JP4991544B2 - ストレス応答を媒介するためのペプチド阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、モノクローナル抗ＤＮＡ抗体によって認識されるペプチドであって、ヒトの変性障害及び炎症を治療するための、真核生物細胞における細胞性及び免疫性ストレス応答を阻害することができるペプチドに関する。

アポトーシス
アポトーシス、即ちプログラムされた細胞死は、胚形成、組織恒常性の維持、多細胞生物の細胞分化、ウイルス感染細胞の排除、及び免疫系の発達を含めた正常な生物学的プロセスにとって基本的に重要である（Ｅｌｌｉｓら、１９９１）。アポトーシスは、幾つかの場合生物学的に有意な恒常性機能を果たす、遺伝子誘導型の細胞の自己破壊の能動的プロセスである点で、変性死又は壊死とは基本的に異なる細胞死の１つの型である。

ｐ５３
腫瘍関連抗原として本来同定されたｐ５３タンパク質は、突然変異又は異常細胞の増殖を停止させるために機能する腫瘍抑制遺伝子の産物である（Ｂａｋｅｒら、１９９０）。機能性ｐ５３はＤＮＡの損傷を検出し（Ｌｅｅら、１９９５）、異常細胞のＤＮＡ修復（Ｋａｓｔａｎら、１９９１）、増殖停止（Ｋｕｅｒｂｉｔｚら、１９９２）、又はアポトーシス（Ｙｏｎｉｓｈ−Ｒｏｕａｃｈら、１９９１）を後に誘導すると考えられている。特にｐ５３は、細胞群から遺伝的に損傷した細胞を排除することによってゲノムの安定性を調節し、その主要機能の１つは腫瘍形成を予防することである。

ｐ５３タンパク質は少なくとも２つのＤＮＡ結合部位を有する：
（１）ｐ５３応答遺伝子のプロモーター領域中のＤＮＡ配列と特異的に相互作用するｐ５３タンパク質の中心部（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９２）、及び
（２）一般に損傷ＤＮＡに共通した特徴を認識することができるｐ５３タンパク質のＣ末端（Ｌｅｅら、１９９５；Ｆｏｏｒｄら、１９９１）。

ｐ５３タンパク質は、ｐ５３依存性遺伝子の制御配列中に存在する共通部位と特異的に結合する転写因子である（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９２）。特定のＤＮＡ制御部位との結合に関与する配列をコードするドメイン中のｐ５３遺伝子の突然変異は、腫瘍抑制の消失を引き起こす。したがって、相当な割合の元のヒト腫瘍が突然変異したｐ５３を有することは、驚くべきことではない（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１）。

ｐ５３は短い半減期を有し、したがって細胞中で絶えず合成され分解される。しかしながら、細胞がストレスに曝されると、ｐ５３は安定化する。ｐ５３の安定化を誘導する細胞ストレスの例は：
ａ）ＤＮＡ損傷、ＵＶ（紫外線）放射、細胞の突然変異、化学療法、及び放射線療法によって引き起こされる損傷など、
ｂ）高熱、
ｃ）低酸素症、及び
ｄ）幾つかの化学療法剤、例えばタクソール又はビンカアルカロイドを使用する治療によって引き起こされる微小管の抑制解除である。

ストレス活性型ｐ５３は、ストレスを受けた細胞の増殖停止又はアポトーシスをもたらす一連の事象を誘導し、それによって異常細胞の増殖及び腫瘍形成を予防する（Ｋｏ、１９９６）。しかしながら、重度のストレス後のｐ５３の過剰な活性化は生物に有害である可能性がある、何故なら、過剰なアポトーシスによって組織の機能が害される可能性があるからである（Ｋｏｍａｒｏｖａ、２００１）。

特に、放射線療法及び化学療法は、これらの療法の有効性を制限する、リンパ及び恒常系及び腸上皮に対する重度の障害などの重度の副作用を示す。毛髪の消失のような他の副作用もｐ５３媒介であり、さらに癌療法を害する。したがって、癌治療と関係がある正常組織における悪い副作用を排除するか或いは減らすために、ｐ５３欠損腫瘍の治療中に正常組織におけるｐ５３活性を阻害し、これによって正常組織を保護することが有益であると思われる。

ｐ５３の不活性化は望ましくなく欲されていない事象であると考えられてきており、ｐ５３機能を回復させることにより癌治療を容易にするための相当な尽力が費やされてきている。しかしながら、ｐ５３の回復又は模倣は、化学療法又は放射線療法中に正常組織細胞を害することに関する、前に記載した問題を引き起こす。これらの正常細胞は癌療法中にストレスに曝され、これが細胞中のｐ５３にプログラムされた死を引き起こさせる。したがって癌治療は、腫瘍細胞と正常細胞の両方を殺傷する。

米国特許第６，５９３，３５３号は、ｐ５３媒介の疾患、状態及び障害の治療におけるｐ５３阻害剤を開示している。

米国特許第６，４２０，１３６号は、ｐ５３の生化学的活性を増大させるか或いは阻害するタンパク質を加えることによって、細胞中のｐ５３タンパク質の活性を調節するための方法を開示している。

米国特許第６，６３０，５８４号は、野生型ｐ５３ではなく突然変異体に曝されたエピトープを認識する単鎖抗体、及び単鎖ＦｖをコードするＤＮＡ分子、抗体を含む医薬組成物、及びこれらの医薬組成物を使用する治療法を開示している。

ｐ５３及びストレス関連応答
生物に対するｐ５３活性の悪影響は癌療法に限られない。障害（例えば火傷）、元来存在する疾患（例えば、熱と関係がある高熱、及び遮断された血液供給と関係がある局所低酸素症の状態、脳卒中、及び虚血）、及び細胞の老化（例えば、線維芽細胞の老齢化）、並びに癌療法と関係があるさまざまなストレスの結果としてｐ５３が活性化される。したがって、一時的なｐ５３阻害も：（ａ）中枢神経系におけるｐ５３依存性の神経死、即ち脳及び脊髄障害の低下又は排除、（ｂ）移植前の組織及び器官の保存、（ｃ）脊髄移植用の宿主の調製、及び（ｄ）例えば発作中の神経障害の低下又は排除において治療上有効である可能性がある。

さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性発作（Ｍａｔｔｓｏｎ、２００１；Ｍａｒｔｉｎ、２００１）、緑内障（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ、１９９９）、外傷後の二次変性（Ｒａｇｈｕｐａｔｈｉ、２０００）、心筋梗塞（Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒ、１９９８）を含めた、さまざまな変性疾患はストレスに応じた敏感な組織の過剰な細胞死と関係がある。したがって、ストレス関連の細胞死の一時的な阻害は、変性疾患の予防及び治療に役立つ可能性がある（Ｋｏｍａｒｏｖａ、２００１）。

ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインに対するモノクローナル抗体
ＤＮＡに対する抗体は、多くの自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び特にループス腎炎に特徴的である。しかしながら、自己免疫障害における抗ＤＮＡ抗体の優勢に関する一般に認められている説明は現在存在しない。ＤＮＡに対する免疫は抗原によって誘導されるようであるが（Ｒａｄｉｃら、１９９４）、ＤＮＡ自体が誘導抗原である可能性はない、何故なら哺乳動物のＤＮＡは抗ＤＮＡ免疫応答を通常誘導しないからである（Ｐｉｓｅｔｓｋｙ、１９９６）。

モノクローナル抗体を用いた免疫処置は、おそらく免疫性モノクローナル抗体の可変領域のイディオタイプ決定基に基づく抗イディオタイプの結合性によって、抗体の特異性を越えて広がる免疫応答を誘導することができることが報告されてきている。

イディオタイプ抗体系の用語によれば、ＡｂＩは第一の抗体、抗原と結合する抗体であり、Ａｂ２はＡｂＩに対する抗イディオタイプ抗体である。Ａｂ２の可変領域は抗原の立体配座と似ている可能性がある、何故なら抗原とＡｂ２の両方はＡｂＩによって結合し得るからである。Ａｂ３はＡｂ２に対する抗イディオタイプ抗体である。構造相補性がある鎖のために、ＡｂＩとＡｂ３は元の抗原に対する類似の特異性を有する可能性がある。

ＰＡｂ−４２１抗体は、ｐ５３のＣ末端ＤＮＡ結合ドメインと反応する原型モノクローナル抗体である。抗ｐ５３ＰＡｂ−４２１の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）の配列は、解明されてきている（ＷＯ９８／５６４１６を参照）。癌を治療するためのＰＡｂ−４２１抗体の使用が提案された、何故なら、それがｉｎ ｖｉｔｒｏでｐ５３のＤＮＡ結合を活性化させたからである（ＷＯ９４／１２２０２を参照）。

本発明者は以前に、ＰＡｂ−４２１でマウスを免疫処置することによって、ＤＮＡとも結合する（Ｈｅｒｋｅｌら、２０００；及びＷＯ００／２３０８２）抗イディオタイプ抗体の形成が誘導されたことを報告した。Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２と示された、これらのモノクローナル抗イディオタイプ抗体の２つは、ｐ５３制御ドメインの結合性が似ており、ＰＡｂ−４２１並びに二本鎖及び一本鎖ＤＮＡと特異的に反応した。

損傷したＤＮＡはｐ５３並びにＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２抗体によって認識される（Ｈｅｒｋｅｌら、２００４）化学的に定義された構造を有することが、（本発明の優先日後に）本発明者によって提案された。このような抗イディオタイプ抗体を使用して抗アポトーシス性及び抗炎症性を有する新規なペプチドを同定することが可能であることは、従来技術では教示或いは示唆されていない。

特異的、安全且つ有効である形式で正常組織中の細胞性及び免疫性ストレス応答を弱めるために働くことができ、それによってストレス関連変性疾患及びストレス誘導型炎症の重度を軽減することができる新規な組成物に対する必要性が満たされていない。

本発明は、さまざまなストレス関連状態に対する細胞性及び免疫性ストレス応答を阻害するためのペプチドを含む、組成物及び方法を提供する。本発明のペプチドは抗アポトーシス活性及び抗炎症活性を示し、これによってストレスに曝される細胞又は組織における細胞生存率が増大する。

抗腫瘍免疫を誘導するためのｐ５３に対する抗体の使用が記載されてきているが、抗ｐ５３抗体と免疫反応性がある抗イディオタイプ抗体を使用して、細胞死を予防するか或いは減少させるのに有用な療法を定義することもできることを、本発明は実証する。

予想外に、抗ｐ５３モノクローナル抗体に対するイディオタイプ免疫処置により作製したモノクローナル抗体によって認識されるペプチドは、ヒトの変性疾患の療法及び炎症応答の修正に使用される可能性があることが、現在開示されている。言い換えると、抗ｐ５３抗体（Ａｂ）は抗イディオタイプ抗体を生成させることができ、これらの後者の抗体は細胞死又は炎症を予防するのに有用なエピトープを認識する。

本発明は部分的に、ＤＮＡ損傷剤、高熱、毒性ストレス及びγ線照射などの刺激によって誘導されるストレス誘導型細胞死及びｐ５３媒介型応答を改善する際の、本発明のペプチドの有効性を実証した実験に基づく。

驚くことに、本発明のペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で抗炎症活性を示すことをさらに発見した。したがって本発明は、本発明のペプチドは炎症及び自己免疫疾患を治療するのに有用であることを実証する。

第一の態様によれば本発明は、抗ｐ５３抗体を対象とする抗イディオタイプ抗体と免疫反応性があるエピトープを含むペプチドであって、抗ｐ５３抗体がｐ５３のＣ末端の制御ドメインの少なくとも一部分と免疫反応性があるペプチドを対象とする。本発明のペプチドは、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性から選択される少なくとも１つの活性を示す。

特定の一実施形態では、ペプチドは抗ｐ５３抗体ＰＡｂ−４２１を対象とする抗イディオタイプ抗体と免疫反応性がある（参照として本明細書に完全に組み込まれる、Ｈｅｒｋｅｌら、２０００）。他の特定の実施形態では、ペプチドは、ｐ５３制御ドメインと構造類似性を有するＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２で示すモノクローナル抗体と免疫反応性がある（参照として本明細書に完全に組み込まれる、Ｈｅｒｋｅｌら、２００４）。

一実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、配列番号１５及び１８、並びに配列番号２１及び２４からなる群から選択されるＶ_Ｌ−ＣＤＲ３及びＶ_Ｈ−ＣＤＲ３配列を含む分子である。他の実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、これらの類似体及び誘導体からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を含む分子である。

当技術分野で知られている方法によって、ペプチドを特徴付け及び合成する。一実施形態では、ペプチドを質量分析法によって特徴付けし、化学合成によって合成する。

他の実施形態によれば、ペプチドはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインと構造相補性を有する可能性がある。任意の特定の理論又は作用機構に縛られることを望まずに、ペプチドはｐ５３と結合することができ、したがってｐ５３が損傷したＤＮＡと結合するのを妨げることができると仮定する。他の実施形態では、本発明のペプチドは、アポトーシスと関係があるタンパク質と結合する活性を示す。他の実施形態では、本発明のペプチドは、前記タンパク質が損傷したＤＮＡと結合するのを妨げる活性を示す。

幾つかの実施形態によれば、ペプチドは合計約５〜２５個のアミノ酸を含み、好ましくはペプチドは約５〜約２５個のアミノ酸を含み、好ましくは約７〜１２個のアミノ酸を含む。

幾つかの特定の実施形態では、本発明は、抗アポトーシス活性及び／又は抗炎症活性を有する配列番号１〜配列番号４、その類似体、誘導体、又は活性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する新規なペプチドを提供する。本発明のペプチドは以下の通りである：
配列番号１−ＬＰＰＬＰＹＰ、ストレシン−１で示す；
配列番号２−ＤＬＳＴＤＡＬＨＹＲＴＡ、ストレシン−２で示す；
配列番号３−ＨＰＴＮＱＱＳＬＷＲＷＰ、ストレシン−３で示す；
配列番号４−ＳＳＬＳＶＤＹＰＴＲＹＰ、ストレシン−４で示す。

他の特定の実施形態では、誘導体は配列番号５〜８のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有するレトロインベルソペプチドである：
配列番号５−ＰＹＰＬＰＰＬ（全残基が「Ｄ」異性体形である）；
配列番号６−ＡＴＲＹＨＬＡＤＴＳＬＤ（全残基が「Ｄ」異性体形である）；
配列番号７−ＰＷＲＷＬＳＱＱＮＴＰＨ（全残基が「Ｄ」異性体形である）；
配列番号８−ＰＹＲＴＰＹＤＶＳＬＳＳ（全残基が「Ｄ」異性体形である）。

特定の一実施形態では、ペプチドは配列番号１、２及び５のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有する。

他の実施形態によれば、本発明のペプチドは正常組織の細胞死を選択的に予防するのに有用である。一実施形態では、ペプチドは哺乳動物細胞のアポトーシス活性を阻害する。他の実施形態では、ペプチドはヒト細胞のアポトーシス活性を阻害する。

幾つかの好ましい実施形態によれば、本発明のペプチドはアポトーシス活性を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、及び最も好ましくは少なくとも９５％阻害することができる。

本発明は、正常組織中の細胞性及び免疫性ストレス応答を有効に阻害する能力を有するペプチドであって、細胞内タンパク質活性の阻害が利点をもたらす疾患又は状態を治療するのに有用なペプチドを提供する。

幾つかの実施形態によれば、本発明のペプチドはストレス関連のヒトの変性疾患を治療するのに有用である。他の実施形態によれば、ペプチドは免疫媒介のストレス応答を下方制御することができる。

他の態様では本発明は、配列番号１５及び１８、並びに配列番号２１及び２４からなる群から選択されるＶ_Ｌ−ＣＤＲ３及びＶ_Ｈ−ＣＤＲ３配列を含む抗体分子、並びに本発明によるペプチドを単離するためその使用を対象とする。一実施形態では、抗体分子は配列番号９及び１０、並びに配列番号１１及び１２からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を含む。

さらに他の態様によれば本発明は、本発明のペプチド、又はその塩、及び薬剤として許容される担体又は希釈剤を活性成分として含む医薬組成物を提供する。

他の態様によれば本発明は、生物の細胞中の細胞性及び免疫性ストレス関連の応答を調節するための方法であって、有効量の本発明のペプチド、類似体、誘導体、又はその塩に細胞を曝すことを含む方法を提供する。

本発明のペプチドにより治療することができる疾患及び炎症状態には、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後の二次変性、脳卒中、ＣＮＳ中毒、緑内障、黄斑部変性、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、移植片対宿主病、移植片拒絶、関節炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、成人呼吸促拍症候群（ＡＲＤＳ）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、放射線疾患、高熱、低酸素症、劇症中毒性肝炎、腎不全、不妊症及び他の多くがあるが、これらだけには限られない。

他の態様では本発明は、その必要のある対象の変性疾患又は状態を治療するための方法であって、本発明のペプチド、類似体、誘導体、又はその塩を治療有効量、対象に投与することを含む方法を提供する。

一実施形態では、疾患又は状態がストレス関連の変性障害である。

他の実施形態では、前記対象は腫瘍障害を有し、癌を治療するための化学療法及び／又は放射線療法を受けている。

他の実施形態では、疾患又は状態はアルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後の二次変性、脳卒中、ＣＮＳ中毒、緑内障、黄斑部変性、心筋梗塞、放射線疾患、高熱、低酸素症、劇症中毒性肝炎、腎不全及び不妊症からなる群から選択される。

他の態様では本発明は、その必要のある対象の炎症疾患又は状態を治療するための方法であって、本発明のペプチド、類似体、誘導体、又はその塩を治療有効量、対象に投与することを含む方法を提供する。

一実施形態では、疾患又は状態は、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αから選択される少なくとも１つの前炎症性サイトカインの生成と関係がある病因を有する。

他の実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。

他の実施形態では、疾患又は状態は、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性ブドウ膜炎、関節炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、成人呼吸促拍症候群（ＡＲＤＳ）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、移植片拒絶及び移植片対宿主病からなる群から選択される。

特定の一実施形態では、疾患は多発性硬化症である。

一実施形態ではペプチドが、正常組織又は細胞中の細胞性及び免疫性ストレス障害に応答してアポトーシス活性を阻害する。一実施形態によれば、本発明のペプチドはｉｎ ｖｉｖｏで細胞中の細胞内タンパク質活性を調節する。他の実施形態では、本発明のペプチドはｅｘ ｖｉｖｏで細胞中の細胞内タンパク質活性を調節する。

幾つかの実施形態によれば、経口、局所、経皮、非経口経路だけには限られないが、これらを含めた任意の適切な投与経路によって、その必要のある対象にペプチドを投与することができる。

本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下に続く図面、記載事項及び特許請求の範囲と共に明らかになると思われる。

本発明は、さまざまなストレス関連状態に対する細胞性及び免疫性ストレス応答を阻害するためのペプチドを含む、組成物及び方法を提供する。本発明は、モノクローナル抗ＤＮＡ抗体によって認識され、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性を有するペプチドを利用して、ヒトの変性疾患及び炎症を治療するための組成物及び方法を提供する。

定義
本明細書で使用する用語「直線状ペプチド」は、１アミノ酸のα−アミノ基と他のアミノ酸のα−カルボキシル基の間で形成されたアミド結合によってアミノ酸が互いに連結している、ペプチド又はポリペプチドを意味する。

本明細書で使用する「細胞」は、真核生物細胞を指す。典型的には、細胞は動物起源であり、幹細胞又は体細胞であってよい。適切な動物細胞は、例えば哺乳動物及び鳥類起源であってよい。哺乳動物細胞の例にはヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウサギ細胞がある。細胞は胚細胞、骨髄幹細胞又は他の始原細胞であってよい。細胞が体細胞である場合、細胞は例えば上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血液細胞（造血細胞、赤血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞などを含む）、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、神経細胞（例えば、グリア細胞又は星状細胞）であってよい。

本発明の文脈では、「調節」は阻害、即ち発現の低下を意味する。当技術分野で一般的な方法で、例えばタンパク質発現のウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡアッセイによって、或いはタンパク質発現の免疫沈降アッセイによって、この調節を測定することができる。

本明細書で使用する用語「治療」は、予防及び治療用途を含み、患者の特定の障害の症状の緩和、特定の障害と関係がある確認可能な測定の改善、又は特定の免疫応答（移植片拒絶など）の予防を指す。

抗体、又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって１つに連結した２本の重鎖、及びそれぞれの軽鎖が「Ｙ」形立体配座でジスルフィド結合によって各重鎖と連結した２本の軽鎖を含む。抗体のタンパク質分解による消化によって、Ｆｖ（可変断片）及びＦｃ（結晶断片）ドメインが生成する。抗原結合ドメインＦａｂ’は、ポリペプチド配列がさまざまである領域を含む。用語Ｆ（ａｂ’）_２は、ジスルフィド結合によって１つに連結した２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸はＦｃ断片と呼ばれる。それぞれの重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）、次に幾つかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）、及びその他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線に並んでおり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）と一直線に並んでいる。

軽鎖と重鎖の各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖上のドメインと重鎖上のドメインは同じ一般構造を有し、それぞれのドメインは４個の骨格領域を含み、それらの配列は比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られている３個の超可変ドメインによって接合している。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性及び親和性に貢献する。

本明細書で使用する用語「抗体」は、エピトープ（例えば抗原）と特異的に結合し認識する、１つ又は複数の免疫グロブリン遺伝子、又はその断片によって実質的にコードされているポリペプチドリガンドを指す。本明細書で使用するようにこの用語は、エピトープ抗原決定基と結合することができる、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組換え及び工学処理抗体、並びにこれらの断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ小抗体など（例えば、米国特許第５，９１０，５７３号、米国特許第６２９４３５３号、ＷＯ９６／３７６２１、米国特許出願０８／９９９，５５４を参照）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、５，０９１，５１３号及び５，０９６，８１５号）などの完全な分子を指す。本発明中で使用する抗体は、免疫処置抗原として当該の小さなペプチドを含む完全なポリペプチド又は断片を使用して調製することができる。動物を免疫処置するために使用するポリペプチド又はオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から誘導することができ、或いは化学的に合成することができ、望むならば、担体タンパク質と結合させることができる。ペプチドと化学的に結合する一般的に使用されている担体は、ウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニンによって例示される。次いで結合ペプチドを使用して、動物（例えば、マウス、ラット、又はウサギ）を免疫処置する。抗体を作製する非制限的な方法を本明細書の以下の実施例中に記載するが、しかしながら、当技術分野でよく知られている他の方法を容易に使用することができる。

用語「抗イディオタイプ抗体」によって、他の抗体のイディオタイプ抗原決定基を対象とする（言い換えると、それと免疫反応性がある）抗体を意味する。本明細書で使用する用語「イディオタイプ抗原決定基」は、細胞の１クローンの免疫グロブリン産物に独特な抗原決定基又はエピトープを指す。イディオトープは、抗体の可変領域中に見られる。用語「エピトープ」は、抗体によって認識される分子上の抗原決定基を指す。

本明細書で使用する用語「免疫反応性」は、抗原との免疫反応を示す結合親和性で、抗体が抗原と結合できることを意味する。このような親和性は当業者にはよく知られており、１０^５〜１０^１４のＭ^−１の親和性を含む。抗体組成物の親和性を測定する方法は、Ｄａｙ、「先端の免疫化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（第２版）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．（１９９０）中に記載されている。

ストレシンペプチド
第一の態様によれば本発明は、抗ｐ５３抗体を対象とする抗イディオタイプ抗体と免疫反応性があるエピトープを含むペプチドであって、抗ｐ５３抗体がｐ５３のＣ末端の制御ドメインの少なくとも一部分と免疫反応性があるペプチドを対象とする。本発明のペプチドは、本明細書で以後詳細に示すように、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性から選択される少なくとも１つの活性を示す。

一実施形態では、ｐ５３の制御ドメインと構造類似性を有する抗イディオタイプモノクローナル抗体によってペプチドを選択する。幾つかの実施形態によればペプチドは、抗ｐ５３抗体に対して産生したモノクローナル抗体と免疫反応性がある。特定の一実施形態では、抗ｐ５３抗体はＰＡｂ−４２１である（Ｈｅｒｋｅｌら、２０００）。他の特定の実施形態ではペプチドは、ｐ５３の制御ドメインと構造類似性を有するＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２で表すモノクローナル抗体と免疫反応性がある（Ｈｅｒｋｅｌら、２００４）。

他の実施形態ではペプチドは、配列番号１５及び１８、並びに配列番号２１及び２４からなる群から選択されるＶ_Ｌ−ＣＤＲ３及びＶ_Ｈ−ＣＤＲ３配列を含む抗イディオタイプ抗体分子と免疫反応性がある。他の実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、配列番号１３〜１８、及び配列番号１９〜２４からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む分子である。他の実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、これらの類似体からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を含む分子である。

当技術分野で知られている方法によって、ペプチドを特徴付け及び合成する。一実施形態では、以下に記載するように、ペプチドを質量分析法によって特徴付けし、化学合成によって合成する。

本発明のペプチドは好ましくは５〜２５個のアミノ酸、より好ましくは５〜１５個のアミノ酸、及び最も好ましくは７〜１２個のアミノ酸である。

ある特定の実施形態によれば、本発明は（ストレス応答性特異的ペプチド阻害剤に関して）ストレシン−１〜４で表す４個の選択ペプチドを提供する。本発明の幾つかのペプチドのアミノ酸配列は表１に列挙し、配列番号１〜配列番号４で表す。

他に指定しない限り、本明細書に記載するアミノ酸残基は「Ｌ」異性体形であることが好ましい。しかしながら、ペプチドが所望の機能性を保持する限り、「Ｄ」異性体形の残基は任意のＬ−アミノ酸残基で置換することができる。

他の特定の実施形態では、本明細書で以後詳細に記載するように、本発明は配列番号１〜配列番号４で表すペプチドの類似体、断片及び機能的誘導体を提供する。幾つかの特定の実施形態によれば、以下で特定されている誘導体は配列番号５〜８のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有するレトロインベルソペプチドである。特定の実施形態では、ペプチドは配列番号１、２及び５のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有する。

以前に、ｍＡｂＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２は、ＰＡｂ−４２１及び一本鎖又は二本鎖のＤＮＡの両方と特異的に結合することが実証された（Ｈｅｒｋｅｌら、２０００、本発明の発明者数名）。本発明は、配列番号９及び１０、並びに配列番号１１及び１２からなる群から選択される可変領域を含むＰＡｂ−４２１を対象とする抗体分子、及び配列番号１３〜１８及び配列番号１９〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ含む抗体分子を提供する。このような抗体は、Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２と呼ばれる周知のｍＡｂは含まない。

一実施形態では抗体分子は、配列番号１５及び１８（それぞれ、Ｉｄｉ−１の軽鎖の相補性決定領域３及びＩｄｉ−１の重鎖の相補性決定領域３に対応する）、並びに配列番号２１及び２４（Ｉｄｉ−２）からなる群から選択されるＶ_Ｌ−ＣＤＲ３及びＶ_Ｈ−ＣＤＲ３配列を含む。他の実施形態では抗体分子は、配列番号１３〜１８（Ｉｄｉ−１）及び配列番号１９〜２４（Ｉｄｉ−２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、以下の表４に示すＣＤＲ配列を含む。他の実施形態では抗体分子は、配列番号９及び１０（Ｉｄｉ−１）、配列番号１１及び１２（Ｉｄｉ−２）からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域（免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域）を含む。本発明の抗体分子は、類似体又は誘導体がＰＡｂ−４２１の抗原結合部分と免疫反応性がある限り、前記Ｖ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域の類似体及び誘導体を含む分子も含む。

他の態様では本発明は、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を示すペプチドを単離するための、前に記載した抗体分子の使用を提供する。本発明のペプチドを同定及び単離するための、これらの抗体を利用する適切な方法は、本明細書で以後開示する。

ファージディスプレイライブラリー
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、このようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを同定する際の強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）、米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，７３３，７３１号；米国特許第５，４９８，５３０号；米国特許第５，４３２，０１８号；米国特許第５，３３８，６６５号；米国特許第５，９２２，５４５号；ＷＯ９６／４０９８７；及びＷＯ９８／１５８３３を参照のこと。このようなライブラリーでは、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によってランダムなペプチド配列を表す。典型的には表すペプチドを、抗体固定化した受容体の細胞外ドメインに対する親和性によって溶出させる。連続ラウンドの親和性による精製及び再増殖によって、残ったファージを増大させることができる。最良の結合ペプチドを塩基配列決定して、１つ又は複数の構造上関連があるペプチドのファミリー内の重要な残基を同定することができる。例えば、２つの異なるファミリーを同定したＣｗｉｒｌａら（１９９７）を参照のこと。これらのペプチド配列は、どの残基をアラニンスキャニングによって、或いはＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって安全に置換することができるかも示唆し得る。突然変異誘発ライブラリーを作製及びスクリーニングして、最良の結合剤の配列をさらに最適化することができる（Ｌｏｗｍａｎ、１９９７）。

本発明のペプチドは、ｐ５３制御ドメインの抗体代用物を用いて、ファージディスプレイライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、ドイツからのＰｈ．Ｄ．−７又はＰｈ．Ｄ．−１２）から選択し単離した。ｐ５３抗体代用物は、ｐ５３制御ドメインと結合するＰＡｂ−４２１モノクローナル抗体、ｐ５３制御ドメインの結合性を模倣したＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２で示す２つのモノクローナル抗体（Ｈｅｒｋｅｌら、２０００）に対するイディオタイプの免疫処置によって作製された。

選択した候補ペプチドを、内因性ｐ５３活性を欠きｐ５３遺伝子又は対照ベクターによって安定的にトランスフェクトされたＬ１２細胞系（Ｗｏｌｆ、１９８４）の、高熱に対する応答を阻害するそれらの能力を試験することによって、ｐ５３媒介型細胞性ストレス応答に干渉するそれらの能力に関して試験した。これらの細胞中では、高熱に応答して、ｐ５３活性はアポトーシスではなく増殖停止及び細胞生存を誘導する（Ｎｉｔｔａ、１９９７）。

（ストレス応答性特異的ペプチド阻害剤に関して）ストレシン−１〜−４で表す４個のペプチドを同定し、これらは１００μｇ／ｍｌの濃度で高熱後にｐ５３媒介の増殖停止を阻害し、活性ｐ５３を有するほぼ全ての細胞の死を誘導した、これはｐ５３活性を欠くＬＩ２細胞の応答結果である（表１）；これらのペプチド配列は表２中に示す。

ペプチドを同定及び単離するための他の方法
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析を使用して、大きなタンパク質リガンドの結合活性と似たペプチドを示唆することもできる。このような分析において結晶構造は、そこからペプチドを設計することができる大きなタンパク質リガンドの重要な残基の、同一性及び相対的配向を示唆する可能性がある（例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら、１９９７を参照）。これらの分析法を使用して、結合親和性を増大させるためのペプチドの他の修飾を示唆する可能性がある、ファージディスプレイによって選択した受容体タンパク質とペプチドの間の相互作用を調べることもできる。

ペプチド研究では、他の方法がファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーはｌａｃリプレッサーのカルボキシ末端と融合させ、大腸菌中で発現させることができる。他の大腸菌系の方法は、ペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって細胞の外側膜上での提示を可能にする。本明細書では以後、これらの方法及び関連する方法を集合的に「大腸菌ディスプレイ」と呼ぶ。他の方法では、リボソーム放出前にランダムなＲＮＡの翻訳を停止させ、その関連ＲＮＡが依然付着しているポリペプチドのライブラリーを生成させる。本明細書では以後、これらの方法及び関連する方法を集合的に「リボソームディスプレイ」と呼ぶ。他の方法はペプチドとＲＮＡの化学結合を使用する；例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）を参照。本明細書では以後、これらの方法及び関連する方法を集合的に「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。ポリエチレン製ロッド又は溶媒透過性樹脂などの安定性のある非生物材料上にペプチドが固定される、化学的に誘導されるペプチドライブラリーが開発されてきている。他の化学的に誘導されるペプチドライブラリーはフォトリソグラフィーを使用して、ガラススライド上に固定されたペプチドをスキャンする。本明細書では以後、これらの方法及び関連する方法を集合的に「化学的ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。化学的ペプチドスクリーニングは、それがＤ−アミノ酸及び他の非天然型類似体、並びに非ペプチド要素を使用することができる点において有利である可能性がある。生物学的方法と化学的方法の両方がＷｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）中に総説されている。

ファージディスプレイは特に、本発明中で使用するためのペプチドを作製する際に有用である。ランダムなペプチドのライブラリーからの親和性による選択を使用して、任意の遺伝子産物の任意の部位用のペプチドリガンドを同定することができることは言及されてきている（Ｄｅｄｍａｎら、１９９３）。ファージディスプレイは特に、細胞表面受容体又は直線状エピトープを有する任意のタンパク質などの、当該のタンパク質と結合するペプチドを同定するのに非常に適している（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８；Ｋａｙら、１９９８）。

本発明のペプチドの合成
本発明のペプチドは、ペプチド模倣法（Ａｌｌｅｎ Ｇ．、１９８９；Ｙｏｕｎｇ、１９６３；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、１９７３；Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｐｋｅ、１９６５）を含めた、アミノ酸配列を生成する任意の知られている化学的方法及び組換え方法によって生成することができる。アミノ酸残基又はペプチド断片を液相中において正しい方向で互いに結合させて、所望のペプチドを生成させることによって、化学合成は一般に実施される。他の一般的な戦略は、配列の最後のアミノ酸のＣ末端が結合し、最後から２番目のアミノ酸のＣ末端が最後のアミノ酸のＮ末端に結合する固相（樹脂）などで始めて、アミノ酸を互いに結合させること、最後に固相から増大したペプチドを放出させることである（いわゆる固相技法）。

用語「ペプチド」は２〜２５個のアミノ酸の分子を指し、５〜２０個のアミノ酸の分子が好ましく、７〜１２個のアミノ酸の分子が最も好ましい。代表的なペプチドは前に挙げた方法のいずれかによってランダムに作製することができ、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）中に保つことができ、タンパク質の消化によって誘導することができる。

本発明は、本発明のペプチドを含む任意の類似体、誘導体、及び複合体を含み、ペプチドがアポトーシス及び／又は炎症を阻害することができる限りそのアミノ酸配列を本明細書に示す。したがって本発明は、非天然型アミノ酸誘導体又は非タンパク質側鎖を含むペプチドを含む。

用語「類似体」は、１つ又は複数の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており本明細書で記載した能力を示す、本明細書で詳細に示す配列の１つと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する、任意のペプチド又はポリペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの１個の無極性（疎水性）残基と他の残基の置換、１個の極性（親水性）残基と他の残基の置換、例えばアルギニンとリシンの間の置換、グルタミンとアスパラギンの間の置換、グリシンとセリンの間の置換など、リシン、アルギニン又はヒスチジンなどの１個の塩基性残基と他の残基の置換、或いはアスパラギン酸又はグルタミン酸などの１個の酸性残基と他の残基の置換がある。

ペプチド誘導体は、本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む分子であって、化学修飾、置換、挿入、延長及び欠失だけには限られないが、これらを含めたさまざまな変化に曝され、このような変化がペプチドの抗炎症活性又は抗アポトーシス活性を害さず、このような誘導体が知られているペプチド又はタンパク質ではない分子を指す。「ペプチド誘導体」は、本明細書で以下に記載するペプチド模倣体を含むことを意味する。この点において本発明のペプチドは、本明細書で定義する１つ又は複数のアッセイにおいて本発明のペプチドの阻害機能をポリペプチドが有する限り１つ又は複数の変化が施される、表１に挙げたペプチドの１個に対応し、好ましくはそれと同一である。本発明の抗体分子に関しては、可変領域誘導体はＰＡｂ−４２１のイディオタイプ抗原決定基と特異的に結合する能力を有する（即ち、それと免疫反応性がある）。

化学修飾を有するペプチド誘導体には、例えば側鎖又は官能基の反応によって化学的に誘導された１つ又は複数の残基を有するペプチドがある。このような誘導体化分子には、例えば遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成している分子がある。遊離カルボキシル基を誘導体化させて、塩、メチル及びエチルエステル、或いは他の型のエステル又はヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化させて、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化させて、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成することができる。さらに化学誘導体として、１つ又は複数の２０個の標準的アミノ酸残基の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換することができ、５−ヒドロキシリシンをリシンに置換することができ、３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換することができ、ホモセリンをセリンに置換することができ、且つオルニチンをリシンに置換することができる。

さらにペプチド誘導体は、末端ＮＨ_２アシル化、アセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、及び例えばアンモニア、メチルアミンなどによる末端カルボキシアミド化だけには限られないがこれらを含めた化学修飾によって、本発明のペプチドの本来の配列と異なる可能性がある。

本発明のペプチドは、アポトーシス及び／又は炎症に対する必要な阻害活性が保たれる限り、その配列を本明細書に示す本発明のペプチドの配列に対して残基の１つ又は複数の付加及び／又は欠失を有する任意のペプチドも含む。したがって用語「活性断片」は、対応する完全長ペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有する、本発明の完全長ストレシンペプチドのペプチド部分に関する。アポトーシス及び炎症の阻害を測定するのに適した方法の非制限的な例は、本明細書に示す。

アミノ酸残基の付加は、それによって本発明のペプチドを担体と都合よく結合させることができる「リンカー」を与える目的で、本発明のペプチドのいずれかの末端において実施することができる。このようなリンカーは通常少なくとも１つのアミノ酸残基であり、４０以上の残基、より多くの場合１〜１０残基であってよい。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸などである。

本発明のペプチドは、ペプチドを含む大きな複合体を生成させるような方法で、互いに結合させるか或いは凝集させることもできる。このような大きな複合体は有利である可能性がある、何故ならそれは、循環中のより長い半減期又はより高い活性などの新たな生物学的性質を有するからである。

ペプチド模倣体
ペプチド模倣体は、ペプチド及びタンパク質の幾つかの構造態様を模倣することによって、タンパク質と結合することができる小分子である。ペプチド模倣体は、細胞性及び他の受容体のタンパク質及びペプチドリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストとして、且つ酵素の基質及び基質類似体として、科学及び医学分野で広く使用されている。

ペプチド模倣体の設計における主な目的は、ペプチダーゼによる切断及び不活性化に対する模倣体の感受性を低下させることとなっている。一手法では、１つ又は複数のアミド結合が、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、又は任意の他の共有結合だけには限られないが、これらを含めたさまざまな化学官能基によって、ほぼ等配電子式に置換されている。他の手法では、Ｄ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などのさまざまな非コード又は修飾アミノ酸を使用して、哺乳動物ペプチドを修飾している。

ストレシンペプチドが、ＢＡＬＢ／ｃマウスに全身γ線照射（６．５Ｇｙ）を施すことによる過剰なｐ５３活性化及び組織障害による死から、生物を保護することができるかどうかを試験すること。レトロインベルソペプチドを使用して、延長したｉｎ ｖｉｖｏ半減期が利点を与えるかどうかを測定した（実施例６参照）。レトロインベルソペプチドはプロテアーゼに耐性があり、逆の順序のＤ−アミノ酸からなり、改変されているが側鎖の方向が不変であるペプチド骨格を与える（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ、１９９８）。

本明細書で使用する用語ストレシン−１ペプチドの「レトロインベルソペプチド」は、例えば本発明の変形において使用するように、ストレシン−１中の配列と比較してアミノ酸の配列が逆であり、逆の順序のＤ−アミノ酸からなるペプチドを含むものとする。

したがって本発明は、配列番号５〜８のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有する、レトロインベルソストレシンペプチドを提供する。

骨格は炭素、窒素、酸素、イオウ及びリンを含めたさまざまな原子型を含むことができ、骨格鎖原子の大部分は典型的には炭素からなる。末端グアニジノ又はアミジノ基を含む複数の側鎖部分が骨格と結合する。隣接する側鎖部分の間の空間は典型的には一致するが、本発明で使用する送達促進輸送体は、骨格に沿った側鎖部分の間のさまざまな空間も含み得る。

細胞死及びｐ５３阻害
アポトーシス、即ち「プログラムされた細胞死」は、細胞が「細胞自殺」のプログラムを行うプロセスである。アポトーシスのプログラムは、ほぼ全ての多細胞生物、並びに個々の生物中の全細胞の進化の過程で保たれていると現在考えられている。さらに、多くの場合アポトーシスは、健康に生存している細胞において能動的に阻害されるに違いない「デフォルト」プログラムである可能性があると考えられる。

アポトーシスを引き起こす細胞による決定は、さまざまな制御刺激及び環境因子によって影響を受ける可能性がある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５）。アポトーシスの生理的活性化因子には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆａｓリガンド、形質転換成長因子−β、神経伝達物質グルタミン酸、ドーパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸、成長因子の損失、マトリクス結合の消失、カルシウム及び糖質コルチコイドがある。アポトーシスの損傷関連誘導因子には、熱ショック、ウイルス感染、細菌毒素、癌遺伝子ｍｙｃ、ｒｅｌ及びＥ１Ａ、腫瘍抑制因子ｐ５３、細胞溶解性Ｔ細胞、酸化剤、遊離基及び栄養失調（代謝拮抗物質）がある。療法関連のアポトーシス誘導因子には、γ線放射、ＵＶ放射、及びシスプラチン、ドキソルビシン、ベロマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセート及びビンクリスチンを含めたさまざまな化学療法剤がある。毒素又はアポトーシス関連誘導因子には、エタノール及びｄ−アミロイドペプチドがある。アポトーシスは、それがニューロンなどの通常再生しない細胞中で病的に起こると、非常に壊滅的な結果を有する可能性がある。このような細胞はそれらが死ぬときに交換されないので、その消失は侵される器官の衰弱及び時には致死的な機能障害につながる可能性がある。このような機能障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎及び小脳変性症を含めた増大したアポトーシスと関係がある幾つかの神経変性障害において明らかである。

一態様では本発明は、真核生物細胞中のアポトーシスを予防又は阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明のペプチドがストレス応答を媒介する機構と無関係に、且ついずれかの理論又は作用機構によって縛られることを望まずに、本発明のペプチドはｐ５３と結合することができ、したがってｐ５３が損傷ＤＮＡと結合するのを妨げることができると仮定される。

ｐ５３の考えられる治療阻害剤は、ｐ５３シグナル経路の任意の段階で作用し、ｐ５３媒介型応答の機能不活性化（即ち、ｐ５３依存性増殖の停止、アポトーシス、又は両方の阻害）をもたらす化合物である。従来の研究者は治療用ｐ５３阻害剤を考えなかった、何故なら治療によるｐ５３の抑制は、癌性腫瘍の発症及び増殖をもたらす不都合なことであると考えたからである。したがって本発明は、ｐ５３活性の治療的及び可逆的阻害、及びこのような阻害が可能であるペプチドを対象とする。

しかしながら、アポトーシス又は炎症関連障害において役割を果たすｐ５３又は任意の他のタンパク質の抑制に関する治療を実施する前に、言及しなければならない幾つかの目的がある、例えば：
ａ）治療薬剤としてｉｎ ｖｉｖｏで実際投与するのに充分有効である阻害剤を与えること、
ｂ）治療において使用するのに充分低い毒性を有し、さらにｐ５３活性を阻害するのに充分な濃度で望ましくない副作用を引き起こさない阻害剤を与えること、
ｃ）可逆的である阻害を示すこと。長期のｐ５３不活性化は、例えば癌の危険性を著しく増大させる可能性がある、
ｄ）一時的なｐ５３の不活性化中、細胞は施したストレスから回復しなければならず、ｐ５３活性化シグナルは排除するか或いは減少させなければならず、他の場合ｐ５３活性の回復は、ｐ５３活性化シグナルが活性状態である一方で、細胞の損傷をもたらす可能性がある、
ｅ）ｐ５３抑制治療は、癌進行の頻度の劇的な増大とは関係がない。

本発明のペプチドは単独で、或いは例えば癌治療中に化学療法又は放射線療法と共に使用して、癌治療或いは疾患又は外傷によって加えられるストレスによるｐ５３プログラム型の死から正常細胞を保護することができる。さらに化学療法中、腫瘍細胞と正常細胞の両方が破壊される。正常細胞と比較して腫瘍細胞が優先的に殺傷され、このことは首尾良い化学療法の基盤である。治療用ｐ５３阻害剤を投与することによって、例えば正常細胞が保護され、したがって化学療法剤の用量を増大させて、癌をさらに効率よく治療することができる。

本発明のペプチドは必ずしもｐ５３活性の調節によって作用するわけではないことは理解されるはずである、何故ならこれらのペプチドの幾つかは、ｐ５３欠損細胞系及びｐ５３活性のアッセイにおいて抗アポトーシス活性を示したからである。

アポトーシスを測定するための方法
アポトーシスは細胞の能動的な、遺伝子誘導型の自己破壊プロセスであり、特徴的な形態及び生化学的変化と関係がある。核及び細胞質凝縮、並びに膜結合アポトーシス体への死細胞の断片化は、アポトーシスの典型的な特徴である。アポトーシス細胞死の他の特徴は、特定のヌクレアーゼの活性化後のオリゴヌクレオソーム断片への染色体ＤＮＡの分解である。

「アポトーシスを阻害する」又は「アポトーシス活性を阻害する」によって、未処理対照（即ち、本発明のペプチドに曝していない細胞）と比較した、アポトーシスを経る細胞数の任意の減少を意味する。好ましくは減少は少なくとも２５％であり、より好ましくは減少は少なくとも５０％であり、及び最も好ましくは減少は少なくとも１倍である。

フローサイトメトリーは、アポトーシスを測定するための広くさまざまな可能性を与える。異なる方法が確立され実施されており、その幾つかは細胞表面を染色し、その幾つかは細胞内を染色する。

最初の手法の１つは、アポトーシス細胞は縮小し高い細胞内粒度を有するという観察結果以外に、ＤＮＡ特異的蛍光色素（例えばヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、臭化エチジウム［ＥｔＢｒ］）で染色することであった。致死的衝撃が誘導されるや否や、ＤＮＡはその概略を変え始める。アポトーシスＤＮＡは断片ＤＮＡ（アガロースゲル中で短いバンド、いわゆるＤＮＡラダーとして目に見える状態になる）からなるだけでなく、単ヌクレオチドに一部分が消化されるので、したがって、ＰＩ又はＥｔＢｒのような蛍光色素は少ないＤＮＡを染色する（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）。これは典型的には、（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡからの）ＦＡＣＳｃａｎ（商標）中の特異的蛍光色素検出チャンネルにおける、サブＧ１ピークと呼ばれる左部分への移動によって観察される。

他の方法は、ＤＮＡ鎖切断部の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介型末端標識である（ＴＵＮＥＬ）。ＴＵＮＥＬ法は、アポトーシスを経ている細胞中のＤＮＡ鎖切断部を検出する。ＴｄＴは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ端へのデオキシリボヌクレオチド３リン酸の付加を触媒する酵素である。正常細胞と異なり、アポトーシス細胞の核はＴｄＴの存在下で外因性ヌクレオチド（ｄＵＴＰ）−ＤＩＧを取り込む。抗ＤＩＧ抗体断片及び結合する蛍光色素は、アポトーシス細胞を目に見える状態にすることができる。アポトーシス細胞の増大は多数のＤＮＡ断片、したがってより明るい蛍光色素をもたらす。この方法の１つの利点は非常に高い特異性である（Ｇａｖｒｉｅｌｉら、１９９２）。この方法の１つの欠点はそれが高価であり、時間集約的であるため小さなサンプル組にのみ使用することができることである。したがって、これは大規模なスクリーニングプログラムには適用できない。

アポトーシスの初期中の細胞膜極性の消失、及び細胞膜の外側での多量のホスファチジルセリン（ＰＳ）の提示は、さらに新しい手法につながる。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、ＰＳに対する高い親和性を有するカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。細胞膜の完全性は、アポトーシスの初期段階及び中期段階に保たれる。初期及び中期のアポトーシス細胞はＡｎｎｅｘｉｎとＦＩＴＣの増大した結合性を示し、大部分はＰｉ染色に陰性である。膜の分解による表面上でのＰＳ提示及び細胞内核酸のＰＩ染色のため、後期アポトーシス段階及び壊死細胞は二重陽性になる。この方法はさらに、コストがかかり労力を要する。

ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシスを測定するための他の方法は、米国特許第６，７２６，８９５号及び６，７２３，５６７号中に開示されている。

炎症ストレス応答並びにＴＮＦ−α及びＩＬ−６媒介の炎症
哺乳動物のストレスに対する応答には、ストレスを受ける細胞の応答だけではなく、組織維持及び治癒（Ｃｏｈｅｎ、２０００）に働く多数の免疫活性を含む、炎症として知られる免疫系の複合活性（Ｎａｔｈａｎら、２００２）もある。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、集合的に前炎症性サイトカインと呼ばれる重要な生物物質である。これら、及び幾つかの他の関連分子は、感染物質の免疫認識と関係がある炎症応答を媒介する。炎症応答は、病的感染の制限及び調節において重要な役割を果たす。

高レベルの前炎症性サイトカインは、毒性ショック症候群、慢性関節リウマチ、骨関節炎、糖尿病及び炎症性腸疾患などの幾つかの自己免疫の疾患とも関係がある（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら、１９８４）。これらの疾患では、慢性的な炎症の増大は、観察される大部分の異常病態生理を悪化させるか或いは引き起こす。

これらの疾患における考えられる薬剤介入の重要且つ認められている治療手法は、ＴＮＦ（その分泌された細胞遊離形でＴＮＦ−αとも呼ばれる）及びＩＬ−６などの前炎症性サイトカインを減少させることである。幾つかの抗サイトカイン療法が、現在臨床試験において存在する。幾つかの自己免疫疾患において、ＴＮＦ−αを対象とするモノクローナル抗体を用いて有効性が実証されている（Ｈｅａｔｈ、１９９７）。これらは慢性関節リウマチ、クローン病及び潰瘍性大腸炎の治療を含む（Ｒａｎｋｉｎ、１９９７、及びＳｔａｃｋら、１９９７）。モノクローナル抗体は、可溶性ＴＮＦ−αと膜結合ＴＮＦの両方と結合することによって機能すると考えられる。

外傷性脳障害は、遅延型浮腫、壊死及び欠陥的機能をもたらす一連の事象を誘導する。有害なメディエーターが障害後に脳内に蓄積しており、且つ近年、脳障害の病態生理におけるサイトカインの役割が示唆されてきている。閉鎖性頭部障害後のラット脳内のＴＮＦ−α及びＩＬ−６活性の、空間的及び時間的誘導が以前に報告されている。ＴＮＦ−α生成の阻害剤ＨＵ−２１１は、実験モデルにおいて閉鎖性頭部障害の結果を改善することが示された（Ｓｈｏｈａｍｉら、１９９７）。アテローム性動脈硬化症には炎症要素があることが知られており、ＩＬ−Ｉ及びＴＮＦなどのサイトカインは、この疾患を助長することが示唆されてきている。

前炎症性サイトカインＩＬ−６は急性相応答と関係してきている。ＩＬ−６は、多発性骨髄腫及び関連形質細胞悪液質を含めた幾つかの腫瘍疾患における増殖因子である（Ｔｒｅｏｎら、１９９８，）。ＩＬ−６は、中枢神経系内の炎症の重要なメディエーターであることも示されてきている。高レベルのＩＬ−６が、ＡＩＤＳ痴呆合併症、アルツハイマー病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＣＮＳ外傷並びにウイルス性及び細菌性髄膜炎を含めた幾つかの神経障害において見られる（Ｇｒｕｏｌら、１９９７）。ＩＬ−６は骨粗しょう症においても重要な役割を果たす。ネズミモデルにおいて、ＩＬ−６は骨の再吸収に影響を与え、溶骨活性を誘導することが示されてきている（Ｅｒｓｈｌｅｒら、１９９７）。

ＷＯ０１／０１９８６は、ＴＮＦ−αを阻害する能力を有すると言われる特定の化合物を開示する。ＷＯ９８／５２５５８は、サイトカイン媒介型疾患の治療において有用であることが示されているヘテロアリール尿素化合物を開示する。ＷＯ９９／２３０９１は、抗炎症剤として有用である他のクラスの尿素化合物を開示する。ＷＯ９９／３２４６３はアリール尿素、並びにサイトカイン疾患及びタンパク質分解酵素媒介型疾患を治療する際のそれらの使用に関する。

本発明は、リポ多糖（ＬＰＳ）又はＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの内生活性物質に応答したマクロファージ細胞によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６分泌の両方を阻害及び遮断する際に、ストレシンペプチドが有用であることを示す（実施例７参照）。したがって、これらのペプチドは、免疫細胞中の前炎症性シグナル経路を変えることができる。以下でストレシン−１に関して実証するように、本発明のペプチドはストレスに対する炎症性免疫応答を下方制御する際に役割を果たす。

本発明はさらに、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒト多発性硬化症の動物モデルに例示されるような、自己免疫疾患に対するストレシンペプチドの抗炎症性を実証する（実施例８参照）。

医薬組成物及び治療用途
他の態様では本発明は、治療有効量の本発明のペプチド及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本明細書で使用する「医薬組成物」は、本明細書に記載する１つ又は複数の物質、又は生理的に許容されるその塩又は溶媒、並びに生理的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学要素の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

活性成分としてペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物の調製物は、当技術分野でよく知られている。典型的には、このような組成物は注射液として、液体溶液又は懸濁液として調製されるが、しかしながら、注射前に懸濁又は可溶化させることができる固体形を調製することもできる。調製物は乳化させることもできる。活性治療成分は、薬剤として許容され、活性成分と適合性がある無機及び／又は有機担体と混合させる。担体は、医薬組成物に加えると適切なコンシステンシーを与えるか或いは組成物を形成する不活性物質を多かれ少なかれ含む、薬剤として許容される賦形剤（賦形薬）である。適切な担体は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せである。さらに、望むならば組成物は、活性成分の有効性を増大させる湿潤剤又は乳化剤及びｐＨ緩衝剤などの、微量の補助物質を含むことができる。

本明細書に記載するペプチドの毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において標準的な調剤手順によって、例えば対象化合物のＩＣ_５０（５０％の阻害をもたらす濃度）及びＬＤ_５０（試験動物の５０％の死を引き起こす致死的用量）を測定することによって測定することができる。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトにおいて使用するための一定範囲の用量を配合する際に使用することができる。使用する剤形及び利用する投与経路に応じて、用量が変わる可能性がある。患者の状態を鑑みて個々の医師によって、正確な配合、投与経路及び用量を選択することができる（例えばＦｉｎｇｌら，１９７５を参照）。

本発明の投与用組成物中に使用する活性物質の量は、標的徴候用の個々の活性物質の目的を実施するのに有効な量である。組成物中の活性物質の量は典型的には、薬理学的、生物学的、治療的、又は化学的に有効な量である。しかしながら、その量は組成物を単位剤形で使用するときの量未満であってよい、何故なら単位剤形は、複数の化合物又は活性物質を１つの組成物中に含む可能性があり、或いは分配された薬理学的、生物学的、治療的、又は化学的に有効な量を含む可能性があるからである。したがって全有効量を、全体に有効量の活性物質を含む累積単位で投与することができる。

本発明のペプチドの治療上有効な量は、患者に投与したときに抗アポトーシス活性及び／又は抗炎症活性を示すことができる量である。本発明のペプチドの抗アポトーシス活性を検出するためのアッセイには、ヨウ化プロピジウム及び臭化エチジウムなどの特異的蛍光色素を用いたＤＮＡ染色、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイなどだけには限られないが、これらがあり、このようなアッセイの幾つかの非制限的な例は以下の実施例中に示す。ペプチドの抗炎症活性を検出するためのアッセイも当技術分野でよく知られており、このような方法の非制限的な例は以下の実施例中に示す。

本発明のペプチドの適切な用量は患者の投与経路、年齢、体重、性別又は状態に応じて変わり、最終的には医師により決定されるべきであるが、ヒト成人に適した用量は一般に約０．２〜２０００ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約２〜２００ｍｇ／体重１ｋｇであってよい。

本発明の医薬組成物は、本発明の１つ又は複数の化合物、及び１つ又は複数の賦形剤又は希釈剤を含む。一実施形態では、１つ又は複数の化合物、又は溶媒和物、又はこれらの化合物の塩。

本明細書で使用する用語「薬剤として許容される塩」は、生きている生物に対して実質的に無毒である塩を指す。典型的な薬剤として許容される塩は、薬剤として許容される鉱酸又は有機酸と本発明の化合物の反応によって調製される塩を含む。このような塩は酸付加塩としても知られている。

化合物及び活性物質を含む組成物は、選択した生物系への活性物質の送達、及び送達物質なしの活性物質の投与と比較して、活性物質の増大又は改善した生物学的利用能において有用性がある。より活性のある物質の一定時間の送達、によって、或いは特定時間期間（有効な即時型又は遅延型送達など）又は一定時間期間（持続型送達など）の活性物質の送達によって、送達を改善することができる。

本発明に従い使用するための医薬組成物は、薬剤として使用することができる調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び助剤を含む、１つ又は複数の生理的に許容される担体を使用する従来の方法で配合することが、したがって可能である。適切な配合は、選択する投与経路に依存する。

経口、腹膜内、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、クモ膜下、局所、直腸、頬、吸入又は鼻腔内だけには限られないが、これらを含めた任意の従来の経路及び適切な経路によって、医薬組成物を局所又は全身に投与することができる。

注射用に、本発明の化合物を水溶液、好ましくは生理的に適合性があるバッファー、ハンクスの溶液、リンガーの溶液又は生理食塩水バッファーなどに配合することができる。経粘膜投与用に、障壁に浸透させるのに適した浸透剤を配合において使用する。このような浸透剤、例えばＤＭＳＯ、又はポリエチレングリコールは当技術分野で一般的に知られている。

経口的に使用することができる医薬組成物には、ゼラチンでできた押し出しカプセル、並びにゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密封カプセルがある。押し出しカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び場合によっては安定剤と混合させて活性成分を含むことができる。

軟質カプセルにおいては、活性化合物を適切な液体、脂肪油、液状パラフィン、又は液状ポリエチレングリコールなどに溶解又は懸濁させることができる。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与に関する全ての配合は、選択する投与経路に適した用量内でなければならない。

或いは、本発明の化合物は経口用液体調製物、例えば水性懸濁液又は油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、又はエリキシル剤などの中に取り込ませることができる。さらに、これらの化合物を含む配合物は、使用前に水又は他の適切な媒体で還元するための乾燥品として示すことができる。このような液体調製物は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び硬化食用油などの懸濁剤；レシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシアなどの乳化剤；アーモンド油、ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、及びエチルアルコールなどの（食用油を含むことができる）非水性媒体；並びにメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸及びソルビン酸などの防腐剤のような従来の添加剤を含むことができる。

吸入による投与用に、本発明に従い使用するためのペプチドは、適切な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用する加圧パック又はネブライザーから、エアロゾルスプレー物質の形で送達することが好都合である。加圧エアロゾルの場合、測定量を送達するためのバルブを与えることによって用量単位を測定することができる。吸入器又は吹き入れ器において使用するための、ペプチドとラクトース又は澱粉などの適切なパウダーベースの粉末混合物を含む、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを配合することができる。

本発明の医薬組成物は、局所及び病巣内施用にも有用である。本明細書で使用する用語「局所」は、「特定の表面両域に関すること」、例えば皮膚及び粘膜を意味し、前記表面のある領域に施す局所用物質は、それが施される領域のみに影響を与えると思われる。ペプチド／ペプチド類似体の配合物はゲル、軟膏、クリーム、乳濁液、経皮パッチを含めた徐放性製剤として局所に投与することができ、薬剤を局所投与するのに適したリポソーム及び任意の他の薬剤として許容される担体を含むことができる。本明細書に記載した医薬組成物は、適切な固体状のゲル相担体又は賦形剤も含むことができる。このような担体又は賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーがあるが、これらだけには限られない。

他の態様では本発明は、生物の細胞中の細胞性及び免疫性ストレス関連の応答を調節するための方法であって、有効量の本発明のペプチドに細胞を曝すことを含む方法を提供する。

他の態様では本発明は、炎症状態の症状及び／又は変性疾患及び障害を治療又は予防するための方法であって、疾患に罹患した患者に本発明のペプチドを治療有効量投与することを含む方法に関する。本発明のさらに他の態様は、外傷又は疾患に起因する正常細胞の死を減らすか或いは排除する方法であって、ストレス関連のタンパク質活性を阻害するために本発明によるペプチドを治療有効量生物に投与することを含む方法を提供することである。

幾つかの実施形態ではペプチドは、有効量の前記ペプチド及び薬剤として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物の形である。

ストレス関連の応答は、例えば神経変性疾患（例えば脳卒中、パーキンソン病及びアルツハイマー病）、心筋梗塞などの病状、放射線又は化学療法剤への曝露、炎症、障害（例えば、火傷及び中枢神経系障害）、細胞の加齢、高熱、発作、低酸素症（例えば、虚血及び脳卒中）、並びに移植組織及び移植前の器官における疾患及び障害を含めた、疾患及び障害に付随する。

これらの状態は、身体の正常な構成成分の少なくとも１つに対する個体の免疫の状態によって特徴付けられる自己免疫疾患も含む。ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス病）と関係がある感染、グージェロ−シェーグレン症候群（又はシェーグレン病）及びリウマチ性多発性関節炎だけには限られないが、これらを含めた病状、並びにサルコイドーシス及びオステオペニア、脊椎関節炎、強皮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血症、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、突発性紫斑病による出血、インシュリン依存型糖尿病、筋無力症、尋常性天ぽうそう、悪性貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎、乾癬及び突発性不妊症などの病状、並びに移植片拒絶及び移植片対宿主病中に観察される即時型又は遅延型現象において、これらの現象が特に観察される。特定の一実施形態では、本明細書の実施例８中に例示するように、本発明のペプチドは多発性硬化症を治療するのに有用である。

移植片拒絶の現象は、患者に計画的に移植した外来成分（例えば、血液、脳脊髄液などの体液、細胞、組織、器官、抗体など）に対する個体の免疫の状態である。

本明細書で使用する用語「変性障害」、「変性疾患」及び「変性状態」は、不適切な細胞増殖又は不適切な細胞死、或いは幾つかの場合この両方、或いは異常又は制御不能なアポトーシスによって特徴付けられる任意の障害、疾患又は状態を対象とする。これらの状態は、単細胞のレベルにおいて適切で制御可能ではあるが、過剰なアポトーシスが器官の機能不全又は障害と関係がある状態も含む。

一実施形態ではペプチドは、腫瘍性障害を有し癌を治療するための化学療法及び／又は放射線療法を受けている対象中の非悪性組織又は細胞における、細胞死を予防するのに有用である。

本明細書で使用する用語「炎症疾患」及び「炎症状態」は、過剰又は制御不能な炎症応答が過剰な炎症症状、宿主組織損傷、又は組織機能の消失をもたらす任意の疾患又は状態を意味する。

一実施形態では、炎症疾患又は炎症状態は自己免疫疾患である。特定の実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。

本明細書で論じるように、他の実施形態では炎症疾患又は炎症状態は、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αから選択される少なくとも１つの前炎症性サイトカインの生成と関係がある病因を有する。

以下の実施例は、単なる例示的且つ非制限的な性質のものとして考えられる。多くの改変、変更、及び変形を本発明の範囲から逸脱せずに作製することができることは、本発明が関係する分野の当業者には明らかであると思われる。

（実施例１）
ファージディスプレイライブラリーからのペプチドの選択：
記載された通りに（Ｈｅｒｋｅｌら、２００４）、モノクローナル抗ＰＡｂ−４２１抗体Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２を作製し、特徴付けした。簡潔に言うと、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＡｂ−４２１で３回免疫処置し、最高の抗ＰＡｂ−４２１力価を生じたマウスの脾臓細胞をＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させた。増殖細胞の上清を、ＰＡｂ−４２１及びＤＮＡとの結合に関してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。Ｉｄｉ−１とＩｄｉ−２のハイブリドーマを単離し、限界希釈によって２回クローニングした。

Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト、ドイツからのＰｈ．Ｄ．−７又はＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーを、製造者の教示書に従いスクリーニングした。簡潔に言うと、Ｉｄｉ−１又はＩｄｉ−２モノクローナル抗体によって３ラウンドの選択を実施し、共通のペプチド配列をファージＤＮＡの塩基配列決定によって同定した。次いで候補ペプチドをＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｉｓ（Ｐａｍｐｉｓｆｏｒｄ、ＵＫ）によって合成し、本明細書で以後記載するように機能アッセイにおいてさらに試験した。

（実施例２）
ｐ５３媒介型の増殖停止に対する候補ペプチドの作用の調査。
選択した候補ペプチドは、内因性ｐ５３活性を欠きｐ５３遺伝子又は対照ベクターによって安定してトランスフェクトされているＬ１２細胞系（Ｗｏｌｆ、１９８４）の、高熱に対する応答を阻害するそれらの能力を試験することによって、ｐ５３媒介型の細胞性ストレス応答に干渉するそれらの能力に関して試験した。これらの細胞ではｐ５３活性が、高熱に応答してアポトーシスではなく増殖停止及び細胞生存を誘導する（Ｎｉｔｔａ、１９９７）。

細胞死の量は、重要な色素であるトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）で細胞を染色することによって、及び光学顕微鏡を用いた視野当たりの死細胞／生存細胞の比を計算することによって評価した。

結果：４２℃で２時間のインキュベーションによって、ｐ５３を欠く全細胞の死、及び対照的に、活性ｐ５３を有する約８０％の細胞の一時的な増殖停止及び生存を誘導した。１００μｇ／ｍｌの濃度で高熱後にｐ５３媒介型の増殖停止を阻害し、ｐ５３活性を欠くＬ１２細胞の応答である（表１）活性ｐ５３を有するほぼ全ての細胞の死を誘導した、（ストレス応答性特異的ペプチド阻害剤に関する）ストレシン−１〜−４で表す４個のペプチドを同定した、ペプチド配列は表２中に示す。

（実施例３）
ＤＮＡ損傷によって誘導されるｐ５３媒介型の細胞死に対するストレシンペプチドの作用。
Ｌ１２細胞を５０μＭのＤＮＡ損傷剤シスプラチンで４８時間治療し、ｐ５３媒介型の細胞死はヨウ化プロピジウムで染色した細胞のＤＮＡ含量を測定することによって判定した（図１）。ペプチドの不在下でインキュベートした細胞は、シスプラチン治療及びｐ５３媒介型の細胞死に応答した。

結果：ＦＡＣＳ分析は、ストレシン−１又はストレシン−２を用いた治療が、ｐ５３媒介型の細胞死からそれぞれ３５％又は２５％の細胞を救済したことを示す。

（実施例４）
非形質転換細胞におけるｐ５３媒介型の細胞死に対するストレシンペプチドの作用。
マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、実施例３中に記載したようにストレシン−１ペプチドの存在又は不在下においてシスプラチン（８０μＭ）で治療し、細胞死は重要な色素であるニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）の取り込みによって評価し、５４０ｎｍでのＯ．Ｄ．はＥＬＩＳＡリーダー中で読み取った。

生存能力のある細胞の割合を図２Ａ中に表す；生存能力は以下の等式によって計算した：
細胞の生存能力＝サンプルのＯＤ_５４０×１００／未治療細胞のＯＤ_５４０。
治療細胞の顕微鏡写真は図２Ｂ中に表す。

図２は、５０μＭの濃度において最高の有効度で用量依存式に８０μＭのシスプラチンによって誘導されたＭＥＦ細胞の細胞死を、ストレシン−１が阻害したことを示す。

（実施例５）
毒性ストレスによって誘導した細胞死に対するストレシンペプチドの作用。
ストレシンペプチドが毒性ストレスから保護することができるかどうかを調べるために、一次肝細胞培養物を０．６％の濃度でエタノールと共に、或いはエタノールなしで、且つ５０μＭのストレシン−１と共に、或いはペプチドなしでインキュベートした。４８時間後、死細胞と生存細胞の数をトリパンブルー排除によって測定した（表３）。

結果：エタノールに曝した全ての肝細胞はストレシン−１の不在下で死んだ、対照的にストレシン−１は、エタノール誘導型の細胞死から２０％の肝細胞を救済した。

（実施例６）
γ線照射を施したマウスに対するストレシンペプチドの作用
ＢＡＬＢ／ｃマウスは全体にγ線照射（６．５Ｇｙ）を施した。照射後１時間で、いずれも５００μｇ／マウスの濃度でストレシン−１（ｎ＝７；配列番号１）又は修飾型レトロインベルソストレシン−１ペプチド（ｎ＝７；配列番号５）をマウスの腹膜内に与え、或いは生理食塩水を擬似注射した（ｎ＝６）。レトロインベルソペプチドを使用して、長期のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が利点を与え得るかどうか測定した。

結果：１７日後、擬似治療群の６６％が死んだ、対照的に、ソストレシン−１ペプチドで治療したマウスは死なず、修飾型ストレシン−１ペプチドで治療したマウスのわずか２９％が死んだ。４０日後、擬似治療群中のわずか３３％が放射線疾患から回復し、対照的に、修飾型又は非修飾型ストレシン−１ペプチドで治療したマウスの５７％及び８６％が放射線疾患から回復した（図３）。

（実施例７）
ＬＰＳ及びＣｐＧ誘導型サイトカイン分泌に対するストレシンペプチドの作用。
ストレシンペプチドがストレスシグナルに対する炎症応答を変えることができるかどうかを調べるために、前炎症性微生物シグナル、リポ多糖（ＬＰＳ）及びＣｐＧオリゴヌクレオチドに対するＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞系の応答を試験した。細胞はストレシン−１（５０μＭ）の存在又は不在下においてＬＰＳ又はＣｐＧオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。６時間後、マクロファージ活性化の指標として、培養物上清中の分泌されたＴＮＦ−α（図４）又はインターロイキン−６（図５）の量を、特異的ＥＬＩＳＡ試薬及び抗ＴＮＦ−α及び抗ＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）によって測定した。

結果：ストレシン−１は、ＬＰＳ及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの両方によって誘導された、マクロファージ活性化並びにＴＮＦ−α及びインターロイキン−６の分泌を阻害した。

（実施例８）
ストレシン−１は実験的自己免疫疾患（ＥＡＥ）からマウスを保護する。
ＭＢＰ Ａｃ１−９特異的Ｔ細胞受容体−トランスジェニックＴｇ４マウス（Ｌｉｕら、１９９５）は、２００μｇの修飾型（位置４のＹ）ＡｃＩ−９ペプチド、フロイント完全アジュバント中を皮下に免疫処置し、次に翌日２００ｎｇの百日咳毒素を腹膜内投与した。ＭＢＰ免疫処置後１時間で、１群のマウス（ｎ＝４）に１００μｌのＰＢＳを腹膜内に与え、他群のマウス（ｎ＝６）には１００μｌのＰＢＳ中の５００μｇのストレシン−１ペプチドを腹膜内に与えた。次いでマウスを、臨床ＥＡＥ値を評価することによって実験的自己免疫脳脊髄炎の進行に関して試験した。図６において見ることができるように、ストレシン−１はＥＡＥからマウスを保護する。

（実施例９）
Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２可変領域の塩基配列決定。
ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＩＮＣ．）を使用してＩｄｉ−１とＩｄｉ−２のハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用するｃＤＮＡ合成用の鋳型として、そのＲＮＡを使用した。重鎖及び軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅は、各側面の定常領域に特異的なプライマー：５’ＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ 配列番号２５及び３’ＧＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣ 配列番号２６、重鎖用；５’ＣＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡ 配列番号２７及び３’ＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ 配列番号２８、軽鎖用を使用して実施した。ＰＣＲ産物を精製し、同じプライマーを使用して塩基配列を決定した。

Ｉｄｉ−１（Ｉｄｉ−１ Ｖ_Ｌ−配列番号９；Ｉｄｉ−１ Ｖ_Ｈ−配列番号１０）、Ｉｄｉ−２（Ｉｄｉ−２ Ｖ_Ｌ−配列番号１１；Ｉｄｉ−２ Ｖ_Ｈ−配列番号１２）、及びＰＡｂ−４２１の可変領域を図７中に表す。Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２のＣＤＲ配列を図７中に示し、以下の表４中にそれらの対応する配列番号と共に列挙する：

本発明を詳細に記載してきたが、多くの変形及び改変を作製することができることを、当業者は理解していると思われる。したがって本発明は、詳細に記載した実施形態に制限されると解釈されず、そうではなくて以下の特許請求の範囲を参照することによって、本発明の範囲、精神及び概念は、さらに容易に理解されると思われる。
（参考文献）

ｐ５３媒介の細胞死の指標としての、ＤＮＡ損傷剤シスプラチンで治療したＬ１２細胞のＤＮＡ含量の図である。 マウス胚繊維芽細胞のシスプラチン（８０μＭ）誘導型のｐ５３媒介の細胞死の図である。 ６．５Ｇｙの線量での照射を身体に施したときの、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するストレシンペプチドの影響の図である。 リポ多糖（ＬＰＳ）又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチドに応答して、ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＴＮＦ−α分泌がストレシン−１によって阻害されることを示す図である。 リポ多糖（ＬＰＳ）又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチドに応答して、ＲＡＷ２６４．７マクロファージのインターロイキン−６分泌がストレシン−１によって阻害されることを示す図である。 マウス中の実験的自己免疫疾患（ＥＡＥ）の進行におけるストレシン−１の阻害効果を示す図である。 ＰＡｂ−４２１、Ｉｄｉ−１及びＩｄｉ−２の可変領域のアミノ酸配列の図である。軽鎖又は重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を一直線に並べる。

Claims (30)

1. ７個から１２個のアミノ酸を含み、配列番号１〜８のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドは、抗ｐ５３抗体を対象とする抗イディオタイプ抗体と免疫反応性があるエピトープを含むペプチドであって、抗ｐ５３抗体がｐ５３のＣ末端の制御ドメインの少なくとも一部分と免疫反応性があり、ペプチドが抗アポトーシス活性及び抗炎症活性から選択される少なくとも１つの活性を示す、上記ペプチド。
2. 抗ｐ５３抗体がＰＡｂ−４２１であるか、又は
   抗イディオタイプ抗体がＩｄｉ−１及びＩｄｉ−２からなる群から選択されるか、又は
   抗イディオタイプ抗体が配列番号１５及び１８、並びに配列番号２１及び２４からなる群から選択されるＶ_Ｌ−ＣＤＲ３及びＶ_Ｈ−ＣＤＲ３配列を含む分子であるか、又は
   抗イディオタイプ抗体が配列番号９及び１０、並びに配列番号１１及び１２からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を含む分子である、請求項１に記載のペプチド。
3. アポトーシスと関係があるタンパク質と結合し、前記タンパク質が損傷ＤＮＡと結合するのを妨げる活性を示す、請求項１に記載のペプチド。
4. 哺乳動物細胞のアポトーシス活性を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、及び最も好ましくは少なくとも９５％阻害する、請求項１に記載のペプチド。
5. 免疫媒介型のストレス応答を下方制御することができる、請求項１に記載のペプチド。
6. 配列番号１〜４のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
7. 配列番号５〜８のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
8. 配列番号１、２及び５のいずれか１つに挙げたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
9. 配列番号１〜８のいずれか１つに挙げたペプチド。
10. 配列番号１に挙げたペプチドである請求項９記載のペプチド。
11. 活性成分として、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド又は薬剤として許容されるその塩、及び薬剤として許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
12. 生物の細胞中のアポトーシス、先天性免疫応答及び自己免疫応答から選ばれた細胞性及び免疫性ストレス関連の応答を調節するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド又は薬剤として許容されるその塩の有効量を含む、上記医薬。
13. ストレスがＤＮＡ損傷剤、高熱、毒性ストレス又は照射と関係がある請求項１２に記載の医薬。
14. ストレス関連の応答が、筋萎縮性側索硬化症、中枢神経系障害、発作、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後の二次変性、脳卒中、ＣＮＳ中毒、緑内障、黄斑部変性、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、移植片対宿主病、移植片拒絶、関節炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、成人呼吸促拍症候群（ＡＲＤＳ）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、放射線疾患、高熱、低酸素症、劇症中毒性肝炎、腎不全及び不妊症からなる群から選択される障害と関係がある、請求項１２に記載の医薬。
15. ペプチドがインビボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）又はエクスビボ（ｅｘ−ｖｉｖｏ）で細胞中の細胞内タンパク質活性を調節する、請求項１２に記載の医薬。
16. ペプチドが経口、局所、経皮及び非経口から選択される経路によってその必要のある対象に投与されるものである、請求項１２に記載の医薬。
17. ペプチドが正常組織又は細胞中の細胞性及び免疫性ストレス障害に応答してアポトーシス活性を阻害する、請求項１２に記載の医薬。
18. その必要のある対象のストレス関連の変性疾患又は状態を治療するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド又は薬剤として許容されるその塩の治療有効量を含む、上記医薬。
19. 疾患又は状態がＤＮＡ損傷剤、高熱、毒性ストレス又は照射と関係がある、請求項１８に記載の医薬。
20. 前記対象が腫瘍障害を有し、癌を治療するための化学療法及び／又は放射線療法を受けている、請求項１８に記載の医薬。
21. 疾患又は状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後の二次変性、脳卒中、ＣＮＳ中毒、緑内障、黄斑部変性、心筋梗塞、放射線疾患、高熱、低酸素症、劇症中毒性肝炎、腎不全及び不妊症からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬。
22. 疾患又は状態が細胞死又はｐ５３媒介型ストレス応答と関係がある、請求項１８に記載の医薬。
23. ペプチドが経口、局所、経皮及び非経口から選択される経路によってその必要のある対象に投与されるものである、請求項１８に記載の医薬。
24. その必要のある対象の先天性免疫応答又は自己免疫応答と関係がある炎症疾患又は状態を治療するための医薬であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド又は薬剤として許容されるその塩の治療有効量を含む、上記医薬。
25. 疾患又は状態がＩＬ−６及びＴＮＦ−αから選択される少なくとも１つの前炎症性サイトカインの生成と関係がある病因を有する、請求項２４に記載の医薬。
26. 疾患が自己免疫疾患である、請求項２４に記載の医薬。
27. 疾患又は状態が１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性ブドウ膜炎、関節炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、成人呼吸促拍症候群（ＡＲＤＳ）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、移植片拒絶及び移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬。
28. 疾患が多発性硬化症である、請求項２４に記載の医薬。
29. ペプチドが経口、局所、経皮及び非経口から選択される経路によってその必要のある対象に投与されるものである、請求項２４に記載の医薬。
30. ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング又は化学ペプチドスクリーニングを用いて、抗アポトーシス活性及び抗炎症活性から選択される少なくとも１つの活性を示すペプチドを単離するための、
    配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域及びＶ_Ｈ領域を含む抗体分子の
    使用。

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