CN107922470A - 对lag‑3和pd‑1特异性的新型融合多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供对免疫检查点PD‑1和LAG‑3特异性的融合多肽，其中所述融合多肽能够用于产生持久的抗‑肿瘤或抗‑感染响应。这种融合多肽可用于许多制药应用中，例如作为用于治疗或预防诸如各种肿瘤的人疾病的抗癌剂和/或免疫调节剂，或作为抗感染剂。本发明还涉及制备本文所述的融合多肽以及包含这种融合多肽的组合物的方法。本发明进一步涉及编码这种融合多肽的核酸分子和用于产生这种融合多肽和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这些融合多肽以及包含一种或多种这种融合多肽的组合物的治疗性和/或诊断性用途。

Description

对LAG-3和PD-1特异性的新型融合多肽

背景技术

淋巴细胞活化基因-3或LAG-3(也称为分化簇223或CD223)是免疫球蛋白超基因家族的一种膜蛋白。LAG-3在结构上和基因上与分化簇4(CD4)相关，其编码基因位于12号染色体短臂的远侧部分，临近CD4基因，这表明LAG-3基因可能通过基因重复进化(Triebel等人，J Exp Med，1990)。LAG-3在静息的外周血淋巴细胞上不表达而在活化的T细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达(Triebel等人，J Exp Med，1990)，且已报道其还在活化的B细胞(Kisielow等人，Eur J Immunol，2005)和浆细胞样树突状细胞(Workman等人，J Immunol，2009)上表达。

与CD4类似，LAG-3与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子结合，但其以CD4两倍高的亲和力且在不同结合位点处结合(Huard等人，Proc Natl Acad Sci，1997)。通过LAG-3在树突状细胞上的MHC II类接合导致了树突状细胞的细胞因子和趋化因子情况(profile)的变化(Buisson和Triebel，Vaccine，2003)。此外，已报道LAG-3引发树突状细胞成熟，这由这些细胞产生白细胞介素12(IL-12)和组织坏死因子α(TNF-α)以及树突状细胞刺激异基因(allogeneic)T-细胞的增殖和干扰素γ(IFN-γ)响应的能力的增加来证明(Andreae等人，J ImmunoI，2002)。已报道LAG-3信号传导和MHC II类交联抑制人分化簇4阳性(CD4⁺)和分化簇8阳性(CD8⁺)T细胞初级活化的早期事件(Macon-Lemaitre和Triebel，Immunology，2005)。LAG-3负调节T细胞的细胞增殖、活化和内环境稳态。

因此，与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)类似，LAG-3为抑制性免疫受体。在基于敲除小鼠和靶特异性抗体的研究中，特别是与PD-1结合，LAG-3作为T细胞响应的负调节剂的突出作用已得到了令人印象深刻的证明(Woo等人，Cancer Res，2012)。在该研究中，双重抗-LAG-3/抗-PD-1抗体疗法治愈了大多数已建立肿瘤的小鼠，所述小鼠对单一抗体疗法有很大抗性。此外，LAG-3/PD-1双敲除小鼠显示了显著增加的存活和多种可移植肿瘤的清除。双敲除小鼠极易发生致死性自身炎症(autoinflammation)这一事实，为PD-1和LAG-3作为抑制性免疫检查点的强大组合作用提供了另外的实验支持。

程序性细胞死亡蛋白1，或PD-1(也称为分化簇279或CD279)是分化簇28(CD28)基因家族的成员并在活化的T、B和髓系细胞上表达(Sharpe等人，Nat Immunol，2007；Greenwald等人，Annu Rev Immunol，2005)。PD-1与两个配体，程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)相互作用。这些配体与PD-1的相互作用在通过局部限制过度活化的T细胞而下调免疫系统中起重要作用，这继而防止了自身免疫且维持了正常组织中感染或炎症期间的外周耐受。

PD-1负调节T细胞活化，并且PD-1对T细胞活化的抑制作用与其胞质结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)相关(Greenwald等人，Annu Rev Immunol，2005；Parry等人，Mol Cell Biol，2005)。破坏PD-1的这种抑制作用可导致自身免疫。另一方面，在许多病理情况下，PD-1的持续负向信号(negative signal)已牵涉T细胞功能障碍，比如慢性病毒感染和肿瘤免疫逃避。

在许多癌症中，PD-1由与宿主抗肿瘤免疫性相关的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表达(Galon等人，Science，2006)。多种证据表明，TIL受PD-1抑制性调节，和抗肿瘤免疫性由PD-1/PD-L1信号传导调节。第一，在许多人和小鼠肿瘤系中证实了PD-L1的表达，并且该表达在体外可进一步通过IFN-γ上调(Dong等人，Nat Med，2002)。第二，肿瘤细胞PD-L1的表达与其对抗肿瘤T细胞体外溶解的抗性直接相关(Dong等人，Nat Med，2002；Blank等人，CancerRes，2004)。第三，PD-1敲除小鼠对肿瘤攻击具有抗性(Iwai等人，Int Immunol，2005)且当过继转移至荷瘤小鼠时，来自PD-1敲除小鼠的T细胞在肿瘤排异中高度有效(Blank等人，Cancer Res，2004)。第四，通过单克隆抗体阻断PD-1抑制信号可以增强小鼠的宿主抗肿瘤免疫性(Iwai等人，Int Immunol，2005；Hirano等人，Cancer Res，2005)。第五，肿瘤中PD-L1的高度表达(通过免疫组织化学染色检测)与许多人类癌症类型的不良预后相关(Hamanishi等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2007)。

因此，本领域存在对新化合物的需求，该化合物可以调节LAG-3⁺淋巴细胞(比如T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞)的响应并同时缓解这种淋巴细胞的PD-1抑制性调节。这样的组合在治疗或预防癌症、器官移植排异或治疗自身免疫性或自身炎性疾病中可具有重要用途。对此，本发明提供一组结合LAG-3和PD-1的新型蛋白，由此调节免疫响应。

发明内容

定义

以下所列定义了在本说明书中使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。

如本文所使用，除另有规定外，“LAG-3”是指人LAG-3(huLAG-3)并包括人LAG-3的变体、同种型和物种同源物。LAG-3也称为“淋巴细胞活化基因3”、“分化簇223”或“CD223”，它们可互换使用。人LAG-3意指由UniProt P18627(2009年7月7日的版本5)定义的全长蛋白、其片段或其变体。人LAG-3由LAG3基因编码。

如本文所使用，除另有规定外，术语“PD-1”意指人PD-1(hPD-1)并包括人PD-1的变体、同种型和物种同源物。PD-1也称为“程序性细胞死亡蛋白1”、“分化簇279”或“CD279”，它们可互换使用。人PD-1意指由UniProt Q15116定义的全长蛋白、其片段或其变体。人PD-1由PDCD1基因编码。

如本文所使用，“可检测的亲和力”是指以通常通过至多约10^-5M或以下(更低的K_d或EC₅₀值反映更好的结合活性)的K_d或EC₅₀量度的亲和力常数结合选定靶标的能力。不再能通过常规方法例如ELISA(酶联免疫吸附试验)测量的更低的亲和力是次要的。

如本文所使用，可以通过本领域技术人员已知的多种方法测量本发明的蛋白(如，脂质运载蛋白突变蛋白或抗体)或其融合多肽与一种或多种选定靶标(在本发明中为LAG-3和/或PD-1)的“结合亲和力”(并由此可以测定突变蛋白-配体复合物的K_d值)。这种方法包括但不限于，荧光滴定、竞争ELISA、比如等温滴定量热法(ITC)的量热法和表面等离子体共振(SPR)。这样的方法在本领域中是熟知的，并且其实例也在下文详述。

还注意到，相应结合剂与其配体之间的复合物的形成受许多不同因素的影响，比如各自结合配偶体的浓度、竞争者的存在、所采用的缓冲系统的pH和离子强度以及用于测定解离常数K_d的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离子体共振，仅举几个例子)，或甚至用于评估实验数据的数学算法。

因此，本领域技术人员也清楚K_d值(相应结合剂与其靶标/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在某个实验范围内变化，这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着，所测得的K_d值可能会有轻微的偏差或公差范围，例如，取决于该K_d值是通过表面等离子体共振(SPR)、竞争ELISA、直接ELISA、还是其它方法测定的。

如本文所使用，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白质或核酸)或“突变体”是指与天然存在(野生型)的核酸或蛋白的“参考”骨架相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。所述术语还包含如本文所述的突变蛋白的片段和变体。优选地，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白、其片段或变体具有如本文所述的结合LAG-3的功能。

如本文所使用的与本发明的突变蛋白有关的术语“片段”涉及N-末端和/或C-末端缩短的(即缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的至少一个)源自全长成熟人泪液脂质运载蛋白(hTlc或hTLPC)的蛋白质或肽。这种片段可缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达10个、多达15个、多达20个、多达25个或多达30个(包括之间的所有数字)。作为示例性实例，这种片段可缺少4个N-末端和2个C-末端氨基酸。应理解，所述片段优选为全长泪液脂质运载蛋白(突变蛋白)的功能性片段，这意味着该片段优选包含其所源自的全长泪液脂质运载蛋白(突变蛋白)的结合口袋。作为示例性实例，这种功能性片段可包含天然成熟hTlc的线性多肽序列的至少氨基酸7-153。这种片段可包括成熟脂质运载蛋白一级序列的至少10个、更多比如20或30个或者更多个连续氨基酸，并且通常在成熟脂质运载蛋白的免疫实验中可检测到。一般而言，如本文中关于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本发明的组合或本文所述的融合蛋白的相应蛋白配体LAG-3所使用的术语“片段”涉及N-末端和/或C-末端缩短的蛋白或肽配体，其保留了全长配体被根据本发明的突变蛋白识别和/或结合的能力。

如本文所使用的术语“诱变”是指，选择实验条件，以使得天然存在于成熟脂质运载蛋白给定序列位置处的氨基酸可被至少一个不存在于相应天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸置换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而(另外的)改变序列区段的长度。因此，以下情况在本发明的范围内：例如，一个在选定序列位置处的氨基酸被三个随机突变的延伸段(stretch)替代，从而相比于野生型蛋白相应区段的长度，导致两个氨基酸残基的插入。这样的插入或缺失可以彼此独立地引入在本发明中可以进行诱变的任何肽区段中。在本发明的一个示例性实施方案中，几个突变的插入可以引入到选定的脂质运载蛋白骨架的AB环中(参见以全文引用并入本文的国际专利公开文本No.WO 2005/019256)。

术语“随机诱变”指无预定的单个氨基酸(突变)存在于某个序列位置处，而是至少两个氨基酸可以在诱变期间以某概率掺入在预限定的序列位置处。

“同一性”是衡量序列的相似性或关系的序列特性。如本发明所用的术语“序列同一性”或“同一性”是指在本发明多肽序列与所讨论的序列(同源性)比对之后，相对于这两个序列中较长一个的残基数量的配对相同残基的百分比。通过将相同氨基酸残基的数量除以残基总数再使结果乘以100来量度序列同一性。

如本文所使用的术语“同源性”是其一般含义，并包括相同氨基酸以及认为是在本发明的多肽(如本发明的任意脂质运载蛋白突变蛋白)线性氨基酸序列中的等同位置处的保守置换的氨基酸(例如天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)。

可以采用例如程序BLASTP，blastp 2.2.5版(2002年11月16日)(参见Altschul等人，Nucleic Acids Res，1997)测定序列同源性或序列同一性百分比。在本实施方案中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对(矩阵：BLOSUM 62；间隙罚分：11.1；截止值设置为10^-3)，优选地在配对比较中使用野生型蛋白骨架作为参考。作为BLASTP程序输出的结果表示的“阳性”(同源氨基酸)数除以程序选定的用于比对的氨基酸总数来计算百分比。

具体而言，为了确定脂质运载蛋白(突变蛋白)氨基酸序列的氨基酸残基是否与对应于野生型脂质运载蛋白氨基酸序列中的某一位置的野生型脂质运载蛋白不同，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用计算机程序例如BLAST 2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任意适用于产生序列比对的其它合适程序进行比对。因此，脂质运载蛋白的野生型序列可作为“受试序列”或“参考序列”，而本文所述的与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。本文中术语“野生型序列”和“参考序列”和“受试序列”可互换使用。优选地，脂质运载蛋白的野生型序列是示于SEQ ID NO：1的hTlc序列。

“间隙”是添加或缺失氨基酸所导致的比对中的空间。因此，两份完全相同的序列具有100％的同一性，但较不高度保守且具有缺失、添加或替换的序列可能具有较低程度的序列同一性。本领域技术人员将会认识到，可以得到数个计算机程序，以用来使用标准参数测定序列同一性，例如BLAST(Altschul等人，Nucleic Acids Res，1997)、BLAST2(Altschul等人，J Mol Biol，1990)和Smith-Waterman(Smith和Waterman，J Mol Biol，1981)。

如本发明中使用的术语“变体”涉及包含氨基酸序列修饰的蛋白质或肽的衍生物，所述氨基酸序列修饰例如通过置换、缺失、插入或化学修饰进行。在一些实施方式中，这些修饰不会降低蛋白质或肽的功能。这种变体包括蛋白质，其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或除天然存在的20个氨基酸外的氨基酸(比如，例如，鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸，高丝氨酸，羟赖氨酸、戊氨酸)替换。然而，这样的置换也可以是保守的，即氨基酸残基被替代为化学相似的氨基酸残基。保守置换的实例为以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。如本文中关于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或根据本发明的组合和/或融合蛋白的相应蛋白靶标LAG-3和/或PD-1所使用的术语“变体”涉及分别与野生型LAG-3或PD-1蛋白(比如如本文所述的以SwissProt/UniProt保存的LAG-3或PD-1参考蛋白)相比分别具有一个或多个(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多个)氨基酸置换、缺失和/或插入的LAG-3和/或PD-1或其片段。LAG-3或PD-1变体与野生型人LAG-3或PD-1(比如如本文所述的以SwissProt/UniProt保存的LAG-3或PD-1参考蛋白)分别具有优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性。

脂质运载蛋白的“天然序列”意指与源自自然界的相应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白的序列。因此，天然序列脂质运载蛋白可以具有来自任何生物体，特别是哺乳动物的相应天然存在的脂质运载蛋白的氨基酸序列。这种天然序列多肽可以从自然界中分离或者可以通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如替代地，脂质运载蛋白的剪接形式和天然存在的等位基因变体)。多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约50％、60％、70％、80％或至少约85％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这种变体包括，例如，在多肽的N-或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽具有至少约70％，包括至少约80％，比如至少约85％的氨基酸序列同一性，包括至少约90％的氨基酸序列同一性或至少约95％的氨基酸序列同一性。作为示例性实例，可以在本发明的hTlc突变蛋白中使前4个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu)和最后2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp)缺失而不影响该蛋白的生物功能，如SEQ ID NOs：13-28。

当根据本发明使用时，术语“位置”意指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。为了理解如本文中在一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列位置的上下文中使用的术语“对应”或“相应”，相应位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量决定。因此，由于在(突变体或野生型)脂质运载蛋白的其它位置处的氨基酸缺失或添加，则可被置换的根据本发明的给定氨基酸的位置可能改变。类似地，由于在突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子))的其它位置处的核苷酸缺失或添加，则可被置换的根据本发明的给定核苷酸的位置可能改变。

因此，对于根据本发明的“相应位置”，优选地理解，核苷酸/氨基酸的位置在指定数字方面可以不同于类似的相邻核苷酸/氨基酸，但是所述一个或多个“相应位置”仍包含可被交换、缺失或添加的所述相邻核苷酸/氨基酸。

此外，对于基于根据本发明的参考序列的脂质运载蛋白突变蛋白中的相应位置，优选地理解，核苷酸/氨基酸的位置在结构上对应于(突变体或野生型)脂质运载蛋白中的其它位置，尽管这些位置在指定数字方面可能不同，如技术人员鉴于脂质运载蛋白之间高度保守的整体折叠形式所理解地。

术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，比如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。

如本文针对非天然靶标使用的术语“有机分子”或“小有机分子”表示这样的有机分子，其包含至少两个碳原子，但是优选地包含不超过7或12个可旋转碳键，具有100到2,000道尔顿、优选地100到1,000道尔顿的分子量范围，且任选地包含一个或两个金属原子。

如本文所使用的词“检测/可检测的”理解为在定量和定性水平上以及它们的组合。从而其包括目标分子的定量、半定量和定性测量。

“受试者”是脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。如本文所使用的术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农用动物以及动物园、运动或宠物动物，比如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、如食蟹猕猴(cynomolgous monkey)的猿等等，仅举几个示例性实例。优选地，本文所述“哺乳动物”是人。

“有效量”是足够实现有益或者所希望的结果的量。可以在一次或多次施用中施用有效量。

将“样品”定义为从任何受试者中采集的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织。

将本文公开的融合多肽的“亚基”定义为该多肽的一段(stretch)氨基酸，该段(stretch)定义所述多肽的独特功能单元，比如提供朝向靶标的结合基序。

如本文所述的“融合多肽”包含两个或更多个亚基，这些亚基中至少一个结合LAG-3，和另一个亚基结合PD-1。在该融合多肽中，这些亚基可通过共价或非共价接合(linkage)连接。优选地，所述融合多肽是两个或更多个亚基之间的翻译融合物。该翻译融合物可以通过使一个亚基的编码序列在与另一个亚基的编码序列的阅读框内基因工程化产生。两个亚基被编码连接子的核苷酸序列散布(interspersed)。然而，本发明的融合多肽的亚基也可通过化学连接子连接。

可由本发明所述的融合多肽包含的“连接子”连接两个或更多个如本文所述融合多肽的亚基。所述接合(linkage)可以是共价或非共价的。一种优选的共价接合(linkage)是通过肽键，比如氨基酸之间的肽键。因此，在优选的实施方案中，所述连接子包含一个或多个氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。本文描述了优选的连接子。其它优选的连接子是化学连接子。

附图说明

图1：提供了本申请中描述的代表性融合多肽的设计概述，所述融合多肽是对靶标PD-1和LAG-3双特异性的，或是对LAG-3单特异性的。基于对PD-1特异性的抗体(如SEQ IDNos：3和4的抗体)和对LAG-3特异性的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)制备图1 a-e的代表性双特异性融合多肽。如图1所示，将脂质运载蛋白突变蛋白基因融合至PD-1特异性抗体的重链或轻链的C-或N-末端，得到SEQ ID NOs：5和4、SEQ ID NOs：9和4、SEQ ID NOs：6和4、SEQ ID NOs：10和4、SEQ ID NOs：3和7、SEQ ID NOs：3和11、SEQ ID NOs：3和8以及SEQ IDNOs：3和12的融合多肽。通过将SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白基因融合至SEQ ID NO：3的Fc部分的C-末端制备LAG-3单特异性融合多肽，分别得到SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。图1 a-e示出了可采用对PD-1特异性的不同抗体(如SEQ ID NOs：47和48)和对LAG-3特异性的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)制备的其它代表性融合多肽。如图1所示将脂质运载蛋白突变蛋白基因融合至PD-1特异性抗体的重链或轻链的C-或N-末端以得到SEQ ID NOs：51和48、SEQ ID NOs：55和48、SEQ ID NOs：52和48、SEQ ID NOs：56和48、SEQ ID NOs：47和53、SEQ ID NOs：47和57、SEQ ID NOs：47和54以及SEQ ID NOs：47和58的融合多肽。图1 f-i另外地示出了其它融合多肽的设计及这些多肽的相应序列，其中这些多肽基于对PD-1特异性的抗体(如SEQ ID NOs：3和4的抗体或SEQID NOs：47和48的抗体)和一种或多种对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ IDNO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)制备。

图2：示出了酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果，其中测定了代表性融合多肽、基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)和阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：43)与PD-1的结合。将重组人PD-1-His(具有C-末端聚组氨酸标签的PD-1)涂布在微量滴定板上，并用250nM的最高浓度和1：3的稀释系列开始滴定测试的试剂(融合多肽、基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)和阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：43))。如实施例2所述通过抗-人IgG Fc抗体检测研究中结合的样品。使用1∶1结合模型拟合数据，其中EC₅₀值和最大信号作为自由参数，斜率固定为1。图2A示出了具有SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽的结果，和图2B示出了具有SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽的结果。所得到的EC₅₀值在表2中提供。

图3：示出了ELISA实验的结果，其中测定了代表性融合多肽、基准抗体(SEQ IDNOs：3和4)和LAG-3结合脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NOs：17和27)和不结合LAG-3的阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：43)与LAG-3的结合。将人LAG-3-His(具有C-末端聚组氨酸标签的LAG-3)涂布在微量滴定板上，并用250nM的最高浓度开始滴定测试的试剂。如实施例3所述通过抗-Tlc抗体或通过抗-人-IgG-Fc抗体检测所研究的结合的试剂。使用1∶1结合模型拟合数据，其中EC₅₀值和最大信号作为自由参数，斜率固定为1。图3A和3C示出了分别由抗-Tlc抗体和抗-人-IgG-Fc抗体检测的具有SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽的结果。图3B和3D示出了分别由抗-Tlc抗体和抗-人-IgG-Fc抗体检测的具有SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽的结果。所得到的EC₅₀值在表3中提供。

图4：示出了如实施例4所述，为了评估融合多肽分别与哺乳动物细胞上表达的人PD-1(图4A)或人LAG-3(图4B)的特异性结合而实施的荧光激活细胞分选(FACS)研究的结果。hIgG4(Sigma)和SEQ ID NO：43的阴性对照组合显示无结合。将荧光强度的几何平均值针对最大平均值归一化并使用1∶1结合模型拟合。所得到的EC₅₀值在表4中提供。

图5：证明了ELISA实验的结果，其中测定了代表性融合多肽同时结合靶标PD-1和LAG-3的能力。将重组PD-1-His涂布在微量滴定板上，然后用250nM的最高浓度开始滴定该融合多肽。随后，加入恒定浓度的生物素化的人LAG-3-Fc，其如实施例5所述通过碱性磷酸酶(extravidin)检测。图5A示出了具有SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽以及SEQ ID NOs：3和4的针对PD-1的基准抗体的结果，和图5B示出了具有SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白的融合多肽以及SEQ ID NOs：3和4的针对PD-1的基准抗体的结果。

图6：示出了如实施例6所述进行的竞争FACS研究中所示，融合多肽与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子(LAG-3的天然配体)竞争结合LAG-3。用MHC II类阳性人细胞系A375温育恒定浓度的人LAG-3-Fc融合物(融合人IgG1 Fc片段的人LAG-3胞外结构域)和融合多肽或对照的稀释系列。采用荧光标记的抗-IgG Fc抗体检测细胞结合的huLAG-3-Fc。观察到LAG-3和PD-1双特异性抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽或LAG-3单特异性Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽对huLAG-3-Fc结合MHC II类分子的剂量依赖性抑制。

图7：示出了代表性实验的结果，其中研究了SEQ ID NOs：5和4的融合多肽诱导T细胞活化的能力。还测试了基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)以及基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)和Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽(SEQ ID NO：41)的混合物(cocktail)。在该实验中，以两个不同的浓度的融合多肽或对照温育葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)。如实施例7所述，通过基于电化学发光分析作为T细胞活化读数测定反映T细胞活化的分泌的白细胞介素2(IL-2)的水平。

图8：示出了代表性实验的结果，其中研究了SEQ ID NOs：5和4的融合多肽诱导T细胞活化的能力。还测试了基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)以及基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)和Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽(SEQ ID NO：41)的混合物(cocktail)。在该实验中，将黑素瘤A375细胞涂布并使其粘附过夜。第二天，在不同浓度的双特异性融合多肽和对照存在下于涂布的细胞上温育用植物凝集素(PHA)预处理的纯化的T细胞。如实施例8所述，通过基于电化学发光的分析测定反映T细胞活化的上清干扰素γ(IFN-γ)的水平。

具体实施方式

在一些实施方案中，所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，(1)包含对PD-1特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域的第一亚基，和(2)包含对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的第二亚基。

在一些实施方案中，所述融合多肽还包含第三亚基。例如，所述多肽可包含对LAG-3特异性的第三亚基。在一些实施方案中，所述第三亚基包含对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。例如，两个脂质运载蛋白突变蛋白可融合至免疫球蛋白亚基，一个在该免疫球蛋白的C-末端，和一个在N-末端。在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白可融合至免疫球蛋白的重链或轻链。

在一些实施方案中，基本上如图1所述，一个亚基可连接至另一个亚基。例如，一个脂质运载蛋白突变蛋白可通过肽键连接至免疫球蛋白重链结构域(VH)的C-末端、VH的N-末端、免疫球蛋白轻链(VL)的C-末端和/或VL的N-末端(图1)。在一些特别的实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基在其N-末端和/或其C-末端可融合至免疫球蛋白亚基。例如，所述脂质运载蛋白突变蛋白可通过肽键在免疫球蛋白重链恒定区(CH)的C-末端或轻链恒定区(CL)的C-末端连接。在一些进一步的实施方案中，所述肽键可以是连接子，优选地是非结构性的(G₄S)₃连接子，例如，如SEQ ID NO：19所示。所述连接子可具有1至50个氨基酸，比如1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。

在这一方面，一个亚基可在其N-末端和/或其C-末端与另一个亚基融合。例如，当一个亚基包含全长免疫球蛋白时，可以通过第二亚基的N-末端和所述免疫球蛋白重链恒定区(CH)的C-末端之间的肽键连接另一个亚基。在一些进一步的实施方案中，可以通过第三结合结构域的N-末端和所述免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的C-末端之间的肽键连接第三亚基。在一些又进一步的实施方案中，所述肽键可以是连接子，优选地是非结构性的(G₄S)₃连接子，例如，如SEQ ID NO：2所示。

在一些本发明的融合多肽的实施方案中，该多肽的亚基中的一个包含全长免疫球蛋白，所述多肽同时结合(engaging)PD-1和LAG-3，同时可保留全长免疫球蛋白的Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。

在另一些本发明的融合多肽的实施方案中，该多肽的亚基中的一个包含全长免疫球蛋白，所述多肽同时结合(engaging)PD-1和LAG-3，通过蛋白质工程化可降低或完全抑制全长免疫球蛋白的Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。这可以通过，例如将IgG1骨架转换为IgG4实现，因为与IgG1相比已知IgG4显示降低的Fc-γ受体相互作用。为了进一步降低与Fc-γ受体的残余结合(residual binding)，可以将如F234A和L235A的突变引入IgG4骨架。此外，可将S228P突变引入IgG4骨架以使IgG4半抗体的交换最小化。在一些又进一步的实施方案中，另外的N297A突变可存在于所述融合多肽的免疫球蛋白重链中以便移除天然糖基化基序。

在一些实施方案中，由于同时结合PD-1和LAG-3，本发明的融合多肽可表现出持久的抗肿瘤或抗感染响应。

在一些实施方案中，包含在本发明融合多肽中的免疫球蛋白的Fc部分可有助于维持该融合多肽的血清水平，对其在体内的稳定性和耐久性至关重要。例如，当Fc部分与内皮细胞和吞噬细胞上的Fc受体结合时，该融合多肽可被内化并再循环至血流，从而增强其在体内的半衰期。

在一些实施方案中，当在基本上如实施例2所述的ELISA(酶联免疫吸附试验)分析中测量所述融合多肽时，该融合多肽可能够以至多约10nM或甚至更低，比如约5nM、约1nM或约0.5nM或甚至更低的EC₅₀值结合PD-1。

在一些实施方案中，例如，当在基本上如实施例2所述的ELISA分析中测量本发明的融合多肽和包含在这种融合多肽中的对PD-1特异性的免疫球蛋白(比如具有由SEQ IDNOs：3和4提供的重链和轻链的抗体)时，所述融合多肽可能够以与所述免疫球蛋白的EC₅₀值相当的EC₅₀值结合PD-1。

另一方面，例如，当在基本上如实施例3所述的ELISA分析中测量所述融合多肽时，该融合多肽可能够以至多约10nM或甚至更低，比如约5nM、约1nM或约0.5nM或甚至更低的EC₅₀值结合LAG-3。

在一些实施方案中，例如，当在基本上如实施例3所述的ELISA分析中测量本发明的融合多肽和包含在这种融合多肽中的对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(例如SEQID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)时，所述融合多肽可能够以与所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC₅₀值至少一样好或更优的EC₅₀值结合LAG-3。

在一些实施方案中，例如，当在基本上如实施例5所述的ELSA分析中测量本发明的对PD-1和LAG-3特异性的融合多肽时，所述融合多肽可能够同时结合PD-1和LAG-3。在一些实施方案中，例如，当在基本上如实施例5所述的ELSA分析中测量时，所述融合多肽可能够以至多约100nM的EC₅₀值同时结合PD-1和LAG-3。

在一些实施方案中，本发明的融合多肽能够抑制LAG-3与MHC II类的结合，所述MHC II类例如是在抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞上表达的那些。可以通过例如基本上如实施例6所述的FACS分析测定该抑制性作用模式。

在一些实施方案中，在基本上如实施例7和8所述的功能性T细胞活化分析中，本发明的融合多肽可能够诱导反映T细胞活化的IL-2和/或IFN-γ产生，并可甚至证明了在更高涂布浓度下的朝向更强IL-2和/或IFN-γ诱导的趋势。

A.包含在融合多肽中的示例性免疫球蛋白

在一些实施方案中，就融合多肽而言，第一结合结构域包含对PD-1特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。所述免疫球蛋白可以是，例如IgG1、IgG2或IgG4。在进一步的实施方案中，所述免疫球蛋白是针对PD-1的单克隆抗体。

本发明的结合PD-1的抗体的示例性实例可包括抗原结合区，其交叉阻断或结合与PD-1-结合抗体相同的表位，所述PD-1-结合抗体包含以下抗体的VH和VL区：尼沃鲁单抗(nivolumab)(也称为ONO-4538、BMS-936558或MDX1106，以Opdivo销售)、帕母单抗(pembrolizumab)(也称为lambrolizumab或MK03475，商品名Keytruda)、PDR001、MEDI0680(以前称为AMP-514)、pidilizumab(CT-011)、ENUM-388D4或ENUM-244C8，这些是本领域已知的。在另一特别的实施方案中，本发明的PD-1-结合抗体可包含来自选自尼沃鲁单抗、帕母单抗、PDR001、MEDI0680、pidilizumab、ENUM-388D4和ENUM-244C8的抗体的抗原结合区，比如三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。

在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体或其抗原结合结构域具有抗原结合区，该抗原结合区交叉阻断或结合选自SEQ ID NOs：124-154的序列任意之一。

在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体具有SEQ ID NOs：3和4的基准抗体或SEQID NOs：47和48的基准抗体的序列。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域具有选自SEQ ID NOs：59-84的重链可变区(HCVR)，和选自SEQ ID NOs：85-111的轻链可变区(LCVR)。在其它实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域具有选自SEQ ID NOs：112-117的重链可变区(HCVR)，和选自SEQ ID NOs：118-123的轻链可变区(LCVR)。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或抗原结合结构域具有包含HCVR的重链和包含LCVR的轻链，所述HCVR为SEQ ID NOs：59-84、112-117的任意之一和所述LCVR为SEQ IDNOs：85-111、118-123的任意之一。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体的重链和轻链配对包含分别如下的HCVR和LCVR：SEQ ID NOs：112和118；SEQ ID NOs：112和119；SEQ ID NOs：112和120；SEQ ID NOs：112和121；SEQ ID NOs：112和122；SEQ ID NOs：112和123；SEQ ID NOs：113和118；SEQ IDNOs：113和119；SEQ ID NOs：113和120；SEQ ID NOs：113和121；SEQ ID NOs：113和122；SEQID NOs：113和123；SEQ ID NOs：114和118；SEQ ID NOs：114和119；SEQ ID NOs：114和120；SEQ ID NOs：114和121；SEQ ID NOs：114和122；SEQ ID NOs：114和123；SEQ ID NOs：115和118；SEQ ID NOs：115和119；SEQ ID NOs：115和120；SEQ ID NOs：115和121；SEQ ID NOs：115和122；SEQ ID NOs：115和123；SEQ ID NOs：116和118；SEQ ID NOs：116和119；SEQ IDNOs：116和120；SEQ ID NOs：116和121；SEQ ID NOs：116和122；SEQ ID NOs：116和123；SEQID NOs：117和118；SEQ ID NOs：117和119；SEQ ID NOs：117和120；SEQ ID NOs：117和121；SEQ ID NOs：117和122；以及SEQ ID NOs：117和123。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域具有与选自SEQ ID NOs：59-84的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的重链可变区(HCVR)，和与选自SEQ ID NOs：85-111的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的轻链可变区(LCVR)。在其它实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域具有与选自SEQ ID NOs：112-117的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的重链可变区(HCVR)，和与选自SEQ ID NOs：118-123的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的轻链可变区(LCVR)。

在一些进一步优选的实施方案中，本发明的特异性地结合PD-1的抗体是尼沃鲁单抗、帕母单抗、PDR001、MEDI0680、pidilizumab、ENUM-388D4或ENUM-244C8或其抗原结合结构域。

许多专利申请公开了抗-PD-1抗体、其产生和/或采用这种抗-PD-1抗体增强免疫响应的方法，包括以下专利申请：美国专利申请公开文本Nos.US 2003/0039653、US 2004/0213795、US 2006/0110383、US 2007/0065427、US 2007/0122378、US 2009/0217401、US2011/0008369和US2015/0203579以及PCT国际申请公开文本Nos.WO 2003/099196、WO2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/156712、WO 2009114335、WO 2010/027423、WO2011/110604、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO 2014/194302、WO 2015/035606和WO2016/106159。这些申请中的每一件的公开内容均通过引用全文并入本文。

本发明的PD-1-结合抗体可以是上文提及的申请中公开的抗-PD-1抗体中的任意之一。

本发明的PD-1-结合抗体可包含抗原结合区，其交叉阻断或结合与PD-1-结合抗体相同的表位，所述PD-1-结合抗体包含上文提及的申请中公开的抗-PD-1抗体中的任意之一的VH和VL区。在另一特别的实施方案中，所述PD-1-结合抗体可包含来自上文提及的申请中公开的抗-PD-1抗体中的任意之一的抗原结合区，比如三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GYTFTDYE(HCDR1，SEQ ID NO：163)、IDPGTGGT(HCDR2，SEQ ID NO：164)、TSEKFGSNYYFDY(HCDR3；SEQ ID NO：165)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GYTFTSYW(HCDR1，SEQ ID NO：168)、IDPSNSET(HCDR2，SEQ IDNO：169)、ARSRGNYAYEMDY(HCDR3；SEQ ID NO：170)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GYTFTDYW(HCDR1，SEQ ID NO：173)、IDTSDSYT(HCDR2，SEQ ID NO：174)、ARRDYGGFGY(HCDR3；SEQ ID NO：175)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GYTFTDYN(HCDR1，SEQID NO：178)，IDPNNGDT(HCDR2，SEQ ID NO：179)，ARWRSSMDY(HCDR3；SEQ ID NO：180)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GYSITSDYA(HCDR1，SEQ ID NO：183)、ITYSGSP(HCDR2，SEQ ID NO：184)、ARGLGGHYFDY(HCDR3；SEQ ID NO：185)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：GFSLTSYG(HCDR1，SEQ ID NO：188)、IWRGGNT(HCDR2，SEQ ID NO：189)、AASMIGGY(HCDR3；SEQ ID NO：190)。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：QTIVHSDGNTY(LCDR1，SEQ ID NO：166)、KVS(LCDR2)、FQGSHVPLT(LCDR3，SEQ ID NO：167)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：SSVSSNY(LCDR1，SEQ ID NO：171)、STS(LCDR2)、HQWSSYPP(LCDR3，SEQ ID NO：172)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：QDISSY(LCDR1，SEQ ID NO：176)、YTS(LCDR2)、QQYSELPW(LCDR3，SEQ ID NO：177)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：QGISNY(LCDR1，SEQ ID NO：181)、YTS(LCDR2)、QQYSNLPW(LCDR3，SEQ ID NO：182)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：QSISDY(LCDR1，SEQ ID NO：186)、YAS(LCDR2)、QNGRSYPY(LCDR3，SEQ ID NO：187)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述三个互补决定区具有如下序列：QSIVHSNGNTY(LCDR1，SEQ ID NO：191)、KVS(LCDR2)、FQGSHVPL(LCDR3，SEQ ID NO：192)。

在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GYTFTDYE(HCDR1，SEQ IDNO：163)、IDPGTGGT(HCDR2，SEQ ID NO：164)、TSEKFGSNYYFDY(HCDR3；SEQ ID NO：165)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：QTIVHSDGNTY(LCDR1，SEQ ID NO：166)、KVS(LCDR2)、FQGSHVPLT(LCDR3，SEQ ID NO：167)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GYTFTSYW(HCDR1，SEQ ID NO：168)、IDPSNSET(HCDR2，SEQ ID NO：169)、ARSRGNYAYEMDY(HCDR3；SEQ ID NO：170)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：SSVSSNY(LCDR1，SEQ ID NO：171)、STS(LCDR2)、HQWSSYPP(LCDR3，SEQ IDNO：172)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GYTFTDYW(HCDR1，SEQ IDNO：173)、IDTSDSYT(HCDR2，SEQ ID NO：174)、ARRDYGGFGY(HCDR3；SEQ ID NO：175)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：QDISSY(LCDR1，SEQ ID NO：176)、YTS(LCDR2)、QQYSELPW(LCDR3，SEQ ID NO：177)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GYTFTDYN(HCDR1，SEQ ID NO：178)、IDPNNGDT(HCDR2，SEQ ID NO：179)、ARWRSSMDY(HCDR3；SEQ ID NO：180)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：QGISNY(LCDR1，SEQ ID NO：181)、YTS(LCDR2)、QQYSNLPW(LCDR3，SEQ ID NO：182)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GYSITSDYA(HCDR1，SEQ ID NO：183)、ITYSGSP(HCDR2，SEQ ID NO：184)、ARGLGGHYFDY(HCDR3；SEQ ID NO：185)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：QSISDY(LCDR1，SEQ ID NO：186)、YAS(LCDR2)、QNGRSYPY(LCDR3，SEQ ID NO：187)。在一些实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：GFSLTSYG(HCDR1，SEQ ID NO：188)、IWRGGNT(HCDR2，SEQ ID NO：189)、AASMIGGY(HCDR3；SEQID NO：190)，和所述轻链可变区具有有如下序列的三个互补决定区(CDR)：QSIVHSNGNTY(LCDR1，SEQ ID NO：191)、KVS(LCDR2)、FQGSHVPL(LCDR3，SEQ ID NO：192)。

除非另有说明，本文公开的全部CDR序列均根据Lefranc，M.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)中所述的IMGT方法定义。CDR1由位置27至38组成，CDR2由位置56至65组成，种系(germline)V-基因的CDR3由位置105至116组成，重排的V-J-基因或V-D-J-基因的CDR3由位置105至117(J-PHE或J-TRP 118之前的位置)组成，其中对于具有小于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT的环顶部具有间隙，或对于具有大于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT具有另外的位置112.1、111.1、112.2、111.2等。本段给出的位置根据Lefranc，M.-P.，The Immunologist，7，132-136(1999)中描述的IMGT编号。

在一些其它的实施方案中，对于本发明的PD-1-结合抗体，优选的是所述具有沉默效应子功能的抗体在F234和L235或位置D265和P329处具有突变，根据Kabat的EU索引(Johnson和Wu，Nucleic Acids Res，2000)编号。

包含在本发明的融合多肽中的特异性地结合PD-1的抗体可包括Fc部分，所述Fc部分允许延长本发明的双特异性结合分子的体内半衰期。这种Fc部分优选地来自人来源，更优选地为IgG1或IgG4抗体的人Fc部分，甚至更优选地为具有活化的或沉默的效应子功能的IgG1或IgG4的工程化人Fc部分，其中沉默的效应子功能优于活化的效应子功能。最优选地，这种Fc部分被工程化为沉默效应子功能，其在位置234和/或235处具有突变，根据Kabat的EU索引(Johnson和Wu，Nucleic Acids Res，2000)编号。在一些实施方案中，可以在所述抗-PD-1抗体的位置F234和L235处引入突变以沉默效应子功能。在其他实施方案中，可以在所述抗-PD-1抗体的位置D265和P329处引入突变以沉默效应子功能。两组这些潜在突变的编号均根据Kabat的EU索引(Shields等人，J Biol Chem，2001)。

用于产生抗体及其片段的各种技术是本领域熟知的并描述在如Altshuler等人(Biochemistry(Mosc)，2010)中。因此，在用与添加剂和佐剂混合的抗原免疫后，可以从动物的血液中获得多克隆抗体，并且可以通过提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术来生产单克隆抗体。这种技术的实例描述在如Harlow和Lane(1999)，(1988)中，并包括最初由和Milstein，1975描述的杂交瘤技术、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(参见如Li等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2006；Kozbor和Roder，Immunol Today，1983)和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole等人，Cancer Res，1984)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得或可以通过各种展示方法(比如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示)从头制备。用于表达重组(人源化)抗体或其片段的合适系统可选自，例如，细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见如美国专利No.6,080,560；Holliger和Hudson，Nat Biotechnol，2005)。另外，所描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利No.4,946,778)可适于产生对本发明的靶标特异性的单链抗体。可将BIAcore系统中应用的表面等离子体共振用于增加噬菌体抗体的效率。

B.包含在融合多肽中的示例性LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白

如本文所使用，将“脂质运载蛋白”定义为重量为约18-20kDa的单体蛋白，其具有圆柱形β-折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的多个(优选为4个)环逐对连接的多个(优选为8个)β链以由此限定结合口袋。在脂质运载蛋白家族成员中，正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如Skerra，Biochim Biophys Acta，2000；Flower等人，Biochim Biophys Acta，2000；Flower，Biochem J，1996中的综述)。事实上，蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化为结合范围广泛的配体，具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有少于20％的序列同一性)，但保留高保守性的整体折叠模式。不同脂质运载蛋白中位置间的对应关系为本领域技术人员所熟知(参见，如美国专利No.7,250,297)。

如上所述，脂质运载蛋白是由其超二级结构定义的多肽，超二级结构即包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链以由此限定结合口袋的圆柱形β-折叠片超二级结构区。本发明不局限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这一方面，本发明涉及具有圆柱形β-折叠片超二级结构区的脂质运载蛋白突变蛋白，该结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链以由此限定结合口袋，其中与参考序列相比，所述4个环中的至少3个的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合LAG-3。

在一个特别的实施方案中，本发明公开的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪液脂质运载蛋白(hTlc或TLPC)(也称为脂质运载蛋白-1、人泪液前白蛋白或von Ebner腺蛋白)的突变蛋白。如本文所使用的术语“人泪液脂质运载蛋白”或“hTlc”或“脂质运载蛋白-1”指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025(同种型1)的成熟的人泪液脂质运载蛋白。可将示于SwissProt/UniProt数据库登录号P31025的氨基酸序列用作优选的“参考序列”，更优选地，将示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列在本文中用作“参考序列”。

在一些实施方案中，以可检测的亲和力结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用另一个氨基酸(例如丝氨酸残基)置换参考序列的天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些其它实施方案中，以可检测的亲和力结合LAG-3的脂质运载蛋白突变蛋白可包含置换野生型脂质运载蛋白的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。在进一步特别的实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个用半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸置换，从而形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。根据Flower(Biochem J，1996)、(BiochimBiophys Acta，2000)和Breustedt等人(J Biol Chem，2005)在本文中使用这些区的定义。在相关的实施方案中，本发明教导了一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够通过结合LAG-3来活化LAG-3的下游信号传导通路。

本发明的针对LAG-3的蛋白或对LAG-3特异性的蛋白包含任何数目的基于所定义的蛋白骨架(优选脂质运载蛋白骨架)的特异性结合蛋白突变蛋白。还优选地，交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数目分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多(比如25、30、35、40、45或50)，其中优选的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11和甚至更优选的是9、10或11。然而，优选的是本发明的蛋白质突变蛋白仍然能够结合LAG-3。

一方面，本发明包含以至少可检测的亲和力结合LAG-3的各种脂质运载蛋白突变蛋白。在此意义上，可将LAG-3看作参考野生型脂质运载蛋白的非天然配体，其中“非天然配体”是指在生理条件下不结合野生型脂质运载蛋白的化合物。通过在某些序列位置处用一个或多个突变工程化野生型脂质运载蛋白，本发明表明对非天然配体即LAG-3的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，在编码野生型脂质运载蛋白上某些序列位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体处，可以通过用核苷酸三联体的亚集(subset)在这些位置处的置换来实施随机诱变。

此外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于参考脂质运载蛋白的线性多肽序列的某些序列位置的任意一个或多个(包括至少任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)序列位置处具有突变的氨基酸残基。

在突变的氨基酸序列位置之外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含“亲本”蛋白骨架(例如脂质运载蛋白骨架)的野生型(天然)氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可在一个或多个序列位置处携带一个或多个氨基酸突变，只要这种突变不妨碍或干扰、至少基本上不妨碍或干扰突变蛋白的结合活性和折叠。可以采用已建立的标准方法(Sambrook和Russell，2001，Molecular cloning：a laboratorymanual)在DNA水平上非常简单地完成这种突变。氨基酸序列改变的示例性实例是插入或缺失以及氨基酸置换。这种置换可以是保守的，即氨基酸残基被化学性质(特别是关于极性以及尺寸)相似的氨基酸残基替换。保守置换的实例是以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以将非-保守性改变引入氨基酸序列。此外，代替替换单一氨基酸残基，还可以使参考脂质运载蛋白(优选hTlc)的一级结构插入或缺失一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定、折叠和功能性的突变蛋白。在这种突变蛋白中，例如，在多肽(例如，具有截短的N-和C-末端的Tlc突变蛋白)的N-或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，这种突变蛋白可与hTlc(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列具有约至少70％(包括至少约80％，比如至少约85％)的氨基酸序列同一性。作为示例性实例，本发明还涵盖如上定义的Tlc突变蛋白，其中成熟人泪液脂质运载蛋白序列的前4个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的最后2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158)缺失(SEQ ID NOs：13-28)。

当比较与其它脂质运载蛋白的序列同一性时，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参考脂质运载蛋白(优选hTlc)具有高序列同一性。在该一般情况下，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列至少基本上类似于参考脂质运载蛋白的氨基酸序列，前提是在比对中可能存在由氨基酸的添加或缺失导致的间隙(如下所定义)。在一些实施方案中，本发明的基本上类似于参考脂质运载蛋白的序列的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列与参考脂质运载蛋白的序列具有至少70％的同一性或序列同源性、至少75％的同一性或序列同源性、至少80％的同一性或序列同源性、至少82％的同一性或序列同源性、至少85％的同一性或序列同源性、至少87％的同一性或序列同源性或者至少90％的同一性或序列同源性(包括至少95％的同一性或序列同源性)，前提是保留改变的位置或序列并且一个或多个间隙是可能的。

如本文所使用，由于结合特异性不是绝对的，而是一种相对性质，因此，若本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够区分靶标和一个或多个参考靶标，则其“特异性地结合”这种靶标(例如，LAG-3)。可以例如根据蛋白质印迹、ELISA、FACS、RIA(放射免疫分析)、ECL(电化学发光)、IRMA(免疫放射分析)、IHC(免疫组织化学)和肽扫描来测定“特异性结合”。

一方面，本发明提供结合LAG-3的hTlc突变蛋白。

在这一方面，本发明提供一种或多种hTlc突变蛋白，其能够以通过约300nM或更低和甚至约100nM或更低的K_d量度的亲和力结合LAG-3。

在一些实施方案中，这种hTlc突变蛋白在对应于所述hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列的位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。

在一些特别的实施方案中，这种hTlc突变蛋白可在对应于hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。

在进一步特别的实施方案中，这种hTlc突变蛋白可进一步在对应于hTlc(SEQ IDNO：1)的线性多肽序列的位置101、111、114和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。

在其他特别的实施方案中，所述hTlc突变蛋白可在对应于hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列的序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153的一个或多个序列位置处包含突变的氨基酸残基。

在一些进一步的实施方案中，所述hTlc突变蛋白可在对应于所述hTlc(SEQ IDNO：1)的线性多肽序列的序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153的一个或多个序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3，特别是结合人LAG-3。

在一些又进一步的实施方案中，本发明涉及一种多肽，其中所述多肽为hTlc突变蛋白，与hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列相比，所述hTlc突变蛋白在序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合LAG-3，特别是结合人LAG-3。

在一些实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用如丝氨酸残基置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋包含用另一个氨基酸如丝氨酸残基置换在位置61和/或153处的天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在本上下文中应注意已经发现(在相应的天然核酸文库的水平上)移除由半胱氨酸残基61和153形成的野生型泪液脂质运载蛋白的结构二硫键(参见Breustedt等人，J Biol Chem，2005)可以提供泪液脂质运载蛋白突变蛋白，其不仅稳定折叠，还能以高亲和力结合给定非-天然配体。在一些特别的实施方案中，根据本发明的Tlc突变蛋白包含氨基酸置换Cys 61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp，和/或Cys 153→Lys、Arg、Thr。已证明置换可用于阻止形成天然存在的连接Cys61和Cys 153的二硫桥，并从而有助于处理所述突变蛋白。然而，结合LAG-3并具有在Cys 61和Cys 153之间形成的二硫桥的hTlc也是本发明的一部分。

在一些实施方案中，结构性二硫键的消除可提供进一步的优点，即允许将非天然人工二硫键(自发)生成或有意引入到本发明的突变蛋白中，由此增加该突变蛋白的稳定性。例如，在一些实施方案中，在位置61、101和153处的两个或全部三个半胱氨酸密码子被另一个氨基酸的密码子替换。此外，在一些实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋白包含位置101处的天然半胱氨酸残基被丝氨酸残基或组氨酸残基置换的氨基酸置换。

在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含天然氨基酸被关于hTlc(SEQ IDNO：1)氨基酸序列的位置28或105处的半胱氨酸残基置换的氨基酸置换。

此外，在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含关于hTlc(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的位置111处的天然精氨酸残基被脯氨酸残基置换的氨基酸置换。另外，在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含关于hTlc(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的位置114处的天然赖氨酸残基被色氨酸残基或谷氨酸置换的氨基酸置换。

在一些实施方案中，根据本发明的结合LAG-3的Tlc突变蛋白在对应于hTlc(SEQID NO：1)的线性多肽序列的位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser、Phe、Gly、Ala、Asp或Glu；Glu27→Asp、Val或Thr；Phe 28→Cys或Asp；Pro 29→Phe、Leu或Trp；Glu 30→Trp、Asn或Tyr；Met 31→Ile、Val、Asp、Leu或Tyr；Asn 32→Asp、Glu、Tyr、Trp、Val、Thr或Met；Leu 33→Asp、Glu或Pro；Glu 34→Val、Trp或His；Val 36→Ala；Asn 48→Asp；Lys 52→Glu、Ser、Arg或Asn；Val 53→Ala；Met 55→Ala或Val；Leu 56→Asp、Gln或Asn；Ile 57→Leu；Ser 58→Phe、Trp或Asp；Arg 60→Phe或Glu；Cys 61→Trp、Pro、Leu或Trp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Val 85→Ala；Ala 86→Asp；Cys 101→Ser或Phe；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys或Gly；His 106→Ala、Glu、Thr、Tyr、Gln或Val；Lys 108→Tyr、Phe、Thr或Trp；Val 110→Gly或Ala；Arg 111→Pro；Gly 112→Met或Thr；Lys 114→Trp或Ala；Lys 121→Thr；Ser 140→Gly和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋白在hTlc(SEQ ID NO：1)的这些序列位置处包含两个或更多个，比如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，甚至更多个，比如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或全部突变的氨基酸残基。

在一些另外的实施方案中，与hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列相比，结合LAG-3的hTlc突变蛋白包含以下氨基酸置换组之一。

(a)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(b)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Asn；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Ala；Gly 112→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(c)Arg 26→Phe；Glu 27→Val；Phe 28→Cys；Pro 29→Leu；Glu 30→Tyr；Met 31→Asp；Asn 32→Val；Leu 33→Pro；Leu 56→Gln；Ser 58→Trp；Arg 60→Glu；Cys 61→Leu；Cys 101→Ser；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys；His 106→Val；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(d)Arg 26→Glu；Glu 27→Thr；Phe 28→Cys；Pro 29→Trp；Glu 30→Trp；Met 31→Tyr；Asn 32→Val；Leu 33→Asp；Glu 34→His；Leu 56→Asn；Ile 57→Leu；Ser 58→Trp；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Gln；Lys 108→Trp；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(e)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(f)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(g)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Val 36→Ala；Asn 48→Asp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 140→Gly；Cys 153→Ser；

(h)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Glu；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(i)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Val 36→Ala；Lys 52→Glu；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(j)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Val；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(k)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Trp；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Tyr；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(1)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ala；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Val；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Ala；Gly 112→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(m)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(n)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(o)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Met；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；或

(p)Arg 26→Phe；Glu 27→Val；Phe 28→Cys；Pro 29→Leu；Glu 30→Asn；Met 31→Asp；Asn 32→Tyr；Leu 33→Pro；Leu 56→Gln；Ser 58→Trp；Arg 60→Glu；Cys 61→Pro；Cys 101→Ser；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys；His 106→Thr；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser。

在剩余区域，即与序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153不同的区域，在突变的氨基酸序列位置之外，本发明的hTlc突变蛋白可包含野生型(天然)氨基酸序列。

在又进一步的实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋白与hTlc(SEQ ID NO：1)的序列具有至少70％的序列同一性或至少70％的序列同源性。作为示例性实例，SEQ ID NO：20的突变蛋白与hTlc(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列具有近86％的氨基酸序列同一性或序列同源性。

在进一步特别的实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白包含如SEQ ID NOs：13-28中任一个所示的氨基酸序列或其片段或变体。

在进一步特别的实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白与选自SEQ ID NOs：13-28的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性。

本发明还包含具有选自SEQ ID NOs：13-28的氨基酸序列的hTlc突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物与所述的hTlc突变蛋白具有大于约60％，优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选地大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。

可以通过诱变天然存在形式的hTlc(SEQ ID NO：1)获得根据本发明的hTlc突变蛋白。在一些所述诱变的实施方案中，置换(或替换)是保守置换。然而，设想任何置换(包括非保守置换或来自下文的示例性置换中的一个或多个)，只要所述脂质运载蛋白突变蛋白保留了其结合LAG-3的能力，和/或其与之后被置换的序列具有序列同一性，即所述脂质运载蛋白突变蛋白与hTlc(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列具有至少60％，比如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性。

在一些特别的实施方案中，本发明提供一种脂质运载蛋白突变蛋白，其以通过约15nM或更低的K_d量度的亲和力结合人LAG-3，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ IDNO：17和SEQ ID NO：27中任一个的氨基酸序列具有至少90％或更高，比如95％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，该融合配偶体是延长所述突变蛋白血清半衰期的蛋白结构域。在进一步特别的实施方案中，该蛋白结构域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白。

在另一个实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与延长所述突变蛋白血清半衰期的化合物缀合。更优选地，所述突变蛋白与选自以下的化合物缀合：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。

在又一个实施方案中，本发明涉及包含编码本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明涵盖包含所述核酸分子的宿主细胞。

C.对LAG-3和PD-1特异性的融合多肽的示例性用途、应用和产生

已报道LAG-3在促进调节性T细胞(Treg)活性和负调节T细胞活化和增殖中起重要作用(Workman和Vignali，J Immunol，2005)。天然的和诱导的Treg均表达升高水平的LAG-3，这是其最大抑制功能所需的(Huang等人，Immunity，2004；Camisaschi等人，J Immunol，2010)。此外，LAG-3在CD4+效应T细胞上的异位表达降低了它们的增殖能力并赋予它们对抗第三方T细胞的调节潜力(Huang等人，Immunity，2004)。最近的研究还显示，在耗竭的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)特异性的CD8+T细胞上的高LAG-3表达有助于其无响应状态并限制CD8+T细胞的抗肿瘤响应(Grosso等人，J Clin Invest，2007；Blackbum等人，NatImmunol，2009)。事实上，LAG-3通过直接作用于2只鼠模型的CD8+T细胞来维持对自身和肿瘤抗原的耐受性(Grosso等人，J Clin Invest，2007)。

然而，在肿瘤发展和肿瘤复发的情况中观察到的免疫耐受性似乎是由各种T细胞负调节受体的共表达介导的，而不是仅由LAG-3介导。来自慢性病毒感染模型(Grosso等人，J Clin Invest，2007；Blackburn等人，Nat Immunol，2009；Lyford-Pike等人，Cancer Res，2013)、敲除小鼠(Woo等人，Cancer Res，2012；Bertini等人，J Immunol，2011；Okazaki等人，J Exp Med，2011)、肿瘤复发模型(Goding等人，J Immunol，2013)和在更有限的程度上，人癌症患者(Goding等人，J Immunol，2013；Gandhi等人，Blood，2006；Matsuzaki等人，ProcNatl Acad Sci U S A，2010)的数据支持了这样一种模型，其中通过一个称为“耗竭”的过程使持续暴露于抗原的T细胞逐渐失活。耗竭的T细胞的特征在于T细胞负调节受体(主要为PD-1和LAG-3)的表达，其作用是限制细胞的增殖、产生细胞因子和杀伤靶细胞和/或增加Treg活性的能力。然而，这些分子在肿瘤发展和复发中的表达时间和顺序尚未完全表征。

PD-1是一种在调节T细胞活化和耐受性中起关键作用的细胞表面信号传导受体(Keir等人，Annu Rev Immunol，2008)。它是I型跨膜蛋白，并与BTLA、CTLA-4、ICOS和CD28一起构成T细胞共刺激受体的CD28家族。PD-1主要在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上表达(Dong等人，Nat Med，1999)。PD-1也在天然杀伤(NK)细胞上表达(Terme等人，Cancer Res，2011)。

PD-1通过其配体PD-L1和PD-L2的结合导致在近端(proximal)细胞内免疫受体酪氨酸抑制结构域中的酪氨酸残基的磷酸化，随后是磷酸酶SHP-2的募集，最终导致T细胞活化的下调。PD-1的一个重要作用是在对感染炎症性响应时限制外周组织中T细胞的活性，从而限制自身免疫性的发展(Pardoll，Nat Rev Cancer，2012)。这种负调节作用的证据来自这样的发现，即PD-1缺陷型小鼠发展狼疮样自身免疫性疾病，包括关节炎和肾炎以及心肌病(Nishimura等人，Science，2001；Nishimura等人，Immunity，1999)。在肿瘤情况中，结果是肿瘤微环境中免疫耐受的发展。PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞上高表达，其配体在许多不同肿瘤的细胞表面上调(Dong等人，Nat Med，2002)。多种鼠癌症模型已经证明配体与PD-1的结合导致免疫逃避。另外，阻断这种相互作用导致抗肿瘤活性(Hamid等人，N Engl J Med，2013；Topalian等人，N Engl J Med，2012)。

PD-1和LAG-3抑制通路在对自身和肿瘤抗原的耐受中具有很强的协同作用，因此，对靶标的双重阻断代表了一种很有前途的癌症组合策略(Woo等人，Cancer Res，2012)。

通过同时靶向免疫检查点PD-1和LAG-3，本发明的融合多肽可以产生持久的抗肿瘤和/或抗感染响应、增加抗肿瘤淋巴细胞活性和增强抗肿瘤免疫力，由此产生协同的抗肿瘤效果。

因此本发明的融合多肽的许多可能应用存在于医药中。在一些实施方案中，本发明的融合多肽可以通过双重靶向PD-1和LAG-3产生协同作用。

一方面，本发明涉及本文公开的融合多肽在用于检测样品中PD-1和LAG-3以及相应的诊断方法中的用途。

另一方面，本发明的特征在于本文公开的一种或多种融合多肽或者一种或多种包含此类多肽的组合物在用于同时结合PD-1和LAG-3中的用途。

本发明还涉及所述的一种或多种融合多肽在用于与PD-1和LAG-3形成复合物中的用途。

因此，本发明的又一方面，所公开的一种或多种融合多肽用于检测PD-1和LAG-3。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述融合多肽与怀疑含有PD-1和LAG-3的样品在合适条件下接触，由此允许在所述融合多肽与PD-1和LAG-3之间形成复合物，并通过合适信号检测所述复合物。可检测信号可以通过如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是表面等离子体共振，其数值在结合配偶体结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。

本文公开的融合多肽还可用于分离PD-1和LAG-3。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述融合多肽与猜测含有PD-1和LAG-3的样品在合适条件下接触，由此允许在所述融合多肽与PD-1和LAG-3之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。

又一方面，本发明的特征在于包含根据本发明的融合多肽的诊断或分析试剂盒。

除了其在诊断中的用途，再一方面，本发明考虑包含本发明的融合多肽和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

此外，本发明提供用作抗感染和/或抗癌剂和免疫调节剂的同时结合PD-1和LAG-3的融合多肽。设想本发明的融合多肽用在治疗或预防有此需要的受试者中诸如各种肿瘤和自身炎症的人疾病的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的融合多肽。

可采用本发明的融合多肽治疗的癌症的实例包括：肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睾丸20癌、子宫癌、输卵管癌(carcinoma)、子宫内膜癌(carcinoma)、宫颈癌(carcinoma)、阴道癌(carcinoma)、外阴癌(carcinoma)、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、25儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌(carcinoma)、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体瘤、卡波西(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌，由环境诱导的包括那些由石棉诱导的那些的癌症，血液恶性肿瘤30，包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴样白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、外膜(mantle)细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病(mycosis fungoides)、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、和所述癌症的任意组合。本发明还用于治疗转移性癌症。

在一个实施方案中，所述人患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)或病毒相关癌症(如人乳头瘤病毒(HPV)相关的癌症)或胃腺癌。在特别的实施方案中，所述HPV相关的肿瘤是HPV+头颈癌(HNC)。在另一特别的实施方案中，所述胃腺癌与Epstein-Barr病毒(EBV)感染有关。

在另一实施方案中，本发明还涉及包含编码本文公开的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。在又一实施方案中，本发明涵盖包含所述核酸分子的宿主细胞。由于遗传密码的简并性允许指定相同氨基酸的其它密码子置换某些密码子，本发明不限于编码如本文所述的融合多肽的具体核酸分子，而是包括所有包含编码功能性多肽的核苷酸序列的核酸分子。在这一方面，本发明还涉及编码本发明的融合多肽的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码本申请公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，比如DNA，可以“可操作地连接”编码本发明免疫球蛋白的另一核酸分子，从而允许表达本文公开的融合多肽。在这一方面，可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，一个核酸分子的序列元件和另一核酸分子的序列元件以使融合多肽能够表达为单一多肽的方式相连接。

本发明还涉及用于产生本发明的融合多肽的方法，其通过遗传工程方法从编码该多肽或其中的任意亚基的核酸开始。在一些实施方案中，该方法可以在体内进行，其中所述融合多肽可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物体或其培养物中分离。还可以在体外产生本发明的融合多肽，例如通过使用体外翻译系统。

在体内产生融合多肽时，通过重组DNA技术(如上文已概述)将编码该多肽的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体中。为此，首先使用已建立的标准方法，用克隆载体转化该宿主细胞，所述克隆载体包含编码如本文所述的融合多肽的核酸分子。然后在允许表达该异源DNA并因而允许合成相应多肽的条件下培养该宿主细胞。之后，从细胞或培养基中回收该多肽。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使编码融合多肽的至少一个核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，所述核苷酸三联体编码对应于包含在所述融合多肽中的hTlc(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列的序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153中的至少一个、有时甚至更多个序列位置。

此外，对于包含在融合多肽中的本发明的hTlc突变蛋白，可以移除Cys 61和Cys153之间天然存在的二硫键。因此，这种突变蛋白可以在具有还原性氧化还原环境的细胞隔室中产生，例如在革兰氏阴性菌的细胞质中。

本发明还包含编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其在实验诱变的指定序列位置之外包含另外的突变。这种突变通常是耐受的或甚至可证明是有利的，例如若这些突变有利于所述脂质运载蛋白突变蛋白的改善的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力。

本申请中公开的核酸分子可以“可操作地连接”至一个或多个调节序列以允许表达该核酸分子。

核酸分子，如DNA，如果它包括包含关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列的话，其被称为“能够表达核酸分子”或“能够允许核苷酸序列的表达”。可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，调节序列元件和待表达的序列以使基因能够表达的方式相连接。基因表达需要的调节区域的确切性质可能在物种间变化，但一般来说这些区域包括启动子，在原核生物中，所述启动子既包含启动子本身(即指导转录启动的DNA元件)，又包括当转录成RNA时发出翻译启动信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译启动的5′非编码序列，如-35/-10盒以及原核生物中的Shine-Dalgamo元件或者真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏元件以及用于将天然多肽靶向宿主细胞特定隔室的被翻译信号和前导序列。

此外，3′非编码序列可以包含参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞内没有令人满意的功能，那么它们可能被该细胞中有功能的信号置换。

因此，本发明的核酸分子可以包括调节序列，如启动子序列。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是，例如，tet启动子，lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例有SV40启动子或CMV启动子。

本发明的核酸分子也可以是载体或任何其它类型的克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体的一部分。

在一个实施方案中，核酸分子包含在质粒中。质粒载体指编码融合至目的cDNA的温和噬菌体(如M13或f1)基因间区域或其功能部分的载体。用这样的噬菌粒载体和合适的辅助噬菌体(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，由此使得能够将编码的异源cDNA物理偶联至在噬菌体表面上展示的其相应多肽(Lowman，Annu Rev Biophys Biomol Struct，1997；Rodi和Makowski，Curr Opin Biotechnol，1999)。

除上文描述的调节序列和编码如本文所述的融合多肽的核酸序列以外，这种克隆载体可以包括源自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予被转化或转染的细胞可选择表型的选择标记物。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并可商购获得。

可将编码如本文所述的融合多肽(例如，SEQ ID NOs：29-36)的DNA分子，特别是含有这种多肽的编码序列的克隆载体，转化到能够表达该基因的宿主细胞中。可以使用标准技术进行转化。因此，本发明还涉及含有如本文公开的核酸分子的宿主细胞。

在适于表达编码本发明融合多肽的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，或者是真核细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。

在本发明的脂质运载蛋白突变蛋白(包括包含在本文公开的融合多肽中)包括分子内二硫键的一些实施方案中，可以优选的是，使用适合的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的外周胞质、在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中或在真核细胞的内质网腔中提供，并且这种氧化性环境通常有利于结构性二硫键的形成。

在一些实施方案中，还可以在宿主细胞(优选大肠杆菌)的胞液中产生本发明的融合多肽。在这种情况下，该多肽可以以可溶和折叠状态直接获得，也可以以包涵体的形式回收，然后体外复性。其它选择为使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，其可以因而允许在胞液中形成二硫键(Venturi等人，J Mol Biol，2002)。

在一些实施方案中，如本文所述的本发明的融合多肽可以不一定仅通过利用基因工程生成或产生。而是，还可以通过化学合成或通过体外转录和翻译获得这种多肽，所述化学合成例如Merrifield固相多肽合成。例如可行的是，将有希望的融合多肽和/或包含在这种融合多肽中的脂质运载蛋白突变蛋白采用分子建模鉴定，体外合成并研究对于目的靶标的结合活性。用于固相和/或液相合成蛋白的方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer等人，Curr Pharm Biotechnol，2004)。

在另一个实施方案中，本发明的融合多肽可以使用本领域技术人员已知的成熟方法通过体外转录/翻译产生。

本领域技术人员将会理解用于制备本发明预期的、但其蛋白或核酸序列在本文中没有明确地披露的融合多肽的方法。作为一个概述，氨基酸序列的这种修饰包括，例如，通过引入某些限制性酶的切割位点对单个氨基酸位置进行定向诱变，以便简化多肽基因或其部分的亚克隆。此外，也可以引入这些突变以进一步提高融合多肽对其靶标(如PD-1和LAG-3)的亲和力。并且，如果必要，可以引入突变来调节多肽的某些特征，如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶解性，或者降低聚集趋势。例如，天然存在的半胱氨酸残基可突变为其它氨基酸以防止形成二硫桥。

本发明的融合多肽可以通过任意许多常规且熟知的技术，比如简单的有机合成策略、固态辅助合成技术或商购可得的自动合成器制备。另一方面，其也可以通过仅常规重组技术或与常规合成技术结合来制备。可以通过将上文(A)和(B)部分的化合物组合来获得根据本发明的融合多肽。

对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图用于限制)，本发明的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本发明通过示例性实施方案以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以采取本文所公开于其中的公开内容的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1：代表性融合多肽的表达和分析

为同时接合(engage)PD-1和LAG-3，我们生成了几种代表性的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽，将具有由SEQ ID NOs：3和4提供的重链和轻链的PD-1特异性抗体经非结构性的(G₄S)₃连接子(SEQ ID NO：2)与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白分别融合在一起。所产生的不同形式如图1 a-e所示。通过SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白与包含SEQ ID NO：3的重链和SEQ ID NO：4的轻链的抗体的四个末端之一的融合产生这种融合多肽(分别为SEQID NOs：5和4；SEQ ID NOs：9和4；SEQ ID NOs：6和4；SEQ ID NOs：10和4；SEQ ID NOs：3和7；SEQ ID NOs：3和11；SEQ ID NOs：3和8；以及SEQ ID NOs：3和12)。当将脂质运载蛋白突变蛋白融合至所述抗体的重链或轻链的N-末端时，它们在连接子序列(SEQ ID NO：2)之前的C-末端包含另外两个氨基酸，丝氨酸和天冬氨酸。包含SEQ ID NO：3的重链和SEQ ID NO：4的轻链的PD-1特异性抗体具有工程化的IgG4骨架，所述IgG4骨架包含S228P突变以在体外和体内最小化IgG4半抗体交换(Silva等人，J Biol Chem，2015)。此外，通过将SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白经由非结构性的(G₄S)₃连接子(SEQID NO：2)与SEQ ID NO：3的Fc部分的C-末端融合产生脂质运载蛋白突变蛋白Fc融合物。图1中描绘了两个不同的构建体(SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42)。图1 f-i另外示出了其它融合多肽的设计及这种多肽的相应序列，其中基于对PD-1特异性的抗体(如SEQ ID NOs：3和4的抗体或SEQ ID NOs：47和48的抗体)和一种或多种对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)制备。

通过基因合成并克隆至哺乳动物表达载体产生所述融合多肽的构建体。然后将融合多肽的构建体在Expi293F^TM细胞(Life Technologies)中瞬时表达。采用ForteBioProtein A传感器(Pall Corp.)或通过应用蛋白A亲和柱(AppliedBiosystems)的HPLC(Agilent Technologies)测量细胞培养基中融合多肽的浓度。

同样，为了同时接合PD-1和LAG-3，可以将具有由SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48提供的重链和轻链的PD-1特异性抗体经由如非结构性的(G₄S)₃连接子(SEQ ID NO：2)与SEQID NO：17或SEQ ID NO：27的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白分别融合在一起。可以产生不同的形式；参见图1，经适当修饰后适用。如上文关于PD-1-LAG-3抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽所述，将具有由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4提供的重链和轻链的PD-1特异性抗体与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白分别融合在一起，类似地产生这些不同的形式，不同之处在于使用SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的氨基酸序列作为重链和轻链。

具体而言，图1示出了另外的代表性融合多肽，其可采用不同的对PD-1特异性的抗体(如SEQ ID NOs：47和48的抗体)和一种或多种对LAG-3特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：17的脂质运载蛋白突变蛋白或SEQ ID NO：27的脂质运载蛋白突变蛋白)通过本文所述的相同方法制备。如图1所描绘，可以将脂质运载蛋白突变蛋白与PD-1特异性抗体的重链或轻链的C-或N-末端基因融合以获得SEQ ID NOs：51和48、SEQ ID NOs：55和48、SEQ ID NOs：52和48、SEQ ID NOs：56和48、SEQ ID NOs：47和53、SEQ ID NOs：47和57、SEQID NOs：47和54以及SEQ ID NOs：47和58的融合多肽。

采用蛋白质A色谱，然后通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的尺寸排阻色谱(SEC)纯化融合多肽。SEC纯化后，将包含单体蛋白的级分合并采用分析级SEC再次分析。蛋白质A纯化并外推至1升的构建体滴度如下表1所述。融合多肽的表达与抗体表达处于相同的范围内。

表1：在Expi293F^TM细胞中瞬时表达的表达滴度。外推至1L的表达规模。

实施例2：在酶联免疫吸附试验(ELISA)中融合多肽对PD-1的结合

我们采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析来测定融合多肽与重组人PD-1-His(具有C-末端聚组氨酸标签的PD-1，ACROBiosystems)的结合效力。PBS中1μg/mL浓度的PD-1-His在微量滴定板上于4℃下涂布过夜。用PBS-0.05％T(补充有0.05％(v/v)吐温20的PBS)洗涤后，将板用在PBS-0.1％T(补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时。用100μL PBS-0.05％T洗涤5次后，将不同浓度的基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)或融合多肽添加至孔并在室温下温育1h，随后是另一洗涤步骤。用在PBS-0.1％T-2％BSA中1∶5000稀释的抗人IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)温育后检测研究中结合的抗体/融合多肽。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。

图2中描绘了实验结果以及由1∶1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC₅₀值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。所得到的EC₅₀值在表2中提供。对于所有测试的分子所观察到的EC₅₀值都非常相似，并且与包含在融合多肽中的PD-1-特异性抗体(SEQ IDNOs：3和4)相当。本实验表明，当包含在融合多肽中时，所述PD-1-特异性抗体在该抗体的四个末端中的任意之一处可与脂质运载蛋白突变蛋白融合并仍然结合PD-1。

表2：PD-1结合的ELISA数据

实施例3：在ELISA中融合多肽对LAG-3的结合

我们采用ELISA分析来测定抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽、Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽(SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42)以及SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：27的亲本脂质运载蛋白突变蛋白与重组LAG-3His(ACROBiosystems)的结合效力。将融合多肽/脂质运载蛋白突变蛋白在PBS中稀释(1μg/mL)并在微量滴定板上于4℃下涂布过夜。每一温育步骤后，用100μL的PBS-0.05％T洗涤板5次。将板用在PBS-0.1％T中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时并随后洗涤。将不同浓度的单体形式的LAG-3-特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：27)或抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽或Fc-脂质运载蛋白突变蛋白多肽添加至孔并在室温下温育1h，随后是另一洗涤步骤。温育1h后，在室温下加入在PBS-0.1％T-2％BSA中的与HRP缀合的多克隆1∶2000稀释的抗-Tlc抗体达1h。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。另外，在独立的实验中，在其它相同的ELISA分析中加入了1∶5000稀释的抗-人IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)。

图3中描绘了实验结果以及由1∶1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。所得到的EC₅₀值示于表3。对于两种检测方法，所测试分子的EC₅₀值是可比较的。当所述多肽中包含相同的脂质运载蛋白突变蛋白时，不同融合形式对LAG-3的结合效力彼此相当，并与各自的亲本脂质运载蛋白突变蛋白相当。SEQID NO：43作为阴性对照并且未显示结合LAG-3(数据未示出)。本实验表明，当包含在上文所述的融合多肽中时，所述脂质运载蛋白突变蛋白能够融合至所述抗体的四个末端而不损失对LAG-3的活性。

表3：LAG-3结合的ELISA数据

实施例4：结合表达PD-1和LAG-3的细胞的融合多肽的荧光激活细胞分选(FACS)分析

我们使用荧光激活细胞分选(FACS)研究来评估融合多肽和阴性对照与分别用人PD-1(CHO-huPD-1)或人LAG-3(CHO-huLAG-3)稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的特异性结合。使用Flp-In系统(Invitrogen)，根据制造商的说明产生该细胞系。将模拟转染的Flp-In CHO细胞作为阴性对照。

在补充有10％胎牛血清(FCS，Biochrom)和500μg/ml潮霉素B(Roth)的Ham′s F12培养基(InVitrogen)中维持转染的CHO细胞。根据制造商的说明，在标准条件下(37℃，5％CO₂气氛)将细胞培养在细胞培养瓶中。为了分离贴壁细胞以用于传代培养或FACS实验，根据制造商的说明使用Accutase(PAA Laboratories)。

为了实施该实验，用融合多肽温育PD-1-阳性和阴性对照Flp-In CHO细胞，以及LAG-3阳性和阴性对照Flp-In CHO细胞，并按照如下所述在FACS分析中采用荧光标记的抗-脂质运载蛋白突变蛋白抗体检测结合的融合多肽。

将每孔2.5×10⁴个细胞在含有5％胎牛血清的冰冷PBS(PBS-FCS)中预温育1h。随后，向细胞中加入通常为250至0.001nM的稀释系列的融合多肽、脂质运载蛋白突变蛋白和阴性对照，并在冰上温育1h。使用300xg离心将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，然后用由荧光染料Alexa488(Pieris)标记的兔抗-Tlc抗体在冰上温育30min。随后将细胞洗涤并用iQueFlow cytometer(Intellicyte)分析。使用GraphPad软件，将荧光强度的几何平均值针对最大平均值归一化，并用1∶1结合模型进行拟合，以EC50值作为自由参数并将斜率固定为一。

SEQ ID NOs：5和4、SEQ ID NOs：6和4、SEQ ID NOs：3和7以及SEQ ID NOs：3和8的示例性数据示于图4和表4。脂质运载蛋白突变蛋白与抗-PD-1抗体重链(SEQ ID NOs：6和4)的N-末端的融合似乎降低了抗体与PD-1的结合效力，而其他融合位点未导致与细胞上表达的人PD-1的结合的差异。对SEQ ID NOs：5和4的LAG-3的改善的EC₅₀可能是由于亲合力效应引起的。如预期的那样，阴性对照未结合细胞上表达的人PD-1和人LAG-3(数据未示出)。

图4：对huPD-1和huLAG-3的结合的FACS数据

实施例5：在基于ELISA的设置中同时靶向结合的证明

为了证明所述融合多肽与PD-1和LAG-3的同时结合，使用双重结合ELISA形式。在PBS中的重组PD-1-His(ACROBiosystems)(1μg/mL)在微量滴定板上于4℃下涂布过夜。在每个温育步骤后，用100μL PBS-0.05％T洗涤板5次。将板用在PBS-0.1％T中2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合多肽加入到孔中并在室温下温育1小时，随后进行洗涤步骤。随后，将生物素化的人LAG-3-Fc(R&D Systems)以在PBS-0.1％T-2％BSA中2μg/mL的恒定浓度加入1小时。洗涤后，向孔中加入PBS-0.1％T-2％BSA中1∶5000稀释的Extravidin-HRP(Sigma-Aldrich)并温育1小时。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。

图5中示出了融合多肽的双重结合数据以及由1∶1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC₅₀值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。所得到的EC₅₀值汇总于表5。全部融合多肽均显示清晰的结合信号，这表明所述融合多肽能够同时接合PD-1和LAG-3。然而，在该双重结合形式中，脂质运载蛋白突变蛋白在抗体上的附着点对EC₅₀具有影响，因为与其它形式相比，N-末端重链融合物(SEQ ID NOs：6和4以及SEQ ID NOs：10和4)的EC₅₀降低2倍。

表5：同时靶向结合PD-1和LAG-3的ELISA数据

实施例6：融合多肽与表达主要组织相容性复合体(MHC)II类的细胞竞争结合人LAG-3的FACS分析

为了评估给定融合多肽是否干扰LAG-3结合MHC II类阳性细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)II类，应用竞争FACS实验。在该实验中，用MHC II类阳性人细胞系A375温育恒定浓度的人LAG-3-Fc融合物(huLAG-3-Fc，R&D system)和系列稀释的融合多肽，并采用荧光标记的抗-IgG Fc抗体来检测细胞结合的huLAG-3-Fc。在该分析中，竞争性脂质运载蛋白突变蛋白干扰huLAG-3与其配体MHC II类的结合，导致huLAG-3-Fc与MHC II类阳性细胞系A375的结合降低。

将黑素瘤细胞系A375维持在补充有10％胎牛血清(FCS，Biochrom)的DMEM培养基(Invitrogen)中。根据制造商的说明，在标准条件(37℃，5％CO₂气氛)下将细胞培养在细胞培养瓶中。为了分离贴壁细胞以用于传代培养或FACS实验，根据制造商的说明使用Accutase(PAA Laboratories)。

为了FACS分析，将每孔5×10⁴个A375细胞在PBS-FCS中温育1h，然后加入3nMhuLAG-3-Fc和不同浓度的融合多肽。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，重悬浮于PBS-FCS中并在冰上用藻红蛋白标记的抗-人IgG Fc抗体(Jackson Immunologics)温育30min。之后将细胞洗涤并用Intellicyt IQue流式细胞仪(Intellicyt)分析。采用Forecyt软件分析通过huLAG-3-Fc结合A375细胞产生的荧光数据，并且将得到的几何荧光平均值针对huLAG-3-Fc最大结合归一化。采用Graphpad软件绘制并拟合huLAG-3-Fc结合的百分比。图6提供了选定的竞争结合曲线。数据表明所测试的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽和Fc-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽竞争huLAG-3与人MHC II类表达细胞上的其配体MHC II类的结合。所述融合多肽对LAG-3/MHC II类分子结合的抑制作用出现在与参考LAG-3单克隆抗体(SEQID NOs：49和50)相当的浓度时。不结合LAG-3的阴性对照hIgG4(Sigma)和脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：43)未显示任何竞争，参见图6。

实施例7：采用人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞活化评估

我们使用T细胞分析来评估融合多肽通过阻断LAG-3和PD-1与各自的配体之间的相互作用来还原阴性检查点分子LAG-3和PD-1的抑制性信号传导的能力。为此目的，将不同浓度的融合多肽添加至葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)中并于37℃下温育3天。作为读出结果，评估上清液中分泌的IL-2和IFN-γ水平。

遵循Biochrom的方案，通过聚蔗糖密度梯度(Biocoll，1.077g/mL，Biochrom)离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的PBMC。将纯化的PBMC重悬浮于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该分析，将PBMC解冻16小时，并在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中培养。

对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。

将1x10⁵个PBMC在平底组织培养板的每个孔中在补充或未补充不同浓度的SEB的培养基中温育。然后将两个不同浓度，即150nM或2000nM的融合多肽添加至孔中。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿的5％CO₂气氛中温育3天。随后，评估上清液中的IL-2和IFN-γ水平。

使用来自R&D Systems的IL-2和IFN-γ DuoSet试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2和人IFN-γ进行定量。

以下程序描述了IL-2定量。使用特定的IFN-γ抗体，采用相同的程序对IFN-γ定量。

在第一步中，用在PBS中1μg/mL的“人IL-2捕获抗体”(R&D System)在室温下涂布384孔板2小时。随后，使用80μL的PBS-0.05％T洗涤孔5次。在另外含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-0.05％T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中于4℃下温育过夜。为了允许检测和定量所捕获的IL-2，加入在含有0.5％的酪蛋白的PBS-T中100ng/mL的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体(R&D System)和1μg/mL的Sulfotag标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物，并在室温下温育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液，并使用Mesoscale Discovery读数器读取每个孔的电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。

图7描绘了代表性实验的结果。其表明由融合多肽(SEQ ID NOs：5和4)诱导的IL-2分泌水平增加。融合多肽显示出改善的细胞因子分泌，因此与基准抗体/脂质运载蛋白-Fc突变蛋白混合物(SEQ ID NOs：3和4以及SEQ ID NO：41)、包含在融合多肽中的PD-1-特异性基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)或脂质运载蛋白-Fc突变蛋白相比，T细胞活化。与基础活性相比，hIgG4(Sigma)的阴性对照几乎不诱导T细胞产生IL-2。

实施例8：使用表达LAG-3和PD-1配体的A375肿瘤细胞的功能性T细胞活化分析

我们使用另外的T细胞分析来评估融合多肽通过阻断LAG-3和PD-1与其各自的配体之间的相互作用来还原阴性检查点分子LAG-3和PD-1的抑制性信号传导的能力。在表达MHC II(LAG-3的配体)和PD-L1(PD-1的配体)的黑素瘤细胞系A375存在下，我们将不同浓度的融合多肽应用于PHA预刺激的T细胞，然后在37℃下温育3-天。作为读出结果，我们评估上清液中分泌的IL-2和IFN-γ水平。

遵循Biochrom的方案，通过聚蔗糖(Polysucrose)密度梯度(Biocoll，1.077g/mL，来自Biochrom)离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞(PBMC)。采用Pan T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)和制造商的方案自所得的PBMC中分离T淋巴细胞。将纯化的T细胞重悬浮于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。

对于该分析，将T细胞解冻16小时，并在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中培养。之后将T细胞设定密度为2x 10⁶个细胞/ml，并在培养基中用5μg/mlPHA-P(Sigma Aldrich)刺激48h。

对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。

将黑素瘤细胞系A375以5x10⁴个细胞每孔铺板并允许在加湿的5％CO₂气氛中于37℃下贴壁过夜。靶细胞在标准条件下生长之前，使用Accutase(PAA Laboratories)分离，并重悬浮于培养基中。

在接下来的几天中，在37℃下用浓度为30μg/ml的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理肿瘤细胞1小时以便阻断其增殖。用PBS洗涤板两次，并向每个孔中加入100μL的PHA预刺激的T细胞悬浮液(相当于5×10⁴个T细胞)、浓度范围为1nM至100nM的所选定的融合多肽(SEQ ID NOs：5和4)、抗体/脂质运载蛋白突变蛋白混合物、PD-1-特异性基准抗体(SEQ IDNOs：3和4)或阴性对照。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿的5％CO₂气氛中温育3天。

随后，按照针对IFN-γ分泌的实施例7中所述评估上清液中的IL-2和IFN-γ水平(关于IL-2分泌的数据未示出)。

图8中示出了示例性数据。这些数据表明采用PD-1和LAG-3双特异性融合蛋白处理明显增加了IFN-γ分泌水平。

实施例9：融合多肽的稳定性评估

为了测定作为整体稳定性的一般指标的熔融温度(T_m)，采用毛细管nanoDSC仪(CSC 6300，TA Instruments)以1℃/min扫描(25-100℃)PBS(Gibco)中1mg/mL的蛋白质浓度的融合多肽。采用积分(integrated)Nano分析软件从所示的热分析图计算T_m。

所得融合多肽的T_m以及熔融起始点列于下表6中。全部融合多肽均具有与参考抗体(SEQ ID NOs：3和4)相同范围的T_m以及熔融起始点。

表6：如通过nanoDSC测定的融合多肽的熔融温度(T_m)和熔融起始点。

为了评估储存稳定性，将在PBS中的浓度为1mg/mL的融合多肽于37℃下温育1周。在定量ELISA(qELISA)设置中测量活性融合多肽。在分析级尺寸排阻色谱中测量单体蛋白。SEQ ID NOs：5和4、SEQ ID NOs：6和4、SEQ ID NOs：3和7以及SEQ ID NOs：3和8的示例性数据示于表8。

为了分析蛋白质活性，应用如实施例5中所述的同时结合ELISA。

制备具有标准蛋白稀释物的校准曲线。为每个样品制备在校准曲线的线性范围内的三个不同的独立稀释物。将任选地补充有1％人血浆的PBS-0.1％T-2％BSA用于稀释物。参照以相同浓度和在相同基质中在-20℃下储存的未应激样品，从校准曲线计算每一样品的活性恢复(recovery)百分比。

使用PBS(Gibco)作为洗脱液，以0.3mL/min的流速，在具有两个串联的Superdex200，3.2/300Increase(GE Healthcare)的Agilent HPLC系统上进行分析级尺寸排阻色谱。参照在-20℃下冷冻的未应激参考样品，通过每一样品的单体峰面积来测定单体的恢复百分比。

为了进一步评估在血浆中的储存稳定性，将浓度为0.5mg/mL的融合多肽于37℃下在人血浆中温育1周。如所述在定量ELISA设置中测量活性融合多肽。

表8：通过在qELISA中的活性恢复和在分析级SEC中的单体含量(仅用于储存在PBS中的样品)评估的于37℃下在PBS或人血浆(HPL)中储存1周后的稳定性：在qELISA中稳定＝100+/-15％；在aSEC中稳定＝100+/-5％；对于包括参考的所有样品，已经检测到至少99面积百分比的单体含量。

本文示例性描述的实施方式可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所采用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除掉显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修饰可以在本发明请求保护的范围内。因此，应当理解的是，虽然这些实施方式已通过优选的实施方式和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修饰和变化，并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。每个较窄种类和亚属分组落入类属的公开范围内，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中去除任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以该马库什组中任何单独成员或成员亚组的形式描述。进一步的实施方式将由以下的权利要求变得显而易见。

等同物：本领域技术人员使用不超过常规实验就会认识到或者能够确定本文描述的本发明的具体实施方式的许多等同物。以下的权利要求意欲涵盖这些等同物。在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用到本说明书中并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请具体地且分别指出通过引用并入本文相同。

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Claims (47)

1.一种能够结合PD-1和LAG-3的融合多肽，其中所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基是对PD-1特异性的和第二亚基是对LAG-3特异性的。

2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一亚基包含对PD-1具有结合特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域，和其中所述第二亚基包含对LAG-3具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。

3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约1nM的EC₅₀值结合PD-1。

4.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约.3nM的EC₅₀值结合PD-1。

5.根据权利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以与包含在该融合多肽中的对PD-1特异性的抗体的EC₅₀值至少一样好或更优的EC₅₀值结合PD-1。

6.根据权利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以比包含在该融合多肽中的对PD-1特异性的抗体的EC₅₀值更低的EC₅₀结合PD-1。

7.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约2nM的EC₅₀值结合LAG-3。

8.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约1nM的EC₅₀值结合LAG-3。

9.根据权利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以与包含在该融合多肽中的对LAG-3特异性的所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC₅₀值相当的或更低的EC₅₀值结合LAG-3。

10.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够同时结合PD-1和LAG-3。

11.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约10nM的EC₅₀值同时结合PD-1和LAG-3。

12.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够以至多约.6nM的EC₅₀值同时结合PD-1和LAG-3。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的融合多肽，其中通过基本上如实施例2、3或5所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定所述EC₅₀值。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽竞争地抑制LAG-3与主要组织相容性复合体(MHC)II类的结合。

15.根据权利要求14所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中通过基本上如实施例6所述的荧光激活细胞分选(FACS)分析所述融合多肽竞争地抑制LAG-3与主要组织相容性复合体(MHC)II类结合的能力。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够共刺激T细胞响应。

17.根据权利要求16所述的融合多肽，其中在基本上如实施例7或8所述的功能性T细胞活化分析中测量共刺激T细胞响应的能力。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的融合多肽，其中在T细胞刺激存在下所述融合多肽能够诱导IL-2和/或IFN-γ产生。

19.根据权利要求18所述的融合多肽，其中在基本上如实施例7或8所述的功能T细胞活化或杀伤分析中测量诱导IL-2和/或IFN-γ产生的能力。

20.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽，其中所述第二亚基是LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白，所述LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白在人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列的序列位置14、25-34、36、48、52-53、55-58、60-61、66、79、85-86、101、104-106、108、110-112、114、121、140和153处包含一个或多个突变的氨基酸残基。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽，其中所述第二亚基是LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白，与人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列相比，所述LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸残基突变中的至少一个：Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ser，Phe，Gly，Ala，Asp或Glu；Glu 27→Asp，Val或Thr；Phe 28→Cys或Asp；Pro 29→Phe，Leu或Trp；Glu 30→Trp，Asn或Tyr；Met 31→Ile，Val，Asp，Leu或Tyr；Asn 32→Asp，Glu，Tyr，Trp，Val，Thr或Met；Leu 33→Asp，Glu或Pro；Glu 34→Val，Trp或His；Val 36→Ala；Asn 48→Asp；Lys 52→Glu，Ser，Arg或Asn；Val 53→Ala；Met 55→Ala或Val；Leu 56→Asp，Gln或Asn；Ile 57→Leu；Ser 58→Phe，Trp或Asp；Arg 60→Phe或Glu；Cys 61→Trp，Pro，Leu或Trp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Val 85→Ala；Ala 86→Asp；Cys 101→Ser或Phe；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys或Gly；His 106→Ala，Glu，Thr，Tyr，Gln或Val；Lys 108→Tyr，Phe，Thr或Trp；Val 110→Gly或Ala；Arg 111→Pro；Gly 112→Met或Thr；Lys 114→Trp或Ala；Lys 121→Thr；Ser 140→Gly；和Cys 153→Ser。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述第二亚基是LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白，与人泪液脂质运载蛋白(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列相比，所述LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸残基突变组之一：

(a)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(b)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Asn；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Ala；Gly 112→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(c)Arg 26→Phe；Glu 27→Val；Phe 28→Cys；Pro 29→Leu；Glu 30→Tyr；Met 31→Asp；Asn 32→Val；Leu 33→Pro；Leu 56→Gln；Ser 58→Trp；Arg 60→Glu；Cys 61→Leu；Cys 101→Ser；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys；His 106→Val；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(d)Arg 26→Glu；Glu 27→Thr；Phe 28→Cys；Pro 29→Trp；Glu 30→Trp；Met 31→Tyr；Asn 32→Val；Leu 33→Asp；Glu 34→His；Leu 56→Asn；Ile 57→Leu；Ser 58→Trp；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Gln；Lys 108→Trp；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(e)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Asp；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(f)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(g)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Val 36→Ala；Asn 48→Asp；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Val 85→Ala；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 140→Gly；Cys 153→Ser；

(h)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Glu；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(i)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Ile；Asn 32→Glu；Leu 33→Glu；Glu 34→Trp；Val 36→Ala；Lys 52→Glu；Val 53→Ala；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(j)Arg 26→Ser；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Phe；Glu 30→Trp；Met 31→Val；Asn 32→Asp；Leu 33→Glu；Glu 34→Val；Leu 56→Asp；Ser 58→Phe；Arg 60→Phe；Cys 61→Trp；Cys 101→Ser；Leu 105→Cys；His 106→Ala；Lys 108→Phe；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；

(k)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Trp；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Tyr；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(l)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Ala；Phe 28→Asp；Met 31→Leu；Asn 32→Val；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Ala；Gly 112→Thr；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(m)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Asp；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(n)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Glu；Phe 28→Asp；Asn 32→Thr；Lys 52→Ser；Met 55→Ala；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；

(o)Ser 14→Pro；Asp 25→Ser；Arg 26→Gly；Phe 28→Asp；Asn 32→Met；Lys 52→Arg；Met 55→Val；Ser 58→Asp；Ala 66→Asn；Ala 79→Glu；Ala 86→Asp；Cys 101→Phe；Leu 105→Gly；His 106→Gln；Lys 108→Thr；Val 110→Gly；Gly 112→Met；Lys 114→Ala；Lys 121→Thr；或

(p)Arg 26→Phe；Glu 27→Val；Phe 28→Cys；Pro 29→Leu；Glu 30→Asn；Met 31→Asp；Asn 32→Tyr；Leu 33→Pro；Leu 56→Gln；Ser 58→Trp；Arg 60→Glu；Cys 61→Pro；Cys 101→Ser；Glu 104→Tyr；Leu 105→Cys；His 106→Thr；Lys 108→Tyr；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的融合多肽，其中所述LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQ ID NOs：13-28或其片段或变体的氨基酸序列，所述片段或变体包含如权利要求20-22中任一项所限定的氨基酸残基。

24.根据权利要求1-22中任一项所述的融合多肽，其中所述LAG-3特异性脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID NOs：13-28的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的融合多肽，其中基本上如图1所述通过连接子能够将一个亚基连接至另一个亚基。

26.根据权利要求25所述的融合多肽，其中所述肽键是非结构性的(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃连接子(SEQ ID NO：2)。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的融合多肽，其中所述第一亚基是单克隆抗体。

28.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体的重链可变区选自SEQ IDNOs：59-84、112-117，和其中所述单克隆抗体的轻链可变区选自SEQ ID NOs：85-111、118-123。

29.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体的重链可变区与选自SEQID NOs：59-84、112-117的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性，和其中所述单克隆抗体的轻链可变区与选自SEQ ID NOs：85-111、118-123的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。

30.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有以下CDR序列：

a-VH-CDR1：GYTFTDYE(SEQ ID NO：163)，VH-CDR2：IDPGTGGT(SEQ ID NO：164)，VH-CDR3：TSEKFGSNYYFDY(SEQ ID NO：165)，VL-CDR1：QTIVHSDGNTY(SEQ ID NO：166)，VL-CDR2：KVS，VL-CDR3：FQGSHVPLT(SEQ ID NO：167)；或

b.VH-CDR1：GYTFTSYW(SEQ ID NO：168)，VH-CDR2：IDPSNSET(SEQ ID NO：169)，VH-CDR3：ARSRGNYAYEMDY(SEQ ID NO：170)，VL-CDR1：SSVSSNY(SEQ ID NO：171)，VL-CDR2：STS，VL-CDR3：HQWSSYPP(SEQ ID NO：172)；或

c.VH-CDR1：GYTFTDYW(SEQ ID NO：173)，VH-CDR2：IDTSDSYT(SEQ ID NO：174)，VH-CDR3：ARRDYGGFGY(SEQ ID NO：175)，VL-CDR1：QDISSY(SEQ ID NO：176)，VL-CDR2：YTS，VL-CDR3：QQYSELPW(SEQ ID NO：177)；或

d.VH-CDR1：GYTFTDYN(SEQ ID NO：178)，VH-CDR2：IDPNNGDT(SEQ ID NO：179)，VH-CDR3：ARWRSSMDY(SEQ ID NO：180)，VL-CDR1：QGISNY(SEQ ID NO：181)，VL-CDR2：YTS，VL-CDR3：QQYSNLPW(SEQ ID NO：182)；或

e.VH-CDR1：GYSITSDYA(SEQ ID NO：183)，VH-CDR2：ITYSGSP(SEQ ID NO：184)，VH-CDR3：ARGLGGHYFDY(SEQ ID NO：185)，VL-CDR1：QSISDY(SEQ ID NO：186)，VL-CDR2：YAS，VL-CDR3：QNGRSYPY(SEQ ID NO：187)；或

f.VH-CDR1：GFSLTSYG(SEQ ID NO：188)，VH-CDR2：IWRGGNT(SEQ ID NO：189)，VH-CDR3：AASMIGGY(SEQ ID NO：190)，VL-CDR1：QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO：191)，VL-CDR2：KVS，VL-CDR3：FQGSHVPL(SEQ ID NO：192)。

31.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体选自尼沃鲁单抗、帕母单抗、PDR001、MEDI0680、pidilizumab、ENUM-388D4和ENUM-244C8。

32.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有IgG4骨架。

33.根据权利要求32所述的融合多肽，其中所述IgG4骨架具有以下突变的任意之一，所述突变选自S228P、N297A、F234A和L235A。

34.根据权利要求27所述的融合多肽，其中所述单克隆抗体具有IgG1骨架。

35.根据权利要求34所述的融合多肽，其中所述IgG1骨架具有以下突变的任意之一，所述突变选自N297A、L234A和L235A。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含示于SEQ IDNOs：4和5的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：4和9的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：4和6的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：4和10的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：3和7的氨基酸、或示于SEQ IDNOs：3和8的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：3和11的氨基酸、或示于SEQ ID NOs：3和12的氨基酸。

37.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-37中任一项所述的多肽的核苷酸序列。

38.根据权利要求37所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至允许所述核酸分子表达的调节序列。

39.根据权利要求37或38所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在载体或噬菌粒载体中。

40.一种宿主细胞，其含有权利要求37-39中任一项所述的核酸分子。

41.一种产生根据权利要求1-36中任一项所述的融合多肽的方法，其中通过基因工程方法从编码所述突变蛋白的核酸开始产生所述融合多肽。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述融合多肽在细菌或真核宿主生物体中产生且自该宿主生物体或其培养物中分离。

43.一种将根据权利要求1-36中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物用于同时抑制免疫检查点PD-1和LAG-3的用途。

44.一种将根据权利要求1-36中任一项所述的融合多肽或者包含这种融合多肽的组合物用于增加抗肿瘤淋巴细胞活性的用途。

45.一种同时抑制免疫检查点PD-1和LAG-3的方法，其包括应用根据权利要求1-36中任一项所述的融合多肽或者包含这种融合多肽的组合物。

46.一种增加抗肿瘤淋巴细胞活性的方法，其包括应用根据权利要求1-36中任一项所述的融合多肽或者包含这种融合多肽的组合物。

47.一种干扰受试者中人LAG-3与主要组织相容性复合体(MHC)II类的结合的方法，其包括应用一种或多种权利要求1-36中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。