CN111936509A - 蛋白质分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了对应于乙酰化位点的蛋白质分子、及其用于抑制或降低核可定位多肽(如PD‑1、PD‑L1和PD‑L2)核定位的用途。本发明还涉及蛋白质分子用于改变以下至少一项的用途：过度表达PD‑1、PD‑L1或PD‑L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)上皮向间充质细胞的转化(EMT)；或(v)间充质向上皮细胞的转化(MET)，以及用于治疗或预防受试者癌症的用途。

Description

蛋白质分子及其用途
本申请要求2018年1月15日提交的题为“蛋白质分子及其用途”的澳大利亚临时申请No.2018900108的优先权，其全部内容通过引用并入此处。
技术领域
本发明总体上涉及对应于乙酰化位点的蛋白质分子、及其在抑制或降低核可定位多肽(如PD-1、PD-L1和PD-L2)核定位中的用途。本发明还涉及蛋白质分子用于改变以下至少一项的用途：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)上皮向间充质细胞的转化(EMT)；或(v)间充质向上皮细胞的转化(MET)，以及用于治疗或预防受试者癌症的用途。
背景技术
在本说明书中对任何在先出版物(或其衍生信息)的引用，或对任何已知事物的引用，不是、并且也均不应被当作承认或接受或以任何形式暗示该在先出版物(或其衍生信息)或已知事物构成了本说明书所涉领域中公知常识的一部分。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)通过调节T细胞激活和降低免疫应答的能力，在免疫系统的调节中起着重要的作用。PD-1表达于激活的T细胞(包括免疫抑制性CD4+T细胞(Treg)和疲惫的CD8+T细胞)、B细胞、骨髓树突状细胞(MDC)、单核细胞、胸腺细胞和自然杀伤(NK)细胞上(Gianchecchi等人(2013)，Autoimmun.Rev.12：1091-1100)。
PD-1信号传导通路有助于维持正常个体的中枢和外周抗性，从而避免破坏正常宿主组织。在胸腺中，PD-1与其配体的相互作用抑制了阳性选择，从而抑制CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性T细胞的转化(Keir等人(2005)，J.Immunol.175：7329-7379)。PD-1信号传导通路还负责抑制逃避阴性选择的自身反应性和炎症效应T细胞，以避免附带的免疫介导的组织损伤(Keir等人(2006)，J.Exp.Med.203：883-895)。
PD-1被两种配体结合：程序性细胞死亡配体-1(PD-L1；B7-H1；CD274)和程序性细胞死亡配体-2(PD-L2；B7-DC；CD273)。PD-L1在多种细胞类型中表达，包括T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞(Chen等人(2012)Clin Cancer Res,18(24)：6580-6587；Herzberg等人(2016)The Oncologist,21：1-8)。在局部肿瘤环境中，许多类型的肿瘤细胞和其他细胞中PD-L1的表达也被上调(Herzberg等人(2016)The Oncologist，21：1-8)。PD-L2主要在抗原呈递细胞(如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)上表达，但取决于微环境的刺激，也可能在其他多种免疫细胞和非免疫细胞上诱导表达(Herzberg等人(2016)The Oncologist,21：1-8；Kinter等人(2008)J.Immunol.，181：6738–6746；Zhong等人(2007)Eur.J.Immunol.，37：2405–2410；Messal等人(2011)Mol.Immunol.，48：2214–2219；Lesterhuis等人(2011)Mol.Immunol.，49：1-3)。
在局部肿瘤环境中，恶性细胞和其他细胞过度表达PD-1、PD-L1和PD-L2。PD-1在来自许多不同肿瘤类型的大部分肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中高表达，并抑制局部效应免疫应答。PD-1的TIL表达与多种肿瘤类型中的效应功能受损(细胞因子的产生和针对肿瘤细胞的细胞毒性作用)和/或预后不良相关(Thompson等人(2007)Clin Cancer Res,13(6)：1757-1761；Shi等人(2011)Int.J.Cancer,128：887-896)。已经发现PD-L1的表达与许多肿瘤类型的预后不良密切相关，包括肾癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、尿路上皮癌、胃癌和胰腺癌(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.，26：677-704；Shi等人(2011)Int.J.Cancer,128：887-896)。已经显示PD-L2在肿瘤亚型中被上调，并且还与预后不良有关。
有趣的是，已经证明核PD-L1表达与几种肿瘤类型的短生存期和化学抗性有关，包括前列腺癌、结肠直肠癌和乳腺癌(Satelli等人(2016)Scientific Reports,6：28910；Ghebeh等人(2010)Breast Cancer Res.，12：R48)。
因此，PD-1信号传导通路的成员是用于治疗癌症的重要治疗靶标，并且期望靶向该通路的新治疗剂，特别是PD-1信号传导通路成员的核定位。
发明内容
本发明部分基于以下发现：包含对应于PD-L1乙酰化位点的氨基酸序列的蛋白质分子抑制或降低PD-L1、PD-L2和PD-1的核定位。因此，发明人认为，包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列的蛋白质分子可以用于抑制核可定位多肽的核定位，其中核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加了其在细胞中的核定位。发明人还认为，蛋白质分子可以用于治疗受试者中的癌症。
因此，在本发明的一方面，提供了一种抑制或降低核可定位多肽的核定位的方法，其中核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加了其在细胞中的核定位，所述方法包括使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
在另一方面，提供了一种在过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞中抑制或降低PD-1、PD-L1或PD-L2核定位的方法，所述方法包括使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
在另一方面，提供了一种改变以下至少一项的方法：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力，所述方法包括使所述细胞与调节形成、增殖、维持、EMT、MET或活力的量的蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
另一方面，提供了一种治疗或预防受试者癌症的方法，其中所述癌症包括至少一种过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞，所述方法包括向所述受试者施用蛋白质分子，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
在另一方面，本发明提供了一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
在另一方面，提供了一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
在另一方面，本发明提供了一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低癌症干细胞的形成、增殖、活力或EMT中的至少一种，所述方法包括：
a)使癌症干细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)相对于没有所述蛋白质分子的情况下细胞形成、增殖、活力或EMT的正常或参考水平，检测所述癌症干细胞的形成、增殖或EMT的降低或抑制。
本发明还考虑了一种分离或纯化的蛋白质分子，其是式I所示：
Z1X1X2X3X4FX5X6X7X8X9X10XiiX12X13X14X15X16Z2 (I)
其中：
Z1和Z2独立地不存在、或独立地选自以下至少一个：包含约1至约50个氨基酸残基(及其之间的所有整数残基)的蛋白质部分和保护部分；
X1不存在或选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X2选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基；
X3选自任何氨基酸残基；
X4选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X5选自任何氨基酸残基；
X6选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X7选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X8选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、Orn及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括N、Q、Orn(Ac)、K(Ac)及其修饰形式的具有含酰胺侧链的氨基酸残基；
X9选自包括G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X10选自任何氨基酸残基；
X11选自任何氨基酸残基；
X12选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X13选自任何氨基酸残基；
X14选自任何氨基酸残基；
X15选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；以及
X16选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
在一些实施方案中，蛋白质分子具有选自以下的任何一种或多种活性：(i)增加细胞死亡；(ii)增加MET；(iii)降低或抑制EMT；(iv)抑制或降低维持；(v)抑制或降低增殖；(vi)增加分化；(vii)抑制或降低形成；或(viii)降低过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞活力。
附图说明
图1是代表在转移性乳腺癌患者液体活检组织分离的转移起始细胞(MIC)中PD-L1和细胞表面波形蛋白(CSV)定位的照片(图1A)和图形表示(图1B至图1D)。10例患者(P1-P10)中以1周、3周和6周的间隔对各患者分别取样本。图1A代表P1-P10患者在第6周时PD-L1和CSV定位的照片，图1B描述了在第1、3和6周时采集的样本中PD-L1的总核荧光(TNFI)，图1C描述分别在第1、3和6周时采集的样本中PD-L1的核与细胞质的荧光比(Fn/c)，图1D描述了在第1、3和6周时采集的样本中CSV总细胞质荧光(TCFI)(每个样本n≥5-10个单个细胞)。数据显示为平均值±SE，按收集时间点分组。显示了每种情况的代表性图像。
图2代表在从6名黑色素瘤患者(P1-P6)的液体活检组织分离的MIC中PD-L1和CSV定位的照片(图2A)和图形表示(图2B)。图2A代表P1-P6患者在第1周时PD-L1和CSV定位的照片，图2B描述在第1周时采集的样本中CSV的TCFI，在第1周时采集的样本中PD-L1的TNFI，以及第1周时采集的样本中PD-L1的Fn/c(每个样本n≥5-10个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。
图3显示了PD-L1在乳腺癌细胞中的定位。图3A显示了MDA-MB-231细胞(MDA)和刺激的(MCF7ST)和非刺激的(MCF7NS)MCF7细胞中PD-L1的TNFI和TCFI。图3B描述了用60mg/kg白蛋白结合型紫杉醇或10mg/kg多西他赛(Dox)处理35天的MDA-MB-231小鼠异种移植细胞中PD-L1的TNFI。还显示了切除前的肿瘤体积。图3C是在MDA-MB-231细胞中PD-L1、H3K27Ac、H3K4me3和H3K9me3定位的照片和图形表示。提供了TNFI和皮尔逊相关系数(PCC(r))。数据显示为平均值±SE。每个样本中n≥20个单个细胞；NS＝未刺激；ST＝用PMA刺激。显示了每种情况的代表性图像。
图4表示PD-L1野生型质粒和带有K263Q突变的PD-L1质粒(Mut1质粒)的示意图。带下划线的是野生型质粒中的赖氨酸263和Mut1质粒中的谷氨酰胺263。
图5代表在转染有空载体(VO)、PD-L1野生型质粒(PDL1-WT)和PD-L1Mut1质粒(PDL1-Mut1)的刺激的和非刺激MCF7细胞中，PD-L1和CSV定位的照片(图5A)和图形表示(图5B至图5E)。图5B描述了CSV的TCFI，图5C描述了PD-L1的TNFI，图5D描述了PD-L1的TCFI，以及图5E描述了PD-L1的Fn/c(每个样本n≥5-10个单个细胞；NS＝未刺激；ST＝被PMA刺激)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图6代表在用空载体(VO)、PD-L1野生型质粒(PDL1-WT)和PD-L1 Mut1质粒(PDL1-Mut1)转染的刺激和未刺激的MCF7细胞中，表皮生长因子受体(EGFR)、CD133和SNAI1定位的照片(图6A)和图形表示(图6B至图6H)。图6B描述了EGFR的TNFI，图6C描述了EGFR的TCFI，图6D描述了EGFR的Fn/c，图6E描述了SNAI1的TNFI，图6F描述了SNAI1的TCFI，图6G描述了SNAI1的Fn/c，以及图6H描述了CD133的TCFI(每个样本n≥5-10个单个细胞；NS＝未刺激；ST＝被PMA刺激)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图7代表用质粒孵育24或48小时，并用WST-1试剂处理2、3或4小时，转染有空载体(仅载体)、PD-L1野生型质粒(WT)和PD-L1 Mut1质粒(Mut-1)的MCF7细胞的增殖的图示。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图8代表在MDA-MB-231细胞中(图8A)以及转移性黑色素瘤和转移性乳腺癌患者细胞中(图8B和8C)PD-L1、在赖氨酸263处三甲基化的PD-L1(PDL1me3；“三甲基化PD-L1”)和在赖氨酸263处乙酰化的PD-L1(PDL1(Ac)；“乙酰化的PD-L1”)定位的照片和图形表示。图8A显示了MDA-MB-231细胞中三甲基化和乙酰化PD-L1以及天然PD-L1的核定位(Fn/c)。图8B显示了从对免疫疗法有响应的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(响应者)、从对免疫疗法显示原发性抗性的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(原发性抗性)、从转移性乳腺癌患者分离的CTC(MBC CTC S2)和MDA-MB-231细胞中的三甲基化PD-L1的定位。显示了三甲基化PD-L1的TCFI。CSV(细胞表面波形蛋白)作为对照。图8C描述了从对免疫疗法有响应的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(响应者)、从对免疫疗法显示继发性抗性的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(继发性抗性)、从转移性乳腺癌患者分离的CTC(MBC CTC S1)和MDA-MB-231细胞中的乙酰化PD-L1的定位。显示了乙酰化PD-L1的TNFI。CSV(细胞表面波形蛋白)作为对照。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图9显示了P1、P2和P3(分别称为PDL1-P1、PDL1-P2和PDL1-P3)对PD-L1和乙酰化PD-L1在MDA-MB-231细胞中的定位的影响。图9A是响应P1、P2和P3处理的MDA-MB-231细胞中PD-L1的定位的照片和图形表示。图9B代表响应P1、P2和P3处理的MDA-MB-231细胞中乙酰化PD-L1的定位的照片和图形表示。给出了TNFI、TCFI和Fn/c。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图10代表P4(称为PDL1-P4)对MDA-MB-231细胞中PD-L1和乙酰化PD-L1定位的影响的照片和图形表示。图10A显示了乙酰化PD-L1的定位，图10B显示了响应P4处理的PD-L1的定位。给出了TNFI、TCFI和Fn/c。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图11显示了P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞中癌症干细胞表型(CD44高/CD24低)的影响。图11A描述了用P1处理的细胞的FACS分析，图11B描述了用P2处理的细胞的FACS分析，图11C描述了用P3处理的细胞的FACS分析，图11D是用P1(称为肽1)处理的细胞的FACS分析的图示，图11E是用P2(称为肽2)处理的细胞的FACS分析的图示，图11F是用P3(称为肽3)处理的细胞的FACS分析的图示。
图12代表P1(称为肽1；图12A)、P2(称为肽2；图12B)和P3(称为肽3；图12C)对MDA-MB-231细胞增殖的影响的图示。用肽处理细胞72小时，然后与WST-1试剂一起孵育2小时。
图13代表在P1(PDL1-P1)、P2(PDL1-P2)和P3(PDL1-P3)处理的MDA-MB-231细胞中CSV、PD-L1和SNAI1定位的照片(图13A)和图形表示(图13B至图13D)。图13B描述了CSV的TCFI，图13C描述了PD-L1的TNFI，图13D描述了SNAI1的TNFI(每个样本n≥20个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图14代表在用P1(PDL1-P1)、P2(PDL1-P2)和P3(PDL1-P3)处理的MDA-MB-231细胞中CSV、EGFR和SNAI1定位的照片(图14A)和图形表示(图14B至图14D)。图14B描述了CSV的TCFI，图14C描述了EGFR的TNFI，图14D描述了SNAI1的TNFI(每个样本n≥20个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图15代表在用P1、P2、P3或P4处理的MDA-MB-231细胞中EHMT2、DMNTI和SETDB1定位的照片和图形表示。显示了TNFI。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。每个样本n≥20个单个细胞。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图16代表在用载剂(对照)或P3处理的MDA-MB-231细胞中H3K9me3(图16A)和5-甲基胞嘧啶(图16B)定位的照片和图形表示。包括ABCB5作为化学抗性标记物。给出了TNFI和TFI。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图17是从对免疫疗法治疗有响应的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(响应者)、或从对免疫疗法治疗显示原发性或继发性抗性的转移性黑色素瘤患者中分离的CTC(抗性)中乙酰化PD-L1和p300定位的照片和图形表示。显示了TNFI和PCC(r)。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图18代表在匹配的初始
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透化MDA-MB-231、MCF7、T-47D和4T1(4T1 A组)细胞、多西紫杉醇抗性透化MDA-MB-231(MDA-MB-231TXT50)、MCF7(MCF7 TXT50)和T-47D(T-47D TXT50)细胞、以及白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)抗性透化4T1(4T1 B组)细胞中乙酰化PD-L1和p300定位的照片和图形表示。显示了TNFI和PCC(r)。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图19代表在用P1(PDL1-P1)、P2(PDL1-P2)、P3(PDL1-P3)、P4(PDL1-P4)或载剂(对照)处理的MDA-MB-231细胞中乙酰化PD-L1和p300定位的照片和图形表示。显示了TNFI和PCC(r)。数据显示为平均值±SE(n＝20个细胞/样本)。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图20代表Jurkat T细胞或OT1衍生T细胞中PD-1定位的照片(图20A)和图形表示(图20B)。图20B描述了PD-1的TNFI(每个样本n≥20个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。D0＝第0天；D1＝第一天；D6＝第六天；NS＝未刺激；ST＝用PMA刺激；RST＝用PMA再刺激；SW＝用PMA刺激并洗涤；初始＝获自初始T细胞的OT1细胞；E1、E2或E3＝从效应病毒特异性T细胞中分离出OT1细胞；****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图21代表在用P1(PEP1)、P2(PEP2)和P3(PEP3)处理的Jurkat T细胞中PD-1定位的照片(图21A)和图形表示(图21B至图21D)。图21B描述了PD-1的TNFI，图21C描述了PD-1的TCFI，图21D描述了PD-1的Fn/c(每个样本中n≥20个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
图22代表在P1(PDL1-P1)、P2(PDL1-P2)和P3(PDL1-P3)处理的MDA-MB-231细胞中PD-L1、PD-L2和CSV定位的照片(图22A)和图形表示(图22B至图22D)。图22B描述了PD-L2的TNFI，图22C描述了PD-L1的TNFI，图22D描述了CSV的TCFI(每个样本n≥20个单个细胞)。数据显示为平均值±SE。显示了每种情况的代表性图像。****＝p值≤0.0001；***＝p值≤0.001；**＝p值≤0.01；*＝p值≤0.05；ns＝p值>0.05。
具体实施方式
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即至少一个)冠词语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。
“大约”是指量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相对于参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度的变化多达15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
本文使用的术语“乙酰化位点”是指可以被乙酰化的任何氨基酸序列，例如被乙酰基转移酶乙酰化；具体是组蛋白乙酰基转移酶乙酰化，其非限制性示例包括GCN5、Hat1、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK，尤其是p300。术语“乙酰化位点”是指这样的序列，其包含乙酰化底物(例如赖氨酸残基)、以及可能参与酶(例如乙酰基转移酶)对底物识别的周围和/或邻近氨基酸残基。乙酰化位点可以是任何适当长度的氨基酸序列，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或大于22个残基，优选长度为14、15、16、17、18、19、20或21个残基。
术语“试剂(agent)”包括诱导所需药理和/或生理作用的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的和药理活性成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用以上术语时，则应理解其包括活性剂本身以及药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“剂”不应狭义地解释，但可延及小分子、蛋白质分子(例如肽、多肽和蛋白)以及包含它们的组合物，以及遗传分子(例如RNA、DNA及其模拟物和化学类似物)，以及细胞因子。
如本文所用，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当解释为任选方式(或)时，不进行组合。
术语“癌症干细胞”(CSC)是指具有肿瘤引发和肿瘤维持能力的细胞，包括广泛增殖、形成新肿瘤和维持癌症发展的能力，即具有无限增殖潜能的细胞，其驱动该肿瘤的形成和生长。CSC在生物学上与肿瘤细胞块(bulk)不同，并且具有与干细胞相关的特征，特别是自我更新以及增殖并产生特定癌症样本中发现的所有细胞类型的能力。术语“癌症干细胞”既包括干细胞(SC)中的基因变化，又包括成为CSC的细胞内的基因变化。在具体的实施方案中，CSC是乳腺CSC，其合适地是CD24+CD44+，其说明性示例包括CD44高CD24低。
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及变体(如“包括”和“含有”)将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤、或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤、或整数或步骤的组。因此，术语“包含”等的使用指示所列出的整数是必需的或必须的，但是其他整数是可选的并且可以存在或也可以不存在。“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”之后的内容。因此，短语“由...组成”表示所列要素是必需的或必须的，并且不可能存在其他要素。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或不影响本公开中针对所列要素所规定活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列出的要素是必需的或必须的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列要素的活性或作用，可以存在或可以不存在。在具体的实施方案中，在本文公开的具体氨基酸序列上下文中，术语“基本上由...组成”在其范围内包括特定氨基酸序列上游的约1至约50个任选氨基酸(以及其间的所有整数个任选氨基酸)和/或特定氨基酸序列下游的约1至约50个任选氨基酸(以及其间的所有整数个任选氨基酸)。
“对应于”或“与...对应”是指和参考序列显示出实质性序列同一性的序列(例如核酸或氨基酸序列)(如，与参考核酸序列的全部或部分显示出至少约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％的序列同一性)或与参考氨基酸序列显示出实质性序列相似性或同一性的氨基酸序列(如，与参考氨基酸序列的全部或部分显示出至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性)。
“衍生物”是指分子(例如多肽)，如本领域中将理解的，其通过修饰(例如与其他化学部分缀合或复合，或通过翻译后修饰技术)衍生自基础分子。术语“衍生物”在其范围内还包括对亲本序列已进行的改变，包括提供功能上等同分子的添加或缺失。
如本文所用，术语“剂量单位形式”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单元，每个单元包含预定量的活性物质以及所需的药学上可接受的载剂，该预定量经计算可产生所需的治疗效果。
在治疗或预防病症的上下文中，“有效量”是指对需要这种治疗或预防的个体施用一定量的试剂或组合物，而无论是单剂量还是作为系列的一部分，其对于预防所述病症症状的发生、抑制这种症状和/或治疗现有症状是有效的。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类组、组合物的制剂、医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。可以预计，该量会落入相对广的范围，其可以通过常规试验来确定。
如本文所用，术语“上皮向间充质的转化”(EMT)是指从上皮细胞向间充质表型的转化，其是胚胎发育的正常过程。EMT也是这样的一种过程，在该过程中，充当离子和液体转运者的受损上皮细胞成为基质重塑的间充质细胞，在癌症中这种转化通常会导致细胞形态的改变、间充质蛋白的表达和侵袭性增加。体外EMT的定义标准包括上皮细胞极性的丧失、分离为单个细胞以及随后获得细胞运动性后的分散(参见Vincent-Salomon和Thiery(2003)，Breast Cancer Res.，5(2)：101-6)。在EMT过程中其表达、分布和/或功能发生变化的、且因果上相关的分子类别包括生长因子(例如转化生长因子(TGF)-β、wnts)、转录因子(例如SNAI、SMAD、LEF和核β-连环蛋白)、细胞间粘附轴的分子(钙黏着蛋白、连环蛋白)、细胞骨架调节剂(Rho家族)和细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活剂)(参考Thompson和Newgreen,Cancer Res.2005；65(14):5991-5)。
如本文所用，术语“上皮”是指身体的内表面和外表面的覆盖，包括血管和其他小腔的衬里。它由上皮细胞的集合组成，这些上皮细胞形成相对较薄的片或层，这是由于组成细胞通过细胞间连接而相互侧向且广泛地粘附。该层是有极性的，并具有顶侧和底侧。尽管上皮细胞结构严密，上皮细胞确实具有一定的可塑性，并且上皮层的细胞可以改变形状，例如一端从扁平状变为柱状或压紧(pinch)，而另一端扩张。但是，这些趋向于发生在细胞群中，而不是单个发生(请参阅Thompson和Newgreen,Cancer Res.2005；65(14):5991-5)。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在编码序列的情况下，表达涉及将编码序列转录成mRNA以及将mRNA翻译成一个或多个多肽。相反，非编码序列的表达仅涉及非编码序列转录成转录物。术语“表达”在本文中也用于指蛋白质或分子在特定位置的存在，因此可以与“定位”互换使用。
“表达载体”是指能够指导载体中包含的多核苷酸进行转录并且适当地指导多核苷酸所编码肽或多肽进行合成的任何遗传元件。这样的表达载体是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“高”是指大于正常的、大于标准(例如预定测量值或亚组测量值)的测量值，或者是指比另一亚组测量值相对更高的测量值。例如，CD44高是指CD44的测量值大于正常CD44的测量值。因此，“CD44高”至少始终对应于受试者体内相关部分或受试者体内相关样本中可检测到的CD44。正常测量值可以根据本领域技术人员可用的任何方法来确定。术语“高”还可以指等于或大于预定测量值的测量值，例如预定的截断值。如果受试者的特定标记物不“高”，则该标记物为“低”。通常，应该选择用于确定受试者是“高”还是“低”的截断值，使划分在临床上有意义。
术语“激素受体阴性(HR-)肿瘤”是指不表达激素受体的肿瘤，如通过标准方法确定的(如患者生物样本中细胞核的免疫组织化学染色)，所述激素刺激肿瘤的增殖、存活或活力，使其高于特定阈值。可以例如使用Allred得分或基因表达来测量该阈值。参见例如Harvey等人(1999，J Clin Oncol，17：1474-1481)和Badve等人(2008，J Clin Oncol，26(15)：2473-2481)。在一些实施方案中，肿瘤不表达雌激素受体(ER-)和/或孕激素受体(PR-)。
术语“激素受体阳性(HR+)肿瘤”是指表达激素受体的肿瘤，如通过标准方法确定的(如患者生物样本中细胞核的免疫组织化学染色)，所述激素刺激肿瘤的增殖、存活或活力，使其高于特定阈值。可以例如使用Allred得分或基因表达来测量该阈值。参见例如Harvey等人(1999，J Clin Oncol，17：1474-1481)和Badve等人(2008，J Clin Oncol，26(15)：2473-2481)。在一些实施方案中，肿瘤表达雌激素受体(ER)和/或孕激素受体(PR)。
术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然的、偶然的或刻意的突变和/或变化，后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA互补性方面)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
本文使用“杂交”来表示互补核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。互补碱基序列是根据碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T配对，以及C与G配对。在RNA中，U与A配对，以及C与G配对。就这一点而言，本文所用的术语“匹配”和“错配”是指互补核酸链中配对核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸可以高效地杂交，例如上面提到的经典A-T和G-C碱基对。错配是不能有效杂交的核苷酸的其他组合。在本发明中，优选的配对机制涉及寡聚化合物链中互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键键合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。可以在本领域技术人员已知的不同情况下发生杂交。
如本文所用，术语“抑制剂”是指降低或抑制靶标分子至少一种功能或生物学活性的试剂。
如本文所用，术语“分离的”是指材料实质上或基本上不含其在天然状态下通常所伴有的组分。例如，“分离的蛋白质分子”是指从其天然细胞环境以及与细胞其他组分的结合中，在体外分离和/或纯化蛋白质分子。“基本上不含”是指蛋白质分子制剂至少为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92，93、94、95、96、97、98或99％纯的。在一个优选的实施方案中，蛋白质分子的制剂中并非本发明主题(在本文中也称为“污染分子”)的分子少于约30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％(以干重计)。当重组生产蛋白质分子时，其还理想地基本上不含培养介质，即培养介质占制剂体积的小于约20、15、10、5、4、3、2或1％。本发明包括干重至少0.01、0.1、1.0和10毫克的分离或纯化的制剂。
如本文所用，术语“间充质向上皮的转化”(MET)是可逆的生物学过程，其涉及从运动的、多极性或纺锤形的间充质细胞向极性细胞的平面阵列(称为上皮)的转化。MET是EMT的逆过程。MET在正常发育、癌症转移和诱导性多能干细胞重编程中发生。
如本文所用，术语“间充质”是指胚胎中胚层的一部分，由松散堆积的非特化细胞组成，其处于凝胶状的基底物质(ground substance)中，从中发育出结缔组织、骨骼、软骨以及循环系统和淋巴系统。间充质是形成相对扩散性组织网络的细胞的集合。间充质不是完整的细胞层，并且细胞通常在其表面上仅存在若干的点来参与与相邻细胞的粘附。这些粘附也可能涉及钙黏着蛋白的结合(参见Thompson和Newgreen(2005)，Cancer Res，65(14)：5991-5)。
“调节”是指直接或间接增加或降低靶标分子的水平或功能活性。例如，试剂可以通过与靶标分子以外的分子相互作用来间接调节水平/活性。在这方面，编码靶标多肽的基因的间接调节包括在其范围内对第一核酸分子表达的调节，其中第一核酸分子的表达产物调节编码靶标多肽的核酸分子的表达。
如本文所用，术语“过度表达”、“过表达”、“过表达的”或“被过表达”可互换使用，是指与正常细胞相比，通常在癌细胞中基因(例如，PD-1基因、PD-L1基因或PD-L2基因)以可检测的更高水平被转录或翻译。因此，过度表达是指蛋白质和RNA的过度表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工、稳定性改变和蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运输方式的改变(核定位增加)和功能活性增强而导致的局部过度表达。与正常细胞或对照细胞(例如乳腺细胞)相比，过度表达也可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的过度表达。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指将结构基因置于调控元件的调控控制下，所述调控元件包括但不限于启动子，其随后控制基因的转录和任选翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选将基因序列或启动子定位于距基因转录起始位点一定距离，使得该距离大致等于该基因序列或启动子与其天然环境下所控制的基因(即基因序列或启动子所源自的基因)之间的距离。如本领域中已知的，可以调整该距离的一些变化而不会损失功能。类似地，调控序列元件相对于要置于其控制下的异源基因的优选定位是通过该元件在其天然环境中的定位来定义的，即其所来源的基因。
如本文所用，术语“过度表达PD-1的细胞”、“过度表达PD-L1的细胞”和“过度表达PD-L2的细胞”是指相比正常细胞，以可检测的更高水平表达PD-1、PD-L1或PD-L2的脊椎动物细胞，特别是哺乳动物或禽(鸟)细胞，特别是哺乳动物细胞。该细胞可以是脊椎动物细胞，例如灵长动物细胞；禽(鸟)细胞；家畜动物细胞，例如绵羊细胞、牛细胞、马细胞、鹿细胞、驴细胞和猪细胞；实验室测试动物细胞，例如兔细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞和仓鼠细胞；伴侣动物细胞，例如猫细胞和狗细胞；以及圈养的野生动物细胞，例如狐狸细胞、鹿细胞和野狗细胞。在具体的实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是人细胞。在具体的实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；优选地，癌症干细胞肿瘤细胞。与正常细胞或对照细胞(例如乳腺细胞)相比，过度表达也可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的过度表达。
“药学上可接受的载体”是指由并非生物学上或其他方面不期望的材料所组成的药物载剂(即，可以将该材料与选择的活性剂一起施用给受试者，而不会引起任何或实质性的不良反应)。载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂、去污剂、着色剂、湿润或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。
类似地，本文提供的化合物的“药理学上可接受的”盐、酯、酰胺、前药或衍生物，是生物学上或其他方面并非不期望的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。
如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质分子”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物以及它们的变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，例如天然存在氨基酸以及天然存在氨基酸聚合物的相应化学类似物。这些术语不排除修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。主题蛋白质分子的可溶形式特别有用。定义中包括例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括例如非天然氨基酸或具有取代键的多肽。
如本文所用，术语“预防”、“预防的”或“预防性”是指预防性治疗，其增加了受试者对发展成疾病或病症的抗性，或者换句话说，降低了受试者将发展为疾病或病症的可能性，以及疾病或病症开始之后的治疗以降低或完全消除或防止其恶化。这些术语在它们的范围内还包括防止受试者中疾病或病症的发生，所述受试者可能易感于该疾病或病症，但尚未被诊断为患有该疾病或病症。
当用于指代第一样本相对于第二样本中物质和/或现象的水平时，术语“降低”、“抑制”、“阻遏”、“减少”和语法上的等价物，是指使用任何本领域公认的统计分析方法，第一样本中该物质的量和/或现象低于第二样本的量在统计学上是显著的。在一个实施方案中，降低可以主观地确定，例如当患者参考他们对疾病症状(如疼痛、疲劳等)的主观感知时。在另一实施方案中，可以客观地确定降低，例如当患者样本中的CSC和/或非CSC肿瘤细胞的数目低于患者早期样本。在另一个实施方案中，第一样本中的物质和/或现象的量比第二样本中相同物质和/或现象的量低至少10％。在另一个实施方案中，第一样本中的物质和/或现象的量比第二样本中相同物质和/或现象的量低至少25％。在又一个实施方案中，第一样本中的物质和/或现象的量比第二样本中相同物质和/或现象的量低至少50％。在另一实施方案中，第一样本中的物质和/或现象的量比第二样本中相同物质和/或现象的量低至少75％。在又一个实施方案中，第一样本中的物质和/或现象的量比第二样本中相同物质和/或现象的量低至少90％。替代地，差异可以表示为“n倍”的差异。
如本文所用，术语“盐”和“前药”包括任何药学上可接受的盐、酯、水合物或任何其他化合物，其在施用于接受者后能够提供(直接或间接)本发明的蛋白质分子、或其活性代谢物或其残基。合适的药学上可接受的盐包括药学上可接受的无机酸的盐，例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐，或药学上可接受的有机酸的盐，例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸的盐。碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子(例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵)形成的那些。另外，碱性含氮基团可以用这种试剂进行季铵化，比如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，例如二甲基和二乙基硫酸盐；和其他试剂。然而，应当理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为它们可用于制备药学上可接受的盐。盐和前药的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，可以通过使本发明的化合物与金属氢氧化物反应来制备金属盐。可以通过使适当的酸与本发明的蛋白质分子反应来制备酸盐。
如本文所用，术语“严谨度”是指温度和离子强度的条件，以及在杂交和洗涤过程中某些有机溶剂的存在或不存在。严谨度越高，固定的靶标核苷酸序列与标记的探针多核苷酸序列之间的互补程度越高，洗涤后仍与靶标杂交。术语“高严谨度”是指温度和离子的条件，在该条件下，只有具有高频率互补碱基的核苷酸序列才能杂交。所需的严谨度取决于核苷酸序列，并取决于杂交过程中存在的各种组分。通常，在限定的离子强度和pH下，对于具体的序列而言，严谨条件应选择比热熔点(Tm)低约10至20℃。Tm是50％的靶标序列与互补探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。
如本文所用，术语“受试者”是指希望对其进行治疗或预防的脊椎动物受试者，具体是哺乳动物或禽(鸟)受试者。合适的受试者包括但不限于灵长动物；禽(鸟)；家畜动物(例如绵羊、牛、马、鹿、驴和猪)；实验室测试动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠)；伴侣动物，例如猫和狗；以及圈养的野生动物，例如狐狸、鹿和野狗。特别地，受试者是人。然而，将理解，前述术语并不暗示存在症状。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”等是指获得所需的药理和/或生理作用。就部分或完全治愈疾病或病症、和/或可归因于疾病或病症的副作用而言，该作用可以是治疗性的。这些术语还涵盖了在哺乳动物(具体是人)中对病症或疾病的任何治疗，包括：(a)抑制疾病或病症，即阻止其发展；或(b)缓解疾病或病症，即导致疾病或病症的消退。
如本文所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常以细胞生长不受调控为特征。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前”是指通常在癌症之前或发展成癌症的状况或生长。术语“非转移性”是指良性的癌症或保留在原发部位并且尚未渗透到淋巴或血管系统或除原发部位以外的组织中的癌症。通常，非转移性癌症是指第0、I或II期的任何癌症。“早期癌症”是指非侵袭性或转移性或分类为0期、I或II期癌症的癌症。术语“晚期癌症”通常是指III或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的亚阶段。本领域技术人员将理解，II期癌症分类为早期癌症还是晚期癌症取决于具体的癌症类型。癌症的说明性示例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌(肾脏癌)、癌瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、直肠癌和食道癌。在示例性实施方案中，癌症是乳腺癌或黑色素瘤。
如本文所用，术语“载体”是指多核苷酸分子，合适地是例如衍生自质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，多核苷酸可以插入或克隆于其中。载体可以包含一个或多个独特的限制性位点，并且能够在限定的宿主细胞(包括靶标细胞或组织或其祖细胞或其组织)中自主复制，或与限定的宿主的基因组整合，从而使克隆的序列可复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如线性或封闭的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是这种载体，当引入宿主细胞时，其被整合到基因组中并与已经整合到其中的染色体一起复制。载体系统可以包括单个载体或质粒、两个或多个载体或质粒，其共同包含要引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。载体的选择通常将取决于载体与将载体引入其中的宿主细胞的相容性。在当前情况下，载体优选是病毒或衍生自病毒的载体，其在真菌、细菌或动物细胞(优选哺乳动物细胞)中可操作地起作用。这样的载体可以衍生自痘病毒、腺病毒或酵母。载体还可以包括选择标记，例如可用于选择合适转化子的抗生素抗性基因。这样的抗性基因的示例是本领域技术人员已知的，包括赋予对抗生素卡那霉素和G418
Figure BDA0002680414600000161
抗性的nptII基因、和赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
除非另外特别说明，否则本文所述的每个实施方案均应作必要的变通而应用于每个实施方案。
2.缩写
在整个说明书中使用以下缩写：
K(Ac)＝Nε-乙酰基-L-赖氨酸
Nle＝正亮氨酸
Orn(Ac)＝Nδ-乙酰基-L-鸟氨酸
K(Me3)＝Nε-三甲基-L-赖氨酸
Orn＝鸟氨酸。
3.蛋白质分子
本发明部分地基于鉴定了对应于乙酰化位点(例如PD-L1的位点)的蛋白质分子抑制或降低多肽的核定位，其中乙酰化位点的乙酰化增加了多肽(例如免疫检查点蛋白，包括PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位。在一个或多个实施方案中，这样的蛋白质分子抑制或降低癌症干细胞和非癌症干细胞肿瘤细胞的形成、维持和/或活力，和/或抑制EMT和/或诱导癌症干细胞肿瘤细胞的MET。因此，发明人已经想到本发明的蛋白质分子可以用于治疗或预防癌症。
因此，在本发明的一方面，提供了由式I所示的分离或纯化的蛋白质分子：
Z1X1X2X3X4FX5X6X7X8X9X10XiiX12X13X14X15X16Z2 (I)
其中：
Z1和Z2独立地不存在、或独立地选自以下至少一个：包含约1至约50个氨基酸残基(及其之间的所有整数残基)的蛋白质部分和保护部分；
X1不存在或选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X2选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基；
X3选自任何氨基酸残基；
X4选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X5选自任何氨基酸残基；
X6选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X7选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X8选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、Orn及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括N、Q、Orn(Ac)、K(Ac)及其修饰形式的具有含酰胺侧链的氨基酸残基；
X9选自包括G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X10选自任何氨基酸残基；
X11选自任何氨基酸残基；
X12选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X13选自任何氨基酸残基；
X14选自任何氨基酸残基；
X15选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；以及
X16选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
在一些实施方案中，Z1不存在。在其他实施方案中，Z1由10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，Z1中的氨基酸残基独立地选自任何氨基酸残基。
在一些实施方案中，Z2不存在。在其他实施方案中，Z2由10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，Z2中的氨基酸残基独立地选自任何氨基酸残基。
在一些实施方案中，X1不存在或选自L和A。在一些实施方案中，X1是A。
在一些实施方案中，X2选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X2选自T、A和K；具体是A或K；最尤其是K。
在一些实施方案中，X3选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。在具体的实施方案中，X3选自F、E和K；具体是F。
在一些实施方案中，X4选自包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基，以及包括I、L、V、M、Nle及其修饰形式的疏水氨基酸残基。在具体的实施方案中，X4选自I、L和E；具体是I。
在一些实施方案中，X5选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X5选自R、E和V；具体是R或V；最尤其是V。
在一些实施方案中，X6选自L、E、K、F和V；具体是L或F；最尤其是F。
在一些实施方案中，X7选自R、E和L；具体是R或L；最尤其是L。
在一些实施方案中，X8选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R、Orn及其修饰形式的碱性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X8是K或A；最尤其是A。
在一些实施方案中，X9选自G，包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X9是G、D或V；具体是D或V。
在一些实施方案中，X10选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X10是R或V；具体是R。
在一些实施方案中，X11选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X11选自M、Nle、A和E；具体是E或A；最尤其是A。
在一些实施方案中，X12选自包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X12是M、Nle或E；具体是E。
在一些实施方案中，X13选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X13是A、D或V；具体是A或V；最尤其是A。
在一些实施方案中，X14选自包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。在具体的实施方案中，X14为V或K；具体是K。
在一些实施方案中，X15选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。在具体的实施方案中，X15是R、K或Y；具体是K或Y；最尤其是K。
在一些实施方案中，X16为K或R；具体是K。
在一些实施方案中，式I的分离的或纯化的蛋白质分子包含SEQ ID NO：1-21中的任一项所示的氨基酸序列、由或基本上由SEQ ID NO：1-21中的任一项所示的氨基酸序列组成：
Figure BDA0002680414600000191
Figure BDA0002680414600000201
在一些实施方案中，式I的蛋白质分子包含SEQ ID NO：1-18中的任一项所示氨基酸序列、由或基本上由SEQ ID NO：1-18中的任一项所示氨基酸序列组成。在具体的实施方案中，式I的蛋白质分子包含SEQ ID NO：1、4、9、10、13、16、18或19所示氨基酸序列、由或基本上由SEQ ID NO：1、4、9、10、13、16、18或19所示氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，式I的蛋白质分子具有选自以下的任何一种或多种活性：(i)增加细胞死亡；(ii)增加MET；(iii)降低或抑制EMT；(iv)抑制或降低维持；(v)抑制或降低增殖；(vi)增加分化；(vii)抑制或降低形成；或(viii)降低过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞活力；具体是过度表达PD-L1的细胞。在一些实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；具体是癌症干细胞肿瘤细胞。
在一些实施方案中，式I的蛋白质分子与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性。在一些实施方案中，式I的蛋白质分子与SEQID NO：1的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在优选的实施方案中，本发明的蛋白质分子不包含甲硫氨酸。甲硫氨酸残基易于氧化，可导致纯度降低和溶液中活性损失。用于甲硫氨酸残基的合适替代氨基酸可以包括但不限于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、甘氨酸或丙氨酸；具体是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸或正缬氨酸；最尤其是正亮氨酸。
在本发明的蛋白质分子包含N和/或C-末端的一些实施方案中，本发明的蛋白质分子在C-末端具有伯、仲或叔酰胺、酰肼、羟酰胺或游离羧基，和/或在N-末端具有伯胺或乙酰胺。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子是环状肽，因此可以不包含N-末端和/或C-末端氨基酸残基。
本发明还考虑了蛋白质分子，所述蛋白质分子是SEQ ID NO：1-21中任一项的变体，具体是SEQ ID NO：1-18中任一项的变体。此类“变体”蛋白质分子包括衍生自SEQ IDNO：1-21中任一项的蛋白质分子，具体是通过将一个或多个氨基酸缺失或添加至蛋白质分子N-末端和/或C-末端、在蛋白质分子的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸、或在蛋白质分子的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：1-18中任一项的蛋白质分子。
本发明涵盖的变体蛋白质分子是生物活性的，也就是说它们仍然具有所期望的天然蛋白质分子的生物活性。这样的变体可以由例如遗传多态性或人为操纵而产生。
SEQ ID NO：1-21中任一项的蛋白质分子(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)可以按多种方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于这种操纵的方法是本领域公知的。例如，通过诱变编码SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)所示氨基酸序列的核酸，来制备SEQ ID NO：1-21中任一项的氨基酸序列变体(具体是SEQID NO：1-18中任一项)。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的。例如，参见Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：488-492)、Kunkel等人(1987,Methods inEnzymol,154：367-382)、美国专利号4,873,192、Watson,J.D等人(“Molecular Biology ofthe Gene”第四版Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.，1987)，及其中引用的参考文献。有关不影响目标蛋白质分子生物学活性的适当氨基酸取代的指南，可见于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)。用于筛选通过点突变或截短而制备的组合文库中基因产物的方法，以及用于筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选通过SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)蛋白质分子的组合诱变而产生的基因文库。递归集合诱变(REM)是可提高文库中功能性突变体频率的技术，可与筛选试验结合使用以鉴定活性变体(Arkin和Yourvan，1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering,6：327-331)。保守的取代，例如将一个氨基酸与另一个具有相似特性的氨基酸交换，可能是理想的，如下文更详细地讨论。
与亲本(如天然存在的或参考)氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1-21中任一项，具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)相比，本发明的变体蛋白质分子可以在其序列的各个位置包含保守的氨基酸取代基。“保守的氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。如下面详细讨论的，在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。
酸性的：残基在生理pH下由于质子的损失而具有负电荷，当肽处于生理pH下的水性介质中时，该残基被水性溶液吸引，使得在其所处的肽构象中寻找表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性的：残基在生理pH下或在其一个或两个pH单位内，由于结合质子而具有正电荷(例如，组氨酸)，当肽处于生理pH下的水性介质中时，该残基被水性溶液吸引，使得在其所处的肽构象中寻找表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电荷的：残基在生理pH下带电荷，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸，例如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
疏水性的：残基在生理pH下不带电荷，当肽处于生理pH下的水性介质中时，该残基被水性溶液排斥，使得在其所处的肽构象中寻找内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性的：残基在生理pH下不带电荷，但是当肽处于生理pH下的水性介质时，该残基不能被水性溶液充分排斥使其在所处的肽构象中寻找内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
本说明书还将某些氨基酸表征为“小”，因为即使缺乏极性基团，其侧链也不足够大以赋予疏水性。除脯氨酸外，“小”氨基酸是指当至少有一个极性基团位于侧链上时，具有四个或更少的碳，否则具有三个或更少的碳。具有小的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是特例，因为已知它对肽链二级构象具有作用。脯氨酸的结构不同于所有其他天然存在的氨基酸，因为它的侧链与α-氨基的氮以及α-碳键合。然而，几种氨基酸的相似性矩阵(例如，Dayhoff等人(1978)A model ofevolutionary change in proteins所公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵。用于确定距离关系的矩阵，可见于M.O.Dayhoff,(ed.),Atlas of protein sequence and structure,Vol.5,pp.345-358,National Biomedical Research Foundation,Washington DC；以及Gonnet等人(1992),Science,256(5062)：1443-1445)包括与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸属于同一类的脯氨酸。因此，出于本发明的目的，脯氨酸被分类为“小”氨基酸。
分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是任意的，因此本发明具体考虑的氨基酸已被分类为一类或另一类。大多数未具体命名的氨基酸都可以根据已知的行为进行分类。
氨基酸残基可进一步亚分类为环状或非环状、以及芳香族或非芳香族、相对于残基侧链取代基的自明分类、以及亚分类为小或大。如果残基包含总共四个或更少碳原子(包括羧基碳)，则被认为是小的，条件是存在额外的极性取代基；否则，残基包含总共三个或更少碳原子时，被认为是小的。当然，小氨基酸残基始终是非芳香族。根据它们的结构性质，氨基酸残基可以分为两类或更多类。对于天然存在的蛋白质氨基酸，根据该方案的亚分类在表1中给出。
表1：氨基酸的亚分类
Figure BDA0002680414600000221
Figure BDA0002680414600000231
保守性氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和正亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸的组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构上相关氨基酸的氨基酸类似取代不会对所得的本发明变体肽的性质产生重大影响。氨基酸变化是否会产生抑制或降低核可定位多肽(如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位的蛋白质分子，可以通过分析其活性来轻易确定。在表2中示例性和优选取代的标题下显示保守取代。一般而言，属于本发明范围内的氨基酸取代是通过选择在维持以下方面的作用中没有显著不同的取代来实现的：(a)取代区域中肽主链的结构，(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积(bulk)。引入取代后，筛选变体的生物活性。
表2：示例性和优选的氨基酸取代
Figure BDA0002680414600000241
或者，可以基于侧链的性质，将用于进行保守取代的相似氨基酸分为三组。第一组包括都具有带电荷侧链的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和正亮氨酸，如Zubay,Biochemistry第三版Wm.C.Brown Publishers(1993)所述。
因此，本发明的蛋白质分子中预测的非必需氨基酸残基通常被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基代替。备选地，可以例如通过饱和诱变，沿着本发明蛋白质分子的全部或部分编码序列随机引入突变，并且可以如本文所描述的那样，筛选所得突变体的亲本多肽活性，以鉴定保留活性的突变体。在诱变编码序列之后，可以重组表达编码的蛋白质分子并确定其活性。“非必需”氨基酸残基是可以改变自本发明实施方案的蛋白质分子的野生型序列，而没有丧失或实质性改变其一项或多项活性的残基。适当地，所述改变基本上不改变这些活性中的一种，例如所述活性是野生型活性的至少20％、40％、60％、70％或80％。相反，“必需的”氨基酸残基是这样的残基，当从本发明实施方案的蛋白质分子的野生型序列发生改变时，其导致亲本分子的活性丧失，使得仅存少于20％的野生型活性。
因此，本发明还考虑了SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子的变体，其中所述变体与所述亲本序列的区别在于一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代。通常，使用默认参数通过本文其他地方所述的序列比对程序所确定的，变体将显示与亲本或参考蛋白质分子序列(例如SEQ ID NO：1-21中任一项所示，具体是SEQ ID NO：1-18中任一项所示)具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性。理想地，使用默认参数通过本文所述的序列比对程序所确定的，变体将与亲本或参考蛋白质分子序列(例如SEQ ID NO：1-21中任一项所示，具体是SEQ ID NO：1-18中任一项所示)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。落入本发明的变体蛋白质分子范围内的SEQ IDNO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中的任一项)的变体，通常与亲本分子相差至少1个，但少于5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白质分子与SEQID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的对应序列相差至少1个，但少于5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白质分子的氨基酸序列包含式I所示的蛋白质分子。在具体的实施方案中，本发明的变体蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽(如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位。
如果序列比较需要比对，则通常为了最大的相似性或同一性而比对序列。从缺失或插入或不匹配中“圈出”的序列，通常被认为是差异。适当地，差异是非必需残基的差异或变化或保守取代。
在一些实施方案中，如下执行序列之间的序列相似性或序列同一性的计算：
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将这些序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，以实现最佳比对，出于比较目的，可以忽略非同源序列)。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的参考序列长度是参考序列长度的至少40％，更通常至少50％或60％，甚至更通常至少70％、80％、90％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置和第二序列中的相应位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的。对于氨基酸序列比较，当第一序列中的位置和第二序列的相应位置被相同或相似的氨基酸残基占据时(即保守取代)，则该分子在该位置是相似的。
两个序列之间的同一性百分比是各个位置上由序列共享的相同氨基酸残基数目的函数，其中考虑了空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些空位以进行两个序列的最佳比对。相比之下，两个序列之间的相似性百分比是各个位置上序列共享的相同和相似氨基酸残基数目的函数，其中要考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些空位以进行两个序列的最佳比对。
可以使用数学算法来完成序列的比较以及序列之间百分比同一性或相似性百分比的确定。在某些实施方案中，使用Needleman和Wünsch(1970，J.Mol.Biol.48：444-453)算法，确定氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比，该算法已纳入GCG软件包GAP程序中(Devereaux等人(1984)Nucleic Acids Research,12：387-395)，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，可以使用Meyers和Miller(1989，Cabios，4：11-17)的算法，确定氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比，该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12和空位罚分为4。
本发明还考虑了由多核苷酸序列编码的分离的或纯化的蛋白质分子，在本文定义的严谨条件下，具体是在中、高或非常高的严谨条件下，优选在高或非常高的严谨条件下，所述多核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)蛋白质分子的多核苷酸序列或其非编码链进行杂交。本发明还考虑了包含多核苷酸序列的分离的核酸分子，在本文定义的严谨条件下，具体是在中、高或非常高的严谨条件下，优选在高或非常高的严谨条件下，所述多核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQID NO：1-18中任一项)蛋白质分子的多核苷酸序列或其非编码链进行杂交。
如本文所用，术语“在严谨条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件，并且可以包括低严谨度、中等严谨度、高严谨度和非常高严谨度的条件。
可以在Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons,Inc.)具体是6.3.1-6.3.6章节中找到进行杂交反应的指南。可以使用水性和非水性方法。本文中提及的低严谨条件包括并涵盖至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M到至少约2M的盐，用于在42℃杂交，和至少约1M到至少约2M盐，用于在42℃下洗涤。低严谨条件还可能包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％十二烷基硫酸钠(SDS)，用于在65℃杂交，和(i)2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、5％SDS，用于在室温下洗涤。低严谨条件的一个实施方案包括：于6×SSC中在约45℃杂交，然后在至少50℃在0.2×SSC、0.1％SDS中进行两次洗涤(对于低严谨条件，可将洗涤温度增加至55℃)。中等严谨条件包括并涵盖至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，用于在42℃杂交，和至少约0.1M到至少约0.2M的盐，用于在55℃进行洗涤。中等严谨条件还包括1％的牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、5％SDS，用于在60-65℃下洗涤。中度严谨条件的一个实施方案包括于6×SSC中在约45℃下杂交，然后于0.2×SSC、0.1％SDS中在60℃下进行一次或多次洗涤。高严谨条件包括并涵盖至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺和约0.01M至约0.15M的盐，用于在42℃杂交，以及约0.01M至约0.02M的盐在55℃洗涤。高严谨条件也可包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS，用于在65℃杂交，和(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、1％SDS用于在超过65℃的温度下洗涤。高严谨条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃进行杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于65℃进行一次或多次洗涤。
在本发明的一些方面，提供了由多核苷酸序列编码的本发明分离或纯化的蛋白质分子，在高严谨条件下所述多核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ IDNO：1-18中任一项)所示蛋白质分子的多核苷酸序列或其非编码链进行杂交。在某些实施方案中，本发明的分离的或纯化的蛋白质分子由多核苷酸序列编码，在非常高严谨条件下该多核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)所示蛋白质分子的多核苷酸序列或其非编码链杂交。非常高严谨条件的一个实施方案包括在0.5M磷酸钠、7％SDS中于65℃杂交，然后于0.2×SSC、1％SDS在65℃进行一次或多次洗涤。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白质分子的氨基酸序列包括式I所示氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明的变体蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位。
其他严谨条件在本领域中是众所周知的，并且本领域技术人员将认识到可以操纵各种因素来优化杂交的特异性。最终洗涤的严谨度的优化可用于确保高度杂交。有关详细的示例，请参见Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons,Inc.)具体是2.10.1至2.10.16页以及Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Press)具体是1.101至1.104章节。
尽管严谨洗涤通常在约42℃至68℃的温度下进行，但本领域技术人员将理解，其他温度可能适合于严谨条件。最大杂交率通常发生在低于Tm约20℃至25℃的温度下，以形成DNA-DNA杂交体。在本领域中众所周知，Tm是解链温度，或两个互补的多核苷酸序列解离的温度。估计Tm的方法在本领域中是众所周知的(见Ausubel(1998)等人CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.)2.10.8页)。通常，完全匹配的DNA双链体的Tm可以通过下式近似预测：
Tm＝81.5+16.6(log10 M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)–(600/长度)
其中：M为Na+的浓度，优选在0.01M至0.4M的范围；％G+C为鸟苷和胞嘧啶碱基的总和占碱基总数的百分比，范围为30％至75％G+C；％甲酰胺是甲酰胺浓度占体积的百分比；长度是DNA双链体中碱基对的数目。随机错配碱基对的数目每增加1％，双链体DNA的Tm就会降低大约1℃。对于高严谨度，洗涤通常在Tm–15℃进行，或对于中等严谨度，在Tm–30℃进行洗涤。
在杂交过程的一个示例中，将含有固定的DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％BSA)、0.1％SDS和200mg/mL变性鲑鱼精DNA)中在42℃过夜杂交。然后对膜进行两次连续的中度严谨洗涤(即2×SSC、0.1％SDS在45℃下15分钟，然后2×SSC、0.1％SDS在50℃下15分钟)，然后进行两次连续的严谨度更高的洗涤(即0.2×SSC、0.1％SDS在55℃下12分钟，然后在0.2×SSC和0.1％SDS溶液中在65-68℃下12分钟)。
本发明的蛋白质分子还包括蛋白质分子，其包含具有修饰侧链的氨基酸，在肽合成过程中引入非天然氨基酸残基和/或其衍生物，以及使用交联剂和其他对本发明蛋白质分子的构象施加限制的方法。侧链修饰的示例包括氨基的修饰，例如通过用乙酸酐酰化；用琥珀酐和四氢邻苯二甲酸酐进行氨基的酰化；用亚氨酰乙酸甲酯进行酰胺化；用氰酸酯进行氨基的甲氨酰化；用5-磷酸吡哆醛进行赖氨酸的吡啶氧化，然后用硼氢化钠还原；通过醛反应进行还原烷基化，然后用硼氢化钠还原；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)进行氨基的三硝基苄基化。
可以通过形成O-酰基异脲来激活碳二亚胺、然后随后衍生化为例如相应的酰胺，来修饰羧基。
可通过与试剂(如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛)形成杂环缩合产物来修饰精氨酸残基的胍基。
在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的示例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、Nδ-乙酰基-L-鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸、Nε-乙酰基-L-赖氨酸、Nε-甲基-L-赖氨酸、Nε-二甲基-L-赖氨酸、Nε-甲酰基-L-赖氨酸和/或氨基酸的D-异构体。表3中列出了本发明所考虑的非天然氨基酸。
表3：示例性非天然氨基酸
Figure BDA0002680414600000281
Figure BDA0002680414600000291
Figure BDA0002680414600000301
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包含至少一种非天然氨基酸。在具体的实施方案中，本发明的蛋白质分子包含至少一个正亮氨酸残基。
如果存在的话，可以将另外的氨基酸或其他取代基添加到本发明的蛋白质分子的N或C-末端。例如，本发明的蛋白质分子可以形成在N-末端和C-末端中的一个或两个末端都添加了额外的氨基酸的较长序列的一部分。
对于本发明的具体用途和方法，可能需要具有高稳定性水平的蛋白质分子，例如，以增加蛋白质分子在受试者中的半衰期。因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包含稳定部分(moiety)或保护部分。稳定部分或保护部分可以偶联在肽上的任何点。合适的稳定或保护部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚糖或封端部分，包括乙酰基、焦谷氨酸或氨基。在优选的实施方案中，乙酰基和/或焦谷氨酸与蛋白质分子的N-末端氨基酸残基偶联。在具体的实施方案中，蛋白质分子的N-末端是乙酰胺。在优选的实施方案中，氨基与蛋白质分子的C-末端氨基酸残基偶联。在具体的实施方案中，蛋白质分子在C-末端具有伯、仲或叔酰胺、酰肼或羟酰胺；具体而言在C-末端具有伯酰胺。在优选的实施方案中，PEG与蛋白质分子的N-末端或C-末端氨基酸残基偶联、或通过赖氨酸侧链或其他适当修饰侧链的氨基偶联，具体是通过N-末端氨基酸残基，例如，通过残基的氨基，或通过赖氨酸侧链的氨基偶联。
在优选的实施方案中，本发明的蛋白质分子在C-末端具有伯酰胺或游离羧基(酸)，在N-末端具有伯胺或乙酰胺。
尽管本发明的蛋白质分子可固有地穿透膜，但可通过膜穿透部分与蛋白质分子的缀合而进一步增加膜穿透。因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包括膜穿透部分。膜穿透部分可以偶联在蛋白质分子上的任何点。合适的膜穿透部分包括脂质部分、胆固醇和蛋白质，例如细胞穿透肽和聚阳离子肽；具体是脂质部分。
合适的细胞穿透肽可包括例如在US20090047272、US20150266935和US20130136742中描述的肽。因此，合适的细胞穿透肽可包括但不限于碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽和含有Arg和Lys残基非天然类似物的碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽，例如YGRKKRPQRRR(HIV TAT47-57；SEQ ID NO：22)、RRWRRWWRRWWRRWRR(W/R；SEQ ID NO：23)、CWK18(AlkCWK18；SEQ ID NO：24)、K18WCCWK18(Di-CWK18；SEQ ID NO：25)、WTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan；SEQ ID NO：26)、GLFEALEELWEAK(DipaLytic；SEQ ID NO：27)、K16GGCRGDMFGCAK16RGD(K16RGD；SEQ ID NO：28)、K16GGCMFGCGG(P1；SEQ ID NO：29)、K16ICRRARGDNPDDRCT(P2；SEQ ID NO：30)、KKWKMRRNQFWVKVQRbAK(B)bA(P3；SEQ ID NO：31)、VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA(P3a；SEQ ID NO：32)、IGRIDPANGKTKYAPKFQDKATRSNYYGNSPS(P9.3；SEQ ID NO：33)、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1；SEQ ID NO：34)、PLAEIDGIELTY(Plae；SEQ ID NO：35)、K16GGPLAEIDGIELGA(Kplae；SEQ ID NO：36)、K16GGPLAEIDGIELCA(cKplae；SEQ ID NO：37)、GALFLGFLGGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(MGP；SEQ IDNO：38)、WEAK(LAKA)2-LAKH(LAKA)2LKAC(HA2；SEQ ID NO：39)、(LARL)6NHCH3(LARL46；SEQ IDNO：40)、KLLKLLLKLWLLKLLL(Hel-11-7；SEQ ID NO：41)、(KKKK)2GGC(KK；SEQ ID NO：42)、(KWKK)2GCC(KWK；SEQ ID NO：43)、(RWRR)2GGC(RWR；SEQ ID NO：44)、PKKKRKV(SV40NLS7；SEQID NO：45)、PEVKKKRKPEYP(NLS12；SEQ ID NO：46)、TPPKKKRKVEDP(NLS12a；SEQ ID NO：47)、GGGGPKKKRKVGG(SV40 NLS13；SEQ ID NO：48)、GGGFSTSLRARKA(AV NLS13；SEQ ID NO：49)、CKKKKKKSEDEYPYVPN(AV RME NLS17；SEQ ID NO：50)、CKKKKKKKSEDEYPYVPNFSTSLRARKA(AVFP NLS28；SEQ ID NO：51)、LVRKKRKTEEESPLKDKDAKKSKQE(SV40 N1 NLS24；SEQ ID NO：52)、以及K9K2K4K8GGK5(Loligomer；SEQ ID NO：53)；HSV-1被膜蛋白VP22；融合有核输出信号(NES)的HSV-1被膜蛋白VP22r；突变的大肠杆菌肠毒素B亚基EtxB(H57S)；脱毒的毒素A(ETA)；HIV-1Tat蛋白的蛋白转导结构域、GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：54)；果蝇(Drosophila melanogaster)触角足结构域Antp(氨基酸43-58)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQID NO：55)；Buforin II、TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO：56)；hClock-(氨基酸35-47)(人类Clock蛋白DNA结合肽)、KRVSRNKSEKKRR(SEQ ID NO：57)；MAP(两亲性模型肽)、KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO：58)；K-FGF、AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：59)；Ku70-衍生肽，其包含选自以下的肽：VPMLKE(SEQ ID NO：60)、VPMLK(SEQ ID NO：61)、PMLKE(SEQ IDNO：62)或PMLK(SEQ ID NO：63)；朊蛋白，小鼠Prpe(氨基酸1-28)，MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP(SEQ ID NO：64)；pVEC，LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO：65)；Pep-I，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO：66)；SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ IDNO：67)；Transportan，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：68)；Transportan-10，AGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：69)；CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-巯基乙胺化(SEQ ID NO：70)；Pep-7，SDLWEMMMVSLACQY(SEQ ID NO：71)；HN-1，TSPLNIHNGQKL(SEQ IDNO：72)；VT5，DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD(SEQ ID NO：73)；或pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：74)。
在优选的实施方案中，膜穿透部分是脂质部分，例如C10-C20脂肪酰基，具体是硬脂酰基(十八烷酰基；C18)、棕榈酰基(十六烷酰基；C16)或豆蔻酰基(十四烷酰基；C14)；最尤其是豆蔻酰基。在优选的实施方案中，膜穿透部分偶联至N或C-末端氨基酸残基，或通过蛋白质分子赖氨酸侧链或其他适当修饰侧链的氨基偶联，具体偶联至蛋白质分子的N-末端氨基酸残基或通过赖氨酸侧链的氨基偶联。在具体的实施方案中，膜穿透部分通过N-末端氨基酸残基的氨基进行偶联。
因此，在本发明的另一个方面，提供了由式II所示分离或纯化的蛋白质分子：
M-P (II)
其中：
M是膜穿透部分；和
P是由式I所示分离的或纯化的蛋白质分子。
在一些实施方案中，M偶联在蛋白质分子上的任何点；具体是偶联至N或C-末端氨基酸残基，或通过蛋白质分子赖氨酸侧链或其他适当修饰侧链的氨基偶联，更具体是蛋白质分子的N-末端的氨基酸残基或通过赖氨酸侧链的氨基偶联；最尤其是，通过N-末端氨基酸残基的氨基偶联。式I所示合适的膜穿透部分和蛋白质分子的实施方案如本文所述。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子是环状分子。不希望被理论所束缚，认为肽的环化降低了肽对降解的敏感性。在具体的实施方案中，使用N至C环化(头至尾环化)，优选通过酰胺键，将蛋白质分子环化。这种蛋白质分子不具有N或C-末端氨基酸残基。在具体的实施方案中，蛋白质分子具有酰胺环化的肽主链。在其他实施方案中，使用侧链至侧链环化，优选通过二硫键、二硒键、硒硫键、硫醚键(如羊毛硫氨酸(lanthionine)键)、硒醚键、三唑键、内酰胺键或二甲基烯键将肽环化；具体是通过二硫键。
在一些实施方案中，使用连接部分将N-末端和C-末端连接。所述连接部分可以是肽接头，使得环化产生酰胺环化的肽主链。连接部分的肽序列内的变化是可能的，使得可以修饰连接部分以改变蛋白质分子的物理化学性质并潜在地降低本发明的蛋白质分子的副作用或改善分子的治疗用途，例如通过提高稳定性。连接部分将具有合适的长度以跨越蛋白质分子的N-末端和C-末端之间的距离，而基本上不改变蛋白质分子的结构构象，例如，肽连接部分长度可以在2至10个氨基酸残基之间。在一些实施方案中，可能需要更长或更短的肽连接部分。
本发明的蛋白质分子可以是盐或前药的形式。本发明的蛋白质分子的盐优选是药学上可接受的，但是应当理解非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内。
本发明的蛋白质分子可以是晶体形式和/或溶剂化物(例如水合物)的形式。可以使用本领域已知的方法进行溶剂化。
可以使用重组DNA技术或通过化学合成来制备本发明的肽。
在一些实施方案中，使用重组DNA技术制备本发明的蛋白质分子。例如，可以通过包括以下步骤的方法来制备本发明的蛋白质分子：(a)制备包含编码本发明的蛋白质分子并且与调节元件可操作连接的多核苷酸序列的构建体；(b)将构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达多核苷酸序列从而产生本发明的编码的蛋白质分子；和(d)从宿主细胞中分离出本发明的蛋白质分子。可以使用例如Klint等人(2013)PLOS One,8(5)：e63865；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarbourPress)具体是16和17章节；Ausubel等人(1998)Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley and Sons,Inc.)具体是10和16章；Coligan等人(1997)CurrentProtocols in Protein Science(John Wiley and Sons,Inc.)具体是1、5和6章；以及US5,976,567中所述的标准方法重组制备本发明的蛋白质分子，上述文献全部内容通过引用并入本文。
因此，本发明还考虑了编码本发明蛋白质分子的核酸分子。因此，在本发明的另一方面，提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列、或与编码本发明蛋白质分子的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，所述本发明的蛋白质分子例如式I所示的蛋白质分子、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)或本文所述的变体蛋白质分子。
本发明的分离的核酸分子可以是DNA或RNA。当核酸分子为DNA形式时，它可以是基因组DNA或cDNA。本发明的核酸分子的RNA形式通常是mRNA。
尽管通常分离核酸分子，但是在一些实施方案中，可以将核酸分子整合到或连接到或融合或结合到其他遗传分子(例如表达载体)。通常，表达载体包括可操作地连接至多核苷酸序列的转录和翻译调控核酸。因此，在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，其包含编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列，所述本发明的蛋白质分子为例如式I所示的蛋白质分子、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)或本文所述的变体蛋白质分子。
典型的载体包含可用于调节核酸表达的转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列和启动子。载体任选地包含通用表达盒，该通用表达盒包含至少一个独立的终止子序列、允许该盒在真核生物、原核生物或两者中复制的序列(如穿梭载体)和用于原核和真核系统的选择标记。载体可能适合在原核生物、真核生物或两者中复制和整合。参见Giliman和Smith(1979)Gene,8：81-97；Roberts等人(1987)Nature,328：731-734；Berger和Kimmel,Guideto Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,第152卷,Academic Press,Inc.，San Diego,Calif.(Berger)；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning–LaboratoryManual(第二版)第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology,eds.，CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.的联合企业(增刊)，其全部内容通过引用并入本文。
含有来自真核病毒(例如逆转录病毒)的调节元件的表达载体通常用于在真核细胞中表达核酸序列。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，源自EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、以及允许蛋白质在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中对表达有效的启动子的指导下得以表达的任何其他载体。
尽管可以使用多种载体，但是应当注意，由于病毒载体转染靶标细胞并整合到靶标细胞基因组中的效率很高，因此病毒表达载体可用于修饰真核细胞。这种类型的示例性表达载体可以衍生自病毒DNA序列，包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒，例如B、C和D逆转录病毒以及泡沫病毒(spumavirus)和修饰的慢病毒。用于转染动物细胞的合适表达载体描述于，例如Wu和Ataai(2000)Curr.Opin.Biotechnol.，11(2)：205-208；Vigna和Naldini(2000)J.Gene Med.，2(5)：308-316；Kay等人(2001)Nat.Med.，7(1)：33-40；Athanasopoulos等人(2000)Int.J.Mol.Med.，6(4)：363-375；以及Walther和Stein(2000)Drugs,60(2)：249-271，其全部内容通过引用并入本文。
表达载体的多肽或肽编码部分可以包含天然存在的序列或其变体，其已经使用重组技术进行了工程改造。在一个变体的示例中，使用利用例如国际公开WO99/02694和WO00/42215中所示在具体哺乳动物细胞或组织类型中密码子使用偏倚或密码子翻译效率的方法，对编码本发明蛋白质分子的多核苷酸的密码子组成进行修饰以允许本发明的蛋白质分子在哺乳动物宿主中的表达增强。简而言之，后一种方法是基于以下观察结果：不同密码子的翻译效率在不同细胞或组织之间不同，并且可以利用这些差异以及基因的密码子组成来调节蛋白质在具体细胞或组织类型中的表达。因此，对于密码子优化的多核苷酸的构建，至少一个现有的亲本多核苷酸的密码子被替换为同义密码子，该同义密码子在靶标细胞或组织中的翻译效率高于其所替换的现有密码子。尽管优选用具有较高翻译效率的同义密码子替换亲本核酸分子的所有现有密码子，但这不是必需的，因为即使部分替换也可以实现表达增加。适当地，替换步骤影响亲本多核苷酸的现有密码子的5％、10％、15％、20％、25％、30％，更优选35％、40％、50％、60％、70％或更多。
表达载体与其中被引入该表达载体的细胞相容，使得本发明的蛋白质分子可被该细胞表达。通过任何合适的方式将表达载体引入细胞，这将取决于表达载体的具体选择和所用细胞。这种引入方式是本领域技术人员众所周知的。例如，利用接触(例如对于病毒载体的情况)、电穿孔、转化、转导、缀合或三亲交配、转染、与阳离子脂质的感染膜融合、DNA包被的微粒的高速轰击、用磷酸钙-DNA沉淀的孵育、直接显微注射到单细胞内等进行引入。其他方法也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。或者，通过阳离子脂质例如脂质体引入载体。此类脂质体可商购获得(例如，
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LipofectamineTM等，由LifeTechnologies、Gibco BRL、Gaithersburg,Md.提供)。
在一些实施方案中，可通过引入包含编码本发明蛋白质分子的多核苷酸序列的一个或多个表达构建体(例如表达载体)而在细胞内产生本发明的蛋白质分子。
本发明考虑在宿主细胞中(例如哺乳动物细胞)重组生产本发明的蛋白质分子(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞或人胚肾(HEK293)细胞、酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)、酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母细胞(Schizosaccharomyces pombe)、多形汉逊酵母细胞(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母细胞(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母细胞(Yarrowia lipolytica)、或Arxula adeninivorans细胞)或细菌细胞(例如大肠杆菌细胞(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或荧光假单胞菌细胞(Pseudomonas fluorescens))。
对于治疗应用，本发明还考虑在受试者体内细胞中产生本发明的蛋白质分子，例如过表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞，例如脊椎动物细胞，具体是哺乳动物或禽细胞，具体是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，使用标准肽合成方法制备本发明的蛋白质分子，例如溶液合成或固相合成。本发明的蛋白质分子的化学合成可以手动或使用自动合成仪进行。例如，可使用Boc或Fmoc化学方法通过固相肽合成法合成线性肽，如Merrifield(1963)J Am ChemSoc,85(14)：2149-2154；Schnolzer等人(1992)Int J Pept Protein Res,40：180-193以及Cardoso等人(2015)Mol Pharmacol,88(2)：291-303所述，其全部内容通过引用并入本文。脱保护后，并从固体支持物上切割，使用合适的方法(例如制备色谱法)纯化线性肽。
在其他实施方案中，本发明的蛋白质分子可以被环化。可以使用例如Davies(2003)J Pept Sci，9：471-501中描述的几种技术来进行环化，其全部内容通过引用并入本文。在具体的实施方案中，使用涉及Boc化学的固相肽合成法合成线性肽，N-末端以半胱氨酸残基起始，C-末端以硫酯结尾。脱保护后，从树脂上裂解，通过硫代内酯中间体将肽环化，随后将其重排为胺环化的肽。
4.药物组合物
根据本发明，蛋白质分子可用于组合物和方法中，用于治疗或预防涉及核可定位多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位的病症，例如癌症。
因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子可以是药物组合物的形式，其中所述药物组合物包含本发明的蛋白质分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的蛋白质分子可以以中性或盐形式配制成药物组合物。
如本领域技术人员将理解的，药学上可接受的载体或稀释剂的选择将取决于施用途径以及病症的性质和待治疗的受试者。具体的载体或递送系统和施用途径可以由本领域技术人员容易地确定。应当仔细选择载体或输送系统和施用途径，以确保在制剂制备过程中蛋白质分子的活性不被耗尽，并且蛋白质分子能够完整到达作用位点。本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、直肠、局部、鼻内、眼内、透粘膜、肠(intestinal)、肠(enteral)、肌内、皮下、髓内、鞘内、心/脑室内、脑内、阴道内、膀胱内、静脉内或腹膜内施用。
适用于注射用途的药物形式包括无菌注射溶液或分散液以及用于制备无菌注射溶液的无菌粉末。这样的形式在制造和储存条件下应该是稳定的，并且可以保存以防还原、氧化和微生物污染。
本领域技术人员将能够使用常规方法容易地确定用于本发明的蛋白质分子的合适制剂。制剂和施用技术可参见，例如Remington(1980)Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.，Easton,Pa.，最新版；以及Niazi(2009)Handbook ofPharmaceutical Manufacturing Formulations,Informa Healthcare,New York第二版，其全部内容通过引用并入。
优选的pH范围和合适的赋形剂(例如抗氧化剂)的确定是本领域常规的，例如，如Katdare和Chaubel(2006)Excipient Development for Pharmaceutical,Biotechnologyand Drug Delivery Systems(CRC Press)中所述。缓冲液系统通常用于提供所需范围的pH值，可能包括但不限于羧酸缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和琥珀酸盐；甘氨酸；组氨酸；磷酸盐；三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)；精氨酸；氢氧化钠；谷氨酸盐；和碳酸盐缓冲液。合适的抗氧化剂包括但不限于酚类化合物，例如丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基茴香醚；维生素E；抗坏血酸；还原剂，例如甲硫氨酸或亚硫酸盐；金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；盐酸半胱氨酸；亚硫酸氢钠；偏亚硫酸氢钠；亚硫酸钠；抗坏血酸棕榈酸酯；卵磷脂；没食子酸丙酯；和α-生育酚。
对于注射，本发明的蛋白质分子可以在水性溶液中配制，合适地在生理相容的缓冲液中，例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于透粘膜施用，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域公知的。
本发明的组合物可以配制为以含有可接受的稀释剂(例如盐水和无菌水)的液体形式施用，或者可以含有赋予所需的质地、稠度、粘度和外观的可接受的稀释剂或载体的洗剂、霜剂或凝胶剂形式形式施用。可接受的稀释剂和载体是本领域技术人员熟悉的，包括但不限于乙氧基化和非乙氧基化表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、pH平衡剂、纤维素衍生物、乳化剂(例如非离子有机和无机碱)、防腐剂、蜡酯、类固醇、甘油三酸酯、磷脂(例如卵磷脂和脑磷脂)、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水羊毛脂衍生物和亲水蜂蜡衍生物。
可替代地，使用本领域公知的药学上可接受的载体，可以容易地将本发明的蛋白质分子配制为适合口服施用的剂量，这也是本发明的实践所考虑的。此类载体使本发明的生物活性剂能够配制成剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等，以供待治疗的患者口服摄取。这些载体可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的本发明的蛋白质分子的水性溶液。另外，本发明的蛋白质分子的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油、或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度的溶液。
可以通过在适当的溶剂中将所需量的活性化合物与如上所述的如所需的其他赋形剂混合，然后灭菌(例如过滤)来制备无菌溶液。通常，通过将各种灭菌的活性化合物掺入到无菌载剂中来制备分散剂，所述无菌载剂含有如上所述的基本分散介质和所需的赋形剂。可通过将包含上述活性化合物和其他所需赋形剂的无菌溶液进行真空干燥或冷冻干燥来制备无菌干粉。
可以通过将本发明的蛋白质分子与固体赋形剂组合，并在加入合适的助剂后(如果需要)加工颗粒的混合物来获得片剂或糖衣丸芯，从而获得口服使用的药物制剂。合适的赋形剂具体是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。这样的组合物可以通过任何药学方法来制备，但是所有方法都包括使一种或多种如上所述的治疗剂与构成一种或多种必要成分的载体进行联合的步骤。通常，可以以本身已知的方式制造本发明的药物组合物，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、浸出、乳化、包囊、包埋或冻干过程。
以具有合适的包衣的形式，提供糖衣丸芯。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以进行识别或表征颗粒剂量的不同组合。
可以口服使用的药物包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以包含与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。
本发明的蛋白质分子可以掺入调节释放的(modified-release)制备物和制剂中，例如聚合物微球制剂和基于油或凝胶的制剂。
在具体的实施方案中，本发明的蛋白质分子可以局部而不是全身性方式施用，例如通过将蛋白质分子通常以贮库或缓释制剂的形式直接注射入组织中，该组织优选为皮下或网膜组织。
此外，可以在靶向药物递送系统中施用本发明的蛋白质分子，例如适合靶向细胞或组织并被其选择性吸收的颗粒。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包含在载剂中、或以其他方式与载剂相关，所述载剂选自脂质体、胶束、树状聚合物(dendrimer)、可生物降解的颗粒、人工DNA纳米结构、脂基纳米颗粒和碳纳米颗粒或金纳米颗粒。在这种类型的说明性示例中，载剂选自聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乙二醇)(PEG)、PLA-PEG共聚物及其组合。
在局部施用或选择性摄取的情况下，试剂的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
以剂量单位形式配制组合物是有利的，以易于剂量的施用和均匀。本发明新型剂量单位形式的确定取决于或直接依赖于活性物质的独特特性、要达到的具体治疗效果、以及本领域中复合活性物质来治疗活受试者疾病的固有限制，如本文所详细公开的，受试者患有身体健康受损的疾病病症。
虽然本发明的蛋白质分子可以是施用于受试者的唯一活性成分，但是与所述蛋白质分子同时施用其他癌症疗法也在本发明的范围内。例如，本文所述的式I所示蛋白质分子，SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)或变体可以与一种或多种癌症疗法同时施用，癌症疗法的非限制性示例包括放射疗法、手术、化学疗法、激素消融疗法、促凋亡疗法和免疫疗法。本发明的蛋白质分子可以在用癌症疗法治疗之前进行治疗性使用，可以在癌症疗法之后进行治疗性使用，或者可以与癌症疗法一起进行治疗性使用。
合适的放射疗法包括引起DNA损伤的放射和波，例如γ照射、X射线、UV照射、微波、电子发射和放射性同位素。通常，可以通过用上述形式的辐射，局部照射肿瘤部位来实现治疗。所有这些因素最有可能导致对DNA、对DNA的前体、DNA的复制和修复、以及染色体的组装和维持产生广泛破坏。
X射线的剂量范围从长期(例如3-4周)每日剂量的50-200伦琴到单次剂量的2000-6000伦琴。放射性同位素的剂量范围差异很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型、以及赘生细胞的吸收。合适的放射疗法可能包括但不限于适形(conformal)外部束放射疗法(在4-8周内分次给予50-100Gray)、单次或分次高剂量近距离放射疗法、永久性间质近距离放射疗法和全身放射性同位素(如锶89)。在一些实施方案中，放射疗法可以与放射增敏剂一起施用。合适的放射增敏剂可包括但不限于乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑(etanidazole)、氟酚(fluosol)、米索尼唑(misonidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、替莫泊芬(temoporfin)和替拉帕明(tirapazamine)。
合适的化学治疗剂可包括但不限于抗增殖/抗肿瘤药及其组合，包括烷基化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)、抗代谢药(例如抗叶酸药物，例如氟吡啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、甲氨蝶呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷和羟基脲)、抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素，如亚德里亚霉素、博莱霉素、多柔比星、多柔霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、放线菌素D和光神霉素)、抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱，长春地辛和长春瑞滨，以及紫杉烷类，如紫杉醇和多西紫杉醇)、以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；细胞抑制剂，如抗雌激素(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬)、雌激素受体下调剂(例如氟维司汀)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)、UH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏洛唑和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂(如非那雄胺)；抑制癌细胞侵袭的试剂(例如金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能抑制剂)；生长因子功能抑制剂，例如这种抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法呢基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生生长因子家族的抑制剂，例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子作用的抗血管生成剂(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，例如国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856和WO98/13354中公开的化合物)以及通过其他机制起作用的化合物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能抑制剂和血管生成抑制素)；依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂，例如帕博西尼(palbociclib)、阿贝西尼(abemaciclib)、瑞博西尼(ribociclib)和alvociclib；血管损伤剂，例如康普瑞汀A4和国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；反义疗法，例如针对上述靶标的那些，例如ISIS2503，抗-ras反义疗法；以及基因治疗方法，包括例如替换异常基因的方法，例如异常p53或异常GDEPT(基因定向酶(gene directed enzyme)前药疗法)的方法，例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及增加患者对化学疗法或放射疗法(如多药抗性基因疗法)耐受性的方法。
合适的免疫疗法可以包括但不限于增加患者肿瘤细胞免疫原性的离体和体内方法，例如用细胞因子(其包括白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)转染；降低T细胞无响应性的方法；使用转染的免疫细胞(如细胞因子转染的树突状细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；以及使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于免疫效应细胞和分子的使用来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为疗法的效应物起到作用，或也可以募集其他细胞来实际促进细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学疗法药、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，抗体仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，其直接或间接与恶性细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-L1的分子，包括但不限于抗PD-L1抗体，其非限制性示例包括阿特朱单抗、阿维鲁单抗、杜鲁伐单抗、BMS-936559、BMS-935559、WO2013/173223A1、WO2013/079174A1、WO2010/077634A1、WO2011/066389A1、CN101104640A、WO2010/036959A2、WO2007/005874A2、WO2004/004771A1、WO2006/133396A2、WO2013/181634A2、WO2012/145493A1中所述的抗体、克隆EH12和克隆29E.2A3；CA-170；CA-327；BMS-202(N-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]-乙酰胺)；BMS-8(1-[[3-溴-4-[(2-甲基[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶羧酸)；Chang等人(2015)Angew Chem Int Ed Engl,54(40)：11760-11764中描述的肽，具体是(D)PPA-1；AUNP-12；以及WO2014/151634A1中描述的肽，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-1的分子，包括但不限于抗PD-1抗体，其非限制性示例包括纳武单抗、派姆单抗、BGB-A317、在WO2016/106159A1、WO2009/114335A2、WO2004/004771A1、WO2013/173223A1、WO2015/112900A1、WO2008/156712A1、WO2011/159877A2、WO2010/036959A2、WO2010/089411A2、WO2006/133396A2、WO2012/145493A1、WO2002/078731A1中描述的抗体、抗小鼠PD-1抗体克隆J43、抗小鼠抗体克隆RMP1-14、ANB011(TSR-042)、AMP-514(MEDI0680)、WO2006/121168A1、WO2001/014557A1、WO2011/110604A1、WO2011/110621A1、WO2004/072286A1、WO2004/056875A1、WO2010/036959A2、WO2010/029434A1；以及WO2013/022091A1；AMP-224；WO2011/082400A2中所述的化合物；US6,808,710B1中描述的分子和抗体；WO2013/019906A1中描述的分子和抗体；WO2003/011911A1中描述的分子；以及WO2013/132317A1中描述的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-L2的分子，包括但不限于抗PD-L2抗体，其非限制性示例包括WO2010/036959A2中描述的抗体，其全部内容通过引用并入本文；以及rHigM12B7。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向CTLA-4的分子，包括但不限于抗CTLA-4抗体，例如伊匹单抗、曲美单抗、WO00/37504A2、WO01/14424A2、US2003/0086930A1中描述的抗体；以及WO2006/056464A2中描述的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
其他癌症疗法的示例包括本草疗法、冷冻疗法、毒素疗法或促凋亡疗法。本领域技术人员将理解，该列表并不详尽地涵盖可用于癌症和其他增生性病变的治疗方式的类型。
众所周知，化学疗法和放射疗法靶向快速分裂的细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗几种形式的癌症的一部分而提供，旨在通过治愈性治疗减缓其进程或逆转疾病症状。然而，这些癌症治疗可能导致免疫受损的状态和随后的病原体感染，因此本发明还扩展到组合疗法，其采用式I的蛋白质分子、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)或本文所述的变体、癌症疗法和抗感染剂，其中抗感染剂能有效对抗感染的发展或由癌症疗法导致的免疫受损状态而发展成感染的风险增加。抗感染药适当地选自：抗微生物剂，其可包括但不限于杀死或抑制微生物(如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等)生长的化合物，因此包括抗生素、抗阿米巴药、抗真菌剂、抗原生动物、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。抗感染药在其范围内还包括驱虫药和杀线虫剂。示例性抗生素包括喹诺酮药物(例如氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、奥索利酸、培氟沙星、罗索沙星、替马沙星、托氟沙星、司帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星；吉米沙星；和加雷沙星)、四环素、糖基环素和恶唑烷酮(例如金霉素、地美环素、多西环素、莱美环素、甲环素、米诺环素、土霉素、四环素、替加环素；利奈唑胺、依哌唑胺)、糖肽、氨基糖苷(例如阿米卡星、阿贝卡星、布替罗星、地贝卡星、福提霉素、庆大霉素、卡那霉素、莫诺霉素、奈替米星、核生霉素、西索米星、壮观霉素、链霉素、妥布霉素)、β-内酰胺(例如亚胺培南、美罗培南、比阿培南、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢羟唑、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑啉、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑喃、头孢乙腈、头孢氨苄、头孢血糖素、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢拉定、cefinetazole、头孢西丁、头孢替坦、氨曲南、卡芦莫南(carumonam)、氟氧头孢(flomoxef)、拉氧头孢(moxalactam)、美西林(amdinocillin)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、苄基青霉素、卡非西林(carfecillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素G、哌拉西林(piperacillin)、磺苄西林(sulbenicillin)、替莫西林、替卡西林、头孢地烯、SC004，KY-020、头孢地尼、头孢地丁、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰(cefozopran)、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)、利福霉素、大环内酯(例如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、竹桃霉素、罗他霉素(rokitamycin)、罗沙米星(rosaramicin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin))、酮内酯(例如泰利霉素、塞红霉素(cethromycin))、香豆霉素、林可酰胺(例如克林霉素、林可霉素)和氯霉素。
说明性抗病毒药包括硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、氨普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉韦定、地达诺新(didanosine)、依法韦伦、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦(nelfinavirmesylate)、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
合适的抗阿米巴药或抗原生动物剂，包括但不限于阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝唑和喷他脒羟乙磺酸盐(pentamidine isethionate)。驱虫药可以选自苯甲唑、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)、阿苯达唑、伊维菌素和噻苯达唑中的至少一种。示例性的抗真菌剂可以选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、超细灰黄霉素、超微细灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和盐酸特比萘芬。合适的抗疟药包括但不限于盐酸氯喹、磷酸氯喹、强力霉素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶、和乙胺嘧啶与磺胺多辛。抗结核药包括但不限于氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷丁和硫酸链霉素。
如前所述，为了方便和有效地施用，可以将有效量的蛋白质分子与合适的药学上可接受的载体，以剂量单位形式进行复合。在一些实施方案中，单位剂型形式可以以约0.25μg至约2000mg范围内的量包含本发明的活性肽。本发明的活性肽可以以约0.25μg至约2000mg/mL载体的量存在。在药物组合物包含一种或多种其他活性成分的实施方案中，通过参考所述成分的常规剂量和施用方式来确定所述剂量。
5.方法
本发明人已经确定了包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列的蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加了核可定位多肽在细胞内的核定位。具体地，本发明人发现与PD-L1中乙酰化位点相对应的蛋白质分子，具体是与PD-L1第255至271位残基对应的蛋白质分子，降低或抑制PD-1、PD-L1和PD-L2的核定位。本发明人认为，本发明的蛋白质分子可用于改变以下中至少一种的方法中：过度表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞的形成、增殖、维持、EMT、MET或活力，并且可用于治疗或预防涉及受试者中PD-1、PD-L1和/或PD-L2核定位的病症，例如癌症。
在不希望受理论束缚的情况下，发明人已经确定了具体的核可定位多肽(例如免疫检查点蛋白，包括PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的乙酰化，增加了该多肽的核定位，因此提出了抑制核可定位多肽的乙酰化也将抑制或降低多肽的核定位。此外，提出了对应于乙酰化位点的蛋白质分子将竞争性地抑制核可定位多肽的乙酰化，从而降低多肽的核定位。
因此，在本发明的另一方面，提供了抑制或降低核可定位多肽的核定位的方法，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加了核可定位多肽在细胞中的核定位，该方法包括使细胞接触蛋白质分子，该蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还提供了蛋白质分子用于抑制或降低核可定位多肽的核定位的用途，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸组成，其中核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加其在细胞中的核定位；以及本发明提供了包含对应于乙酰化位点的氨基酸、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸组成的蛋白质分子，其用于抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加其在细胞中的核定位。
在一些实施方案中，核可定位多肽是免疫检查点蛋白，具体是PD-L1、PD-L2和/或PD-1。在优选的实施方案中，核可定位多肽是PD-L1。
对应于乙酰化位点的氨基酸序列可以是任何氨基酸序列，其对应于可以被例如乙酰基转移酶乙酰化的氨基酸序列；乙酰基转移酶具体是组蛋白乙酰基转移酶，包括但不限于GCN5、Hat1、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK；具体是p300。
在具体的实施方案中，蛋白质分子的氨基酸序列对应于赖氨酸乙酰化位点(即乙酰化位点，其中赖氨酸残基被乙酰化)；具体是PD-L1赖氨酸乙酰化位点；最具体是PD-L1第255至271位残基。
PD-L1的氨基酸序列(Uniprot No.Q9NZQ7)示于SEQ ID NO：75。对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列包含潜在的乙酰化位点，其中赖氨酸263上的ε-氨基被乙酰化。第255至271残基在下面的序列中以下划线表示。
Figure BDA0002680414600000442
在一些实施方案中，蛋白质分子是式I所示的分离或纯化的蛋白质分子；具体而言是SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子，或本文所述的变体蛋白质分子。
在优选的实施方案中，蛋白质分子不是对应于组蛋白3上乙酰化位点的蛋白质分子，具体地，当赖氨酸4被乙酰化(H3K4)时的位点，例如组蛋白3的残基1-21，例如Kumarasinghe和Woster(2014)ACSMed.Chem.Lett.，5：29-33；Culhane等人(2010)J.Am.Chem.Soc.，132(9)：3164-3176；Culhane等人(2006)J.Am.Chem.Soc.，128(14)：4536-4537；Szewczuk等人(2007)Biochemistry，46(23)：6892-6902；Yang等人(2007)NatureStructural andMolecularBiology，14(6)：535-539；Fomeris等人(2007)J.Biol.Chem.，282(28)：20070-20074；Forneris等人(2005)J.Biol.Chem.，280(50)：41360-41365；以及US9186391 B2所描述的蛋白质分子。在具体的实施方案中，蛋白质分子不是对应于以下分子的蛋白质分子：
Figure BDA0002680414600000441
Figure BDA0002680414600000451
Figure BDA0002680414600000452
或其黄素或生物素缀合物，或其盐或前药。
在本发明的另一方面，提供了本发明的分离的或纯化的蛋白质分子用于治疗或用于制造治疗药物的用途，所述蛋白质分子具体是式I所示、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子，或本文所述的变体蛋白质分子。本发明还提供了本发明的分离或纯化的蛋白质分子，具体是式I所示、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子，或本文所述的变体蛋白质分子，其用于治疗。
本发明还提供了在过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞中抑制或降低PD-1、PD-L1或PD-L2核定位的方法，包括使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还考虑了蛋白质分子在过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞中抑制或降低PD-1、PD-L1或PD-L2核定位的用途，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；本发明还考虑了包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成的蛋白质分子，其用于在过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞中抑制或降低PD-1、PD-L1或PD-L2核定位；以及用于制造此类用途的药物。
在本发明的又一方面，提供了一种改变以下至少一项的方法：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力，所述方法包括使所述细胞与调节形成、增殖、维持、EMT、MET或活力的量的蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还考虑了蛋白质分子用于改变以下至少一项的用途，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力。本发明还扩展到用于改变以下至少一项的蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力；以及用于制造此类用途的药物。
在以上任一方面的一些实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞，具体是癌症干细胞肿瘤细胞。
在一些实施方案中，蛋白质分子导致降低、损伤、废除、抑制或预防过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；或(vi)活力；和/或增强过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(v)MET。
蛋白质分子的合适的实施方案如本文所述。
本文所述的蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，具体是式I所示、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子，或变体蛋白质分子，用于抑制PD-1、PD-L1和/或PD-L2的核定位。因此，本发明人认为蛋白质分子可用于在受试者中治疗或预防癌症。因此，在另一方面，提供了一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，其中所述癌症包含至少一种过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞，所述方法包括对所述受试者施用蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还扩展到蛋白质分子用于治疗或预防受试者癌症的用途，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其中所述癌症包括至少一种过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞；以及用于制造用于此类目的的药物。还考虑了用于治疗或预防受试者癌症的蛋白质分子，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其中所述癌症包括至少一种过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞。
癌症可以是涉及PD-1、PD-L1和/或PD-L2过度表达的任何癌症。合适的癌症可包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌或脑癌、或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤；具体是乳腺癌、肺癌或黑色素瘤；最尤其是乳腺癌或黑色素瘤；更具体是乳腺癌。
在一些实施方案中，本文所述的蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其可用于治疗、预防和/或缓解恶性的症状，具体是转移性癌症的症状。在优选的实施方案中，蛋白质分子用于治疗、预防和/或缓解转移性癌症的症状。合适类型的转移性癌症包括但不限于转移性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌或脑癌、或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，脑癌是神经胶质瘤。在优选的实施方案中，转移性癌症是转移性乳腺癌、肺癌或黑色素瘤；具体是转移性乳腺癌或黑色素瘤；最尤其是转移性乳腺癌。
所述蛋白质分子可用于涉及过度表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞的方法中。在具体的实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞选自：乳腺、前列腺、睾丸、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑色素瘤、白血病、视网膜母细胞瘤、肝、卵巢、肾或脑细胞；具体是乳腺、肺或黑色素瘤细胞；最具体是乳腺或黑色素瘤细胞；更具体是乳腺细胞。在优选的实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞是乳腺上皮细胞，具体是乳腺导管上皮细胞。
在一些实施方案中，过度表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；具体是癌症干细胞肿瘤细胞；最尤其是乳腺癌干细胞肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌症干细胞肿瘤细胞表达CD24和CD44，具体是CD44高，CD24低。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在向受试者施用蛋白质分子之前，在从受试者获得的肿瘤样本中检测PD-1、PD-L1和/或PD-L2基因的过度表达，其中所述肿瘤样本包括癌症干细胞肿瘤细胞和任选地非癌症干细胞肿瘤细胞。
本文所述的蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其适合于治疗已被诊断出患有癌症、疑似患有癌症、已知易感于癌症以及被认为可能发展为癌症、或被认为是先前治疗过的癌症发生复发的个体。癌症可能是激素受体阴性。在一些实施方案中，癌症是激素受体阴性的，因此对激素或内分泌疗法有抗性。在癌症是乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌是激素受体阴性的。在一些实施方案中，乳腺癌是雌激素受体阴性和/或孕激素受体阴性。
存在许多涉及PD-1、PD-L1和/或PD-L2过度表达的病症，其中本文所述的蛋白质分子可能是有用的，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。因此，在本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防受试者病症的方法，在受试者中抑制或降低PD-1、PD-L1和/或PD-L2的核定位与有效治疗该疾病有关，所述方法包括向受试者施用蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还提供了蛋白质分子用于治疗或预防受试者中病症的用途，蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，在受试者中抑制或降低PD-1、PD-L1和/或PD-L2的核定位与有效治疗该疾病有关；本发明还提供用于治疗或预防受试者中病症的蛋白质分子，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，在受试者中抑制或降低PD-1、PD-L1和/或PD-L2的核定位与有效治疗该疾病有关；以及本发明还提供蛋白质分子在制造用于此目的的药物中的用途，蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
涉及PD-1、PD-L1和/或PD-L2过度表达的病症的非限制性示例包括癌症、感染、自身免疫疾病和呼吸疾病。
在一些实施方案中，感染是病原体感染。感染可以选自但不限于病毒、细菌、酵母、真菌、蠕虫或原生动物感染。本发明考虑的病毒感染包括但不限于由HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、丝状病毒、人乳头瘤病毒、人T细胞淋巴病毒、人逆转录病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、肠病毒、鼻病毒、埃博拉病毒、西尼罗河病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染；具体是由以下引起的感染：HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、EB病毒和呼吸道合胞病毒。细菌感染包括但不限于由以下引起的感染：奈瑟氏球菌属(Neisseria)、脑膜炎球菌属(Meningococcal)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcal)、军团菌属(Legionella)、支原体属(Mycoplasma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、衣原体属(Chlamydia)、放线菌属(Actinomyces)、鱼腥藻属(Anabaena)、拟杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、博德特氏菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、弯曲杆菌(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、铬杆菌(Chlrorbium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Chlostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、噬细胞菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌(Haemophilus)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、微球菌属(Micrococcus)、粘球菌属(Myxococcus)、硝化细菌属(Nitrobacter)、颤藻属(Oscillatoria)、原绿藻属(Prochloron)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺螺旋体属(Rhodospirillum)、立克次体属(Rickettsia)、志贺氏菌属(Shigella)、螺旋菌属(Spirillum)、螺旋体属(Spirochaeta)、链霉菌属(Streptomyces)、硫杆菌属(Thiobacillus)、梅毒螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、和分枝杆菌属(Mycobacterium)；具体是由以下引起的感染：奈瑟氏球菌属(Neisseria)、脑膜炎球菌属(Meningococcal)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcal)、军团菌属(Legionella)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。本发明涵盖的原生动物感染包括但不限于由以下引起的那些：疟原虫属(Plasmodium)、利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)、弓形虫属(Toxoplasma)、内阿米巴属(Entamoeba)和贾第虫属(Giardia)。蠕虫感染可包括但不限于由血吸虫属(Schistosoma)引起的感染。本发明考虑的真菌感染包括但不限于由组织胞浆菌属(Histoplasma)和念珠菌属(Candida)引起的感染。
合适的自身免疫性疾病包括但不限于自身免疫性风湿性疾病(比如，例如类风湿性关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮(例如系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮肾炎)、多发性肌炎-皮肌炎、冷沉球蛋白病、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、自身免疫性胃肠道和肝脏疾病(例如，炎症性肠病，如溃疡性结肠炎和克罗恩病、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、脉管炎(比如，例如抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性的脉管炎和与ANCA相关的脉管炎，包括Churg-Strauss脉管炎、韦格纳肉芽肿和显微镜下多发性血管炎)、自身免疫性神经系统疾病(比如，例如多发性硬化症、眼阵挛性肌阵挛综合征(opsoclonus mypclonus)、重症肌无力、神经元视神经炎、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和自身免疫性多发性神经病)、肾脏疾病(比如，例如肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture's syndrome)和伯杰氏病)、自身免疫性皮肤病(比如，例如银屑病、荨麻疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)、大疱性天疱疮(bullous pemphigus)和皮肤性红斑狼疮)、血液系统疾病(比如，例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病(比如，例如内耳疾病和听力丧失)、白塞氏病、雷诺氏综合症、器官移植和自身免疫性内分泌失调(比如，例如与糖尿病相关的自身免疫性疾病，例如I型糖尿病、艾迪生氏病和自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。
合适的呼吸系统疾病包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)或哮喘，具体是过敏性哮喘。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在向受试者施用本发明的蛋白质分子之前，从受试者获得的肿瘤样本中检测PD-1、PD-L1和/或PD-L2基因的过度表达，其中所述肿瘤样本包括癌症干细胞肿瘤细胞和任选的非癌症干细胞肿瘤细胞。
在具体的实施方案中，上述方法中的任何一种涉及施用如上文第4节中所述的一种或多种其他活性剂，例如其他癌症疗法和/或抗感染剂，具体是其他癌症疗法。
本发明的蛋白质分子，具体是对应于PD-L1第255至271位残基的蛋白质分子，具体是式1所示、SEQ ID NO：1-21中任一项(具体是SEQ ID NO：1-18中任一项)的蛋白质分子或如本文所述的变体蛋白质分子，用于抑制或降低多肽的乙酰化。在一些实施方案中，通过乙酰基转移酶(具体是组蛋白乙酰基转移酶)来催化乙酰化。在一些实施方案中，组蛋白乙酰基转移酶是GCN5、Hat1、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK，尤其是p300。
因此，在本发明的另一方面，提供了抑制受试者中乙酰基转移酶的催化活性的方法，其包括施用蛋白质分子，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其实施方案在本文中描述。本发明还扩展到本文所述的蛋白质分子用于抑制受试者中乙酰基转移酶的催化活性的用途，以及本文所述的蛋白质分子，其用于抑制受试者中乙酰基转移酶的催化活性。在优选的实施方案中，乙酰基转移酶为组蛋白乙酰基转移酶，其实施方案如上所述。
本发明还考虑了生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加了核可定位多肽在细胞中的核定位，该方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
在一些实施方案中，蛋白质分子是核可定位多肽的片段。在具体的实施方案中，蛋白质分子包含、由或基本上由50、45、40、35、30、25、20、19、18或17(及其之间的每个整数)或更少个氨基酸残基组成。
在一些实施方案中，对应于乙酰化位点的氨基酸序列是对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列。在具体的实施方案中，蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中，所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2个氨基酸的添加、缺失和/或取代。
在另一方面，本发明提供了生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
在一些实施方案中，蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中，所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2个氨基酸的添加、缺失和/或取代。
可以使用本领域中的标准技术，确定核可定位多肽的核定位的降低或抑制，其非限制性示例包括免疫荧光、免疫组织化学染色、染色质免疫沉淀(ChIP)、ChIP-seq、染色质可接近性(Chromatin Accessibility)分析，比如DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq分析，例如Satelli等人(2016)Sci Rep,6:28910；Bajetto等人(2000)Brain ResearchProtocols,5(3)：273-281；以及Sung等人(2014)BMC Cancer,14:951中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在另一方面，提供了生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低癌症干细胞的形成、增殖、活力或EMT中的至少一种，所述方法包括：
a)使癌症干细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)检测相对于没有所述蛋白质分子的情况下细胞形成、增殖、活力或EMT的正常或参考水平，所述癌症干细胞的形成、增殖或EMT的降低或抑制。
在一些实施方案中，蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中，所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2个氨基酸的添加、缺失和/或取代。
蛋白质分子的氨基酸序列可以对应于天然的、设计的或合成的乙酰化位点。在一些实施方案中，乙酰化位点是核可定位多肽的位点，例如但不限于PD-1、PD-L1或PD-L2。合适的乙酰化位点如本文先前所述。在其他实施方案中，对应于乙酰化位点的氨基酸序列不同于核可定位多肽(如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的氨基酸序列。
可以使用本领域中的药物化学标准技术来鉴定具有对应于所设计的乙酰化位点的氨基酸序列的蛋白质分子。
可以使用计算机方法来鉴定多肽的乙酰化位点，如Hake和Janzen(2013)ProteinAcetylation：Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.981；Li等人(2014)Sci Rep,4:5765；Hou等人(2014)PLoS One,9(2):e89575；以及Wuyun等人(2016)PLoS One,11(5):e0155370所述的方法(其整个内容通过引用并入本文)；或可以使用例如预测残基的诱变组合乙酰化水平的检测，使用例如针对乙酰化氨基酸残基(例如乙酰化赖氨酸)的抗体，来实验性确定多肽的乙酰化位点。可以使用本领域的药物化学标准技术确定周围和/或邻近残基的参与。
本领域技术人员将充分了解用于评估多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)核定位的合适测定法，并鉴定抑制或降低多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)核定位的蛋白质分子。可以通过任何合适的方法，来筛选根据本发明的活性剂。例如，该方法可以包括：使表达多核苷酸的细胞接触疑似有抑制活性的试剂，以及筛选细胞核中兴趣多肽水平的抑制或降低，其中所述多核苷酸对应于编码兴趣多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的基因。或者，可以筛选兴趣多肽的功能活性的抑制或由多核苷酸编码的转录物的水平降低，或多肽或转录物下游的细胞靶标的活性或表达的抑制，其中活性和兴趣多肽的核定位相关。使用以下技术可以检测到这种抑制，包括但不限于ELISA、免疫荧光、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫染色、狭缝或斑点印迹测定、闪烁邻近测定法、使用抗原结合分子缀合物或荧光物质(如荧光素或若丹明)的抗原缀合物的荧光免疫测定法、RIA、奥氏(Ouchterlony)双扩散分析、采用抗生物素蛋白-生物素或链霉亲和素-生物素检测系统的免疫分析、包括逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)在内的核酸检测分析、细胞增殖分析(如WST-1增殖分析)以及对用PD-L1 Half-Way ChIP处理的细胞进行免疫印迹分析。可以使用针对乙酰化多肽的抗体(例如针对乙酰化赖氨酸残基的抗体)来确定多肽的乙酰化。
应当理解，调控或表达兴趣多肽(例如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的多核苷酸可以天然存在于测试受试者的细胞中，或可能为了测试目的而将其引入宿主细胞。
可以使用本领域标准技术来确定乙酰基转移酶催化活性的抑制。例如，可以使用荧光测定法评价乙酰基转移酶的抑制，例如Abcam的乙酰基转移酶活性测定试剂盒(目录编号ab204536)、BPS Bioscience的p300荧光测定试剂盒(目录编号50092)或Abcam的p300抑制剂筛选测定试剂盒(荧光)(目录编号ab196996)；比色测定法，例如Abcam的组蛋白乙酰基转移酶活性测定试剂盒(目录编号ab65352)；或化学发光测定法，例如BPS Bioscience的p300化学发光测定试剂盒(目录编号50077)。
这些方法提供了用于进行高通量筛选假定的调节剂(例如包含合成、组合、化学和天然文库的蛋白质试剂)的机制。
可以在动物模型中进一步测试活性分子以鉴定具有最有效的体内作用的那些分子。例如，这些分子可以用作进一步药物开发的先导分子，例如，将这些化合物用于后续修饰、分子建模和合理药物设计中使用的其他常规程序。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述具体的优选实施方案。
实施例
实施例1-PD-L1在来自乳腺癌和黑色素瘤患者的转移起始细胞(MICS)中的定位
对从转移性乳腺癌和黑色素瘤患者的液体活检组织分离的MIC进行共聚焦激光扫描显微镜检查。PD-L1在乳腺癌(图1A至图1D)和黑色素瘤(图2A和图2B)细胞中均表现出显著的核定位，显示为强的TNFI和大于1的Fn/c得分。
实施例2-PD-L1在乳腺癌细胞中的定位
在MDA-MB-231(MDA)细胞和上皮(MCF7 NS)或间充质(MCF7 ST)MCF7细胞上进行共聚焦激光扫描显微镜检查，以检查PD-L1的定位。在MDA-MB-231和上皮和间充质MCF7细胞中可检测到PD-L1，具体而言在间充质MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中具有高的核定位(图3A)。
使用共聚焦激光扫描显微镜研究了用白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)或多西紫杉醇(10mg/kg)处理35天的小鼠MDA-MB-231异种移植物中PD-L1的表达。与未处理的细胞相比，用白蛋白结合型紫杉醇或多西紫杉醇处理的存活、抗性MDA-MB-231异种移植细胞在细胞核中表达的PD-L1水平更高(图3B)。
使用共聚焦激光扫描显微镜，在MDA-MB-231细胞中研究了PD-L1和关键组蛋白标记物、乙酰化H3K27(H3K27ac)、三甲基化H3K4(H3K4me3)和三甲基化H3K9(H3K9me3)的定位。在细胞的核中PD-L1与活性标记物H3K27ac和H3K4me3共定位，但不与抑制性标记物H3K9me3共定位(图3C)。
实施例3-K263Q突变对PD-L1定位和肿瘤细胞标记物表达的影响
使用Wen等人(2016)Bioinformatics,32(20)：3107-3115中描述的高严谨度甲基化预测软件、和Li等人(2014)Sci Rep,4:5765描述的乙酰化预测软件，将PD-L1第255至271位残基鉴定为甲基化和乙酰化位点，赖氨酸263为甲基化/乙酰化残基。为了确定该位点的乙酰化对PD-L1的定位和肿瘤细胞标记物的表达的影响，用含有野生型PD-L1序列的质粒和含有PD-L1[K263Q]突变体序列(Mut1)的质粒转染了MCF7细胞(图4)。将赖氨酸263替换为谷氨酰胺以防止该位置的乙酰化。
与用空载体转染的细胞相比，用含有野生型PD-L1序列的质粒转染的细胞中PD-L1的过度表达，导致细胞表面波形蛋白(CSV)(侵袭性肿瘤细胞的标记物)(图5A和图5B)、CD133(化学持久性癌症干细胞的标记物)(图6A和图6H)、和间充质标记物EGFR(图6A至图6D)和SNAI1(图6A和图6E至图6G)的表达增加。在含有野生型PD-L1序列的质粒转染的细胞中，PD-L1核定位也增加了(图5A和图5C至图5E)。与用空载体转染的细胞相比，用Mut1质粒转染的细胞显示CSV的表达显著增加，而与用空载体和含有野生型PD-L1序列的质粒转染的细胞相比，用Mut1质粒转染的细胞显示CD133、EGFR和SNAI1的表达显著增加(图5A、图5B和图6A至图6H)。令人惊讶的是，与用空载体或含有野生型PD-L1序列的质粒转染的细胞相比，用Mut1质粒转染的细胞显示出PD-L1的核定位显著增加(图5A和图5C至图5E)。
除了所研究的所有间充质标记物的表达显著增加之外，用包含野生型PD-L1序列的质粒和Mut1质粒转染的细胞还提示获得运动表型，表明强的转移潜力。这对于用Mut1质粒转染的细胞特别显著。
使用WST-1增殖试验研究了PD-L1[K263Q]突变对细胞增殖的影响。用含有野生型PD-L1序列的质粒转染MCF7细胞引起显著的细胞增殖抑制(图7)。Mut1质粒转染细胞后，这种抑制作用增强(图7)。结合显微镜数据，这表明转染的细胞正处于转移、间充质、非增殖状态。
因此，显而易见的是，赖氨酸263在PD-L1的核定位中起关键作用，而PD-L1的核定位对于调节侵略性肿瘤标记物和间充质、癌症干细胞样、化学持久性、非增殖状态是重要的。
实施例4–在MDA-MB-231细胞和来自乳腺癌和黑色素瘤患者的循环肿瘤细胞中三 甲基化和乙酰化PD-L1的定位
使用共聚焦激光扫描显微镜，使用对PD-L1(从Santa-Cruz获得)、赖氨酸263处乙酰化的PD-L1、和赖氨酸263处三甲基化的PD-L1具有特异性的抗体，检查赖氨酸263处三甲基化的PD-L1(“三甲基化PD-L1”)和赖氨酸263处乙酰化的PD-L1(“乙酰化的PD-L1”)于MDA-MB-231细胞中的定位。乙酰化PD-L1(PDL1-263K乙酰基)表明高的Fn/c(核与细胞质荧光之比)，指示着清晰的核存在，而三甲基化PD-L1(PDL1-263KMe3)主要位于MDA-MB-231细胞的细胞质中，显示低的Fn/c(图8A)。
然后，在未透化的MDA-MB-231细胞、从转移性乳腺癌患者(MBC CTC S1或S2)分离的循环肿瘤细胞(CTC)、从对化学疗法治疗有响应的黑色素瘤患者分离的CTC(响应者)、以及对化学疗法治疗具有原发性(原发性抗性)或继发性抗性(继发性抗性)的黑色素瘤患者分离出的CTC中，检测三甲基化和乙酰化的PD-L1的定位。这些细胞中只有三甲基化PD-L1被清楚地标记(图8B)，而乙酰化的PD-L1几乎没有结合(图8C)，表明乙酰化的PD-L1主要位于细胞核中，而三甲基化PD-L1主要位于细胞质中或细胞表面。
实施例5–P1、P2和P3的合成
基于PD-L1的甲基化位点设计P1、P2和P3(参见表4)。如Ensenat-Waser等人(2002)IUBMB Life，54：33-36和WO 2002/010193中所述，使用自动化的现代固相肽合成和纯化技术，采用温和的Fmoc化学方法合成P1、P2和P3。使用标准的N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/羟基苯并三唑(HOBt)偶联进行偶联。脱保护后，使用自动制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化肽。使用分析型RP-HPLC和质谱分析级分。合并纯度为98％或更高的级分，得到最终产物。
通过N-末端氨基酸的N-末端氨基基团，将所有测试的肽进行肉蔻酰化。在将肽脱保护和纯化之前，通过如上所述使用标准DIC/HOBt偶联将肉豆蔻酸共价偶联至N-末端残基，从而进行肉豆蔻酰化。
表4：P1、2和3的序列
肽 序列
P1 肉豆蔻酰-LTFIFRLRKGRMMDVKK-NH<sub>2</sub>
P2 肉豆蔻酰-LTFIFRLRQGRMMDVKK-NH<sub>2</sub>
P3 肉豆蔻酰-LTFIFRLRK(Ac)GRMMDVKK-NH<sub>2</sub>
实施例6–P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞中PD-L1和乙酰化PD-L1核表达的影响
利用共聚焦激光扫描显微镜研究了(根据实施例5合成的)P1、P2和P3对PD-L1和乙酰化PD-L1(PDL1-Ac)的核表达的影响(图9)。低的Fn/c表明(图9A)，PD-L1的定位显著偏向细胞质。P1、P2和P3抑制PD-L1的核表达。乙酰化PD-L1的定位主要局限于细胞核(图9B)。令人惊讶的是，在用P1、P2和P3处理的细胞中，总核荧光强度(TNFI)显著降低，这些细胞表现出乙酰化PD-L1在细胞质的表达。对于用P1、P2和P3处理的细胞，Fn/c显著降低，表明用P1、P2和P3处理导致乙酰化PD-L1偏向细胞质。
为了研究对应于可能的核定位信号的N-末端截短的肽是否抑制PD-L1的核定位，根据实施例5的程序设计并合成了P4。
表5：P4肽的序列
肽 序列
P4 肉豆蔻酰-FRLRKGRMMDVKK-NH<sub>2</sub>
P4对PD-L1或乙酰化PD-L1的定位没有影响(图10A和图10B)。
实施例7–在MDA-MB-231细胞中P1、P2和P3对癌症干细胞表型(CD44高/CD24低)的 影响
通过FACS分析确定了(根据实施例5合成的)P1、P2和P3处理对MDA-MB-231细胞(具有高癌症干细胞表型)中的癌症干细胞表型(CD44高/CD24低)的影响。P1、P2和P3处理显著抑制了癌症干细胞表型，其中P3对癌症干细胞表型的抑制作用最大(图11A至图11F)。
实施例8–P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞增殖的影响
使用WST-1增殖测定法评估(根据实施例5合成的)P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞增殖的影响。尽管过度表达PD-L1会促进化学持久的、非增殖表型，但P1、P2和P3均抑制MDA-MB-231细胞的增殖，IC50值分别为102.8μM、564.1μM和542.1μM(图12A至图12C)。
实施例9–P1、P2和P3对肿瘤细胞标记物和表观酶表达的影响
使用共聚焦激光扫描显微镜评估了(根据实施例5合成的)P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞中PD-L1、CSV、SNAI1和EGFR表达的影响。P1、P2和P3显著抑制PD-L1的核定位(图13A和图13C)。此外，P1、P2和P3一致地抑制侵袭性肿瘤细胞标记物CSV(图13A、图13B、图14A和图14B)以及间充质标记物EGFR(图14A和图14C)和SNAI1(图13A、图13D、图14A和图14D)的表达。这些结果证实，P1、P2和P3显著抑制PD-L1的核定位，并证明了核PD-L1在间充质转移起始癌细胞中的重要性。
使用共聚焦激光扫描显微镜确定了(根据实施例5合成的)P1、P2、P3和P4对MDA-MB-231细胞中EHTM2、DMNTI和SETDB1表达的影响。P1、P2和P3显著消除了EHTM2、DMNTI和SETDB1的表达，EHTM2、DMNTI和SETDB1是与癌症进展有关的表观遗传酶(图15)。P4也抑制了DMNTI和SETDB1的核定位，但对EHTM2的定位没有显著影响。
根据这些结果，使用共聚焦激光扫描显微镜研究了P3对MDA-MB-231细胞中的H3K9me3(SETDB1的靶标)、5-甲基胞嘧啶(DNA甲基化的指标)和ABCB5(抗性标记物)的表达的影响。P3强烈抑制H3K9me3、5-甲基胞嘧啶和ABCB5(图16A和图16B)的表达。
实施例10–黑色素瘤和乳腺癌中乙酰化PD-L1和P300的共表达
使用共聚焦激光扫描显微镜研究了来自转移性黑色素瘤患者的CTC中乙酰化PD-L1和乙酰基转移酶p300的表达。在显示出对免疫疗法原发和继发抗性的转移性黑色素瘤CTC的细胞核中富集乙酰化PD-L1(图17)。在显示出对免疫疗法抗性的转移性黑色素瘤CTC中p300的表达略有增加。有趣的是，p300与乙酰化PD-L1的皮尔逊相关系数(PCC(r))在抗性CTC中显著增加，而对免疫疗法有响应的CTC中很少或没有PCC(r)，表明乙酰化的PD-L1和p300在抗性CTC中共定位。
使用共聚焦激光扫描显微镜，进一步研究了在多西紫杉醇抗性转移性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MCF7和T-47D)和白蛋白结合型紫杉醇抗性转移性乳腺癌细胞系(4T1细胞)中p300和乙酰化的PD-L1的表达。相较于非抗性细胞(MDA-MB-231、MCF7、T-47D和4T1组A)，在抗性细胞(MDA-MB-231TXT50、MCF7 TXT50、T-47D TXT50和4T1组B)中的乙酰化PD-L1的核表达显著增加(图18)。与乙酰化PD-L1相似，相较于非抗性细胞，抗性细胞中p300的核表达显著提高(图18)。乙酰化的PD-L1和p300强烈共定位于细胞的核内，这种共定位在抗性细胞中显著增加(图18)。
实施例11–P1、P2、P3和P4对P300定位的影响
使用共聚焦激光扫描显微镜检查了(根据实施例5合成的)P1、P2、P3和P4对p300定位的影响。与对乙酰化PD-L1的作用相似，P1、P2和P3显著降低p300核表达，其中P3的作用最大(图19)。这些肽还显著降低了乙酰化PD-L1和p300的共定位。P4稍微降低了p300的核表达，但对乙酰化PD-L1和p300的共定位没有影响。
实施例12–在JURKAT T细胞中或OT1衍生T细胞中PD-1的定位
使用共聚焦激光扫描显微镜确定PD-1在Jurkat T细胞或OT1衍生T细胞中的定位。在Jurkat T细胞(白血病细胞系)中PD-1的核定位很显著(图20A和图20B)。但是，炎症通路激活后，表达降低。在OT1衍生的初始T细胞和效应T细胞中，PD-1的核定位也很显著，但强度低于Jurkat T细胞。
实施例13–P1、P2和P3对JURKAT T细胞中PD-1定位的影响
使用共聚焦激光扫描显微镜评估了(根据实施例5合成的)P1、P2和P3对Jurkat T细胞中PD-1定位的影响。与对照相比，P1、P2和P3显著抑制Jurkat T细胞中的PD-1核定位(图21A至图21D)。
实施例14–P1、P2和P3对MDA-MB-231细胞中PD-L2定位的影响
使用共聚焦激光扫描显微镜确定(根据实施例5合成的)P1、P2和P3对PD-L2在MDA-MB-231细胞中的定位的影响。相对于对照，P1、P2和P3显著抑制了PD-L2的核定位(图22A和图22B)。同样，相对于对照，P1、P2和P3显著抑制PD-L1的核定位(图22A和22C)和侵袭性肿瘤细胞标记物CSV的表达(图22A和图22D)。
实施例15–P1类似物对MDA-MB-231细胞中癌症干细胞的影响
按照实施例5的程序设计和合成P1类似物(表6)。使用FACS分析在用肽处理的MDA-MB-231细胞上，测定这些类似物抑制癌症干细胞的能力，MDA-MB-231细胞组成型地包含约90％的CD44高CD24低癌症干细胞，
表6：肽类似物
Figure BDA0002680414600000581
Figure BDA0002680414600000591
Figure BDA0002680414600000601
FACS结果示于表7和表8中。
表7：肽抑制剂对MDA-MB-231细胞中CD44高CD24低CSC数目的影响(n＝3)
Figure BDA0002680414600000611
Figure BDA0002680414600000621
Figure BDA0002680414600000631
表8：多肽抑制剂对MDA-MB-231细胞中CSC数目和细胞活力的影响(n＝1)
Figure BDA0002680414600000632
Figure BDA0002680414600000641
通常对点突变的耐受性良好，大多数肽保留了抑制癌症干细胞(CD44高CD24低CSC)的能力(表7)。有趣的是，赖氨酸乙酰化靶标突变为丙氨酸(P12-17[K9A])保留了抑制癌症干细胞的能力，表明周围的残基也对肽的活性有贡献。
另外，肽2853805(P1[T2K])、2853825(P1[R8L])、2853839(P1[V15K])、2815309(P12-17[K9A])、2815312(P12-17[M12A])和2815314(P12-17[D14A])杀死MDA-MB-231细胞总数中的大多数，而不仅是CSC(表7和表8)。
为了进一步研究这些肽的细胞毒性，确定了它们对MCF7细胞的作用，MCF7细胞是上皮非CSC乳腺癌细胞(表9)。只有肽2853825(P1[R8L])对MCF7细胞具有细胞毒性，这表明该肽可能同时靶向CSC和非CSC癌细胞。其余的肽虽然在未诱导的MCF7细胞中无细胞毒性，但仍能抑制诱导的MCF7细胞中CSC的形成(表10)。
表9：肽抑制剂对CSC数目和MCF7细胞的细胞活力的影响
Figure BDA0002680414600000651
表10：肽抑制剂对诱导的MCF7细胞中CSC数目的影响
肽 CSC抑制(％)
P1 38.10
P2 59.93
P3 53.67
2815309 52.46
2815312 53.47
2815314 61.00
2853805 64.52
2853825 细胞毒性
2853839 83.87
材料和方法
除非另有说明，否则所使用的所有材料和试剂可容易地从商业来源获得，例如Sigma-Aldrich、Santa Cruz Biotechnology、Abcam等。
细胞培养
MCF7和MDA-MB-231细胞获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。将细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素-新霉素的DMEM(Invitrogen，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中培养。用1.32ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)处理60h，产生刺激的MCF7细胞。从体内4T1转移癌小鼠模型获得4T1细胞，并在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素-新霉素的DMEM中培养。在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素-新霉素的DMEM中培养T-47D细胞。多西紫杉醇抗性细胞系获自合作者。以30mg/kg白蛋白结合型紫杉醇处理后，产生白蛋白结合型紫杉醇抗性4T1细胞(4T1组B)。
从转移性乳腺癌或黑色素瘤患者液体活检组织中分离CTC
用RosetteSepTM方法分离CTC，采用RosetteSepTM人CD45耗竭试剂盒(15162，Stemcell Technologies)去除CD45+细胞和红细胞，通过SepMateTM-15(IVD)密度梯度管(85420，Stemcell Technologies)和LymphoprepTM密度梯度介质(目录号07861，StemcellTechnologies)以密度梯度离心法，从而预富集黑色素瘤或乳腺癌活检组织。然后将富集的细胞离心涂片到盖玻片上，该盖玻片用聚-L-赖氨酸预处理，然后固定在PBS中进行染色。
PD-L1、H3K27ac、H3K4me3和H3K9me3在MDA-MB-231以及刺激的和未刺激的MCF7细 胞中的免疫荧光分析
通过用1％Triton X-100孵育20分钟，使MDA-MB-231或刺激或未刺激的MCF7细胞透化。使用兔抗PD-L1探测细胞，并使用与Alexa Fluor 488缀合的驴抗兔二抗进行观察，或使用兔抗PDL1和小鼠抗H3K27ac、H3K4me3或H3K9me3进行探测，并用缀合有Alexa Fluor488的驴抗兔二抗或缀合有Alexa Fluor 568的驴抗小鼠二抗进行标记。将盖玻片用ProLong Diamond Antifade试剂(Life Technologies)固定在玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。运行LAX软件使用100×油浸透镜，用LeicaDMI8显微镜获得单个0.5μm切片。通过同一切片的四个连续图像取平均获得最终图像。使用ImageJ软件(ImageJ，NIH，贝塞斯达，MD，USA)分析数字图像，以确定总核荧光强度(TNFI)或总细胞质荧光强度(TCFI)。使用ImageJ软件，采用自动阈值和手动选择特异于细胞核的兴趣区域(ROI)，来计算每对抗体的皮尔逊相关系数(PCC)。PCC值的范围为：-1＝共定位的相反数，0＝无共定位，+1＝完美共定位。每个样本组至少使用n＝20个细胞。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，GraphPad Software，San Diego，CA)来确定数据集之间的显著差异。
白蛋白结合型紫杉醇或多西紫杉醇处理的MDA-MB-231小鼠异种移植物及其免疫 荧光分析
获得五周龄的雌性裸鼠，并使其在实验前在动物设施中适应一周。所有实验程序均已获得澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会(伦理ID A2014/30)批准。将MDA-MB-231人乳腺癌细胞皮下注射到右乳腺中(在1：1PBS和BD Matrigel Matrix中2×106个细胞)。使用外部卡尺测量肿瘤，并使用改进的椭圆公式计算：1/2(a/b2)，其中a＝最长径，b＝最短径。开始治疗前，肿瘤长至约50mm3(约15天)。腹膜内注射施用白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)或多西紫杉醇(10mg/kg)。切除肿瘤并收集在补充有2.5％FCS的DMEM中。然后用手术刀将肿瘤切细，并在DMEM、2.5％FCS和4型胶原酶(Worthington-Biochem)(1mg胶原酶/1g肿瘤)中于37℃孵育1小时。将消化的肿瘤旋转离心并重悬于DMEM、2.5％FCS中，然后使其通过0.2μM过滤器，并按照上文所述使用免疫荧光显微镜对PD-L1核定位进行评估。
在转移性乳腺癌或黑色素瘤患者液体活检组织分离的MIC中PD-L1和CSV的免疫荧 光分析
将MIC用3.7％甲醛固定，并用2％Triton-X-100透化，然后用CSV的小鼠一抗或PD-L1的山羊一抗，随后用缀合至抗小鼠Alexa-Fluor 568或抗山羊Alexa-Fluor633的相应二抗进行探测。使用共聚焦激光扫描显微镜测量TNFI、TCFI和Fn/c(核/细胞质荧光比，使用公式Fn/c＝(Fn-Fb)/Fc-Fb)计算，其中Fn是核荧光，Fc是细胞质荧光，Fb是背景荧光；其中值大于1表示核偏向)，如前所述。每个样本分析至少5-10个单个细胞。
含有野生型PD-L1序列的质粒和含有PD-L1[K263Q]突变体序列的质粒的制备
将PD-L1序列(野生型或PD-L1[K263Q]突变体)连接到载体pTracer-CMV-BSD中，并用于转化电感受态的DH10B ElectroMAX细胞(Life Technologies；目录号No.18290015)。使用Qiagen Plasmid Mega纯化试剂盒(Qiagen NV，Hilden，德国；目录号12183)，将转化的细菌用于生长大量纯化/提取的质粒)。使用NEON质粒电穿孔转染系统(LifeTechnologies；目录号MPK5000)，用含有野生型PD-L1序列的质粒、含有PD-L1[K263Q]突变体的质粒(Mut1)或仅载体(VO)转染MCF7细胞。
在含有野生型PD-L1序列的质粒和含有PD-L1[K263Q]突变序列的质粒转染的MCF7 细胞中PD-L1的免疫荧光分析
使用NEON电穿孔转染系统(Life Technologies)，用含有野生型PD-L1序列的质粒、含有PD-L1[K263Q]突变体的质粒(Mut1)或仅载体(VO)转染MCF7细胞。用仅载剂(未刺激)处理或用1.32ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)刺激转染的细胞60小时。用3.7％甲醛固定细胞，并用2％Triton-X-100透化20分钟，然后用抗CSV或CD133的小鼠一抗、抗SNAI1的山羊一抗、或抗PD-L1或EGFR的兔一抗，然后用缀合有抗小鼠Alexa-Fluor 568、抗山羊Alexa-Fluor 633或抗兔Alexa-Fluor 488的相应二抗，进行探测。如上所述，使用共聚焦激光扫描显微镜测量TNFI、TCFI和Fn/c。每个样本分析至少5-10个单个细胞。
WST-1细胞增殖测定法
使用NEON电穿孔转染系统(Life Technologies)，将含有野生型PD-L1序列的质粒、含有PD-L1[K263Q]突变体的质粒(Mut1)或仅载体(VO)转染MCF7细胞。将转染的细胞用于基于比色的WTS-1增殖测定法(Sigma-Aldrich)，以检查转染对MCF7细胞增殖的影响。还使用WTS-1增殖测定法确定了(按照实施例5合成的)P1、P2和P3处理对MDA-MB-231细胞增殖的影响。通过主要在细胞表面发生的复杂细胞机制，稳定的四唑盐WST-1裂解为可溶性甲瓒。这种生物还原很大程度上取决于在有活力的细胞中NAD(P)H的糖酵解产生。因此，形成的甲瓒染料的量与培养物中代谢活性细胞的数目直接相关。在37℃湿润的CO2培养箱中，96孔组织培养板中生长的细胞用仅载剂或6.25、12.5、25、50、100、200或400μM的P1、P2或P3处理72小时。然后将细胞与WST-1试剂孵育0.5-4小时。孵育后，用扫描多孔分光光度计(ELISA读板器)对形成的甲瓒染料进行定量。测得的吸光度直接与具有活力的细胞数目相关。
在赖氨酸263处三甲基化的PD-L1和在赖氨酸263处乙酰化的PD-L1的特异性抗体 的产生
产生了针对肽2803201、2803204和2803213的抗体(表11)。由于短肽通常本身不具有免疫原性，因此有必要将其与免疫原性载体蛋白偶联。为了促进这种偶联，将半胱氨酸掺入到肽的C-末端，并进行反应以使肽与免疫原性载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合。不需要特殊的免疫方案即可生成抗三甲基化或抗乙酰化的肽抗体。针对每个肽序列，间隔数周免疫两只兔子。第一次免疫是用完全弗氏佐剂乳化肽缀合物，第二次使用不完全弗氏佐剂。数周后可获得有效的抗肽血清(参见Palfreyman等人(1984)J Immunol Meth，75：383)。
表11：用于产生抗体的肽序列
肽 序列 分子量(Da)
2803201 FRLRKGRMMDVKKC-OH 1768.25
2803204 FRLRK(Ac)GRMMDVKKC-OH 1810.29
2803213 FRLRK(Me<sub>3</sub>)GRMMDVKKC-OH 1811.34
使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行三甲基化和乙酰化肽抗血清的测试，其中将血清滴定在微量滴定板上，所述微量滴定板包被有非三甲基化肽和三甲基化肽、或非乙酰化和乙酰化的肽。
按照制造商的说明，通过可用的半胱氨酸残基，将用于免疫的肽的非三甲基化非乙酰化类似物偶联至凝胶Sulfo Link偶联树脂上(Thermo Scientific，目录号20401)，来进行抗体的增强。将所得的凝胶与抗血清的等分一起孵育，以吸收特异于非三甲基化非乙酰化肽的抗体。所得的抗血清将具有增强的对三甲基化肽或乙酰化肽序列的特异性。
为了产生仅特异于三甲基化或乙酰化肽的亲和纯化抗体，必须首先进行增强程序，以从血清中去除特异于非三甲基化和非乙酰化肽的抗体。回到非三甲基化和三甲基化肽、或非乙酰化和乙酰化肽包被的板上，再通过ELISA测试亲和纯化抗体的特异性。生成的抗体对残基263处三甲基化的PD-L1和乙酰化的PD-L1显示高特异性。
在MDA-MB-231细胞、非透化MDA-MB-231细胞、从转移性乳腺癌患者中分离的CTC和 从黑色素瘤患者分离的CTC中，在赖氨酸263处乙酰化的PD-L1(乙酰化PD-L1)和在赖氨酸 263处三甲基化的PD-L1(三甲基化PD-L1)的免疫荧光分析
通过与1％Triton X-100孵育20分钟产生透化的MDA-MB-231细胞。根据治疗后在多个点测量的实体瘤大小的RECIST 1.1CT扫描测量结果，将黑色素瘤患者样本分为响应者、原发性抗性和继发性抗性群。响应者是指肿瘤正在缩小，原发性抗性是指肿瘤没有缩小且大小增加，而继发性抗性首先是具有响应者的响应，然后是抗性和肿瘤生长。黑色素瘤和转移性乳腺癌CTC来自使用CD45耗竭的Rosette Lymphopep(STEMCELL)细胞分离试剂盒分离出的患者液体活检组织。用兔抗PD-L1(Santa Cruz Biotechnology)、兔抗乙酰化PD-L1或兔抗三甲基化PD-L1(如上所述生成的)探测细胞，并用驴抗兔AF 488进行观察。用ProLong Diamond Antifade试剂(Life Technologies)将盖玻片固定在玻璃显微镜玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。运行LAX软件使用100×油浸透镜，用Leica DMI8显微镜获得单个0.5μm切片。通过同一切片的四个连续图像取平均获得最终图像。如上所述，使用ImageJ软件分析数字图像。
P1、P2、P3和P4处理的MDA-MB-231细胞中PD-L1和乙酰化PD-L1的免疫荧光分析
将1×104MDA-MB-231细胞接种到具有DMEM介质的12孔板中的盖玻片上过夜。细胞用50μM P1、P2、P3或P4或载剂(水)处理72小时。用3.7％的甲醛固定处理过的细胞，然后通过与1％Triton X-100孵育20分钟使其透化。然后用兔抗PD-L1抗体(Santa CruzBiotechnology)或兔抗乙酰化PD-L1(如上所述产生的)探测细胞，并用驴抗兔AF 488观察。用ProLong Diamond Antifade试剂(Life Technologies)将盖玻片固定在玻璃显微镜玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。运行LAX软件使用100×油浸透镜，用Leica DMI8显微镜获得单个0.5μm切片。通过同一切片的四个连续图像取平均获得最终图像。如上所述，使用ImageJ软件分析数字图像。
响应P1、P2和P3处理，MDA-MB-231细胞中的癌症干细胞表型(CD44高/CD24低)的 FACS分析
将5×104MDA-MB-231细胞与1mL完全DMEM接种在12孔板中过夜。用6.25、12.5、25、50、100、200或400μM(根据实施例5合成的)P1、P2或P3或仅载剂处理MDA-MB-231细胞72小时。通过胰蛋白酶消化收集样本，然后用含有2％HI-FBS的DPBS洗涤。使用抗人CD44-APC、抗人CD24-PE、Hoechst和抗人EpCAM抗体混合物进行FACS染色。通过BD-FACSLSR-II流式细胞仪收集数据。Treestar FlowJo用于数据分析。
响应P1类似物处理，MDA-MB-231细胞和MCF7细胞中的癌症干细胞表型和细胞活力 的FACS分析
按照实施例5的方法合成P1类似物。将4×104个MDA-MB-231细胞或1×104个诱导的或非诱导的MCF7细胞连同1mL完全介质接种于12孔板中过夜。通过用PMA/TGF-β刺激细胞并孵育12小时来制备诱导的MCF7细胞。用50μM测试肽(溶于水)处理细胞48小时。然后将细胞用1mL PBS洗涤两次，并通过胰蛋白酶消化收集。在洗涤步骤中去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞，然后在冰上用抗人CD44、CD24和Hoechst 33342抗体染色30分钟。在BD FACS LSRII上进行FACS，通过将CD44高CD24低事件除以总活细胞计数(Hoechst阴性群)，来测量CD44高CD24低CSC的百分比(如Fillmore和Kuperwasser(2007)Breast Cancer Res，9：303中所述)。如前所述(Siemann和Keng(1986)，Cancer Res，46：3556-3559)，通过将活细胞事件总数除以单个细胞总数，计算出有活力细胞的百分比。
响应P1、P2、P3和P4处理，MDA-MB-231细胞中CSV、PD-L1、EGFR、SNAI1、EHTM2、 DMNTI、SETDB1、H3K9me3、5-甲基胞嘧啶和ABCB5的免疫荧光分析
将1×104MDA-MB-231细胞接种到具有DMEM介质的12孔板中的盖玻片上。用50μM(根据实施例5合成的)P1、P2、P3或P4或载剂(水)处理细胞72小时。用3.7％甲醛固定细胞，并用2％Triton-X-100透化，然后用针对CSV、DMNT1、H3K9me3或5-甲基胞嘧啶的小鼠一抗；针对SNAI1、SETDB1或ABCB5的山羊一抗；或针对PD-L1、EGFR、EHMT2的兔一抗；其后用缀合有抗小鼠Alexa-Fluor 568、抗山羊Alexa-Fluor 633或抗兔Alexa-Fluor 488的相应二抗，进行探测。如上所述，共聚焦激光扫描显微镜用于测量TFI、TNFI和TCFI。每个样本分析至少20个单个细胞。
来自转移性黑色素瘤患者和转移性乳腺癌细胞的CTC中p300和乙酰化PD-L1的免 疫荧光分析
如上所述，从转移性黑色素瘤活检组织中分离出CTC。根据对免疫疗法的响应，将从液体活检组织中分离出的黑色素瘤CTC分为三个群体。响应者(对免疫疗法有响应)，抗性(对免疫疗法无响应，癌症是难治性或初始响应，然后是难治性疾病，癌症不再响应)。将黑色素瘤CTC与1％Triton X-100一起孵育20分钟进行透化，并用兔抗乙酰化PD-L1(如上所述制备)或小鼠抗p300进行探测，并用驴抗兔Alexa-Fluor 488或抗小鼠Alexa-Fluor 568进行观察。匹配的初始(MCF7、MDA-MB-231、T-47D和4T1组A)、多西紫杉醇抗性的(MCF7 TXT50、MDA-MB-231TXT50和T-47D TXT50)、和白蛋白结合型紫杉醇抗性(4T1组B)的转移性乳腺癌细胞与1％Triton X-100孵育20分钟进行透化，然后用兔抗乙酰化PD-L1(如上所述制备)或小鼠抗p300进行探测，并用驴抗兔Alexa-Fluor 488或抗小鼠Alexa-Fluor 568进行观察。将盖玻片用ProLong Diamond Antifade试剂(Life Technologies)安装在玻璃显微镜载玻片上。如上所述，通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。如上所述，使用ImageJ软件确定PCC(r)、TNFI、TCFI或TFI。
响应P1、P2、P3和P4处理，p300定位的免疫荧光分析
用50μm的P1、P2、P3、P4或载剂处理MDA-MB-231细胞。用3.7％甲醛固定细胞，并用1％Triton-X-100透化20分钟，然后用兔抗乙酰化PD-L1(如上所述制备)、小鼠抗p300探测，用驴抗兔Alexa-Fluor 488或抗小鼠Alexa-Fluor 568进行观察。将盖玻片用ProLongDiamond Antifade试剂(Life Technologies)安装在玻璃显微镜载玻片上。如上所述，通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶标进行定位。如上所述，使用ImageJ软件计算TNFI和PCC(r)。
Jurkat T细胞或OT1衍生T细胞中PD-1的免疫荧光分析
用3.7％甲醛固定初始Jurkat T细胞、用PMA/I刺激的Jurkat T细胞、初始OT1衍生的T细胞、或经OT1病毒处理的流感特异性效应细胞，用2％Triton-X-100透化，然后用与Alexa-Fluor 647直接缀合的PD-1小鼠一抗进行探测。共聚焦激光扫描显微镜用于测量TNFI。每个样本分析至少20个单个细胞。
响应P1、P2和P3处理，Jurkat T细胞中PD-1的免疫荧光分析
将1×104个Jurkat T细胞接种到具有DMEM介质的12孔板中的盖玻片上。用50μM(根据实施例5合成的)P1、P2、P3或载剂(水)处理细胞72小时。用3.7％甲醛固定细胞，并用2％Triton-X-100透化，然后用与Alexa-Fluor 647直接缀合的PD-1小鼠一抗进行探测。如上所述，共聚焦激光扫描显微镜用于测量TNFI、TCFI和Fn/c。每个样本分析至少20个单个细胞。
响应P1、P2和P3处理，MDA-MB-231细胞中PD-L2、PD-L1和CSV的免疫荧光分析
用50μM(根据实施例5合成的)P1、P2、P3或载剂(水)处理1×104MDA-MB-231细胞72小时。将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后用针对PD-L2的兔一抗、针对PD-L1的山羊一抗和针对CSV的小鼠一抗，然后通过缀合有抗小鼠Alexa-Fluor 568、抗山羊Alexa-Fluor 633或抗兔Alexa-Fluor488的相应二抗进行探测。如上所述，使用共聚焦激光扫描显微镜测量TNFI和TCFI。每个样本分析至少20个单个细胞。
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在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限制为任何一个实施方案或特征的具体集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对示例性的具体实施方案进行各种修改和改变。所有这些修改和改变旨在被包括在所附权利要求的范围内。

Claims (88)

1.一种抑制或降低核可定位多肽的核定位的方法，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括使所述细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽是PD-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽是PD-L1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽是PD-L2。
5.一种抑制或降低过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞中PD-1、PD-L1或PD-L2核定位的方法，所述方法包括使所述细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
8.一种改变以下至少一项的方法：过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)上皮向间充质细胞的转化(EMT)；(v)间充质向上皮细胞的转化(MET)；或(vi)活力，所述方法包括使所述细胞与调节形成、增殖、维持、EMT、MET或活力的量的蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中EMT被抑制或降低。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中癌症干细胞肿瘤细胞的形成被抑制或降低。
13.根据权利要求11所述的方法，其中癌症干细胞肿瘤细胞的增殖被抑制或降低。
14.根据权利要求11所述的方法，其中癌症干细胞肿瘤细胞的活力被抑制或降低。
15.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，其中所述癌症包含至少一种过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞，所述方法包括向所述受试者施用蛋白质分子，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌或脑癌、或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其进一步包括施用一种或多种其他癌症疗法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述其他癌症疗法是化学治疗剂。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成。
22.一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白质分子是核可定位多肽的片段。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述蛋白质分子包含50个氨基酸残基或更少。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中对应于乙酰化位点的氨基酸序列是对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。
27.一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低核可定位多肽的核定位，其中所述核可定位多肽的乙酰化位点的乙酰化增加所述核可定位多肽在细胞中的核定位，所述方法包括：
a)使细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)相对于不存在所述蛋白质分子的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中核可定位多肽的核定位的降低或抑制。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。
29.一种生产蛋白质分子的方法，所述蛋白质分子抑制或降低癌症干细胞的形成、增殖、活力或EMT中的至少一种，所述方法包括：
a)使癌症干细胞与蛋白质分子接触，所述蛋白质分子包含对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列、由或基本上由对应于PD-L1第255至271位残基的氨基酸序列组成；和
b)相对于没有所述蛋白质分子的情况下细胞的形成、增殖、活力或EMT的正常或参考水平，检测所述癌症干细胞的形成、增殖或EMT的降低或抑制。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述蛋白质分子与PD-L1的区别在于：PD-L1第255至271位残基中至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)氨基酸的添加、缺失和/或取代。
31.一种分离或纯化的蛋白质分子，其是式I所示：
Z1X1X2X3X4FX5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16Z2 (I)
其中：
Z1和Z2独立地不存在、或独立地选自蛋白质部分和保护部分中的至少一个，所述蛋白质部分包含约1至约50个氨基酸残基(及其之间的所有整数残基)；
X1不存在或选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X2选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基；
X3选自任何氨基酸残基；
X4选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X5选自任何氨基酸残基；
X6选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X7选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X8选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、Orn及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括N、Q、Om(Ac)、K(Ac)及其修饰形式的具有含酰胺侧链的氨基酸残基；
X9选自包括G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X10选自任何氨基酸残基；
X11选自任何氨基酸残基；
X12选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；
X13选自任何氨基酸残基；
X14选自任何氨基酸残基；
X15选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基；以及
X16选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
32.根据权利要求31所述的蛋白质分子，其中Z1不存在。
33.根据权利要求31或32所述的蛋白质分子，其中Z2不存在。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的蛋白质分子，其中X1选自L和A。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的蛋白质分子，其中X1不存在。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的蛋白质分子，其中X2选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
37.根据权利要求36所述的蛋白质分子，其中X2选自A和K。
38.根据权利要求37所述的蛋白质分子，其中X2是K。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的蛋白质分子，其中X3选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。
40.根据权利要求39所述的蛋白质分子，其中X3选自F、E和K。
41.根据权利要求40所述的蛋白质分子，其中X3是F。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的蛋白质分子，其中X4选自包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基，以及包括I、L、V、M、Nle及其修饰形式的疏水氨基酸残基。
43.根据权利要求42所述的蛋白质分子，其中X4选自I、L和E。
44.根据权利要求43所述的蛋白质分子，其中X4是I。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的蛋白质分子，其中X5选自包括K、R、D、E及其修饰形式的带电荷氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。
46.根据权利要求45所述的蛋白质分子，其中X5选自R、E和V。
47.根据权利要求46所述的蛋白质分子，其中X5是V。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的蛋白质分子，其中X6选自L、E、K、F和V。
49.根据权利要求48所述的蛋白质分子，其中X6是L或F。
50.根据权利要求49所述的蛋白质分子，其中X6是F。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的蛋白质分子，其中X7选自R、E和L。
52.根据权利要求51所述的蛋白质分子，其中X7是L。
53.根据权利要求31至52中任一项所述的蛋白质分子，其中X8选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，以及包括K、R、Orn及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
54.根据权利要求53所述的蛋白质分子，其中X8是A或K。
55.根据权利要求54所述的蛋白质分子，其中X8是A。
56.根据权利要求31至55中任一项所述的蛋白质分子，其中X9选自G，包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。
57.根据权利要求56所述的蛋白质分子，其中X9是G、D或V。
58.根据权利要求31至57中任一项所述的蛋白质分子，其中X10选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基。
59.根据权利要求58所述的蛋白质分子，其中X10选自R和V。
60.根据权利要求59所述的蛋白质分子，其中X10是R。
61.根据权利要求31至60中任一项所述的蛋白质分子，其中X11选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。
62.根据权利要求61所述的蛋白质分子，其中X11选自M、Nle、A和E。
63.根据权利要求62所述的蛋白质分子，其中X11是A。
64.根据权利要求31至63中任一项所述的蛋白质分子，其中X12选自包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。
65.根据权利要求64所述的蛋白质分子，其中X12是M、Nle或E。
66.根据权利要求65所述的蛋白质分子，其中X12是E。
67.根据权利要求31至66中任一项所述的蛋白质分子，其中X13选自包括A、G、S、T及其修饰形式的小氨基酸残基，包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括D、E及其修饰形式的酸性氨基酸残基。
68.根据权利要求67所述的蛋白质分子，其中X13是A、D或V。
69.根据权利要求68所述的蛋白质分子，其中X13是A。
70.根据权利要求31至69中任一项所述的蛋白质分子，其中X14选自包括M、Nle、I、L、V、F、Y、W及其修饰形式的疏水性氨基酸残基，以及包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
71.根据权利要求70所述的蛋白质分子，其中X14是V或K。
72.根据权利要求71所述的蛋白质分子，其中X14是K。
73.根据权利要求31至72中任一项所述的蛋白质分子，其中X15选自包括K、R及其修饰形式的碱性氨基酸残基，以及包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。
74.根据权利要求73所述的蛋白质分子，其中X15是R、K或Y。
75.根据权利要求74所述的蛋白质分子，其中X15是K。
76.根据权利要求31至75中任一项所述的蛋白质分子，其中X16是K。
77.根据权利要求31所述的蛋白质分子，其中式I所示蛋白质分子包含SEQ ID NO：1-18中任一项所示氨基酸序列、由或基本上由SEQ ID NO：1-18中任一项所示氨基酸序列组成：
LTFIFRLRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：1]；
LTFIFRLRQGRMMDVKK [SEQ ID NO：2]；
LTFIFRLRK(Ac)GRMMDVKK [SEQ ID NO：3]；
ATFIFRLRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：4]；
LKFIFRLRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：5]；
AFIFRLRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：6]；
LTFIFVLRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：7]；
LTFIFRFRKGRMMDVKK [SEQ ID NO：8]；
LTFIFRLLKGRMMDVKK [SEQ ID NO：9]；
TFIFRLRAGRMMDVKK [SEQ ID NO：10]；
LTFIFRLRKDRMMDVKK [SEQ ID NO：11]；
LTFIFRLRKVRMMDVKK [SEQ ID NO：12]；
TFIFRLRKGRAMDVKK [SEQ ID NO：13]；
LTFIFRLRKGREMDVKK [SEQ ID NO：14]；
LTFIFRLRKGRMEDVKK [SEQ ID NO：15]；
TFIFRLRKGRMMAVKK [SEQ ID NO：16]；
LTFIFRLRKGRMMVVKK [SEQ ID NO：17]；或
LTFIFRLRKGRMMDKKK [SEQ ID NO：18]。
78.根据权利要求77所述的蛋白质分子，其中式I所示蛋白质分子包含SEQ ID NO：1、4、9、10、13、16或18所示氨基酸序列、由或基本上由SEQ ID NO：1、4、9、10、13、16或18所示氨基酸序列组成。
79.根据权利要求31至78中任一项所述的蛋白质分子，其中所述蛋白质分子具有选自以下的任何一种或多种活性：(i)增加细胞死亡；(ii)增加MET；(iii)降低或抑制EMT；(iv)抑制或降低维持；(v)抑制或降低增殖；(vi)增加分化；(vii)抑制或降低形成；或(viii)降低过度表达PD-1、PD-L1或PD-L2细胞的活力。
80.根据权利要求79所述的蛋白质分子，其中所述细胞是过度表达PD-L1的细胞。
81.根据权利要求79或权利要求80所述的蛋白质分子，其中所述细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
82.根据权利要求81所述的蛋白质分子，其中所述细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
83.根据权利要求31至82中任一项所述的蛋白质分子，其中式I所示蛋白质分子还包含至少一个膜穿透部分。
84.根据权利要求83所述的蛋白质分子，其中所述膜穿透部分是脂质部分。
85.根据权利要求84所述的蛋白质分子，其中所述膜穿透部分是肉豆蔻酰基团。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的蛋白质分子，其中所述膜穿透部分偶联至N或C-末端氨基酸残基。
87.根据权利要求86所述的蛋白质分子，其中所述膜穿透部分偶联至N-末端氨基酸残基。
88.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白质分子是权利要求31至87中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子。
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