ES2863410T3 - Métodos para prevenir o tratar ciertos trastornos mediante la inhibición de la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina lagrimal humana o un fragmento de la misma, que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto mediante nebulización dicha composición farmacéutica, a una concentración en el intervalo de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml en una solución, en donde dicha solución comprende: (a) un nivel de pH entre 5,5 y 8,0, (b) un valor de osmolalidad entre 150 y 550 mOsm/kg, y (c) una concentración iónica entre 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y en donde dicha solución se nebuliza en un aerosol que tiene una masa media aerodinámica (MMAD) en el intervalo de 1 μm a 10 μm, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene los mismos aminoácidos que los expuestos en la SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoácidos correspondientes a la posición 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1) y en donde el fragmento de la muteína de lipocalina carece de al menos uno de los aminoácidos aminoterminales y/o carboxiloterminales en comparación con dicha muteína de lipocalina.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para prevenir o tratar ciertos trastornos mediante la inhibición de la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a métodos para tratar, aliviar o prevenir un trastorno, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una proteína que inhibe la unión del ligando de Uniprot n.° P05112 y/o el ligando de Uniprot n.° P35225 a sus respectivos receptores, a un sujeto que lo necesite. En algunas divulgaciones, el trastorno está preferentemente asociado con un aumento en la respuesta inmunitaria de Th2. En algunas divulgaciones, la administración es preferentemente local en el pulmón para tratar, aliviar o prevenir el asma alérgica, la rinitis, la conjuntivitis, la fibrosis pulmonar, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la proteinosis alveolar pulmonar o el edema pulmonar fulminante.

ANTECEDENTES

Las proteínas que se unen de manera selectiva a dianas seleccionadas mediante interacciones no covalentes desempeñan un papel crucial como reactivos en biotecnología, medicina, análisis biológicos, así como en las ciencias biológicas y biosanitarias en general. Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un destacado ejemplo de esta clase de proteínas. A pesar de las múltiples necesidades de proteínas de este tipo, unidas al reconocimiento, la unión y/o la separación de ligandos/dianas, en la actualidad se emplean inmunoglobulinas de manera prácticamente exclusiva.

Las moléculas de unión proteicas adicionales que tienen funciones similares a las de los anticuerpos son los miembros de la familia de las lipocalinas, que han evolucionado de manera natural para unirse a ligandos. Las lipocalinas están presentes en múltiples organismos, incluidos de vertebrados, insectos, plantas y bacterias. Los miembros de la familia de proteínas de las lipocalinas (Pervaiz, S., y Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) normalmente son pequeñas proteínas secretadas que tienen una sola cadena polipeptídica. Se caracterizan por una serie de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su capacidad para unirse a diversas moléculas, principalmente hidrófobas (tales como los retinoides, ácidos grasos, colesteroles, prostaglandinas, biliverdinas, feromonas, tastanos y odorizantes), su unión a receptores específicos de la superficie celular y su formación de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se han clasificado principalmente como proteínas de transporte, en la actualidad resulta evidente que las lipocalinas tienen diversas funciones fisiológicas. Estas incluyen papeles en el transporte de retinol, la olfacción, la señalización de las feromonas y la síntesis de prostaglandinas. También se han relacionado las lipocalinas con la regulación de la respuesta inmunitaria y con la mediación de la homeostasia celular (revisado, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318, 1-14 y Flower, D.R. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24). Lofblom et al. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 843-848 divulgan armazones de proteínas no basados en inmunoglobulina como potenciales alternativas a los anticuerpos.

Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservación de secuencia general, a menudo con identidades de secuencia inferiores al 20 %. Sin embargo y sorprendentemente, su patrón de plegado general está altamente conservado. La parte central de la estructura de las lipocalinas consta de una lámina p formada por ocho hebras antiparalelas cerrada sobre sí misma, de modo que forma un barril p enlazado de manera continua por enlaces de hidrógeno. Este barril p forma una cavidad central. Un extremo del barril está bloqueado estéricamente por el segmento peptídico aminoterminal dispuesto atravesado en su base, así como por tres bucles peptídicos que conectan las hebras p. El otro extremo del barril p está expuesto al disolvente y abarca un sitio de unión a la diana, que se forma mediante cuatro bucles peptídicos flexibles. Esta diversidad de bucles en el armazón rígido de la lipocalina es lo que da lugar a diversos modos de unión diferentes, cada uno con capacidad para acomodar dianas de diferente tamaño, forma y carácter químico (revisado, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996), anteriormente citado; Flower, D.R. et al. (2000), anteriormente citado o Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350).

En diversas publicaciones PCT (por ejemplo, los documentos WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029463, WO 03/029471 y WO 2005/19256) se divulga cómo pueden construirse muteínas de diversas lipocalinas (por ejemplo, lipocalina lagrimal y la lipocalina hNGAL) para que muestren alta afinidad y especificidad frente a una diana que sea diferente a un ligando natural de una lipocalina de tipo silvestre. Esto puede efectuarse, por ejemplo, mutando una o más posiciones de aminoácidos de al menos uno de los cuatro bucles peptídicos. Además, la publicación PCT WO 2011/154420 enseña uno o más métodos para producir muteínas de lipocalina, que se unen a la subunidad alfa del receptor de IL-4. Además, Hohlbaum et al., Inflammation Research, 2011, Vol.60, no. Supl.1, páginas 82-83 divulga una muteína de lipocalina lagrimal humana que se une a IL4-Ra.

Las citocinas de Th2 IL-4 (oficialmente conocida como interleucina-4, Uniprot n.° P05112) e IL-13 (oficialmente conocida como interleucina-13, Uniprot n.° P35225) tienen funciones en su mayoría superpuestas y promueven directamente varias características clave del asma, incluidas la eosinofilia, la metaplasia de células caliciformes, la hiperreactividad de las vías respiratorias, el cambio a inmunoglobulinas IgE, la activación alternativa de macrófagos, el remodelado de las células del músculo liso y la fibrosis subepitelial. Además, los polimorfismos genéticos en los genes de IL-4, IL-13, IL-4RA (oficialmente conocida como subunidad alfa del receptor de interleucina-4, Uniprot n.° P24394, SEQ ID NO: 12) y Stat6 están relacionados con el asma. Esto es especialmente relevante, dado que la combinación de variantes alélicas de IL-4, IL-13, IL-4RA y Stat6 parecen ser sinérgicas y un polimorfismo descrito en IL-4, IL-13 e IL-4RA potencian la producción, la función o la actividad de señalización de las citocinas de Th2 o de la subunidad común del receptor de IL-4/IL-13 (Finkelman et al. JI, 2010, 184:1663-74). Recientemente, se han definido endotipos o subfenotipos del asma según el mecanismo molecular o la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, Woodruff et al definieron los fenotipos del asma en altos en Th2 y bajos en Th2, basándose en la expresión en el epitelio pulmonar de los genes inducibles por IL-13 POSTN (periostina), CLCA1 (gob5) y SERPINB2 (Wooddruff PG et al, Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids PNAS, 2007, 104: 15858-63; Prescott G. Woodruff) (T-helper Type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of Asthma, Am.J. Respir.Crit.Care Med., 2009, 180:388-395). Es sabido que la inhibición selectiva de IL-4 e IL-13 reduce la hiperreactividad en las vías respiratorias inducida por alérgenos y mejora los síntomas del asma (Wenzel et al., Lancet, 2007, 370; 1422-31, Tomkinson et al., American Thoracic Soc, 2006, 102).

Por tanto, sería deseable disponer de métodos terapéuticos mejorados que impliquen una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende muteínas de lipocalina lagrimal humana, que se unan a IL-4RA con alta afinidad de unión y que de este modo, inhiban la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores y que muestre actividad terapéutica in vivo en un sujeto que lo necesite. Cuando se usa en la presente solicitud, un sujeto que lo necesite puede ser un mamífero, tal como un ser humano, un perro, un ratón, una rata, un cerdo, un simio, tal como macaco cangrejero, solo por nombrar algunos ejemplos ilustrativos, que necesite el tratamiento o la prevención de un trastorno.

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina lagrimal humana o un fragmento de la misma, que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto mediante nebulización dicha composición farmacéutica, a una concentración en el intervalo de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml en una solución, en donde dicha solución comprende:

(a) un nivel de pH entre 5,5 y 8,0,

(b) un valor de osmolalidad entre 150 y 550 mOsm/kg, y

(c) una concentración iónica entre 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y en donde dicha solución se nebuliza en un aerosol que tiene una masa media aerodinámica (MMAd ) en el intervalo de 1 pm a 10 pm, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene los mismos aminoácidos que los expuestos en la SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoácidos correspondientes a la posición 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1) y en donde el fragmento de la muteína de lipocalina carece de al menos uno de los aminoácidos aminoterminales y/o carboxiloterminales en comparación con dicha muteína de lipocalina.

En una realización, la muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de mostrar una actividad terapéutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir, in vivo, el transcrito Ccl11 (eotaxina) inducido por IL-13 humana.

En una realización, la muteína lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de interrumpir la señalización posterior y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13.

En una realización, la muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es más potente que un mutante de IL-4 (R121D, Y124D) a la hora de inhibir el transcrito Ccl11 (eotaxina) inducido por IL-13 humana in vivo.

En una realización, la muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de mostrar una actividad funcional igual de buena que el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

En una realización, la muteína de lipocalina o el fragmento de la misma es capaz de inhibir la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 con la misma eficacia que el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

En una realización, una muteína de lipocalina o un fragmento de la misma carece esencialmente de reactividad cruzada con la cadena alfa del receptor de IL-23, el receptor de citocinas de tipo I con dominio de fibronectina de tipo III, el receptor de IL-6 o el receptor de IL-18.

En una realización, la muteína de lipocalina o el fragmento de la misma se une a la cadena alfa del receptor de IL-4.

En una realización, la solución tiene un valor de viscosidad menor de aproximadamente 1,5 cp.

En una realización, la composición farmacéutica tiene un grado de concentración de dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma seleccionado entre el grupo que consiste en: de 0,05 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 10 mg/ml y de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml.

En una realización, la solución tiene un pH ajustado seleccionado entre el grupo que consiste en: entre 5,5 y 8,0, entre 6,0 y 8,0, entre 6,0 y 7,5, entre 5,5 y 7,5, entre 6,0 y 7,0 y entre 6,5 y 7,5.

En una realización, la solución tiene un grado de osmolalidad seleccionado entre el grupo que consiste en: entre 150 y 550 mOsm/kg, entre 150 y 500 mOsm/kg, entre 200 y 550 mOsm/kg, entre 200 y 500 mOsm/kg, entre aproximadamente 200 y 450 mOsm/kg y entre 150 y 450 mOsm/kg.

En una realización, la solución tiene una concentración iónica de cloruro como anión permeante entre el grupo que consiste en: entre 31 y 300 mM, entre 50 y 200 mM, entre 50 y 300 mM, entre 50 y 150 mM, entre 100 y 200 mM, entre 100 y 300 mM, entre 100 y 250 mM, entre 150 y 250 mM, entre 150 y 300 mM y entre 200 y 300 mM.

En una realización, la solución tiene una viscosidad seleccionada entre el grupo que consiste en: entre 0 y 1,5 cp, entre 0 y 1,0 cp, 0 y 0,5 cp, entre 0,5 y 1,0 cp, entre 0,5 y 1,5 cp y entre 1,0 y 1,5 cp.

En una realización, el aerosol tiene una masa media aerodinámica (MMAD) seleccionada entre el grupo que consiste en: entre 1 pm a 10 pm, entre 2 pm a 8 pm, entre 2 pm a 5 pm, entre 1,5 pm a 4 pm, entre 3 pm a 4,5 pm y entre 2,5 pm a 3,5 pm.

En una realización, se usa un nebulizador electrónico, un nebulizador de chorro, un nebulizador por ultrasonidos o un nebulizador de membrana perforada vibratoria o de malla vibratoria.

En una realización, el sujeto que necesita la composición padece inflamación alérgica, asma alérgica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, proteinosis alveolar pulmonar o edema pulmonar fulminante.

En una realización, la muteína de lipocalina o el fragmento de la misma mantiene su integridad funcional y estructural durante y tras la nebulización.

En una realización, la muteína de lipocalina o el fragmento de la misma se mantiene en forma monomérica durante y tras la nebulización.

La invención también proporciona una solución para su uso en un método como se ha definido anteriormente, en donde la solución es una solución salina que comprende;

(a) un nivel de pH entre 5,5 y 8,0 y

(b) un valor de osmolalidad entre 150 y 550 mOsm/kg, y

(c) una concentración iónica entre 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y

(d) una viscosidad menor de 1,5 cp,

y en donde la solución comprende la composición farmacéutica para su uso como se ha definido anteriormente, en donde la composición farmacéutica comprende la muteína de lipocalina lagrimal humana o un fragmento de la misma, a una concentración en el intervalo de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml.

La solución para su uso puede ser para su uso en un método de administración por inhalación en 1-3 minutos.

La solución para su uso puede ser para su uso en un método de administración por inhalación, en donde la administración por inhalación es local al pulmón.

La solución para su uso puede ser para su uso en un método de administración de la composición farmacéutica al paciente que lo necesite en forma de un aerosol, por ejemplo, por inhalación.

La presente divulgación se refiere a un método de tratamiento, alivio o prevención de un trastorno que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición a un sujeto que necesite dicha composición, en donde dicha composición comprende una muteína de lipocalina de la divulgación que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores. En algunas divulgaciones adicionales, la muteína de lipocalina es capaz de interrumpir la señalización posterior y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13. En diversas divulgaciones, el trastorno es un trastorno en el que la vía de IL-4/IL-13 contribuye a la patogénesis de la enfermedad. En diversas divulgaciones adicionales, la composición puede administrarse localmente al pulmón. En diversas divulgaciones preferidas, la composición puede administrarse mediante inhalación de aerosol. En algunas divulgaciones más preferidas, la composición se administra a un sujeto que lo necesite con una frecuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: hasta cuatro veces al día, hasta tres veces al día, hasta dos veces al día, hasta una vez al día, hasta una vez cada dos días, hasta una vez cada tres días, hasta una vez a la semana o hasta una vez cada dos semanas.

En algunas divulgaciones, cuando se usa en la presente solicitud, un sujeto que necesite dicha composición padece un trastorno en el que la expresión de IL-4 y/o la expresión de IL-13 contribuye o está relacionada con la patogénesis o el agravamiento de la enfermedad. En algunas divulgaciones, el sujeto que necesita dicha composición padece un trastorno que puede mejorarse, aliviarse o inhibirse mediante la eliminación, la inhibición o la reducción de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. En algunas divulgaciones adicionales, un sujeto que necesita dicha composición puede padecer uno o más trastornos que incluyen, por ejemplo, inflamación alérgica, asma alérgica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, proteinosis alveolar pulmonar o edema pulmonar fulminante. También se prevé que la muteína de lipocalina de la divulgación, en algunas divulgaciones, se aplique para el tratamiento, el alivio o la prevención de la fibrosis tisular (véase Chiaramonte et al. (1999), J. Clin. Invest. 104(6), 777-785. La fibrosis puede ser el resultado, preferentemente, de la curación de una herida, por ejemplo, una herida por una incisión quirúrgica. La fibrosis tisular afecta, por ejemplo, a un tejido seleccionado entre el grupo que consiste en hígado, epidermis de la piel, endodermis de la piel, músculo, tendón, cartílago, tejido cardíaco, tejido pancreático, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testículo, ovario, glándula suprarrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar e intestinal, en particular, el tejido se selecciona entre pulmón e hígado.

Por ejemplo, un trastorno que, preferentemente, puede tratarse, aliviarse o prevenirse mediante un método de la divulgación está asociado con un aumento de la respuesta inmunitaria de Th2.

En algunas realizaciones, el trastorno puede asociarse con una reacción alérgica o una inflamación alérgica, preferentemente, la reacción alérgica es una alergia alimentaria y preferentemente, la inflamación alérgica está asociada con asma alérgica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis. En diversas divulgaciones preferidas, el asma alérgica puede ser una inflamación de las vías respiratorias en la que la vía de IL-4/IL-13 contribuye a la patogénesis de la enfermedad.

En otras divulgaciones, la composición de la divulgación comprende además un medicamento contra la alergia y/o un medicamento contra la inflamación alérgica.

Otro trastorno ilustrativo que, preferentemente, puede tratarse, aliviarse o prevenirse mediante un método de la divulgación está asociado con la producción de moco o la secreción de moco.

En diversas realizaciones preferidas, el trastorno puede ser un trastorno pulmonar y preferentemente, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o fibrosis quística (FQ).

En una divulgación adicional, dicha composición puede usarse como un agente de terapia génica para diversos trastornos divulgados.

Una muteína de lipocalina de la invención puede ser una muteína de lipocalina lagrimal humana que tiene un aminoácido mutado en una posición correspondiente a la posición 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lagrimal humana madura. Sin embargo, la muteína de lipocalina de la divulgación también puede ser una muteína de una lipocalina distinta de la lipocalina lagrimal humana, tal como lipocalina de NGAL humana u otras lipocalinas descritas en el presente documento.

En diversas divulgaciones preferidas, la muteína de lipocalina tiene un aminoácido mutado en dos cualesquiera o más aminoácidos en una posición correspondiente a la posición 26, 32, 34, 55, 56, 58 y 63 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lagrimal humana madura.

La muteína de lipocalina descrita en el presente documento tiene, en una realización particularmente preferida, al menos un 75 % de identidad con respecto a la secuencia de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1).

Una muteína de lipocalina aplicada en los métodos de la presente divulgación tiene preferentemente reactividad cruzada con otras especies, por ejemplo, IL-4RA de tití, que permite evaluar la muteína de lipocalina candidata en titíes, que se asemejan a los organismos humanos. La muteína de lipocalina puede tener o no reactividad cruzada con IL-4RA de otras especies no humanas, tales como IL-4RA de ratón y/o IL-4RA de macaco cangrejero.

En general, se prefiere que la muteína de lipocalina esencialmente no tenga reactividad cruzada con una proteína relacionada o una proteína no relacionada. Dicha proteína relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa del receptor de IL-23 y/o un receptor de citocinas de tipo I con dominio de fibronectina de tipo II, mientras que dicha proteína no relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa del receptor de IL-6 y/o el receptor de IL-18.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 representa la inhibición de la fosforilación de STAT 6 inducida por IL-4 e IL-13 humana (ensayo basado en FACS) en células TF-1 mediante una muteína de lipocalina de la divulgación.

La figura 2 representa la inhibición de la fosforilación de STAT 6 inducida por IL-4 humana (ensayo basado en FACS) en ratones con doble inserción génica de cadena IL-4RA/IL-13RA1 humana (oficialmente conocida como subunidad alfa-1 del receptor de interleucina-13, Uniprot n.° P78552, SEQ ID NO: 13) mediante una muteína de lipocalina de la divulgación.

La figura 3 representa la inhibición de eotaxina inducida por IL-13 humana en tejido pulmonar de ratones con doble inserción génica del receptor de IL-4 alfa/la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano, mediante una muteína de lipocalina de la divulgación.

La figura 4 representa la inhibición del transcrito de eotaxina inducido por IL-13 en ratones con doble inserción génica de receptor de IL-4 alfa/cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano, mediante una muteína de lipocalina de la divulgación, cuando se administra a diferentes intervalos de tiempo (figura 4a) o diferentes dosis (figura 4b), antes de la administración de IL-13 humana, así como en comparación con un mutante de IL-4 a diferentes concentraciones de dosis (figura 4c).

La figura 5 representa el análisis de una muteína de lipocalina nebulizada mediante cromatografía de exclusión por tamaños y difracción láser.

La figura 6 representa las propiedades farmacocinéticas y la biodistribución de una muteína de lipocalina de la divulgación en ratones con doble inserción génica de IL-4RA humano/IL-13 humana después de la instilación intratraqueal.

La figura 7 representa la inhibición de la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-líquido de epitelio de las vías respiratorias humanas por medio de una muteína de lipocalina de la divulgación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar o prevenir un trastorno divulgado, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una muteína de lipocalina, que inhibe la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores mediante la unión a la cadena alfa del receptor de IL-4, a un sujeto que lo necesite. Una muteína de lipocalina para su uso de acuerdo con la presente divulgación puede unirse específicamente a una cadena alfa del receptor de IL-4. Ventajosamente, estas muteínas de lipocalina tienen una elevada afinidad de unión por la cadena alfa del receptor de IL-4. Estas muteínas de lipocalina tienen incluso propiedades de unión mejoradas por la cadena alfa del receptor de IL-4 en relación con las muteínas de lipocalina proporcionadas en el documento WO 2008/015239, en particular, tienen una mayor afinidad de unión.

Los presentes inventores han demostrado que las muteínas de lipocalina de la presente divulgación, gracias a su unión a la cadena alfa del receptor de IL-4, interfieren con la interacción de los ligandos afines de los receptores, es decir, las citocinas IL-4 y/o IL-13, de una manera que proporcionan una respuesta terapéutica in vivo. Por ejemplo, los datos de un modelo de ratón transgénico, que se usó para efectuar los efectos que puedan tener las muteínas de lipocalina de la divulgación en la señalización mediada por IL-4 y/o IL-13, demuestran una alteración de la señalización posterior mediada por IL-4 e IL-13. El ratón transgénico, que se asemeja a un ser humano en tanto que los ratones portan genes que codifican la cadena del receptor de IL-4 alfa humana y la cadena alfa 1 del receptor de IL-13, son representativos del potencial terapéutico en seres humanos. Con este objetivo en mente, los genes humanos se ubican en su locus correspondiente del cromosoma de ratón respectivo, haciendo que de este modo el ratón sea un ratón con doble inserción génica que expresa el receptor tanto de tipo I como de tipo II. Por tanto, cuando se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es preferentemente una cantidad de una muteína de lipocalina de la presente divulgación que es terapéuticamente eficaz en un ser humano.

A diferencia de los ejemplos de la divulgación, la técnica anterior no enseña al experto si una muteína de lipocalina de la divulgación es capaz de interrumpir la señalización o las respuestas celulares posteriores inducidas por la IL-4 y/o la IL-13 en sujetos o si es capaz de mostrar una actividad terapéutica in vivo en sujetos que padecen uno o más trastornos, tales como inflamación alérgica, asma alérgica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, proteinosis alveolar pulmonar o edema pulmonar fulminante. Tampoco puede deducirse de la técnica anterior información alguna acerca de la eficacia de las muteínas de lipocalina contra estos trastornos. En ausencia de cualquier dato que demuestre un efecto terapéutico de una muteína de lipocalina contra trastornos, por ejemplo, asociados con un aumento de la respuesta inmunitaria de Th2 y/o con una reacción alérgica o una inflamación alérgica, no podría haberse esperado dicho efecto terapéutico y los métodos correspondientes de tratamiento, prevención o alivio.

De hecho, la presente divulgación proporciona datos in vivo que muestran un efecto terapéutico de las muteínas de lipocalina descritas en el presente documento que ilustran, por ejemplo, el efecto antiinflamatorio de las muteínas de lipocalina de la presente divulgación. A este respecto, la presente divulgación muestra, por primera vez, que una muteína de lipocalina de la divulgación (SEQ ID NO: 6) es capaz de inhibir eficazmente in vivo el transcrito Ccl11 (eotaxina) inducido por IL-13 y es más potente que un mutante de IL-4 (la IL-4 (R121D, Y124D) en la figura 4c) medido mediante un análisis esencialmente descrito en el ejemplo 5:

□ se preparan varios ratones con doble inserción génica del receptor de IL-4 alfa humana/la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano como se describe en el ejemplo 4 con la excepción de que se administraron 30 pl de IL-13 (Peprotech, 11 pg) solo una vez mediante instilación intratraqueal,

□ opcionalmente, establecer los parámetros del análisis como se describe en el ejemplo 5 y se agrupa a los ratones de manera correspondiente,

□ aplicar la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) mediante instilación intratraqueal con un volumen de 30 pl o bien a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,

□ aplicar la IL-4 mutante (R121D, Y124D) también por instilación intratraqueal con un volumen de 30 pl a diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,

□ usar el modelo abreviado de inflamación de las vías respiratorias inducida por IL-13 (una sola administración intratraqueal de IL-13) para evaluar la duración de la respuesta farmacológica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable.

El efecto terapéutico observado en el modelo animal murino aplicado en la presente divulgación proporciona por tanto suficientes pruebas de una aplicación terapéutica, dada la presencia de ortólogos humanos y la ausencia de ortólogos murinos. Basándose en este principio, resultaría totalmente razonable que, en ausencia de datos en pacientes humanos, el experimento in vivo es suficientemente predictivo de la actividad in vivo, por ejemplo, la actividad antiinflamatoria in vivo, de las muteínas de lipocalina descritas en el presente documento en seres humanos.

Además, la presente divulgación demuestra que una muteína de lipocalina de la divulgación (SEQ ID NO: 6) es capaz de mostrar una actividad funcional igual de buena que la de un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (el mAb anti-IL4R en la figura 7; cuyas regiones variables de cadena ligera y pesada se muestran en las SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente) divulgado en el ejemplo 8, medida mediante un análisis descrito esencialmente en el ejemplo 8:

□ tratar MucilAir™ (un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido con epitelio de las vías respiratorias humano reconstituido in vitro usando células primarias humanas) cada dos días con IL-13 humana a de aproximadamente 0,3 a 30 ng/ml,

□ opcionalmente, llevar a cabo una tinción in situ con azul alcián (tiñe los mucopolisacáridos ácidos y los glucosaminoglicanos con un color de azul a verde azulado) y/o llevar a cabo un análisis histológico, para demostrar que MucilAir™ muestra una densidad aumentada de células caliciformes después de aproximadamente 14 días de tratamiento,

□ analizar el efecto inhibidor de una muteína de lipocalina en la metaplasia de células caliciformes comparando la exposición continua de MucilAir™ a aproximadamente 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 días como control positivo, a IL-13 más diferentes concentraciones de una muteína de lipocalina, a IL-13 más diferentes concentraciones de dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (las regiones variables de la cadena ligera y pesada se muestran en las SEQ ID NO: 14 y 15) y a MucilAir™ cultivado durante 14 días sin IL-13 como control negativo, □ llevar a cabo una tinción con azul alcián, por ejemplo, tinción de azul alcián dd, en la superficie apical para una tinción in situ y tomar imágenes de las células teñidas en un microscopio de contraste de fase para el análisis de las imágenes,

□ cuantificar el porcentaje de las células positivas a azul alcián mediante el programa de procesamiento de imágenes en Java de dominio público ImageJ y expresar su número como relación de área del área de azul alcián al área total de la imagen,

□ opcionalmente, medir la eotaxina-3 (una quimiocina inducida por IL-13) en el medio basal en el día 14 usando un kit ultrasensible para eotaxina-3 comercial de, por ejemplo, Meso Scale Discovery.

Dicho anticuerpo anti-IL-4RA tiene las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de las SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente y se desarrolló por Amgen (anteriormente Immunex) y se denomina AMG 317. Se trata de un anticuerpo monoclonal completamente humano que se encontraba en investigación por su capacidad para bloquear las acciones de la interleucina-4 y la interleucina-13, que desempeñan un papel en el asma (en 2008, se completó un estudio de fase 2 de búsqueda de dosis para el asma de moderada a grave). Un análisis provisional mostró pruebas de actividad biológica; sin embargo, la eficacia clínica general no cumplió con las expectativas. Por tanto, la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 6 es capaz de inhibir la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 tan bien como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA descrito en el presente documento, cuando la comparación de la muteína de lipocalina con dicho anticuerpo anti-IL-4RA se efectuó como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones adicionales se prefiere, por tanto, que una muteína de lipocalina de la divulgación tenga en el análisis anteriormente descrito las mismas propiedades que la muteína de lipocalina de la SEQ ID NO: 6 con respecto a la inhibición de la metaplasia de células caliciformes.

El complejo de IL-4/ IL-4Ra puede dimerizarse o bien con la cadena gamma común (yc, CD132) o con la subunidad IL-13Ralfa1 (IL-13Ra1), por medio de dominios en IL-4, para crear dos complejos de señalización diferentes, comúnmente denominados receptores de tipo I y de tipo II, respectivamente. Como alternativa, IL-13 puede unirse a IL-13Ra1 para formar un complejo de IL-13/IL-13Ra1 que recluta a la subunidad IL-4Ra para formar un complejo de receptor de tipo II. Por tanto, IL-4Ra media las actividades biológicas tanto de IL-4 como de IL-13 (revisado por Gessner et al, Immunobiology, 201:285, 2000). Las muteínas de lipocalina de la presente divulgación interfieren ventajosamente con y/o bloquean la señalización a través de los receptores de tipo I y/o tipo II, ya que estas muteínas de lipocalina son capaces de unirse a la cadena alfa del receptor de IL-4.

Se ha demostrado en estudios in vitro que la IL-4 y la IL-13 activan funciones efectoras en diversos tipos celulares, por ejemplo, en los linfocitos T, los linfocitos B, los eosinófilos, los mastocitos, los basófilos, las células de músculo liso de las vías respiratorias, las células epiteliales respiratorias, los fibroblastos pulmonares y las células endoteliales (revisado por Steinke et al, Resp Res, 2:66, 2001 y por Willis-Karp, Immunol Rev, 202:175, 2004). IL-4Ra se expresa en baja cantidad (100-5000 moléculas/célula) en diversos tipos celulares (Lowenthal et al, J Immunol, 140:456, 1988), por ejemplo, linfocitos T de sangre periférica, monocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, linfocitos B y fibroblastos pulmonares. El receptor de tipo I es predominante en las células hematopoyéticas, mientras que el receptor de tipo II se expresa tanto en células hematopoyéticas como en células no hematopoyéticas.

Los receptores y complejos de receptores de la superficie celular se unen a IL-4 y/o IL-13 con diferentes afinidades. Los componentes principales de los receptores y los complejos de receptores que se unen a IL-4 y/o IL-13 son IL-4Ra, IL-13Ra1 e IL-13Ra2. Estas cadenas se expresan en la superficie de las células en forma de monómeros o heterodímeros de IL-4Ra/IL-13Ra1 o IL-4Ra/IL-13Ra2. El monómero IL-4ra se une a IL-4, pero no a IL-13. Los monómeros IL-13Ra1 e IL-13Ra2 se unen a IL-13, pero no se unen a IL-4. Los heterodímeros IL-4Ra/IL-13RaI e IL-4Ra/IL-13Ra2 se unen tanto a IL-4 como a IL-13. Dado el hecho de que el receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ralfa2) se une a IL-13 con alta afinidad pero es un receptor no señalizante que se cree que es un receptor señuelo para la IL-13, se prevé que las muteínas de lipocalina de la presente divulgación preferentemente no se unan al receptor alfa 2 de IL-13.

Como ya se ha explicado, tanto IL-4 como IL-13 señalizan a través del IL-4Ra, un componente de los receptores de tipo I (IL-4Ra y yc) y de tipo II (IL-4Ra e IL-13Ra1). IL-4 señaliza a través de las vías de receptores de tipo I y II, mientras que IL-13 señaliza únicamente a través de IL-4R, de tipo II. IL-13 también se une a la cadena IL-13Ra2, que no contiene un dominio de señalización transmembrana y se cree que actúa como receptor señuelo. yc activa a la cinasa Janus (JAK)3, mientras que IL-13Ra1 activa a la tirosina cinasa 2 (TYK2) y a JAK2. Las JAK activadas fosforilan posteriormente a STAT-6. STAT-6 fosforilada se dimeriza, migra al núcleo y se une a los promotores de los genes sensibles a IL-4 e IL-13, tales como los relacionados con la diferenciación en linfocitos T colaboradores de tipo 2 (Th2), la inflamación de las vías respiratorias, la hipersensibilidad de las vías respiratorias (HVR) y la producción de moco.

Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 promueven la producción de anticuerpos y la inmunidad humoral y se generan para combatir los patógenos extracelulares. Los linfocitos Th2 son mediadores de la producción de Ig (inmunidad humoral) y producen IL-4, iL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 (Tanaka, et. al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1996)). Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 se caracterizan por la generación de ciertas citocinas (por ejemplo, IL-4, IL-13) y tipos específicos de anticuerpos (IgE, IgG4) y son típicas de las reacciones alérgicas, que pueden causar ojos llorosos y síntomas de asma, tales como inflamación de las vías respiratorias y contracción de las células musculares de las vías respiratorias en los pulmones.

Además, el trastorno que preferentemente se trata, alivia o previene mediante los métodos de la presente divulgación aplicando las lipocalinas descritas en el presente documento, puede estar asociado con una reacción alérgica o una inflamación alérgica.

En algunas divulgaciones, el trastorno puede ser asma alérgica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis.

El asma es una compleja enfermedad inflamatoria persistente caracterizada por la hipersensibilidad de las vías respiratorias, asociada con inflamación de las vías respiratorias. Existen estudios que sugieren que el uso regular de corticoesteroides inhalados a altas dosis y broncodilatadores de acción prolongada u omalizumab (un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a la inmunoglobulina E y que normalmente se usa como terapia avanzada) puede no ser suficiente para proporcionar control del asma en todos los pacientes, lo que resalta una importante necesidad no satisfecha. La interleucina-4, la interleucina-13 y el transductor de señales y factor activador de la transcripción-6 son componentes clave en el desarrollo de la inflamación de las vías respiratorias, la producción de moco y la hipersensibilidad de las vías respiratorios en el asma. Los compuestos biológicos que actúen selectivamente sobre estas moléculas pueden proporcionar una nueva modalidad terapéutica para pacientes con asma de moderada a grave no controlada. La presente divulgación proporciona estos compuestos biológicos por medio de las muteínas de lipocalina como se describen en el presente documento.

En algunas divulgaciones, el asma alérgica es una inflamación de las vías respiratorias en la que la vía de IL-4/IL-13 contribuye a la patogénesis de la enfermedad.

Además, el trastorno que preferentemente se trata, alivia o previene mediante los métodos de la presente divulgación mediante la aplicación de las lipocalinas como se describen en el presente documento también pueden ser trastornos pulmonares, por ejemplo, trastornos pulmonares en los que la vía de IL-4/IL-13 contribuye a la patogénesis de la enfermedad. Dichos trastornos pulmonares incluyen, pero sin limitación, fibrosis pulmonar, incluida la enfermedad pulmonar fibrótica crónica, otras afecciones caracterizadas por la proliferación de fibroblastos o la acumulación de colágeno en los pulmones inducida por IL-4, afecciones pulmonares en las que una respuesta inmunitaria de Th2 desempeña un papel, afecciones caracterizadas por una función de barrera reducida en el pulmón (por ejemplo, como resultado del daño inducido por IL-4 en el epitelio) o afecciones en las que la IL-4 desempeña un papel en una respuesta inflamatoria.

De manera similar, la fibrosis quística (FQ) se caracteriza por la sobreproducción de moco y el desarrollo de infecciones crónicas. La inhibición de IL-4RA y la respuesta de Th2 reducirán la producción de moco y ayudarán a controlar infecciones, tales como la aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA). La micosis broncopulmonar alérgica se produce principalmente en pacientes con fibrosis quística o asma, donde es dominante una respuesta inmunitaria de Th2. La inhibición de IL-4RA y la respuesta de Th2 ayudarán a eliminar y controlar estas infecciones.

De manera similar, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se asocia con el exceso de secreción de moco y la fibrosis. La inhibición de IL-4RA y la respuesta de Th2 ayudarán a reducir la producción de moco y el desarrollo de fibrosis, de forma que se mejora la función respiratoria y se retrasa la progresión de la enfermedad. La neumopatía y la fibrosis inducida por bleomicina y la fibrosis pulmonar inducida por radiación son trastornos caracterizados por la fibrosis pulmonar, que se manifiesta por la entrada de linfocitos Th2 c D4+ y macrófagos, que producen IL-4 e IL-13, lo que a su vez media el desarrollo de la fibrosis. La inhibición de IL-4RA y la respuesta de Th2 reducirán o prevendrán el desarrollo de estos trastornos.

Además, IL-4 e IL-13 inducen la diferenciación de las células epiteliales funcionales en las células caliciformes productoras de moco. Por tanto, la IL-4 y la IL-13 contribuyen a una producción mejorada de moco en subpoblaciones o algunas situaciones. La producción y secreción de moco contribuye a la patogénesis de la enfermedad en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística (FQ). Por tanto, el trastorno asociado con la producción de moco o la secreción de moco (por ejemplo, la sobreproducción o hipersecreción), puede preferentemente tratarse, aliviarse o prevenirse mediante los métodos de la presente divulgación, aplicando una muteína de lipocalina como se describe en el presente documento. En algunas divulgaciones preferidas, el trastorno asociado con la producción de moco o la secreción de moco es preferentemente la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o la fibrosis quística (FQ). La composición de la divulgación puede comprender además un medicamento contra el moco.

La proteinosis alveolar pulmonar se caracteriza por la alteración de la eliminación de tensioactivo. IL-4 aumenta los productos tensioactivos. También puede contemplarse en el presente documento el uso de un antagonista de IL-4RA, tal como una muteína de lipocalina de la divulgación para reducir la producción de tensioactivo y reducir la necesidad del lavado pulmonar completo.

El edema pulmonar fulminante (EPF) puede ser atribuible a diversos factores, uno de los cuales es la exposición a agentes químicos tóxicos. Por tanto, como ejemplo preferido pero no limitante, una población de pacientes susceptible al EPF es pacientes en estado crítico en ventilación mecánica, ya que el EPF es una complicación frecuente en dichos pacientes. En algunas divulgaciones adicionales, puede usarse, por tanto, un antagonista de IL-4RA, tal como una muteína de lipocalina de la divulgación para aliviar, prevenir o tratar el EPF al reducir la inflamación y las moléculas de adhesión.

La sarcoidosis se caracteriza por lesiones granulomatosas. También puede contemplarse en el presente documento el uso de un antagonista de IL-4RA, tal como una muteína de lipocalina de la divulgación para tratar la sarcoidosis, en particular la sarcoidosis pulmonar.

Pueden tratarse con antagonistas de IL-4RA afecciones en las que la alteración de la barrera inducida por IL-4 desempeña un papel (por ejemplo, afecciones caracterizadas por una función de barrera epitelial reducida en el pulmón). El daño en la barrera epitelial en los pulmones puede inducirse, directa o indirectamente, por IL-4 y/o IL-13. El epitelio pulmonar en el pulmón funciona como una barrera selectiva que impide que el contenido de la luz del pulmón entre en la submucosa. Una barrera dañada o "con fugas" permite que los antígenos atraviesen la barrera, lo que a su vez provoca una respuesta inmunitaria que podría provocar daño adicional al tejido pulmonar. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir, por ejemplo, el reclutamiento de eosinófilos o mastocitos. Puede administrarse un antagonista de IL-4RA para inhibir dicha estimulación no deseable de una respuesta inmunitaria.

A este respecto, puede emplearse un antagonista de IL-4RA, tal como una muteína de lipocalina de la divulgación, para promover la curación del epitelio pulmonar, por ejemplo en pacientes asmáticos, restaurando de este modo la función de barrera o como alternativa, administrado con fines profilácticos, para prevenir el daño inducido por IL-4 y/o IL-13 al epitelio pulmonar.

Cabe destacar que los métodos para tratar una enfermedad o trastorno de acuerdo con la presente divulgación no están limitados por un mecanismo de acción particular. Por ejemplo, la muteína de lipocalina de la divulgación puede utilizarse como agentes de terapia génica en los métodos divulgados.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica con el objetivo de alterar la evolución del sujeto o la célula que se esté tratando y puede llevarse a cabo antes o durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparición o recidiva de una enfermedad o una afección o un síntoma de la misma, aliviar una afección o síntoma de la enfermedad, reducir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, reducir la velocidad de progresión de la enfermedad, aliviar o paliar la patología y lograr la remisión o un pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones de la divulgación son útiles con el objetivo de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. El tratamiento es aplicable a la terapia tanto en seres humanos como en aplicaciones veterinarias.

"Prevención" incluye que los trastornos (o los síntomas asociados con los mismos) descritos en el presente documento puedan evitarse antes de que se produzcan y/o que no haya recurrencia de los trastornos.

"Alivio" incluye que los trastornos (o los síntomas asociados con los mismos) descritos en el presente documento se alivian, reducen, disminuyen y/o palían.

El término "administrado" o "administración" en todas sus formas farmacéuticas significa la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la muteína de lipocalina como único agente terapéutico o en combinación con otro agente terapéutico como se describe en el presente documento a un sujeto. Por tanto, se prevé que una muteína de lipocalina de la presente divulgación se encuentre preferentemente en forma de una composición, preferentemente una composición farmacéutica, que pueda emplearse preferentemente en estrategias de politerapia, es decir, administrado junto con otros medicamentos o fármacos, por ejemplo, otros medicamentos para tratar un trastorno como se describe en el presente documento y/o cualquier otro agente terapéutico que pueda ser beneficioso en el contexto de los métodos de la presente divulgación. Por tanto, una composición que comprende las muteínas de lipocalina descritas en el presente documento puede comprender además un medicamento contra la alergia y/o un medicamento contra la inflamación alérgica.

Una "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios de una muteína de lipocalina como se describe en el presente documento, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento y podrá determinarse por un experto en la materia usando técnicas conocidas.

Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una muteína de lipocalina como se describe en el presente documento puede variar dependiendo de factores tales como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la interacción farmacológica y la gravedad de la afección y podrá determinarse con experimentación rutinaria por los expertos en la materia. En ocasiones, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" puede usarse indistintamente en el presente documento con la expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz":

Una cantidad terapéuticamente eficaz, cuando se usa en la presente solicitud, también es una en la que los efectos tóxicos o perjudiciales de la muteína de lipocalina se vean superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, de una muteína de lipocalina como se describe en el presente documento para obtener el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que la dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. La muteína de lipocalina descrita en el presente documento que tiene la actividad terapéutica deseada puede administrarse en un portador fisiológicamente aceptable a un paciente, como se describe en el presente documento.

En algunas divulgaciones, un "sujeto", cuando se usa en la presente solicitud, es un vertebrado. En ciertas realizaciones particulares, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, primates (incluidos seres humanos y primates no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas divulgaciones particulares, un sujeto mamífero es un ser humano. En algunas divulgaciones adicionales, un sujeto humano, sinónimo de un individuo, es un sujeto particularmente preferido. En algunas realizaciones adicionales más, un sujeto humano que lo necesite, cuando se usa en la presente solicitud, es un paciente.

Una proteína de la divulgación puede ser una muteína de una lipocalina, preferentemente una lipocalina seleccionada entre el grupo que consiste en proteína de unión a retinol (RBP), proteína de unión a bilina (BBP), apolipoproteína D (APO D), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), lipocalina lagrimal (TLPC), proteína relacionada con a²-microglobulina (A2m), 24p3/uterocalina (24p3), proteína 1 de la glándula de von Ebners (VEGP 1), proteína 2 de la glándula de von Ebners (VEGP 2) y precursor Can f1 de alérgenos principal (ALL-1), en donde NGAL humana es una lipocalina preferida y la lipocalina lagrimal humana es una lipocalina más preferida. Como se usa en el presente documento, una "lipocalina" se define como una proteína monomérica de aproximadamente 18-20 kDA de peso, que tiene una región estructural supersecundaria de p lámina plegada que comprende una pluralidad de (preferentemente ocho) hebras p conectadas por pares mediante una pluralidad de (preferentemente cuatro) bucles en un extremo para de este modo definir un bolsillo de unión. La diversidad de bucles en el armazón rígido de la lipocalina es lo que da lugar a diversos modos de unión diferentes entre los miembros de la familia de lipocalinas, cada uno con capacidad para acomodar dianas de diferente tamaño, forma y carácter químico (revisado, por ejemplo, en Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). De hecho, la familia de proteínas de las lipocalinas ha evolucionado de manera natural para unirse a una gran variedad de ligandos y comparte niveles infrecuentemente bajos de conservación general de secuencia (normalmente con una identidad de secuencia de menos de un 20 %) aunque conserva un patrón de plegamiento general altamente conservado. La correspondencia entre las posiciones en diversas lipocalinas es bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 7.250.297.

En general, cuando en el presente documento se hace referencia a una muteína de lipocalina de la divulgación, preferentemente es diferente a su lipocalina homóloga de origen natural en tanto que difiere en al menos un aminoácido respecto de su lipocalina homóloga de origen natural. La diferencia puede ser una sustitución, eliminación y/o adición de un aminoácido, prefiriéndose una sustitución. En ciertas realizaciones particulares, una "muteína de una lipocalina" o "muteína de lipocalina" puede, en particular, ser una "muteína de lipocalina lagrimal humana" o "muteína de Tlc".

Una proteína de la divulgación es una muteína de la lipocalina lagrimal humana (Tlc). La expresión "lipocalina lagrimal humana" se usa en el presente documento para hacer referencia a la lipocalina lagrimal humana madura con el número de referencia de SWISS-PROT P31025. La lipocalina lagrimal humana madura (aminoácidos 19-176 de la secuencia de aminoácidos del número de referencia de SWISS-PROT P31025) (SEQ ID NO: 1) no incluye el péptido de señal aminoterminal (aminoácidos 1-18) que se incluye en la secuencia con el número de referencia de secuencia de aminoácidos de SWISS-PROT P31025 usado como "referencia" o "secuencia de referencia" en diversas realizaciones descritas en el presente documento.

La prealbúmina lagrimal humana, en la actualidad denominada lipocalina lagrimal (TLPC o Tlc), se describió inicialmente como una proteína principal del fluido lagrimal humano (aproximadamente una tercera parte del contenido proteico total), pero recientemente también se ha identificado en varios tejidos secretorios diferentes, incluidos los de próstata, la mucosa nasal y la mucosa traqueal. Se han encontrado proteínas homologas en ratas, cerdos, perros y caballos. La lipocalina lagrimal es un miembro de las lipocalinas infrecuentes debido a su elevada promiscuidad por lípidos relativamente insolubles y a características de unión diferentes a las de otros miembros de esta familia de proteínas (revisado en Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Un elevado número de compuestos lipófilos de diferentes clases químicas, tales como los ácidos grasos, los alcoholes grasos, los fosfolípidos, los glucolípidos y el colesterol son ligandos endógenos de esta proteína. De manera interesante, a diferencia de otras lipocalinas, la fuerza de la unión al ligando (diana) está correlacionada con la longitud de la cola de hidrocarburo, tanto para las amidas alquílicas como para los ácidos grasos. Por lo tanto, la lipocalina lagrimal se une con más fuerza a los lípidos menos solubles (Glasgow, Bj . et al. (1995) Curr. Eye Res. 14, 363-372; Gasymov, O.K. et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320).

Las muteínas de lipocalina particularmente adecuadas para un uso terapéutico como se divulga en el presente documento incluyen las lipocalinas expuestas en las SEQ ID NO: 2-11. Estas moléculas muestran especificidad y alta afinidad por IL4Ra humana, pero antes de la presente divulgación no se han caracterizado con datos in vivo terapéuticamente relevantes. Otras muteínas de lipocalina que también son adecuadas para un uso terapéutico como se divulga en el presente documento son las lipocalinas expuestas en las SEQ ID NO: 2-8 del documento WO 2008/015239.

Las muteínas de lipocalina adicionales que también pueden ser adecuadas para un uso terapéutico como se divulga en el presente documento incluyen las lipocalinas expuestas en las SEQ ID NO: 2-11 del documento WO 2011/154420.

Como se usa en el presente documento, una "muteína", una entidad "mutada" (ya sea una proteína o un ácido nucleico) o un "mutante" se refiere al intercambio (sustitución), la eliminación o la inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con el armazón de ácido nucleico o de proteína de origen natural (tipo silvestre) de "referencia". Se prefiere una sustitución de un aminoácido del ácido nucleico o la proteína de origen natural (de tipo silvestre). Los términos y expresiones "referencia", "secuencia de referencia" y "secuencia de tipo silvestre" se usan indistintamente en el presente documento.

La presente divulgación también contempla variantes optimizadas de las muteínas de lipocalina específicamente divulgadas en el presente documento. Una vez que se ha seleccionado una muteína de lipocalina con afinidad por una diana dada, es posible someter a la muteína a mutagénesis adicional para posteriormente seleccionar variantes con una afinidad aún mayor o variantes con propiedades mejoradas, tales como mayor termoestabilidad, estabilidad sérica mejorada, estabilidad térmica, solubilidad mejorada, comportamiento monomérico mejorado, resistencia mejorada frente a la desnaturalización térmica, desnaturalización térmica, proteólisis o detergentes, etc. Esta mutagénesis adicional, que en caso de tener como objetivo una mayor afinidad puede considerarse "maduración de la afinidad" in vitro, puede lograrse mediante mutación de sitio específico basándose en diseño racional o una mutación aleatoria. Otra posible estrategia para obtener una mayor afinidad o propiedades mejoradas es el uso de la PCR propensa a errores, que da como resultado mutaciones puntuales a lo largo de una serie seleccionada de posiciones de secuencia de la muteína de lipocalina. La PCR propensa a errores puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conocido, tal como el descrito por Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Otros métodos de mutagénesis aleatoria adecuados para dichos fines incluyen la mutagénesis inserción/eliminación aleatoria (RID) como se describe por Murakami, H et al. (2002) Nat.Biotechnol. 20, 76-81 o recombinación aleatoria de no homólogos (NRR) como se describe por Bittker, J. A et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024-1029. Si se desea, la maduración de la afinidad también puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 00/75308 o en Schlehuber, S. et al., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105­ 1120, donde se obtuvieron muteínas de la proteína de unión a bilina que tiene alta afinidad por digoxigenina.

Puede usarse una muteína de lipocalina para la formación de complejos con el receptor alfa de IL-4. La muteína también puede ser capaz de unirse a un fragmento inmunogénico del receptor alfa de IL-4. Un fragmento inmunogénico del receptor alfa de IL-4 es un fragmento que tiene uno o más epítopos, mimótopos u otros determinantes antigénicos y por tanto, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria o contra el que pueda generarse un anticuerpo. El fragmento inmunogénico puede incluir un solo epítopo o puede tener diversos epítopos. Dado que puede usarse un sistema presentador de antígenos, por ejemplo, una proteína portadora, para proporcionar el tamaño necesario para el reconocimiento por un sistema inmunitario, no se aplica una limitación de tamaño particular al fragmento inmunogénico. Por tanto, el fragmento inmunogénico también puede ser un "hapteno", es decir, un fragmento que no es necesariamente antigénico por sí mismo o puede tener baja inmunogenicidad, en particular debido a su pequeño peso molecular y por consiguiente, el tamaño. Normalmente, un fragmento inmunogénico puede estar unido, solo o cuando se presenta sobre un portador, a una inmunoglobulina o a un receptor de linfocitos T (TCR) si se presenta por moléculas del MHC. Normalmente, un fragmento inmunogénico solo o cuando se presenta en forma del sistema presentador de antígeno, es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular que da lugar, por ejemplo, a la activación de los linfocitos B y/o T.

Una diana de la muteína de lipocalina usada en la presente divulgación es la cadena alfa del receptor de interleucina-4 (oficialmente conocido como subunidad alfa del receptor de interleucina-4, n.° de Uniprot P24394, SEQ ID NO: 12), una proteína transmembrana, que contiene un dominio extracelular de 207 aminoácidos. Existe una forma secretada del dominio extracelular, sIL-4R alfa, que también se conoce como CD124 y es capaz de bloquear las actividades de la IL-4. Una muteína de lipocalina de la divulgación puede ser capaz de unirse al receptor alfa de sIL-4, así como a cualquier porción del dominio extracelular del receptor alfa de IL-4.

La presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN), que incluyen secuencias nucleotídicas que codifican muteínas de lipocalina como se describen en el presente documento. Debido a que la degeneración del código genético permite las sustituciones de ciertos codones por otros codones que especifican el mismo aminoácido, la divulgación no se limita a una molécula de ácido nucleico específica que codifica una muteína de lipocalina de la divulgación, pero abarca todas las moléculas de ácido nucleico que incluyen secuencias nucleotídicas que codifican una muteína funcional.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas también pueden formar parte de un vector o de cualquier otro tipo de vehículo de clonación, tal como un plásmido, un fagémido, un fago, un baculovirus, un cósmido o un cromosoma artificial. La molécula de ácido nucleico puede estar incluida en un plásmido.

En algunas muteínas de lipocalina lagrimal divulgadas, se elimina el enlace disulfuro de origen natural entre Cys 61 y Cys 153. Por consiguiente, pueden producirse dichas muteínas (o cualquier otra muteína de lipocalina lagrimal que no incluye un enlace disulfuro intramolecular) en un compartimento celular que tenga un medio redox reductor, por ejemplo, en el citoplasma de las bacterias gramnegativas. En caso de que una muteína de lipocalina de la divulgación incluya enlaces disulfuro intramoleculares, puede ser deseable dirigir el polipéptido naciente a un compartimento celular que tenga un medio redox oxidante usando una secuencia de señal adecuada. Dicho ambiente oxidante puede proporcionarse por el periplasma de las bacterias gramnegativas, tales como E. coli, en el medio extracelular de bacterias gramnegativas o en la luz del retículo endoplasmático de las células eucariotas y normalmente favorece la formación de enlaces disulfuro estructurales. Sin embargo, también es posible producir una muteína de lipocalina de la divulgación en el citosol de una célula hospedadora, tal como E. coli. En este caso, el polipéptido puede obtenerse o bien directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusión, seguido de su renaturalización in vitro. Una opción adicional es el uso de estirpes hospedadoras específicas que tienen un medio intracelular oxidante, que puede por tanto permitir la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M, et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8).

La divulgación también se refiere a una composición, que incluye al menos una muteína de lipocalina de la divulgación o un fragmento o variante de la misma o una proteína de fusión o un conjugado de la misma y una formulación farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, combinación de tampón/sal/excipiente), en donde dicha composición puede administrarse a un sujeto que lo necesite a un nivel de dosis seleccionado entre el grupo que consiste en: 0,06-600 mg, 0,06-100 mg, 0,3-10 mg, 1-3 mg.

Una composición de la presente divulgación puede administrarse por cualquier vía parenteral o no parenteral (entérica) que sea terapéuticamente eficaz para fármacos proteicos. Los métodos de aplicación parenteral incluyen, por ejemplo, inyección y técnicas de infusión intracutánea, subcutánea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravítrea o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones para inyección, soluciones para infusión o tinturas, así como una instilación e inhalación de aerosol, por ejemplo, en forma de mezclas de aerosol, pulverizaciones, nebulizaciones o polvos.

En algunas realizaciones, se prefiere la administración local de la composición al pulmón. Una vía de administración local al pulmón preferida es mediante inhalación de aerosol. Se proporciona una revisión acerca de la administración farmacológica pulmonar, es decir, o bien mediante inhalación de aerosoles (que también pueden usarse en la administración intranasal) o mediante instilación intratraqueal, por Patton, J.S., et al. (2004) Proc. Amer. Thoracic Soc., 1, 338-344, por ejemplo. Los modos de administración no parenterales son, por ejemplo, orales, por ejemplo en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o rectales, por ejemplo, en forma de supositorios. En algunas realizaciones, una muteína de lipocalina de la divulgación también puede administrarse por vía sistémica o tópica en formulaciones que contienen excipientes o portadores, aditivos y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales según se desee. Para la administración de una muteína de lipocalina de la divulgación por inhalación, la muteína puede estar presente en una formulación en polvo junto con una fase adicional. El polvo micronizado de la muteína de lipocalina puede mezclarse con un material portador, por ejemplo, lactosa, glucosa, maltosa, trehalosa, como se describe en la memoria descriptiva de patente WO96/02231 o el artículo de P. Lucas, K. Anderson, J. N. Staniforth, Protein deposition from dry powder inhalers, Pharmaceutical Research, Vol. 15, abril de 1988, páginas 562-569. Como alternativa, para inhalación, pueden usarse preparaciones farmacéuticas sólidas como las descritas en las solicitudes de patente de los Estados Unidos 2005/0014677 y 2009/0142407.

Se describen composiciones en polvos dispersables adecuadas para inhalación en la solicitud de patente de los Estados Unidos US2011/0284412A1.

Por tanto, una composición de la divulgación puede comprender una muteína de lipocalina de la divulgación, así como una de las formulaciones divulgadas.

La dosis de la composición aplicada puede variar dentro de límites amplios a fin de lograr el efecto preventivo o la respuesta terapéutica deseada. Por ejemplo, dependerá de la afinidad de la muteína de lipocalina en la misma por un ligando seleccionado, así como de la semivida del complejo entre la muteína de lipocalina y el ligando in vivo. Además, la dosis óptima dependerá de la biodistribución de la muteína de lipocalina o un fragmento o variante de la misma o su proteína de fusión o su conjugado, el modo de administración, la gravedad de la enfermedad/trastorno que se esté tratando, así como del estado médico del paciente.

En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica mediante nebulización, en donde la composición farmacéutica comprende al menos un antagonista de IL-4RA o un fragmento o variante del mismo o una proteína de fusión o un conjugado de la misma y una solución adecuada.

La formulación farmacéuticamente aceptable de la divulgación es una formulación para nebulización, por ejemplo, una solución que puede mantener la integridad funcional y estructural del antagonista o de un fragmento o variante del mismo o de una proteína de fusión o conjugado de la misma, durante y después de la nebulización (por ejemplo, se mantiene en estado monomérico y con plena actividad funcional) y/o en combinación con el nebulizador empleado, puede generar gotículas del intervalo de tamaño deseado. A este respecto, a modo ilustrativo, la presente divulgación enseña que: el antagonista, por ejemplo, una muteína de lipocalina de la divulgación, puede formularse en forma de una solución que comprende, por ejemplo, de 0,01 mg a 100 mg del antagonista o un fragmento o variante del mismo o una proteína de fusión o conjugado de la misma por cada 1 ml de una solución salina que tiene un pH ajustado a entre 5,5 y 8,0, un grado de osmolalidad entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/kg, una concentración iónica entre aproximadamente 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y/o una viscosidad inferior a 1,5 cp. Preferentemente, la solución formulada tiene una concentración del antagonista o un fragmento o variante del mismo o una proteína de fusión o conjugado de la misma a una concentración seleccionada entre el grupo que consiste en: de 0,05 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 10 mg/ml y de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml. En una realización adicional preferida, la solución salina divulgada tiene un pH ajustado seleccionado entre el grupo que consiste en: entre 5,5 y 8,0, entre 6,0 y 8,0, entre 6,0 y 7,5, entre 5,5 y 7,5, entre 6,0 y 7,0 y entre 6,5 y 7,5; y/o un valor de osmolalidad seleccionado entre el grupo que consiste en: entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/kg, entre aproximadamente 150 y 500 mOsm/kg, entre aproximadamente 200 y 550 mOsm/kg, entre aproximadamente 200 y 500 mOsm/kg, entre aproximadamente 200 y 450 mOsm/kg y entre aproximadamente 150 y 450 mOsm/kg. La osmoalidad es el valor de la concentración de soluto, definida como el número de osmoles (Osm) de soluto por litro (l) de solución, por ejemplo, osmol/l u Osm/l; y/o una concentración iónica de cloruro como anión permeante seleccionada entre el grupo que consiste en: entre 31 y 300 mM, entre 50 y 200 mM, entre 50 y 300 mM, entre 50 y 150 mM, 100 y 200 mM, entre 100 y 300 mM, entre 100 y 250 mM, entre 150 y 250 mM, entre 150 y 300 mM y entre 200 y 300 mM.

Además, preferentemente, la solución salina divulgada tiene una viscosidad seleccionada entre el grupo que consiste en entre 0 y 1,5 cp, entre 0 y 1,0 cp, 0 y 0,5 cp, entre 0,5 y 1,0 cp, entre 0,5 y 1,5 cp y entre 1,0 y 1,5 cp.

En algunas realizaciones adicionales, la solución acuosa del antagonista, por ejemplo, una muteína de lipocalina de la divulgación, puede nebulizarse con un nebulizador electrónico, un nebulizador de chorro, un nebulizador por ultrasonidos o un nebulizador de membrana perforada vibratoria o de malla vibratoria. En una realización preferida, la solución se nebuliza en un aerosol que tiene una masa media aerodinámica (MMAD) entre 1 pm y 10 pm, para un nebulizador electrónico, de chorro, por ultrasonidos o de membrana perforada vibratoria, 2 veces al día, y dicho nebulizador es capaz de aerosolizar la solución resultante en partículas de los tamaños requeridos (los aerosoles) en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones más preferidas, cualquiera de dichos aerosoles tiene una masa media aerodinámica (MMAD) seleccionada entre el grupo que consiste en entre 1 pm a 10 pm, entre 2 pm a 8 pm, entre 2 pm a 5 pm, entre 1,5 pm a 4 pm, entre 3 pm a 4,5 pm y entre 2,5 pm a 3,5 pm.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método de administración por inhalación, en 1-3 minutos, preferentemente 1-2 minutos, de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la divulgación, que comprende una formulación para nebulización divulgada, a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones adicionales, dicha administración por inhalación es local al pulmón.

Por lo tanto, la divulgación proporciona una solución eficaz, segura, no irritante, fisiológicamente aceptable y compatible adecuada para su uso en un método de la divulgación que comprende administrar una composición farmacéutica divulgada a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones diferentes, la divulgación proporciona el uso de la solución para administrar una composición farmacéutica de la divulgación a un sujeto que lo necesite en forma de un aerosol, por ejemplo, por inhalación.

Cuando se usa en el presente documento, "antagonista de IL-4RA" significa un polipéptido o proteína que se une a IL-4RA con una afinidad de unión detectable y/o que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores. Como se usa en el presente documento, "afinidad detectable" significa la capacidad para unirse a una diana seleccionada con una constante de afinidad generalmente de al menos aproximadamente 10'5 M. En general, las afinidades menores dejan de ser medibles con los métodos habituales, tales como ELISA y por tanto tienen una importancia secundaria. Por ejemplo, las afinidades de unión de las muteínas de acuerdo con la divulgación pueden ser, en algunas realizaciones, de una K^d menor que 800 nM, en algunas realizaciones puede ser de una K^d menor que 30 nM y en algunas realizaciones, de aproximadamente 50 picomolar (pM) o menos

En algunas divulgaciones, una muteína de lipocalina de la presente divulgación puede usarse para tratar cualquier enfermedad o trastorno en el que la expresión de IL-4 y/o la expresión de IL-13 contribuya o esté relacionada con la patogénesis o el agravamiento de la enfermedad. En algunas divulgaciones, una muteína de lipocalina de la presente divulgación puede usarse para tratar cualquier enfermedad o trastorno que se mejore, alivie o inhiba mediante la eliminación, inhibición o reducción de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. A modo de ejemplo ilustrativo, la muteína o la composición farmacéutica que contiene la misma puede utilizarse en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con un aumento en la respuesta inmunitaria de Th2. Dicha enfermedad o trastorno también puede, por ejemplo, asociarse con una reacción alérgica o una inflamación alérgica. En algunas divulgaciones adicionales, dicha enfermedad o trastorno puede ser asma alérgica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis (véase Hage et al. (1999) Cell, 97, 271-281, o Mueller et al. (2002) Biochemica et Biophysica Acta, 237-250).

El término "fragmento", como se usa en la presente divulgación en relación con las muteínas de lipocalina lagrimal de la divulgación, se refiere a proteínas o péptidos derivados de la lipocalina lagrimal humana madura de longitud completa que están acortados en su extremo aminoterminal y/o carboxiloterminal, es decir, carecen de al menos uno de los aminoácidos aminoterminales y/o carboxiloterminales. Dichos fragmentos comprenden preferentemente al menos 10, más preferentemente 20, lo más preferentemente 30 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de la lipocalina lagrimal humana madura y normalmente son detectables en un inmunoensayo de lipocalina lagrimal humana madura.

El término "variante", como se usa en la presente divulgación, se refiere a derivados de una proteína o péptido (por ejemplo, una muteína de lipocalina lagrimal de la divulgación), que comprende modificaciones de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, mediante sustitución, eliminación, inserción o modificación química. Preferentemente, dichas modificaciones no reducen la funcionalidad de la proteína o el péptido. Dichas variantes incluyen proteínas, en donde se han reemplazado uno o más aminoácidos por sus respectivos D-estereoisómeros o por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural, tales como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Sin embargo, dichas sustituciones también pueden ser conservativas, es decir, se reemplaza un resto de aminoácido por un resto de aminoácido químicamente similar. Los ejemplos de sustituciones conservativas son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina y treonina; 2) ácido aspártico y ácido glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptófano.

El término "posición", cuando se usa de acuerdo con la divulgación, significa la posición de o bien un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento o la posición de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico representada en el presente documento. El término "correspondiente", como se usa en el presente documento, también incluye que una posición no solo esté determinada por el número de los nucleótidos/aminoácidos precedentes. Por consiguiente, la posición de un aminoácido dado de acuerdo con la divulgación que puede sustituirse puede variar debido a la eliminación o la adición de aminoácidos en otras partes en una lipocalina (mutante o de tipo silvestre). De manera similar, la posición de un nucleótido dado de acuerdo con la presente divulgación que puede sustituirse puede variar debido a eliminaciones o nucleótidos adicionales en otras partes en una región 5' no traducida (UTR) de una muteína o una lipocalina de tipo silvestre que incluye el promotor y/o cualquier otra secuencia o gen regulador (incluidos los exones e intrones). Por tanto, en una "posición correspondiente" de acuerdo con la divulgación, ha de entenderse preferentemente que los nucleótidos/aminoácidos pueden diferir en el número indicado, pero pueden seguir teniendo nucleótidos/aminoácidos vecinos similares. Dichos nucleótidos/aminoácidos que pueden intercambiarse, eliminarse o añadirse también están comprendidos por la expresión "posición correspondiente". Específicamente, a fin de determinar si un resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de una lipocalina (muteína) diferente de una lipocalina de tipo silvestre corresponde a una posición determinada en la secuencia de aminoácidos de una lipocalina de tipo silvestre, un experto en la materia puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos o bien manuales o mediante el uso de programas informáticos, tales como BLAST2.0, forma siglada de Basic Local Alignment Search Tool (herramienta de búsqueda de alineamiento local básico) o ClustalW o cualquier otro programa adecuado que es adecuado para generar alineamientos de secuencia. Por consiguiente, una lipocalina puede servir como "secuencia objeto" o "secuencia de referencia", mientras que la secuencia de aminoácidos de una lipocalina diferente de la lipocalina de tipo silvestre descrita en el presente documento sirve como "secuencia de consulta". Las expresiones "secuencia de referencia" y "secuencia de tipo silvestre" se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "uno" y "el" o "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una muteína de lipocalina" incluye una o más muteínas de lipocalina.

A menos que se indique de otro modo, debe entenderse que la expresión "al menos", antes de una serie de elementos, hace referencia a cada uno de los elementos en la serie. Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de determinar empleando tan solo experimentación rutinaria, muchos equivalentes para las realizaciones específicas de la divulgación descritas en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por la presente divulgación.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que la siguen, se entenderá que a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende" y las variaciones tales como "comprenden" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero, etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o un grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que tiene".

Cuando se usa en el presente documento, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usa en el presente documento, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

Como se usa en el presente documento, se entiende que la conjunción "y/o" entre múltiples elementos citados abarca opciones tanto individuales como combinadas. Por ejemplo, cuando se unen dos elementos mediante "y/o", una primera opción se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción se refiere a la aplicabilidad de los elementos primero y segundo juntos. Se entiende que una cualquiera de estas opciones se encuentra dentro de su significado y por tanto, cumple el requisito del término "y/o" como se usa en el presente documento. También ha de entenderse que la aplicabilidad concurrente de más de una de las opciones se encuentra dentro de su significado y por tanto, cumple el requisito del término "y/o" como se usa en el presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Inhibición de la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 e IL-13 en células TF-1 mediante un antagonista del receptor alfa de IL-4.

Se incubaron células TF-1 a 37 °C durante 30 min con un antagonista del receptor alfa de IL-4, una muteína de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 (SEQ ID NO: 6), antes de añadir IL-13 10 nM (figura 1a) o IL-40,1 nM (figura 1b). Las células se fijaron después de la incubación durante 15 min a 37 °C con PFA al 1,6 % y se permeabilizaron con metanol al 100 % antes de la tinción intracelular de STAT6 con PE de ratón anti-STAT6 (pY641) - BD 612701. El anticuerpo específico para IL-4RA MAB230 (R&D Systems) y la IL-4 doble mutante de IL-4 (R121D, Y124D) como se describe por Andrews et al. JI 2006 176:7456-7461 se usó como control positivo. Además, como controles negativos, se usaron la lipocalina lagrimal humana (SEQ ID NO: 1) y un anticuerpo IgG2a de ratón (mlgG2a, Ancell 281-010; n.° de lote 171605). Los resultados del ensayo de fosforilación de Stat6 en TF-1 se representan en la figura 1 y demuestran que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) es un potente antagonista de la of IL-4 así como de la IL-13 ya que está relacionada con la señalización posterior a IL-4RA. El anticuerpo específico para IL-4RA, MAB230 (R&D Systems) funciona igualmente bien. Sorprendentemente, el mutante de IL-4 es significativamente menos eficaz a la hora de inhibir la fosforilación de Stat6 inducida tanto por IL-4 como por IL-13 en células TF-1, aunque se ha descrito con anterioridad un antagonismo funcional. La constante de velocidad de disociación rápida (koff) del mutante de IL-4 (R121D, Y124D) en comparación con la muteína de lipocalina (tabla 1) puede ser la causa de esta diferencia funcional.

Tabla 1

Ejemplo 2: Construcción de ratones con doble inserción génica

Se generaron ratones con inserción génica de la cadena alfa del receptor de IL-4 humano y la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 reemplazando el gen de la cadena alfa del receptor de IL-4 y el gen de la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 por sus respectivos ortólogos humanos. Por consiguiente, los ratones generados se denominan ratones con doble inserción génica de receptor alfa de IL-4/cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano que portan los genes humanos del receptor alfa de IL-4 y la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 en lugar de los de ratón en los locus génicos de los ortólogos de ratón.

Los ratones se generaron como se indica a continuación: se eliminó el gen de IL-13RA1 de ratón de 70 kb en el cromosoma X, generando un alelo nulo en las células madre embrionarias de ratón. Se introdujo un segmento de ADN que porta el gen de IL-13RA1 en el locus eliminado. El gen humano consiste en un fragmento de 95,7 kb del cromosoma X humano que contiene no solo el gen IL13RA completo, sino también ~11 kb del ADN intergénico 5' y ~7 kb del ADN en 3' de la 3'UTR. Esto conlleva implícitamente el conocimiento de que este fragmento de ADN dirigirá la expresión del receptor humano. Se generaron ratones portadores de esta alteración a partir de las células ES modificadas. En un experimento separado, se intercambió el segmento de 39 kb de ADN que porta el gen de IL-4RA de ratón por el segmento correspondiente de 63 kb de ADN que codifica IL-4R humano, que está compuesto por IL-4R alfa y la cadena gamma común y nuevamente, usando una línea de ratón generada a partir de las células modificadas. Se entrecruzaron las dos líneas de ratón con inserción génica para establecer una línea de ratón homocigota para el locus humanizado tanto en el locus de IL-4R como en el locus de IL-13RA. Los ratones expresan las proteínas humanas en ausencia de las proteínas de ratón. Se verificó la expresión adecuada de los receptores humanos de tipo I y de tipo II demostrando la respuesta de las células inmunitarias a IL-4 humana y la respuesta de las células epiteliales de las vías respiratorias a la IL-13.

Ejemplo 3: Análisis ex vivo de los esplenocitos de ratón con doble inserción génica para verificar la función de un antagonista del receptor alfa de IL-4 en el receptor de IL-4 de tipo I

Se aislaron esplenocitos de ratones con doble inserción génica de receptor alfa de IL-4 humano/cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano mediante métodos comúnmente conocidos en la técnica. Estos esplenocitos se estimularon con concentraciones crecientes de IL-4 humana en ausencia o presencia de un antagonista del receptor alfa de IL-4, una muteína de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humano (SEQ ID NO: 6). La IL-4 efectúa la fosforilación de STAT6 por medio del complejo del receptor de IL-4. Por tanto, la fosforilación de STAT6 es una lectura de la unión de IL-4 a su receptor. La lipocalina lagrimal humana (SEQ ID NO: 1) sirve como control negativo.

En la figura 2 se muestra que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) reduce y de este modo neutraliza la acción de IL-4 en el receptor de IL-4 de tipo I expresado sobre esplenocitos, ya que la fosforilación de STAT 6 en esplenocitos estimulados con IL-4 era igual al nivel en esplenocitos no estimulados.

Ejemplo 4: Administración de un antagonista del receptor alfa de IL-4 a ratones transgénicos con doble inserción génica y análisis de las concentraciones de eotaxina

El modelo de inflamación de las vías respiratorias inducida por IL-13 proporcionado por Blanchard et al. (Clin Exp Allergy 2005, 35(8):1096-1103 se usó para investigar el efecto de un antagonista del receptor alfa de IL-4, una muteína de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humano. En el modelo, se administra 1 pg de IL-13 tres veces cada 48 horas mediante instilación intratraqueal.

Por consiguiente, como se muestra en la figura 3, se administró vehículo (solución salina tamponada con fosfato, en lo sucesivo denominada "PBS") o IL-13 (hIL-13) a ratones transgénicos con doble inserción génica, como grupo 1 (PBS) y grupo 2 (hIL-13), respectivamente, mientras que el grupo 3 (SEQ ID NO: 6/hIL-13) y el grupo 4 (TLPC/hIL-13) recibieron la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) a una dosis de 57 pg o la lipocalina lagrimal humana (SEQ ID NO: 1) como control negativo a una dosis de 57 pg, respectivamente, además de haber recibido hIL-13.

Los grupos 2 y 3 contenían 3 ratones, mientras que los grupos 1 y 4 contenían 2 ratones. La administración intratraqueal se efectuó a 30 pl. La IL-13, la muteína de lipocalina (s Eq ID NO: 6) y el control negativo se administraron por vía intratraqueal y se obtuvo homogeneizado de tejido con el objetivo de medir las concentraciones de eotaxina. Obsérvese que la muteína de lipocalina y el control negativo se administraron 30 minutos antes de la administración de IL-13.

Cuando se administra IL-13 en este modelo, las concentraciones de eotaxina aumenta, por ejemplo, 24 horas después de la última dosis de IL-13 en el grupo 4 en comparación con el grupo 1. La eotaxina es un potente quimioatrayente de eosinófilos y por tanto, un marcador de inflamación, en particular de la inflamación alérgica. En la figura 3 se muestra que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el grupo 4 neutraliza eficazmente la acción de la IL-13 en la inducción de eotaxina, en comparación con el control negativo en el grupo 3 (véase también el grupo 1 de PBS y el grupo 2 de solo IL-13).

Ejemplo 5: Administración de un antagonista del receptor alfa de IL-4 a ratones transgénicos con doble inserción génica y análisis de la expresión de ARNm de Ccl11 (eotaxina).

La administración de un antagonista del receptor alfa de IL-4, una muteína de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 (SEQ ID NO: 6), a ratones con doble inserción génica del receptor de IL-4 alfa humana/la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano se efectuó como se describe en el ejemplo 4 con la excepción de que se administraron 30 pl de IL-13 (Peprotech, 1 pg) solo una vez mediante instilación intratraqueal. Cada uno de los grupos contenía 3 ratones con doble inserción génica de receptor alfa de IL-4 humano/cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano. Se aisló ARN total de homogeneizados de pulmón 24 horas después de la dosis de IL-13 y se analizó la expresión de eotaxina de ratón mediante RT-PCR. La expresión de ARNm en tejido pulmonar después de 24 h se normaliza con el ARN de 18S y el valor en ratones para 1 pg de hIL-13 se establece como 1. La muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) también se aplicó mediante instilación intratraqueal con un volumen de 30 pl o bien a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. La IL-4 mutante (R121D, Y124D) también se aplicó por instilación intratraqueal con un volumen de 30 pl a diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. Se usó el modelo abreviado de inflamación de las vías respiratorias inducida por IL-13 (una sola administración intratraqueal de IL-13) para evaluar la duración de la respuesta farmacológica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable. En la figura 4a puede observarse que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) inhibió eficazmente el transcrito Ccl11 (eotaxina) inducido por IL-13 humana durante un periodo de tiempo prolongado (figura 4a), mientras que también se demostró la dependencia de la dosis de la respuesta farmacológica, como se muestra en la figura 4b. Además, como puede observarse en la figura 4c, se demostró una potencia favorable de la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) cuando se comparó lado a lado con el mutante de IL-4 (figura 4c).

Ejemplo 6: Identificación de formulaciones adecuadas para nebulizar un antagonista del receptor alfa de IL-4 usando el nebulizador de malla vibratoria Pari eFlow.

Se nebulizó un antagonista del receptor alfa de IL-4, una muteína de lipocalina específica para IL-4RA (SEQ ID NO: 6), con un dispositivo Pari eFlow a una concentración de 0,1 mg/ml en PBS que contenía 0,01 o 0,05 de polisorbato 20. Se rellenó el depósito del nebulizador con 6 ml de la formulación y se accionó durante aproximadamente 15 minutos hasta que se nebulizó la mitad del depósito. Como se muestra en la figura 5, se recogió la muestra nebulizada con un vial de vidrio montado en la boquilla del nebulizador y se analizó mediante inspección visual para controlar las partículas visibles, mediante oscurecimiento de la luz para controlar las partículas subvisibles, mediante cromatografía de exclusión por tamaños de alta presión (HP-SEC) para controlar los agregados solubles, mediante SEC en fase inversa para controlar las modificaciones químicas, mediante un ELISA de unión a IL-4RA para controlar la actividad funcional y mediante difracción láser para medir el tamaño de las gotículas. La nebulización de la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en la formulación elegida no dio lugar a la generación de agregados visibles, partículas subvisibles. Tanto la proteína nebulizada como la proteína restante en el depósito se mantuvieron en estado monomérico y completamente activas desde el punto de vista funcional. Se generaron gotículas con un tamaño medio de 5,5 pm de acuerdo con las especificaciones del dispositivo. La concentración de polisorbato 20 en la formulación no pareció tener influencia en la capacidad para nebulizar la muteína, ya que ninguno de los parámetros medidos eran idénticos en las formulaciones que contenían 0,01 o 0,05 de polisorbato 20.

Ejemplo 7: Propiedades farmacocinéticas y biodistribución de un antagonista del receptor alfa de IL-4 en ratones con doble inserción génica de IL-4RA humano/IL-13 humana después de la instilación intratraqueal.

Se administró un antagonista del receptor alfa IL-4, la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) mediante administración intratraqueal de 30 pl (98 pg) a ratones con doble inserción génica de receptor alfa de IL-4 humano/cadena alfa 1 del receptor de IL-13 humano. Se efectuó la administración en veinte animales y se sacrificaron grupos de 4 después de 1, 4, 8, 16 y 24 horas. En el momento del sacrificio, se efectuó un lavado de los pulmones con 2 x 1 ml de fluido FACSflow, se extrajeron muestras de plasma en Li-heparina y se congelaron inmediatamente los pulmones en nitrógeno líquido. El tejido pulmonar se homogeneizó en 1,5 ml de tampón de lisis (un comprimido de comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa mini completo (Roche)/10 ml de T-PER (Perbio)) usando un homogeneizador de tejidos IKA T10 Basic Ultra-Turrax (S10N-5G) a 4°C durante 55 segundos. El homogeneizado se incubó sobre hielo durante 30-60 minutos y se aclaró mediante centrifugación a 10.000 g a 4°C durante 10 minutos. La concentración total de proteína se determinó con un kit BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las muestras se diluyeron con PBS hasta una concentración final estándar de proteína de 1 mg/ml antes de la conservación de las alícuotas a -80 °C. Se usó un ELISA cuantitativo basado en Meso Scale Discovery ("MSD") para medir las concentraciones activas de unión de la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el fluido de lavado, el tejido pulmonar y el plasma en los diferentes puntos de tiempo. En resumen, se recubrieron placas MSD con neutravidina, 5 pg/ml en PBS durante una noche a 4 °C, se lavaron con PBS/Tween 20 al 0,05 % y se bloquearon con BSA al 3 %. Se añadió IL-4RA humano biotinilado a una concentración de 2,5 pg/ml en PBS/Tween 20 al 0,1 % para capturar la muteína de lipocalina de las diferentes matrices y la muteína unida se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo específico para la lipocalina lagrimal (preparación: TLPC-Mix4666 Ab, Pieris, PL n.° 684) y un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a marcador Sulfo (Meso Scale Discovery, 0,5 pg/ml) en PBS/Tween 20 al 0,5 %/BSA al 0,5 %. El ensayo mostró en las tres matrices un intervalo lineal de 75 pg/ml a 6 ng/ml, mientras que las muestras de CC tuvieron una recuperación de entre un 80-120 %. Para los cálculos de las concentraciones y las cantidades totales, se asumió un volumen total de plasma de 900 pl por ratón. El factor de dilución usado para estandarizar el homogeneizado de pulmón a 1 mg/ml de concentración total de proteína medida mediante el kit BCA se determinó teniendo en cuenta cuándo se calculó la cantidad total de muteína de lipocalina por pulmón basándose en la concentración medida en el homogeneizado total de pulmón estandarizado y su volumen de 1,5 ml de tampón de lisis y el peso medido de los pulmones. La cantidad total de la muteína de lipocalina en el fluido de lavado broncoalveolar (en lo sucesivo "BALF") se basó en la cantidad recuperada en 2 ml de fluido de lavado.

En la figura 6a puede observarse que un 43 % de la dosis administrada podría recuperarse en el BALF, un 6 % en el tejido pulmonar y un 0,2 % en el plasma 1 hora después de la administración intratraqueal. Se determinó una semivida terminal de 3,7, 3,9 y 2,7 horas en el BALF, el tejido pulmonar y el plasma, respectivamente. Además, en la figura 6b puede observarse que las concentraciones en tejido pulmonar calculadas en los ratones con doble inserción génica de IL-4RA humano/IL-13 humana se mantenían por encima de 0,7 pg/ml después de la instilación intratraqueal de 98 pg de la muteína de lipocalina durante aproximadamente 20 horas, lo que concuerda con las observaciones mostradas en la figura 4a. La concentración de 0,7 pg/ml corresponde al mayor valor de CI⁹⁰ de la muteína de lipocalina observado en diferentes ensayos de potencia in vitro. Además, la figura 6b también muestra que las concentraciones plasmáticas y por tanto la exposición sistémica eran 100 veces menores en comparación con las concentraciones observadas en el tejido pulmonar.

Ejemplo 8: Inhibición de la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-líquido de epitelio de las vías respiratorias humanas mediante un antagonista del receptor alfa de IL-4

La metaplasia de células caliciformes es una característica común de varias enfermedades respiratorias, incluida el asma. Por tanto, se evaluó la capacidad de un antagonista del receptor alfa de IL-4, la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) para prevenir la metaplasia de células caliciformes en un modelo in vitro basado en MucilAir™ (Epithelix). MucilAir™, un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido con epitelio de las vías respiratorias humano reconstituido in vitro usando células primarias humanas, se trató cada dos días con IL-13 humana a de 0,3 a 30 ng/ml. Mediante tinción con azul alcián in situ, así como análisis histológico, se demostró que MucilAir™ mostraba una densidad aumentada de células caliciformes después de 14 días de tratamiento, de una manera dependiente de la dosis. Por tanto, se analizó el efecto inhibidor de la muteína de lipocalina en la metaplasia de células caliciformes comparando la exposición continua de MucilAir™ a 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 días como control positivo y a IL-13 diferentes concentraciones (como se muestra en la figura 7a) de la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6), el mutante de IL-4 (R121D, Y124D) y un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (se muestran las regiones variables de cadena ligera y pesada en las SEQ ID NO: 14 y 15), respectivamente, y después se comparó con MucilAir™ cultivado durante 14 días sin IL-13 como control negativo. La tinción de azul alcián, que tiñe de color azul a verde azulado los mucopolisacáridos ácidos y los glucosaminoglicanos, se añadió a la superficie apical para una tinción in situ y se tomaron imágenes de las células teñidas bajo un microscopio de contraste de fase para el análisis de las imágenes. Se cuantificó el porcentaje de células positivas para azul alcián mediante el programa de procesamiento de imágenes en Java de dominio público ImageJ y se expresó como relación de área del área de azul alcián al área total de la imagen. El análisis histológico se ha llevado a cabo por medio de una plataforma en la Universidad de Ginebra de acuerdo con el protocolo estándar. Además, se midió la eotaxina-3, una quimiocina inducida por IL-13, en el medio basal en el día 14 usando un kit para eotaxina-3 ultrasensible comercial de Meso Scale Discovery de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En la figura 7a y la figura 7b, se puede observar que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 6) era capaz de bloquear la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo MucilAir, de una manera completamente dependiente de la dosis. Se redujo el nivel de relación de área de azul alcián con respecto al fondo (la relación del control negativo que no tenía IL-13) mediante la muteína de lipocalina, así como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA, pero no por el mutante de IL-4 (R121D, Y124D), mientras que la lipocalina lagrimal humana (SEQ ID NO: 1) mostró una tinción similar a la del control positivo (que solo tenía IL-13). Se obtuvieron resultados similares para eotaxina-3 (secretada en el medio de cultivo basal) como se observa en la figura 7d. Las secciones en parafina teñidas con azul alcián/rojo neutro ilustrativas de cultivos de 14 días con y sin IL-13 como se muestran en la figura 7c mostraron el impacto de IL-13 en el epitelio de las vías respiratorias humanas en el sistema de cultivo de interfaz aire-líquido.

La invención tiene aplicaciones industriales en relación con el tratamiento de enfermedades y/o afecciones en las que la vía de IL-4/IL-13 contribuye a la patogénesis de la enfermedad, por ejemplo, enfermedades y/o afecciones asociadas con un aumento de la respuesta inmunitaria de Th2. La invención descrita de manera ilustrativa en el presente documento puede ponerse en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no divulgados específicamente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, las expresiones "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. deben interpretarse de manera expansiva y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en el presente documento se han usado como términos descriptivos y no como limitación y no se pretende que el uso de dichos términos y expresiones excluya cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del ámbito de la invención reivindicada. Por tanto, debe entenderse que aunque la presente invención se ha divulgado específicamente por medio de realizaciones preferidas y características opcionales, los expertos en la materia pueden efectuar modificaciones y variaciones de las invenciones realizadas en el mismo divulgadas en el presente documento y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la presente invención. La invención se ha descrito en el presente documento de manera amplia y genérica. Además, cuando una definición o uso de un término en una referencia sea incoherente o contrario a la definición de dicho término proporcionada en el presente documento, prevalece la definición de dicho término proporcionada en el presente documento y no prevalece la definición de dicho término en la referencia. También forman parte de la invención cada una de las especies más limitantes y agrupamientos subgenéticos que se encuentran dentro de la divulgación genérica. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una salvedad o limitación negativa que elimine cualquier materia del género, independientemente de que el material eliminado se recite específicamente en el presente documento. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Las realizaciones de la invención resultarán evidentes a partir de las siguientes reivindicaciones.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina lagrimal humana o un fragmento de la misma, que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto mediante nebulización dicha composición farmacéutica, a una concentración en el intervalo de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml en una solución, en donde dicha solución comprende:

(a) un nivel de pH entre 5,5 y 8,0,

(b) un valor de osmolalidad entre 150 y 550 mOsm/kg, y

(c) una concentración iónica entre 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y en donde dicha solución se nebuliza en un aerosol que tiene una masa media aerodinámica (MMAD) en el intervalo de 1 pm a 10 pm, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma tiene los mismos aminoácidos que los expuestos en la SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoácidos correspondientes a la posición 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1) y en donde el fragmento de la muteína de lipocalina carece de al menos uno de los aminoácidos aminoterminales y/o carboxiloterminales en comparación con dicha muteína de lipocalina.

2. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de mostrar una actividad terapéutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir, in vivo, el transcrito Ccl 11 (eotaxina) inducido por IL-13 humana.

3. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de interrumpir la señalización posterior y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13.

4. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es más potente que un mutante de IL-4 (R121D, Y124D) a la hora de inhibir el transcrito Ccl11 (eotaxina) inducido por IL-13 humana in vivo.

5. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma es capaz de mostrar una actividad funcional igual de buena que el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

6. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha muteína de lipocalina o el fragmento de la misma es capaz de inhibir la metaplasia de células caliciformes inducida por IL-13 con la misma eficacia que el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

7. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma carece esencialmente de reactividad cruzada con la cadena alfa del receptor de IL-23, el receptor de citocinas de tipo I con dominio de fibronectina de tipo III, el receptor de IL-6 o el receptor de IL-18.

8. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma se une a la cadena alfa del receptor de IL-4.

9. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha solución tiene además un valor de viscosidad menor de 1,5 cp.

10. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composición tiene un grado de concentración de dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma seleccionado entre el grupo que consiste en: de 0,05 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, de 0,05 mg/ml a 10 mg/ml y de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml.

11. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha solución tiene un pH seleccionado entre el grupo que consiste en: entre 5,5 y 8,0, entre 6,0 y 8,0, entre 6,0 y 7,5, entre 5,5 y 7,5, entre 6,0 y 7,0 y entre 6,5 y 7,5.

12. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha solución tiene un valor de osmolalidad seleccionado entre el grupo que consiste en: entre 150 y 550 mOsm/kg, entre 150 y 500 mOsm/kg, entre 200 y 550 mOsm/kg, entre 200 y 500 mOsm/kg, entre 200 y 450 mOsm/kg y entre 150 y 450 mOsm/kg.

13. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha solución tiene una concentración iónica de cloruro como anión perneante entre el grupo que consiste en: entre 31 y 300 mM, entre 50 y 200 mM, entre 50 y 300 mM, entre 50 y 150 mM, entre 100 y 200 mM, entre 100 y 300 mM, entre 100 y 250 mM, entre 150 y 250 mM, entre 150 y 300 mM y entre 200 y 300 mM.

14. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha solución tiene una viscosidad seleccionada entre el grupo que consiste en: entre 0 y 1,5 cp, entre 0 y 1,0 cp, 0 y 0,5 cp, entre 0,5 y 1,0 cp, entre 0,5 y 1,5 cp y entre 1,0 y 1,5 cp.

15. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el aerosol tiene una masa media aerodinámica (MMAD) seleccionada entre el grupo que consiste en: entre 1 pm a 10 pm, entre 2 pm a 8 pm, entre 2 pm a 5 pm, entre 1,5 pm a 4 pm, entre 3 pm a 4,5 pm y entre 2,5 pm a 3,5 pm.

16. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se usa un nebulizador electrónico, un nebulizador de chorro, un nebulizador por ultrasonidos o un nebulizador de membrana perforada vibratoria o de malla vibratoria.

17. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto que necesita la composición padece inflamación alérgica, asma alérgica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, proteinosis alveolar pulmonar o edema pulmonar fulminante.

18. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma mantiene su integridad funcional y estructural durante y después de la nebulización.

19. Una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha muteína de lipocalina o un fragmento de la misma se mantiene en su forma monomérica durante y después de la nebulización.

20. Una solución para su uso en un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde la solución es una solución salina que comprende;

(a) un nivel de pH entre 5,5 y 8,0 y

(b) un valor de osmolalidad entre 150 y 550 mOsm/kg y

(c) una concentración iónica entre 31 y 300 mM de cloruro como anión permeante y

(d) una viscosidad menor de 1,5 cp,

y en donde la solución comprende la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde la composición farmacéutica comprende la muteína de lipocalina lagrimal humana o un fragmento de la misma, a una concentración en el intervalo de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml.

21. La solución para el uso de acuerdo con la reivindicación 20 para su uso en un método de administración por inhalación en 1-3 minutos.

22. La solución para el uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la administración por inhalación es local al pulmón.

23. La solución para el uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la solución es para administrar la composición farmacéutica al paciente que lo necesite en forma de un aerosol, por ejemplo, por inhalación.