CN110402252A - 对lag-3具有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白 - Google Patents

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Abstract

本披露提供特异性结合LAG‑3的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白，所述人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可用于制药应用中，例如作为用于治疗或预防如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的人疾病的抗癌剂和/或免疫调节剂。本披露进一步显示所述人脂质运载蛋白突变蛋白可抑制LAG‑3与过表达II类MHC的细胞上的II类MHC的结合。本披露还涉及制备本文所述的结合LAG‑3的脂质运载蛋白突变蛋白的方法，以及包含此类脂质运载蛋白突变蛋白的组合物。本披露进一步涉及编码此类脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，以及用于产生此类脂质运载蛋白突变蛋白和核酸分子的方法。此外，本申请披露了这些脂质运载蛋白突变蛋白以及包含一种或多种此类脂质运载蛋白突变蛋白的组合物的治疗性用途和/或诊断性用途。

Description

对LAG-3具有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白
I.背景技术
淋巴细胞活化基因-3或LAG-3(也称为分化簇223或CD223)是免疫球蛋白超基因家族的膜蛋白。LAG-3在结构上和基因上与CD4相关，其编码基因位于12号染色体短臂的远侧部分(临近CD4基因)，这表明LAG-3基因可能通过基因重复进化(Triebel等人，J Exp Med[实验医学杂志],1990)。LAG-3在静息的外周血淋巴细胞上不表达而在活化的T细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达(Triebel等人，J Exp Med[实验医学杂志],1990)，且已报道还在活化的B细胞(Kisielow等人，Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志],2005)和浆细胞样树突状细胞(Workman等人，J Immunol[免疫学杂志],2009)上表达。
与CD4类似，LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，但以较高的亲和力且在不同结合位点处结合(Huard等人，Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院院刊],1997)。通过LAG-3在树突状细胞上的II类MHC接合导致了树突状细胞的细胞因子和趋化因子谱(profile)的变化(Buisson和Triebel,Vaccine[疫苗],2003)。此外，已报道LAG-3引发树突状细胞成熟，这由这些细胞产生IL-12和TNF-α以及树突状细胞刺激异基因(allogeneic)T-细胞增殖和IFN-γ响应的能力的增加来证明(Andreae等人，J Immunol[免疫学杂志],2002)。已报道LAG-3信号传导和II类MHC交联抑制人CD4+和CD8+T细胞的初级活化的早期事件(Macon-Lemaitre和Triebel,Immunology[免疫学],2005)。其负调节T细胞的细胞增殖、活化和内环境稳态。
与CTLA-4和PD-1类似，LAG-3为抑制性免疫受体。在基于敲除小鼠和靶特异性抗体的研究中，特别是与PD-1结合，LAG-3作为T细胞响应的负调节剂的突出作用已得到了令人印象深刻的证明(Woo等人，Cancer Res[癌症研究],2012)。在此研究中，双重抗-LAG-3/抗-PD-1抗体疗法治愈了大多数已建立肿瘤的小鼠，这些小鼠对单一抗体疗法有很大抗性。此外，LAG-3/PD-1双敲除小鼠显示了显著增加的存活和多种可移植肿瘤的清除。由于双敲除小鼠极易发生致死性自身炎症(autoinflammation)，所以为PD-1和LAG-3作为免疫检查点的强大组合作用提供了进一步强有力的实验支持。
因此，本领域存在对调节LAG-3+淋巴细胞(比如T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞)的响应的化合物的尚未满足的需求，所述化合物在治疗或预防癌症、器官移植排异、或治疗自身免疫性或自身炎性疾病中可具有重要用途。进一步期望获得能够以高亲和力结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白具有增强的生物稳定性，并且可以用于药学和/或诊断应用。在这方面，本披露的目的是提供此类脂质运载蛋白突变蛋白。先前没有描述过具有这些高结合亲和力和增强的生物稳定性特征的脂质运载蛋白突变蛋。
此外，人们认为猴的代谢与人的代谢最为相似，因此，食蟹猴在新疗法(包括新的生物制剂)开发中已被广泛用于药物动力学或药物安全性研究中。此类研究还是获得监管部门批准的必要条件。因此，还需要与人和食蟹猴LAG-3均具有交叉反应(具有相当的结合模式，包括相当或相似的结合亲和力)的脂质运载蛋白突变蛋白。先前没有描述过具有这些交叉反应特征的脂质运载蛋白突变蛋白。
在此申请中引用的任何参考文献并不是承认该参考是本申请的现有技术。
在这方面，本披露提供了一组新颖的化合物，这些化合物特异性结合人和食蟹猴两者的LAG-3(具有高亲和力和增强的生物稳定性特征)，从而调节免疫应答。此类化合物是源自脂质运载蛋白的突变蛋白，并且可以用于药物、诊断、或其他应用。脂质运载蛋白的突变蛋白是一类快速扩张的治疗剂，并且可构建为对所需靶展示高亲和力和特异性(参见例如，国际专利公开号WO 99/16873、WO 00/75398、WO 03/029471、和WO 05/19256)。
II.定义
以下所列定义了贯穿本说明书使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。
如本文所用，除非另有说明，否则“LAG-3”意指人LAG-3(huLAG-3)并包括人LAG-3的变体、同种型和物种同源物。LAG-3也称为“淋巴细胞活化基因3”、“分化簇223”或“CD223”，其可互换使用。人LAG-3意指由UniProt P18627(2009年7月7日的版本5)定义的全长蛋白、其片段或其变体。食蟹猴(cynomolgus)LAG-3(cyLAG-3)是指食蟹猴的LAG-3。CyLAG-3也可用于指如SEQ ID NO:56的位置1-428所示的cyLAG-3细胞外结构域。
如本文所用，“可检测的亲和力”意指以通常通过至多约10-5M或以下(更低的Kd或EC50值反映更好的结合活性)的Kd或EC50量度的亲和力结合所选择的靶的能力。更低的亲和力通常不再能通过常规方法(如ELISA(酶联免疫吸附测定))测量，因此是次要的。
如本文所用，可以通过本领域技术人员已知的多种方法测量本披露的蛋白(如，脂质运载蛋白的突变蛋白)或其融合多肽与所选择的靶(在本发明的情况下，LAG-3)的“结合亲和力”(并由此可以确定突变蛋白-配体复合物的Kd值)。此类方法包括但不限于，荧光滴定、竞争ELISA、量热法(如等温滴定量热法(ITC))、和表面等离子体共振(SPR)。此类方法在本领域中是熟知的，并且其实例也在下文详述。
还注意到，相应结合剂与其配体之间的复合物的形成受许多不同因素的影响，这些因素如各自结合配偶体的浓度、竞争者的存在、所使用的缓冲系统的pH和离子强度、以及用于确定解离常数Kd的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离子体共振，仅举几个例子)，或甚至用于评估实验数据的数学算法。
因此，本领域技术人员也清楚Kd值(相应结合剂与其靶/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在某个实验范围内变化，这取决于用于确定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着，所测量的Kd值可能会有轻微的偏差或公差范围，该偏差或公差范围取决于例如Kd值是通过表面等离子体共振(SPR)、竞争ELISA、还是“直接ELISA”确定的。
如本文所用，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白质或核酸)或“突变体”是指与天然存在(野生型)的核酸或蛋白的“参考”骨架相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。所述术语还包含如本文所述的突变蛋白的片段和变体。优选地，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白、其片段或变体具有本文所述的结合LAG-3的功能。
如本文所用，与本披露的突变蛋白有关的术语“片段”涉及N-末端和/或C-末端缩短的(即缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的至少一个)源自全长成熟人泪液脂质运载蛋白(hTlc或hTLPC)的蛋白质或肽。这种片段可缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达10个、多达15个、多达20个、多达25个或多达30个(包括之间的所有数字)。作为示例性实例，这种片段可缺少4个N-末端和2个C-末端氨基酸。应理解，该片段优选为全长泪液脂质运载蛋白(突变蛋白)的功能性片段，这意味着该片段优选包含其所源自的全长泪液脂质运载蛋白(突变蛋白)的结合口袋。作为示例性实例，这种功能性可包含天然成熟人泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的至少氨基酸5-156。此类片段可包括成熟泪液脂质运载蛋白一级序列的至少10个、更多如20或30个或者更多个连续氨基酸，并且通常在成熟脂质运载蛋白的免疫实验中可检测到。
一般而言，如本文中关于本披露的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本披露的组合或本文所述的融合蛋白的相应蛋白配体LAG-3所使用的术语“片段”涉及N-末端和/或C-末端缩短的蛋白或肽配体，其保留了全长配体被根据本披露的突变蛋白识别和/或结合的能力。
如本文所用，术语“诱变”是指，选择实验条件，以使得天然存在于成熟脂质运载蛋白给定序列位置处的氨基酸可被至少一个不存在于相应天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸置换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而(另外的)改变序列区段的长度。因此，以下情况在本披露的范围内：例如，一个在选定序列位置处的氨基酸被三个随机突变的延伸段(stretch)替代，从而相比于野生型蛋白相应区段的长度，导致两个氨基酸残基的插入。这样的插入或缺失可以彼此独立地引入到本披露中可以进行诱变的任何肽区段中。在本披露的一个示例性实施例中，若干个突变的插入可以引入到选定的脂质运载蛋白骨架的AB环中(参见国际专利公开号WO 2005/019256，将其通过引用以其全文结合在此)。
术语“随机诱变”意指无预定的单个氨基酸(突变)存在于某个序列位置处，但是至少两个氨基酸可以在诱变期间以某概率并入预限定的序列位置处。
“同一性”是衡量序列的相似性或关系的序列特性。如本披露所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指在本披露多肽序列与所讨论的序列(同源性)比对之后，相对于这两个序列中较长一个的残基数量的配对相同残基的百分比。通过将相同氨基酸残基的数量除以残基总数再使结果乘以100来量度序列同一性。
如本文所用，术语“同源性”是其一般含义，并包括相同氨基酸以及认为是在本披露的多肽(如本披露的任意脂质运载蛋白突变蛋白)线性氨基酸序列中的等同位置处的保守置换的氨基酸(例如天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)。
可以使用例如程序BLASTP，blastp 2.2.5版(2002年11月16日)(参见Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究],1997)确定序列同源性或序列同一性百分比。在此实施例中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对(矩阵：BLOSUM62；空位罚分：11.1；截止值设置为10-3)，优选地在配对比较中使用野生型蛋白骨架作为参考。作为BLASTP程序输出的结果表示的“阳性”(同源氨基酸)数除以程序所选择的用于比对的氨基酸总数来计算百分比。
具体而言，为了确定脂质运载蛋白(突变蛋白)的氨基酸序列的氨基酸残基是否与对应于野生型脂质运载蛋白的氨基酸序列中的某一位置的野生型脂质运载蛋白不同，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法(如手动地或通过使用计算机程序如BLAST 2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任意适用于产生序列比对的其他合适程序)进行比对。因此，脂质运载蛋白的野生型序列可作为“受试序列”或“参考序列”，而本文所述的与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。本文中术语“野生型序列”和“参考序列”和“受试序列”可互换使用。优选地，脂质运载蛋白的野生型序列是示于SEQ ID NO:1中的hTlc序列。
“空位”是添加或缺失氨基酸所导致的比对中的空间。因此，两份完全相同的序列具有100％的同一性，但较不高度保守且具有缺失、添加或替换的序列可以具有较低程度的序列同一性。本领域技术人员将会认识到，可以得到若干个计算机程序以用于使用标准参数确定序列同一性，例如BLAST(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25,3389-3402)、Blast2(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215,403-410)、和Smith-Waterman(Smith等人(1981)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]147,195-197)。
如本披露中所用，术语“变体”涉及包括氨基酸序列修饰的蛋白质或肽的衍生物，该氨基酸序列修饰例如通过取代、缺失、插入或化学修饰进行。在一些实施例中，此类修饰确实不会降低蛋白质或肽的功能。此类变体包括蛋白质，其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或除天然存在的20个氨基酸外的氨基酸(例如，鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、戊氨酸)替换。然而，此类取代也可以是保守的，即氨基酸残基被化学相似的氨基酸残基替换。保守取代的实例是以下组成员之间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。如本文中关于本披露的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本披露的组合和/或融合蛋白的对应蛋白靶LAG-3所用，术语“变体”涉及与野生型LAG-3蛋白(如本文所述的以UniProt保存的LAG-3参考蛋白)相比具有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多个)氨基酸取代、缺失和/或插入的LAG-3或其片段。LAG-3变体与野生型LAG-3(如本文所述的以UniProt保存的人LAG-3参考蛋白)具有优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性。
通过脂质运载蛋白的“天然序列”意指与源自自然界的对应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白的序列。因此，天然序列脂质运载蛋白可以具有来自任何生物体(特别是哺乳动物)的相应天然存在的脂质运载蛋白的氨基酸序列。这种天然序列多肽可以从自然界中分离或者可以通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(如可替代地，脂质运载蛋白的剪接形式和天然存在的等位基因变体)。多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约50％、60％、70％、80％或至少约85％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括，例如，在多肽的N-末端或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽具有至少约70％，包括至少约80％，如至少约85％的氨基酸序列同一性，包括至少约90％的氨基酸序列同一性或至少约95％的氨基酸序列同一性。作为示例性实例，可以在本披露的hTlc突变蛋白中使前4个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu，SEQ ID NO:51)和最后2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp)缺失而不影响该蛋白(例如，SEQ ID NO:7-28、57-70、和85-95)的生物功能。
当根据本披露使用时，术语“位置”意指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。为了理解如本文中在一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列位置的上下文中使用的术语“对应(correspond或corresponding)”，对应位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量决定。因此，由于在(突变体或野生型)脂质运载蛋白的其他位置处的氨基酸缺失或添加，则可被取代的根据本披露的给定氨基酸的位置可以改变。类似地，由于在突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其他调节序列或基因(包括外显子和内含子))的其他位置处缺失或添加核苷酸，则可被取代的根据本披露的给定核苷酸的位置可以改变。
因此，对于根据本披露的“对应位置”，优选地理解为，核苷酸/氨基酸的位置在指定数字方面可以不同于相似的相邻核苷酸/氨基酸，但是所述相邻核苷酸/氨基酸(可被交换、缺失或添加的)仍由一个或多个“对应位置”包含。
此外，对于基于根据本披露的参考序列的脂质运载蛋白突变蛋白中的对应位置，优选地理解为，核苷酸/氨基酸的位置在结构上对应于(突变体或野生型)脂质运载蛋白中的其他位置，尽管这些位置在指定数字方面可能不同，如技术人员鉴于脂质运载蛋白之间高度保守的整体折叠形式所理解地。
术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，如人血清白蛋白、或牛血清白蛋白、或大鼠血清白蛋白。
如本文对应非天然靶所用，术语“有机分子”或“小有机分子”表示这样的有机分子，该有机分子包含至少两个碳原子，但是优选地不超过7或12个可旋转碳键，具有范围在100与2,000道尔顿之间、优选地100与1,000道尔顿之间的分子量范围，并且任选地包含一个或两个金属原子。
如本文所用，词“检测(detect、detection、detecting)”、“可检测的(detectable)”理解为在定量和定性水平上以及它们的组合。其从而包括目标分子的定量、半定量和定性测量。
“受试者”是脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。如本文所用，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，这些动物包括但不限于人、家畜和农用动物以及动物园、运动或宠物动物，如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、猿(如食蟹猴)，仅举几个示例性实例。优选地，本文的“哺乳动物”是人。
“有效量”是足以实现有益或所希望的结果的量。有效量能够以一次或多次给予来给予。
将“样品”定义为从任何受试者中采集的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织。
III.附图说明
图1：描绘了与成熟hTlc的线性多肽序列相比较的优化的LAG-3特异性人泪液脂质运载蛋白(hTlc)突变蛋白的氨基酸序列的比对。与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，前4个N-末端氨基酸残基(His、His、Leu、Leu；SEQ ID NO:50)和最后2个C-末端氨基酸残基(Ser，Asp)在这些hTlc衍生的、结合LAG-3的突变蛋白(列为hTlc突变蛋白SEQ IDNO:7-28和57-70)、和阴性对照突变蛋白(SEQ ID NO:3和4)中缺失。
图2：描绘了荧光活化细胞分选(FACS)研究的结果，进行该研究以分别评估脂质运载蛋白突变蛋白与人LAG-3(图2A)和食蟹猴LAG-3(图2B)的特异性结合，其在如实例5中所述的哺乳动物细胞上表达。将用人或食蟹猴LAG-3稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞与脂质运载蛋白突变蛋白一起孵育，并使用荧光标记的抗hTlc抗体检测结合的突变蛋白。所有脂质运载蛋白突变蛋白显示与CHO细胞上表达的LAG-3结合，其中EC50与测试的基准抗体(SEQ ID NO:5和6)相当。负脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:3和阴性对照人IgG4(hIgG4)(SEQ ID NO:55和56，Sigma#I4639)显示无结合。将荧光强度的几何平均值归一化至最大平均值并与1:1结合模型拟合。表3中提供了所得EC50值。
图3：显示了脂质运载蛋白突变蛋白与II类主要组织相容性复合物(MHC)分子(LAG-3的天然配体)竞争在竞争性FACS实验中与LAG-3的结合。将II类MHC阳性人细胞系A375与脂质运载蛋白突变蛋白和huLAG-3-Fc(与人IgG1 Fc片段(R&D系统公司(R&Dsystems))融合的人LAG-3细胞外结构域)一起孵育，使用与藻红蛋白(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)，#109-116-098)缀合的山羊抗人IgG抗体检测结合的huLAG-3-Fc。显示了LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白对huLAG-3-Fc与II类MHC分子结合的剂量依赖性抑制。LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白和参照分子(SEQ ID NO:5和6)在相同浓度下对LAG-3/II类MHC结合显示出抑制作用。阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:3)和hIgG4阴性对照不会导致huLAG-3-Fc与表达II类MHC分子的A375细胞结合的可测量的抑制。
IV.具体实施方式
如本文所用，将“脂质运载蛋白”定义为重量为大约18-20kDa的单体蛋白，该单体蛋白具有圆柱形β-折叠片超二级结构区，该结构区包含通过在一端的多个(优选为四个)环逐对连接的多个(优选为八个)β-链以由此限定结合口袋。在脂质运载蛋白家族成员中，正是这些环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的多样性产生多种不同的结合模式，每种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶(综述于例如Skerra,Biochim Biophys Acta[生物物理学生物化学],2000,Flower等人,Biochim Biophys Acta[生物物理学生物化学],2000,Flower,Biochem J[生物化学杂志],1996中)。事实上，蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化为结合广泛的配体，具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有少于20％的序列同一性)，但保留高保守性的整体折叠模式。不同脂质运载蛋白中位置间的对应关系为本领域技术人员所熟知(参见，如美国专利号7,250,297)。
如上所述，脂质运载蛋白是由其超二级结构定义的多肽，超二级结构即包含通过在一端的四个环逐对连接的八个β-链以由此限定结合口袋的圆柱形β-折叠片超二级结构区。本披露不局限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这一方面，本披露涉及具有圆柱形β-折叠片超二级结构区的脂质运载蛋白突变蛋白，该结构区包含通过在一端的四个环逐对连接的八个β-链以由此限定结合口袋，其中与参考序列相比，所述四个环中的至少三个的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合LAG-3。
在一个特别的实施例中，本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪液脂质运载蛋白(hTlc或hTLPC)(也称为脂质运载蛋白-1、人泪液前白蛋白或冯·埃布纳腺(von Ebnergland)蛋白)的突变蛋白。如本文所用，术语“人泪液脂质运载蛋白”或“hTlc”或“脂质运载蛋白-1”指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025(同种型1)的成熟的人泪液脂质运载蛋白。可将示于SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025的氨基酸序列用作优选的“参考序列”，更优选地，将示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在本文中用作“参考序列”。
在一些实施例中，以可检测的亲和力结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白可包括至少一个用另一个氨基酸(例如，丝氨酸残基)取代参考序列的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些其他实施例中，以可检测的亲和力结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白可包括取代野生型脂质运载蛋白的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。在进一步特别的实施例中，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白包括至少两个用半胱氨酸残基取代天然氨基酸的氨基酸取代，从而形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施例中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。根据Flower(Biochem J[生物化学杂志],1996)、(BiochimBiophys Acta[生物化学与生物物理学学报],2000)和Breustedt等人(J Biol Chem[生物化学杂志],2005)在本文中使用这些区的定义。在相关的实施例中，本披露教导了一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够通过结合LAG-3来活化LAG-3的下游信号传导通路。
本披露的针对LAG-3的蛋白或对LAG-3具有特异性的蛋白包含任何数目的基于所定义的蛋白骨架(优选脂质运载蛋白骨架)的特异性结合蛋白突变蛋白。还优选地，交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数目分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多(如25、30、35、40、45或50)，其中优选的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，并且甚至更优选的是9、10或11。然而，优选的是本披露的蛋白质突变蛋白仍然能够结合LAG-3。
一方面，本披露包括以至少可检测的亲和力结合LAG-3的各种脂质运载蛋白突变蛋白。在此意义上，可将LAG-3看作野生型脂质运载蛋白的非天然配体，其中“非天然配体”是指在生理条件下不结合野生型脂质运载蛋白的化合物。通过在某些序列位置处用一个或多个突变来工程化野生型脂质运载蛋白，本发明的发明人已经证明对非天然配体(LAG-3)的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施例中，在编码野生型脂质运载蛋白上某些序列位置处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体处，可以通过用核苷酸三联体的亚集(subset)在这些位置处的取代来实施随机诱变。
此外，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于参考脂质运载蛋白的线性多肽序列的某些序列位置的任意一个或多个(包括至少任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)序列位置处具有突变的氨基酸残基。
在突变的氨基酸序列位置之外，本披露的蛋白可包括“亲本”蛋白骨架(如脂质运载蛋白骨架)的野生型(天然)氨基酸序列。在一些实施例中，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白还可在一个或多个序列位置处携带一个或多个氨基酸突变，只要这种突变不妨碍或干扰、至少基本上不妨碍或干扰突变蛋白的结合活性和折叠。可以使用已建立的标准方法(Sambrook和Russell,2001,Molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆:实验室手册])在DNA水平上非常简单地完成这种突变。氨基酸序列改变的示例性实例是插入或缺失以及氨基酸取代。这种取代可以是保守的，即氨基酸残基被化学性质(特别是关于极性以及尺寸)相似的氨基酸残基替换。保守取代的实例是以下组成员之间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以将非保守性改变引入氨基酸序列中。此外，代替替换单一氨基酸残基，还可以使参考脂质运载蛋白(优选hTlc)的一级结构插入或缺失一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定、折叠和功能性的突变蛋白。在这种突变蛋白中，例如，在多肽(例如，具有截短的N-末端和C-末端的hTlc突变蛋白)的N-末端或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，这种突变蛋白可与hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有约至少70％(包括至少约80％，如至少约85％)的氨基酸序列同一性。作为示例性实例，本披露还涵盖如上定义的hTlc突变蛋白，其中成熟人泪液脂质运载蛋白序列的前四个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu，SEQ ID NO:51；位置1-4)和/或成熟人泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的最后两个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158)已经被缺失(参见，例如SEQ ID No:7-28、57-70、和85-95)。
当与其他脂质运载蛋白的序列同一性比较时，本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参考脂质运载蛋白(优选hTlc)具有高序列同一性。在此一般情况下，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列至少基本上类似于参考脂质运载蛋白的氨基酸序列，前提是在比对中可能存在由氨基酸的添加或缺失导致的空位(如下所定义)。在一些实施例中，本披露的基本上类似于参考脂质运载蛋白的序列的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列与参考脂质运载蛋白的序列具有至少70％的同一性或序列同源性、至少75％的同一性或序列同源性、至少80％的同一性或序列同源性、至少82％的同一性或序列同源性、至少85％的同一性或序列同源性、至少87％的同一性或序列同源性、或者至少90％的同一性或序列同源性(包括至少95％的同一性或序列同源性)，其前提是保留改变的位置或序列并且一个或多个空位是可能的。
如本文所用，由于结合特异性不是绝对的，而是相对性质，因此，如果本披露的脂质运载蛋白突变蛋白能够区分靶和一个或多个参考靶，则其“特异性结合”这种靶(例如，LAG-3)。可以例如根据蛋白质印迹、ELISA、FACS、RIA(放射免疫分析)、ECL(电化学发光)、IRMA(免疫放射分析)、IHC(免疫组织化学)和肽扫描来确定“特异性结合”。
在一个实施例中，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，该融合配偶体是延长该突变蛋白血清半衰期的蛋白结构域。在进一步特别的实施例中，蛋白结构域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白。
在另一个实施例中，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白与延长突变蛋白血清半衰期的化合物缀合。更优选地，突变蛋白与选自以下的化合物缀合：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
在又一个实施例中，本披露涉及包含编码本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本披露涵盖包含所述核酸分子的宿主细胞。
A.对LAG-3具有特异性的脂质运载蛋白突变蛋白
一方面，本披露提供以高亲和力结合人LAG-3的人脂质运载蛋白突变蛋白，及此类突变蛋白的有益用途。本披露还提供制备本文所述的结合LAG-3的蛋白的方法，以及包含此类蛋白的组合物。本披露的结合LAG-3的蛋白及其组合物可用于检测样品中LAG-3蛋白的方法中、或用于结合受试者中LAG-3以刺激或抑制免疫响应的方法中。所披露的结合LAG-3的蛋白具有增强的生物稳定性并且具有与人和食蟹猴LAG-3两者相似或相当的结合模式。最后，本披露提供使用针对LAG-3的脂质运载蛋白的突变蛋白来抑制LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)分子的结合的方法。之前未描述过此类具有伴随本披露提供的用途的这些特征的人脂质运载蛋白突变蛋白。
1.对LAG-3具有特异性的示例性脂质运载蛋白突变蛋白。
本披露的一些实施例涉及脂质运载蛋白突变蛋白，该脂质运载蛋白突变蛋白能够以通过Kd测量的约80nM、60nM、40nM、20nM、15nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1.5nM、1nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、或甚至更低的亲和力结合LAG-3(优选是人LAG-3(huLAG-3))。可以通过例如基本上如实例4所述的表面等离子体共振(SPR)分析确定这种亲和力。
在其他实施例中，结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白可以与食蟹猴LAG-3(cyLAG-3)交叉反应，并且在一些进一步的实施例中，结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白能够以通过Kd测量的约80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、或甚至更低(如约0.46nM)的亲和力结合cyLAG-3。可以通过例如基本上如实例4所述的SPR分析确定这种亲和力。
在其他实施例中，脂质运载蛋白突变蛋白能够以约5nM、4nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM、0.5nM或甚至更低(如约0.22nM或0.02nM)的EC50值结合用huLAG-3转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上的LAG-3。在其他实施例中，脂质运载蛋白突变蛋白能够以约350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、50nM、20nM、10nM、或甚至更低(如约9.3nM)的EC50结合用cyLAG-3转染的CHO细胞上的LAG-3。可以通过例如基本上如实例5中描述的荧光激活细胞分选(FACS)测定EC50值。
在一些实施例中，脂质运载蛋白突变蛋白能够抑制LAG-3与II类MHC(如在抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞上表达的那些)的结合。可以例如通过基本上如实例6中描述的FACS分析确定抑制作用模式。
一方面，本披露提供结合LAG-3的hTlc突变蛋白。
在这一方面，本披露提供一种或多种hTlc突变蛋白，其能够以约10nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1.5nM或更低、1nM或更低、0.75nM或更低、0.5nM或更低、0.25nM或更低、.1nM或更低、或甚至约0.05nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
在一些实施例中，这种hTlc突变蛋白在以下位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、和152-154的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以含有一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、111、114、124、148-150、和152-154的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以含有一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置14、25-26、28、31-32、52、55、58、66、79、84、86、101、105-106、108、110、112-114、和121的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以包括一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、8、26-34、56、58、60-61、65、69、85、101、105-106、108、111、114、和153-154的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以包括一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置14、25-26、28、32、52、55、58、66、79、84、86、101、105、106、108、110、112、114、和121的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以包括一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置26-34、56、58、60-61、65、70、101、105-106、108、111、114、和153的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以包括一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置26-34、56、58、60-61、63、65、101、105-106、108、111、114、149、和153的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个位置处。
在一些特定的实施例中，此类hTlc突变蛋白在以下位置处可以包括一个或多个突变的氨基酸残基：对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、16、44、46、63、65、69-70、73、80、84、89-90、93、96-98、113、124、148-150、152、或154的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27个位置处。
在一些进一步的实施例中，hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、8、65、69、85、和154处可以包含至少1、2、3、4、5、或6个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3(特别是huLAG-3)。
在一些进一步的实施例中，hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置63、65、和149的一个或多个序列位置处可以包含至少1、2、或3个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3(包括huLAG-3)。
在一些进一步的实施例中，hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置26、84、106、和112的一个或多个序列位置处可以包含至少1、2、3、或4个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3(包括huLAG-3)。
在一些仍进一步的实施例中，本披露涉及多肽，其中所述多肽是hTlc突变蛋白，与hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，该hTlc突变蛋白在序列位置84处包含至少1个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3(特别是huLAG-3)。
在一些实施例中，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可包括至少一个用如丝氨酸残基取代天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋包括用另一个氨基酸如丝氨酸残基取代在位置61和/或153处的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在本上下文中应注意已经发现(在相应的天然核酸文库的水平上)去除由半胱氨酸残基61和153形成的野生型泪液脂质运载蛋白的结构二硫键(参见Breustedt等人，J Biol Chem[生物化学杂志],2005)可以提供hTlc突变蛋白，其不仅稳定折叠，还能以高亲和力结合给定非天然配体。在一些特定的实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白包括氨基酸取代Cys 61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp、和/或Cys 153→Ser或Ala。已证明此类取代可用于阻止形成天然存在的连接Cys 61和Cys 153的二硫桥，并从而有助于处理突变蛋白。然而，结合LAG-3并具有在Cys 61与Cys153之间形成的二硫桥的hTlc突变蛋白也是本披露的一部分。
在一些实施例中，结构性二硫键的消除可提供进一步的优点，即允许将非天然人工二硫键(自发)生成或有意引入到本披露的突变蛋白中，由此增加突变蛋白的稳定性。例如，在一些实施例中，在位置61、101和153处的两个或全部三个半胱氨酸密码子被另一个氨基酸的密码子替换。此外，在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白包括位置101处的天然半胱氨酸残基被丝氨酸残基或组氨酸残基取代的氨基酸取代。
然而，结合LAG-3并具有在Cys 61与Cys 153之间形成的二硫桥的hTlc突变蛋白也是本披露的一部分。在一些特定的实施例中，hTlc突变蛋白在位置61和153处不包含突变的氨基酸并且具有在Cys 61和Cys 153之间形成的二硫键。在一些进一步特别的实施例中，在位置61和/或153处具有一个或多个突变的氨基酸的hTlc突变蛋白经受进行进一步诱变以通过将位置61和/或153反向突变为天然半胱氨酸来恢复天然二硫键。
在一些实施例中，根据本披露的突变蛋白包括天然氨基酸被关于hTlc(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的位置28或105处的半胱氨酸残基取代的氨基酸取代。
此外，在一些实施例中，根据本披露的突变蛋白包括关于hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置111处的天然精氨酸残基被脯氨酸残基取代的氨基酸取代。另外，在一些实施例中，根据本披露的突变蛋白包含关于hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置114处的天然赖氨酸残基被色氨酸残基或谷氨酸取代的氨基酸取代。
在一些实施例中，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括突变为天冬酰胺残基的一个或多个氨基酸以引入一个或多个糖基化位点。在一些优选的实施例中，根据本披露的突变蛋白包括在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置12的氨基酸突变。例如，根据本披露的突变蛋白可以具有关于hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的以下突变的氨基酸残基：Asp 12→Asn。
在一些实施例中，根据本披露的突变蛋白包括在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5的氨基酸取代。例如，根据本披露的突变蛋白可以具有关于hTlc(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的以下突变的氨基酸残基：Ala 5→Thr。
此外，在一些实施例中，根据本披露的突变蛋白可以包括天然带负电荷的残基被中性残基取代的至少一个氨基酸取代，其中该天然带负电荷的残基不参与与LAG-3的结合，并且其中该取代导致突变蛋白的增加的等电点(pI)。在一些特定的实施例中，此类天然带负电荷的残基和位置包括关于hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的Asp 7、Glu 9、Asp 12、Glu 45、Asp 72、Glu 73、Asp 80、和Asp 95。在一些特定的实施例中，此类中性氨基酸残基包括Asn、Arg、和Lys。在一些进一步特别的实施例中，根据本披露的突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置7、9、12、45、72、73、80、和95处包括以下突变的氨基酸残基的一个或多个：Asp 7→Asn、Arg、或Lys；Glu 9→Gln、Arg、或Lys；Asp 12→Asn或Arg；Glu 45→Arg；Asp 72→Asn、Arg、或Lys；Glu 73→Arg；Asp 80→Gly；和Asp 95→Asn、Arg、或Lys。示例性突变蛋白包括SEQ ID NO:57-60、63、66。
在一些实施例中，根据本披露的结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、和152-154的一个或多个位置处的一个或多个以下突变的氨基酸残基：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Ser 14→Pro；Thr 16→Met；Asp25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys或Asp；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile或Leu；Asn 32→Asp、Met、或Thr；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Lys 52→Arg；Val 53→Ala；Met 55→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe或Asp；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Ala 66→Asn；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr或Glu；Asp 80→Gly；His 84→Tyr或Leu；Val 85→Ala或Asp；Ala 86→Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser或Phe；Leu 105→Cys或Gly；His106→Ala、Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Tyr或Thr；Val 110→Gly或Asn；Arg 111→Pro；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Trp或Ala；Lys 121→Thr；Leu124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala。在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包括两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多个如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或甚至更多个突变的氨基酸残基。
在一些实施例中，根据本披露的结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置14、25-26、28、31-32、52、55、58、66、79、84、86、101、105-106、108、110、112-114、和121的一个或多个位置处的一个或多个以下突变的氨基酸残基：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Phe 28→Asp；Met31→Leu；Asn 32→Met或Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala79→Glu；His 84→Tyr或Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly或Asn；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr。在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包括两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多个如13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22个突变的氨基酸残基。
在一些实施例中，根据本披露的结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-111、114、121，124、148-150、和152-154的一个或多个位置处的一个或多个以下突变的氨基酸残基：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala。在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包括两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多个如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或甚至更多个突变的氨基酸残基。
在一些实施例中，根据本披露的结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括在对应于成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、111、114、124、148-150、和152-154的一个或多个位置处的一个或多个以下突变的氨基酸残基：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala。在一些实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包括两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多个如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或甚至更多个突变的氨基酸残基。
在一些实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括以下氨基酸突变：Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys153→Ser；以及进一步包括以下氨基酸突变的一个或多个，这些氨基酸突变包括2、3、4、5、6、或7个、或甚至更多个：Ala 5→Thr；Asp7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；和Ser 154→Ala。
在一些实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括以下氨基酸突变：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；以及以下氨基酸突变的一个或多个，这些氨基酸突变包括2、3、4、5、6、7个、或甚至更多个：Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Leu 56→Asp；His 84→Tyr或Leu；His 106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Val 110→Gly 或Asn；Gly 112→Met、Val或Leu；Val 113→Ala或Leu。
在一些实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括以下氨基酸突变：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；以及以下氨基酸突变的一个或多个，这些氨基酸突变包括2、3、4、5、6、7个、或甚至更多个：Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr或Leu；His 106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Val110→Gly或Asn；Gly 112→Met、Val或Leu；Val 113→Ala或Leu。
在一些实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括以下氨基酸突变：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；以及以下氨基酸突变的一个或多个，这些氨基酸突变包括2、3、4、5、6、7个、或甚至更多个：Arg 26→Ser、Asp、Glu、或Ala；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Leu 56→Asp；His 84→Tyr或Leu；His 106→Glu、Lys、或Pro；Val 110→Asn；Gly 112→Val或Leu；Val 113→Ala或Leu。
在一些另外的实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys153→Ser；和Ser 154→Ala；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Gly 46→Asp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Gly；和Cys 153→Ser；
(c)Asp 7→Gly；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Arg 148→Trp；Thr 152→Pro；和Cys153→Ser；
(d)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；Tyr 97→His；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；和Cys 153→Ser；
(f)Thr 16→Met；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ile 89→Ser；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(g)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Gln 149→Leu；和Cys 153→Ser；
(h)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Lys 70→Arg；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(i)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(j)Ile 10→Phe；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；Val 93→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(k)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys153→Ser；和Ser 154→Ala；
(l)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(m)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(n)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(o)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Glu；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Val；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(p)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Leu；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(q)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(r)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ala；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Lys；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(s)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Asn；Gly 112→Met；Val 113→Ala；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(t)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(u)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Val 113→Leu；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(v)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Met；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；或
(w)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Gln 149→Leu。
在一些另外的实施例中，与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；和Ser154→Ala；
(b)Ala 5→Thr；Gly 46→Asp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；和Ser 150→Gly
(c)Asp 7→Gly；Val 85→Asp；Arg 148→Trp；和Thr 152→Pro；
(d)Ala 5→Thr；Val 53→Ala；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；和Tyr 97→His；
(e)Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；和Leu 124→Gln；
(f)Thr 16→Met；Leu 44→His；Lys 65→Glu；和Ile 89→Ser；
(g)Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；和Gln 149→Leu；
(h)Lys 65→Glu和Lys 70→Arg；
(i)Ala 5→Thr；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；和Ile 98→Val
(j)Ile 10→Phe；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；和Val 93→Glu；
(k)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；
(l)Arg 26→Glu；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val110→Gly；和Gly 112→Met；
(m)Arg 26→Glu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Glu；和Gly 112→Val；
(n)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；和Gly 112→Leu；
(o)Arg 26→Ser；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；
(p)Arg 26→Ala；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Lys；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；
(q)Asn 32→Thr；His 106→Gln；Val 110→Asn；Gly 112→Met；和Val 113→Ala；
(r)Arg 26→Gly；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Pro；Val110→Gly；和Gly 112→Met；或
(s)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Leu；His 106→Gln；Val 110→Gly；Gly112→Met；和Val 113→Leu。
在一些另外的实施例中，与hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包括以下氨基酸突变：在位置156与157之间插入Pro。
在剩余区域，即与序列位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、152-154、和157不同的区域，在突变的氨基酸序列位置或在此类位置的突变的氨基酸残基之外，本披露的hTlc突变蛋白可以包括成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的野生型(天然)氨基酸序列。
除非另有说明，否则与hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比编号本文所述的hTlc突变蛋白的残基的位置。
在仍进一步的实施例中，根据本披露的hTlc突变蛋白与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的序列具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为示例性实例，SEQ ID NO:8的突变蛋白与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有大约81.8％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在进一步特别的实施例中，本披露的hTlc突变蛋白包含如SEQ ID NO:7-28、57-70、和85-95的任一项中示出的氨基酸序列、或其片段或变体。
在进一步特别的实施例中，本披露的hTlc突变蛋白与选自下组的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％或更高、至少90％或更高、至少95％或更高、至少97.5％或更高、至少98％或更高、或至少99％或更高序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:8-18、20-28、57-70和85-95。
本披露还包括具有选自下组的氨基酸序列的hTlc突变蛋白的结构同源物，该组由以下组成：SEQ ID NO:7-28、57-70、和85-95，该结构同源物具有与所述hTlc突变蛋白有关的大于约60％、优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％、以及最优选的大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
根据本披露的hTlc突变蛋白可以通过诱变天然存在形式的成熟hTlc(SEQ ID NO:1)获得。在诱变的一些实施例中，取代(或替换)是保守取代。然而，设想任何置换(包括非保守取代或来自下文的示例性取代中的一个或多个)，只要脂质运载蛋白突变蛋白保留了其结合LAG-3的能力，和/或其与之后被取代的序列具有序列同一性，即该脂质运载蛋白突变蛋白与hTlc(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性。
在一些特定的实施例中，本披露提供了以通过以下的Kd测量的亲和力结合人LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白：约10nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1nM或更低、0.5nM或更低、0.1nM或更低、或0.05nM或更低。在一些实施例中，脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO:7和19中任一项的氨基酸序列具有至少90％或更高，如95％或更高、97.5％或更高、98％或更高、或99％或更高序列同一性。
2.对LAG-3具有特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的应用。
本披露的结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白的许多可能应用存在于医药中。
另一方面，本披露涉及本文所披露的结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白在用于检测样品中LAG-3以及相应的诊断方法中的用途。
本披露还涉及如所述的一种或多种结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白在用于与LAG-3形成复合物中的用途。
因此，本披露的又一方面，所披露的脂质运载蛋白突变蛋白用于检测LAG-3。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与怀疑含有LAG-3的样品在合适条件下接触，由此允许在突变蛋白与LAG-3之间形成复合物，并通过合适信号检测复合物。可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是表面等离子体共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，该配偶体中的一个固定在表面(例如金箔)上。
本文披露的结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白还可用于分离LAG-3。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述突变蛋白与猜测含有LAG-3的样品在合适条件下接触，由此允许在突变蛋白与LAG-3之间形成复合物，并从样品中分离所述复合物。
在所披露的突变蛋白用于检测LAG-3以及分离LAG-3的用途中，可以将突变蛋白和/或LAG-3或者其结构域或片段固定在合适的固相上。
在仍一方面，本披露的特征在于包含根据本披露的结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白的诊断试剂盒或分析试剂盒。
除了其在诊断中的用途，又一方面，本披露考虑包含本披露的突变蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
此外，本披露提供用作抗癌剂和/或免疫调节剂的结合LAG-3的人脂质运载蛋白突变蛋白。因此，设想将结合LAG-3的本披露的脂质运载蛋白突变蛋白用在治疗或预防如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的人疾病的方法中。因此，还提供了治疗或预防有此需要的受试者中如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的人疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的结合LAG-3的本披露的脂质运载蛋白突变蛋白。
B.本披露的脂质运载蛋白突变蛋白
脂质运载蛋白是天然进化以结合配体的蛋白质性结合分子。脂质运载蛋白存在于许多生物体中，这些生物体包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白家族的成员(Pervaiz和Brew，FASEB J[美国实验生物学会联合会会志],1987)通常是小的分泌的蛋白并具有单个多肽链。它们的特征在于一系列不同的分子识别特性：它们结合多种主要是疏水性的小分子(如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、甜味剂和着嗅剂)；和特异细胞表面受体及其大分子复合物的形成。尽管过去将它们主要分类为转运蛋白，但现在明确了脂质运载蛋白完成多种生理功能。这些功能包括在视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导和前列腺素合成中的作用。脂质运载蛋白还涉及免疫响应的调节和细胞内环境稳态的介导(综述于例如，Flower等人,Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报],2000,Flower,Biochem J[生物化学杂志],1996中)。
脂质运载蛋白之间的全序列保守性非常低，通常具有低于20％的序列同一性。形成强烈对比的是，其整体折叠模式高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八链反平行β-片组成，该β-片自身闭合形成连续的氢键合β-桶。此β-桶形成中央腔体。桶的一端被穿过其底部的N末端肽区段以及连接β-链的三个肽环立体封闭。β-桶的另一端对溶剂开放并涵盖由四个柔性肽环形成的靶结合位点。正是这些环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶(综述于例如Skerra,Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报],2000,Flower等人,Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报],2000,Flower,BiochemJ[生物化学杂志],1996中)。
当在本文的结合LAG-3的本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的上下文中使用时，术语“对……具有特异性的(specific for)”包括该脂质运载蛋白突变蛋白针对LAG-3、结合LAG-3或者与LAG-3反应。因此，针对、结合或与其反应包括该脂质运载蛋白突变蛋白特异性结合LAG-3。如本文所述，在上下文中的术语“特异性地(specifically)”是指，脂质运载蛋白突变蛋白与LAG-3蛋白反应，但至少基本上不与另一种蛋白反应。术语“另一种蛋白”包括任何非LAG-3蛋白，包括本文披露的脂质运载蛋白指向的与LAG-3密切相关或同源的蛋白。然而，来自除人以外的物种(如在定义“受试者”的上下文中描述的那些)的LAG-3蛋白、片段和/或变体未被术语“另一种蛋白”排除。术语“基本上不结合”意指本披露的脂质运载蛋白突变蛋白不结合另一种蛋白，即显示出小于30％、优选地20％、更优选地10％、特别优选地小于9％、8％、7％、6％或5％的交叉反应性。如上定义的所述脂质运载蛋白是否特异性反应可以很容易地进行测试，特别是通过比较本披露的脂质运载蛋白突变蛋白与LAG-3的反应和所述脂质运载蛋白与一种或多种其他蛋白的反应。“特异性结合”也可以例如根据蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、FACS、IHC和肽扫描来确定。
相比于本披露的脂质运载蛋白突变蛋白与另一种脂质运载蛋白的序列同一性，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参考脂质运载蛋白(例如hTlc)具有高序列同一性。在所述一般情况下，根据本披露的组合的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与相应野生型或参考脂质运载蛋白的氨基酸序列至少基本上相似。与对应参考脂质运载蛋白的序列基本上相似的根据本披露的组合的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列，与对应脂质运载蛋白的序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％的同一性，包括至少95％的同一性。在这一方面，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白当然可包含如本文所述的比较取代，其使脂质运载蛋白突变蛋白能够结合LAG-3。典型地，脂质运载蛋白的突变蛋白相对于参考脂质运载蛋白的序列在脂质运载蛋白配体结合位点开放端的四个环(参见上文)中包含一个或多个氨基酸突变。如上文所述，这些区域在决定脂质运载蛋白突变蛋白对所需靶的结合特异性中至关重要。
本披露的突变蛋白还可在形成脂质运载蛋白的靶结合位点的四个柔性肽环之外的区域含有突变。例如，本发明的突变蛋白可在连接脂质运载蛋白封闭端处的β-链的三个肽环(命名为BC、DE和FG)中的一个或多个中含有一个或多个突变。作为示例性实例，源自泪液脂质运载蛋白的多肽或其同源物的突变蛋白在N-末端区域的和/或在β-桶结构端部处排列的三个肽环BC、DE和FG中的任意序列位置处可具有1、2、3、4或更多个突变的氨基酸残基，该β-桶结构位于天然脂质运载蛋白结合口袋的对面。作为进一步的示例性实例，与泪液脂质运载蛋白的野生型序列相比，源自泪液脂质运载蛋白的多肽或其同源物的突变蛋白在β-桶结构端部处排列的肽环DE中可能没有突变的氨基酸残基。
与对应的天然脂质运载蛋白相比，根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白包含一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20个)取代，其条件是这种脂质运载蛋白突变蛋白应该能够结合LAG-3。例如，脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于具有例如hTlc的野生型序列的野生型脂质运载蛋白的不同位置的位置处(即在对应位置处)具有取代。在一些实施例中，根据本披露的组合的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个氨基酸取代，包括用精氨酸残基取代天然氨基酸的2、3、4、5或甚至更多个氨基酸取代。因此，以产生能够结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白为目标，对如本文所述的“参考蛋白”骨架的核酸进行诱变。
并且，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54)可在其N-末端或C-末端，优选地C-末端包含异源氨基酸序列(如Strep-标签II序列)而不影响该脂质运载蛋白突变蛋白的生物活性(结合其靶，如LAG-3)。
同样，与相应的野生型泪液脂质运载蛋白相比，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N-末端缺失1、2、3、4或更多个氨基酸和/或在其C-末端缺失1、2或更多个氨基酸；例如SEQ ID NO:7-28、57-70、和85-95。
在一些实施例中，取代(或替换)是保守取代。然而，设想任意取代(包括非保守取代或者来自下文列出的示例性取代的一个或多个)，只要脂质运载蛋白突变蛋白保留了其结合LAG-3的能力，和/或其与之后被取代的序列具有同一性，即该脂质运载蛋白突变蛋白与“参考序列”具有至少60％，比如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。
保守取代通常为以下取代，根据待突变的氨基酸列举，每一个待突变的氨基酸后面为一个或多个可作为保守性的替换：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→Ile、Leu。其他取代也是可允许的并可凭经验或根据其他已知的保守或非保守取代确定。作为另一取向(orientation)，以下八组的每一组包含氨基酸，这些氨基酸通常可用于定义另一氨基酸的保守取代：
a.丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)；
b.天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
c.天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；
d.精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)；
e.异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)；
f.苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)；
g.丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；以及
h.半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)
如果此类取代导致了生物活性的改变，则可引入更多实质性改变(如以下或如下文关于氨基酸分类进一步描述)并就所希望的特征筛选产物。这种更实质性改变的实例是：Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、正亮氨酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Ala。
脂质运载蛋白的生物性质中的实质性修饰通过选择它们在维持以下的效果上显著不同的取代完成：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片或螺旋构象；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。基于共同侧链性质，将天然存在的残基分为以下的组：(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守取代需要将这些类别中之一的成员交换成另一类。通常还可用丝氨酸取代不参与维持相应脂质运载蛋白正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将一个或多个半胱氨酸键添加至脂质运载蛋白以提高其稳定性。
使用已经建立的标准方法，可在核酸(如DNA水平)上非常简单地完成任何突变(包括如以上所讨论的插入)。氨基酸序列改变的示例性实例是插入或缺失以及氨基酸取代。这种取代可以是保守的，即氨基酸残基被化学性质(特别是关于极性以及尺寸)相似的氨基酸残基替换。保守取代的实例是以下组成员之间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以将非保守性改变引入氨基酸序列中。此外，代替替换单个氨基酸残基，还可以使泪液脂质运载蛋白的一级结构插入或缺失一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定的折叠/功能的突变蛋白。
氨基酸序列的修饰包括单个氨基酸位置的定向诱变，以便通过引入某些限制性酶的切割位点来简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，还可引入这些突变以进一步改善针对给定靶(如LAG-3)的脂质运载蛋白突变蛋白的亲和力。另外，如果需要，可以引入突变以便调节突变蛋白的某些特征，如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶解性或者降低聚集趋势。例如，可以将天然存在的半胱氨酸残基进行突变成其他氨基酸以防止形成二硫桥。还可以有意将其他氨基酸序列位置突变成半胱氨酸以便引入新的反应基团，例如用于与其他化合物(如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质)缀合，或用于形成非天然存在的二硫键。所产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白，例如，以便增加相应脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。这种将半胱氨酸残基引入hTlc突变蛋白的氨基酸序列的突变的示例性可能性包括取代Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp95→Cys、和Glu 131→Cys。在任意氨基酸位置40、73、90、95和/或131侧面产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白，例如，以便增加相应hTlc突变蛋白的血清半衰期。
在一些实施例中，如果上述部分中的一个与本披露的脂质运载蛋白突变蛋白缀合，则与氨基酸侧链的缀合可能是有利的。合适的氨基酸侧链可以天然存在于人脂质运载蛋白的氨基酸序列中，或者可以通过诱变引入。在经由诱变引入了合适的结合位点的情况下，一种可能性是用半胱氨酸残基替代在适当位置处的氨基酸。例如，这种突变包括人泪液脂质运载蛋白的野生型序列中Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys或Glu 131→Cys取代中的至少一个。在这些位置中任意处新产生的半胱氨酸残基随后可用于将该突变蛋白与延长该突变蛋白血清半衰期的部分(如PEG或其活化衍生物)缀合。
在另一个实施例中，为了给将上述化合物中的一个缀合至根据本披露的脂质运载蛋白突变蛋白提供合适的氨基酸侧链，可以通过诱变引入人工氨基酸。一般而言，此类人工氨基酸设计为更具反应性，从而促进与所希望的化合物缀合。这种可经由人工tRNA引入的人工氨基酸的一个实例是对乙酰基-苯丙氨酸。
对于本文披露的突变蛋白的若干应用，以融合蛋白形式使用它们可能是有利的。在一些实施例中，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白在其N-末端或其C-末端融合至蛋白质、蛋白质结构域、或肽，例如单个序列和/或亲和标签。
亲和标签(如Strep-标签或Strep-标签II(Schmidt等人，J Mol Biol[分子生物学杂志],1996)、c-myc-标签、FLAG-标签、His-标签或HA-标签)或者蛋白(如谷胱甘肽-S-转移酶，其进一步允许容易检测和/或纯化重组蛋白)是合适的融合配偶体的进一步实例。最后，具有生色或荧光性质的蛋白质(如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP))也是本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的合适的融合配偶体。
一般而言，可以用任何合适的化学物质或酶标记本披露的脂质运载蛋白突变蛋白，该化学物质或酶直接或间接产生可检测化合物或者化学、物理、光学或酶反应信号。物理反应和同时光学反应/标记物的实例是照射时的荧光发射或当使用放射活性标记时的X-射线发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是催化显色反应产物形成的酶标记(同时是光学标记)的实例。一般而言，通常用于抗体(除了那些专门与免疫球蛋白的Fc部分中的糖部分一起使用的)的所有标记也可用于与本披露的脂质运载蛋白突变蛋白缀合。本披露的脂质运载蛋白突变蛋白还可与任何合适的治疗活性剂缀合，例如用于将此类试剂靶向递送至给定细胞、组织或器官，或用于选择性靶向细胞(如肿瘤细胞)而不影响周围正常细胞。此类治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小有机分子和治疗性肽(如作为细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶上蛋白质结合位点的肽)。然而，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白还可与治疗活性核酸(如反义核酸分子、小干扰RNA、微RNA或核酶)缀合。可以通过本领域熟知的方法产生此类缀合物。
如上所述，在一些实施例中，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可与延长该突变蛋白血清半衰期的部分缀合(这方面还参见国际专利公开文本号WO 2006/056464，其中参考具有CTLA-4结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白描述了此类缀合策略)。仅举几个例子，延长血清半衰期的部分可以是聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、如棕榈酸(Vajo和Duckworth,Pharmacol Rev[药理学评论],2000)的脂肪酸、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白、转铁蛋白。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、包括结构域抗体(例如，美国专利号6,696,245)的抗体片段或具有白蛋白结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。因此，用于延长本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的合适缀合配偶体包括白蛋白结合蛋白，例如，细菌白蛋白结合结构域，如链球菌蛋白G(Konig和Skerra,JImmunol Methods[免疫学方法杂志],1998)的一种。可用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的其他实例是，例如美国专利公开文本号20030069395或Dennis等人(J Biol Chem[生物化学杂志],2002)所述，具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；并且Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr。
在其他实施例中，白蛋白本身(Osborn等人，J Pharmacol Exp Ther[药理学和实验治疗学杂志],2002)或白蛋白的生物活性片段可用作本披露脂质运载蛋白突变蛋白的缀合配偶体。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，如人血清白蛋白、或牛血清白蛋白、或大鼠白蛋白。可以如美国专利号5,728,553或欧洲专利公开号EP0330451和EP 0361991中的描述重组产生白蛋白或其片段。可将重组的人白蛋白(如，来自诺维信δ有限公司(Novozymes Delta Ltd.)，诺丁汉，英国的)缀合或融合至本披露的脂质运载蛋白突变蛋白，以便延长该突变蛋白的半衰期。
如果白蛋白结合蛋白是抗体片段，则其可以是结构域抗体。将结构域抗体(dAb)工程化以允许精确控制生物物理性质和体内半衰期，以产生最佳安全性和有效性产品概况。结构域抗体例如从Domantis公司(Domantis Ltd.)(剑桥，英国和马萨诸塞州，美国)可商购获得。
如果将转铁蛋白用作延长本披露的脂质运载蛋白突变蛋白血清半衰期的部分，可将该突变蛋白遗传地融合至非糖基化转铁蛋白的N或C末端或者两者。非糖基化转铁蛋白具有14-17天的半衰期，且转铁蛋白融合蛋白将类似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供高生物利用度、生物分布、和循环稳定性。此技术从BioRexis(比奥雷克西斯药物公司(BioRexis Pharmaceutical Corporation)，宾夕法尼亚州，美国)可商购获得。用于用作蛋白质稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也从诺维信δ有限公司(诺丁汉，英国)可商购获得。
如果将免疫球蛋白的Fc部分用于延长本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期的目的，则可使用从Syntonix制药有限公司(Syntonix Pharmaceuticals,Inc.)(马萨诸塞州，美国)可商购获得的SynFusionTM技术。此Fc-融合技术的使用允许产生更长效的生物药物，并可以例如由两个拷贝的连接至抗体Fc区的突变蛋白组成以改善药物动力学、溶解度和生产效率。
延长本披露的脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的另一个可替代的是将长的、非结构化的、柔性富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)与突变蛋白的N-末端或C-末端融合。国际专利公开文本号WO 2007/038619中公开的此方法，例如也称为“rPEG”(重组PEG)。
如果将PEG用作缀合配偶体，则聚亚烷基二醇可以是取代的、未取代的、线性的或支链的。其也可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例是如国际专利公开文本号WO 99/64016、美国专利号6,177,074或美国专利号6,403,564中关于干扰素所述的PEG分子，或如对于其他蛋白(如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶)所述的PEG分子(Fuertges和Abuchowski,Journal of Controlled Release[控释杂志],1990)。这种聚合物(如PEG)的分子量可以从约300到约70,000道尔顿，包括，例如，具有约10,000、约20,000、约30,000、或约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇。此外，如例如美国专利号6,500,930或6,620,413所述，为了延长血清半衰期的目的，可将如HES的碳水化合物低聚物和聚合物与本披露的突变蛋白缀合。
此外，本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白可与可赋予本披露的脂质运载蛋白突变蛋白新特征(如酶活性或对其他靶的结合亲和力)的部分融合。合适融合配偶体的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白G的白蛋白结合结构域、蛋白A、抗体或抗体片段、低聚结构域或毒素。
特别地，可以将本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白与单独的酶活性位点融合，使得所得融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定治疗靶。可将脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域附接至致病靶，从而允许酶结构域消除该靶的生物功能。
本披露还涉及核酸分子(DNA和RNA)，该核酸分子包括编码本披露的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列。由于遗传密码子的简并性允许指定相同氨基酸的其他密码子置换某些密码子，因此本披露不局限于编码如本文所述脂质运载蛋白突变蛋白的特定核酸分子，而是涵盖包括编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的全部核酸分子。在这一方面，本披露提供核苷酸序列，该核苷酸序列编码如SEQ ID NO:29-50、71-84、和96-106所示的本披露的一些脂质运载蛋白突变蛋白。
在根据本披露的方法的另一个实施例中，首先使编码hTlc的核酸分子在hTlc(SEQID NO:1)的线性多肽序列的氨基酸序列位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、152-154、和157中一个或多个处经受诱变。第二，使编码人泪液脂质运载蛋白的核酸分子还在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置101、111、114和153中一个或多个处经受诱变。
本披露还包括编码本披露脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其在实验诱变的指定序列位置之外包含另外的突变。此类突变通常是耐受的或甚至可证明是有利的，例如如果这些突变有利于所述突变蛋白的改善的折叠效率、血清稳定性、热稳定性、配制稳定性、或配体结合亲和力。
本申请披露的核酸分子可以“可操作地连接”至一个或多个调节序列以允许该核酸分子的表达。
如果核酸分(如DNA)包括含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且此类序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列的话，核酸分子被称为“能够表达核酸分子”或“能够允许核苷酸序列的表达”。可操作的连接是这样的连接：其中调节序列元件和待表达的序列以使基因能够表达的方式相连接。基因表达需要的调节区域的确切性质可能在物种间变化，但一般来说这些区域包括启动子，在原核生物中，该启动子既含有启动子本身(即指导转录启动的DNA元件)，又含有当转录成RNA时发出翻译启动信号的DNA元件。此类启动子区域通常包括参与转录和翻译启动的5'非编码序列，如-35/-10盒以及原核生物中的SD(Shine-Dalgarno)元件或者真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5'-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏元件以及用于将天然多肽靶向宿主细胞特定隔室的被翻译信号和前导序列。
此外，3'非编码序列可以含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞内没有令人满意的功能，那么它们可能被该细胞中有功能的信号置换。
因此，本披露的核酸分子可以包括调节序列，如启动子序列。在一些实施例中，本披露的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是，例如，tet启动子，lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例有SV40启动子或CMV启动子。
本披露的核酸分子也可以是载体或任何其他类型的克隆载体(如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体)的部分。
在一个实施例中，核酸分子包含在质粒中。质粒载体指编码融合至目的cDNA的温和噬菌体(如M13或f1)基因间区域或其功能部分的载体。用这样的噬菌粒载体和合适的辅助噬菌体(例如，M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，由此使得能够将编码的异源cDNA物理偶联至在噬菌体表面上展示的其相应多肽(Lowman,Annu Rev Biophys Biomol Struct[生物物理学与生物分子结构年鉴],1997；Rodi和Makowski,Curr Opin Biotechnol[当前生物技术观点],1999)。
除上文描述的调节序列和编码如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列以外，此类克隆载体可以包括源自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予被转化或转染的细胞可选择表型的选择标记物。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并可商购获得。
可将编码如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子，特别是含有这种突变蛋白的编码序列的克隆载体，转化到能够表达该基因的宿主细胞中。可以使用标准技术进行转化。因此，本披露还涉及含有如本文披露的核酸分子的宿主细胞。
在适于表达编码本披露融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，或者是真核细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
本披露还涉及用于产生如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的方法，其中通过遗传工程方法，从编码该突变蛋白的核酸开始产生该突变蛋白、该突变蛋白的片段或该突变蛋白与另一多肽(如，另一脂质运载蛋白突变蛋白、或抗体、或抗体片段)的融合蛋白。该方法可以在体内进行，脂质运载蛋白突变蛋白可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从此宿主生物体或其培养物中分离。还可以在体外产生蛋白质，例如使用体外翻译系统。
在体内产生脂质运载蛋白突变蛋白时，通过重组DNA技术(如上文已概述)将编码突变蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体中。为此，首先使用已建立的标准方法，用克隆载体转化该宿主细胞，该克隆载体包括编码如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子。然后在允许表达该异源DNA并因而允许合成对应多肽的条件下培养该宿主细胞。之后，从细胞或培养基中回收该多肽。
在一些实施例中，本申请披露的核酸分子(如DNA)可以“可操作地连接”至本披露的另一核酸分子以允许本披露融合蛋白的表达。在这一方面，可操作的连接是这样的连接：其中第一核酸分子的序列元件和第二核酸分子的序列元件以使融合蛋白能够表达为单一多肽的方式相连接。
此外，在本披露的hTlc突变蛋白的一些实施例中，可以移除Cys 61和Cys 153之间天然存在的二硫键。因此，此类突变蛋白可以在具有还原性氧化还原环境的细胞隔室中产生，例如，在革兰氏阴性细菌的细胞质中。
在本披露的脂质运载蛋白突变蛋白包括分子内二硫键的情况下，可以优选的是，使用适合的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的外周胞质、在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中或在真核细胞的内质网腔中提供，并且这种氧化性环境通常有利于结构性二硫键的形成。
然而，还可以在宿主细胞(优选大肠杆菌)的胞液中产生本披露的突变蛋白。在这种情况下，该多肽能以可溶和折叠状态直接获得，也能以包涵体的形式回收，然后体外复性。其他选择为使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，其可以因而允许在胞液中形成二硫键(Venturi等人，J Mol Biol[分子生物学杂志],2002)。
然而，如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白可以不一定为仅通过利用基因工程生成或产生。而是，还可以通过化学合成或通过体外转录和翻译获得这种突变蛋白，该化学合成例如梅里菲尔德(Merrifield)固相多肽合成。例如可行的是，使用分子建模鉴定有希望的突变，体外合成包含这种突变的多肽并研究对于LAG-3的结合活性及其他所希望的性质(如稳定性)。用于固相和/或液相合成多肽/蛋白的方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer等人，Curr Pharm Biotechnol[当代药学生物技术],2004)。
在另一个实施例中，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可以使用本领域技术人员已知的成熟方法通过体外转录/翻译产生。
本领域技术人员将会理解用于制备本披露预期的、但其蛋白或核酸序列在本文中没有明确地披露的脂质运载蛋白突变蛋白的方法。作为一个概述，氨基酸序列的此类修饰包括，例如，通过引入某些限制性酶的切割位点对单个氨基酸位置进行定向诱变，以便简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，也可以引入这些突变以进一步提高脂质运载蛋白突变蛋白对其靶(如LAG-3)的亲和力。并且，如果必要，可以引入突变来调节突变蛋白的某些特征，如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶解性，或者降低聚集趋势。例如，可以将天然存在的半胱氨酸残基进行突变成其他氨基酸以防止形成二硫桥。
本文披露的脂质运载蛋白突变蛋白以及其衍生物可以类似于抗体或其片段用在许多领域。例如，该脂质运载蛋白突变蛋白可以用于以酶、抗体、放射活性物质或任何其他具有生物化学活性或确定的结合特征的基团进行标记。这样，它们各自的靶或其缀合物或融合蛋白可以被检测或者与它们接触。此外，本披露的脂质运载蛋白突变蛋白可以用于通过已建立的分析方法(如ELISA或蛋白质印迹)或通过显微术或免疫传感技术(immunosensorics)来检测化学结构。在这个方面，检测信号可以通过使用合适的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接产生，或者通过经由抗体对结合的突变蛋白进行免疫化学检测而间接产生。
对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图用于限制)，本披露的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本披露通过示例性实施例以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以使用本文所披露于其中的公开内容的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本披露的范围内。
本发明可以进一步通过以下项目表征：
项目1.一种脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以通过约250nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
项目2.如项目1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约50nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
项目3.如项目1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约3nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
项目4.如项目1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约0.1nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
项目5.如项目1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约0.05nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
项目6.如项目1-5中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例4中描述的表面等离子体共振分析确定所述Kd的值。
项目7.如项目1-7中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、152-154、和156-157处包含至少两个或更多个突变的氨基酸残基。
项目8.如项目1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置14、25-26、28、31-32、52、55、58、66、79、84、86、101、105-106、108、110、112-114、和121处包含至少一个突变的氨基酸残基。
项目9.如项目1-7中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-111、114、121、124、148-150、152-154、和156-157处进一步包含至少一个或多个突变的氨基酸残基。
项目10.如项目1-9中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在hTlc(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、16、44、46、63、65、69-70、73、80、84、89-90、93、96-98、113、124、148-150、152、154、和156-157处包含至少至少一个或多个突变的氨基酸残基。
项目11.如项目7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的两个或更多个：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Ser 14→Pro；Thr 16→Met；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys或Asp；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile或Leu；Asn 32→Asp、Met或Thr；Leu33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Lys 52→Arg；Val 53→Ala；Met 55→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe或Asp；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Ala 66→Asn；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr或Glu；Asp 80→Gly；His 84→Tyr或Leu；Val 85→Ala或Asp；Ala 86→Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser或Phe；Leu 105→Cys或Gly；His 106→Ala、Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Tyr或Thr；Val 110→Gly或Asn；Arg 111→Pro；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Trp或Ala；Lys 121→Thr；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro。
项目12.如项目7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Met或Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr或Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly或Asn；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr。
项目13.如项目7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Arg26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro。
项目14.如项目1-13中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约320nM或更低的EC50值结合LAG-3。
项目15.如项目14中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约10nM或更低的EC50值结合LAG-3。
项目16.如项目14中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约0.2nM或更低的EC50值结合LAG-3。
项目17.如项目14-16中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例5中描述的荧光激活细胞分选测量所述EC50值。
项目18.如项目1-17中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与人LAG-3和食蟹猴LAG-3(SEQ ID NO:1)两者交叉反应。
项目19.如项目1-18中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够干扰人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合。
项目20.如项目19所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例6中描述的荧光激活细胞分选分析干扰人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合的能力。
项目21.如项目1-20中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；和一个或多个以下氨基酸突变：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Leu 44→His；Gly46→Asp；Val 53→Ala；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro。
项目22.如项目1-20中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；和一个或多个以下氨基酸突变：Arg 26→Ser、Asp、Glu、或Ala；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Leu 56→Asp；His 84→Tyr或Leu；His 106→Glu、Lys、或Pro；Val 110→Asn；Gly 112→Val或Leu；Val 113→Ala或Leu。
项目23.如项目1-22中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys153→Ser；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Gly 46→Asp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Gly；Cys 153→Ser；在位置156与157之间插入Pro；
(c)Asp 7→Gly；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Arg 148→Trp；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；在位置156与157之间插入Pro；
(d)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；Tyr 97→His；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；在位置156与157之间插入Pro；
(e)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；Cys 153→Ser；
(f)Thr 16→Met；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ile 89→Ser；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；
(g)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Gln 149→Leu；Cys 153→Ser；在位置156与157之间插入Pro；
(h)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Lys 70→Arg；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；
(i)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；在位置156与157之间插入Pro；
(j)Ile 10→Phe；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；Val 93→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；
(k)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys153→Ser；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro；
(l)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；
(m)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(n)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(o)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Glu；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Val；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(p)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Leu；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(q)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(r)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ala；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Lys；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(s)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Asn；Gly 112→Met；Val 113→Ala；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(t)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；
(u)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Val 113→Leu；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；或(v)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Met；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr。
项目24.如项目1-22中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Ser 154→Ala；在位置156与157之间插入Pro；
(b)Ala 5→Thr；Gly 46→Asp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；Ser 150→Gly；在位置156与157之间插入Pro；
(c)Asp 7→Gly；Val 85→Asp；Arg 148→Trp；Thr 152→Pro；在位置156与157之间插入Pro；
(d)Ala 5→Thr；Val 53→Ala；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；Tyr 97→His；在位置156与157之间插入Pro；
(e)Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；Leu 124→Gln；
(f)Thr 16→Met；Leu 44→His；Lys 65→Glu；Ile 89→Ser；
(g)Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Gln 149→Leu；在位置156与157之间插入Pro；
(h)Lys 65→Glu；Lys 70→Arg；
(i)Ala 5→Thr；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；Ile 98→Val；在位置156与157之间插入Pro；
(j)Ile 10→Phe；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；Val 93→Glu；
(k)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；
(l)Arg 26→Glu；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val110→Gly；Gly 112→Met；
(m)Arg 26→Glu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Glu；Gly 112→Val；
(n)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；Gly112→Leu；
(o)Arg 26→Ser；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；Gly112→Met；
(p)Arg 26→Ala；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Lys；Val 110→Gly；Gly112→Met；
(q)Asn 32→Thr；His 106→Gln；Val 110→Asn；Gly 112→Met；Val 113→Ala；
(r)Arg 26→Gly；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Pro；Val110→Gly；Gly 112→Met；或
(s)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Leu；His 106→Gln；Val 110→Gly；Gly112→Met；Val 113→Leu。
项目25.如项目1-24中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列、或其片段或变体，该组由以下组成：SEQ ID NO:8-18和20-28。
项目26.如项目1-25中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与选自下组的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、或至少99％序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:SEQ ID NO:8-18和20-28。
项目27.如项目1-26中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与选自下组的化合物缀合，该组由以下组成：有机分子、酶标记、放射活性标记、着色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属络合物、金属、和胶体金。
项目28.如项目1-27中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，所述融合配偶体是蛋白质、蛋白质结构域、或肽。
项目29.如项目1-28中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，所述融合配偶体是抗体或抗体片段。
项目30.如项目1-29中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合。
项目31.如项目30所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述延长血清半衰期的化合物选自下组，该组由以下组成：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽、和白蛋白结合蛋白。
项目32.如项目31所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述聚亚烷基二醇分子是聚乙烯(PEG)或其活化的衍生物。
项目33.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列。
项目34.一种表达载体，所述表达载体包含如项目33所述的核酸分子。
项目35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如项目34所述的核酸分子。
项目36.一种产生如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白的方法，其中，通过基因工程方法从编码所述突变蛋白或其片段的核酸开始产生所述突变蛋白。
项目37.一种结合受试者中LAG-3的方法，所述方法包括应用一种或多种如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
项目38.一种在受试者中刺激免疫反应的方法，所述方法包括应用一种或多种如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
项目39.一种诱导受试者中T淋巴细胞增殖的方法，所述方法包括应用一种或多种如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
项目40.一种干扰受试者中人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合的方法，所述方法包括应用一种或多种如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
项目41.如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与表达II类主要组织相容性复合体(MHC)的细胞竞争结合人LAG-3。
项目42.如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，当在基本上如实例6中描述的荧光激活细胞分选分析测定中测量时，所述突变蛋白与表达II类主要组织相容性复合体(MHC)的细胞竞争结合人LAG-3。
项目43.一种药物组合物，所述药物组合物包含如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。
项目44.一种免疫缀合物或融合蛋白，所述免疫缀合物或融合蛋白包含与治疗剂连接的如项目1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白、或其片段。
项目45.如项目1-32中任一项所述的突变蛋白用于结合/检测LAG-3的用途，所述用途包括：
(a)使所述突变蛋白与怀疑含有LAG-3的测试样品接触，由此允许在所述突变蛋白与LAG-3之间形成复合物；以及
(b)通过合适的信号检测所述突变蛋白与LAG-3之间的所述复合物。
项目46.一种诊断试剂盒或分析试剂盒，所述诊断试剂盒或分析试剂盒包含如项目1-32中任一项所述的突变蛋白。
项目47.一种检测生物样品中LAG-3的存在的方法，所述方法包括使所述样品与如项目1-32中任一项所述的突变蛋白在允许形成所述突变蛋白与LAG-3的复合物的条件下接触。
项目48.如项目47所述的方法，所述方法进一步包括检测所述突变蛋白和LAG-3的所述复合物。
项目49.如项目47或48所述的方法，其中，从人中分离所述生物样品。
项目50.如项目47-49中任一项所述的方法，其中，所述样品包含体液。
V.实例
实例1：成熟文库(maturation library)的产生和特异性结合LAG-3的优化的突变蛋白的选择
[为了优化LAG-3-特异性突变蛋白，通过使用所选位置的偏差(biased)随机化或基于易错聚合酶链反应(PCR)的方法，基于突变蛋白SEQ ID NO:7和19产生文库。进行偏差设计使得对于每个所选择的位置，编码的氨基酸对应于在相应母本克隆中发现的氨基酸(概率为50％-70％)，而它可以是不同氨基酸(具有50％-30％的概率)。当N为靶位置数且B为偏差时，每个克隆最可能的交换次数为N×(1-B)。
基本上如所述(Kim等人,J Am Chem Soc[美国化学学会杂志],2009)，将产生的脂质运载蛋白突变蛋白高效克隆到噬菌粒载体中。采用噬菌体展示来选择具有改善的热稳定性和结合亲和力的优化的突变蛋白。与初始突变蛋白选择相比，进行了噬菌粒选择，其具有增加的严格性，并且涉及在升高的温度下的预孵育步骤和限制目标浓度等。
实例2：使用高通量ELISA筛选识别特异性结合LAG-3的突变蛋白
将单个菌落用于接种2x酵母菌提取物胰蛋白胨(2XYT)/Amp培养基并生长过夜(14-18h)至稳定期。随后，接种来自稳定期培养物的50μL 2xYT/Amp，并在37℃孵育3h，然后转移至22℃直至达到0.6-0.8的OD595。通过添加10μL补充有1.2μg/mL脱水四环素的2xYT/Amp诱导产生突变蛋白。将培养物在22℃孵育直到第二天。添加40μL在PBS/T中的5％(w/v)BSA并在25℃孵育1h之后，培养物准备用于筛选测定。
应用反向筛选形式，其中经由Strep-标签在涂覆了抗-Strep-标签抗体的微量滴定板上捕获突变蛋白，并且添加生物素化的LAG-3-Fc并经由Extravidin-辣根过氧化物酶(HRP(西格玛公司(Sigma))检测。
为了选择具有增加的亲和力和稳定性的突变蛋白，用以下进行筛选：i)降低的抗原浓度，ii)使用反向筛选形式，其中经由Strep-标签在涂覆了抗-Strep-标签抗体的微量滴定板上捕获突变蛋白，并且添加不同浓度的靶并经由Extravidin-HRP(西格玛公司)检测，以及部分地iii)在添加靶板之前，将筛选上清液在75℃孵育。
之后基于筛选的结果对克隆测序并且选择突变蛋白用于进一步表征。
实例3：突变蛋白的表达
在2XYT/Amp培养基中的大肠杆菌中表达所选择的突变蛋白(具有SA连接子的C-末端序列SAWSHPQFEK和Strep-标签II肽(WSHPQFEK))，以使用Strep-Tactin亲和层析和制备型尺寸排阻色谱(SEC)纯化表达后的突变蛋白。在SEC纯化后，将含有单体蛋白质的级分合并并使用分析型SEC再次分析。Strep-Tactin亲和层析和制备型尺寸排阻层析(SEC)后脂质运载蛋白突变蛋白的产率如表1所示，以及Strep-Tactin纯化后脂质运载蛋白突变蛋白的单体含量：
表1：突变蛋白的表达
实例4：通过表面等离子体共振(SPR)测定的突变蛋白结合人和食蟹猴LAG-3的亲和力
使用表面等离子体共振(SPR)测量本文公开的代表性脂质运载蛋白突变蛋白的结合动力学和亲和力。
使用Biacore T200仪器(GE医疗(GE Healthcare))通过表面等离子体共振(SPR)确定示例性脂质运载蛋白突变蛋白与huLAG-3-Fc(R&D系统公司)和cyLAG-3-Fc的结合。经由因子Xa切割位点和(G4S)3接头通过将食蟹猴LAG-3(cyLAG-3)的细胞外结构域与人IgG1Fc片段融合，产生来自食蟹猴(cyLAG-3-Fc)的重组LAG-3。
使用标准胺化学将抗-人IgG Fc抗体(GE医疗)固定在CM5传感器芯片上：使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化芯片上的羧基。随后，以5μL/min的流速应用10mM醋酸钠(pH)5中浓度为25μg/mL的抗-人IgG Fc抗体溶液(GE医疗)，直至达到9000-14000共振单位(RU)的固定水平。通过使1M乙醇胺溶液通过表面来封闭剩余未反应的NHS-酯。参考通道以类似的方式处理。随后，在HBS-EP+缓冲液中的0.25μg/mL的huLAG-3-Fc或1.5μg/mL的cyLAG-3-Fc被芯片表面的抗人IgG-Fc抗体以10μL/min流速捕获180s。
对于亲和力确定，在HBS-EP+缓冲液中制备每种突变蛋白的稀释液，并将其应用于制备的芯片表面。对于SEQ ID NO:19-28，应用100nM低至4nM(并且在一些情况下低至0.8nM)的浓度，并且对于SEQ ID NO:7和85-94，测量与人LAG-3的亲和力应用6nM低至0.5nM的浓度，而测量与食蟹猴LAG-3的亲和力测量应用8nM低至0.5nM的浓度。采用接触时间为180s、解离时间为1500或600s和流速为30μL/min来进行结合分析。所有的测量均在25℃进行。通过以10μL/min的流速注入3M MgCl2持续60s和10mM甘氨酸-HCl(pH 1.7)持续180s，然后通过采用运行缓冲液(HBS-EP+缓冲液)的另外洗涤以及120s的稳定时间来实现芯片表面的再生。还测试脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:3作为阴性对照。在蛋白测量之前，进行三个启动循环以用于调节目的。用Biacore T200评估软件(v2.0)评估数据。使用双重参考并将1:1的结合模型用于拟合原始数据。
针对SEQ ID NO:7和19以及针对SEQ ID NO:85-94、20-28、57、61、和63-68的优化的脂质运载蛋白突变蛋白的kon、koff和所得平衡解离常数(Kd)而确定的值总结在表2中。所有优化的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白以皮摩尔至低纳摩尔亲和力与人和食蟹猴LAG-3结合，并且优化后亲和力提高多达60倍。
表2：通过表面等离子体共振(SPR)确定的LAG-3特异性突变蛋白的动力学常数和亲和力。
实例5：与表达人和食蟹猴LAG-3的细胞结合的脂质运载蛋白突变蛋白的荧光激活细胞分选(FACS)分析
我们使用荧光激活细胞分选(FACS)研究来评估脂质运载蛋白突变蛋白SEQ IDNO:7、19-28、和85-94与用huLAG-3(CHO-huLAG-3)或cyLAG-3(CHO-cyLAG-3(稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的特异性结合。平行测定SEQ ID NO:3作为阴性对照。使用Flp-In系统(英杰公司(Invitrogen))，根据制造商的说明产生细胞系。将模拟转染的Flp-In CHO细胞作为阴性对照。
在补充有10％胎牛血清(FCS，英国百康公司(Biochrom))和500μg/mL潮霉素B(罗氏公司(Roth))的Ham's F12培养基(英杰公司)中维持转染的CHO细胞。根据制造商的说明，在标准条件(37℃，5％CO2气氛)下将细胞培养在细胞培养瓶中。为了分离贴壁细胞以用于传代培养或FACS实验，根据制造商的说明使用Accutase(PAA)。
为了进行该实验，用脂质运载蛋白突变蛋白孵育LAG-3-阳性和阴性Flp-In CHO细胞，并使用荧光标记的抗-hTlc抗体结合的突变蛋白，然后使用如此实例中描述的FACS分析检测信号。
将每孔5×104个细胞在含有5％胎牛血清的冰冷PBS(PBS-FCS)中预孵育1h。随后，脂质运载蛋白突变蛋白、阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:3)和基准抗LAG-3抗体(SEQ ID NO:5和6)的稀释系列(通常范围为1μM至0.01nM)添加至细胞，并在冰上孵育1小时。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，使用500xg离心，然后与用荧光染料Alexa 488(皮里斯公司(Pieris))标记的兔抗脂质运载蛋白抗体或用Alexa 488(英杰公司)标记的山羊抗人IgG抗体孵育30分钟。随后将细胞洗涤并使用intellicyt IQue流式细胞仪(Intellicyt)分析。通过门控表达LAG-3的CHO细胞并使用软件分析通过脂质运载蛋白突变蛋白与表达LAG-3的细胞结合产生的荧光数据，并使用Graphpad软件绘制并拟合所得到的几何荧光平均值。SEQ ID NO:7、19-28、和85-94生成的数据示于图2和表3。所有优化的LAG-3特异性突变蛋白(SEQ ID NO:85-94和20-28)显示与表达huLAG-3或cyLAG-3的CHO细胞的明显结合，其中EC50与基准抗体相当。与SEQ ID NO:7和19相比，大多数优化的突变蛋白展示较低的EC50值，这指示与亲本脂质运载蛋白突变蛋白相比改善了结合。对于大多数优化的突变蛋白，对人与食蟹猴LAG-3的结合亲和力之间的差异已经显著降低，这代表了潜在的药代动力学或药物安全性研究的优选特征。不结合LAG-3的阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:3)未显示任何结合(未示出)。在模拟转染的Flp-In CHO细胞上未检测到脂质运载蛋白突变蛋白的结合(未示出)。
表3.LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白和参考分子(基准抗LAG-3抗体，SEQ IDNO:5和6)与用huLAG-3或食蟹猴LAG转染的CHO细胞的结合。
实例6：脂质运载蛋白突变蛋白与表达II类MHC的细胞竞争结合人LAG-3的FACS分析。
为了评估给定脂质运载蛋白突变蛋白是否干扰LAG-3结合II类MHC阳性细胞上的II类MHC，利用竞争FACS实验。在该实验中，用II类MHC阳性人细胞系A375温育恒定浓度的人LAG-3-Fc融合体(huLAG-3-Fc，R&D系统公司)和系列稀释的每种脂质运载蛋白突变蛋白，并使用荧光标记的抗-IgG Fc抗体来检测细胞结合的huLAG-3-Fc。在此测定中，竞争性脂质运载蛋白突变蛋白干扰huLAG-3与其配体II类MHC的结合，导致huLAG-3-Fc与II类MHC阳性细胞系A375的结合降低。
将黑色素瘤细胞系A375维持在补充有10％胎牛血清(FCS，英国百康公司)的DMEM培养基(英杰公司)中。根据制造商的说明，在标准条件(37℃，5％CO2气氛)下将细胞培养在细胞培养瓶中。为了分离贴壁细胞以用于传代培养或FACS实验，根据制造商的说明使用Accutase(PAA实验室股份有限公司(PAA Laboratories GmbH))。
为了FACS测定，将每孔5×104个A375细胞在PBS-FCS中孵育1h，然后添加3nMhuLAG-3-Fc和范围为1μM至0.01nM的不同浓度的LAG-3-特异性脂质运载蛋白突变蛋白。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，重悬浮于PBS-FCS中并在冰上用藻红蛋白标记的抗-人IgGFc抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)孵育30min。随后将细胞洗涤并使用IntellicytIQue流式细胞仪(Intellicyt)分析。使用Forecyt软件分析通过huLAG-3-Fc结合A375细胞产生的荧光数据，并且将得到的几何荧光平均值针对huLAG-3-Fc最大结合归一化。使用Graphpad软件绘制并拟合huLAG-3-Fc结合的百分比。SEQ ID NO:7、19-28、和85-94的IC50值总结于表4中，并且图3提供了所选择的竞争结合曲线。数据显示所有优化的脂质运载蛋白突变蛋白与表达人II类MHC的细胞上的其配体II类MHC竞争结合huLAG-3。达到了这种实验的检测限，因此未观察到与亲本突变蛋白(如果有的话)相比优化的脂质运载蛋白突变蛋白的IC50的改善。不结合LAG-3的阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:3)未显示任何竞争。
表4：脂质运载蛋白突变蛋白与表达II类MHC的细胞上的其配体II类MHC竞争结合huLAG-3。
SEQ ID NO: IC<sub>50</sub>[nM]
7 0.22
85 0.38
86 0.78
87 0.32
88 1.4
89 0.58
90 0.25
91 0.39
92 0.23
93 0.29
94 0.41
19 1.2
20 1.7
21 0.68
22 1.11
23 0.63
24 1.01
25 0.3
26 0.54
27 0.39
28 0.55
5和6 0.28
实例7：脂质运载蛋白突变蛋白的热稳定性评估
为了测定脂质运载蛋白突变蛋白的作为整体稳定性的一般指标的熔融温度(Tm)，使用毛细管nanoDSC仪(CSC 6300，TA仪器公司(TA Instruments))以1℃/min扫描(25℃-100℃)PBS(Gibco公司)中1mg/mL的蛋白质浓度的LAG-3特异性突变蛋白。使用积分(integrated)Nano分析软件从所示的热分析图计算Tm。
所得示例性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:7、19-28、85-94、和67)的最大熔融温度以及熔融起始点列于下表5中。几乎全部脂质运载蛋白突变蛋白均具有60℃至80℃范围的Tm，这表明这些突变蛋白中的每一个均具有良好的整体稳定性。
表5：如通过nanoDSC测定的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的Tm和起始熔融温度
SEQ ID NO: T<sub>m</sub>[℃] 起始熔融[℃]
7 73和81 58
85 72 60
86 74 60
87 72 61
88 68 55
89 65 54
90 66和72 59
91 80 66
92 80 69
93 69和73 58
94 67 55
19 58和67 42
20 64和69 49
21 58和69 50
22 64 56
23 55和67 47
24 59和68 51
25 60和68 50
26 59和70 50
27 60和70 49
28 63和70 51
67 88 74
本文示例性描述的实施例可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所使用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除掉显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修饰可以在本发明请求保护的范围内。因此，应当理解的是，虽然这些实施例已通过优选的实施例和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修饰和变化，并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。落在总披露内容之内的更窄的种类和亚属的分类中的每个也形成了本发明中的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中去除任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本披露还由此以该马库什组中任何单独成员或成员亚组的形式描述。进一步的实施例将由以下的权利要求变得显而易见。
等效物：本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明这些具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在为下列权利要求所涵盖。本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本说明书中，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用并入本文。
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序列表
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<120> 对LAG-3具有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白
<130> LC19310007P
<150> EP17151945.7
<151> 2017-01-18
<160> 106
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr
1 5 10 15
Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn
35 40 45
Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val
50 55 60
Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
65 70 75 80
Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
85 90 95
Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly
100 105 110
Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu
115 120 125
Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile
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Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp
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<210> 2
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<212> PRT
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<222> ()..()
<223> LAG-3 Fc融合蛋白
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Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20 25 30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50 55 60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65 70 75 80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
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Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115 120 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130 135 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
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Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165 170 175
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Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
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Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
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Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
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Leu Pro Ala Gly His Leu Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys
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Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val
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Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
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Gly Arg Asp Pro Thr Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
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Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
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<223> Lag-3抗体重链
<400> 5
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Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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<400> 24
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaacat 240
gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300
ggccagggca ccccgaatag gatggcggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456
<210> 49
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60
agcggggaag atccggaatt gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gtgctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180
aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240
gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300
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gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456
<210> 50
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300
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gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
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<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
His His Leu Leu
1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 因子 Xa 切割位点
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Ile Glu Gly Arg
1
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> SA接头和 strep-标签 II 融合肽
<400> 53
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> Strep-标签 II 肽
<400> 54
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> (G4S)3 接头
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> cynoLAG-3 Fc融合蛋白
<400> 56
Pro Gln Pro Gly Ala Glu Ile Ser Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly His Pro Pro Val Pro Gly His Arg Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Tyr Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Thr
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Val
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Thr Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Ser Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Gln
180 185 190
Gly Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro His
195 200 205
Val Gly Pro Met Asp Ser Gly Leu Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Ala Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Ala Val Gly Thr Gln Ser Phe Leu
260 265 270
Thr Ala Lys Trp Ala Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Ala
275 280 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
290 295 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Ile Cys His Ile Arg Leu Gln Gly Gln Gln Leu
305 310 315 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
325 330 335
Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
340 345 350
Ser Gly Gln Glu His Phe Val Trp Ser Pro Leu Asn Thr Pro Ser Gln
355 360 365
Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu
370 375 380
Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu His Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser
405 410 415
Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Arg Ala Gly His Leu Ile Glu Gly Arg
420 425 430
Met Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
450 455 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465 470 475 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
485 490 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
500 505 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
515 520 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
530 535 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
645 650 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Ser Pro Gly Lys
675
<210> 57
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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Thr Ser Asp Gln Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
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Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
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Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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Thr Ser Asn Gln Gln Ile Gln Asn Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
Gly Lys Thr Asn Arg Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asn His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly
145 150
<210> 59
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 59
Thr Ser Arg Gln Arg Ile Gln Arg Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
Gly Lys Thr Arg Arg Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Arg His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly
145 150
<210> 60
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 60
Thr Ser Lys Gln Lys Ile Gln Lys Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
Gly Lys Thr Lys Arg Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Lys His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly
145 150
<210> 61
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 61
Thr Ser Asn Gln Gln Ile Gln Asn Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
Gly Lys Thr Asp Arg Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly
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<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 62
Thr Ser Asn Gln Gln Ile Gln Asn Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
Gly Lys Thr Asn Arg Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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<211> 152
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 63
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
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Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 64
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 66
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<400> 68
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<220>
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<222> ()..()
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 70
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Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
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Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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ctcatcccca ggcagagcga aaccagcgct ccaggg 456

Claims (54)

1.一种脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够以通过约250nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
2.如权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约50nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
3.如权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约3nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
4.如权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约0.1nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
5.如权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够以通过约0.05nM或更低的Kd测量的亲和力结合LAG-3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例4中描述的表面等离子体共振分析确定所述Kd的值。
7.如权利要求1-7中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、14、16、25-34、44、46、52-53、55-56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、84-86、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-114、121、124、148-150、和152-154处包含至少两个或更多个突变的氨基酸残基。
8.如权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置14、25-26、28、31-32、52、55、58、66、79、84、86、101、105-106、108、110、112-114、和121处包含至少一个突变的氨基酸残基。
9.如权利要求1-7中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65-66、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、110-111、114、121、124、148-150、152-154、和156-157处进一步包含至少一个或多个突变的氨基酸残基。
10.如权利要求1-7中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、16、26-34、44、46、53、56、58、60-61、63、65、69-70、73、79-80、85、89-90、93、96-98、101、105-106、108、111、114、124、148-150、152-154、和156-157处进一步包含至少一个或多个突变的氨基酸残基。
11.如权利要求1-10中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置5、7-8、10、16、44、46、63、65、69-70、73、80、84、89-90、93、96-98、113、124、148-150、152、和154处包含至少一个或多个突变的氨基酸残基。
12.如权利要求7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的两个或更多个：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Ser 14→Pro；Thr 16→Met；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys或Asp；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile或Leu；Asn 32→Asp、Met或Thr；Leu33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Lys 52→Arg；Val 53→Ala；Met 55→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe或Asp；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Ala 66→Asn；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr或Glu；Asp 80→Gly；His 84→Tyr或Leu；Val 85→Ala或Asp；Ala 86→Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser或Phe；Leu 105→Cys或Gly；His 106→Ala、Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Tyr 或Thr；Val 110→Gly或Asn；Arg 111→Pro；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Trp或Ala；Lys 121→Thr；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala。
13.如权利要求7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Asp、Glu、Ala、或Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Met或Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr或Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly或Asn；Gly 112→Met、Val、或Leu；Val 113→Ala或Leu；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr。
14.如权利要求7所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Arg26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；Cys 153→Ser；和Ser154→Ala。
15.如权利要求1-14中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约320nM或更低的EC50值结合LAG-3。
16.如权利要求15中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约10nM或更低的EC50值结合LAG-3。
17.如权利要求15中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述脂质运载蛋白突变蛋白以约0.2nM或更低的EC50值结合LAG-3。
18.如权利要求15-17中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例5中描述的荧光激活细胞分选测量所述EC50值。
19.如权利要求1-18中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与人LAG-3和食蟹猴LAG-3两者交叉反应。
20.如权利要求1-19中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白能够干扰人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合。
21.如权利要求20所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，通过基本上如实例6中描述的荧光激活细胞分选分析干扰人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合的能力。
22.如权利要求1-21中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；和一个或多个以下氨基酸突变：Ala 5→Thr；Asp 7→Gly；Glu 8→Gln；Ile 10→Phe；Thr 16→Met；Leu 44→His；Gly 46→Asp；Val 53→Ala；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Lys 70→Arg；Glu 73→Ala；Ala 79→Thr；Asp 80→Gly；Val 85→Ala或Asp；Ile 89→Ser或Asn；Arg 90→Ser；Val 93→Glu；His 96→Asn；Tyr 97→His；Ile 98→Val；Leu 124→Gln；Arg 148→Trp；Gln 149→Leu；Ser 150→Gly；Thr 152→Pro；和Ser 154→Ala。
23.如权利要求1-21中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu105→Gly；Lys 108→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；和一个或多个以下氨基酸突变：Arg 26→Ser、Asp、Glu、Gly、或Ala；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Leu 56→Asp；His 84→Tyr或Leu；His 106→Gln、Glu、Lys、或Pro；Val 110→Gly或Asn；Gly 112→Met、Val或Leu；Val113→Ala或Leu。
24.如权利要求1-23中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Gly 46→Asp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Gly；和Cys 153→Ser；
(c)Asp 7→Gly；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Arg 148→Trp；Thr 152→Pro；和Cys 153→Ser；
(d)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；Tyr 97→His；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；Cys 101→Ser；Leu105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Gln；和Cys 153→Ser；
(f)Thr 16→Met；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 44→His；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Ile 89→Ser；Cys 101→Ser；Leu105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(g)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Gln 149→Leu；和Cys 153→Ser；
(h)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Lys 70→Arg；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(i)Ala 5→Thr；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；Ile 98→Val；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(j)Ile 10→Phe；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；Val 93→Glu；Cys101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(k)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；和Ser 154→Ala；
(l)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(m)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(n)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(o)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Glu；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Val；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(p)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Leu；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(q)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(r)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ala；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Lys；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(s)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Asn；Gly 112→Met；Val 113→Ala；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(t)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Tyr；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Pro；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(u)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；His 84→Leu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Val 113→Leu；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；
(v)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Met；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；和Lys 121→Thr；或
(w)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Gln 149→Leu。
25.如权利要求1-23中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸突变组之一：
(a)Ala 5→Thr；Glu 8→Gln；Lys 65→Glu；Glu 69→Gly；Val 85→Ala；和Ser 154→Ala；
(b)Ala 5→Thr；Gly 46→Asp；Lys 65→Glu；Val 85→Ala；和Ser 150→Gly；
(c)Asp 7→Gly；Val 85→Asp；Arg 148→Trp；和Thr 152→Pro；
(d)Ala 5→Thr；Val 53→Ala；Lys 65→Glu；Ala 79→Thr；和Tyr 97→His；
(e)Glu 63→Asp；Val 85→Asp；Arg 90→Ser；His 96→Asn；和Leu 124→Gln；
(f)Thr 16→Met；Leu 44→His；Lys 65→Glu；和Ile 89→Ser；
(g)Glu 63→Asp；Lys 65→Glu；和Gln 149→Leu；以及
(h)Lys 65→Glu和Lys 70→Arg；
(i)Ala 5→Thr；Lys 65→Glu；Asp 80→Gly；Ile 89→Asn；和Ile 98→Val；
(j)Ile 10→Phe；Lys 65→Glu；Glu 73→Ala；Ile 89→Asn；和Val 93→Glu；
(k)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；
(l)Arg 26→Glu；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；
(m)Arg 26→Glu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Glu；和Gly 112→Val；
(n)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；和Gly112→Leu；
(o)Arg 26→Ser；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Gln；Val 110→Gly；和Gly112→Met；
(p)Arg 26→Ala；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Lys；Val 110→Gly；和Gly112→Met；
(q)Asn 32→Thr；His 106→Gln；Val 110→Asn；Gly 112→Met；和Val 113→Ala；
(r)Arg 26→Gly；Met 31→Leu；Asn 32→Thr；His 84→Tyr；His 106→Pro；Val 110→Gly；和Gly 112→Met；或
(s)Arg 26→Asp；Asn 32→Thr；His 84→Leu；His 106→Gln；Val 110→Gly；Gly 112→Met；和Val 113→Leu。
26.如权利要求1-25中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白的氨基酸序列在成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列的序列位置61和153处包含半胱氨酸残基。
27.如权利要求1-25中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列进一步包含以下突变的氨基酸残基中的一个或两个：Ala 5→Thr和Asp 12→Asn。
28.如权利要求1-25中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，与成熟人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO:1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列进一步包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Asp 7→Asn、Arg、或Lys；Glu 9→Gln、Arg、或Lys；Asp12→Asn或Arg；Glu 45→Arg；Asp 72→Asn、Arg、或Lys；Glu 73→Arg；Asp 80→Gly；和Asp95→Asn、Arg、或Lys。
29.如权利要求1-28中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列、或其片段或变体，该组由以下组成：SEQ ID NO:8-18、20-28、57-70、和85-95。
30.如权利要求1-28中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与选自下组的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、或至少99％序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:SEQ ID NO:8-18、20-28、57-70、和85-95。
31.如权利要求1-30中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与选自下组的化合物缀合，该组由以下组成：有机分子、酶标记、放射活性标记、着色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属络合物、金属、和胶体金。
32.如权利要求1-31中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，所述融合配偶体是蛋白质、蛋白质结构域、或肽。
33.如权利要求1-32中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，所述融合配偶体是抗体或抗体片段。
34.如权利要求1-33中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合。
35.如权利要求34所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述延长血清半衰期的化合物选自下组，该组由以下组成：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽、和白蛋白结合蛋白。
36.如权利要求35所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述聚亚烷基二醇分子是聚乙烯(PEG)或其活化的衍生物。
37.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列。
38.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求37所述的核酸分子。
39.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求38所述的核酸分子。
40.一种产生如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白的方法，其中，通过基因工程方法从编码所述突变蛋白或其片段的核酸开始产生所述突变蛋白。
41.一种结合受试者中LAG-3的方法，所述方法包括应用一种或多种如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
42.一种在受试者中刺激免疫反应的方法，所述方法包括应用一种或多种如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
43.一种诱导受试者中T淋巴细胞增殖的方法，所述方法包括应用一种或多种如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
44.一种干扰受试者中人LAG-3与II类主要组织相容性复合体(MHC)的结合的方法，所述方法包括应用一种或多种如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，或者一种或多种包含此类突变蛋白的组合物。
45.如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，所述突变蛋白与表达II类主要组织相容性复合体(MHC)的细胞竞争结合人LAG-3。
46.如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中，当在基本上如实例6中描述的荧光激活细胞分选测定中测量时，所述突变蛋白与表达II类主要组织相容性复合体(MHC)的细胞竞争结合人LAG-3。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。
48.一种免疫缀合物或融合蛋白，所述免疫缀合物或融合蛋白包含与治疗剂连接的如权利要求1-36中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白、或其片段。
49.如权利要求1-36中任一项所述的突变蛋白用于结合/检测LAG-3的用途，所述用途包括：
(a)使所述突变蛋白与怀疑含有LAG-3的测试样品接触，由此允许在所述突变蛋白与LAG-3之间形成复合物；以及
(b)通过合适的信号检测所述突变蛋白与LAG-3之间的所述复合物。
50.一种诊断试剂盒或分析试剂盒，所述诊断试剂盒或分析试剂盒包含如权利要求1-36中任一项所述的突变蛋白。
51.一种检测生物样品中LAG-3的存在的方法，所述方法包括使所述样品与如权利要求1-36中任一项所述的突变蛋白在允许形成所述突变蛋白与LAG-3的复合物的条件下接触。
52.如权利要求51所述的方法，所述方法进一步包括检测所述突变蛋白与LAG-3的所述复合物。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中，从人中分离所述生物样品。
54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中，所述样品包含体液。
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