CN103998053B - 通过抑制il-4和/或il-13与其各自的受体结合来预防或治疗某些障碍的方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及治疗、缓解或预防障碍的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含抑制IL‑4和/或IL‑13与其各自的受体结合的蛋白质。在一些实施方式中，所述障碍优选地与Th2免疫应答的增加相关。在一些实施方式中，优选向肺局部施用，以便治疗、改善或预防过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎、肺纤维化、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症或成人呼吸窘迫综合征。

Description

通过抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合来预防或治疗 某些障碍的方法

技术领域

本发明涉及治疗，缓解或预防障碍的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含抑制Uniprot#P05112的配体和/或Uniprot#P35225的配体与其各自的受体结合的蛋白质。在一些实施方式中，所述障碍优选地与Th2免疫应答的增加相关。在一些实施方式中，优选向肺局部施用，以便治疗、改善或预防过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎、肺纤维化、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症或成人呼吸窘迫综合征。

背景技术

通过非共价相互作用的方式选择性地结合到选定靶标的蛋白质在生物技术、医药、生物分析以及通常的生物学和生命科学中作为试剂发挥了关键作用。抗体，即免疫球蛋白，是这一类蛋白质的突出代表。尽管在配体/靶标的识别、结合和/或分离方面对此类蛋白质存在多种多样的需求，但目前使用的几乎全部是免疫球蛋白。

其它具有抗体样功能的蛋白质性的结合分子是脂质运载蛋白家族的成员，它们已经自然进化为结合配体。脂质运载蛋白存在于多种生物体内，包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白家族成员(Pervaiz,S.,和Brew,K.(1987)FASEB J.1,209-214)，通常是小的分泌蛋白，且具有单个多肽链。它们的特征具有一系列不同的分子识别特性：其能够结合多种主要疏水性的分子(如类视黄醇，脂肪酸，胆固醇，前列腺素，胆绿素，信息素，促味剂，和添味剂)，其能够与特定的细胞表面受体结合，以及其能够形成大分子复合物。虽然过去它们基本被归类为转运蛋白，但是现在已明确脂质运载蛋白完成多种生理功能。这些功能包括参与视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导、和前列腺素的合成。还表明脂质运载蛋白参与免疫应答调控和细胞稳态(homeostasis)调节(例如Flower,D.R.,(1996)Biochem.J.318，1-14；和Flower,D.R.等人,(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,9-24的综述)。

脂质运载蛋白之间的全序列保守性非常低，通常序列同一性小于20％。与之形成强烈对比的是，它们的整体折叠模式却高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八股反平行β-折叠构成，所述β-折叠自身闭合形成连续的氢键合β-桶。该β-桶形成中央空腔。桶的一个末端被穿过其底部的N-末端肽段以及连接β-折叠段的三个肽环立体封闭。β-桶的另一端暴露于溶剂并且包括靶标结合位点，所述靶标结合位点由四个柔性肽环形成。在本应是刚性的脂质运载蛋白支架中，正是这些环的多样性产生了多种多样的不同结合模式，每一种模式能够适应不同大小、形状和化学性质的靶标(例如上文的Flower,D.R.(1996)；上文的Flower,D.R.等人(2000)；或Skerra,A.,(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,337-350中的综述)。

多种PCT公开(如，WO99/16873，WO00/75308，WO03/029463，WO03/029471和WO2005/19256)公开了可以如何构建各种脂质运载蛋白(如泪液脂质运载蛋白和hNGAL脂质运载蛋白)的突变蛋白，所述突变蛋白显示出对不同于野生型脂质运载蛋白的天然配体的靶标的高亲和力和特异性。例如，通过使四个肽环中至少一个环的一个或多个氨基酸位置发生突变，可以完成上述构建。另外，PCT公开WO2011/154420教导了一种或多种用于产生与IL-4受体亚基α结合的脂质运载蛋白突变蛋白的方法。

Th2细胞因子IL-4(正式被称为白介素-4，Uniprot#P05112)和IL-13(正式被称为白介素-13，Uniprot#P35225)很多功能重叠，并且都直接促进哮喘的若干关键特征，包括嗜酸性粒细胞、杯状细胞化生、气道高反应性、IgE免疫球蛋白开关、替代性巨噬细胞活化、平滑肌细胞重塑和上皮下纤维化。此外，IL-4、IL-13、IL-4RA(正式被称为白介素-4受体亚基α，Uniprot#P24394，SEQ ID NO:12)和Stat6的基因遗传多态性也与哮喘相关。这是特别相关的，因为IL-4、IL-13、IL-4RA和Stat6的等位基因变体的组合看起来是协同的，而且所述IL-4、IL-13和IL-4RA的多态性促进Th2细胞因子或IL-4/IL-13受体共同亚基的产生、功能或信号传导活性(Finkelman等,JI,2010,184:1663-74)。最近，已由分子机制或治疗反应明确了哮喘的内在型(endotype)或亚表面。例如Woodruff等人基于IL-13诱导基因POSTN(骨膜蛋白)、CLCA1(gob5)和SERPINB2的肺上皮表达将哮喘表型分为高Th2型和低Th2型(Wooddruff PG等人,Genome-wide profiling identifies epithelial cell genesassociated with asthma and with treatment response to corticosteroids PNAS,2007,104:15858-63；Prescott G.Woodruff)(T-helper Type2-driven inflammationdefines major subphenotypes of Asthma,Am.J.Respir.Crti.Care Med.,2009,180:388-395)。

因此，获得改进的治疗方法是令人期待的，所述方法涉及治疗有效量的包含人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的组合物，所述突变蛋白以高结合亲和力结合至IL-4RA、并因此抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合，并在有此需要的受试者中显示出体内治疗活性。在本申请中使用时，有此需要的受试者可以是需要治疗或预防某种障碍的哺乳动物，举几个说明性的例子，如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿如猕猴(cynomolgus)。

发明内容

本发明涉及一种治疗、缓解或预防障碍的方法，该方法包括给需要组合物的受试者施用治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物包含能够抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合的本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些进一步的实施方式中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够破坏IL-4和/或IL-13诱导的下游信号传导和/或细胞反应。在各种实施方式中，所述障碍是其中IL4/IL13通路促进疾病发病的障碍。在各种进一步的实施方式中，所述组合物可以向肺局部施用。在各种优选的实施方式中，所述组合物可通过气溶胶吸入施用。在一些更优选的实施方式中，所述组合物给有此需要的受试者的施用频率选自：达到每日四次、达到每日三次、达到每日两次、达到每日一次、达到每隔一日一次、达到每隔两日一次、达到一周一次和达到每隔一周一次。

在一些实施方式中，在本申请中使用时，需要所述组合物的受试者正患有其中IL-4表达和/或IL-13表达促进疾病发病或恶化或与疾病发病或恶化相关的障碍。在一些实施方式中，需要所述组合物的受试者正患有可以通过去除、抑制或减少IL-4活性和/或IL-13活性而改善、缓解或抑制的障碍。在一些进一步的实施方式中，需要所述组合物的受试者可以正患有包括例如以下的一种或多种障碍：过敏性炎症、过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎、肺纤维化、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症或成人呼吸窘迫综合征。在一些实施方式中，也可以设想本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白应用于组织纤维化的治疗、缓解或预防(参见Chiaramonte等人.(1999),J.Clin.Invest.104(6),777-785。纤维化优选可以因伤口愈合导致，例如，从外科手术切口而致的伤口。组织纤维化影响例如选自以下的组织：肝、皮肤表皮层、皮肤内皮层、肌肉、肌腱、软骨、心脏组织、胰腺组织、肺组织、子宫组织、神经组织，睾丸、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、小肠、胆道和肠道；特别地，所述组织选自肺和肝。

例如，可以通过本发明所述方法优选治疗、缓解或预防的一种障碍与Th2免疫应答的增加相关。

在一些实施方式中，所述障碍可以与过敏反应或过敏性炎症相关，优选地，所述过敏反应是食物过敏，并且优选地，所述过敏性炎症与过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎相关。在各种优选的实施方式中，过敏性哮喘可以是其中IL4/IL13气道促进疾病发病的气道炎症。

在其它优选的实施方式中，本发明所述组合物进一步包含抗过敏药物和/或抗过敏性炎症药物。

另一种可以通过本发明所述方法优选治疗、缓解或预防的示例性障碍与粘液产生或粘液分泌相关。

在各种优选的实施方式中，所述障碍可以是肺障碍，优选慢性阻塞性肺疾病(COPD)或囊性纤维化(CF)。

在一个进一步的实施方式中，所述组合物可以作为用于所述各种障碍的基因治疗剂。

本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白可以是在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的位置27、28、30、31、33、53、57、61、64、66、80、83、104-106和108中的任一个或多个氨基酸位置处具有突变的氨基酸的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。然而，本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白也可以是除人泪液脂质运载蛋白之外的脂质运载蛋白的突变蛋白，所述脂质运载蛋白如人NGAL脂质运载蛋白或本文所述的其它脂质运载蛋白。

在多个优选的实施方式中，脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的位置26、32、34、55、56、58和63中的任两个或更多个氨基酸位置处具有突变的氨基酸。

在一个特别优选的实施方式中，本发明所述的脂质运载蛋白突变蛋白与成熟人泪液脂质运载蛋白的序列(SEQ ID NO:1)具有至少75％同一性。

应用于本发明所述方法的脂质运载蛋白突变蛋白优选与另一物种例如狨猿(marmoset)IL-4RA具有交叉反应性，这样允许在类似人生物体的狨猿(marmoset ape)中测试候选的脂质运载蛋白突变蛋白。所述脂质运载蛋白突变蛋白可以或不可以与来自其它非人物种的IL-4RA如小鼠IL-4RA和/或猕猴IL-4RA有交叉反应性。

通常优选地，所述脂质运载蛋白突变蛋白基本上与相关蛋白或不相关蛋白没有交叉反应性。所述相关蛋白是，例如，IL-23受体α链和/或具有纤维连接蛋白III型结构域的I型细胞因子受体，而所述不相关蛋白是，例如，IL-6受体和/或IL-18受体α链。

附图说明

图1示出TF-1细胞中本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白对人IL-4和IL-13诱导的STAT6磷酸化(基于FACS的检测)的抑制。

图2示出本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人IL-4RA/IL-13RA1(正式被称为白介素-13受体亚基α-1，Uniprot#P78552，SEQ IDNO NO:13)链双敲入小鼠中对人IL-4诱导的STAT6磷酸化(基于FACS的检测)的抑制。

图3示出本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人IL-4受体α/IL-13受体α1链双敲入小鼠的肺组织中对人IL-13诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子的抑制。

图4示出施用人IL-13前在不同时间间隔施用(图4a)或以不同剂量施用(图4b)时，以及与以不同剂量水平的IL-4突变体(图4c)比较，本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人IL-4受体α/IL-13受体α1链双敲入小鼠中对人IL-13诱导的嗜酸性粒细胞趋化因子转录物的抑制。

图5示出以尺寸排阻色谱和激光衍射对雾化的脂质运载蛋白突变蛋白的分析。

图6示出本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在气管内滴注后在人IL-4RA/人IL-13双敲入小鼠中的药代动力学性质和生物分布。

图7示出本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人气道上皮气-液-界面培养系统中对IL-13诱导的杯状细胞化生的抑制。

具体实施方式

本发明提供一种治疗、缓解或预防所述障碍的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的包含脂质运载蛋白突变蛋白的组合物，所述脂质运载蛋白突变蛋白通过与IL-4受体α链结合抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合。根据本发明所使用的脂质运载蛋白突变蛋白可以特异性地结合到IL-4受体α链。有利的是，这些脂质运载蛋白突变蛋白对IL-4受体α链具有高度结合亲和力。相较于WO2008/015239中提供的脂质运载蛋白突变蛋白，这些脂质运载蛋白突变蛋白与IL-4受体α结合特性进一步得到改善；特别是，它们具有更高的结合亲和力。

本发明的发明人已经证明，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白，由于其与IL-4受体α链的结合，干扰受体的同源配体即细胞因子IL-4和/或IL-13的相互作用，进而产生体内治疗反应。例如，从用于研究本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白可能对IL-4和/或IL-13介导的信号传导的作用的转基因小鼠模型得到的数据，证明IL-4和IL-13介导的下游信号传导的中断。该转基因小鼠，因携带编码人IL-4受体α链和IL-13受体α1链的基因而与人类似，代表了对人的治疗潜力。为此，人的基因被置于相应小鼠染色体的相应位点，从而使得该小鼠成为一种表达I型和II型受体二者的双敲入小鼠。因此，本文中使用的“治疗有效量”优选是本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人中治疗有效的量。

与本文公开的实施例相比，现有技术没有教导本领域技术人员本发明所述脂质蛋白突变蛋白是否能够干扰IL-4和/或IL-13诱导的受试者中下游信号传导或细胞反应，和/或是否能够显示在患有一种或多种如下障碍的受试者中的体内治疗活性：过敏性炎症，过敏性哮喘，鼻炎，结膜炎，肺纤维化，囊性纤维化，慢性阻塞性肺疾病，肺泡蛋白沉积症或成人呼吸窘迫综合征。也无法从现有技术引申出任何关于脂质运载蛋白突变蛋白针对这些障碍的信息。在没有任何证明脂质运载蛋白突变蛋白针对某些障碍、例如与Th2免疫应答的增加和/或与过敏反应或过敏性炎症相关的障碍有治疗效果的数据的情况下，无法合理预测出上述治疗效果以及相应的治疗、预防或缓解的方法。

实际上，本发明提供的体内数据体现了本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的治疗作用，例如示出了本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的抗炎作用。在这方面，如通过实施例5中基本所述试验测定，本发明首次证明本发明脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)能够体内有效抑制人IL-13诱导的转录物Ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)，且强于IL-4突变体(图4c中的IL-4(R121D，Y124D))：

-准备几只如实施例4所描述的人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠，不同之处在于30μL的IL-13(Peprotech公司，1μg)气管内滴注施用仅一次，

-任选地，设置如实施例5中所述的测试参数并将小鼠相应分组，

-脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)通过气管内滴注30μL的体积应用，或者在IL-13给药前在不同的时间以恒定98μg的剂量应用，或者在IL-13给药前30分钟以不同的量应用，

-还在IL-13给药前30分钟通过气管内滴注应用不同量的IL-4突变体(R121D，Y124D)30μL，

-使用简化的IL-13诱导的气道炎症模型(IL-13单次气管内施用)以评估药效反应、剂量依赖性和可比较的效力的持续时间。

考虑到鼠模型动物中存在人直系同源基因且缺乏鼠直系同源基因，因此在本发明中应用的该鼠动物模型中观察到的治疗效果为治疗应用提供了足够证据。基于这个原理，非常合理的是，在没有人患者的任何数据的情况下，体内实验足以预测体内活性，例如本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白在人中的体内抗炎活性。

此外，如通过实施例8中基本所述试验测定，本公开内容证明了本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)能够显示出与抗IL-4RA单克隆抗体(图7中的抗IL4R mAb；其轻链和重链可变区分别在SEQ ID NO:14和15中示出)一样良好的功能活性：

-每两天用约0.3至30ng/ml的人IL-13处理MucilAir^TM(使用人原代细胞体外重构的具有人气道上皮的气-液界面培养系统)，

-任选地，进行原位Alcain蓝染色(蓝色至蓝绿色的染色酸粘多糖和糖胺聚糖)，和/或进行组织学分析，以证明处理约14天后MucilAi^TM示出了杯状细胞密度的升高，

-通过比较将MucilAir^TM连续暴露于约10ng/ml人IL-1314天(为阳性对照)、连续暴露于IL-13加不同浓度的脂质运载蛋白突变蛋白、连续暴露于IL-13加不同浓度的所述抗IL-4RA单克隆抗体(轻链和重链可变区在SEQ ID NO:14和15中示出)，并以14天无IL-13培养的MucilAir^TM作为阴性对照，测试脂质运载蛋白突变蛋白对杯状细胞化生的抑制作用，

-进行Alcain蓝染色，如对表面用Alcain蓝染料进行原位染色并在相差显微镜下拍摄染色的细胞用于图像分析，

-利用公共领域的Java图像处理程序ImageJ定量Alcain蓝阳性细胞百分率，并以Alcain蓝色面积/总图像区域的面积比表示Alcain蓝阳性细胞数，

-任选地，在第14天用市售的、例如来自Meso Scale Discovery公司的超灵敏嗜酸性粒细胞趋化因子-3(IL-13诱导的趋化因子)试剂盒检测基础培养基中嗜酸性粒细胞趋化因子-3。

所述抗-IL-4RA抗体分别具有SEQ ID NO:14和15的可变轻链和重链区，由Amgen公司(前身为Immunex公司)开发，被称为AMG317。它是一个全人单克隆抗体，其阻断在哮喘中起作用的白介素-4和白介素-13的作用的能力已处于研究阶段(2008年，一项对中度至重度哮喘的不同剂量2期研究已经完成)。中期分析显示出生物活性的证据；但是，总的临床疗效没有达到预期。因此，当所述脂质运载蛋白突变蛋白与所述抗IL-4RA抗体经过上述比较时，SEQ ID NO:6的脂质运载蛋白突变蛋白能够与本文所述抗IL-4RA单克隆抗体一样良好地抑制IL-13诱导的杯状细胞化生。因此，优选地，在一些进一步的实施方式中，在上述测试中本发明的脂质运载蛋白突变蛋白对杯状细胞化生的抑制作用具有与SEQ ID NO:6的脂质运载蛋白突变蛋白相同的特性。

IL-4/IL-4Rα复合物可以与普通γ链(γC，CD132)或IL-13R阿尔法1(IL-13Rα1)亚基通过IL-4结构域二聚化，以产生两个不同的信号传导复合物，通常分别被称为I型和II型受体。或者，L-13能够结合IL-13Rα1形成IL-13/IL-13Rα1复合物，其募集IL-4Rα亚基以形成II型受体复合物。因此，IL-4Rα介导IL-4和IL-13二者的生物活性(Gessner等人的综述，Immunobiology,201:285,2000)。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白经由I型和/或II型受体有利地干扰和/或阻断信号传导，因为所述脂质运载蛋白突变蛋白能够结合到IL-4受体α链。

体外研究表明，IL-4和IL-13活化效应物在多种细胞类型中发挥作用，例如在T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、气道平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞、肺成纤维细胞和内皮细胞中(Steinke等人的综述，Resp Res,2:66,2001，和Willis-Karp的综述，Immunol Rev,202:175,2004)。IL-4Rα在多种细胞类型中以低数量表达(100-5000个分子/细胞)(Lowenthal等人,J Immunol,140:456,1988)，所述细胞类型例如外周血T细胞、单核细胞、气道上皮细胞、B细胞和肺成纤维细胞。I型受体在造血细胞中起主导，而II型受体则在造血细胞和非造血细胞上表达。

细胞表面受体和受体复合物结合IL-4和/或IL-13的亲和力不同。受体和受体复合物结合IL-4和/或IL-13的主要组分是IL-4Rα，IL-13Rα1和IL-13Rα2。这些链作为IL-4Rα/IL-13Rα1或IL-4Rα/IL-13Rα2的单体或杂二聚体在细胞表面上表达。IL-4rα单体结合IL-4，而不结合IL-13。IL-13Rα1和IL-13Rα2单体结合IL-13，但不结合IL-4。IL-4Rα/IL-13Rαl和IL-4Rα/IL-13Rα2杂二聚体结合IL-4和IL-13二者。鉴于IL-13受体阿尔法2(IL-13Rα2)以高亲和力结合IL-13、但其却是非信号传导受体(其被认为是IL-13的诱饵受体)这一事实，因此可以设想本发明的脂质运载蛋白突变蛋白优选地不结合IL-13受体α2。

如所解释的，IL-4和IL-13都通过IL-4Rα传导信号，所述IL-4Rα是I型受体(IL-4Rα和γC)和II型受体(IL-4Rα和IL-13Rα1)的组件。IL-4通过I型受体和II型受体两个途径传导信号，而IL-13仅通过II型IL-4R传导信号。IL-13也结合到所述IL-13Rα2链，该IL-13Rα2链不包含跨膜信号传导结构域而被认为充当诱饵受体。γC活化Janus激酶(JAK)3，而IL-13Rα1活化酪氨酸激酶2(TYK2)和JAK2。接着活化的JAK磷酸化STAT-6。磷酸化的STAT-6二聚化，迁移至细胞核，并结合IL-4和IL-13应答基因的启动子，例如那些与T辅助2型(Th2)细胞分化、气道炎症、气道高反应(AHR)和粘液产生相关的启动子。

Th2型免疫反应促进抗体产生和体液免疫，其对抗细胞外病原体的作用已经被详细阐述。Th2细胞是Ig产生(体液免疫)的调控因子，并产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13(Tanaka等人,Cytokine Regulation of Humoral Immunity,251-272,Snapper ed.,John Wiley and Sons,New York(1996))。Th2型免疫应答的特征在于某些细胞因子(如IL-4，IL-13)和特定类型的抗体(IgE，IgG4)的产生，而且Th2型免疫应答是典型的过敏反应，其可能会导致流泪和如气道炎症和肺内气道平滑肌细胞收缩的哮喘症状。

另外，通过应用本文所述脂质运载蛋白的本发明所述方法来优选治疗、缓解或预防的障碍可以与过敏反应或过敏性炎症相关。

在一些优选的实施方式中，所述障碍可以是过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎。

哮喘是一种复杂的、持久的、以与气道炎症关联的气道高反应性为特征的炎症性疾病。研究表明，经常使用大剂量吸入性糖皮质激素和长效支气管扩张剂或奥马珠单抗(结合到免疫球蛋白E的人源化单克隆抗体，经常被用来作为二线治疗)对所有患者可能不足以控制哮喘，从而突显出一个重要的未得到满足的需求。白介素-4、白介素-13、以及转录因子-6的信号转导子和活化子是哮喘中的气道炎症、粘液产生和气道高反应的发展中的关键因子。靶向这些分子的生物化合物可以为具有无法控制的中度至重度哮喘的患者提供新的治疗方法。本发明以本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白提供这些生物化合物。

在一些优选的实施方式中，过敏性哮喘是其中IL4/IL13通路促进疾病发病的气道炎症。

此外，通过应用本文所述脂质运载蛋白的本发明所述方法来优选治疗、缓解或预防的障碍也可以是肺障碍，例如其中IL4/IL13通路促进疾病发病的肺障碍。所述肺障碍包括但不限于，包括慢性纤维化肺疾病或其它以IL-4诱导的肺中成纤维细胞增殖或胶原积累为特征的病症的肺纤维化、其中Th2免疫反应发挥作用的肺病症、以肺中屏障功能降低为特征的病症(例如，从IL-4诱导的上皮细胞损伤导致的)、或其中IL-4在炎症反应中起作用的病症。

同样，囊性纤维化(CF)的特征在于粘液的过量产生和慢性感染的发展。抑制IL-4RA和Th2反应会减少粘液的产生，并有助于控制感染，如过敏性支气管肺曲菌病(ABPA)。过敏性支气管肺真菌病主要发生在其中Th2免疫反应占主导地位的囊性纤维化患者或哮喘患者。抑制IL-4RA和Th2反应会有助于清除和控制上述感染。

同样，慢性阻塞性肺疾病(COPD)与粘液分泌过多和纤维化相关。抑制IL-4RA和Th2反应会减少黏液分泌和纤维化发展，从而改善呼吸功能并延缓疾病进展。博莱霉素诱导的肺病和纤维化、和辐射诱发的肺纤维化都是以肺纤维化为特征的障碍，明确地体现在产生IL-4和IL-13的Th2、CD4.sup.+细胞和巨噬细胞的流入，而IL-4和IL-13继而介导纤维化的发展。抑制IL-4RA和Th2反应将减缓或预防上述障碍的发展。

此外，IL-4和IL-13诱导肺上皮细胞分化成产生黏液的杯状细胞。因此，IL-4和IL-13可以在亚群或一些情况下有助于增强粘液产生。粘液产生和分泌促进慢性阻塞性肺疾病(COPD)和囊性纤维化(CF)的疾病发病。因此，与粘液产生或粘液分泌相关(例如，过量产生或过多分泌)的障碍，优选地可以通过应用本文所述脂质运载蛋白突变蛋白的本发明所述方法来治疗、缓解或预防。在一些优选的实施方式中，与粘液产生或粘液分泌相关的障碍优选为慢性阻塞性肺疾病(COPD)或囊性纤维化(CF)。在其他优选的实施方式中，本发明所述的组合物还包括抗黏液药物。

肺泡蛋白沉积症以表面活性剂清除的破坏为特征。IL-4增加表面活性剂产物。在一些进一步的实施方式中，本文也考虑到使用IL-4RA拮抗剂，如本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白，以减少表面活性剂的产生和减少全肺灌洗的需要。

成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，可以由多种因素引起，其中之一是暴露于有毒化学品。因此，作为一个优选的但非限制性的实施例，易受ARDS影响的一个患者群是使用呼吸机的重症患者，因为ARDS是这类患者中常见的并发症。因此，在一些进一步的实施方式中，IL-4RA拮抗剂如本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以通过减少炎症和粘附分子用于缓解、预防或治疗ARDS。

肉状瘤病的特征是肉芽肿性损伤。在一些进一步的实施方式中，本文也考虑到使用IL-4RA拮抗剂如本发明的脂质运载蛋白突变蛋白来治疗肉状瘤病，特别是肺肉状瘤病。

其中IL-4介导屏障破坏起作用的病症(如以肺中上皮屏障功能降低为特征的病症)可以用IL-4RA拮抗剂来治疗。肺中上皮屏障功能损伤可以由IL-4和/或IL-13直接或间接诱导。上皮在肺中起到选择性屏障的作用，其阻止肺腔内容物进入黏膜下层。损坏的或“漏”的屏障则允许抗原跨越屏障，继而引发可能造成进一步肺组织受损的免疫反应。所述的免疫应答例如可以包括嗜酸性粒细胞或肥大细胞募集。IL-4RA拮抗剂可以施用以抑制免疫反应的这种有害刺激。

在这方面，例如对哮喘，IL-4RA拮抗剂如本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以用来促进肺上皮愈合，从而恢复屏障功能，或者，用于预防性目的，以防止IL-4和/或IL-13诱导的肺上皮损伤。

应当指出的是，根据本发明所述用于治疗疾病或障碍的方法并不受限于特定的作用机制。例如，在一些进一步的实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以在所公开的方法中用作基因治疗剂。

本文所述的“治疗”，是试图改变被治疗的受试者或细胞的自然病程的一种临床干预，并且能够在临床病理进展之前或期间进行。理想的治疗效果，包括防止疾病或病症或其症状的发生或复发，减轻病症或疾病的症状，减少疾病的任何直接或间接的病理后果，降低疾病进展率，改善或缓解病情，和达到缓解或改善的预后。在一些实施方式中，本发明所述方法和组合物可用于延缓疾病或病症发展的尝试中。所述治疗对人治疗和兽医应用都适用。

“预防”包括可以在本文所述障碍发生之前避免所述障碍(或伴随的症状)和/或所述障碍不复发。

“改善”包括缓解、减轻、减少和/或缓和本文所述障碍(或伴随的症状)。

术语“施用于(administered)”或“施用(administering)”以其所有的语法形式都是指给受试者施用治疗有效剂量的脂质运载蛋白突变蛋白，作为唯一的治疗药剂或与本文所述另一治疗药剂组合。因此，可以设想，本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白优选组合物的形式，优选药物组合物的形式，其可优选以联合治疗的方式应用，即与其他药剂或药物共施用，例如，用于治疗本发明所述障碍的其它药剂和/或在本发明所述方法中可为有益的的任何其他治疗药剂。因此，包含本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的组合物优选还包含抗过敏药物和/或抗过敏性炎症药物。

本文所用的“有效量”，是指在本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白所需的剂量和时间段下，有效达到所需治疗或预防结果的量。精确的剂量取决于治疗的目的，并可由使用已知技术的本领域技术人员确定。

“治疗有效量”是指对其施用的对象产生效果的剂量。本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的“治疗有效量”可能因一些因素而不同，并且可通过本领域技术人员采用常规实验确定，所述因素如年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和病症的严重程度。有时，在本文中术语“治疗有效量”可以与术语“药学有效量”互换使用。

在本申请中所用的治疗有效量，也是脂质运载蛋白突变蛋白的治疗有益作用抵过其任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”，是指在本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白所需的剂量和时间段下，有效达到所需预防效果的量。通常但不是必须地，由于预防用药是在疾病发生之前或在疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量小于治疗有效量。如本文所述，具有所需治疗活性的本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白可以通过生理学上可接受的载体施用给患者。

用于本申请时，在一些实施方式中，“受试者”是脊椎动物。在某些特定实施例中，所述脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括、但不限于灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)和啮齿类动物(如小鼠和大鼠)。在某些特定实施例中，哺乳动物受试者是人。在一些进一步的实施方式中，特别优选的受试者是人受试者，其与个体同义。在一些更进一步的实施方式中，用于本申请时，有此需要的人受试者是患者。

本发明所述蛋白质可为脂质运载蛋白的突变蛋白，所述脂质运载蛋白优选是选自视黄醇结合蛋白(RBP)、后胆色素结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APO D)、中性粒细胞明胶酶结合的脂质运载蛋白(NGAL)、泪液脂质运载蛋白(TLPC)、α2-微球蛋白相关蛋白质(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白质1(VEGP1)、von Ebners腺蛋白质2(VEGP2)和主要变应原Can f1前体(ALL-1)的脂质运载蛋白，其中人NGAL是优选的脂质运载蛋白，人泪液脂质运载蛋白是更优选的脂质运载蛋白。本文所用的“脂质运载蛋白”定义为重量约18,000-20,000道尔顿的单体蛋白质，具有圆柱形β折叠片的超二级结构区，所述超二级结构区包括多个(优选8个)通过多个(优选4个)环在一端成对连接的β股，因此限定了结合口袋。正是本应为刚性的脂质运载蛋白支架中的这种环多样性才在脂质运载蛋白家族成员中产生了多种不同的结合模式，它们各自能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(综述于例如Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,337-350)。事实上，脂质运载蛋白家族中的蛋白质自然进化为结合广泛的配体，共有异常低水平的总体序列保守性(通常序列同一性小于20％)，但是总体折叠模式高度保守。对本领域技术人员而言，各个脂质运载蛋白中位置之间的对应是众所周知的。参见，例如，美国专利号7,250,297。

一般来说，本文提及的本发明脂质运载蛋白突变蛋白，优选地，因至少有一个氨基酸与其天然存在的脂质运载蛋白对应物不同，而异于其天然存在的脂质运载蛋白对应物。所述不同可能是氨基酸置换、缺失和/或添加，其中优选置换。在某些特定实施方式中，“脂质运载蛋白的突变蛋白”或“脂质运载蛋白突变蛋白”可以尤其是“人泪液脂质运载蛋白突变蛋白”或“Tlc突变蛋白”。

在一个优选的实施方式中，本发明所述蛋白质是人泪液脂质运载蛋白(Tlc)突变蛋白。在本文中所用的术语“人泪液脂质运载蛋白”是指成熟人泪液脂质运载蛋白，SWISS-PROT数据库登记号为P31025。成熟人泪液脂质运载蛋白(SWISS-PROT数据库登记号P31025氨基酸序列中的氨基酸19-176)(SEQ ID NO:1)不包括包括于所述SWISS-PROT数据库登记号P31025序列的序列中的N-末端信号肽(氨基酸1-18)，在本发明多个实施方式中用作“参考”或“参考序列”。

人泪液前白蛋白，现在称为泪液脂质运载蛋白(TLPC或Tlc)，最初被描述为人泪液中的主要蛋白(约占总蛋白质含量的三分之一)，但最近也在其他若干分泌组织包括前列腺、鼻腔黏膜和气管粘膜中被鉴定得到。同源蛋白质已在大鼠、猪、狗和马中被发现。泪液脂质运载蛋白是一个特殊的脂质运载蛋白成员，因为其具有异于该蛋白家族其他成员的与相对不溶性脂质的高度混杂性及结合特性(综述于Redl,B.(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,241-248)。相当数量的属于不同化学分类的亲脂性化合物，例如脂肪酸、脂肪醇、磷脂、糖脂和胆固醇，是该蛋白质的内源性配体。有趣的是，与其它脂质运载蛋白相对照，对烷基酰胺和脂肪酸而言，配体(靶标)结合强度与烃尾长度相关。因此，泪液脂质运载蛋白与溶解性最小的脂质结合强度最大(Glasgow,BJ.等人(1995)Curr.EyeRes.14,363-372；Gasymov,O.K.等人(1999)Biochim.Biophys.Acta1433,307-320)。

本文公开的特别适于治疗应用的脂质运载蛋白突变蛋白包括SEQ ID NO:2-11中所示的脂质运载蛋白。这些分子对人IL4Ra表现出特异性和高亲和力，但在本发明之前还从未被治疗相关的体内数据所表征。本文公开的其它也适于治疗应用的脂质运载蛋白突变蛋白包括WO2008/015239的SEQ ID NO:2-8中所示的脂质运载蛋白，这些序列中的每一个都通过引用并入本文。本文公开的另一些也可适于治疗应用的脂质运载蛋白突变蛋白包括WO2011/154420的SEQ ID NO:2-11中所示的脂质运载蛋白，这些序列中的每一个都通过引用并入本文。

如本文所用的，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白质或核酸)或“突变体”指的是，与天然存在的(野生型)核酸或蛋白质的“参考”骨架比较，分别替换(置换)、缺失或插入一个或多个核苷酸或氨基酸。优选置换天然存在的(野生型)核酸或蛋白质的氨基酸。本文中术语“参考”、“参考序列”和“野生型序列”可互换使用。

本发明还涵盖本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白的优化变体。一旦筛选出与给定靶标具有亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白，还可以对所述突变蛋白进行进一步诱变，以便后续筛选出具有更高亲和力的变体或特性改进的变体，所述特性如更高的热稳定性、改善的血清稳定性、热力学稳定性、改善的溶解度、提高的单体行为、对热变性、化学变性、蛋白水解或去污剂等提高的抗性等。所述进一步诱变，例如在旨在更高亲和力的情况下，可以被视为体外“亲和力成熟”，其可以通过基于推理性设计的位点特异性突变或随机突变来实现。另一种用于获得更高亲和力或改进的特性的可行方式是利用易错PCR，从而在脂质运载蛋白突变蛋白的选定序列位置范围中产生点突变。易错PCR可按照任何已知的方案进行，如Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255,589-603中所述的方案。其它适于实现上述目的的随机诱变方法包括如Murakami，H等人(2002)Nat.Biotechnol.20,76-81中描述的随机插入/缺失(RID)诱变，或如Bittker,J.A等人(2002)Nat.Biotechnol.20,1024-1029中描述的非同源随机重组(NRR)。如果需要的话，还可以按照WO00/75308或Schlehuber，S.等人(2000)J.Mol.Biol.297,1105-1120中描述的方法进行亲和力成熟，其中获得了对地高辛具有高亲和力的后胆色素结合蛋白突变蛋白。

泪液脂质运载蛋白突变蛋白可用于与IL-4受体α形成复合物。该突变蛋白也能够与IL-4受体α的免疫原性片段结合。IL-4受体α的免疫原性片段是具有一个或多个表位、模拟表位或其它抗原决定簇的片段，因此能够诱导或拮抗可引起抗体的免疫应答。所述免疫原性片段可以包括单一的表位，或可以具有多个表位。由于抗原呈递系统，例如载体蛋白，可被用于提供免疫系统识别所需的大小，对所述免疫原性片段的大小没有特别的限定。因此，该免疫原性片段，特别由于其小分子量和相应的大小，还可以是“半抗原”，即本身无需具有抗原性或可能具有低的免疫原性的片段。典型地，单独或在载体上呈递时，免疫原性片段可以被免疫球蛋白或T细胞受体(TCR)结合(如果被MHC分子呈递)。单独或以抗原呈递系统的形式呈递时，免疫原性片段通常能够诱导体液免疫反应和/或细胞免疫反应，从而导致例如B-和/或T-淋巴细胞活化。

白介素-4受体α链(正式名称为白介素-4受体亚基α，Uniprot#P24394，SEQ ID NO:12)是本发明所用的脂质运载蛋白突变蛋白的一个靶标，其是一种跨膜蛋白，包括有207个氨基酸的胞外结果域。sIL-4Rα，是所述胞外结构域的一种分泌型，亦被称为CD124，能够拮抗IL-4的活性。本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白能够结合IL-4受体α，以及IL-4受体α胞外结构域的任何部分。

本发明还涉及包括编码本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。由于遗传密码的简并允许某些密码子由其他指定同一氨基酸的密码子替换，本发明并不局限于编码本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的特定核酸分子，而是涵盖所有包括编码功能突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。

本发明所述核酸分子也可以是载体或任何其他类型的克隆载体的一部分，所述载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。在一个实施方式中，所述核酸分子包括在噬菌粒中。

在本发明所述一些脂质运载蛋白突变蛋白中，Cys61和Cys153之间天然存在的二硫键被移除。因此，上述突变蛋白(或不包括分子内二硫键的其他任何泪液脂质运载蛋白突变蛋白)可产生于具有还原的氧化还原环境的细胞隔室中，例如，革兰氏阴性细菌的细胞质。如果本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白包括分子内二硫键，可能需要使用适当的信号序列引导新生多肽进入具有氧化的氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化环境可由革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的周质、革兰氏阳性细菌的细胞外环境或真核细胞的内质网腔提供，并且所述氧化环境通常有利于结构二硫键的形成。但是，也可以在宿主细胞如大肠杆菌的细胞溶质中产生本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白。在这种情况下，所述多肽可以以可溶和折叠的状态直接获得的，或以包涵体的形式回收，然后体外复性。另一种选择是使用特定的具有氧化细胞内环境的宿主株，从而可以使二硫键在细胞溶质中形成(Venturi M,等人,(2002)J.Mol.Biol.315,1-8)。

本发明还涉及一种组合物，其包含至少一种本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体或者其融合蛋白或缀合物，和药学上可接受的制剂(例如缓冲液/盐/赋形剂的组合)，其中所述组合物可以以选自下述的剂量水平给有此需要的受试者施用：0.06-600mg，0.06-100mg，0.3-10mg，1-3mg。

在一些实施方式中，本发明的组合物可通过任何对于蛋白质性药物治疗有效的肠胃外或非肠道外(肠内)的途径施用。肠胃外应用的方法，例如包括如以注射溶液、输注溶液或酊剂形式的皮内、皮下、肌内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，以及如以气溶胶混合物、喷雾、薄雾或粉末的形式的气溶胶注入和吸入。

在一些实施方式中，优选所述组合物局部施用于肺。局部施用于肺的优选途径为通过气溶胶吸入。例如Patton,J.S.等人(2004)Proc.Amer.Thoracic Soc.,1,338-344提供了关于肺部药物递送的综述，即通过气溶胶吸入(也可用于鼻内施用)或气管内滴注。非肠胃外递送方式例如为以丸剂、片剂、胶囊、溶液或悬浮液形式的经口，或以栓剂形式的经直肠。在一些实施方式中，本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白也可以在制剂中全身或局部施用，所述制剂根据需要含有常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和溶媒。对于通过吸入施用本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白，所述突变蛋白可以连同另外的相存在于粉末制剂中。脂质运载蛋白突变蛋白的微粉化粉末可以与载体材料混合，所述载体材料例如乳糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖，如专利说明书WO96/02231或P.Lucas,K.Anderson,J.N.Staniforth,Protein deposition from dry powder inhalers,PharmaceuticalResearch,Vol.15,April1988,pages562-569中描述的。可替换地，对于吸入目的，可以使用如美国专利申请2005/0014677和2009/0142407中描述的固体药物制备物。

因此，本发明所述组合物可包括本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白，以及公开的制剂之一。

为达到预期的预防效果或治疗反应，所施用的组合物的剂量可以在一个宽限度内变化。例如，所述剂量将取决于所述脂质运载蛋白突变蛋白与选定配体的亲和力，以及所述脂质运载蛋白突变蛋白和配体之间的复合物的体内半衰期。另外，最佳的剂量将取决于所述脂质运载蛋白突变蛋白或其片段或变体或者其融合蛋白或其缀合物的生物分布、施用方式、被治疗的疾病/障碍的严重程度以及患者的身体状况。

在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括通过雾化给所述受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种IL-4RA拮抗剂或其片段或变体或者其融合蛋白或缀合物，和适宜的溶液。

在各个优选的实施方式中，本发明所述药学上可接受的制剂可以是雾化制剂，例如，可以是能够在雾化时和雾化后保持拮抗剂或其片段或变体或者其融合蛋白或缀合物的功能和结构完整性(如保持单体和全功能活性)的溶液，和/或能够结合使用的雾化器生成所需尺寸范围的液滴。在这方面，作为示例性说明，本发明给出这样的教导：所述拮抗剂，例如本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白，可制成溶液，所述溶液包含，例如每mlpH调至5.5-8.0的盐水0.01mg-100mg的拮抗剂或其片段或变体或者其融合蛋白或缀合物，重量摩尔渗透压浓度值约150-550mOsm/kg，作为渗透阴离子的氯化物的离子浓度为约31-300mM，和/或粘度小于1.5cp。优选地，所配制的溶液的拮抗剂或其片段或变体或者其融合蛋白或缀合物的浓度水平选自：0.05mg/ml-50mg/ml、0.1mg/ml-50mg/ml、0.05mg/ml-25mg/ml、0.1mg/ml-25mg/ml、0.05mg/ml-15mg/ml、0.1mg/ml-15mg/ml、0.05mg/ml-10mg/ml和0.1mg/ml-10mg/ml。在一个进一步优选的实施方式中，所述盐水的经调节的pH选自：5.5-8.0、6.0-8.0、6.0-7.5、5.5-7.5、6.0-7.0和6.5-7.5；和/或重量摩尔渗透压浓度值选自：约150-550mOsm/L、约150-500mOsm/L、约200-550mOsm/L、约200-500mOsm/L、约200-450mOsm/L和约150-450mOsm/L，摩尔渗透压浓度是溶质浓度的量度，定义为每升(L)溶液的溶质渗透压摩尔数(Osm)，例如osmol/L或Osm/L；和/或作为渗透阴离子的氯化物的离子浓度选自：31-300mM、50-200mM、50-300mM、50-150mM、100-200mM、100-300mM、100-250mM、150-250mM、150-300mM和200-300mM。

进一步优选地，所述盐水的粘度选自以下范围：0-1.5cp、0-1.0cp、0-0.5cp、0.5-1.0cp、0.5-1.5cp和1.0-1.5cp。

在一些进一步的实施方式中，拮抗剂例如本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白的水溶液，可以用电子雾化器、喷嘴、超声、或振动的穿孔膜，例如PARI eFlow或Aeroneb振动网孔雾化器进行雾化。在一个优选实施方式中，所述溶液被电子雾化器、喷嘴、超声、或振动的穿孔膜雾化成总气体动力学中位数直径(MMAD)为1μm-10μm的气溶胶，每日2次，而且所述喷雾器能够在约1-约5分钟的时间段将所得溶液雾化成所需尺寸的颗粒(气溶胶)。在一些更进一步的实施方式中，任何所述气溶胶的总气体动力学中位数直径(MMAD)可以选自：1μm-10μm、2μm-8μm、2μm-5μm、1.5μm-4μm、3μm-4.5μm和2.5μm-3.5μm。

在一些实施方式中，本发明提供一种通过在1-3分钟、优选1-2分钟内吸入从而将本发明所述有效量的包含所述雾化制剂的药物组合物递送给有此需要的受试者的方法。在一些进一步的实施方式中，所述通过吸入递送局限于肺。

因此，在其它一些实施方式中，本发明提供了一种有效、安全、无刺激、生理上可接受且相容的溶液，该溶液适用于本发明的包括给有此需要的受试者施用所述药物组合物的方法。

在其它一些实施式中，本发明提供所述溶液作为气雾剂，如通过吸入将本发明所述药物组合物递送给有此需要的受试者的用途。

本文所用的“IL-4RA拮抗剂”是指以可检测的结合亲和力与IL-4RA结合和/或能够抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合的多肽或蛋白。本文所用的“可检测的亲和力”是指以通常至少约10-5M的亲和力常数与选定的靶标结合的能力。更低亲和力通常采用常用方法如ELISA无法检测出，因而具有次要重要性。例如，本发明所述突变蛋白的结合亲和力在一些实施方式中可以具有800nM以下的KD，在一些实施方式中具有30nM以下的KD，在一些实施方式中为约50皮摩尔(pM)或以下。

在一些实施方式中，本发明所述脂质运载白突变蛋白可以用于治疗其中IL-4表达和/或IL-13表达有助于疾病发病或恶化或者与疾病发病或恶化相关的任何疾病或障碍。在一些实施方式中，本发明所述脂质运载蛋白突变蛋白可以用来治疗通过去除、抑制或减少IL-4活性和/或IL-13活性而改善、缓解或抑制的任何疾病或障碍。作为一个说明性的例子，所述突变蛋白或含有其的药物组合物可以应用于治疗与Th2免疫应答的增加相关的疾病或障碍的方法中。所述疾病或障碍可以例如还与过敏反应或过敏性炎症相关。在一些进一步的实施方式中，所述疾病或障碍可以是过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎(参见Hage等人(1999)Cell,97,271-281,或Mueller等人(2002)Biochemica et Biophysica Acta,237-250)。

本发明中与本发明所述泪液脂质运载蛋白突变蛋白相关使用的术语“片段”，涉及源自全长成熟人泪液脂质运载蛋白的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽N-末端和/或C-末端缩短，即缺乏至少一个N-末端和/或C-末端氨基酸。这些片段优选包含至少10、更优选20、最优选30个或更多个成熟人泪液脂质运载蛋白一级序列的连续氨基酸，并通常可由人泪液脂质运载蛋白的免疫测定法检测。

本发明所用术语“变体”涉及包含氨基酸序列的修饰的蛋白质或肽(例如本发明所述人泪液脂质运载蛋白突变蛋白)的衍生物，所述修饰例如通过置换、缺失、插入或化学修饰进行。优选地，上述修改不会降低该蛋白质或肽的功能性。所述变体包括其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或20种天然存在氨基酸以外的氨基酸(例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、正缬氨酸)替换的蛋白质。然而，上述置换也可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基替换。所述保守置换的实例是下列组成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

本发明所用术语“位置”是指氨基酸在本文所述的氨基酸序列中的位置，或者核苷酸在本文所述的核酸序列中的位置。本发明所用术语“对应的”也包括不仅由前述核苷酸/氨基酸的数目来确定的位置。因此，根据本发明的可以被置换的给定氨基酸的位置可能因(突变或野生型)脂质运载蛋白中其它位置的氨基酸的缺失或添加而变化。类似地，本发明公开的可以被置换的给定核苷酸的位置可能因包括启动子和/或其它任何调控序列或基因(包括外显子和内含子)的突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5'-非翻译区(UTR)中其它位置的核苷酸缺失或添加而变化。因此，就本发明所述的“对应位置”，优选理解为核苷酸/氨基酸可能在标示的数字上不同，但可能仍具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。所述可被交换、缺失或添加的核苷酸/氨基酸也包括在术语“对应位置”中。具体地，为了确定不同于野生型脂质运载蛋白的脂质运载蛋白(突变蛋白)氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型脂质运载蛋白氨基酸序列中的特定位置，技术人员可以使用本领域公知的手段和方法，例如以人工或通过利用计算机程序如BLAST2.0(代表基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))或ClustalW或任何其他适于产生序列比对的合适的程序来比对。因此，野生型脂质运载蛋白可以作为“受试者序列”或“参考序列”，而不同于所述野生型脂质运载蛋白的脂质运载蛋白氨基酸序列用作“查询序列”。术语“参考序列”和“野生型序列”在本文中可互换使用。

除非上下文另有明确说明，本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“该(所述)”包括复数指代。因此，例如，提及“一种脂质运载蛋白突变蛋白”包括一个或多个脂质运载蛋白突变蛋白。

除非另有说明，置于一系列要素前的术语“至少”应被理解为指该系列中的每个要素。本领域技术人员使用不超过常规的实验手段将识别或能够确定本发明公开的具体实施方式的很多等同方式。所述等同方式意在也涵盖在本发明中。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包括(包含)”及变体应被理解为表示包括所述整数或步骤或一组整数或一组步骤，但不排除任何其它的整数或步骤或一组整数或一组步骤。本文使用的术语“包括(包含)”可被术语“包含(含有)或“具有”替代。

本文使用的“由……组成”排除了未在权利要求中明确列出的任何要素、步骤或成分。本文使用的“基本上由......组成”并没有排除实质上不影响权利要求的基本特征和新颍特征的材料或步骤。

本文使用的多个列举的要素之间的连接术语“和/或”应理解为包括单独的和组合的选择。例如，当两个要素由“和/或”连接时，第一种选择是指应用第一个要素而非第二个要素。第二种选择是指应用第二个要素而非第一个要素。第三个选择是指同时应用第一个要素和第二个要素。这些选择中的任何一个都被理解为落入所指，因此满足本文所用术语“和/或”的要求。同时应用多于一个的上述选择也被理解为落入所指，因此满足本文所用术语“和/或”的要求。

本发明的整篇说明书引用了若干文献。本文引用的每一篇文献(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论是上文或下文，全部内容在此通过引用并入本文。本文的任何内容不得解释为承认本发明不优先于由于早前的公开而公开的内容。

实施例1：通过IL-4受体α拮抗剂抑制TF-1细胞中IL-4和IL-3诱导的Stat6磷酸化

在加入10nM的IL-13(图1a)或0.1nM的IL-4(图1b)前，TF-1细胞在37℃下与IL-4受体α拮抗剂一起孵育30分钟，所述IL-4受体α拮抗剂是针对人IL-4受体α链的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)。在37℃下用1.6％PFA孵育15分钟后固定细胞，并在用PE小鼠抗STAT6(pY641)-BD612701进行细胞内STAT6染色之前用100％甲醇透性细胞。IL-4RA特异性抗体MAB230(R&D Systems公司)和Andrews等人JI2006176:7456-7461所描述的IL-4的双突变体IL-4(R121D，Y124D)作为阳性对照。此外，人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)和小鼠IgG2a抗体(mIgG2a，Ancell281-010；Lot#171605)被用作阴性对照。TF-1细胞Stat6磷酸化测定结果示于图1，结果表明脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)是IL-4以及IL-13的强效拮抗剂，因为它涉及到IL-4RA下游信号传导。所述IL-4RA特异性抗体MAB230(R&DSystems公司)效果同样良好。令我们惊奇的是，所述IL-4突变体在抑制TF-1细胞中IL-4和IL-13诱导的Stat6磷酸化方面的有效性显著较低，尽管之前已经对功能性拮抗作用有所描述。相比脂质运载蛋白突变蛋白，IL-4突变体(R121D，Y124D)的快速解离速率常数(k_off)(表1)可能是上述功能差异的原因。

表1

实施例2：构建双敲入小鼠

通过将小鼠IL-4受体α链基因和IL-13受体α链1基因替换为各自的人直系同源基因，产生人IL-4受体α链和IL-13受体α链1敲入小鼠。因此，产生的小鼠是所谓的人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠，该小鼠在小鼠直系同源基因位点具有人的而非小鼠的IL-4受体α和IL-13受体α链1基因。

所述小鼠按照下述产生：在X染色体上的70kb小鼠IL-13RA1基因被缺失，从而在小鼠胚胎干细胞中产生无效等位基因。一段携带人IL-13RA1基因的DNA片段被导入被缺失位点。所述人基因由人X染色体的95.7kb的片段构成，其不仅包含整个IL13RA基因而且包含～11kb的5'基因间DNA和～7kb的3'UTR的DNA3'。隐含在此的知识是该DNA片段将指导人受体的表达。携带这种改变的小鼠由改性的ES细胞产生。在单独的实验中，携带小鼠IL-4RA基因的39kb DNA片段被对应的编码人IL-4R的63kb DNA片段替换，所述63kb DNA片段由IL-4Rα和共有γ链构成，并再次使用由所述改性的细胞产生的小鼠品系。两个敲入小鼠系互交，以建立一个在IL-4R基因位点和IL-13RA基因位点二者均是人源化基因位点纯合的小鼠品系。该小鼠表达人的而不是小鼠的蛋白质。人I型和II型受体的正确表达通过显示免疫细胞对人IL-4的反应和气道上皮细胞对IL-13的反应而得以验证。

实施例3：离体分析双敲入小鼠脾细胞以证明IL-4受体α拮抗剂对IL-4I型受体的作用

通过本领域公知的手段和方法从人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠分离出脾细胞。在IL-4受体α拮抗剂存在或不存在的情况下，这些脾细胞用持续升高浓度的人IL-4刺激，其中所述IL-4受体α拮抗剂是针对人IL-4受体α链的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQID NO:6)。IL-4通过IL-4受体复合物影响STAT6的磷酸化。因此，STAT6的磷酸化因而是对IL-4与其受体结合的读出。人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)作为阴性对照。

在图2中，示出了脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)减少、因而中和IL-4对表达于脾细胞上的IL-4I型受体的作用，因为STAT6磷酸化在IL-4刺激的脾细胞中和未刺激的脾细胞的水平相同。

实施例4：IL-4受体α拮抗剂施用于双敲入转基因小鼠及嗜酸性粒细胞趋化因子水平分析

使用由Blanchard等人提供的IL-13诱导的气道炎症模型(Clin ExpAllergy2005,35(8):1096-1103)来研究IL-4受体α拮抗剂的作用，所述IL-4受体α拮抗剂是针对人IL-4受体α链的脂质运载蛋白突变蛋白。在所述模型中，通过气管内滴注每48小时三次施用1μg IL-13。

因此，如图3所示，将溶媒(磷酸盐缓冲盐水，以后称为“PBS”)或IL-13(hIL-13)施用给双敲入转基因小鼠，分别作为组1(PBS)和组2(hIL-13)，而组3(SEQ ID NO:6/hIL-13)和组4(TLPC/hIL-13)，除了已接受hIL-13之外，还分别接受57μg剂量的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)或57μg剂量的人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)(作为阴性对照)。

组2和组3有3只小鼠，而组1和组4有2只小鼠。气管内给药以30μl完成。IL-13、脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)和阴性对照经气管内施用，并获得肺组织匀浆以便检测嗜酸性粒细胞趋化因子水平。需要注意的是，脂质运载蛋白突变蛋白和阴性对照在IL-13给药前30分钟施用。

在此模型中，当IL-13施用后，相比于组1，嗜酸性粒细胞趋化因子水平升高，例如在组4最后一次IL-13给药后24小时。嗜酸性粒细胞趋化因子是一种强效的嗜酸性粒细胞趋化物，因而是炎症、特别是过敏性炎症的标记物。图3中示出，相比于组3中的阴性对照(也参见PBS组1和单用IL-13的组2)，组4中的所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)有效地中和了IL-13对嗜酸性粒细胞趋化因子诱导的作用。

实施例5：IL-4受体α拮抗剂施用于双敲入转基因小鼠及Ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)mRNA表达分析

将IL-4受体α拮抗剂，即针对人IL-4受体α链的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:6)，按照实施例4所述施用于人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠，不同之处在于通过气管内滴注施用30μL的IL-13(Peprotech公司，1μg)仅一次。每个组有3只人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠。IL-13给药后24小时，总RNA从肺匀浆中分离并通过RT-PCR分析小鼠嗜酸性粒细胞趋化因子表达。24小时后肺组织中的mRNA表达用18SrRNA进行归一化，1μg hIL13小鼠的值设定为1。所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)也通过气管内滴注应用30μl体积，或者在IL-13给药前在不同的时间应用恒定剂量98μg，或者在IL-13给药前30分钟应用不同的量。所述IL-4突变体(R121D，Y124D)也在IL-13给药前30分钟通过气管内滴注应用不同量的30μl体积。精简的IL-13诱导的气道炎症模型(单个IL-13气管内施用)被用来评估药理学反应的持续时间、剂量依赖关系和可比较的效力。在图4a中，可以看出所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)长时间有效抑制人IL-13诱导的转录物Ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)(图4a)，而药理学反应的剂量依赖关系也在图4b中示出证明。此外，从图4c可以看出，当与IL-4突变体比对时，脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)显示出有利的效力(图4c)。

实施例6：鉴定适合用于使用Pari eFlow振动筛网喷雾器雾化IL-4受体α拮抗剂的制剂

IL-4受体α拮抗剂，即IL-4RA特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)在含有0.01或0.05聚山梨酯20的PBS中以0.1mg/ml的浓度用ParieFlow装置雾化。雾化器的储液器装有6ml制剂，操作持续约15分钟直至储液器中一半的制剂被雾化。如图5所示，雾化的样品由装配于雾化器口片的玻璃杯收集，并通过目视检查分析来监测可见颗粒、通过光透法来监视显微镜下才能看得见的颗粒、通过高压尺寸排阻色谱法(HP-SEC)来监测可溶性聚集体、通过反相SEC来监测化学修饰、通过IL-4RA结合ELISA来监测功能活性以及通过激光衍射来测量液滴尺寸。脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)在筛选出的制剂中雾化没有导致可见的聚集体、显微镜下才能看得见的颗粒的产生。雾化的蛋白质和储液器中剩余的蛋白质都仍是单体的并保留全功能活性。根据本装置的说明书，产生的是中位尺寸5.5μm的液滴。在制剂中聚山梨酯20的浓度并没有影响到雾化突变蛋白的能力，因为在含有0.01或0.05聚山梨酯20的制剂中没有任何测量参数是相同的。

实施例7：IL-4受体α拮抗剂在气管内滴注后在人IL-4RA/人IL-13双敲入小鼠中的药代动力学特性和生物分布。

给人IL-4受体α/人IL-13受体α链1双敲入小鼠通过气管内滴注施用IL-4受体α拮抗剂，即脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)30μL(98μg)。二十只动物接受给药，4个组在1、4、8、16和24小时后处死。处死时，肺用2×1ml FACSflow液体灌洗，抽取锂肝素血浆样本，肺在液氮中快速冷冻。将肺组织在1,5ml裂解缓冲液(一片全迷你混合蛋白酶抑制剂片(Roche公司)/10mlT-PER(Peribio公司))中使用IKA T10基本Ultra-Turrax(S10N-5G)组织匀浆器在4℃下匀浆55秒。匀浆液在冰上孵育30-60分钟，10.000克4℃下离心10分钟进行澄清。用BCA试剂盒(Pierce公司)依照制造商的说明书测定总蛋白浓度，在-80℃下储存等分试样之前，将样品用PBS稀释至1mg/ml的标准蛋白质终浓度。用基于ELISA的定量MesoScale Discovery(“MSD”)测定在不同时间点的肺灌洗液、肺组织和血浆中脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)的结合活性浓度。简而言之，MSD板用PBS中5μg/ml的亲和素在4℃下涂覆过夜，用PBS/0.05％吐温20洗涤，然后用3％BSA封闭。加入在PBS/0,1％吐温20中浓度为2.5μg/ml的生物素化人IL-4RA以捕获来自不同基质的脂质运载蛋白突变蛋白，在PBS/0,5％Tween20/0.5％BSA中用泪液脂质运载蛋白特异性兔多克隆抗体(制剂：TLPC-Mix4666Ab，Pieris公司，PL#684)和抗兔IgG磺基-标签抗体(Meso Scale Discovery，0.5μg/ml)检测结合的突变蛋白。实验显示，在所有三个基质中线性范围为75pg/ml至6ng/ml，而QC样品的回收率在80-120％。为计算浓度和总量，假设每只小鼠的血浆总量是900μl。当基于测得的标准化总肺匀浆中的浓度及其裂解缓冲液1,5ml的体积以及测得的肺重量来计算每肺中脂质运载蛋白突变蛋白的总量时，要考虑用于将肺匀浆标准化至由BCA试剂盒测得1mg/ml的总蛋白浓度的稀释系数。支气管肺泡灌洗液(此后称为“BALF”)中脂质运载蛋白突变蛋白的总量基于在2ml灌洗液中回收的量。

从图6a可以看出，气管内施用后1小时，施用剂量的43％可以从BALF中回收，6％从肺组织中回收，0,2％从血浆中回收。BALF、肺组织和血浆中测得的终末半衰期分别为3.7、3.9和2.7小时。另外，从图6b可以看出，气管内滴注98μg所述脂质运载蛋白突变蛋白约20小时后，在人IL-4RA/人IL-13双敲入小鼠中计算的肺组织浓度保持在0.7μg/ml以上，与示于图4a的观察情况一致。0.7μg/ml的浓度对应于在不同体外效力测定方法中观察到的所述脂质运载蛋白突变蛋白最高的IC₉₀值。此外，图6b还显示出血浆浓度和因此的全身暴露比肺组织中可见的浓度低100倍。

实施例8：在人气道上皮气-液-界面培养系统中IL-4受体α拮抗剂抑制IL-13诱导的杯状细胞化生

杯状细胞化生是包括哮喘在内若干呼吸性疾病的共同特征。因此，在基于MucilAir^TM(Epithelix)的体外模型中考察了IL-4受体α拮抗剂即所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)防止杯状细胞化生的能力。MucilAir^TM，一种使用人原代细胞体外重构的人气道上皮的气-液界面培养系统，每两天用0.3-30ng/ml的人IL-13进行处理。通过原位Alcian蓝染色以及组织学分析，表明处理14天后MucilAir^TM表现出杯状细胞密度以剂量依赖方式升高。因此，通过比较分别将MucilAir^TM连续暴露于10ng/ml的人IL-1314天(为阳性对照)和连续暴露于IL-13+不同浓度(如图7a所示)的所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:6)、连续暴露于IL-4突变体(R121D,Y124D)和抗IL-4RA单克隆抗体(轻链和重链可变区序列示于SEQ D NOs:14和15)，并在比较是以14天无IL-13培养的MucilAir^TM作为阴性对照，测试所述脂质运载蛋白突变蛋白对杯状细胞化生的抑制作用。将酸性粘多糖和糖胺聚糖染色为蓝色至蓝绿色的Aclain蓝染料，加入到表面进行原位染色，在相差显微镜下拍摄了染色细胞的图片用于图像分析。通过公共领域Java图像处理程序ImageJ定量Alcain蓝阳性细胞百分率，并以Alcain蓝色面积/总图像区域的面积比表示。通过日内瓦大学的平台按照标准操作规程完成了组织学分析。此外，嗜酸性粒细胞趋化因子-3，IL-13诱导的趋化因子，在第14天用市售的Meso Scale Discovery公司的超灵敏嗜酸性粒细胞趋化因子-3试剂盒按照制造商的说明在基础培养基中进行了测定。

在图7a和图7b中，可以看出所述脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:6)能够以剂量依赖方式完全阻断MucilAir培养系统中IL-13诱导的杯状细胞化生。Alcain蓝色面积比率水平被所述脂质运载蛋白突变蛋白以及抗IL-4RA单克隆抗体降低至背景(无IL-13的阴性对照的比率)，但是IL-4突变体(R121D，Y124D)不能降低该比率，同时作为阳性对照(仅具有IL-13)的人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)也表现出相似的染色效果。如图7d所示，对于嗜酸性粒细胞趋化因子-3(被分泌到基础培养基中)也得到类似的结果。如图7c所示，有IL-13和无IL-13的第14天培养物的示例性Alcain蓝/Neutral红染色石蜡切片显示出IL-13对气-液-界面培养系统中人气道上皮的影响。

本发明具有工业实用性，涉及治疗其中IL4/IL13通路促进疾病发病的疾病和/或病症，例如与Th2免疫应答的增加相关的疾病和/或病症。本文示例性描述的发明可以在任何未在本文具体公开的元素或多个元素、限制或多个限制不存在的情况下适当地进行实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应该广泛理解而无限制。并且，本文采用的术语和表达方式用作描述的而非限制的术语，并且无意使用排除所示和所描述特征的任何等同方式或其部分的术语和表达方式，但是应理解，在本发明要求保护的范围内，多种修改方式是可行的。因此，应该理解，尽管本发明已经通过优选实施方式和任选特征予以具体公开，但是本领域技术人员可以寻求本文在此公开的实施发明的修改方式和改变，并且认为此类修改方式和改变在本发明的范围内。本文已经广泛和通用地描述了本发明。本文所述所有专利、专利申请、教科书和经同行评审的出版物的全部内容通过引用的方式并入本文。此外，如果通过引用方式并入本文的参考文献中的定义或术语使用，与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则该术语采用本文提供的定义，而不采用参考文献中的定义。落在通用公开内容之内的每个较窄种类和亚类集合也形成本发明的一部分。这包括具有从该通类去除任何主题的先决或负面限制的本发明的通用描述，无论该排除的物质是否在本文具体描述。并且，在本发明的特征或方面以马库什组的方式进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以任何单独的成员或马库什组成员的子集进行了描述。本发明其它的实施方式由于以下的权利要求而变得显而易见。

Claims (40)

1.能够抑制IL-4和/或IL-13与其各自的受体结合的脂质运载蛋白突变蛋白在制备用于治疗、缓解或预防受试者中的障碍的药物中的用途，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白能够在所述受试者中显示体内治疗活性；

a)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示的成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的位置26、27、28、30、31、32、33、34、53、55、56、57、58、61、63、64、66、80、83、104-106和108的氨基酸位置处具有突变的氨基酸的组，其中所述突变的氨基酸的组是SEQ ID NO:6所示的突变蛋白在各个相应位置处具有的突变的氨基酸的组；

b)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白能够体内抑制人IL-13诱导的转录物Ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)，并且其中如通过实施例5中基本所述试验测定，所述脂质运载蛋白突变蛋白体内抑制人IL-13诱导的转录物Ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)时强于具有R121D和Y124D的IL-4突变体；和

其中所述障碍选自过敏性炎症、过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎、肺纤维化、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症或成人呼吸窘迫综合征。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的制剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够破坏IL-4和/或IL-13诱导的下游信号传导和/或细胞应答。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，如通过实施例8中基本所述试验测定，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够显示与抗IL-4RA单克隆抗体一样良好的功能活性，所述抗IL-4RA单克隆抗体具有分别如SEQ ID NO:14和15中所示的可变轻链序列和重链序列。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，在所述试验中，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够与所述抗IL-4RA单克隆抗体一样良好地抑制IL-13诱导的杯状细胞化生。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述受试者正患有其中IL-4表达和/或IL-13表达促进疾病发病或恶化或与疾病发病或恶化相关的障碍。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述受试者正患有能够通过去除、抑制或减少IL-4活性和/或IL-13活性而改善、缓解或抑制的障碍。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物局部施用于肺。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过气溶胶吸入施用。

11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物给有此需要的受试者施用的频率选自：达到每日四次、达到每日三次、达到每日两次、达到每日一次、达到每隔一日一次、达到每隔两日一次、达到一周一次和达到每隔一周一次。

12.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物每次给有此需要的受试者施用0.06-600mg的剂量水平。

13.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物每次给有此需要的受试者施用0.06-100mg的剂量水平。

14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物每次给有此需要的受试者施用0.3-10mg的剂量水平。

15.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物每次给有此需要的受试者施用1-3mg的剂量水平。

16.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述障碍与Th2免疫应答的增加相关。

17.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述障碍与过敏反应或过敏性炎症相关。

18.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述障碍与粘液产生或粘液分泌相关。

19.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述过敏性哮喘是其中IL4/IL13通路促进疾病发病的气道炎症。

20.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包含抗过敏药物和/或抗过敏性炎症药物。

21.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述障碍是肺障碍。

22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述肺障碍与呼吸性障碍、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺泡蛋白沉积症、成人呼吸窘迫综合征、肉状瘤病和肺上皮相关。

23.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包含抗粘液药物。

24.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白与狨猴IL-4RA有交叉反应性。

25.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白与小鼠IL-4RA和/或猕猴IL-4RA没有交叉反应性。

26.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白基本上与相关蛋白或不相关蛋白没有交叉反应性，其中所述相关蛋白是IL-23受体α链和/或具有纤维连接蛋白III型结构域的I型细胞因子受体，和所述不相关蛋白是IL-6受体和/或IL-18受体α链。

27.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ IDNO:1所示的成熟人泪液脂质运载蛋白的序列具有至少75％同一性。

28.用于根据前述权利要求中任一项所述的用途中的权利要求1中所定义的脂质运载蛋白突变蛋白。

29.一种药物组合物，其包含如权利要求1-27中限定的脂质运载蛋白突变蛋白，用于治疗有此需要的受试者的方法中，所述方法包括通过雾化给所述受试者施用在溶液中浓度范围为0.01mg/ml-100mg/ml的药物组合物，其特征在于，所述溶液包含：

(a)pH水平为5.5-8.0，

(b)重量摩尔渗透压浓度值为150-550mOsm/L，和

(c)作为渗透阴离子的氯化物的离子浓度为31-300mM，且其中产生的气溶胶具有1μm-10μm的总气体动力学中位数直径(MMAD)。

30.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述溶液还具有小于1.5cp的粘度值。

31.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物具有0.05mg/ml-50mg/ml的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的浓度水平。

32.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述溶液具有5.5-8.0的经调节的pH。

33.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述溶液具有150-550mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度值。

34.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述溶液具有31-300mM的作为渗透阴离子的氯化物的离子浓度。

35.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述溶液具有0-1.5cp的粘度。

36.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述产生的气溶胶具有1μm-10μm的总气体动力学中位数直径(MMAD)。

37.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，使用电子雾化器、喷嘴、超声、或振动穿孔膜或振动网孔雾化器。

38.根据权利要求29所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白在雾化时和雾化后保持其功能和结构完整性。

39.根据权利要求38所述的应用的药物组合物，其特征在于，所述脂质运载蛋白突变蛋白在雾化时和雾化后保持为单体的。

40.一种包含如权利要求29-39中任一项所限定的药物组合物的溶液，所述药物组合物的浓度范围为0.01mg/ml-100mg/ml，其中所述溶液包含：

(a)pH水平为5.5-8.0，

(b)重量摩尔渗透压浓度值为150-550mOsm/L，和

(c)作为渗透阴离子的氯化物的离子浓度为31-300mM，且其中产生的气溶胶具有1μm-10μm的总气体动力学中位数直径(MMAD)。