(Synthetic phenotype)。可确认到通过处理ψPLB-SE，合成表型中所减少的受磷蛋白(phospholamban)的丝氨酸16号残基的经磷酸化的恢复(图18a)，通过相同条件下的钙重吸收实验(Ca2+uptake assay)来测定SERCA2a的活性的结果，合成表型中所减少的SERCA2a的活性随着ψPLB-SE的处理而得以恢复(图18b)。这种结果为与本发明人的现有研究结果相一致的结果，表示ψPLB-SE在肺动脉平滑肌细胞中也可调节SERCA2a的活性。
并且，为了确认通过这种SERCA2a活性调节，实际ψPLB-SE是否可阻断肺动脉平滑肌细胞的增殖，确认了图18a-b的条件下作为细胞增殖相关代表基因的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达并及西宁了细胞增殖分析。其结果，确认到通过合成表型诱导所增加的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达随着处理ψPLB-SE而减少(图19a)，并确认了通过细胞增殖分析实验，实际是否可抑制细胞的增殖的效果(图19b)。这种结果表示ψPLB-SE可抑制作为肺动脉高血压中所表现的特征的平滑肌细胞的异常增殖。
9.ψPLB-SE的效果不受细胞穿透肽(CPP)的种类及形态的影响。
细胞穿透肽为信号肽的一种，并且为用于将蛋白质、DNA等物质向细胞内进行传递的的氨基酸组合肽。本发明人利用作为源自人类的序列细胞穿透肽(CPP)的dNP2来澄清了前治疗效果。此外，本发明人通过环化(cyclization)肽以及TAT使细胞穿透肽(CPP)的种类及形态多样化，并将其与现有基于dNP2的肽的效果进行了比较。其结果，具有线性TAT和环化TAT序列的ψPLB-SE也在血管内皮细胞(VECs)中使eNOS和Akt的磷酸化增加(图20a)，诱导合成表型的血管平滑肌细胞(VSMCs)中使PLB的磷酸化增加(图20b)。这种结果意味着ψPLB-SE的效果呈现不局限于细胞穿透肽(CPP)的种类及形态。
结果分析及进一步讨论
心血管系统疾病中的肺动脉高血压(PAH)或冠状动脉介入术之后出现的再狭窄(restenosis)均由血管内皮细胞(VECs)的物理和病理损伤引起，最终由血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的异常增殖引起病因的疾病。这种现象能够以广义的概念包含在高血压(hypertension)中。甚至在10年前还认为肺动脉高血压无特定药，虽然这几年通过诸多研究结果的积累而开发出许多治疗药物，也使患者的生活质量及生存时间延长，但与其他心血管疾病相比显示出了高发病率和死亡率。并且，未完全解决的再狭窄问题也是在无明确的治疗指南的状态喜爱进行着研究。
心血管疾病的主要原因之一为因肌内质网(SR，sarco/endoplasmic reticulum)功能的缺陷而引起的异常性细胞内Ca2+调节[Lou Q et al.(2012)Adv Exp Med Biol 740：1145-1174；Heijman J et al.(2012)Wien Med Wochenschr 162：287-291]。因肌内质网(SR)而引起的异常性Ca2+流入(uptake)主要表达和/或翻译后改性(post-translationalmodification)而可引发的SERCA2a活性的减少而引起的[Meyer M et al.(1995)Circulation 92：778-784；Kho C et al.(2011)Nature 477：601-605]。心肌细胞(cardiomyocytes)中SERCA2a水平的基因转移介质恢复在心脏衰竭的小鼠及猪心力衰竭(heart failure)模型中表现出心脏保护效果(cardioprotective)[Miyamoto MI et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97：793-798；Kawase Y et al(2008)J Am Coll Cardiol51：1112-1119；del Monte F et al.(2001)Circulation 104：1424-1429]。并且，SERCA2a基因递送抑制球囊诱导损伤模型中的血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和新生内膜的生长。因此，SERCA2a可以干预包括动脉再狭窄(arterial restenosis)及肺动脉高血压(PAH)的对于血管增生性疾病的治疗。
SERCA2a活性通过包含抑制剂-1(I-1)、蛋白磷酸酶1(PP1)及受磷蛋白(phospholamban，PLB)的一系列信号传导来调节。I-1与蛋白磷酸酶1(PP1)相结合并抑制蛋白磷酸酶1(PP1)以提高PLB磷酸化及SERCA2a活性。因此，持续性激活的I-1(I-1c)的过表达可恢复各种病理损伤中的心肌细胞中的SERCA2a活性[Nicolaou P et al.(2009)J MollCell Cardiol 47：365-371]。并且，I-1c基因递送使SERCA2a活性增加，从而抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及新生内膜形成。I-1c及SERCA2a基因递送表现出提高作用(synergistical)[Lipskaia L et al.(2014)Cirucation 129：773-785]。
在本发明人的先前研究中，发现作为9聚体肽的ψPLB-SE靶向蛋白磷酸酶1(PP1)，并抑制PLB的去磷酸化，以使心肌细胞中的SERCA2a活性增加。类似地，ψPLB-SE在大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMCs)及PASMCs中也抑制了PLB的去磷酸化(参照本文图7、图18a及图20b)。
在本发明中显示，在合成条件下提高血管平滑肌细胞(VSMCs)的SERCA2a水平，从而抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖与新生内膜形成。在先前研究中，SERCA基因递送使SERCA2a水平恢复，反之，I-1c基因递送可使SERCA2a活性恢复。因此，因ψPLB-SE导致的蛋白磷酸酶1(PP1)靶向使SERCA2a水平恢复，这也是令人惊讶的结果。为了解释这种现象，本发明中提出与SERCA2a水平及活性密切相关的模型。在合成条件下，所提高的细胞质Ca2+水平激活钙蛋白酶并可降解SERCA2a蛋白质，所降低的SERCA2a水平可进一步使细胞质Ca2+水平增加。本发明的数据表示，细胞质Ca2+的增加及SERCA2a减少的恶性循环因靶向蛋白磷酸酶1(PP1)而有可能中断。用ψPLB-SE来靶向PPI，从而增加SERCA2a活性可使细胞质Ca2+水平进一步减少，由此抑制钙蛋白酶-介导的SERCA2a降解并使SERCA2a水平增加。
另一方面，在用于调节作为血管内皮细胞的重要作用的血管松弛/紧张程度的功能当中，NO生成为血管扩张剂，并具有增殖抑制的效果。在肺动脉高血压中缩减少的NO的生成因eNOS的活性减少而导致的，并且eNOS的激活仅通过SERCA2a的细胞内钙浓度调节来说明是不充分的。eNOS的激活途径中存在钙依赖性途径和钙非依赖性途径[Zhao Y et al.(2015)J Pharmacol Sci 129(2)：83-94]。在钙非依赖性途径的情况下，通过调节高级信号传导Akt、AMPK、CamKII、PKA等eNOS的磷酸化来实现。由此产生的NO对血管平滑肌细胞(VSMCs)产生影响，从而还具有使环鸟苷一磷酸(cGMP)依赖性蛋白质磷酸化酶的活性增加并降低细胞内钙的作用[Blatter LA et al.(1994)Cell Calcium 15(2)：122-131]。迄今为止的诸多研究是基于内皮内皮祖细胞(EPC)的eNOS基因递送、环鸟苷一磷酸(cGMP)生成酶激活剂(riociguat)、环鸟苷一磷酸(cGMP)水解抑制剂(sildenafil)等从根本上使NO的产生或作用最大化的方向进行[Prior DL et al.(2016)Med J Aust 205(6)：271-276；Granton J et al(2015)Circ Res 117(7)：645-654]。在本发明中，在现有研究中证实的ψPLB-SE的靶向受磷蛋白的机制以外提出PP1-Akt-eNOS信号转导机制，从而ψPLB-SE不仅抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖，还可使掌握血管功能整体的血管内皮细胞(VECs)的功能障碍得以恢复。并且证实了ψPLB-SE通过抑制蛋白磷酸酶1(PP1)与Akt的相互作用来阻断Akt的去磷酸化，由此eNOS的活性得以调节。
并且，在本发明中的表型表现的特征中，大鼠和小鼠的肺动脉高血压模型的血管中所表现的血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖抑制效果和马森三色“Masson'strichrome”染色结果以及CollagenI、TGF-β等的基因表达水平的正常化表现的血管纤维化减少效果表示ψPLB-SE可潜在性地预期高血压的治疗效果的可能性。
从结果来看，在本发明中，利用ψPLB-SE来靶向蛋白磷酸酶1(PP1)，从而验证了在合成条件下的血管平滑肌细胞(VSMCs)中SERCA2a的水平及活性得以恢复，在肺动脉高血压中使血管内皮细胞(VECs)的eNOS活性增加。这可以成为ψPLB-SE用于治疗血管增生性疾病的策略性基础，并且作为肽也与基因疗法相比具有其他优点。
以上详细记述了本发明的特定部分，对本领域的普通技术人员而言这些具体说明仅为优选实例，本发明的范围并不限定于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质上的范围应由附加的发明要求保护范围及其等同替代物来定义。
序列表
<110> GWANGJU INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> 包含蛋白磷酸酶1抑制肽的血管疾病治疗用组合物
<130> PP170076
<150> KR 10-2016-0138612
<151> 2016-10-24
<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 52
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> 16Ser - 磷酸化
<400> 1
Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser
1 5 10 15
Thr Ile Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe
20 25 30
Ile Asn Phe Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile
35 40 45
Val Met Leu Leu
50
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白磷酸酶 1 抑制性肽
<400> 2
Arg Ala Glu Thr Ile Glu Met Pro Gln
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白磷酸酶 1 抑制性肽
<400> 3
Arg Ala Asp Thr Ile Glu Met Pro Gln
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白磷酸酶 1 抑制性肽
<400> 4
Ala Glu Thr Ile Glu Met Pro Gln
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白磷酸酶 1 抑制性肽
<400> 5
Arg Ala Glu Thr Ile Glu Met
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白磷酸酶 1 抑制性肽
<400> 6
Arg Ala Glu Thr Ile Glu
1 5
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 TGF-b 1 F 引物
<400> 7
caacaattcc tggcgttacc ttgg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 TGF-b 1 R 引物
<400> 8
gaaagccctg tattccgtct cctt 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 胶原 1 F-引物
<400> 9
cccaaggaaa agaagcacgt c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 胶原 1 R-引物
<400> 10
aggtcagctg gatagcgaca tc 22
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 a-SMA F 引物
<400> 11
atcgtccacc gcaaa 15
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 a-SMA R 引物
<400> 12
aaggaactgg aggcgctg 18
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 IL-1b F 引物
<400> 13
caaccaacaa gtgatattct ccat 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 IL-1b R 引物
<400> 14
gatccacact ctccagctgc a 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 TNF-a F 引物
<400> 15
catcttctca aaattcgagt gacaa 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 TNF-a R 引物
<400> 16
tgggagtaga caaggtacaa ccc 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 F4/80 F-引物
<400> 17
cttggctatg ggcttccagt c 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 F4/80 R-引物
<400> 18
gcaaggagga cagagtttat cgtg 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 MCP1 F 引物
<400> 19
gctcagccag atgcagttaa 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 MCP1 R 引物
<400> 20
tcttgagctt ggtgacaaaa act 23
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dNP2
<400> 21
Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys
1 5 10 15
Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys
20
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT
<400> 22
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> 3Ser - 磷酸化
<400> 23
Arg Ala Ser Thr Ile Glu Met Pro Gln
1 5
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 24
Gly Gly Gly
1

Claims (20)

1.一种血管疾病治疗用药物组合物，其包含：(a)蛋白磷酸酶1抑制肽的药物有效量；以及(b)药学上可接受的载体。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽由序列表第一序列的氨基酸序列中的经磷酸化的丝氨酸残基被谷氨酸或天冬氨酸取代的氨基酸序列组成。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽为包含序列表第一序列的氨基酸序列中的第14个至第22个氨基酸序列的模拟肽，并由作为上述第一序列的氨基酸序列中的第16个氨基酸残基的经磷酸化的丝氨酸残基被谷氨酸或天冬氨酸取代的氨基酸序列组成。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽选自序列表第二序列至第六序列的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽由序列表第二序列或第三序列的氨基酸组成。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽由以下通式I表示的氨基酸序列组成：
X1－Ala－X2－X3－Ile－Glu－X4 (I)
上述X1表示0－20个氨基酸残基，上述X2表示Glu或Asp，上述X3表示Thr、Glu或Asp，上述X4表示0～30个氨基酸残基。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述X1为0～20个氨基酸残基，上述X4为0～20个氨基酸残基。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述X1为0～1个氨基酸残基，上述X4为0～3个氨基酸残基。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述X1为Arg。
10.权利要求8所述的组合物，其中所述X4为Met、Met-Pro或Met-Pro-Gln。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白磷酸酶1抑制肽还与细胞穿透肽CPP相结合。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述药物组合物能够进行口服或胃肠外给药。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述胃肠外给药为血管内注射、皮下注射、肌肉注射、腹部注射、透皮给药、鼻腔给药或气道吸入。
14.权利要求1所述的组合物，其中所述血管疾病为心血管疾病、肺血管疾病、脑血管疾病、外周血管疾病、动脉硬化、血管狭窄或高血压。
15.权利要求14所述的组合物，其中所述血管狭窄为心血管狭窄、颈动脉狭窄、脑血管狭窄、肺动脉狭窄、肾动脉狭窄、股动脉狭窄、下肢动脉狭窄或血管再狭窄。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述血管再狭窄为因血管手术或血管成形术引起的再狭窄。
17.权利要求14所述的组合物，其中所述高血压为高血压性血管疾病、高血压性肺病、高血压性脑病、高血压性心脏病、高血压性肾硬化或高血压性视网膜炎。
18.一种用于缓解或改善血管疾病的食品组合物，其包含蛋白磷酸酶1抑制肽。
19.一种血管疾病的治疗方法，其包括将包含(a)蛋白磷酸酶1抑制肽的药物有效量以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物向受试者进行给药的步骤。
20.一种药物组合物，作为血管疾病治疗用用途的组合物，其包含：(a)蛋白磷酸酶1抑制肽的药物有效量；以及(b)药学上可接受的载体。
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