KR20180035906A - Lag-3 및 pd-1에 특이적인 신규 융합 폴리펩타이드 - Google Patents

Lag-3 및 pd-1에 특이적인 신규 융합 폴리펩타이드 Download PDF

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Abstract

본원은 지속적인 항-종양 또는 항-감염 반응을 생성하는데 유용할 수 있는, 체크포인트 PD-1 및 LAG-3 모두에 특이적인 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 융합 폴리펩타이드는 예를 들어 다양한 종양과 같은 인간 질병의 치료 또는 예방을 위한 항암제 및/또는 면역 조절제, 또는 항감염제로서 많은 약제학적 응용 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 융합 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 융합 폴리펩타이드 및 핵산 분자의 생성 방법에 관한 것이다. 추가로, 본원은 이러한 융합 폴리펩타이드의 치료적 및/또는 진단적 용도뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 이러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 개시한다.

Description

LAG-3 및 PD-1에 특이적인 신규 융합 폴리펩타이드
본원은 지속적인 항-종양 또는 항-감염 반응을 생성하는데 유용할 수 있는, 체크포인트 PD-1 및 LAG-3 모두에 특이적인 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
림프구 활성화 유전자-3 또는 LAG-3 (Cluster of Differentiation 223 또는 CD223으로도 알려짐)는 면역글로불린 슈퍼유전자 계열의 막 단백질이다. LAG-3은 CD4(cluster of differentiation 4)와 구조적 및 유전적으로 관련이 있으며, CD4 유전자 근처 염색체 12번의 짧은 팔(short arm) 말단 부분에 이의 인코딩 유전자가 위치하며, LAG-3 유전자가 유전자 중복을 통해 진화되었을 가능성이 있음을 시사한다(Triebel et al ., J Exp Med, 1990). LAG-3은 휴지 말초혈액 림프구에서는 발현되지 않지만 활성화된 T 세포 및 NK 세포(Triebel et al., J Exp Med, 1990)에서 발현되며 활성화된 B 세포(Kisielow et al ., Eur J Immunol, 2005) 및 형질세포 모양(plasmacytoid) 수지상 세포(Workman et al ., J Immunol, 2009)에서도 발현되는 것으로 보고되었다.
CD4와 마찬가지로, LAG-3은 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 II 분자에 결합하지만, 2배 높은 친화도를 가지며 CD4와는 다른 결합 부위에 결합한다 (Huard et al ., Proc Natl Acad Sci, 1997). LAG-3에 의한 수지상 세포에 대한 MHC 클래스 II 결합은 수지상 세포의 사이토카인 및 케모카인 프로파일의 변화를 유도한다 (Buisson and Triebel, Vaccine, 2003). 또한, LAG-3은 이들 세포에 의한 IL-12(interleukin 12) 및 TNF-α(tissue necrosis factor alpha)의 생성에 의해 입증된 바와 같이, 수지상 세포의 성숙을 일으키는 것으로 보고되었고, 수지상 세포의 능력 증가하여 동종 이형성 T 세포에 의한 증식 및 인터페론-감마(IFN-γ) 반응을 자극한다 (Andreae et al ., J Immunol, 2002). LAG-3 신호 전달 및 MHC 클래스 II 교차-결합은 인간 CD4+(cluster of differentiation 4 positive) 및 CD8+(cluster of differentiation 8 positive) T 세포의 일차 활성화에서 초기 사건을 억제한다고 보고되었다 (Macon-Lemaitre and Triebel, Immunology, 2005). LAG-3은 T 세포의 세포 증식, 활성화 및 항상성을 네가티브로 조절한다.
따라서, 세포 독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 및 프로그램된 세포사멸 단백질 1(PD-1)과 같이, LAG-3은 억제 면역 수용체이다. LAG-3의 T 세포 반응의 네가티브 조절 인자로서의 탁월한 역할은 특히 녹아웃 마우스와 표적-특이적 항체 모두를 기반으로 한 연구에서 PD-1과 함께 인상적으로 입증되었다 (Woo et al ., Cancer Res, 2012). 이러한 연구에서, 이중(dual) 항-LAG-3/항-PD-1 항체 치료는 단일 항체 치료에 크게 저항하는 확립된 종양의 대부분 마우스를 치료하였다. 또한, LAG-3/PD-1 이중(double) 녹아웃 마우스는 다중 이식 가능한 종양의 현저히 증가된 생존 및 클리어런스(clearance)를 보였다. 억제 면역 체크포인트로서의 PD-1과 LAG-3의 강력한 결합된 역할에 대한 추가적인 실험적 지원은 이중 녹아웃 마우스가 치명적 자가 염증 질환을 일으키기 매우 쉽다는 사실에 의해 제공되었다.
프로그램된 세포사멸 단백질 1 또는 PD-1(분화 클러스터 279 또는 CD279라고도 함)은 분화 클러스터 28(CD 28) 유전자 계열의 구성원이고, 활성화된 T, B 또는 골수계 세포 상에서 발현된다(Sharpe et al ., Nat Immunol, 2007, Greenwald et al ., Annu Rev Immunol, 2005). PD-1은 두 개의 리간드, 프로그램된 세포사멸 1 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그램된 세포사멸 1 리간드 2 (PD-L2)와 상호 작용한다. 이러한 리간드와 PD-1의 상호 작용은 지나치게 활동적인 T 세포를 국부적으로 제한함으로써 면역계를 하향 조절하는데 중요한 역할을 하며, 이는 차례로 자가 면역을 예방하고 정상 조직에서 감염이나 염증 동안 주변 내성을 유지시킨다.
PD-1은 T 세포 활성화를 네가티브라게 조절하고, T 세포 활성화에 대한 PD-1의 억제 기능은 이의 세포질 도메인의 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)와 연관되어 있다 (Greenwald et al ., Annu Rev Immunol, 2005, Parry et al ., Mol Cell Biol, 2005). PD-1의 이러한 억제 기능의 파괴는 자가 면역을 유도할 수 있다. 다른 한편, PD-1에 의한 지속적인 네가티브 신호는 만성 바이러스 감염 및 종양 면역 회피와 같은 많은 병리학적 상황에서의 T 세포 기능 장애에 연루되어 있다.
많은 암에서, PD-1은 숙주 항-종양 면역과 관련된 종양-침윤 림프구(TILs)에 의해 발현된다(Galon et al ., Science, 2006). 여러 증거들이 TILs가 PD-1 억제 조절을 받기 쉽고 항종양 면역이 PD-1/PD-L1 신호에 의해 조절된다는 것을 보여주었다. 첫째, PD-L1 발현은 많은 인간 및 마우스 종양 세포에서 확인되며, 상기 발현은 또한 인 비트로에서 IFN-γ에 의해 상향 조절될 수 있다 (Dong et al ., Nat Med, 2002). 둘째, 종양 세포에 의한 PD-L1의 발현은 인 비트로에서 항종양 T 세포에 의한 용해에 직접적으로 관련되어 있다 (Dong et al ., Nat Med, 2002, Blank et al ., Cancer Res, 2004). 셋째, PD-1 녹아웃 마우스는 종양 감염(tumor challenge)에 저항성이 있으며(Iwai et al ., Int Immunol, 2005), PD-1 녹아웃 마우스의 T 세포가 종양-보유 마우스로 옮겨질 때 종양 거부에 매우 효과적이다 (Blank et al ., Cancer Res, 2004). 넷째, 단일클론 항체에 의한 PD-1 억제 신호 차단은 마우스에서 항-종양 면역을 강화시킬 수 있다 (Iwai et al ., Int Immunol, 2005, Hirano et al ., Cancer Res, 2005). 다섯째, 종양에서의 PD-L1 발현의 높은 정도(면역조직화학 염색에 의해 검출됨)는 많은 인간 암 유형에 대한 나쁜 예후와 관련된다 (Hamanishi et al ., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007).
따라서, T 세포, NK 세포, B 세포 및 형질세포 모양 수지상 세포와 같은 LAG-3+ 림프구의 반응을 조절하고, 동시에 PD-1 억제 조절의 이러한 림프구를 완화시킬 수 있는 새로운 화합물에 대한 필요성이 존재한다. 그러한 조합은 암, 장기 이식 거부의 치료 또는 예방, 또는 자가면역 또는 자가염증 질환의 치료에 중요한 용도를 가질 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 LAG-3 및 PD-1 모두에 결합하여 면역 반응을 조절하는 신규 단백질 그룹을 제공한다.
II. 정의
다음의 목록은 본 명세서 전체적으로 사용되는 용어, 어구 및 약어를 정의한다. 본 명세서에 열거되고 정의된 모든 용어는 모든 문법적 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "LAG-3"은 인간 LAG-3(huLAG-3)을 의미하며, 인간 LAG-3의 변이체, 이소형(isoform) 및 종 상동체를 포함한다. LAG-3은 "림프구-활성화 유전자 3", "분화 클러스터 223" 또는 "CD223"로도 알려져 있으며, 이들은 상호 교환적으로 사용된다. 인간 LAG-3은 UniProt P18627 (2009년 7월 7일자 버전 5)로 정의된 전장 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 의미한다. 인간 LAG-3은 LAG3 유전자에 의해 코딩된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "PD-1"은 인간 PD-1(hPD-1)을 의미하며, 인간 PD-1의 변이체, 이소형(isoform) 및 종 상동체를 포함한다. PD-1은 "프로그램된 세포 사멸 단백질 1", "분화 클러스터 279" 또는 "CD279"로도 알려져 있으며, 이들은 상호 교환적으로 사용된다. 인간 PD-1은 UniProt Q15116로 정의된 전장 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 의미한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 코딩된다.
본 명세서에 사용되는 "검출 가능한 친화도"는 최대 약 10-5M 또는 그 이하의 Kd 또는 EC50에 의해 일반적으로 측정되는 친화도 상수(더 낮은 Kd 또는 EC50 값은 더 좋은 결합 활성을 반영함)로 선택된 표적에 결합하는 능력을 의미한다. ELISA와 같은 일반적인 방법으로 더 이상 측정할 수 없는 더 낮은 친화도인 점에서 2차적인 중요성이 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 선택된 표적(본원의 경우에, LAG-3 및/또는 PD-1)에 대해 본원의 단백질(예, 리포칼린 뮤테인 또는 항체) 또는 이의 융합 폴리펩타이드의 "결합 친화도"는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다(이에 의해 뮤테인-리간드 복합체의 Kd 값이 측정될 수 있다). 이러한 방법은 형광 적정, 경쟁 ELISA, 등온적정형 열량계(ITC)와 같은 열량 측정 방법, 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 당업계에 잘 확립되어 있으며, 또한 이의 예를 다음에 상술한다.
각각의 바인더와 이의 리간드 사이의 복합체 형성은 많은 상이한 인자들, 예컨대 각각의 결합 파트너들의 농도, 경쟁자의 존재, 사용되는 버퍼 시스템의 pH 및 이온 강도, 및 해리상수 Kd의 측정을 위해 사용되는 실험 방법(예를 들어, 형광 적정, 경쟁 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 단지 몇 가지 예) 또는 심지어 실험 데이터의 평가를 위해 사용된 수학적 알고리즘에 의해 영향을 받음을 주목한다.
따라서, 또한 Kd 값(각각의 바인더와 이의 표적/리간드 사이에 형성된 복합체의 해리상수)은 주어진 리간드에 대한 특정 리포칼린 뮤테인의 친화도를 측정하기 위해 사용한 방법 및 실험 설정에 따라서, 특정 실험 범위 내에서 다를 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 이는, 예를 들어, Kd 값이 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 경쟁 ELISA에 의해, 직접적 ELISA에 의해 또는 또 다른 방법에 의해 측정되었는지의 여부에 따라서 측정된 Kd 값 또는 허용 범위에서 약간의 편차가 있을 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "뮤테인", "돌연변이된" 독립체(단백질이든 또는 핵산이든) 또는 "돌연변이체"는 천연 유래(야생형) 핵산 또는 단백질 "기준(레퍼런스)" 스캐폴드과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 상기 용어는 또한 본 명세서에서 기술된 용어 뮤테인의 단편들 및 변이체들을 포함한다. 본원의 리포칼린 뮤테인, 이의 단편들 또는 변이체들은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 LAG-3에 결합하는 기능을 가진다.
본원의 뮤테인과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 N-말단 및/또는 C-말단이 단축된, 즉, N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산의 적어도 하나가 없는 전장 성숙한 인간 눈물 리포칼린으로부터 유래된 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 단편은 N-말단 및/또는 C 말단 아미노산의 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 (중간의 모든 수 포함)까지 부족할 수 있다. 예시적인 예로서, 그러한 단편은 4개의 N-말단 및 2개의 C-말단 아미노산을 갖지 않을 수 있다. 단편은 바람직하게 전장 눈물 리포칼린 (뮤테인)의 기능적 단편이며, 이는 바람직하게 그것이 유래된 전장의 눈물 리포칼린 (뮤테인)의 결합 포켓을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 예로서, 그러한 기능적 단편은 천연 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열의 적어도 아미노산 7-153을 포함할 수 있다. 그러한 단편은 성숙한 리포칼린의 1차 서열의 적어도 10개 이상, 예컨대 20 또는 30개 또는 그 이상 연속적인 아미노산을 포함할 수 있고, 보통 성숙한 리포칼린의 면역 분석에서 검출 가능하다. 일반적으로, 본원의 리포칼린 뮤테인의 또는 본원에 따른 조합물의, 또는 본원에 기술된 융합 단백질의 상응하는 단백질 리간드 LAG-3에 대해 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 본원에 따른 뮤테인에 의해 인식되고/되거나 결합될 전장 리간드의 능력을 보유하는 N-말단 및/또는 C-말단이 단축된 단백질 또는 펩타이드 리간드에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이유발"은 성숙한 리포칼린의 주어진 서열 위치에서 천연 유래 아미노산이 각각의 천연 폴리펩타이드 서열 내 이 특정 위치에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산으로 치환될 수 있도록 실험 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 용어 "돌연변이유발"은 또한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의한 서열 세그먼트 길이의 (추가적인) 변형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 선택된 서열 위치에서 하나의 아미노산은 3개의 무작위 돌연변이의 신장에 의해 대체되어, 야생형 단백질의 각각의 세그먼트 길이와 비교하여 2개의 아미노산 잔기의 삽입을 야기한다는 것은 본 개시내용 범주 내이다. 이러한 삽입 또는 결실은 본원에서 돌연변이 유발이 실시될 수 있는 임의의 펩타이드 세그먼트에서 서로 독립적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 하나의 예시적인 구현예에서, 선택된 리포칼린 스캐폴드의 루프 AB에 몇 가지 돌연변이의 삽입을 도입할 수 있다 (본원에 참고문헌으로 인용된 국제 특허 공개 번호 WO 2005/019256 참조).
용어 "무작위 돌연변이유발"은 미리 결정된 단일 아미노산(돌연변이)이 특정 서열 위치에서 존재하지 않지만, 적어도 2개의 아미노산이 돌연변이유발 동안 미리 정해진 서열 위치에서 특정 확률로 도입될 수 있음을 의미한다.
"동일성"은 서열의 유사성 또는 관계를 측정하는 서열의 특성이다. 본 개시내용에서 사용되는 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 본원의 폴리펩타이드의 서열을 문제의 서열과 (대응하는) 정렬 후 이들 두 서열 중 더 긴 부분에 있는 잔기 수와 관련하여 쌍으로 동일한 잔기들의 비율을 의미한다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기의 수를 잔기의 총 잔기의 수로 나누고, 생성물에 100을 곱하여 측정한다.
용어 "상동성"은 본원에서 이의 통상적인 의미로 사용되며, 본원의 폴리펩타이드의 선형 아미노산 서열(예를 들어, 본원의 임의의 리포칼린 뮤테인) 내 동등한 위치에서 보존적 치환(예를 들어, 글루타메이트 잔기가 아스파테이트 잔기로 교환)으로 간주되는 아미노산뿐만 아니라 동일한 아미노산을 포함한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성 비율은, 예를 들어, 프로그램 BLASTP, 버전 blastp 2.2.5(2002.11.16)(cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402])를 이용하여 본원에서 측정될 수 있다. 이 구현예에서, 상기 상동성 비율은 바람직하게 야생형 단백질 스캐폴드를 쌍 비교에서 레퍼런스로 사용하여 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 폴리펩타이드 서열(매트릭스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 컷 오프 값은 10-3으로 설정)의 정렬에 기초한다. 이것은 BLASTP 프로그램 결과로 표시되는 "양"의 수(상동의 아미노산)를 정렬을 위한 프로그램에 의해 선택된 아미노산의 총 수로 나눈 비율로 계산된다.
구체적으로, 리포칼린(뮤테인)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 야생형 리포칼린의 아미노산 서열에서 특정 위치에 상응하여 야생형 리포칼린과 상이한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 당업계에 잘 공지된 수단 및 방법, 예를 들어, 수동으로 또는 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 기본적 국소 정렬 검색 툴(Basic Local Alignment Search Tool)을 나타내는 BLAST2.0 또는 클러스탈W(ClustalW) 또는 서열 정렬을 생성하는데 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램을 이용하는 것에 의한 정렬을 사용할 수 있다. 따라서, 리포칼린의 야생형 서열은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로서 작용할 수 있는 반면, 본 명세서에 기재된 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린의 아미노산 서열은 "질의 서열"로서 작용한다. 용어 "야생형 서열" 및 "레퍼런스 서열" 및 "대상 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 바람직한 야생형 리포칼린은 서열번호 1에 나타낸 hTlc의 서열이다.
"갭"은 아미노산의 첨가 또는 결실의 결과인 정렬에서의 간격이다. 따라서, 정확하게 동일한 서열의 두 복제물은 100% 동일성을 갖지만, 덜 고도로 보존되고, 결실, 첨가 또는 대체를 갖는 서열은 더 낮은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 당업자는 몇몇 컴퓨터 프로그램들을 표준 매개변수를 사용한서열 동일성을 측정에 이용할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어 Blast(Altschul et al ., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2 (Altschul et al ., J Mol Biol, 1990),및 Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981).
본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 아미노산 서열의 변형, 예를 들어 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 유도체에 관한 것이다. 그러한 변형은 일부 구현예에서 단백질 또는 펩타이드의 기능을 감소시키지 않는다. 그러한 변이체는 하나 이상의 아미노산이 그들 각각의 D-입체이성질체에 의해 대체되거나 자연적으로 발생하는 20종의 아미노산, 예를 들어, 오르니틴, 하이드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 하이드록시라이신, 노르발린 이외의 아미노산에 의해 대체된 단백질을 포함한다. 그러나, 그러한 치환은 역시 보존적일 수도 있는데, 즉, 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환들의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 교체이다: 1) 알라닌, 세린, 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소루신, 루신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 본원의 리포칼린 뮤테인의 또는 본원에 따른 조합의, 및/또는 본원에 기술된 융합 단백질의 대응하는 단백질 표적 LAG-3 및/또는 PD-1과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "변이체"는 LAG-3 및/또는 PD-1 또는 이의 단편과 관련이 있고, 본원에 기술된 바와 같이 SwissProt/UniProt에 기탁된 LAG-3 또는 PD-1 레퍼런스 단백질과 같은 야생형 LAG-3 또는 PD-1 단백질과 각각 비교하여, 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 하나 이상 가진다. LAG-3 또는 PD-1 변이체 각각은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 SwissProt/UniProt에 기탁된 인간 LAG-3 또는 PD-1 레퍼런스 단백질과 같은 야생형 LAG-3 또는 PD-1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.
"천연 서열"에 의한 리포칼린은 자연에서 유래된 상응하는 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 리포칼린을 의미한다. 따라서, 천연 서열 리포칼린은 임의의 유기체, 특히 포유동물에서 유래된 각각의 자연적으로-발생하는 리포칼린의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩타이드는 자연에서 분리되거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩타이드는 특히 리포칼린의 자연적으로-발생하는 절단 또는 분비된 형태, 리포칼린의 자연적으로-발생하는 변이체 형태, 예컨대 대안적으로 스플라이싱된 형태 및 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적으로 활성이 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 그러한 변이체는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에서 첨가 또는 결실된 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 변이체는 천연 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 예시적인 예로서, 본원의 hTlc 뮤테인에서 처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기(His-His-Leu-Leu) 및 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(Ser-Asp)는 예를 들어, 서열번호 13-28의 단백질의 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 결실될 수 있다.
본원에 따라 사용될 때 용어 "위치"는 본원에 도시된 아미노산 서열 내의 아미노산의 위치 또는 본원에 도시된 핵산 서열 내의 뉴클레오타이드 위치를 의미한다. 본원에서 사용되는 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열 위치와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "상응한다" 또는 "상응하는"을 이해하기 위해, 상응하는 위치는 선행하는 뉴클레오타이드/아미노산의 수로만 측정되는 것이 아니다. 따라서, 치환될 수 있는 본원에 따른 주어진 아미노산의 위치는 (돌연변이 또는 야생형) 리포칼린에서 다른 곳에서의 아미노산의 결실 또는 첨가로 인해 다양할 수 있다. 유사하게, 치환될 수 있는 본원에 따른 주어진 뉴클레오타이드의 위치는 프로모터 및/또는 임의의 다른 조절 서열 또는 유전자(엑손 및 인트론을 포함)를 포함하는 뮤테인 또는 야생형 리포칼린 5'-비번역 영역(UTR)의 다른 곳에서 결실 또는 추가 뉴클레오타이드로 인해 다양항 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 "상응하는 위치"에 있어서, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치는 유사한 이웃하는 뉴클레오타이드/아미노산 보다 표시된 수가 다를 수 있지만, 교환, 결실 또는 첨가될 수 있는 상기 이웃하는 뉴클레오타이드/아미노산은 또한 하나 이상의 "상응하는 위치"에 의해 포함되는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 레퍼런스 서열에 기초한 리포칼린 뮤테인 내 상응하는 위치의 경우, 리포칼린 중 매우 보존된 전체 폴딩 패턴에 비추어 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 표시된 수가 다를지라도, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치는 (돌연변이 또는 야생형) 리포칼린의 다른 위치에 구조적으로 상응하는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
용어 "알부민"은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 랫트 혈청 알부민과 같은 모든 포유동물 알부민을 포함한다.
비-천연 표적에 대해 본원에서 사용되는 용어 "유기 분자" 또는 "소형 유기 분자"는 적어도 2개 이상의 탄소 원자, 바람직하게는 7 또는 12개 이하의 회전 가능한 탄소 결합을 포함하는 유기 분자를 나타내며, 100 내지 2,000 달톤 범위, 바람직하게는 100 내지 1,000 달톤 범위, 및 선택적으로 1 또는 2개의 금속 원자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "검출하다", "검출", "검출 가능한" 또는 "검출하는"은 정량적 수준과 정성적 수준 둘 다뿐만 아니라 이들의 조합으로도 이해된다. 따라서 관심 대상 분자의 정량적, 반정량적 및 정성적 측정을 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 용어 "포유동물"은 본 명세서에서 제한 없이, 단지 몇 개의 예를 들면, 인간, 가정용 및 농가의 동물 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대, 양, 개, 말, 고양이, 소, 랫트, 돼지, 유인원, 예컨대 게먹이원숭이 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 바람직하게는, 본 명세서의 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 유익하거나 목적으로 하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"샘플"은 임의의 대상체에서 얻은 생물학적 샘플로 정의된다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 대변, 정액 또는 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 융합 폴리펩타이드의 "서브유닛"은 폴리펩타이드의 아미노산의 스트레치로 정의되며, 상기 스트레치는 표적을 향하여 결합 모티프를 제공하는 것과 같은 상기 폴리펩타이드의 독특한 기능 유닛을 말한다.
본 명세서에 기재된 "융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)" 는 둘 이상의 서브유닛을 포함하고, 이들 서브유닛 중 적어도 하나 이상은 PD-1에 결합하고, 추가의 서브유닛은 LAG-3에 결합한다. 융합 폴리펩타이드 내에서, 이들 서브유닛은 공유 결합 또는 비공유 결합으로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 둘 이상의 서브유닛 간의 번역 융합이다. 번역 융합은 추가의 서브유닛의 코딩 서열과 프레임 내 하나의 서브유닛에 대한 코딩 서열을 유전자 조작하여 생성될 수 있다. 두 개의 서브유닛은 링커를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 배치되어 있을 수 있다. 그러나, 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 서브유닛은 화학적 링커에 의해서도 연결될 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드에 의해 포함될 수 있는 "링커(linker)"는 본 명세서에 기재된 융합 펩타이드의 둘 이상의 서브유닛을 연결한다. 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직한 공유 결합은 아미노산 간의 펩타이드 결합과 같은 펩타이드 결합에 의해 이루어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 링커는 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직한 링커들은 본 명세서에 기술되어 있다. 다른 바람직한 링커는 화학적 링커들이다.
도 1: 표적 PD-1 및 LAG-3에 대해 이중 특이적이거나 또는 LAG-3에 대해 단일 특이적인 본원에 기술된 대표적인 융합 폴리펩타이드의 디자인 개요를 제공한다. 도 1의 a)-e)의 대표적 이중 특이적 융합 폴리펩타이드는 PD-1에 특이적인 항체(예, 서열번호 3 및 4의 항체) 및 하나 이상의 LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인(예, 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인)에 기초하여 제조되었다. 리포칼린 뮤테인은 도 1에 나타낸 바와 같이 PD-1 특이 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N- 말단 중 어느 하나에 유전적으로 융합되어 서열번호 5 및 4, 서열번호 9 및 4, 서열번호 6 및 4, 서열번호 10 및 4, 서열번호 3 및 7, 서열번호 3 및 11, 서열번호 3 및 8, 및 서열번호 3 및 12의 융합 폴리펩티드를 생성시켰다. LAG-3 단일 특이적 융합 폴리펩타이드는 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인을 서열번호 3의 Fc 부분의 C-말단에 유전적으로 융합되어 서열번호 41 및 서열번호 42 각각 생성되었다.
도 1의 a1)-e)는 상이한 PD-1에 특이적인 항체(예, 서열번호 47 및 48의 항체) 및 하나 이상의 LAG-3에 대해 특이적인 리포칼린 뮤테인(예, 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인)을 사용하여 제조될 수 있는 추가적인 대표적 융합 폴리펩타이드를 나타낸다. 리포칼린 뮤테인은 도 1에 나타낸 바와 같이 PD-1 특이적 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N- 말단에 유전적으로 융합되어 서열번호 51 및 48, 서열번호 55 및 48, 서열번호 52 및 48, 서열번호 56 및 48, 서열번호 47 및 53, 서열번호 47 및 57, 서열번호 47 및 54, 및 서열번호 47 및 58의 융합 폴리펩타이드로 생성되었다.
도 1의 f)-i)은 PD-1에 특이적인 항체(예, 서열번호 3 및 4의 항체 또는 서열번호 47 및 48의 항체) 및 하나 이상의 LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인(예, 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인)에 기초하여 제조된 추가적인 융합 폴리펩타이드 및 이와 같은 폴리펩타이드에 상응하는 서열의 디자인을 추가로 나타낸다.
도 2: 대표적인 융합 폴리펩타이드들, 기준 항체(서열번호 3 및 4) 및 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호 43)의 PD-1에 대한 결합이 측정된 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 결과를 나타낸다. 재조합 인간 PD-1-His (C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 PD-1)를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 상기 시험된 제제(융합 폴리펩타이드, 기준 항체(서열번호 3 및 4) 및 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호 43))를 250nM의 최고 농도 및 1 : 3 희석계열로 시작하여 적정하였다. 연구 중인 결합 제제(bound agent)를 실시예 2에 기술된 바와 같이 항-인간 IgG Fc 항체를 통해 검출하였다. 데이터는 EC50 값 및 최대 시그널이 자유 파라미터이고 기울기가 1로 고정된 1 : 1 결합 모델로 조정하였다. 도 2a는 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인를 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 도시하고, 도 2b는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인를 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 나타낸다. 그 결과 EC50 값을 표 2에 제공한다.
도 3: 대표적 융합 폴리펩타이드들, 기준 항체(서열번호 3 및 4), LAG-3-결합 리포칼린 뮤테인(서열번호 17 및 27) 및 LAG-3에 결합하지 않는 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호 43)의 LAG-3에 대한 결합이 측정된 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 결과를 나타낸다. 인간 LAG-3-His (C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 LAG-3)를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 상기 시험된 제제를 250nM의 최고 농도로 시작하여 적정하였다. 연구 중인 결합 제제를 실시예 3에 기술된 바와 같이 항-Tlc 항체 또는 항-인간-IgG-Fc 항체를 통해 검출하였다. 데이터는 EC50 값 및 최대 시그널이 자유 파라미터이고 기울기가 1로 고정된 1 : 1 결합 모델로 조정하였다. 도 3a 및 3c는 항-Tlc 항체 및 항-인간-IgG-Fc 항체로 각각 검출된 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인을 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 나타낸다. 도 3b 및 3d는 항-Tlc 항체 및 항-인간-IgG-Fc 항체로 각각 검출된 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인을 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 나타낸다. 그 결과 EC50 값은 표 3에 제공된다.
도 4: 실시예 4에서 기술된 바와 같이 포유동물 세포에서 발현된 인간 PD-1 (도 4a) 또는 인간 LAG-3(도 4b) 각각에 대해 융합 폴리펩타이드의 특이적 결합을 평가하기 위하여 수행된 형광-활성화 세포 분류(FACS) 연구의 결과를 도시한다. hIgG4 (시그마)와 서열번호 43의 음성대조군 조합은 어떠한 결합도 나타내지 않았다. 형광 강도의 기하학적 평균은 최대 평균으로 표준화하였고, 1 : 1 결합 모델로 조정하였다. 생성된 EC50 값을 표 4에 제공한다.
도 5: PD-1 및 LAG-3 두 표적을 동시에 결합시키는 대표적 융합 폴리펩타이드의 능력을 측정한 ELISA 실험 결과를 나타낸다. 재조합 PD-1-His를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅한 후, 융합 폴리펩타이드를 250nM의 최고 농도로 시작하여 적정하였다. 이어서, 일정 농도의 바이오티닐화된 인간 LAG-3-Fc를 첨가하였고, 이는 실 시예 5에 기술된 바와 같이 엑스트라비딘을 통해 검출하였다. 도 5a는 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 3 및 4의 PD-1에 대한 기준 항체를 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 나타내고, 도 5b는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 3 및 4의 PD-1에 대한 기준 항체를 갖는 융합 폴리펩타이드에 대한 결과를 나타낸다.
도 6: 융합 폴리펩타이드가 실시예 6에서 기술된 바와 같이 수행된 경쟁적 FACS 연구에 나타낸 LAG-3에 대한 결합에 대한 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 분자(LAG-3의 천연 리간드)와 경쟁함을 보여준다. 일정 농도의 인간 LAG-3-Fc 융합체(인간 IgG1 Fc 단편에 융합된 인간 LAG-3 세포 외 도메인) 및 융합 폴리펩타이드 또는 대조군의 희석계열을 MHC 클래스 II 양성 인간 세포주 A375와 함께 인큐베이션 하였다. 세포-결합된 huLAG-3-Fc는 형광 표지된 항-IgG Fc 항체를 사용하여 검출하였다. LAG-3 및 PD-1 이중 특이적 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드 또는 LAG-3 단일 특이적 Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드에 의해 MHC 클래스 II 분자에 대한 huLAG-3-Fc 결합의 투여량 의존적 억제가 관찰되었다.
도 7: 서열번호 5 및 4의 융합 폴리펩타이드가 T 세포 활성화를 유도하는 능력을 조사한 대표적인 실험의 결과를 나타낸다. 기준 항체(서열번호 3 및 4) 및 기준항체(서열번호 3 및 4)와 Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드(서열번호 41)의 혼합물 또한 시험하였다. 실험에서, 포도상구균의 장독소 B(SEB) 자극된 사람 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 두 가지 상이한 농도에서 융합 폴리펩타이드 또는 대조군과 인큐베이션 하였다. T 세포 활성화를 반영하는 분비된 인터루킨 2(IL-2)의 수준을 실시예 7에 기술된 바와 같이, T 세포 활성화에 대한 판독값으로서 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정하였다.
도 8: T 세포 활성화를 유도하는 서열번호 5 및 4의 융합 폴리펩타이드의 능력을 조사한 대표적 실험 결과를 나타낸다. 기준 항체(서열번호 3 및 4) 및 기준 항체(서열번호 3 및 4)와 Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드(서열번호 41)의 혼합물 또한 시험하였다. 실험에서, 흑색종 A375 세포를 코팅하고 밤새 접착시켰다. 다음날, 피토헤마글루티닌(PHA)으로 전처리된 정제된 T 세포를 다양한 농도의 이중 특이적 융합 폴리펩타이드 및 대조군의 존재 하에 상기 코팅된 세포 상에서 인큐베이션 하였다. T 세포 활성화를 반영하는 상등액 인터페론 감마(IFN-γ)의 수준을 실시예 8에 기술된 바와 같이 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정하였다.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 임의의 순서로 적어도 2개 이상의 서브유닛을 함유한다: (1) PD-1에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 서브유닛, 및 (2) LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함하는 제2 서브유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 또한 제3 서브유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 LAG-3에 특이적인 제3 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제3 서브유닛은 LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 예를 들어, 2개의 리포칼린 뮤테인은 면역글로불린 서브유닛인 하나는 C-말단에, 다른 하나는 면역글로불린의 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나의 서브유닛은 기본적으로 도 1에 기재된 바와 같이 또 다른 서브유닛에 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나의 리포칼린 뮤테인은 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린 중쇄 도메인(VH)의 C-말단, VH의 N-말단, 면역글로불린 경쇄(VL)의 C-말단, 및/또는 VL의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1). 일부 특정 구현예에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 면역글로불린 서브유닛에 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 융합될 수 있다. 예를 들어, 상기 리포칼린 뮤테인은 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단 또는 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 펩타이드 결합은 링커, 예를 들어 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 비구조식 (G4S)3 링커일 수 있다. 링커는 1~50개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산을 포함한다
이와 관련하여, 하나의 서브유닛은 또 다른 서브유닛에 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 융합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 서브유닛이 전장 면역글로불린을 포함하고, 또 다른 서브유닛은 펩타이드 결합을 통해 제2 서브유닛의 N-말단과 상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 제3 서브유닛은 펩타이드 결합을 통해 제3 결합 도메인의 N-말단과 상기 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 상기 펩타이드 결합은 링커. 예를 들어 서열번호 2에 나타낸 바와 같이, 바람직하게 비구조식 (G4S)3 링커일 수 있다.
본원의 융합 폴리펩타이드에 관한 일부 구현예에서, 이의 서브유닛 중 하나는 전장 면역글로불린을 포함하고, 폴리펩타이드가 PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합하는 동안 Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 동시에 보존될 수 있다.
본원의 융합 폴리펩타이드에 관한 일부 다른 구현예에서, 이의 서브유닛 중 하나는 전장 면역글로불린을 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합하는 동안 Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 단백질 조작에 의해 감소되거나 완전히 억제될 수 있다. 이는 IgG4가 IgG1에 비해 감소된 Fc-감마 수용체 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 예를 들어, IgG1 백본에서 IgG4로 전환함으로써 달성될 수 있다. Fc-감마 수용체에 대한 추가 결합을 줄이기 위해 F234A 및 L235A와 같은 IgG4 백본에 돌연변이가 도입될 수 있다. 또한, S228P 돌연변이가 IgG4 절반-항체의 교환을 최소화하기 위해 IgG4 백본에 도입될 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 추가의 N297A 돌연변이가 천연 글리코실화 모티프를 제거하기 위해 융합 폴리펩타이드의 면역글로불린 중쇄에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 및 LAG-3에 대한 동시 결합의 결과로, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 지속적인 항종양 또는 항감염 반응을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 융합 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린의 Fc 부분은 체내에서의 안정성과 지속성에 중요한 융합 폴리펩타이드의 혈청 수준을 유지하는데 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피세포 및 포식세포 상의 Fc 수용체에 결합할 때, 융합 폴리펩타이드는 내재화되고 혈류로 재순환되어 체내 반감기를 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 폴리펩타이드가 실시예 2에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석에서 측정될 때, 최대 약 10 nM 이하, 예컨대 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 심지어 약 0.5 nM 이하의 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 면역글로불린과 상기 융합 폴리펩타이드가 실시예 2에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 서열번호 3 및 4에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체와 같은 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는 PD-1에 특이적인 면역글로불린의 EC50 값과 비슷한 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 폴리펩타이드가 실시예 3에 필수적으로 기술된 ELISA 분석에서 측정될 때, 최대 약 10 nM 이하, 예를 들면 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 심지어 약 0.5 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 리포칼린 뮤테인 및 상기 폴리펩타이드가 실시예 3에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 예를 들어 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인을 포함하는 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는, LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 EC50 값과 적어도 동등하거나 그보다 우수한 EC50 값으로 LAG-3에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 및 LAG-3 모두에 대한 본원의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 상기 폴리펩타이드가 실시예 5에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, PD-1 및 LAG-3 동시에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 예를 들어 실시예 5에 필수적으로 기술된 바와 같이 ELISA 분석에서 측정될 때, 최대 약 100 nM 이하의 EC50 값으로 PD-1 및 LAG-3를 동시에 결합시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 융합 폴리펩타이드는 항원-제시 세포(APC) 또는 종양 세포에서 발현되는 것과 같은 MHC 클래스 Ⅱ에 대한 LAG-3의 결합을 억제할 수 있다. 억제 작용 방식은 예를 들어 실시예 6에 필수적으로 기술된 바와 같이 FACS 분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 실시예 7 및 8에 필수적으로 기술된 바와 같이 기능적 T 세포 활성화 분석에서 T 세포 활성화를 반영하는 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 유도할 수 있고, 심지어 보다 높은 코팅 농도에서 보다 강한 IL-2 및/또는 IFN-γ 유도 경향을 나타낼 수 있다.
A. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 예시적인 면역글로불린.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드와 관련하여 제1 결합 도메인은 PD-1에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함한다. 상기 면역글로불린은 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4일 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 면역글로불린은 PD-1에 대한 단일클론 항체이다.
본원의 PD-1 결합 항체들의 예시는, 당업계에 공지된 니볼루맙(또한 Opdivo로 판매되는 ONO-4538, BMS-936558 또는 MDX1106으로 알려짐), 펨브롤리주맙(lambrolizumab 또는 MK03475, 상품명 Keytruda라고도 함), PDR001, MEDI0680(이전의 AMP-514), 피딜리주맙(CT-011), ENUM-388D4 또는 ENUM-244C8 항체들의 VH 및 VL 영역을 포함하는 PD-1 결합 항체와 동일한 항원 결정기에 교차-블록 또는 결합하는 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 PD-1 결합 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, PDR001, MEDI0680, 피딜리주맙, ENUM-388D4 및 ENUM-244C8으로 구성된 군에서 선택된 항체로부터 3개의 중쇄 상보적 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 중 임의의 하나와 같은 항원 결합 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 또는 이의 항원 결합 도메인에 결합하는 항체는 서열번호 124 내지 154로 이루어진 군에서 선택된 서열 중 임의의 하나에 교차 블록하거나 결합하는 항원 결합 영역을 갖는다
일부 구현예에서, PD-1에 결합하는 항체는 서열번호 3 및 4의 기준(벤치마크) 항체 또는 서열번호 47 및 48의 기준 항체의 서열을 가질 것이다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 서열번호 59 내지 84로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 서열번호 85 내지 111로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR)을 가질 것이다. 다른 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 서열번호 112 내지 117로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 서열번호 118 내지 123으로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR)을 가질 것이다.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 항원 결합 도메인은 HCVR, 즉 서열번호 59-84, 112-117 중 임의의 하나를 포함하는 중쇄 및 LCVR, 즉 서열번호 85-111, 118-123 중 임의의 하나를 포함하는 경쇄를 가질 것이다.
일부 구현예에서, PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍은 다음과 같이 HCVR 및 LCVR 각각을 포함한다: 서열번호 112 및 118; 서열번호 112 및 119; 서열번호 112 및 120; 서열번호 112 및 121; 서열번호 112 및 122; 서열번호 112 및 123; 서열번호 113 및 118; 서열번호 113 및 119; 서열번호 113 및 120; 서열번호 113 및 121; 서열번호 113 및 122; 서열번호 113 및 123; 서열번호 114 및 118; 서열번호 114 및 119; 서열번호 114 및 120; 서열번호 114 및 121; 서열번호 114 및 122; 서열번호 114 및 123; 서열번호 115 및 118; 서열번호 115 및 119; 서열번호 115 및 120; 서열번호 115 및 121; 서열번호 115 및 122; 서열번호 115 및 123; 서열번호 116 및 118; 서열번호 116 및 119; 서열번호 116 및 120; 서열번호 116 및 121; 서열번호 116 및 122; 서열번호 116 및 123; 서열번호 117 및 118; 서열번호 117 및 119; 서열번호 117 및 120; 서열번호 117 및 121; 서열번호 117 및 122; 및 서열번호 117 및 123.
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 서열번호 59 내지 84로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR), 및 서열번호 85 내지 111로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 가질 것이다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 서열번호 112 내지 117로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 서열번호 118 내지 123으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상 또는 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 가질 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, PD-1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, PDR001, MEDI0680, 피딜리주맙, ENUM-388D4, 또는 ENUM-244C8 또는 이의 항원 결합 도메인이다.
다양한 특허 출원은 항-PD-1 항체, 이의 생산 및/또는 다음을 포함하는 항-PD-1 항체로 면역 반응을 증강시키는 방법을 개시한다: 미국특허 공개 번호. US 2003/0039653, US 2004/0213795, US 2006/0110383, US 2007/0065427, US 2007/0122378, US 2009/0217401, US 2011/0008369, and US2015/0203579 및 PCT 국제출원 공개 번호 WO 2003/099196, WO 2006/121168, WO 2007/005874, WO 2008/156712, WO 2009114335, WO 2010/027423, WO2 011/110604, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/194302, WO 2015/035606, 및 WO 2016/106159. 이들 각각의 출원의 개시는 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 PD-1 결합 항체는 상기에 언급된 출원에서 개시된 항-PD-1 항체 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 PD-1 결합 항체는 상기에 언급된 출원에 개시된 항 PD-1 결합 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 영역을 포함하는 PD-1 결합 항체와 동일한 항원 결정기에 교차-블록 또는 결합하는 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, PD-1 결합 항체는 상기 언급된 출원들에 개시된 항-PD-1 항체들 중 어느 하나로부터 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDRs) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 중 어느 하나와 같은 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GYTFTDYE (HCDR1, 서열번호 163), IDPGTGGT (HCDR2, 서열번호 164), TSEKFGSNYYFDY (HCDR3; 서열번호 165). 일부 구현예 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GYTFTSYW (HCDR1, 서열번호 168), IDPSNSET (HCDR2, 서열번호 169), ARSRGNYAYEMDY (HCDR3; 서열번호 170). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GYTFTDYW (HCDR1, 서열번호 173), IDTSDSYT (HCDR2, 서열번호 174), ARRDYGGFGY (HCDR3; 서열번호 175). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GYTFTDYN (HCDR1, 서열번호 178), IDPNNGDT (HCDR2, 서열번호 179), ARWRSSMDY (HCDR3; 서열번호 180). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GYSITSDYA (HCDR1, 서열번호 183), ITYSGSP (HCDR2, 서열번호 184), ARGLGGHYFDY (HCDR3; 서열번호 185). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: GFSLTSYG (HCDR1, 서열번호 188), IWRGGNT (HCDR2, 서열번호 189), AASMIGGY (HCDR3; 서열번호 190).
일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: QTIVHSDGNTY (LCDR1, 서열번호 166), KVS (LCDR2), FQGSHVPLT (LCDR3, 서열번호 167). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: SSVSSNY (LCDR1, 서열번호 171), STS (LCDR2), HQWSSYPP (LCDR3, 서열번호 172). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: QDISSY (LCDR1, 서열번호 176), YTS (LCDR2), QQYSELPW (LCDR3, 서열번호 177). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: QGISNY (LCDR1, 서열번호 181), YTS (LCDR2), QQYSNLPW (LCDR3, 서열번호 182). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: QSISDY (LCDR1, 서열번호 186), YAS (LCDR2), QNGRSYPY (LCDR3, 서열번호 187). 일부 구현예에 있어서, PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 것이다: QSIVHSNGNTY (LCDR1, 서열번호 191), KVS (LCDR2), FQGSHVPL (LCDR3, 서열번호 192).
일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GYTFTDYE (HCDR1, 서열번호 163), IDPGTGGT (HCDR2, 서열번호 164), TSEKFGSNYYFDY (HCDR3; 서열번호 165), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: QTIVHSDGNTY (LCDR1, 서열번호 166), KVS (LCDR2), FQGSHVPLT (LCDR3, 서열번호 167)을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GYTFTSYW (HCDR1, 서열번호 168), IDPSNSET (HCDR2, 서열번호 169), ARSRGNYAYEMDY (HCDR3; 서열번호 170), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: SSVSSNY (LCDR1, 서열번호 171), STS (LCDR2), HQWSSYPP (LCDR3, 서열번호 172)을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GYTFTDYW (HCDR1, 서열번호 173), IDTSDSYT (HCDR2, 서열번호 174), ARRDYGGFGY (HCDR3; 서열번호 175), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: QDISSY (LCDR1, 서열번호 176), YTS (LCDR2), QQYSELPW (LCDR3, 서열번호 177)을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GYTFTDYN (HCDR1, 서열번호 178), IDPNNGDT (HCDR2, 서열번호 179), ARWRSSMDY (HCDR3; 서열번호 180), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: QGISNY (LCDR1, 서열번호 181), YTS (LCDR2), QQYSNLPW (LCDR3, 서열번호 182)을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GYSITSDYA (HCDR1, 서열번호 183), ITYSGSP (HCDR2, 서열번호 184), ARGLGGHYFDY (HCDR3; 서열번호 185), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: QSISDY (LCDR1, 서열번호 186), YAS (LCDR2), QNGRSYPY (LCDR3, 서열번호 187)을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 중쇄 가변 영역: GFSLTSYG (HCDR1, 서열번호 188), IWRGGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 189), AASMIGGY (HCDR3; 서열번호 190), 및 다음 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 가질 경쇄 가변 영역: QSIVHSNGNTY (LCDR1, 서열번호 191), KVS (LCDR2), FQGSHVPL (LCDR3, 서열번호 192)을 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 개시된 모든 CDR 서열은 Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)에 기재된 IMGT 방법에 따라 정의된다. CDR1은 27 내지 38 위치, CDR2는 56 내지 65 위치, 생식선 V- 유전자에 대한 CDR3은 105 내지 116 위치, 재배열된 V-J- 유전자 또는 V-D-J- 유전자에 대한 CDR3은 105 내지 117 위치(J-PHE 또는 J-TRP 118 이전 위치)로 구성되며, 13개 미만의 아미노산을 갖는 재배열된 CDR3-IMGT에 대한 루프 상부에 갭을 갖고, 또는 13개 이상의 아미노산을 갖는 재배열된 CDR3-IMGT에 대한 추가 위치 112.1, 111.1, 112.2, 111.2 등을 갖는다. 이 단락에 주어진 위치는 Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)에 기술된 IMGT 넘버링에 따른다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 PD-1 결합 항체와 관련하여, 침묵된 작동인자 기능을 갖는 항체는 F234 및 L235에서, 또는 위치 D265 및 P329에서 Kabat의 EU 인덱스에 따라 넘버링을 갖는 것이 바람직하다(Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000).
본 발명의 융합 폴리펩타이드에 포함된 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명의 이중 특이적 결합 분자의 인비보 반감기를 연장시키는 것을 허용하는 Fc 부분을 포함할 수 있다. 그러한 Fc 부분은 바람직하게는 인간 기원, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체의 인간 Fc 부분, 더욱 바람직하게는 활성화 또는 침묵 작용인자 기능(effector functions)을 갖는 IgG1 또는 IgG4의 조작된 인간 Fc 부분이며, 상기 침묵 작동인자 기능이 활성화 작동인자 기능 보다 바람직하다. 가장 바람직하게는, 이러한 Fc 부분은 234 및/또는 235 위치에서 돌연변이를 갖는 침묵 작동인자 기능으로 조작되며, Kabat의 EU 인덱스(Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000)에 따라 넘버링한다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체의 위치 F234 및 L235에서의 돌연변이들은 침묵 작동인자 기능에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 항-PD-1 항체의 D265 및 P329 위치에서 돌연변이들은 침묵 작용인자 기능을 위해 도입될 수 있다. 이러한 잠재적 돌연변이들의 두 세트에 대한 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스(Shields et al., J Biol Chem, 2001)에 따른다.
항체들 및 이의 단편들 생산을 위한 다양한 기술들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Altshuler et al . (Biochemistry (Mosc), 2010)에 기술되어 있다. 따라서, 첨가제 및 보조제와 혼합하여 항원으로 면역시킨 후 동물의 혈액으로부터 다클론 항체를 수득할 수 있으며, 연속 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 임의의 기술로 단클론 항체를 생산할 수 있다. 그러한 기술들에 대한 예들로는 예컨대 Harlow and Lane (1999), (1988)에 기술되어 있으며, Kohler 및 Milstein, 1975에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B세포 하이브리도마 기술(예. Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Kozbor and Roder, Immunol Today, 1983 참조) 및 인간 단일클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al ., Cancer Res, 1984)을 포함한다. 또한, 재조합 항체들은 단클론 항체로부터 수득되거나 파지, 리보솜, mRNA 또는 세포 디스플레이와 같은 다양한 표시 방법을 사용하여 새롭게 제조될 수 있다. 재조합(인간화된) 항체 또는 이의 단편의 발현에 적합한 시스템은 예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충, 포유돌물 세포주 또는 형질전환 동물 또는 식물에서 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,080,560호; Holliger and Hudson, Nat Biotechnol, 2005 참조). 또한, 단일 사슬 항체들의 제조에 대해 기술된 기술들은 본 발명의 표적에 특이적인 단일 사슬 항체들을 생산(그 중에서도, 미국 특허 제4,946,778호 참조)하도록 적용될 수 있다. BIAcore 시스템에서 사용되는 표면 플라스몬 공명은 파지 항체들의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
B. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 예시적인 LAG -3-특이적 리포칼린 뮤테인 .
본원에서 사용된 "리포칼린"은 약 18-20 kDa 중량의 단량체 단백질로서 정의되며, 하나의 말단에 복수의 (바람직하게는 4개) 루프(loof)에 의해 복수의(바람직하게는 8개) β-가닥이 쌍으로 연결되어 결합 포켓으로 정의되는 것을 포함하는 원통형 β-주름 시트(β pleated sheet) 슈퍼 2차 구조 영역을 가진다. 그것은 각각 다른 크기, 형태 및 화학적 성질의 표적들을 수용할 수 있는, 리포칼린 패밀리 구성원들 간의 다양한 결합 모드를 야기하는 다른 견고한 리포칼린 스캐폴드에서 루프의 다양성이다 (예, in Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al ., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996). 사실 단백질의 리포칼린 패밀리는 고도로 보존된 전반적인 폴딩 패턴을 유지하나 비정상적으로 낮은 수준의 전반적인 서열 보존성 (흔히 20% 이하의 서열 동일성)을 공유하면서 넓은 범위의 리간드에 결합하기 위해 자연적으로 진화해 왔다. 다양한 리포칼린에서 위치들 간의 일치는 당업자에게 잘 알려져 있다(예, 미국 특허 제7,250,297호 참조).
상기 언급한 바와 같이, 리포칼린은 이의 슈퍼 2차 구조, 즉 결합 포켓으로 정의되는 하나의 말단에 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트 슈퍼 2차 구조 영역에 의해 정의되는 폴리펩타이드이다. 본 발명은 본원에 구체적으로 개시된 리포칼린 뮤테인에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 본 발명은 결합 포켓으로 정의되는 하나의 말단에 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트 슈퍼 2차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인에 관한 것이고, 여기서 레퍼런스 서열과 비교하여 상기 4개의 루프 중 적어도 3개 이상의 각각의 적어도 하나 이상의 아미노산이 돌연변이되고, 상기 리포칼린은 검출 가능한 친화도로 LAG-3에 결합하는데 효과적이다.
하나의 특정 구현예에서, 본원에 개시된 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포 칼린(hTlc 또는 TLPC)의 뮤테인이며, 리포칼린-1, 인간 눈물 프리-알부민 또는 폰 에브너 글랜드 단백질(von Ebner gland protein)로도 불린다. 본원에 사용된 상기 용어 "인간 눈물 리포칼린" 또는 "hTlc" 또는 "리포칼린-1"은 SWISS-PROT/UniProt Data Bank Accession Number P31025(아이소형 1(isoform 1)를 갖는 성숙한 인간 눈물 리포칼린을 나타낸다. SwissProt/UniProt Data Bank Accession Number P31025에 나타낸 아미노산 서열을 바람직한 "레퍼런스 서열"로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 레퍼런스 서열로 본원에 사용한다.
일부 구현예에서, 검출 가능한 친화도를 갖는 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인은 또 다른 아미노산, 예를 들어 세린 잔기에 의해 상기 레퍼런스 서열의 천연 시스테인 잔기의 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 검출 가능한 친화도를 갖는 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인은 야생형 리포칼린의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 하나 이상의 비-천연 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 추가 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 시스테인 잔기에 의해 천연 아미노산의 적어도 둘 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이로서 하나 이상의 시스테인 브릿지를 형성한다. 일부 구현예에서, 상기 시스테인 브릿지는 적어도 둘 이상의 루프 영역을 연결할 수 있다. 이들 영역의 정의는 Flower (Biochem J, 1996), (Biochim Biophys Acta, 2000) 및 Breustedt et al . (J Biol Chem, 2005)에 따라 본원에서 사용된다. 관련된 구현예에서, 본원은 LAG-3에 결합함으로써 LAG-3의 하향 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 리포칼린 뮤테인을 개시한다.
LAG-3를 겨냥하거나 특이적인 본원의 단백질은 정의된 단백질 스캐폴드, 바람직하게 리포칼린 스캐폴드를 기반으로 하는 특이-결합 단백질 뮤테인의 임의의 수를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 교환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 예컨대 25, 30, 35, 40, 45 또는 50이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11이 바람직하고 9, 10 또는 11이 더욱 바람직하다. 그러나, 본원의 단백질 뮤테인은 여전히 LAG-3에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 검출 가능한 친화도를 갖는 LAG-3에 결합하는 다양한 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 이러한 의미에서, LAG-3은 레퍼런스 야생형 리포칼린의 비-천연 리간드로 간주될 수 있고, 여기서 "비-천연 리간드"는 생리학적 조건 하에서 야생형 리포칼린에 결합하지 않는 화합물을 의미한다. 특정 서열 위치들에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 야생형 리포칼린을 조작함으로써, 본 발명은 비-천연 리간드, 예를 들어 LAG-3에 대한 높은 친화도와 높은 특이도가 가능함을 입증하였다. 일부 구현예에서, 야생형 리포칼린 상의 특정 서열 위치를 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 심지어 더 많은 뉴클레오타이드 삼중항들(triplet(s))에서, 뉴클레오타이드의 삼중항의 서브세트에 의해 이들 위치에서 치환을 허용함으로써 무작위 돌연변이 유발이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 레퍼런스 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 특정 서열 위치에 상응하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 서열 위치를 포함하는, 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기를 가질 수 있다.
본원의 리포칼린 뮤테인은 돌연변이된 아미노산 서열 위치 외에 "모체(parental)" 단백질 스캐폴드(예, 리포칼린 스캐폴드)의 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 따른 리포칼린 뮤테인은 또한 그러한 돌연변이가 적어도 필수적으로 뮤테인의 결합 활성 및 접힘을 방해하지 않거나 간섭하지 않는 한 하나 이상의 서열 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 지닐 수 있다. 그러한 돌연변이는 확립된 표준 방법들(Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual)을 사용하여 DNA 수준에서 매우 쉽게 이루어질 수 있다. 아미노산 서열의 변경 예로는 아미노산 치환뿐만 아니라 삽입 또는 결실이다. 그러한 치환들은 보존적, 즉 아미노산 잔기는 특히 극성 및 크기와 관련하여 화학적으로 유사한 성질의 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환의 예는 다음 그룹의 구성원들 간의 대체물이다 : 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소-루신, 루신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 다른 한편, 아미노산 서열에 비보존적 변경을 도입하는 것도 가능하다. 추가로, 단일 아미노산 잔기를 대체하는 대신에, 레퍼런스 리포칼린, 바람직하게 hTlc의 1차 구조의 하나 또는 그 이상의 연속하는 아미노산을 삽입 또는 결실시키는 것이 가능하며, 이들 결실 또는 삽입은 안정한 접힌 그리고 기능적 뮤테인을 초래한다. 이러한 뮤테인에서, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 첨가되거나 결실된다(예를 들어, N-말단 및 C-말단이 절단된 Tlc 뮤테인). 일반적으로, 이러한 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 예컨대 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 예로서, 본 발명은 또한 성숙한 인간 눈물 리포칼린(His-His-Leu-Leu; 1-4번 위치)의 서열의 처음 네 개의 N-말단 아미노산 잔기 및/또는 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(Ser-Asp; 157-158번)가 결실되어 있다 (서열번호 13-28).
본원에 개시된 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 다른 리포칼린과의 서열 동일성을 비교할 때 레퍼런스 리포칼린, 바람직하게 hTlc에 대해 높은 서열 동일성을 갖는다. 이러한 일반적인 맥락에서, 아미노산의 첨가 또는 결실의 결과인 정렬에서 갭(아래 정의된 바와 같은)이 있을 가능성을 가진다는 조건 하에, 본원의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 레퍼런스 리포칼린의 아미노산 서열과 적어도 실질적으로 유사하다. 레퍼런스 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한, 본원의 리포칼린 뮤테인의 각각의 서열은, 일부 구현예에서, 레퍼런스 리포칼린의 서열에 대해 적어도 70% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 75% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 80% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 85% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 87% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 95% 이상의 동일성 또는 서열 상동성을 가진다, 단, 변경된 위치 또는 서열은 유지되고 하나 이상의 갭이 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원의 리포칼린 뮤테인은 결합 특이성이 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이므로 그 표적과 하나 이상의 레퍼런스 표적을 구별할 수 있다면 표적(예를 들어, LAG-3)과 "특이적으로 결합"한다. 그러나 상대적인 성질. "특이적 결합"은 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, FACS, RIA(radioimmunoassay), ECL (electrochemiluminescence), IRMA(Immunoadiometric assay), IHC (ImmunoHistoChemistry) 및 펩타이드 스캔에 따라 측정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인을 제공한다.
이와 관련하여, 본원은 약 300 nM 이하 및 심지어 약 100 nM 이하의 Kd로 측정된 친화도로 LAG-3에 결합할 수 있는 하나 이상의 hTlc 뮤테인을 제공한다.
일부 구현예에서, 그러한 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 그러한 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 및 108 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 그러한 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 101, 111, 114 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 더 포함할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 상기 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다,
일부 추가 구현예에서, 상기 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 서열 위치에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 심지어 그 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있고, 상기 폴리펩타이드가 LAG-3, 특히 인간 LAG-3에 결합한다.
일부 추가 구현예에서, 본 발명은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)과 비교하여, 상기 폴리펩타이드가 hTlc 뮤테인인 폴리펩타이드에 관한 것이며, 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 서열 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 심지어 그 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기들을 포함하고 상기 폴리펩타이드가 LAG-3, 특히 인간 LAG-3에 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 리포칼린 뮤테인은 예를 들면 세린 잔기에 의해 천연 시스테인 잔기의 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 따른 hTlc 뮤테인은 세린 잔기와 같은 또 다른 아미노산에 의해 61 및/또는 153 위치에서 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 맥락에서, 시스테인 잔기 61 및 153에 의해 형성(cf. Breustedt et al ., J Biol Chem, 2005)된 야생형 눈물 리포칼린의 구조적 이황화 결합(각각의 천연 핵산 라이브러리 수준에서)의 제거는 안정하게 접힐 뿐만 아니라 높은 친화도로 주어진 비천연 리간드에 결합할 수 있는 눈물 리포칼린 뮤테인을 제공할 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 따른 Tlc 뮤테인은 Cys61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro 또는 Trp 및/또는 Cys 153, Lys, Arg, Thr 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 Cys 61과 Cys 153을 연결하는 자연적으로 발생하는 이황화 브릿지의 형성을 방지하고 따라서 뮤테인의 취급을 용이하게 하는데 유용하다는 것이 입증되었다. 그러나, LAG-3에 결합하고 Cys 61과 Cys 153 간에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 hTlc도 본 발명의 일부이다.
일부 구현예에서, 구조적 이황화 결합의 제거는 본원의 뮤테인으로 비-천연 인공적인 이황화 결합의 (자발적인) 생성 또는 계획적인 도입을 가능하게 하여 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 61, 101 및 153 위치에서 시스테인 코돈 중 둘 또는 셋 모두가 또 다른 아미노산의 코돈으로 대체된다. 또한, 일부 구현예에서, 본원에 따른 hTlc 뮤테인은 101 위치에서 세린 잔기 또는 히스티딘 잔기에 의해 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)에 대하여 28 또는 105 위치에서 시스테인 잔기에 의해 천연 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 일부 구현예에서, 본원에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)에 대하여 111 위치에서 프롤린 잔기에 의해 천연 아르기닌 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 본원에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)에 대하여 114 위치에서 트립토판 잔기 또는 글루탐산에 의해 천연 리신 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 LAG-3-결합 Tlc 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 다음 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Phe, Gly, Ala, Asp 또는 Glu; Glu 27 → Asp, Val 또는 Thr; Phe 28 → Cys 또는 Asp; Pro 29 → Phe, Leu 또는 Trp; Glu 30 → Trp, Asn 또는 Tyr; Met 31 → Ile, Val, Asp, Leu 또는 Tyr; Asn 32 → Asp, Glu, Tyr, Trp, Val, Thr 또는 Met; Leu 33 → Asp, Glu 또는 Pro; Glu 34 → Val, Trp 또는 His; Val 36 → Ala; Asn 48 → Asp; Lys 52 → Glu, Ser, Arg 또는 Asn; Val 53 → Ala; Met 55 → Ala 또는 Val; Leu 56 → Asp, Gln 또는 Asn; Ile 57 → Leu; Ser 58 → Phe, Trp 또는 Asp; Arg 60 → Phe 또는 Glu; Cys 61 → Trp, Pro, Leu 또는 Trp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Val 85 → Ala; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Ser 또는 Phe; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys 또는 Gly; His 106 → Ala, Glu, Thr, Tyr, Gln 또는 Val; Lys 108 → Tyr, Phe, Thr 또는 Trp; Val 110 → Gly 또는 Ala; Arg 111 → Pro; Gly 112 → Met 또는 Thr; Lys 114 → Trp 또는 Ala; Lys 121 → Thr; Ser 140 → Gly 및 Cys 153 → Ser. 일부 구현예에서, 본원의 hTlc 뮤테인은 hTlc (서열번호 1)의 이러한 서열 위치에서 2 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 심지어 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 모두 돌연변이된 아미노산 잔기들을 포함한다.
일부 추가 구현예에서, 상기 LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)과 비교하여 다음 아미노산 치환 세트 중 하나를 포함한다:
(a) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(b) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Asn; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Ala; Gly 112 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(c) Arg 26 → Phe; Glu 27 → Val; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Leu; Glu 30 → Tyr; Met 31 → Asp; Asn 32 → Val; Leu 33 → Pro; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Glu; Cys 61 → Leu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys; His 106 → Val; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(d) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Thr; Phe 28 → Cys; Pro 29 →Trp; Glu 30 → Trp; Met 31 → Tyr; Asn 32 → Val; Leu 33 → Asp; Glu 34 → His; Leu 56 → Asn; Ile 57 → Leu; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Gln; Lys 108 → Trp; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(f) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(g) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Val 36 → Ala; Asn 48 → Asp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 140 → Gly; Cys 153 → Ser;
(h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Glu; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(i) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Val 36 → Ala; Lys 52 → Glu; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(j) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Val; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(k) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Trp; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Tyr; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(l) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ala; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 →Val; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Ala; Gly 112 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(m) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(n) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(o) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Met; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 또는
(p) Arg 26 → Phe; Glu 27 → Val; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Leu; Glu 30 → Asn; Met 31 → Asp; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Pro; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Glu; Cys 61 → Pro; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys; His 106 → Thr; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser.
나머지 영역, 즉, 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 서열 위치와 다른 영역에서, 본 발명의 hTlc 뮤테인은 돌연변이된 아미노산 서열 위치들 외에 야생형 (천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 hTlc의 서열(서열번호 1)과 적어도 70% 이상의 서열 동일성 또는 적어도 70% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 예시적인 예로서, 서열번호 20의 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)과 약 86%의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 서열번호 13-28 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 hTlc 뮤테인은 서열번호 13-28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 가진다.
본 발명은 서열번호 13-28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 hTlc 뮤테인의 구조적 상동체를 또한 포함하며, 상기 구조적 상동체는 상기 hTlc 뮤테인과 비교하여 약 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 자연적으로 발생하는 형태인 hTlc(서열번호 1)의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 돌연변이유발의 일부 구현예에서, 치환 (또는 대체)은 보존적 치환이다. 그럼에도, 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 결합하는 능력을 보유하고/하거나 hTlc의 아미노산 서열(서열번호 1)에 대해 적어도 60% 이상, 예를 들어 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상 서열 동일성을 갖는 한, 비-보존적 치환 또는 하기에 예시된 치환들 중의 하나 이상을 포함하여 임의의 치환이 예상된다.
일부 특정 구현예에서, 본 발명은 약 15 nM 이하의 Kd로 측정된 친화도로 인간 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인을 제공하며, 상기 리포칼린 뮤테인은 서열번호 17 및 27 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 예컨대 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
하나의 구현혜에서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 단백질 도메인인 융합 파트너에 융합된다. 추가 특정 구현예에서, 상기 단백질 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 및 알부민 결합 단백질을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 리포칼린 뮤테인은 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 화합물에 컨쥬게이트된다. 보다 바람직하게는, 상기 뮤테인은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드로에틸스타치, 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 및 알부민 결합 단백질을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 상기 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
C. LAG -3 및 PD-1에 특이적인 융합 폴리펩타이드의 용도, 적용 및 생산.
LAG-3가 조절 T 세포 (Treg) 활성을 촉진하고 T 세포 활성화 및 증식을 네가티브로 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다 (Workman and Vignali, J Immunol, 2005). 천연적이고 유도된 Treg는 최대 억제 기능에 필요한 LAG-3 수준을 증가시킨다 (Huang et al., Immunity, 2004, Camisaschi et al., J Immunol, 2010). 또한, CD4+ 작용인자 T 세포에서 LAG-3의 이소성 발현은 그들의 증식 능력을 감소시키고 제 3 자 T 세포에 대한 그들의 조절 가능성을 부여한다 (Huang et al., Immunity, 2004). 최근 연구들은 고갈된 LCMV(lymphocytic choriomeningitis virus)-특이 CD8+ T 세포에서의 높은 LAG-3 발현이 반응하지 않는 상태에 기여하고 CD8+ T 세포 항종양 반응을 제한한다는 것을 보여주었다(Grosso et al., J Clin Invest, 2007, Blackburn et Nat Immunol, 2009). 실제로, LAG-3은 2개의 뮤린 모델에서 CD8+ T 세포에 대한 직접적인 효과를 통해 자아 및 종양 항원에 대한 내성을 유지하였다 (Grosso et al ., J Clin Invest, 2007).
그러나 종양 발달 및 종양 재발의 설정에서 관찰되는 면역 내성은 LAG-3만이 아닌 다양한 T 세포 네가티브 조절 수용체의 공동 발현에 의해 매개되는 것으로 보인다. 만성 바이러스 감염 모델(Grosso et al ., J Clin Invest, 2007, Blackburn et al ., Nat Immunol, 2009, Lyford-Pike et al ., Cancer Res, 2013), 녹아웃 마우스(Woo et al ., Cancer Res, 2012, Bettini et al ., J Immunol, 2011, Okazaki et al ., J Exp Med, 2011), 종양 감퇴 모델(Goding et al ., J Immunol, 2013) 및 보다 제한된 범위에서, 인간 암 환자의 데이타는 "소진(exhaustion)"이라는 과정을 통해 항원에 지속적으로 노출되는 T 세포가 점차적으로 불활성화되는 모델(Goding et al ., J Immunol, 2013, Gandhi et al ., Blood, 2006, Matsuzaki et al ., Proc Natl Acad Sci U S A, 2010)을 지지한다. 소진된 T 세포는 T 세포 네가티브 조절 수용체, 주로 PD-1 및 LAG-3의 발현을 특징으로 하는데, 이의 작용은 세포의 증식능, 사이토카인 생성, 표적 세포를 죽이고 및/또는 Treg 활성을 증가시키는 것을 제한한다. 그러나, 종양의 발생 및 재발에 있어서 이들 분자의 발현의 타이밍 및 서열은 완전히 특성화되지 않았다.
PD-1은 T 세포 활성화와 내성의 조절에 결정적인 역할을 하는 세포 표면 신호 수용체이다 (Keir et al ., Annu Rev Immunol, 2008). 이것은 타입 I 막 관통 단백질이며 BTLA, CTLA-4, ICOS 및 CD28과 함께 T 세포 동시 자극 수용체의 CD28 계열을 구성한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 주로 발현된다 (Dong et al., Nat Med, 1999). 그것은 또한 NK(natural killer) 세포에서도 발현된다 (Terme et al., Cancer Res, 2011).
PD-1의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2에 의한 PD-1의 결합은 근위세포 내 면역 수용체 티로신 저해 도메인에서 티로신 잔기의 인산화를 초래하며, 이어서 포스파타아제 SHP-2를 동원하여 결국 T 세포 활성화의 하향 조절을 일으킨다. PD-1의 한 가지 중요한 역할은 감염에 대한 염증 반응 시 말초 조직에서 T 세포의 활성을 제한하여자가면역의 발달을 제한하는 것이다 (Pardoll, Nat Rev Cancer, 2012). 이 네가티브 조절 역할에 대한 증거는 PD-1 결핍 마우스가 심근 병증과 함께 관절염 및 신장염을 비롯한 루프스 같은 면역 질환을 발생시킨다는 사실을 발견한데서 비롯된다 (Nishimura et al., Science, 2001, Nishimura et al., Immunity, 1999). 종양 세팅에서, 상기 결과는 종양 미세 환경 내에서의 면역 내성의 발달이다. PD-1은 종양-침윤 리간드 세포 상에서 높게 발현되며, 그의 리간드는 많은 다른 종양의 세포 표면 상에서 상향 조절된다 (Dong et al., Nat Med, 2002). 다중 마우스 암 모델은 리간드의 PD-1 결합이 면역 회피로 초래되는 사실을 입증하였다. 또한, 이 상호작용의 차단은 항종양 활성을 초래한다 (Hamid et al., N Engl J Med, 2013, Topalian et al., N Engl J Med, 2012).
PD-1과 LAG-3 억제 경로 사이에는 자기 및 종양 항원 모두에 대한 내성이 강한 시너지가 있으므로, 표적의 이중 차단은 암에 대한 유망한 조합 전략을 나타낸다 (Woo et al., Cancer Res, 2012).
면역 체크포인트 PD-1과 LAG-3을 동시에 표적함으로써, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 지속적인 항-종양 및/또는 항-감염 반응을 생성하고 항종양 림프구 세포 활성을 증가시키며 항종양 면역을 증강시킬 수 있으며, 이로 인해 시너지의 항종양 결과를 생성한다.
따라서, 본원의 융합 폴리펩타이드에 대한 수많은 가능한 적용들이 의약에 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 PD-1 및 LAG-3의 이중-표적화를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
일 측면에서, 본원은 샘플에서 PD-1 및 LAG-3을 검출하기 위한 본원에 기술된 융합 폴리펩티드의 용도 및 각각의 진단 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 융합 폴리펩타이드 또는 PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합하기 위한 그러한 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 조성물의 용도를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 PD-1 및 LAG-3과의 복합체 형성에 대해 기술된 바와 같은 하나 이상의 융합 폴리펩타이드의 용도를 포함한다.
그러므로, 본원의 또 다른 측면에서, 개시된 하나 이상의 융합 폴리펩타이드는 PD-1 및 LAG-3의 검출에 사용된다. 그러한 용도는 하나 이상의 상기 융합 폴리펩타이드를 적당한 조건 하에서 PD-1 및 LAG-3을 포함하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시켜 융합 폴리펩타이드와 PD-1 및 LAG-3 사이에 복합체를 형성시키고, 적당한 시그널로 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 가능한 시그널은 상술한 바와 같이 표지에 의해 또는 결합, 즉 복합체 형성 자체에 의한 물리적 특성들의 변화에 의해 야기될 수 있다. 하나의 예로는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)이며, 그 값은 금박과 같은 표면에 고정된 결합 파트너의 결합 중에 변화된다.
본원에 개시된 융합 폴리펩타이드는 또한 PD-1 및 LAG-3의 분리를 위해 사용될 수 있다. 그러한 사용은 하나 이상의 상기 융합 폴리펩타이드를 적당한 조건 하에서 PD-1 및 LAG-3을 포함하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시켜 융합 폴리펩타이드와 PD-1 및 LAG-3 사이에 복합체를 형성시키고 샘플로부터 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 따른 융합 폴리펩타이드를 포함하는 진단 또는 분석 키트를 특징으로 한다.
진단에서의 그들의 용도 외에, 또 다른 측면에서, 본원은 본원의 융합 폴리 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 고려한다.
더욱이, 본 발명은 항감염제 및/또는 항암제 및 면역조절제로서 사용하기 위해 PD-1 및 LAG-3에 동시에 결합하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 본원의 그러한 융합 폴리펩타이드는 본 발명의 하나 이상의 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 다양한 종양 및 자가염증과 같은 인간 질병의 치료 또는 예방 방법에 사용되는 것으로 예상된다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드를 사용하여 치료할 수 있는 암의 예로는, 간암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 안구 내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 결장암, 대장암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁 내막암, 자궁 경부암, 질 암종, 외음부 암종, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 임파종 림프종, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신장 골수암, 중추 신경계(CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척추 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 세포암, 석면에 의해 환경적으로 유발된 암, 예를 들어, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 호지킨 림프종/원발 종격동 B 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 급성 골수종 림프종, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 확산 대 B-세포 림프종, 버키트(Burkitt) 림프종, 면역 결핍성 대세포 림프종, 전구체 B-림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 균상식 육종, 미퇴행성 대세포 림프종, T 세포 림프종 및 전구체 T-림프구성 림프종을 포함하는 혈액학적 악성 종양, 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 전이성 암 치료에도 적용 가능하다.
일 구현예에서, 상기 환자는 비소 세포 폐암(NSCLC) 또는 바이러스 관련 암(예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV) 관련 종양) 또는 위 선암을 앓고 있다. 특정 구현예에서, HPV-관련 종양은 HPV+ 두경부암(HNC)이다. 또 다른 특정 구현예에서, 위암은 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 감염과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본원은 상기 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 유전 암호의 축퇴성(degeneracy)은 동일한 아미노산을 특정하는 다른 코돈에 의한 특정 코돈의 치환을 허용하기 때문에, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 특정 핵산 분자에 제한되지 않고, 기능적 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 핵산 분자를 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 본원의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
일부 구현예에서, DNA와 같은 본원에 기술된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자는 본원에 기술된 융합 폴리펩타이드의 발현되도록 본원의 면역글로불린을 인코딩하는 또 다른 핵산 분자에 "작동 가능하게 결합(operably linked)"될 수 있다. 이와 관련하여, 작동 가능한 결합은 하나의 핵산 분자의 서열 요소들과 다른 핵산의 서열 요소들이 단일 폴리펩타이드로서 융합 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 결합(linkage)이다.
본 발명은 또한 유전 공학적 방법들에 의해, 폴리펩타이드들 또는 이의 임의의 서브유닛을 코딩하는 핵산으로부터 출발하여 생산되는 본원의 융합 폴리펩타이드의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인비보에서 수행될 수 있고, 상기 폴리펩타이드는 예를 들어 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체에서 생성된 다음 이 숙주 유기체 또는 그것의 배양물로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 인비트로 번역 시스템을 사용하여 인비트로에서 본원의 융합 폴리펩타이드를 생산하는 것도 가능하다.
상기 융합 폴리펩타이드를 인비보에서 생산할 때, 그러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 재조합 DNA 기술(이미 상술한 바와 같이)에 의해 적당한 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체로 도입된다. 이러한 목적으로, 숙주 세포는 우선 확립된 표준 방법들을 사용하여 본원에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터에 형질전환된다. 그 다음 숙주 세포를 이종 DNA의 발현 및 상응하는 폴리펩타이드의 합성을 가능하게 하는 조건 하에서 배양한다. 이어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 또는 배양 배지로부터 회수된다.
본원의 일 구현예에서, 이 방법은 융합 폴리펩타이드에 포함되듯이, hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 서열 위치에 상응하는 서열 위치들 중 적어도 하나, 때로는 심지어 그 이상을 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중항에서 융합 폴리펩타이드들을 인딩하는 적어도 하나 이상의 핵산 분자에 돌연변이유발을 받게하는 것을 포함한다.
추가로, 융합 폴리펩타이드에 포함된 본 발명의 hTlc 뮤테인과 관련하여, Cys 61과 Cys 153 사이의 자연적으로 발생하는 이황화 결합이 제거될 수 있다. 따라서, 그러한 뮤테인은 예를 들어 그람-음성 박테리아의 세포질에서, 환원 레독스 환경(reducing redox milieu)을 갖는 세포 구획에서 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 이는 실험 돌연변이유발의 지시된 서열 위치들 외에 추가적인 돌연변이를 포함한다. 그러한 돌연변이는, 예를 들어 리포칼린 뮤테인의 개선된 폴딩 효율, 혈청 안정성, 열 안정성 또는 리간드 결합 친화도에 기여하는 경우 종종 용인되거나 심지어 유리한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명에 개시된 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열들에 "작동 가능하게 결합"되어 이 핵산 분자의 발현을 가능하게 할 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 그것이 전사 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 요소를 포함하고, 그러한 서열들이 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동 가능하게 결합"되어 있다면, "핵산 분자를 발현할 수 있는" 또는 "뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는"것으로 지칭된다. 작동 가능한 결합은 조절 서열 요소들과 발현될 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되어 있는 결합이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 종마다 다를 수 있지만, 일반적으로 이들 영역은 원핵세포에서 프로모터 그 자체, 즉 전사의 개시를 지시하는 DNA 요소들은 물론 RNA로 전사될 때 번역 개시를 알리는 DNA 요소들 모두를 포함하는 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터 영역은 예를 들어 원핵세포에서의 -35/-10 박스 및 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 요소, 또는 진핵세포에서의 TATA 박스, CAAT 서열 및 5'-캡핑 요소와 같은 일반적으로 전사 및 번역의 개시에 결합하는 5' 비-코딩 서열을 포함한다. 이들 영역은 천연 폴리펩타이드를 숙주 세포의 특정 구획으로 표적화하기 위한 번역된 시그널 및 리더 서열뿐만 아니라 인핸서 또는 리프레서 요소를 역시 포함할 수 있다.
또한, 3' 비-코딩 서열은 전사 종결, 폴리아데닐화 등에 관련된 조절 요소들을 포함할 수 있다. 그러나, 이들 종결 서열은 특정 숙주 세포에서 만족스러운 기능이 없다면 그 세포에서 기능적 시그널로 치환될 수 있다.
따라서, 본원의 핵산 분자는 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 핵산 분자는 프로모터 서열과 전사 종결 서열을 포함한다. 적당한 원핵세포 프로모터는 예를 들어 tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵세포에서 발현에 유용한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
본원의 핵산 분자는 또한 플라스미드, 파지미드, 파지, 바큘로바이러스, 코스미드 또는 인공 염색체와 같은 벡터 또는 임의의 다른 종류의 클로닝 운반체의 일부일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 파지미드에 포함된다. 파지미드 벡터는 M13 또는 f1과 같은 템퍼레이트 파지(temperate phage)의 유전자 간(intergenic) 영역 또는 관심 있는 cDNA에 융합된 이의 기능적 일부를 인코딩하는 벡터를 의미한다. 그러한 파지미드 벡터 및 적당한 헬퍼 파지(예, M13K07, VCS-M13 또는 R408)로 박테리아 숙주 세포를 중복감염(superinfection)시킨 후, 온전한 파지 입자가 생산되어 파지 표면 상에 표시된 그것의 상응하는 폴리펩타이드와 암호화된 이종 cDNA의 물리적 커플링을 가능하게 한다(Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, CurrOpin Biotechnol, 1999).
그러한 클로닝 운반체들은 상술된 조절 서열들 및 본원에 기술된 바와 같이 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열를 제외하고, 발현에 사용되는 숙주 세포와 양립 가능한 종류로부터 유래된 복제 및 조절 서열뿐만 아니라 형질전환 또는 형질감염된 세포에서 선택 가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 다수의 적당한 클로닝 벡터들이 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하다.
본원에 기술된 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분자(예를 들면, 서열번호 29-36), 그리고 특히 그러한 폴리펩타이드의 코딩 서열을 함유하는 클로닝 벡터는 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포에 형질전환될 수 있다. 표준 기술을 사용하여 형질전환을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
형질전환된 숙주 세포는 본원의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적당한 조건 하에서 배양된다. 적당한 숙주 세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 섭틸리스와 같은 원핵세포 또는 사카로마이세스 세레비시애, 피키아 파스토리스, SF9 또는 High5 곤충 세포, 불멸화 포유동물 세포주(예, HeLa 세포 또는 CHO 세포)와 같은 진핵세포, 또는 프라이머리 포유동물 세포일 수 있다.
본원의 융합 폴리펩타이드에 포함되는 것을 포함하여, 분자 내 이황화 결합을 포함하는 본원의 리포칼린 뮤테인이 있는 일부 구현예에서, 적당한 시그널 서열을 사용하여 산화 레독스 환경을 갖는 세포 구획으로 신생 폴리펩타이드를 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 산화 환경은 그람 양성 박테리아의 세포 외 환경 또는 진핵 세포의 소포체 내강 또는 대장균과 같은 그람 음성 박테리아의 주변세포질(periplasm)에 의해 제공될 수 있으며, 일반적으로 구조적 이황화 결합의 형성을 선호한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균의 세포질에서 본원의 융합 폴리펩타이드를 생산하는 것도 가능하다. 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 가용성 및 접힘 상태에서 직접 수득되거나 또는 봉입체 형태로 회수되고, 이어서 인비트로에서 복원된다. 추가적인 선택은 산화 세포 내 환경을 갖는 특정 숙주 균주의 사용이며, 이로 인해 세포질에서 이황화 결합의 형성을 가능하게 할 수 있다((Venturi et al ., J Mol Biol, 2002).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 융합 폴리펩타이드는 유전 공학의 사용에 의해서만 생성되거나 생산될 필요는 없다. 오히려, 그러한 폴리펩타이드는 메리필드(Merrifield) 고체상 폴리펩타이드 합성과 같은 화학적 합성 또는 인비트로 전사 및 번역에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어 가능성이 큰 돌연변이가 분자 모델링을 사용하여 확인된 후 인비트로에서 원하는(디자인된) 이러한 융합 폴리펩타이드에 포함된 유망한 융합 폴리펩타이드 및/또는 리포칼린 뮤테인을 합성하고, 관심 표적에 대한 결합 활성을 조사하는 것이 가능하다. 단백질의 고체상 및/또는 용액 상의 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예. Bruckdorfer et al ., CurrPharm Biotechnol, 2004 참조).
또 다른 구현예에서, 본원의 융합 폴리펩타이드는 당업자에게 알려진 잘 확립된 방법들을 사용하여 인비트로 전사/번역에 의해 생산될 수 있다.
숙련된 기술자는 본원에 의해 고려되는 융합 폴리펩타이드를 제조하는데 유용한 방법을 알 수 있을 것이나, 그의 단백질 또는 핵산 서열은 본원에 명백하지 않다. 개요로서, 아미노산 서열의 그러한 변형들은 특정 제한효소들에 대한 절단 부위를 포함함으로써 폴리펩타이드 유전자 또는 그의 부분들의 서브-클로닝을 단순화하기 위해 예를 들어 단일 아미노산 위치들의 지정 돌연변이유발을 포함한다. 추가로, 이들 돌연변이는 리포칼린 뮤테인 또는 그것의 표적(예를 들어, PD-1 또는 LAG-3)에 대한 융합 폴리펩타이드의 친화도를 더욱 개선하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 필요하다면 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 물 용해성을 개선하거나 또는 응집 경향을 감소시키는 등의 폴리펩타이드의 특정 특징을 조절하기 위해 돌연변이가 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기는 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 평범한 유기 합성 전략, 고상 보조 합성 기술 또는 상업적으로 이용 가능한 자동 합성기와 같은 많은 종래의 잘 공지된 기술 중 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 반면에, 이들은 또한 통상적인 재조합 기술에 의해 단독으로 또는 통상적인 합성 기술과 조합하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 상기 본원의 챕터 (A) 및 (B)에서 정의된 바와 같은 화합물을 조합함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 특징들은 하기 실시예들 및 이의 첨부된 도면들을 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 예시적인 구현예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 구체화된 본원의 변형 및 변이는 당업자에 의해 의존될 수 있고, 그러한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것이 이해되어야 한다.
V. 실시예
실시예 1: 대표적인 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분석
PD-1과 LAG-3을 동시에 사용하기 위해, 비구조식(G4S)3 링커(서열번호 2)를 통해 서열번호 3 및 서열번호 4 각각에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 PD-1 특이 항체 및 서열번호 17 또는 서열번호 27의 LAG-3 특이 리포칼린 뮤테인을 함께 융합시킨 몇 가지 대표적인 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드를 생성시켰다.
생성된 다양한 포맷들이 도 1a-e에 도시되어 있다. 그러한 융합 폴리펩타이드(서열번호 5 및 4, 서열번호 9 및 4, 서열번호 6 및 4, 서열번호 10 및 4, 서열번호 3 및 7; 서열번호 3 및 11, 서열번호 3 및 8, 서열번호 3 및 12 각각)는 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인과 서열번호 3의 중쇄 및 서열번호 4의 경쇄를 포함하는 항체의 4개의 말단 중 하나로의 융합을 통해 생성되었다. 리포칼린 뮤테인이 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합되었을 때, 그들은 링커 서열(서열번호 2) 전에 C-말단에 2개의 추가 아미노산, 세린 및 아스파르테이트를 포함시켰다. 서열번호 3의 중쇄 및 서열번호 4의 경쇄를 포함하는 PD-1 특이 항체는 인 비트로 및 인 비보에서 IgG4 절반-항체 교환을 최소화하기 위해 S228P 돌연변이를 포함하는 조작된 IgG4 백본을 가진다(Silva et al., J Biol Chem, 2015). 또한, 리포칼린 뮤테인 Fc 융합체는 비구조식 (G4S)3 링커(서열번호 2)를 통해 서열번호 17 또는 서열번호 27의 LAG-3 특이 리포칼린 뮤테인을 서열번호 3의 Fc의 일부 C- 말단에 융합시킴으로써 생성되었다. 2가지 상이한 구조물을 도 1에 나타내었다(서열번호 41 및 서열번호 42). 도 1f-i은 부가적인 융합 폴리펩타이드 및 PD-1에 특이적인 항체(예, 서열번호 3 및 4의 항체 또는 서열번호 47 및 48의 항체) 및 LAG-3에 특이적인 하나 이상의 리포칼린 뮤테인(예, 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인)에 기초하여 제조된 그러한 폴리펩티드에 대해 상응하는 서열들을 추가로 도시한다.
상기 융합 폴리펩타이드의 구조물은 유전자 합성에 의해 생성되고 포유동물 발현 벡터에 클로닝되었다. 이어서, 그들은 Expi293FTM 세포(Life Technologies)에서 일시적으로 발현되었다. 세포 배양 배지에서 융합 폴리펩타이드의 농도를 ForteBio Protein A 센서 (Pall Corp.) 또는 POROS® 단백질 A 친화성 칼럼(Applied Biosystems)을 사용하는 HPLC(Agilent Technologies)를 사용하여 측정하였다.
마찬가지로, PD-1 및 LAG-3를 동시에 사용하기 위해, 서열번호 47 및 서열번호 48 각각에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 PD-1 특이 항체 및 서열번호 17 또는 서열번호 27의 LAG-3 특이 리포칼린 뮤테인은, 예컨대 비구조식(G4S)3 링커(서열번호 2)를 통해 함께 융합될 수 있다. 다양한 포맷들을 생성할 수 있다; 도 1 참조, 필요한 변경 사항. PD-1-LAG-3 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드에 대해 상술한 바와 같이, 중쇄 및 경쇄로서 서열번호 47 및 서열번호 48의 아미노산 서열이 사용되는 것을 제외하고는 서열번호 3 및 서열번호 4 각각에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 PD-1 특이 항체 및 서열번호 17 또는 서열번호 27의 LAG-3 특이 리포칼린 뮤테인을 함께 융합시킴으로써 그러한 다양한 포맷들은 유추하여 생성할 수 있다.
특히, 도 1은 PD-1에 특이적인 다양한 항체(예, 서열번호 47 및 48의 항체) 및 LAG-3에 대해 특이적인 하나 이상의 리포칼린 뮤테인(예, 서열번호 17의 리포칼린 뮤테인 또는 서열번호 27의 리포칼린 뮤테인)을 사용하여 본원에 기재된 동일한 방법으로 제조될 수 있는 추가적인 대표적 융합 폴리펩타이드를 나타낸다. 리포칼린 뮤테인은 도 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 51 및 48, 서열번호 55 및 48, 서열번호 52 및 48, 서열번호 56 및 48, 서열번호 47 및 53, 서열번호 47 및 57, 서열번호 47 및 54 및 서열번호 47 및 58의 융합 폴리펩타이드를 생성하기 위해, PD-1 특이 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N- 말단 중 하나에 유전적으로 융합될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 단백질 A 크로마토그래피, 이어서 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제하였다. SEC 정제 후 단량체 단백질을 포함하는 분획을 모으고 분석 SEC를 사용하여 다시 분석하였다. 단백질 A 정제 후 1리터로 외삽된 구조물의 역가는 다음 표 1에 기재된 바와 같다. 융합 폴리 펩타이드의 발현은 항체와 동일한 범위이다.
Expi293FTM 세포에서 과발현에 대한 발현 역가. 1리터 발현 규모로 추정
클론명 발현 역가
( Expression titer )
[mg/L]
서열번호 5 및 4 175
서열번호 6 및 4 154
서열번호 3 및 7 209
서열번호 3 및 8 127
서열번호 9 및 4 127
서열번호 10 및 4 110
서열번호 3 및 11 161
서열번호 3 및 12 152
서열번호 41 375
서열번호 42 345
실시예 2 : 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에서 PD-1에 대한 융합 폴리펩타이드의 결합
본 발명자들은 재조합 인간 PD-1-His (C-말단 폴리히스티딘 태그를 갖는 PD-1, ACROBiosystems)에 대한 융합 폴리펩타이드의 결합 효능을 측정하기 위해 ELISA 분석법을 사용하였다. PBS의 1 ㎍/mL 농도에서 PD-1-His를 4 ℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. PBS-0.05% T (0.05%(v/v) Tween 20으로 보충된 PBS)로 세척 후, 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-0.1% T(0.1%(v/v) Tween 20으로 보충된 PBS)에 녹인 2% BSA(w/v)로 차단시켰다. 100 μL PBS-0.05%T로 5회 세척 후, 기준 항체(서열번호 3 및 4) 또는 융합 폴리펩타이드를 농도별로 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 또 다른 세척 단계를 수행하였다. 연구 중인 결합 항체/융합 폴리펩타이드는 PBS-0.1%T-2%BSA에서 1:5000 희석된 항-인간 IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)와 인큐베이션한 후, 검출하였다. 추가의 세척 단계 후, 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다.
실험 결과는 EC50 값 및 최대 시그널이 자유 파라미터이고 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정(binding sigmoidal fit)으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 2에 도시하였다. 생성된 EC50 값은 하기 표 2에 나타내었다. 모든 시험된 분자에 대해 관찰된 EC50 값은 매우 유사하고, 융합 폴리펩타이드에 포함된 PD-1 특이 항체(서열번호 3 및 4)와 비교되었다. 상기 실험은 융합 폴리펩타이드에 포함될 때 기술된 PD-1 특이 항체가 항체의 4개의 말단 중 하나에서 리포칼린 뮤테인과 융합될 수 있고 여전히 PD-1에 결합함을 보여준다.
PD-1 결합에 대한 ELISA 데이터
클론명 EC 50 PD-1
[ nM ]
서열번호 5 및 4 0.22
서열번호 6 및 4 0.26
서열번호 3 및 7 0.19
서열번호 3 및 8 0.19
서열번호 9 및 4 0.20
서열번호 10 및 4 0.30
서열번호 3 및 11 0.21
서열번호 3 및 12 0.23
서열번호 3 및 4 0.14
실시예 3: ELISA에서 LAG -3에 대한 융합 폴리펩타이드의 결합
본 발명자들은 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드, Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드(서열번호 41 및 서열번호 42) 및 서열번호 17 및 서열번호 27의 모체 리포칼린 뮤테인의 재조합 LAG-3-His(ACROBiosystems)에 대한 결합 효능을 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하였다. 융합 폴리펩타이드/리포칼린 뮤테인을 PBS (1㎍/mL)에 녹이고고 4 ℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 상기 플레이트를 100μL PBS-0.05%T로 각 인큐베이션 단계 후에 5회 세척하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-0.1%T에 녹인 2% BSA(w/v)로 차단한 후 세척하였다. 단량체 형태의 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인(서열번호 17 및 서열번호 27) 또는 상기 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드 또는 Fc-리포칼린 뮤테인 폴리펩타이드를 농도별로 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 또 다른 세척 단계를 수행하였다. PBS-0.1%T-2%BSA 내 HRP에 컨쥬게이트된 다클론 1 : 2000 희석된 항-Tlc 항체를 1시간 인큐베이션한 후 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 추가의 세척 단계 후, 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다. 또한, 별도의 실험에서 1 : 5000 희석된 항-인간 IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)를 다른 동일한 ELISA 분석법으로 첨가하였다.
실험 결과를 EC50 값 및 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정(binding sigmoidal fit)으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 3에 나타내었다. 생성된 EC50 값은 표 3에 나타내었다. 시험된 분자에 대한 EC50 값은 두 검출 방법 모두에 대해 비교 가능하다. 동일한 리포칼린 뮤테인이 폴리펩타이드에 포함되었을 때, 다양한 융합 포맷들에 대하여 LAG-3에 대한 결합 효능은 서로 및 각각 모체(parental) 리포칼린 뮤테인과 비교 가능하였다. 서열번호 43은 음성 대조군으로서 작용하고 LAG-3에 대한 결합을 나타내지 않았다 (데이터 미도시). 상기 실험은 상기 기술된 융합 폴리펩타이드에 포함될 때 리포칼린 뮤테인은 LAG-3에 대한 활성의 손실 없이 항체의 4개의 말단에 융합될 수 있음을 보여준다.
Figure pct00001
실시예 4: PD-1 및 LAG -3을 발현하는 세포에 결합하는 융합 폴리펩타이드의 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석
본 발명자들은 인간 PD-1(CHO-huPD-1) 또는 인간 LAG-3 각각 안정하게 형질전환된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 음성대조군와 비교하여 융합 폴리펩타이드의 특이적 결합을 평가하기 위해 형광-활성화 세포 분류(FACS) 연구를 사용하였다. 제조회사의 지시에 따라 Flp-In 시스템(Invitrogen)을 사용하여 세포주를 생성하였다. 모의-형질감염된 Flp-In CHO 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
형질감염된 CHO 세포를 10% 소태아 혈청(FCS, Biochrom) 및 500 ㎍/mL 하이그로마이신 B (Roth)가 보충된 햄스 F12 배지(Ham’s F12 medium, Invitrogen)에서 유지시켰다. 세포를 제조사의 지시(37 ℃, 5% CO2 대기)에 따라 표준 조건 하에 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 계대 배양(subculture)용 또는 FACS 실험용 부착 세포를 해리하기 위해, 제조자의 지시에 따라 Accutase(PAA Laboratories)를 사용하였다.
실험을 수행하기 위해, PD-1- 양성 및 음성 대조군 Flp-In CHO 세포, 뿐만 아니라 LAG-3 양성 및 음성 대조군 Flp-In CHO 세포를 융합 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 폴리펩타이드를 형광 표지된 항-리포칼린 뮤테인 항체를 사용하여 다음에 기술한 바와 같이 FACS 분석으로 검출하였다.
웰당 2.5 x 104 세포를 5% 소 태아 혈청(PBS-FCS)을 포함하는 빙냉(ice-cold) PBS 중에서 1시간 동안 예비 배양(인큐베이션)하였다. 이어서, 일반적으로 250 내지 0.001nM 범위의 융합 폴리펩타이드의 희석계열, 리포칼린 뮤테인 및 음성대조군을 세포들에 첨가하고, 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 300xg에서 원심분리를 사용하여 빙냉 PBS에서 2회 세척한 다음, 얼음에서 30분간 형광 염료 Alexa488 (Pieris)로 표지된 토끼 항-Tlc 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포들을 세척하고, iQue Flow cytometer(Intellicyte)를 사용하여 분석하였다. 형광 강도의 기하학적 평균을 최대 평균으로 표준화하고, 자유 파라미터로서 EC50 값과 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 기울기가 1로 고정된 1 : 1 결합 모델로 조정하였다.
서열번호 5 및 4, 서열번호 6 및 4, 서열번호 3 및 7 및 서열번호 3 및 8에 대한 예시적인 데이터를 도 4 및 표 4에 나타내었다. 항 PD-1 항체 중쇄(서열번호 6 및 4)의 N-말단에 대한 리포칼린 뮤테인의 융합은 PD-1에 대한 항체의 결합 효능을 줄이는 것으로 보이며, 반면에 다른 융합 부위는 세포 상에서 발현된 인간 PD-1에 대한 결합에 차이를 초래하지 않는다. 서열번호 5 및 4의 LAG-3에 대한 개선된 EC50은 결합 효과에 기인할 수 있다. 음성 대조군은 예상대로 세포 상에 발현된 인간 PD-1 또는 인간 LAG-3 어느 것도 결합하지 않았다 (데이타 미도시).
Figure pct00002
실시예 5: ELISA-기반 세팅에서 동시 표적 결합의 입증
PD-1 및 LAG-3에 대한 융합 폴리펩타이드의 동시 결합을 입증하기 위해, 이중-결합 ELISA 포맷이 사용되었다. PBS(1　㎍/mL)에 녹인 재조합 PD-1-His (ACROBiosystems)을 4℃에서 밤새 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 각 인큐베이션 단계 후 100㎕ PBS-0.05%T로 상기 플레이트를 5회 세척하였다. PBS-0.1%T에 녹인 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단하고 나서 다시 세척하였다. 융합 폴리펩타이드를 농도별로 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 한 다음, 세척 단계를 수행하였다. 이어서, 비오틴화 된 인간 LAG-3-Fc(R&D Systems) 를 PBS-0.1%T-2%BSA에 2㎍/mL의 일정 농도로 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후 PBS-0.1%T-2%BSA 내 1:5000 희석된 엑스트라비딘-HRP(Sigma-Adrich)을 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 추가 세척 단계 후, 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
실험 결과는 EC50 값과 최대 시그널이 자유 파라미터이고, 기울기가 1로 고정된 1:1 결합 S자형 조정으로부터 생성된 조정 곡선과 함께 도 5에 도시되었다. 생성된 EC50 값은 표 5에 제공된다. 모든 융합 폴리펩타이드는 명확한 결합 신호를 나타내어, 융합 폴리펩타이드가 PD-1 및 LAG-3을 동시에 결합시킬 수 있음을 입증하였다. 그러나, N-말단 중쇄 융합체(서열번호 6 및 4 및 서열번호 10 및 4)는 다른 포맷들에 비해 2배 감소된 EC50을 갖기 때문에, 항체에 대한 리포칼린 뮤테인의 부착 지점은 이러한 이중 결합 포맷(dual-binding format)의 EC50에 영향을 준다.
Figure pct00003
실시예 6 : 인간 LAG - 3에 대한 주요 조직 적합성 복합체( MHC ) 클래스 II 발현 세포에 대한 융합 폴리펩타이드의 경쟁적 결합에 대한 FACS 분석
주어진 리포칼린 뮤테인이 MHC 클래스 II-양성 세포 상의 MHC 클래스 II에 대한 LAG-3의 결합을 간섭하는지를 평가하기 위해, 경쟁 FACS 실험이 이용되었다. 이 실험에서, 일정한 농도의 인간 LAG-3-Fc 융합체(huLAG-3-Fc, R&D system) 및 융합 폴리펩타이드의 희석계열을 MHC 클래스 II 양성 인간 세포주 A375와 함께 인큐베이션하고, 형광 표지된 항-IgG Fc 항체를 사용하여 세포-결합된 huLAG-3-Fc를 검출하였다. 이 분석에서 huLAG-3와 그의 리간드 MHC 클래스 II의 결합을 간섭하는 경쟁적 리포칼린 뮤테인은 MHC 클래스 II 양성 세포주 A375에 대한 huLAG-3-Fc 결합의 감소를 유도한다.
흑색종 세포주 A375를 10% 소 태아 혈청(FCS, Biochrom)이 보충된 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 유지하였다. 세포를 제조사의 지시(37 ℃, 5% CO2 대기)에 따라 표준 조건 하에 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 계대 배양용 또는 FACS 실험용 접착 세포를 해리하기 위하여, Accutase (PAA Laboratories)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
FACS 분석을 위해, 웰당 5 x 104 A375 세포를 PBS-FCS에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 3 nM의 huLAG-3-Fc 및 다양한 농도의 융합 폴리펩타이드를 첨가하였다. 세포를 빙냉 PBS에서 2회 세척하고, PBS-FCS에서 재현탁하고, 피코에리트린으로 표지된 항-인간 IgG Fc 항체(Jackson Immunologics)와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고 Intellicyt IQue Flow cytometer (Intellicyt)를 사용하여 분석하였다. A375 세포에 결합된 huLAG-3-Fc에 의해 생성된 형광 데이터를 Forecyt 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 얻어진 기하학적 형광 평균을 huLAG-3-Fc 최대 결합으로 표준화하였다. huLAG-3-Fc 결합 퍼센트를 플롯팅하고 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 조정하였다. 선택된 경쟁 결합 곡선을 도 6에 제공한다. 상기 데이터는 항체-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드 및 시험된 Fc-리포칼린 뮤테인 융합 폴리펩타이드는 인간 MHC 클래스 II 발현 세포 상에서 huLAG-3의 리간드 MHC 클래스 II에 대해 huLAG-3의 결합과 경쟁한다는 것을 보여준다. 융합 폴리펩티드의 LAG-3/MHC 클래스 II 분자 결합에 대한 억제 효과는 레퍼런스 LAG-3 단클론 항체(서열번호 49 및 50)와 유사한 농도로 나타났다. LAG-3에 결합하지 않는 음성 대조군 hIgG4 (Sigma) 및 리포칼린 뮤테인(서열번호 43)은 어떠한 경쟁도 보이지 않았다. 도 6 참조.
실시예 7: 인간 말초혈액 단핵세포(PBMCs)를 이용한 T 세포 활성화 평가
본 발명자들은 LAG-3와 PD-1 및 각각의 리간드 사이의 상호 작용을 차단함으로써 음성 체크포인트 분자인 LAG-3와 PD-1의 억제 신호를 되돌리는 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 T 세포 분석을 사용하였다. 이러한 목적을 위해, 다양한 농도의 융합 폴리펩타이드를 포도상구균의 장독소 B(SEB) 자극된 인간 말초혈액 단핵세포(PBMCs)에 첨가하고 37 ℃에서 3일간 인큐베이션 하였다. 판독값으로서, 상등액에서 분비된 IL-2 및 IFN-γ 수준을 평가하였다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077g/mL, Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. 정제된 PBMCs는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁되고, 액체 질소를 사용하여 즉시 냉동하고, 추가로 사용할 때까지 액체 질소에서 저장하였다. 분석을 위해, PBMCs 세포를 16시간 동안 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다.
다음 과정은 각 실험 조건에 대해 3회 반복을 사용하여 수행되었다.
1x105 PBMCs를 다양한 농도에서 SEB이 보충되거나 그렇지 않은 배양 배지의 평평한 바닥 조직 배양 플레이트 각 웰에서 인큐베이션 하였다. 이어서, 융합 폴리펩타이드를 2개의 상이한 농도, 즉 150 nM 또는 2000 nM로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 가스 투과성 씰 (4titude)로 덮고 3일 동안 가습된 5% CO2 대기에서 37 ℃로 인큐베이션 하였다. 이어서, 상등액 중의 IL-2 및 IFN-γ 수준을 평가하였다.
R&D Systems의 IL-2 및 IFN-γ DuoSet 키트를 사용하여 세포 배양 상등액 내 인간 IL-2 및 인간 IFN-γ를 정량화하였다.
다음 절차는 IL-2의 정량을 설명한다. 특이 IFN-γ 항체를 사용하여 IFN-γ 정량화에 동일한 절차를 사용하였다.
제1 단계에서, PBS 내 1㎍/mL의 "인간 IL-2 캡쳐 항체"(R&D System)로 384-웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 이어서, PBS-0.05%T 80 ㎕로 5회 세척하였다. 1% 카제인(w/w)을 추가로 포함하는 PBS-0.05%T에서 1시간 동안 차단한 후, 풀드(pooled) 상등액 및 배양 배지로 희석된 IL-2 표준물질의 농도 계열을 384-웰 플레이트에서 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 포획된 IL-2의 검출 및 정량화를 가능케 하기 위해, 100ng/mL 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체(R&D System) 및 1㎍/mL의 설포태그-표지된 스트렙타비딘(Mesoscale Discovery)의 혼합물을 0.5% 카제인을 포함하는 PBS-T에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 25㎕의 리딩 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 각 웰의 전기화학발광(ECL) 시그널을 메조스케일 디스커버리 리더를 이용하여 판독하였다. 분석 및 정량화를 메조스케일 디스커버리 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
대표적인 실험 결과는 도 7에 도시하였다. 이는 융합 폴리펩타이드(서열번호 5 및 4)에 의해 유도된 증가된 IL-2 분비 수준을 나타낸다. 상기 융합 폴리펩타이드는 개선된 사이토카인 분비를 나타내어, 기준 항체/리포칼린-Fc 뮤테인 칵테일(서열번호 3 및 4 및 서열번호 41), 융합 폴리펩타이드에 포함된 PD-1 특이 기준 항체(서열번호 3 및 4), 또는 리포칼린-Fc 뮤테인 보다 T 세포 활성화를 나타낸다. hIgG4 (Sigma)의 음성 대조군은 기본 활성 보다 T 세포에 의한 IL-2 생산을 거의 유도하지 못한다.
실시예 8: LAG -3 및 PD-1 리간드를 발현하는 A375 종양 세포를 이용한 기능적 T 세포 활성화 분석
본 발명자들은 LAG-3와 PD-1이 각각의 리간드와의 상호 작용을 차단함으로써 LAG-3와 PD-1의 네가티브 체크포인트 분자의 억제 신호를 되돌리는 융합 폴리펩타이드의 능력을 평가하기 위해 추가 T 세포 분석을 사용하였다.
본 발명자들은 LAG-3의 리간드인 MHC II와 PD-1의 리간드인 PD-L1을 발현하는 흑색종 세포주 A375의 존재 하에 PHA 예비 자극된 T 세포에 융합 폴리 펩타이드를 농도별로 적용한 다음, 37 ℃에서 3일간 인큐베이션 하였다. 판독값으로, 본 발명자들은 상등액에서 분비된 IL-2 및 IFN-γ 수준을 평가하였다.
Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll 1.077g/mL, Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 건강한 기증자의 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. Pan T-세포 정제 키트(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 생성된 PBMC로부터 T 림프구를 분리하였다. 정제된 PBMCs는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁되고, 액체 질소를 사용하여 즉시 냉동하고, 추가로 사용할 때까지 액체 질소에서 저장하였다.
분석을 위해, PBMCs 세포를 16시간 동안 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 배양하였다. T 세포를 2 x 106 cells/ml의 밀도로 놓고 배양 배지에서 5㎍/ml PHA-P(Sigma Aldrich)로 48시간 동안 자극하였다.
다음 과정을 각 실험 조건에 대해 3회 반복으로 수행하였다.
흑색종 세포주 A375를 웰당 5 x 104 세포에 플레이팅하고 가습된 5% CO2 대기 하에 37 ℃에서 밤새 부착되도록 하였다. 표적 세포를 이전에 표준 조건 하에서 배양하여 성장시켰고, Accutase (PAA Laboratories)를 사용하여 분리하고, 배양 배지에 재현탁시켰다.
다음날, 종양 세포를 그들의 증식을 차단하기 위해 30㎍/mL의 농도 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)으로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 100 μL의 PHA 예비 자극된 T 세포 현탁액(5×104 T 세포에 해당), 선별된 융합 폴리펩타이드(서열번호 5 및 4), 항체/리포칼린 뮤테인 칵테일, PD-1-특이 기준 항체(서열번호 3 및 4), 또는 음성 대조군을 1 nM 내지 100 nM 범위의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰(4titude)로 플레이트를 덮고 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 3일 동안 인큐베이션 하였다.
이어서, 상등액 내 IL-2 및 IFN-γ 수준을 IFN-γ 분비에 대해 실시예 7에 기술된 바와 같이 평가하였다 (IL-2 분비에 대한 데이터 미도시).
예시적인 데이터는 도 8에 나타내었다. 이들 데이터는 PD-1 및 LAG-3 이중 특이적 융합 폴리펩타이드의 처리로 IFN-γ 분비 수준이 명백하게 증가함을 나타낸다.
실시예 9: 융합 폴리펩타이드의 안정성 평가
전반적인 안정성에 대한 일반적인 지시제로서 용융 온도(Tm)를 결정하기 위해, PBS (Gibco) 중 1 mg/mL의 단백질 농도에서 상기 융합 폴리펩타이드를 모세관 nanoDSC 장치 (CSC 6300, TA Instruments)를 사용하여 1 ℃/분으로 스캔(25-100 ℃)하였다. Tm는 통합된 Nano Analyze 소프트웨어를 사용하여 표시된 열 화상으로부터 계산되었다.
상기 결과 Tm뿐만 아니라 융합 폴리펩타이드에 대한 용융 개시(onset of melting)를 하기 표 6에 열거하였다. 모든 융합 폴리펩타이드는 레퍼런스 항체(서열번호 3 및 4)와 동일한 범위에서 용웅 개시뿐만 아니라 Tm를 갖는다.
Figure pct00004
저장 안정성을 평가하기 위해, 상기 융합 폴리펩타이드를 PBS 중 1 mg/mL의 농도로 37 ℃에서 1주간 인큐베이션하였다. 이어서, 정량적 ELISA 세팅으로 활성 융합 폴리펩타이드를 측정하였다. 단량체 단백질 함량을 분석적 크기 배제 크로마토그래피로 측정하였다. 서열번호 5 및 4, 서열번호 6 및 4, 서열번호 3 및 7 및 서열번호 3 및 8에 대한 예시적인 데이터를 표 7에 나타내었다.
단백질 활성을 분석하기 위해, 실시예 5에 기술된 동시 결합 ELISA를 적용하였다.
표준 단백질 희석액으로 검량선을 작성하였다. 검량선의 선형 범위 내에서 세 가지 상이한 독립 희석액을 각 시료에 대해 준비하였다. 임의로 1% 인간 혈장이 보충된 PBS-0.1%T-2%BSA를 상기 희석액에 사용하였다. 각 샘플의 활성 회복율을 동일한 농도와 동일한 매트릭스에서 -20 ℃로 저장된 스트레스를 받지 않은(non-stressed) 샘플을 기준으로 검량선으로부터 계산하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피는 0.3 mL/min의 유속에서 용출액으로 PBS(Gibco)를 사용하여 2개의 Superdex 200, 3.2/300Increase (GE Healthcare)를 연속적으로 사용하는 Agilent HPLC 시스템에서 수행되었다. 단량체의 회수율은 -20 ℃에서 동결된 스트레스를 받지 않은(non-stressed) 레퍼런스 샘플을 기준으로 한 각 샘플의 단량체 피크 면적에 의해 측정되다.
혈장에서의 저장 안정성을 더 평가하기 위해, 0.5 mg/mL 농도의 융합 폴리펩타이드를 37 ℃에서 1주간 인간 혈장에서 인큐베이션 하였다. 활성 융합 폴리펩타이드는 기술된 바와 같이 정량적 ELISA 세팅에서 측정되었다.
Figure pct00005
본 명세서에 예시적으로 설명된 실시예들은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부존재에도 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는", "함유하는", "담고 있는" 등의 용어는 제한없이 확대되어 해석될 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되었지만 제한이 아니며, 도시되고 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하는 용어 및 표현의 사용에 대한 의도는 없지만, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 본 실시예가 바람직한 실시예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 통상의 기술자라면 이들의 변형예 및 수정예가 가능할 수 있으며, 이러한 수정예 및 변형예는 본 발명의 범위, 본 발명의 본 명세서에 기술된 모든 특허, 특허 출원, 참고서 및 심사 논문은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다. 또한, 본 명세서에 레퍼런스로 포함된 레퍼런스 문헌의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본 명세서에 제공된 그 용어의 정의와 상반되는 경우, 본 명세서에 제공된 용어의 정의 및 레퍼런스 문헌에서의 해당 용어의 정의가 적용되지 않는다. 일반적인 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 하위 전제 군도 각각이 본 발명의 일부를 형성한다. 제거된 물질이 본 명세서에서 구체적으로 인용되는지의 여부에 상관없이 속으로부터 임의의 구성을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 포괄적인 설명을 포함된다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹으로 기술되는 경우, 본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 구성원의 개별 구성원 또는 서브 그룹의 관점에서 기술됨을 인식할 것이다. 추가 실시예는 다음의 청구항으로부터 명백해질 것이다.
등가물 : 통상의 기술자는 일상적인 실험만을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 균등물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본 명세서에 참고로 인용된 것처럼 동등한 정도로 본 명세서에 레퍼런스로 포함된다.
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110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 165 170 175 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 180 185 190 Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln 195 200 205 Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr 210 215 220 Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 225 230 235 240 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 245 250 255 Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 260 265 270 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 275 280 285 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 290 295 300 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 305 310 315 320 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 325 330 335 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 340 345 350 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 355 360 365 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 370 375 380 Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 405 410 415 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 420 425 430 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 435 440 445 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 450 455 460 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 465 470 475 480 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 485 490 495 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 500 505 510 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 515 520 525 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 530 535 540 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 545 550 <210> 162 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific fusion polypeptide <400> 162 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Pro Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Ser Gly Glu Asp Pro Glu Met Met Leu Glu Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Arg 35 40 45 Val Thr Val Leu Ile Asp Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Asn Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Asp Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Phe Glu Gly Glu Gly Gln Gly Thr Pro Gly Arg Met Val Ala Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Thr Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 165 170 175 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 180 185 190 Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln 195 200 205 Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr 210 215 220 Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 225 230 235 240 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 245 250 255 Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 260 265 270 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 275 280 285 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 290 295 300 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 305 310 315 320 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 325 330 335 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 340 345 350 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 355 360 365 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 370 375 380 Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Pro Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 405 410 415 Ala Met Thr Val Ser Gly Glu Asp Pro Glu Met Met Leu Glu Ser Val 420 425 430 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Arg 435 440 445 Val Thr Val Leu Ile Asp Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Asn Val Leu 450 455 460 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Lys His 465 470 475 480 Val Asp Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 485 490 495 Phe Glu Gly Glu Gly Gln Gly Thr Pro Gly Arg Met Val Ala Leu Val 500 505 510 Gly Arg Asp Pro Thr Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 515 520 525 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 530 535 540 Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly 545 550 <210> 163 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 163 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu 1 5 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 164 Ile Asp Pro Gly Thr Gly Gly Thr 1 5 <210> 165 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 165 Thr Ser Glu Lys Phe Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 166 Gln Thr Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 167 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 168 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 168 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 169 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 169 Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr 1 5 <210> 170 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 170 Ala Arg Ser Arg Gly Asn Tyr Ala Tyr Glu Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 171 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 171 Ser Ser Val Ser Ser Asn Tyr 1 5 <210> 172 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 172 His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro 1 5 <210> 173 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 173 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp 1 5 <210> 174 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 174 Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 175 Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Gly Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 176 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 176 Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 177 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 177 Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp 1 5 <210> 178 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 178 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn 1 5 <210> 179 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 179 Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 180 Ala Arg Trp Arg Ser Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 181 Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 182 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 182 Gln Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Trp 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 183 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 184 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 184 Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Pro 1 5 <210> 185 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 185 Ala Arg Gly Leu Gly Gly His Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 186 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 186 Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 187 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 187 Gln Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 188 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-PD1 antibody <400> 189 Ile Trp Arg Gly Gly Asn Thr 1 5 <210> 190 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 190 Ala Ala Ser Met Ile Gly Gly Tyr 1 5 <210> 191 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-PD1 antibody <400> 191 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-PD1 antibody <400> 192 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu 1 5

Claims (47)

  1. PD-1 및 LAG-3 모두에 결합할 수 있는 융합 폴리펩타이드로서,
    임의의 순서로 적어도 2개 이상의 서브유닛을 포함하고,
    제1 서브유닛은 PD-1에 특이적이고, 제2 서브유닛은 LAG-3에 특이적인, 융합 폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 서브유닛은 PD-1에 대해 결합 특이성을 갖는 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함하고,
    상기 제2 서브유닛은 LAG-3에 대해 결합 특이성을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 1nM의 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 3nM의 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함된 PD-1에 특이적인 항체의 EC50 값과 적어도 동일하거나 그보다 우수한 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함된 PD-1에 특이적인 항체의 EC50 값 보다 낮은 EC50 값으로 PD-1에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 2 nM의 EC50 값으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 1 nM의 EC50 값으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 그러한 융합 폴리펩타이드에 포함되는 LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 EC50 값과 동등하거나 그 보다 낮은 EC50 값으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 PD-1 및 LAG-3 동시에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 10 nM의 EC50 값을 갖는 PD-1 및 LAG-3 동시에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 최대 약 6 nM의 EC50 값을 갖는 PD-1 및 LAG-3 동시에 결합할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EC50 값은 실시예 2, 3 또는 5에서 필수적으로 기술된 바와 같이 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되는, 융합 폴리펩타이드.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II에 대한 LAG-3의 결합을 경쟁적으로 억제하는, 융합 폴리펩타이드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩티드의 능력은 주요 조직 적합성(MHC) 클래스 II에 대한 LAG-3의 결합을 경쟁적으로 억제하기 위해 실시예 6에 필수적으로 기술된 바와 같이 형광-활성 세포 선별(FACS)로 분석되는, 융합 폴리펩타이드.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 T 세포 반응을 보조 자극할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 T 세포 반응을 보조 자극하는 능력은 실시예 7 또는 8에 필수적으로 기술된 바와 같이 기능적 T 세포 활성화 검정에서 측정되는, 융합 폴리펩타이드.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 T 세포의 자극 하에 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 유도할 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 IL-2 및/또는 IFN-γ 생성을 유도하는 능력이 실시예 7 또는 8에 필수적으로 기술된 바와 같이 기능적 T 세포 활성화 또는 사멸 분석에서 측정되는, 융합 폴리펩타이드.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 서브유닛은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)의 14, 25-34, 36, 48, 52-53, 55-58, 60-61, 66, 79, 85-86, 101, 104-106, 108, 110-112, 114, 121, 140 및 153 서열 위치에서 하나 이상 돌연변이된 아미노산 잔기들을 포함하는 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인인, 융합 폴리펩타이드.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 서브유닛은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 포함하는 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인인, 융합 폴리펩타이드: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Phe, Gly, Ala, Asp 또는 Glu; Glu 27 → Asp, Val 또는 Thr; Phe 28 → Cys 또는 Asp; Pro 29 → Phe, Leu 또는 Trp; Glu 30 → Trp, Asn 또는 Tyr; Met 31 → Ile, Val, Asp, Leu 또는 Tyr; Asn 32 → Asp, Glu, Tyr, Trp, Val, Thr 또는 Met; Leu 33 → Asp, Glu 또는 Pro; Glu 34 → Val, Trp 또는 His; Val 36 → Ala; Asn 48 → Asp; Lys 52 → Glu, Ser, Arg 또는 Asn; Val 53 → Ala; Met 55 → Ala 또는 Val; Leu 56 → Asp, Gln 또는 Asn; Ile 57 → Leu; Ser 58 → Phe, Trp 또는 Asp; Arg 60 → Phe 또는 Glu; Cys 61 → Trp, Pro, Leu 또는 Trp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Val 85 → Ala; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Ser 또는 Phe; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys 또는 Gly; His 106 → Ala, Glu, Thr, Tyr, Gln 또는 Val; Lys 108 → Tyr, Phe, Thr 또는 Trp; Val 110 → Gly 또는 Ala; Arg 111 → Pro; Gly 112 → Met 또는 Thr; Lys 114 → Trp 또는 Ala; Lys 121 → Thr; Ser 140 → Gly 및 Cys 153 → Ser.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 서브유닛은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)과 비교하여 아미노산 잔기 돌연변이의 다음 세트들 중 하나를 포함하는 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인인, 융합 폴리펩타이드:
    (a) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (b) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Asn; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Ala; Gly 112 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
    (c) Arg 26 → Phe; Glu 27 → Val; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Leu; Glu 30 → Tyr; Met 31 → Asp; Asn 32 → Val; Leu 33 → Pro; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Glu; Cys 61 → Leu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys; His 106 → Val; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (d) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Thr; Phe 28 → Cys; Pro 29 →Trp; Glu 30 → Trp; Met 31 → Tyr; Asn 32 → Val; Leu 33 → Asp; Glu 34 → His; Leu 56 → Asn; Ile 57 → Leu; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Gln; Lys 108 → Trp; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (f) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (g) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Val 36 → Ala; Asn 48 → Asp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 140 → Gly; Cys 153 → Ser;
    (h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Glu; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (i) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Glu; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Trp; Val 36 → Ala; Lys 52 → Glu; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (j) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Val; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Glu; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Phe; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
    (k) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Trp; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Tyr; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
    (l) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ala; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 →Val; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Ala; Gly 112 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
    (m) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
    (n) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Ser; Met 55 → Ala; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
    (o) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Met; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 또는
    (p) Arg 26 → Phe; Glu 27 → Val; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Leu; Glu 30 → Asn; Met 31 → Asp; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Pro; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Trp; Arg 60 → Glu; Cys 61 → Pro; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Tyr; Leu 105 → Cys; His 106 → Thr; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인은 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 잔기를 포함하는, 서열번호 13-28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  24. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAG-3-특이 리포칼린 뮤테인은 서열번호 13-28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나의 서브유닛은 링커를 통해 도 1에 필수적으로 기술된 바와 같이 또 다른 서브유닛에 연결될 수 있는, 융합 폴리펩타이드.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 펩타이드 결합은 비구조식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 링커 (서열번호 2)인, 융합 폴리펩타이드.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 서브유닛은 단클론 항체인, 융합 폴리펩타이드.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 59-84, 112-117로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 단클론 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 85-111, 118-123로 이루어진 군에서 선택된 것인, 융합 폴리펩타이드.
  29. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 59-84, 112-117로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 가지며, 상기 단클론 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 85-111, 118-123로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  30. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체가 다음 CDR 서열을 갖는, 융합 폴리펩타이드:
    a. VH-CDR1: GYTFTDYE (서열번호 163), VH-CDR2: IDPGTGGT (서열번호 164), VH-CDR3: TSEKFGSNYYFDY (서열번호 165), VL-CDR1: QTIVHSDGNTY (서열번호 166), VL-CDR2: KVS, VL-CDR3: FQGSHVPLT (서열번호 167); 또는
    b. VH-CDR1: GYTFTSYW (서열번호 168), VH-CDR2: IDPSNSET (서열번호 169), VH-CDR3: ARSRGNYAYEMDY (서열번호 170), VL-CDR1: SSVSSNY (서열번호 171), VL-CDR2: STS, VL-CDR3: HQWSSYPP (서열번호 172); 또는
    c. VH-CDR1: GYTFTDYW (서열번호 173), VH-CDR2: IDTSDSYT (서열번호 174), VH-CDR3: ARRDYGGFGY (서열번호 175), VL-CDR1: QDISSY (서열번호 176), VL-CDR2: YTS, VL-CDR3: QQYSELPW (서열번호 177); 또는
    d. VH-CDR1: GYTFTDYN (서열번호 178), VH-CDR2: IDPNNGDT (서열번호 179), VH-CDR3: ARWRSSMDY (서열번호 180), VL-CDR1: QGISNY (서열번호 181), VL-CDR2: YTS, VL-CDR3: QQYSNLPW (서열번호 182); 또는
    e. VH-CDR1: GYSITSDYA (서열번호 183), VH-CDR2: ITYSGSP (서열번호 184), VH-CDR3: ARGLGGHYFDY (서열번호 185), VL-CDR1: QSISDY (서열번호 186), VL-CDR2: YAS, VL-CDR3: QNGRSYPY (서열번호 187); 또는
    f. VH-CDR1: GFSLTSYG (서열번호 188), VH-CDR2: IWRGGNT (서열번호 189), VH-CDR3: AASMIGGY (서열번호 190), VL-CDR1: QSIVHSNGNTY (서열번호 191), VL-CDR2: KVS, VL-CDR3: FQGSHVPL (서열번호 192).
  31. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, PDR001, MEDI0680, 피딜리주맙, ENUM-388D4 및 ENUM-244C8으로 이루어진 군에서 선택된, 융합 폴리펩타이드.
  32. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체는 IgG4 백본을 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 IgG4 백본은 S228P, N297A, F234A 및 L235A로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이들 중 임의의 하나를 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  34. 제 27 항에 있어서,
    상기 단클론 항체는 IgG1 백본을 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 IgG1 백본은 N297A, L234A 및 L235A로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이들 중 임의의 하나를 갖는, 융합 폴리펩타이드.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 서열번호 4 및 5에 나타낸 아미노산, 서열번호 4 및 9에 나타낸 아미노산, 또는 서열번호 4 및 6에 나타낸 아미노산, 또는 아미노산 서열번호 4 및 10에 나타낸 아미노산, 또는 서열번호 3 및 7에 나타낸 아미노산, 또는 서열번호 3 및 8에 나타낸 아미노산, 또는 서열번호 3 및 11에 나타낸 아미노산, 또는 서열번호 3 및 12에 나타낸 아미노산을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  37. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 조절 서열에 작동 가능하게 결합되어 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는, 핵산 분자.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 벡터 또는 파지미드 벡터 내에 포함되는, 핵산 분자.
  40. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  41. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 상기 뮤테인을 코딩하는 핵산으로부터 유전공학적 방법에 의해 출발하여 제조되는, 융합 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체에서 생산되고, 이 숙주 유기체 또는 이의 배양물로부터 분리되는, 방법.
  43. 면역 체크포인트 PD-1 및 LAG-3을 동시에 억제하기 위한 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 용도 .
  44. 항-종양 림프구 세포 활성을 증가시키기 위한 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 용도 .
  45. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 면역 체크 포인트 PD-1 및 LAG-3을 동시에 억제하는 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드 또는 그러한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 항-종양 림프구 세포 활성을 증가시키는 방법.
  47. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 하나 이상에 따른 융합 폴리펩타이드 하나 이상 또는 그러한 융합 폴리펩타이드들을 포함하는 조성물 하나 이상을 적용하는 것을 포함하는, 대상체에서 MHC(MHCmajor histocompatibility complex) 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 간섭하는 방법.
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