KR20090080979A - 항-Ｎｏｔｃｈ3 작동제 항체 및 Ｎｏｔｃｈ3 관련 질환을 치료하는 데에 있어서의 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Notch3과 특이적으로 결합하고 신호 전달을 활성화하는 작동제 항체에 관한 것이다. 본 발명은 제1 Lin12 도메인을 포함하는 에피토프와 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 또한, Notch3 관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 이들 항체의 용도를 포함한다.
항-Notch3 작동제 항체, Notch3 관련 질환, Notch3-매개된 신호 전달, 퇴행성 질환

Description

항-Ｎｏｔｃｈ3 작동제 항체 및 Ｎｏｔｃｈ3 관련 질환을 치료하는 데에 있어서의 그의 용도 {Anti-Notch3 agonist antibodies and their use in the treatment of Notch3-related diseases}
본 출원은 2006년 10월 19일자로 출원된 미국 가특허원 제60/852,861호 및 2007년 1월 6일자로 출원된 미국 가특허원 제60/879,218호 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다)의 이권을 청구하고 있다.
본 발명은 항-Notch3 작동제 항체 및 Notch3 관련 질환 또는 장애를 개선, 치료 또는 예방하는 데에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
Notch 유전자는 과일 파리 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 주가 톱니 모양을 한 날개 (notched wing blade)를 갖고 있는 것으로 밝혀진 1917년에 처음으로 보고되었다 [참고: Morgan, Am Nat 51:513 (1917)]. 이 유전자는 거의 70년 후에 클로닝되었고, 드로소필라 (Drosophila)에서 많은 상이한 세포 유형 및 조직을 발생시키는 데에 있어서 중요한 역할을 하는 세포 표면 수용체인 것으로 결정되었다 [참고: Wharton et al., Cell 43:567 (1985)]. Notch 신호 전달 경로는 세포-세포 접촉에 의해 매개된 신호 전달 기전인 것으로 금방 밝 혀졌고, 드로소필라로부터 인간에게 진화적으로 보존되어 왔다. Notch 수용체는 발생 및 조직 생체항상성 동안 각종 세포 유형에서 많은 세포성 과정, 예를 들어 분화, 세포 운명 결정, 줄기 세포의 유지, 세포 운동성, 증식 및 세포소멸에 관여하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Artavanis-Tsakonas, et al., Science 268:225 (1995)].
포유류는 4개의 Notch 수용체 단백질 [Notch1 내지 Notch4로 명명됨]과 5개의 상응하는 리간드 [델타 유사-1 (DLL-1), 델타 유사-3 (DLL-3), 델타 유사-4 (DLL-4), 재그화 (Jagged)-1 및 재그화-2로 명명됨]를 보유하고 있다. 포유류 Notch 수용체 유전자는 세포 표면으로의 수송 동안에 절단되어 이종-이량체 (heterodimer)로서 존재하는 약 300 kD 단백질을 암호화한다. Notch 수용체의 세포외 부분은 34개 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복 서열과 3개의 시스테인-풍부 Notch/LIN12 반복 서열을 갖고 있다. 2개의 절단된 소단위체의 연합은 절단 부위의 N-말단 및 C-말단 바로 앞에 놓여있는 서열에 의해 매개되고, 이들 두 소단위체는 Notch 이종-이량체화 (HD) 도메인을 구성하고 있다 [참고: Wharton, et al., Cell 43:567 (1985); Kidd, et al., Mol Cell Biol 6:3431 (1986); Kopczynski, et al., Genes Dev 2:1723 (1988); Yochem, et al., Nature 335:547 (1988)].
현재, Notch 신호 전달이 상이한 수용체에 의해 어떻게 조절되는지 또는 5개 리간드가 그들의 신호 전달 또는 조절에 있어서 어떻게 상이한지는 여전히 명확치 않다. 신호 전달 및/또는 조절 상의 차이는 상이한 조직에서의 그들의 발현 패턴에 의해 제어되거나 또는 상이한 환경적 자극에 의해 제어될 수 있다. 재그화/세 라테 (Serrate) 및 델타/델타-유사를 포함한 Notch 리간드 단백질은 EGF 반복 서열 영역과 특이적으로 결합하고 수용체-매개된 Notch 신호 전달을 유도시키는 것으로 보고되었다 [참고: Bray, Nature Rev Mol Cell Biol. 7:678 (2006), and Kadesch, Exp Cell Res. 260:1 (2000)]. EGF 반복 서열 중에서, 10번째 내지 12번째 반복 서열이 Notch 수용체에 대한 리간드 결합에 요구되고, 기타 EGF 반복 서열은 수용체-리간드 상호 작용을 증강시킬 수 있다 [참고: Xu, et al., J Biol Chem. 280:30158 (2005); Shimizu, et al., Biochem Biophys Res Comm. 276:385 (2000)]. LIN12 반복 서열 및 이량체화 도메인이 리간드 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 이들은 이종-이량체성 단백질 복합체를 유지시키는 데에 있어서 중요한 역할을 하여, 리간드-비의존성 프로테아제 절단과 수용체 활성화를 방지시켜 준다 [참고: Sanche-Irizarry, et al., Mol Cell Biol. 24:9265 (2004); Vardar et al., Biochem. 42:7061 (2003)].
장관 및 신경원성 줄기 세포를 포함한 많은 조직으로부터의 정상적인 줄기 세포는 자기 재생과 운명 결정을 위해 Notch 신호 전달에 의존한다 [참고: Fre, et al., Nature, 435: 964 (2005); van Es, et al., Nature, 435: 959 (2005); Androutsellis-Theotokis, et al., Nature, 442: 823 (2006)]. 따라서, Notch3 작동성 항체는 퇴행성 질환에 적용될 수 있었다. CADASIL (피질하 경색과 백질뇌증을 수반한 상염색체 우성 뇌동맥증)은 특정 유형의 발작과 치매를 유발시키는데, 그의 주요 특징으로는 재발성 피질하 허혈 사건과 혈관성 치매가 있다. CADASIL은 염색체 19에 국재된 돌연변이체 유전자와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다 [참고: Joutel, et al., Nature 383:707 (1996)]. 이 문헌의 저자는 Notch3 유전자의 심각한 붕괴를 유발시키는 CADASIL 환자에게서 돌연변이를 확인하였는데, 이는 Notch3이 CADASIL 환자에게서 결함있는 단백질일 수 있다는 지표이다. 불행하게도, 이러한 고도로 신체의 자유를 빼앗고 종종 치사적인 질환은 대개 진단되지 못하거나 다발성 경화증 및 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)으로서 잘못 진단되어 왔다. 현 연구는 이것이 처음 생각한 것 보다 훨씬 더 널리 확산된 질환이라는 것을 입증하려는 경향이 있다.
Notch3 관련 질환의 부가 예는 Notch3 유전자와 동일한 염색체 19 영역에 국재된, 전조를 수반한 편두통의 우성 상염색체 형태인 가족성 편마비성 편두통 (FHM)이다. CADASIL으로 인해 고통받고 있는 환자의 30% 이상이 또한, 전조를 수반한 편두통으로 인해 고통받고 있다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 후자는 상기 집단의 약 5%에서만 관찰되고 이러한 관찰로 인해, Notch3 유전자가 상기 질환의 기전에 관여한다는 사실을 발견할 수 있었다. 유사하게, 가족성 발작성 운동실조는 염색체 19의 동일한 영역에 국재된 유전자와 연계되었고, Notch3은 이러한 질환에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. Notch3과 연계되어 온 기타 질환 및 질병에는 알라질 (Alagille) 증후군이 포함된다 [참고: Flynn, et al., J Pathol 204:55 (2004)].
현재 진행중인 연구는 Notch3 발현 및/또는 신호 전달 결함과 연계된 기타 질병 및 질환을 확인하기 위해 수행되고 있다. Notch3 신호 전달 경로와 연관된 다수의 인간 질병의 관점에서 보면, 이들 질환을 예방하고 치료하기 위한 새로운 방식을 확인하는 것이 중요하다. 본 발명은 이러한 채워지지 않은 의학적 요구에 유용한 신규한 항-Notch3 작동제 항체를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 LIN12 도메인 내의 인간 Notch3 수용체의 에피토프와 특이적으로 결합하는 신규한 작동제 항체 및 그의 단편을 제공한다. 본 발명의 또 다른 국면은 본 발명와 동일한 에피토프와 결합하는 항체 및 에피토프 결합 부위를 포함한다. 본 발명의 항체는 리간드 결합과 무관한 Notch3 수용체를 통하여 Notch3-매개된 신호 전달을 활성화시킨다.
본 발명은 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 그의 상응하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태는 이들 항체의 CDR 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항체 서열을 정착시킨 세포주 및 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 작동제 항체에 의해 인식된 에피토프를 포함한다. 본 발명은 또한, 이러한 에피토프와 결합하는 항체를 포함한다. 본 양태는 서열 10과의 서열 동일률이 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상인 Lin 12 도메인을 포함하는 Notch3 에피토프를 포함한다. 보다 특히, Notch3 에피토프는 서열 11을 포함한다. 본 발명은 이러한 에피토프와 결합하는 작동제 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 예를 들어 수용체 불활성화와 연관된 Notch3 관련 질환 및 장애를 치료하기 위한 약물 또는 조성물을 제조하기 위한 이들 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 예를 들어 리간드 결합과 무관한 Notch3 신호 전달을 활성화시킴으로써 결함을 활성화시키는 것을 포함하는, 예를 들어 수용체 불활성화와 연관된 Notch3 관련 질환 또는 장애를 치료하는 데에 있어서의 이들 항체의 용도이다. Notch3 관련 장애에는 CADASIL, 가족성 편마비성 편두통 (FHM), 가족성 발작성 운동실조, 알라질 증후군 및 기타 퇴행성 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 1은 Notch3의 아미노산 서열을 도시한 것이다. EGF 반복 서열 영역은 아미노산 잔기 43에서부터 1383까지 연장되고; LIN12 도메인은 아미노산 잔기 1384에서부터 1503까지 연장되며; 이량체화 도메인은 아미노산 잔기 1504에서부터 1640까지 연장된다.
도 2 (A-H)는 인간 Notch1, Notch2, Notch3, 및 Notch4 간의 아미노산 서열 비교를 도시한 것이다.
도 3은 Notch1, Notch2, Notch3, 및 Notch4의 동일률 (%)을 도시한 것이다.
도 4A 및 4B는 항-Notch3 모노클로날 항체 MAb 256A-13 (서열 2)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 도시한 것인데, CDR 영역이 밑줄처져 있다.
도 5는 Notch3 수용체에 대한 항-Notch3 MAb에 의한 활성화 효과를 나타내는 실시예 5의 루시퍼라제 리포터 (reporter) 검정을 도시한 것이다.
도 6은 Notch3의 메탈로프로테아제 절단에 대한 Notch3 작동성 항체의 강한 영향력을 도시한 것이다.
도 7은 256A-13의 결합 부위의 에피토프 지도화를 위한 Notch3-Fc 융합 단백질 구조물을 도시한 것이다.
도 8은 공학 처리시킨 Notch3 리더 펩티드 암호화 서열을 천연 Notch3 리더 펩티드 암호화 서열 (NCBI 유전자은행 승인 번호 NM_000435)과 비교하여 도시한 것인데, 이는 뉴클레오티드의 차이 (8A)와 공학 처리시킨 Notch 리더 펩티드 서열의 해독된 아미노산 서열의 차이 (8B)를 나타낸다. 도 8C는 LIN12 도메인을 도시한 것이고, 도 8D는 LIN12의 서브도메인 에피토프를 도시한 것이다.
도 9는 PCR-SOE 방법에 의해 구축된 도메인 스와프 (swap) 생성을 도시한 것이다. 막대 화살표는 PCR 프라이머를 나타낸다. 흰색 막대는 Notch3 서열을 나타내고, 검은색 막대는 Notch1 서열을 나타낸다.
도 10은 MAb 256A-13의 Notch3 LIN12 도메인 에피토프 지도화에 사용된 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 11은 256A-13의 선형 에피토프 지도화에 대한 알라닌 스캐닝 펩티드를 도시한 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 특별한 방법론, 프로토콜, 세포주, 벡터 또는 시약으로 제한되지 않는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 추가로, 본원에 사용된 방법론은 단지 특별한 양태를 기재할 목적이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태에는 달리 명백히 지시하지 않는 한, 복수 형태가 포함되는데, 예를 들어 "숙주 세포"에는 복수 개의 숙주 세포가 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어 및 모든 두문자어는 본 발명의 분야에서의 당업자가 통상적으로 인식하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 모든 방법 및 물질을 본 발명의 실시에 사용할 수 있긴 하지만, 예시되는 방법, 장치 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 언급된 모든 특허 및 공개문헌은 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 본원에 보고된 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법론을 기재 및 기술할 목적으로 법으로써 허용된 정도로 본원에 참고로 도입된다. 그러나, 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 기술 내용 보다 선행될 권리가 없는 것으로 승인되는 것으로 간주되지 않는다.
정의
본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어는 당업자에게 통상적이고 전형적인 의미를 지니는 것으로 간주되어야 한다. 그러나, 본 출원인은 다음 용어가 다음과 같이 정의되는 바와 같이 특별한 정의로서 제공되기를 요망한다.
항체 쇄 폴리펩티드 서열과 관련하여 "실질적으로 동일한"이란 기준 폴리펩티드 서열과의 서열 동일률이 70%, 또는 80%, 또는 90%, 또는 95% 이상인 항체 쇄로서 간주될 수 있다. 핵산 서열과 관련한 상기 용어는 기준 핵산 서열과의 서열 동일률이 약 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 97% 이상인 뉴클레오티드 서열로서 간주될 수 있다.
"동일률" 또는 "상동률"은 필요한 경우 전체 서열에 대한 최대 동일률을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (%)을 의미하는 것으로 간주되어야 하고, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 어떠한 N- 또는 C-말단 연장물이나 삽입물도 동일률 또는 상동률을 저하시키는 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 서열 동일률은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 구체적으로 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 및 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 항체 단편 (단, 이는 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다)을 포괄한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 동일한 구조적 특징을 지닌 당단백질이다. 항체가 특이적 표적에 대한 결합 특이성을 나타내긴 하지만, 면역글로불린에는 표적 특이성이 결여된 항체와 기타 항체-유사 분자 둘 다가 포함된다. 본 발명의 항체는 모든 유형 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예: IgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 및 lgA2) 또는 아부류일 수 있다. 천연 항체 및 면역글로불린은 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "항-Notch3 항체"는 리간드와 무관한 Notch3 신호 전달을 활성화시키는 방식으로 인간 Notch3과 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
항체의 가변 도메인 맥락에서 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭하고, 그의 특별한 표적에 대한 각각의 특별한 항체의 결합성 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역으로서 공지되기도 한, 상보성 결정 영역으로 지칭된 3개의 절편 (CDR; 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 골격 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 CDR은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 표적 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1987)]. 본원에 사용된 바와 같은, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 표시되지 않는 한, 카바트 (Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링 시스템에 따른다.
용어 "항체 단편"은 완전한 길이 항체의 일부, 일반적으로 표적 결합성 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예에는 F(ab), F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 단편이 포함된다. 항체의 "기능성 단편 또는 유사체"는 완전한 길이의 항체와 공통의 정성적 생물학적 활성을 지닌 화합물이다. 예를 들어, 항-Notch3 항체의 기능성 단편 또는 유사체는 수용체가 그의 리간드와 결합하거나 신호 전달을 개시시킬 수 있는 능력을 방지시키거나 실질적으로 저하시키는 방식으로 Notch3 수용체와 결합할 수 있는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 항체와 관련한 "기능성 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')2 단편을 지칭한다. "Fv" 단편은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체 (VH-VL 이량체)로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 CDR이 VH-VL 이량체 표면 상의 표적 결합 부위를 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 CDR은 항체에 대한 표적 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 표적에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 표적을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 표적 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
용어 "디아보디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기하여, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다.
F(ab) 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab') 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 수 개의 잔기를 부가함으로써 F(ab) 단편과는 상이하다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 분해 산물의 힌지 시스테인에서 디설파이드 결합을 절단시킴으로써 생성된다. 항체 단편의 부가의 화학적 커플링물은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이물을 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이고, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81:6851 (1984)]. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 표적 부위에 대항하여 유도된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 표적 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로, 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 모노클로날 항체는 널리 공지된 기술을 사용하여 파아지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 방법에 의해 만들 수 있다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab)2 또는 항체의 기타 표적-결합성 아서열)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 주형 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한, 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 선택된 인간 면역글로불린 주형의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 자손을 포함한다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능 또는 생물학적 특성을 지닌 변이체 자손이 포함된다. 본 발명에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로, 원핵성 또는 진핵성 숙주이다.
세포성 유기체, 세포 또는 세포주를 DNA로 "형질전환"시키는 것은 DNA를 표적 세포 내로 도입하여 이러한 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해 복제 가능하도록 하는 것을 의미한다. 세포 또는 유기체를 DNA로 "형질감염"시키는 것은 어떠한 암호화 서열도 실제로 발현되든지 아니든지 간에 이러한 세포 또는 유기체에 의해 DNA (예: 발현 벡터)를 흡수하는 것을 지칭한다. 용어 "형질감염된 숙주 세포" 및 "형질전환된"은 DNA를 도입한 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 "숙주 세포"로 지칭되고, 이는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 전형적인 원핵성 숙주 세포에는 이. 콜라이 (E. coli)의 각종 균주가 포함된다. 전형적인 진핵성 숙주 세포는 포유류, 예를 들어 중국산 햄스터 난소 또는 인간 기원의 세포이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종 또는 숙주 세포와 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 몇몇 외래 및 몇몇 상동성 DNA를 함유하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 제어 서열과 작동적으로 연결되는 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 이러한 제어 서열에는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 임의의 작동인자 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 제어하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파아지 입자, 또는 단순히 잠재적 게놈성 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 몇몇 경우에는, 게놈 자체 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터는 종종 상호 교환적으로 사용되는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명에는 당해 분야에 공지된 바와 같은, 그리고 공지되고 있는 등가의 기능을 제공하는 기타 형태의 벡터가 포함된다.
치료 목적을 위한 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭하는데, 이에는 인간, 가축 및 농장 동물, 비-인간 영장류, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 암소 등이 포함된다.
본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 분자 또는 단백질, 예를 들어 항체와 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있는 탐지 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 탐지 가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소 표지의 경우에는, 탐지 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "고체 상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포괄된 고체 상의 예에는 부분적으로 또는 완전히 유리 (예: 제어 공극 유리), 다당류 (예: 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 형성된 것들이 포함된다. 특정 양태에서는, 상황에 따라서 고체 상이 검정용 판의 웰을 포함할 수 있고, 기타 양태에서는 정제용 칼럼 (예: 친화 크로마토그래피 칼럼)이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Notch3-매개된 장애"는 결함이 있거나 불충분하게 발현된 Notch3 수용체를 특징으로 하는 질환 또는 질병을 의미한다. 구체적으로 언급하면, 퇴행성 질환, 예를 들어 CADASIL, FHM, 가족성 발작성 운동실조, 알라질 증후군 및 기타 퇴행성 질환과 연관된 질환이 포함되는 것으로 간주될 것이다.
항체를 생성하기 위한 Notch3 수용체 면역원
가용성 표적 또는 그의 단편을 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 항체는 관심있는 표적에 대항하여 유도된다. 바람직하게, 표적은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 항체를 특정 질환 또는 장애로 인해 고통받고 있는 포유류에게 투여하면 이러한 포유류에게서 치료적 이득이 발생할 수 있다. 완전 세포를 항체 제조를 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 면역원은 재조합적으로 생성될 수 있거나 또는 합성 방법을 사용하여 만들 수 있다. 면역원은 천연 공급원으로부터 단리시킬 수도 있다.
막관통 (transmembrane) 분자, 예를 들어 수용체의 경우에는, 이의 단편 (예: 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로서 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 막관통 분자를 발현하는 세포를 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예: 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나 또는 막관통 분자를 과발현시키기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환시킨 세포일 수 있다. 항체를 제조하는 데에 유용한 기타 형태의 면역원은 당업자에게 명백할 것이다.
또 다른 한편, 인간 Notch3 수용체를 암호화하는 유전자 또는 cDNA를 플라스미드 또는 기타 발현 벡터 내로 클로닝하고, 당업자에게 널리 공지된 방법에 따라서 수 많은 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. Notch3 수용체를 클로닝 및 발현하는 방법, 및 인간 Notch3 수용체에 대한 핵산 서열은 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,821,332호 및 제5,759,546호]. 유전자 암호의 축퇴로 인해, Notch3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 가능한 코돈 선택에 의거하여 조합물을 선별함으로써 뉴클레오티드 서열을 다양하게 할 수 있다. 이들 조합물은 천연 발생적 Notch3 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적용된 바와 같은 표준 삼중자 유전자 암호에 따라서 만들고, 이러한 모든 변이물이 고려될 수 있다. 이들 폴리펩티드 중의 어느 하나를 동물의 면역에 사용하여 인간 Notch3 수용체와 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다.
기타 종으로부터의 재조합 Notch3 단백질을 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용할 수도 있는데, 이는 Notch3의 아미노산 서열이 고도로 보존되기 때문이다. 인간 Notch3과 마우스 Notch3을 비교한 결과, 두 종 간에 90% 이상의 아미노산 서열이 동일한 것으로 밝혀졌다.
면역원 Notch3 수용체는 유리한 경우, 융합 절편에 부착된 Notch3 수용체를 갖는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 절편은 종종, 예를 들어 융합 단백질이 단리되고 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있도록 해줌으로써 단백질 정제에 도움을 주지만, 면역원성을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다. 융합 단백질은 이러한 단백질의 카복실 및/또는 아미노 말단에 부착된 융합 절편을 포함한 단백질을 암호화하는 융합 핵산 서열로 형질전환시킨 재조합 세포를 배양함으로써 생성시킬 수 있다. 융합 절편에는 면역글로불린 Fc 영역, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 2가 금속 이온과 결합할 수 있는 폴리-히스티딘 절편, 및 말토스 결합성 단백질이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예 1에 기재된 바와 같은 재조합 Notch3 수용체 단백질을 사용하여 마우스를 면역시켜 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시킬 수 있었다. 예시되는 폴리펩티드는 서열 1의 전부 또는 일부, 또는 그의 변이체를 포함한다.
항체 생성
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 적합한 모든 방법에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다 [참고: Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같은 면역원을 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 각종 숙주 동물에게 투여하여, 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청 생성을 유도시킬 수 있다. 면역원의 투여는 면역제, 및 경우에 따라 아주반트 (adjuvant)를 1회 이상 주사하는 것을 수반할 수 있다. 각종 아주반트를 사용하여, 숙주 종에 따라서 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 이에는 프로인트 (Freund) (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 다가 알코올, 다가 음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아주반트, 예를 들어 BCG (bacille Calmette-Guehn) 및 코리네박테륨 파르붐 (Corynebacterium parvum)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이용될 수 있는 아주반트의 부가 예에는 MPL-TDM 아주반트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역 프로토콜은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 선택된 동물 숙주에게서 면역 반응을 유발시키는 모든 방법에 의해 수행될 수 있다. 아주반트 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 면역원 (아주반트를 수반하거나 수반하지 않음)을 포유류에게 여러 차례 피하 또는 복강내 주사하거나 또는 근육내 또는 정맥내 주사한다. 면역원은 Notch3 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 특성 (즉, 소수도, 친수도, 안정성, 순 전하, 등전점 등)에 따라서, 면역원을 면역시키고자 하는 포유류에게서 면역원성인 것으로 공지된 단백질과 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 접합에는 활성 화학적 관능기를 유도체화함으로써 면역원과 접합될 면역원성 단백질 둘 다에 대해 화학적으로 접합시켜 공유 결합이 형성되도록 하는 것, 또는 융합 단백질에 의거한 방법론 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 통한 접합이 포함된다. 이러한 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 헤모시아닌, 오브알부민, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린, 대두 트립신 억제제, 및 불규칙한 T 헬퍼 펩티드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 각종 아주반트를 사용하여 상기 언급된 바와 같은 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위를 인식하는 항체이다. 그의 동형 특이성으로 인해, 모노클로날 항체는 상이한 각종 항원성 부위를 인식하는 항체를 통상 함유하는 폴리클로날 항체 보다 훨씬 더 유용하다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술 [참고: Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); 미국 특허 제4,376,110호; Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) and Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)], 재조합 DNA 방법, 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있는 방법의 기타 예에는 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [참고: Kosbor, et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole, et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)], 및 EBV-하이브리도마 기술 [참고: Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)]이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함한 모든 면역글로불린 부류 및 그의 아부류일 수 있다. 본 발명의 MAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체 내에서 배양할 수 있다.
하이브리도마 모델에서는, 마우스, 인간화 마우스, 인간 면역계를 수반한 마우스, 햄스터, 토끼, 낙타, 또는 기타 적당한 모든 숙주 동물과 같은 숙주를 면역시켜, 면역을 위해 사용된 단백질과 특이적으로 결합하게 될 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또 다른 한편, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (1986)].
일반적으로, 항체 생산 하이브리도마를 제조하는 데에 있어서, 인간 기원 세포가 요망되는 경우에는 말초혈 림프구 ("PBL")를 사용하거나, 또는 비-인간 포유류 공급원이 요망되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]. 불멸화 세포주는 통상적으로, 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 골수종 세포이다. 전형적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주를 이용한다. 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 한 가지 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에는, 하이브리도마에 대한 배양 배지가 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지시키는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")를 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합시켜 주고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 안정한 고 수준의 항체 생성을 뒷받침해주며, HAT 배지 등의 배지에 민감한 세포주이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 공급처 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA]로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것; 및 공급처 [American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA]로부터 입수 가능한 SP2/0 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 [참고: Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., pp. 51-63 (1987)]. 마우스 골수종 세포주 NSO를 사용할 수도 있다 [참고: European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK].
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, Notch3에 대항하여 유도된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 당업자의 기술 수준 내이다. Notch3에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [참고: Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 과정에 의해 클론을 서브클로닝시킨 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 둘벡코 변형 이글 배지 (D-MEM) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물 중에서 복수 (ascites) 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 적합하게 분리 또는 단리시킨다.
모노클로날 항체를 생성시키기 위한 각종 방법이 당해 분야에 존재하므로, 본 발명은 하이브리도마에서의 생성 만으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 방법에 의해 만들 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵성, 파아지 또는 원핵성 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화 또는 기타 공급원으로부터의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열 분석한다 [참고 Innis, et al. In PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), Sanger, et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)]. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, NSO 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이는 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득할 수 있다. DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 암호화 서열로 치환시키거나 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)], 또는 면역글로불린 암호화 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신 사용할 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용하여 키메라 2가 항체를 창출시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수도 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄와 변형된 중쇄를 재조합 발현시키는 것을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, Fc 영역 내의 어떠한 지점에서도 절단시켜 중쇄 가교결합을 방지시킨다. 또 다른 한편으론, 관련 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 치환시키거나 결실시켜 가교결합을 방지시킨다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 전통적으로, 이들 단편은 본래의 항체를 단백질 분해적 분해시킴으로써 유도되었다 [참고: 예를 들어, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); Brennan et al., Science 229:81 (1985)]. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인 [Fab 단편을 생성시키기 위함] 또는 펩신 [F(ab')2 단편을 생성시키기 위함]과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자를 단백질 분해적으로 절단시킴으로써 생성시킬 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 그러나, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 파아지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 또 다른 한편, F(ab')2-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992)]. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리시킬 수 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 양태에서는 선택되는 항체가 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [참고: PCT 특허 출원 WO 93/16185].
인간에게서의 항체의 생체내 용도 및 시험관내 탐지 검정을 포함한 몇몇 용도의 경우에는, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체의 생성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi, et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies, et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816397호; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
인간화 항체는 동물 유래된 모노클로날 항체 보다 인간 면역글로불린에 대한 상동성이 더 크도록 설계된다. 인간화는 본래의 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 덜한 것을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시킨 키메라 항체를 제조하기 위한 기술이다. 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)과 인간 면역글로불린 분자로부터의 골격 (FR) 영역을 갖는 목적 항원과 결합하는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자이다. 종종, 인간 골격 영역 내의 골격 잔기는 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합성을 변경, 바람직하게 개선시킬 것이다. 이들 골격 치환은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 확인하는데, 예를 들어 CDR 잔기와 골격 잔기의 상호 작용물을 모델링하여 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 확인하고, 서열을 비교하여 특별한 위치에 있는 특이한 골격 잔기를 확인한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann, et al., Nature 332:323 (1988); 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 항체는 당해 분야에 공지된 각종 기술, 예를 들어 CDR-이식화 [참고: EP 239,400; PCT 공개공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호], 베니어링 (veneering) 또는 재포장 (resurfacing) [참고: EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka, et al., Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska, et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)], 및 연쇄 셔플링 [참고: 미국 특허 제5,565,332호]을 사용하여 인간화시킬 수 있다.
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 비-인간 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 본래의 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 덜한 것을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체이다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 CDR 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.
인간화 항체가 항원에 대한 보다 고 친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유하고 있는 것이 추가로 중요하다. 이를 달성하기 위한 바람직한 양태에 따르면, 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 시판되고 있으며, 당업자에게 널리 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 추정상의 3차원적 입체 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수 가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어 특정 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선별하고, 이를 수용자로부터 유입 서열과 합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 최대가 되도록 하지만, 항원 결합성에 직접적이면서도 가장 실질적으로 영향을 미치는 것은 CDR 잔기이다.
인간화 항체를 제조하는 데에 사용될, 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택이 항원성을 저하시키는 데에 있어 중요하다. 소위 "최량 적합 (best-fit)" 방법에 따르면, 비-인간 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 이때, 비-인간 모 항체의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 FR로서 허용한다 [참고: Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987)]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특별한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 [참고: Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 15:2623 (1993)].
완전한 인간 항체는 인간 환자를 치료적으로 처치하는 데에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 언급된 파아지 디스플레이 방법을 포함한 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 만들 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 다음 문헌의 기술 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하는 데에 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss (1985); and Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)].
인간 항체는 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입할 수 있다. 또 다른 한편, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자 자리의 도입과 별개로 또는 이와 동시에 비-기능성이 되도록 할 수 있다. 특히, JH 영역을 동형접합성 결실시키면 내인성 항체 생성이 방지된다. 변형된 배아 줄기 세포를 확장시키고 배반포 내로 미소주사하여 키메라 마우스를 생성시킨다. 그 다음, 이러한 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생성시킨다 [참고: 예를 들어, Jakobovitis, et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis, et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann, et al., Year in Immunol 7:33 (1993); Duchosal, et al., Nature 355:258 (1992)]. 트랜스제닉 마우스는 선별된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 정상적 방식으로 면역시킨다. 이러한 항원에 대항하여 유도된 모노클로날 항체는, 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역시킨 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 정착된 인간 면역글로불린 트랜스유전자 (transgene)는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 연속해서 부류 전환과 체세포 돌연변이를 진행한다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성시키는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성시키기 위한 상기 기술에 관한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Lonberg, et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)]. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 상기 기술 및 이러한 항체를 생성시키기 위한 프로토콜에 관한 상세한 논의는, 예를 들어 PCT 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다)를 참고할 수 있다. 또한, 다음 공급처 [예: Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, Calif.), 및 Medarex, Inc. (Princeton, N.J.)]가 상기 언급된 바와 유사한 기술을 이용하여 선별된 항원에 대항하여 유도된 인간 항체를 제공하기 위한 작업에 착수하였다.
또한 인간 MAb는 인간 말초혈 백혈구, 비장세포 또는 골수를 이식한 마우스를 면역시킴으로써 만들 수 있었다 (예를 들어, XTL의 트리오마 기술). 선별된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도된 선별"로서 지칭된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 접근 방식에서, 선별된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선별을 유도한다 [참고: Jespers, et al., Bio/technology 12:899 (1988)].
추가로, 결국에는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 활용하여, 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 "모방"하는 항-개체특이형 항체를 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Greenspan, et al., FASEB J 7:437 (1989); Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)]. 예를 들어, 결합하여 폴리펩티드 다량체화 및/또는 리간드에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합성을 완전히 억제시키는 항체를 사용하여, 폴리펩티드 다량체화 및/또는 결합성 도메인을 "모방"하고 그 결과로서, 폴리펩티드 및/또는 그의 리간드와 결합하여 이를 중화시키는 항-개체특이형을 생성시킬 수 있다. 이와 같이 항-개체특이형 또는 이러한 항-개체특이형의 Fab 단편을 중화시키는 것은 폴리펩티드 리간드를 중화시키기 위한 치료 섭생에 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항-개체특이형 항체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 결합시키고/시키거나 그의 리간드/수용체를 결합시킴으로써, 그의 생물학적 활성을 차단시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 이중-특이적 항체일 수 있다. 이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 모노클로날, 바람직하게 인간 또는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 결합 특이성 중의 하나는 Notch3을 향하여 유도될 수 있고, 다른 것은 기타 모든 항원, 바람직하게 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 소단위체, 조직-특이적 항원, 바이러스에 의해 유래된 단백질, 바이러스에 의해 암호화된 외피 단백질, 세균에 의해 유래된 단백질, 또는 세균성 표면 단백질 등에 대해서일 수 있다.
이중-특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중-특이적 항체의 재조합 생성 방법은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖고 있다 [참고: Milstein et al., Nature 305:537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마 (quadroma)]는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 친화 크로마토그래피 단계에 의해 통상적으로 수행된다. 유사한 과정이 문헌 [참고: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991)]에 기재되어 있다.
목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합시킬 수 있다. 이러한 융합은 바람직하게, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이중-특이적 항체를 생성시키는 것에 관한 추가의 상세 내역은, 예를 들어 문헌 [참고: Suresh, et al., Meth In Enzym 121:210 (1986)]을 참고할 수 있다.
이종-접합체 항체가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 이종-접합체 항체는 2개의 공유적으로 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 불필요한 세포에 표적화시키는 것으로 제안되었다 [참고: 미국 특허 제4,676,980호]. 상기 항체는 가교결합제 사용을 포함한, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설파이드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에스테르 결합을 형성함으로써 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 것이 포함된다.
또한, Notch3에 대한 단일-도메인 항체를 생성시킬 수 있다. 카멜리대 (Camelidae) 중쇄 Ig로부터 유래된 항체에 대한 상기 기술의 예는 WO9425591에 보고되었고, 또한 파아지 라이브러리로부터 단일 도메인 완전 인간 항체의 단리에 관하여 기재한 US20030130496에 보고되었다.
중쇄와 경쇄 Fv 영역을 연결시킨 단일 펩티드 쇄 결합성 분자를 창출시킬 수도 있다. 단일 쇄 항체 ("scFv") 및 그의 구축 방법이 미국 특허 제4,946,778호에 기재되어 있다. 또 다른 한편, 유사한 수단에 의해 Fab를 구축 및 발현시킬 수 있다. 완전한 인간 항체와 부분적 인간 항체 모두는 완전한 뮤린 MAb 보다 덜 면역원성이고, 그의 단편 및 단일 쇄 항체 또한 덜 면역원성이다.
항체 또는 항체 단편은 문헌 [참고: McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature 352:624 (1991) and Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991)]에는 파아지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파아지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 [참고: Waterhouse et al., Nuc Acids Res 21:2265 (1993)] 뿐만 아니라 연쇄 셔플링 [참고: Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)]에 의해 고 친화도 (nM 범위) 인간 항체를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리시키기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대체 방안이다.
DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 암호화 서열로 치환시킴으로써 변형시킬 수 있다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81:6851 (1984)].
또 다른 대안은 하이브리도마를 형성시키기 위해 화학적 융합이 아닌 전기적 융합을 이용하는 것이다. 이러한 기술은 잘 정립되어 있다. 융합 대신, B 세포를 또한 형질전환시켜, 예를 들어 엡슈타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 또는 형질전환성 유전자를 이용하여 상기 세포를 불멸성으로 만들 수 있다 [참고: 예를 들어, "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity," Zurawaki, et al., in Monoclonal Antibodies, ed. by Kennett, et al., Plenum Press, pp.19-33. (1980)]. 항-Notch3 MAb는 설치류 (예: 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그)를 원핵 또는 진핵 시스템에 의해 발현된 Notch3 단백질, 융합 단백질 또는 그의 단편으로 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 면역시키기 위해 기타 동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 트랜스제닉 마우스 발현 면역글로불린, 및 인간 B 림프구가 이식된 중증의 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스를 사용할 수 있다. 하이브리도마는 면역시킨 동물로부터의 B 림프구를 앞서 기재된 바와 같이 [참고: Kohler, et al., Nature 256:495 (1975)], 골수종 세포 (예: Sp2/0 및 NSO)와 융합시킴으로써 통상적인 과정에 의해 생성시킬 수 있다. 또한, 항-Notch3 항체는 파아지-디스플레이 시스템에서 인간 B 림프구로부터 재조합 단일-쇄 Fv 또는 Fab 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성시킬 수 있다. Notch3에 대한 MAb의 특이성은 ELISA, 웨스턴 (Western) 면역블롯팅 또는 기타 면역화학적 기술에 의해 시험할 수 있다. 보체 활성화에 대한 항체의 억제 활성은 전통적인 보체 경로에 대해 감작된 치킨 또는 양 RBC를 이용하여, 용혈성 검정에 의해 평가할 수 있다. 양성 웰 중의 하이브리도마를 제한 희석에 의해 클로닝한다. 항체를 대상으로 하여 상기 언급된 검정에 의해 인간 Notch3에 대한 특이성을 알아보기 위한 성상 확인을 위해 정제한다.
항-Notch3 항체의 확인
본 발명은 리간드와 무관한 Notch3-매개된 신호 전달을 활성화시키는 작동제 모노클로날 항체를 제공한다. 특히, 본 발명의 항체는 Notch3와 결합하여 이를 활성화시킨다. 본 발명의 항체에는 256A-13으로 명명된 항체가 포함된다. 본 발명은 또한, 256A-13과 동일한 에피토프와 결합하는 항체를 포함한다.
후보 항-Notch3 항체는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 면역블롯팅, 또는 기타 면역화학적 기술에 의해 시험하였다. 개개 항체를 성상 확인하기 위하여 수행된 검정은 본 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중-특이적, 이종-접합체, 다중-특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 단일-도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-개체특이형 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기의 에피토프-결합성 단편이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
항체는 본 발명의 인간 항원 결합성 항체 단편일 수 있고, 이에는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv (scFv), 단일 쇄 항체, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단일-도메인 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 단일 쇄 항체를 포함한 항원 결합성 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 포함하거나 또는 다음 중의 일부 또는 전부와 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1 , CH2, 및 CH3 도메인. 또한, 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1 , CH2, 및 CH3 도메인의 모든 조합물을 포함하는 항원 결합성 단편이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 조류 및 포유류를 포함한 모든 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 항체는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 (예: 마우스 및 랫트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 치킨으로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같은, "인간" 항체에는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함되고, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호 (Kucherlapati, et al.)에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리되거나 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉이고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체가 포함된다.
본 발명의 항체는 단일-특이적, 이중-특이적, 삼중-특이적, 또는 보다 큰 다중-특이적일 수 있다. 다중-특이적 항체는 Notch3의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 또는 Notch3 뿐만 아니라 이종 에피토프, 예를 들어 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질 둘 다에 대해 특이적일 수 있다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J Immunol 147:60 (1991); 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,819호; Kostelny, et al., J Immunol 148:1547 (1992)].
본 발명의 항체는 그들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 Notch3의 에피토프(들) 또는 그의 일부(들) 측면에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 이러한 에피토프(들) 또는 폴리펩티드 일부(들)는, 예를 들어 N-말단 및 C-말단 위치, 연속되는 아미노산 잔기의 크기에 의해, 본원에 기재된 바와 같이 구체화될 수 있거나 또는 본원의 표 및 도면에 열거될 수 있다.
본 발명의 항체는 그들의 교차-반응성 측면에서 기재되거나 구체화될 수 있다. Notch3와의 동일률이 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 및 50% 이상 (당해 분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용하여 계산된 바와 같음)인 Notch3 폴리펩티드와 결합하는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 항-Notch3 항체는 기타 단백질, 예를 들어 항-Notch3 항체를 유도시키는 것 이외의 종으로부터의 항-Notch3 항체와 약 10-7 M 미만, 약 10-6 M 미만, 또는 약 10-5 M 미만의 KD로 결합할 수도 있다.
구체적 양태에서, 본 발명의 항체는 인간 Notch3의 원숭이 상동체 및 그의 상응하는 에피토프와 교차 반응한다. 구체적 양태에서, 상기 언급된 교차 반응성은 모든 단일 특이적 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 특이적 항원성 및/또는 면역원성 폴리펩티드의 조합물에 대해서이다.
추가로, 엄격한 혼성화 조건 하에 Notch3을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드와 결합하는 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 또한, 본 발명의 폴리펩티드와의 결합 친화도 측면에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 평형 해리 상수 또는 KD가 10-8 내지 10-15 M, 10-8 내지 10-12 M, 10-8 내지 10-10 M, 또는 10-10 내지 10-12 M를 갖는 것이 포함된다. 본 발명은 또한, 경쟁적 결합을 측정하는 것으로 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해 결정된 바와 같이, 항체가 본 발명의 에피토프와 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상 경쟁적으로 억제한다.
벡터 및 숙주 세포
또 다른 국면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 변이체를 암호화하는 단리된 핵산 서열, 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 구조물, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 항체를 생성하기 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체 변이체를 재조합 생성하기 위해서는, 이를 암호화하는 핵산을 단리시키고, 이를 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체 변이체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들어, 항체 변이체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열 분석한다. 클로닝 및 형질전환에 대한 표준 기술을, 본 발명의 항체를 발현하는 세포주를 제조하는 데에 사용할 수 있다.
벡터
많은 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 널리 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것과 같은 적합한 전사 또는 해독 조절성 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조절성 서열의 예에는 전사 프로모터, 작동인자, 증강인자, mRNA 리보솜성 결합 부위, 및/또는 전사 및 해독 개시와 종결을 제어하는 기타 적당한 서열이 포함된다. 뉴클레오티드 서열은 조절성 서열이 적당한 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 관계가 있는 경우에 "작동적으로 연결"된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 이러한 프로모터 뉴클레오티드 서열이 적당한 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어하는 경우에, 예를 들어 항체 중쇄 서열과 작동적으로 연결되어 있다.
또한, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 천연상 연합되지 않는 적당한 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 발현 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비성 리더)에 대한 뉴클레오티드 서열은 동일 프레임 내에서 폴리펩티드 서열과 융합시켜 항체가 주변세포질 공간 또는 배지 내로 분비되도록 할 수 있다. 의도한 숙주 세포에서 기능적인 신호 펩티드는 적당한 항체의 세포외 분비를 증강시켜 준다. 신호 펩티드는 세포로부터의 항체 분비시 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 이러한 분비성 신호의 예는 널리 공지되어 있고 이에는, 예를 들어 미국 특허 제5,698,435호; 제5,698,417호; 및 제6,204,023호에 기재된 것이 포함된다.
벡터는 플라스미드 벡터, 단일 또는 이중 가닥 파아지 벡터, 또는 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스성 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 DNA 및 RNA를 세포 내로 도입하는 것으로 널리 공지된 기술에 의해 폴리뉴클레오티드로서 세포 내로 도입할 수 있다. 파아지 및 바이러스성 벡터의 경우에 벡터는 또한, 감염 및 형질도입을 위해 널리 공지된 기술에 의해 패키지된 또는 피막화된 바이러스로서 세포 내로 도입할 수 있다. 바이러스성 벡터는 복제 적격하거나 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 상보성 숙주 세포에서만 일어날 것이다. 세포-무함유 해독 시스템을 또한 이용하여, 본 발명의 DNA 구조물로부터 유래된 RNA를 사용하여 단백질을 생성시킬 수 있다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호], 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 항체의 가변 도메인을 상기 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 항체는 적합한 모든 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 본 발명에 유용한 숙주 세포의 예에는 원핵성, 효모 또는 고등 진핵성 세포가 포함되고, 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균 [예: 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)] 등의 미생물; 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모 [예: 삭카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia)]; 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 [예: 바쿨로바이러스 (Baculovirus)]로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 [예: 콜리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)]로 감염시켰거나 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예: Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5 K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 정착시킨 포유류 세포 시스템 (예: COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 숙주 세포로서 유용한 원핵 생물에는 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이, 비. 서브틸리스, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다.
원핵성 숙주 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로, 하나 이상의 표현형 선별성 마커 유전자를 포함한다. 표현형 선별성 마커 유전자는, 예를 들어 항생제 내성을 부여하거나 또는 영양요구성 필요를 충족시켜 주는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 원핵성 숙주 세포에 대한 유용한 발현 벡터의 예에는 시판용 플라스미드, 예를 들어 pKK223-3 (공급처: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1 (공급처: Promega Biotec, Madison, Wisconsin., USA), 및 pET (공급처: Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 및 pRSET (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 시리즈의 벡터로부터 유래된 것이 포함된다 [참고: Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); Schoepfer, Gene 124:83 (1993)]. 재조합 원핵성 숙주 세포 발현 벡터에 흔히 사용되는 프로모터 서열에는 T7 [참고: Rosenberg, et al., Gene 56:125 (1987)], β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 프로모터 시스템 [참고: Chang, et al., Nature 275:615 (1978); Goeddel, et al., Nature 281:544 (1979)], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [참고: Goeddel, et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)], 및 tac 프로모터 [참고: Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)]가 포함된다.
본 발명에 유용한 효모 또는 섬유상 진균에는 삭카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 악티노마이세테스 (Actinomycetes), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 쉬조삭카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 (Trichoderma), 뉴로스포라 (Neurospora), 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스퍼질루스 (Aspergillus) 속으로부터의 것이 포함된다. 효모 벡터는 종종, 2 μ 효모 플라스미드로부터의 복제 서열 기점, 자기 복제 서열 (ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열, 및 선별성 마커 유전자를 함유할 것이다. 효모 벡터에 적합한 프로모터 서열에는 특히, 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 [참고: Hitzeman, et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)] 또는 기타 당분해 효소 [참고: Holland, et al., Biochem 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다. 효모 발현에 사용하기 적합한 기타 벡터 및 프로모터는 문헌 [참고: Fleer, et al., Gene 107:285 (1991)]에 추가로 기재되어 있다. 효모에 적합한 기타 프로모터 및 벡터와 효모 형질전환 프로토콜은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 효모 형질전환 프로토콜은 널리 공지되어 있다. 이러한 프로토콜 중의 한 가지가 문헌 [참고: Hinnen, et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)]에 기재되어 있다. 상기 문헌의 프로토콜은 선택적 배지에서 Trp+ 형질전환체를 선별한다.
포유류 또는 곤충 숙주 세포 배양 시스템을 또한 이용하여 재조합 항체를 발현시킬 수 있다. 원칙적으로, 모든 고등 진핵 세포 배양은 이것이 척추 동물 배양인지 아니면 무척추 동물 배양인지에 상관없이 작동 가능하다. 무척추 동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다 [참고: Luckow, et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller, et al., Genetics Engineering, Setlow, et al., eds. Vol. 8, pp. 277-9, Plenam Publishing (1986); Mseda, et al., Nature 315:592 (1985)]. 예를 들어, 이종 단백질을 생성시키는 데에 바쿨로바이러스 시스템을 사용할 수 있다. 곤충 시스템에서는, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 다면증 바이러스 (AcNPV)를 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용할 수 있다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 암호화 서열을 바이러스의 비필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝시키고 AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓아둘 수 있다. 확인된 기타 숙주에는 애데스 (Aedes), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)가 포함된다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어 AcNPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다. 더우기, 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다 [참고: Tissue Culture, Kruse, et al., eds., Academic Press (1973)]. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장주; 유아 햄스터 신장 세포; 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO; 참고: Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포; 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개의 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 마우스 유방 종양; 및 NSO 세포이다.
숙주 세포는 항체 생성을 위해 상기 언급된 벡터로 형질전환시키고, 프로모터, 전사 및 해독 제어 서열을 유도시키거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 흔히 사용되고 있는 프로모터 서열 및 증강인자 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 원숭이 바이러스 40 (SV40), 및 인간 시토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된다. SV40 바이러스성 게놈으로부터 유래된 DNA 서열을 사용하여 포유류 숙주 세포에서 구조적 유전자 서열을 발현시키기 위한 기타 유전적 요소, 예를 들어 SV40 기점, 초기 및 후기 프로모터, 증강인자, 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위를 제공할 수 있다. 바이러스성 초기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 둘 다가 바이러스성 복제 기점을 함유할 수도 있는 단편으로서 바이러스성 게놈으로부터 용이하게 수득되기 때문이다. 포유류 숙주 세포에 사용하기 위한 예시되는 발현 벡터는 시판중이다.
본 발명의 항체 변이체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma, St Louis, MO), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma, St Louis, MO], RPMI-1640 (공급처: Sigma, St Louis, MO), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma, St Louis, MO]가 숙주 세포를 배양하는 데에 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979); Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980); 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,560,655호; 제5,122,469호; 제5,712,163호; 또는 제6,048,728호]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 [예: X-클로라이드 (여기서, X는 나트륨, 칼슘, 마그네슘이다); 및 인산염], 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 항체 및 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 예를 들어 DNA를 추가로 제공한다. 예시되는 폴리뉴클레오티드에는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 항체 쇄를 암호화하는 것이 포함된다. 본 발명은 또한, 엄격한 또는 보다 낮은 엄격한 혼성화 조건 하에 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있고, 이러한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지된 모든 방법에 의해 결정한다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있는 경우, 이러한 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리할 수 있는데 [참고: 예를 들어, Kutmeier, et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)], 간략하게 설명하면 항체를 암호화하는 서열 일부를 함유하는 중복 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이들 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 연결시킨 다음, 이와 같이 연결된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 것을 포함한다.
또 다른 한편, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성시킬 수 있다. 특별한 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 입수 가능하지 않지만, 이러한 항체 분자의 서열이 공지된 경우에는, 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 서열의 3' 및 5' 말단과 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시키거나 예를 들어, 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특별한 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 클로닝함으로써 적합한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 모든 조직 또는 세포, 예를 들어 본 발명의 항체를 발현하도록 선별된 하이브리도마 세포로부터 발생된 cDNA 라이브러리, 또는 상기 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게 폴리 A+ RNA)로부터 수득할 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당해 분야에 널리 공지된 모든 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 이러한 항체의 뉴클레오티드 서열는 뉴클레오티드 서열을 조작하는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 유도된 돌연변이 유발, PCR 등 [참고: 예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998); 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]을 이용하여 조작하여, 예를 들어 아미노산 치환물, 결실물 및/또는 삽입물을 창출시키기 위해 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성시킬 수 있다.
구체적 양태에서는, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 검사하여 널리 공지된 방법에 의해 CDR의 서열을 확인할 수 있는데, 예를 들어 기타 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열을 비교하여 서열 초가변 영역을 결정할 수 있다. 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 상기 언급된 바와 같이, 골격 영역, 예를 들어 인간 골격 영역 내로 삽입하여 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있다. 골격 영역은 천연 발생적 또는 컨센서스 골격 영역, 바람직하게는 인간 골격 영역일 수 있다 [인간 골격 영역 목록에 관해서는, 예를 들어 문헌 (Chothia, et al., J Mol Biol 278:457 (1998))을 참고할 수 있다]. 바람직하게, 골격 영역과 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 바람직하게, 상기 논의된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환이 골격 영역 내에서 만들어질 수 있고, 바람직하게 이러한 아미노산 치환은 항체가 그의 항원과 결합하는 것을 개선시켜 준다. 부가적으로, 상기 방법을 이용하여 하나 이상의 쇄내 디설파이드 결합이 결여된 항체 분자를 생성시키기 위해 쇄내 디설파이드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만들 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 기타 변경이 본 발명에 의해 포괄되고 당업자의 기술 수준 내이다.
또한, 적당한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적당한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생성시키도록 개발된 기술 [참고: Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci 81:851 (1984); Neuberger, et al., Nature 312:604 (1984); Takeda, et al., Nature 314:452 (1985)]을 사용할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예를 들어 뮤린 MAb로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체, 예를 들어 인간화 항체이다.
또 다른 한편, 단일 쇄 항체를 생성시키는 것으로 보고된 기술 [참고: 미국 특허 제4,946,778호; Bird, Science 242:423 (1988); Huston, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988); and Ward, et al., Nature 334:544 (1989)]을 적응시켜 단일 쇄 항체를 생성시킬 수 있다. 단일 쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 브릿지를 통하여 연결시켜 단일 쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다. 이. 콜라이에서 기능성 Fv 단편을 어셈블리하는 기술을 사용할 수도 있다 [참고: Skerra, et al., Science 242:1038 (1988)].
항-Notch3 항체의 생성 방법
본 발명의 항체는 항체 합성을 위해 당해 분야에 공지된 모든 방법, 특히 화학적 합성 또는 바람직하게, 재조합 발현 기술에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일 쇄 항체)를 재조합 발현시키기 위해서는, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 구축해야 한다. 일단 항체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 수득하면, 이러한 항체 생성을 위한 벡터를 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 항체 암호화 서열과 적당한 전사 및 해독 제어 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축한다. 이들 방법에는, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 전이시킨 다음, 이와 같이 형질감염시킨 세포를 통상적인 기술에 의해 배양하여 본 발명의 항체를 생성시킨다. 본 발명의 한 국면에서, 중쇄와 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터를 다음에 상세히 기재되는 바와 같이, 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현시킬 수 있다.
각종 숙주-발현 벡터 시스템을 활용하여 상기 언급된 바와 같이 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 암호화 서열을 생성시킨 다음 후속 정제시킬 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라 적당한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질전환 또는 형질감염시킨 경우에, 계내에서 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 세균성 세포, 예를 들어 이. 콜라이 및 진핵성 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 특히 완전 재조합 항체 분자의 발현을 위해 흔히 사용되고 있다. 예를 들어, 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간체 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 연계한 포유류 세포 (예: CHO)가 항체에 유효한 발현 시스템이다 [참고: Foecking, et al., Gene 45:101 (1986); Cockett, et al., Bio/Technology 8:2 (1990)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 생성물을 목적하는 특이적 방식으로 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형 (예: 글리코실화) 및 프로세싱 (예: 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독 후 프로세싱과 변형에 대해 특징적이면서도 특이적인 기전을 갖고 있다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형과 프로세싱을 보장하기에 적당한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위하여, 일차 전사체의 적당한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포성 기구를 보유하고 있는 진핵성 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포에는 CHO, COS, 293, 3T3, 또는 골수종 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질을 장기간 고 수율로 생성시키기 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 공학 처리시킬 수 있다. 바이러스성 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것이 아니라, 숙주 세포를 적당한 발현 제어 요소 (예: 프로모터, 증강인자, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선별성 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 공학 처리시킨 세포를 1 내지 2일 동안 증균 배지에서 성장시킨 다음, 선별성 배지로 전환시킨다. 재조합 플라스미드 내의 선별성 마커는 선별에 대한 내성을 부여해주고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정적으로 통합시켜 줄 수 있게 해주며, 병소를 형성하도록 성장시켜, 궁극적으로 이를 클로닝시키고 세포주 내로 확장시킬 수 있다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현시키는 세포주를 공학 처리시키기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 공학 처리시킨 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호 작용하는 화합물을 스크리닝하고 평가하는 데에 특히 유용할 수 있다.
수 많은 선별 시스템을 사용할 수 있는데, 예를 들어 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 [참고: Wigler, et al., Cell 11:223 (1977)], 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [참고: Szybalska, et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [참고: Lowy, et al., Cell 22:817 (1980)] 유전자를 tk, hgprt 또는 aprt-세포에 각각 이용할 수 있다. 또한, 항대사물 내성을 다음 유전자에 대한 선별 기준으로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여해주는 dhfr [참고: Wigler, et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare, et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)]; 미코페놀산에 대한 내성을 부여해주는 gpt [참고: Mulligan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여해주는 neo [참고: Wu, et al., Biotherapy 3:87 (1991)]; 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여해주는 hygro [참고: Santerre, et al., Gene 30:147 (1984)]. 재조합 DNA 기술 분야에 흔히 공지된 방법을 통상적으로 적용하여 목적하는 재조합 클론을 선별할 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli, et al., eds, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); Colberre-Garapin, et al., J Mol Biol 150:1 (1981); 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 [참고: Bebbington, et al., "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells," DNA Cloning, Vol.3. Academic Press (1987)]. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연관이 있기 때문에, 항체 생성 또한 증가할 것이다 [참고: Crouse, et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)].
숙주 세포를 본 발명의 두 가지 발현 벡터로 공동-형질감염시킬 수 있는데, 제1 벡터는 중쇄 유래된 폴리펩티드를 암호화하고 제2 벡터는 경쇄 유래된 폴리펩티드를 암호화한다. 이들 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 등가 발현시켜 줄 수 있는 동일한 선별성 마커를 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황 하에서, 경쇄를 중쇄 앞에 위치시켜 과량의 독성 무함유 중쇄를 피해야 한다 [참고: Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생성되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되면, 이를 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당해 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 크로마토그래피 (예: 이온 교환, 친화, 특히 단백질 A 다음의 특이적 항원에 대한 친화, 및 크기 배제 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질을 정제하기 위한 기타 모든 표준 기술에 의해 정제할 수있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 본원에 기재되거나 당해 분야에 공지된 이종 폴리펩티드 서열과 융합시켜 정제를 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드와 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된 (공유적 접합과 비공유적 접합 둘 다 포함) 항체를 포괄한다. 본 발명의 융합 또는 접합된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 사용할 수 있다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 93/21232; EP 439,095; Naramura, et al., Immunol Lett 39:91 (1994); 미국 특허 제5,474,981호; Gillies, et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992); Fell, et al., J Immunol 146:2446 (1991); 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
더우기, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 마커 서열, 예를 들어 펩티드와 융합시켜 정제를 촉진시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥산-히스티딘 펩티드, 예를 들어 pQE 벡터 (공급처: QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)에 제공된 태그인데, 이들 중의 다수가 시판되고 있다. 예를 들어, 문헌 [참고: Gentz, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공해준다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그에는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그 [참고: Wilson, et al., Cell 37:767 (1984)] 및 "플래그 (flag)" 태그가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
항체 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체 변이체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체 변이체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 문헌 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체 변이체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체 변이체에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 IgG3에 권장된다 [참고: Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체 변이체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을 회수하고자 하는 항체 변이체에 따라서 이용하기도 한다.
예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체 변이체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.
제약 제형
폴리펩티드 또는 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 폴리펩티드를 당해 분야에서 전형적으로 이용되고 있는 임의의 "제약상 허용 가능한" 담체, 부형제 또는 안정화제 (이들 모두는 "부형제"로 명명된다), 즉 완충제, 안정화제, 방부제, 등장제, 비이온성 세정제, 항산화제 및 기타 여러 가지 첨가제와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수성 용제로서 저장하기 위해 제조할 수 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, Ed. (1980)]. 이러한 첨가제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이어야만 한다.
완충제는 생리적 조건에 근접한 pH 범위를 유지시키는 데에 도움을 준다. 이는 바람직하게, 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기 적합한 완충제에는 유기 및 무기산 및 그의 염, 예를 들어 시트레이트 완충제 (예: 일나트륨 시트레이트-이나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-삼나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-일나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제 (예: 석신산-일나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-이나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제 (예: 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르트산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예: 푸마르산-일나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (푸마르산-일나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-이나트륨 푸마레이트 혼합물, 일나트륨 푸마레이트-이나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제 (예: 글루콘산-나트륨 글루코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제 (예: 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제 (예: 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등), 및 아세테이트 완충제 (예: 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)이 포함된다. 부가적으로, 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염 (예: 트리스)이 언급될 수 있다.
방부제를 부가하여 미생물 성장을 지연시킬 수 있고, 이는 0.2% 내지 1% (w/v) 범위의 양으로 가할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 방부제에는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 벤즈알코늄 할라이드 (예: 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 및 3-펜타놀이 포함된다.
종종 "안정화제"로서 공지된 등장제를 가하여 본 발명의 액상 조성물의 등장성을 보장할 수 있고, 이에는 다가 당 알코올, 바람직하게 3가 또는 보다 고 차수의 당 알코율, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 솔비톨 및 만니톨이 포함된다.
안정화제는 벌크제로부터, 치료제를 가용화시키거나 또는 치료제가 변성되지 못하게 하거나 용기 벽에 부착되지 못하게 도와주는 첨가제까지 기능상 여러 범위에 걸친 광범위한 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예를 들어 락토스, 트레할로스, 스타키로스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등 (이노시톨과 같은 시클리톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예를 들어 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, 알파-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트; 저분자량 폴리펩티드 (즉, 10개 미만 잔기); 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예를 들면 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류, 예를 들면 락토스, 말토스, 슈크로스 및 삼당류, 예를 들면 라피노스; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 1 중량부당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세정제 ("습윤제"로서 공지되기도 한다)를 가하여 치료제를 가용화시키는 것을 도와줄 수 있을 뿐만 아니라 치료 단백질이 진탕-유도된 응집되지 못하게 해줄 수 있는데, 이는 또한 단백질의 변성을 유발시키지 않으면서 제형이 응력된 전단 표면에 노출될 수 있도록 해준다. 적합한 비이온성 계면활성제에는 폴리솔베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 (Pluronic™) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르 (TWEEN-20®, TWEEN-80® 등)이 포함된다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
부가의 여러 가지 부형제에는 벌크제 (예: 전분), 킬레이트제 (예: EDTA), 항산화제 (예: 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 조용매가 포함된다. 본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자들은 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다. 활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다. 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체 변이체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸친 분자 방출을 가능케 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막화된 항체가 체내에 장시간 동안 잔존할 경우, 이들은 37℃ 하 수분에 대한 노출 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성을 개발함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
특별한 장애 또는 질환을 치료하는 데에 유효할 치료적 폴리펩티드, 항체 또는 그의 단편의 양은 이러한 장애 또는 질환의 종류에 좌우될 것이고, 이는 표준 임상 기술에 의해 결정할 수 있다. 가능한 경우, 본 발명의 제약 조성물 및 용량-반응 곡선은 인간에게 시험하기에 앞서, 먼저 시험관 내에서 결정한 다음 유용한 동물 모델 시스템에서 결정하는 것이 요망된다.
바람직한 양태에서는, 치료적 폴리펩티드, 항체 또는 그의 단편의 수성 용제를 피하 주사함으로써 투여한다. 각 용량은 체중 1 kg 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 또는 보다 바람직하게, 체중 1 kg 당 약 3 ㎍ 내지 약 30 ㎍의 범위일 수 있다.
피하 투여하는 경우의 투여 스케줄은 질병의 유형, 질병의 중증도, 및 치료제에 대한 대상체의 민감도를 포함한 수 많은 임상 요인에 따라서 1개월에 1회에서부터 1일 1회로 다양할 수 있다.
항-Notch3 항체의 치료적 용도
본 발명의 항체를 사용하여 포유류를 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 한 양태에서는, 항체를, 예를 들어 전임상 데이터를 수득할 목적으로 비-인간 포유류에게 투여한다. 처치하고자 하는 비-인간 포유류의 예에는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 기타 포유류가 포함된다. 이러한 포유류는 본 발명의 항체를 사용하여 치료하고자 하는 질병에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 상기 포유류를 사용하여 관심있는 항체의 독성을 연구할 수 있다. 이들 양태 각각에서는, 용량의 단계적 상승 연구를 포유류에서 수행할 수 있다.
단독으로 투여되거나 인자(들)와 병용해서 투여된 항체가 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 Notch3 매개된 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위하여, 본 발명의 항체를 동물, 포유류 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 항체에 의거한 요법에 관한 것이다. 이러한 동물 또는 대상체는 특별한 치료를 필요로 하는 포유류, 예를 들어 특별한 장애 (예: Notch3 관련 장애)가 있는 것으로 진단된 포유류일 수 있다. Notch3에 대항하여 유도된 항체는 포유류 (이에는 암소, 돼지, 말, 치킨, 고양이, 개, 비-인간 영장류 뿐만 아니라 인간이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)에게서 퇴행성 질병 및 기타 Notch3 관련 질병, 예를 들어 CADASIL, FHM, 알라질 증후군, 신경학적 및 퇴행성 장애에 대항하여 유용하다. 예를 들어, 치료적으로 허용 가능한 용량의 본 발명의 항-Notch3 항체(들), 또는 본 발명의 항체의 칵테일, 또는 다양한 공급원의 기타 항체와 병용되는 본 발명의 항체를 투여함으로써, 이와 같이 처리된 포유류, 특히 인간에게서 질병 증상을 개선시키거나 예방할 수 있다.
본 발명의 치료 화합물에는 본 발명의 항체 (본원에 기재된 바와 같은 그의 단편, 유사체 및 유도체 포함) 및 다음에 기재되는 바와 같이 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 (본원에 기재된 바와 같은 그의 단편, 유사체 및 유도체, 및 항-개체특이형 항체 포함)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체를 사용하여 Notch3의 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질병, 장애 또는 질환 (이에는 본원에 기재된 질병, 장애 또는 질환 중의 어느 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)을 치료, 억제 또는 예방할 수 있다. Notch3의 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질병, 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방에는 이러한 질병, 장애 또는 질환과 연관된 한 가지 이상의 증상을 경감시키는 것이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 바와 같거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 제약상 허용 가능한 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 항-Notch3 항체를 각종 질병에 치료적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 포유류에게서 Notch3-매개된 질병을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 질병 예방 또는 치료 량의 항-Notch3 항체를 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 항-Notch3 항체는 Notch3와 결합하여 그의 기능을 작동시킨다. Notch3 신호 전달은 각종 질병, 예를 들어 CADASAL, FHM, 가족성 발작성 운동실조, 알라질 증후군, 및 기타 퇴행성 질환 및 신경학적 장애와 연관이 있어 왔다 [참고: Joutel, et al., Nature 383:707 (1996); Flynn, et al., J Pathol 204:55 (2004)]. 항-Notch3 항체는 또한, 상기 언급된 질병을 예방하는 데에 유효할 것으로 추측된다.
Notch3의 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 장애를 치료, 억제 및 예방하는 데에 유효할 항체의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정할 수 있다. 투여량은 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 항체는 해당 질병에 부합되는 치료 섭생으로 투여할 수 있는데, 예를 들어 질병 상태를 개선시키기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 단일 용량 또는 수 회분으로 나누어 투여하거나 또는 질병 진행을 억제하고 질병 재발을 방지하기 위해 연장 시간에 걸쳐 주기적 용량으로 투여할 수 있다. 또한, 시험관내 검정을 임의로 이용하여 최적의 투여량 범위를 확인하는 것에 도움을 줄 수 있다. 제형에 이용될 정확한 용량은 또한, 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이고, 이는 실행자의 판단과 각 환자의 상황에 따라서 결정해야 한다. 유효한 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
항체의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로, 환자의 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 150 mg이다. 바람직하게, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 20 mg, 보다 바람직하게 환자의 체중 1 kg 당 1 mg 내지 10 mg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 기타 종으로부터의 항체 보다 인체 내에서의 반감기가 더 길다. 따라서, 인간 항체를 보다 적은 투여량으로 보다 적은 횟수로 투여하는 것이 종종 가능하다. 추가로, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 횟수는 변형 (예: 지질화)에 의해 이러한 항체의 흡수와 조직 침투성 (예: 뇌 내로의 침투성)을 증강시킴으로써 감소시킬 수 있다. 상태에 따라서 수 일 이상 동안 반복 투여하는 경우에는, 목적하는 질병 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.
항체 변이체 조성물은 우수한 의료 행위에 부합되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특별한 장애, 치료하고자 하는 특별한 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여하고자 하는 항체 변이체의 "치료적 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이며, 이는 특정 질병이나 장애를 예방, 개선 또는 치료하는 데에 필요한 최소량이다. 항체 변이체를, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상의 작용제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 지금까지 사용된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99%이다.
본 발명의 항체는 단독으로 투여하거나 또는 기타 유형의 치료와 병용해서 투여할 수 있다.
바람직한 국면에서, 항체는 실질적으로 정제된다 (예를 들어, 바람직하지 못한 부작용을 야기시키거나 그의 효과를 제한하는 물질이 실질적으로 없다).
각종 전달 시스템은 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 항체를 투여할 수 있는데, 이에는 주사, 예를 들어 리포솜, 미소입자 또는 미소캡슐 내에서의 피막화, 해당 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내 이입 [참고: 예를 들어, Wu, et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)], 레트로바이러스성 또는 기타 벡터의 일부로서의 핵산의 구축 등이 포함된다.
항-Notch3 항체는 허용 가능한 모든 방식으로 포유류에게 투여할 수 있다. 도입 방법에는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 경막, 흡입 및 경구 경로, 및 면역억제 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 비경구 주입에는 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여가 포함된다. 항체 또는 조성물은 통상적인 모든 경로, 예를 들어 주입 또는 거환 주사, 상피 또는 피부점막 내층 (예: 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료적 항체 또는 조성물을 적합한 모든 경로, 예를 들어 심실내 및 수막강내 주사에 의해 중추 신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있는데; 심실내 주사는, 예를 들어 저장고 [예: 옴마야 (Ommaya) 저장고]에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 또한, 항체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체 용량을 감소시키면서 펄스 주입함으로써 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게, 투여는 부분적으로 투여가 단시간 내에 이루어지는지 아니면 만성적으로 이루어지는지에 따라서 주사, 가장 바람직하게 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 수반한 제형을 사용함으로써, 폐 투여를 이용할 수도 있다. 항체는 건조 분말 조성물의 형태로 환자의 폐 내로 투여할 수도 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,514,496호].
구체적 양태에서, 본 발명의 치료적 항체 또는 조성물은 치료를 필요로 하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 예를 들어, 국소 주입, 국부 적용, 주사, 카테터를 통하여, 좌제를 통하여, 또는 이식제를 통하여 달성될 수 있지만, 이에 제한되지 않고, 상기 이식제는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이고, 이에는 막 [예: 시알라스틱 (sialastic) 막], 또는 섬유가 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 항체를 투여하는 경우에는, 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하는 것에 주의해야만 한다.
또 다른 양태에서, 항체는 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 [참고: Langer, Science 249:1527 (1990); Treat, et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein, et al., eds., pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-27].
또 다른 양태에서, 항체는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 양태에서는, 펌프를 사용할 수 있다 [참고: Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald, et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek, et al., N Engl J Med 321:574 (1989)]. 또 다른 양태에서는, 중합체성 물질을 사용할 수 있다 [참고: Medical Applications of Controlled Release, Langer, et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen, et al., eds., Wiley (1984); Ranger, et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); Levy, et al., Science 228:190 (1985); During, et al., Ann Neurol 25:351 (1989); Howard, et al., J Neurosurg 71:105 (1989)]. 또 다른 양태에서는, 제어 방출 시스템을 치료적 표적 근처에 놓아둘 수 있다.
본 발명은 또한, 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 항체와 생리적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 구체적 양태에서, 용어 "생리적으로 허용 가능한"이란 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 동물 (보다 특히, 인간)에게서 사용하기 위해 일반적으로 인식된 기타 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 생리적 담체는 멸균성 액상물, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 제약 조성물을 정맥내 투여하는 경우에는 물이 바람직한 담체이다. 특히 주사용 용제의 경우에는, 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액상 담체로서 이용할 수도 있다. 적합한 제약 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 경우에 따라, 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 에멀션, 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 (예: 트리글리세라이드)를 수반한 좌제로서 제형화할 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예가 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]. 이러한 조성물은 바람직하게 정제된 형태의 항체의 유효량을, 환자에게 투여하기 적당한 형태를 제공하기에 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
한 양태에서, 조성물은 통상적인 과정에 따라서, 인간에게 정맥내 투여하도록 적응시킨 약제 조성물로서 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균성 등장성 수성 완충제 중의 용제이다. 필요에 따라, 조성물은 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예를 들어 리그노카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 공급되거나 또는 단위 투여 형태에 함께 혼합하여 공급되는데, 예를 들어 기밀 용기 (예: 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 향낭) 중의 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물을 주입 투여해야 하는 경우에는, 멸균성 제약 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입용 병을 이용하여 투약할 수 있다. 조성물을 주사 투여하는 경우에는, 멸균성 주사용 수 또는 식염수의 앰풀을 제공하여 성분들이 투여에 앞서 혼합될 수 있도록 한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 제약 조성물의 성분들 중의 하나 이상이 충전된 1개 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지 (notice)가 이러한 용기(들)에 부착되어 있는데, 이러한 통지는 해당 기관이 인간 투여를 위해 제조, 사용 또는 판매하는 것을 승인한다는 것을 나타낸다.
제조품
본 발명의 또 다른 양태에서는 전술된 장애를 치료하는 데에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기 및 표지을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험용 튜브가 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 해당 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 활성제는 항체이다. 용기와 연합되거나 그 위의 표지는 해당 조성물이 선택 질환을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시해준다. 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충액, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기 및 사용 설명서를 수반한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
항체에 의거한 유전자 요법
본 발명의 또 다른 국면에서, 항체 또는 그의 기능적 유도체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 투여하여, 유전자 요법을 통하여 Notch3의 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 장애를 치료, 억제 및 예방한다. 유전자 요법은 발현되거나 발현 가능한 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행된 요법을 지칭한다. 이러한 본 발명의 양태에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는 그의 암호화된 단백질을 생성시킨다. 이용 가능한 유전자 요법에 대한 모든 방법을 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 예시되는 방법은 다음에 기재되어 있다.
유전자 요법 방법에 관한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Goldspiel, et al., Clinical Pharmacy 12:488 (1993); Wu, et al., Biotherapy 3:87 (1991); Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993); Mulligan, Science 260:926 (1993); Morgan, et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993); May, TIBTECH 11:155 (1993)].
한 국면에서, 화합물은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 핵산 서열은 항체, 또는 그의 단편 또는 키메라 단백질 또는 중쇄 또는 경쇄를 적합한 숙주에서 발현시키는 발현 벡터의 일부이다. 특히, 이러한 핵산 서열은 항체 암호화 영역과 작동적으로 연결된 프로모터를 갖고 있고, 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성성이며, 임의로 조직-특이적이다.
또 다른 특별한 양태에서는, 항체 암호화 서열 및 기타 모든 목적 서열이 게놈 내의 목적 부위에서의 상동 재조합을 증진시키는 영역에 의해 플랭킹됨으로써, 항체 암호화 핵산의 염색체내 발현을 제공해주는 핵산 분자를 사용한다 [참고: Koller, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989); Zijlstra, et al., Nature 342:435 (1989)]. 구체적 양태에서, 발현된 항체 분자는 단일 쇄 항체이고; 또 다른 한편, 핵산 서열은 항체의 중쇄와 경쇄 둘 다, 또는 그의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
핵산을 환자에게 전달하는 것은 직접적일 수 있거나 (이러한 경우에는, 환자가 핵산 또는 핵산-수반성 벡터에 직접 노출된다) 간접적일 수 있다 (이러한 경우에는, 세포를 먼저, 시험관 내에서 핵산으로 형질전환시킨 다음, 환자에게 이식한다). 이들 두 가지 접근 방식은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로서 공지되어 있다.
구체적 양태에서, 핵산 서열은 생체 내에 직접 투여되는데, 여기서 이를 발현하여 암호화된 생성물을 생성시킨다. 이는 당해 분야에 공지된 수 많은 방법, 예를 들어 상기 서열을 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구축하고 이를 투여하여 이들이 세포내적이 되도록 함으로써, 예를 들어 결함이 있거나 약독화된 레트로바이러스성 또는 기타 바이러스성 벡터를 사용하여 주입하거나 [참고: 미국 특허 제4,980,286호], 또는 있는 그대로의 DNA를 직접 주사하거나, 또는 미소입자 충격을 이용하거나 [예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont], 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제으로 피복하고, 리포솜, 미소입자 또는 미소캡슐 내에서의 피막화에 의해, 또는 수용체-매개된 세포내 이입 [참고: 예를 들어, Wu, et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)] (수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하기 위해 사용될 수 있다)을 수행한 리간드와 연계해서 투여함으로써, 핵으로 유입되는 것으로 공지되어 있는 펩티드와 연계해서 이를 투여함으로써 달성할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 리간드가 엔도솜을 붕괴시키는 융합 바이러스성 펩티드를 포함하여 핵산이 리소솜성 분해를 피하도록 하는 핵산-리간드 복합체를 형성시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내에서 표적화할 수 있다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, WO 93/20221]. 또 다른 한편, 핵산은 상동 재조합에 의해, 세포내적으로 도입하고, 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 혼입시킬 수 있다 [참고: Koller, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989); Zijlstra, et al., Nature 342:435 (1989)].
구체적 양태에서, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스성 벡터를 사용한다. 예를 들어, 레트로바이러스성 벡터를 사용할 수 있다 [참고: Miller, et al., Meth Enzymol 217:581 (1993)]. 이들 레트로바이러스성 벡터는 바이러스성 게놈의 정확한 패키징과 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필요한 성분을 함유한다. 유전자 요법에 사용될 항체를 암호화하는 핵산 서열을 하나 이상의 벡터 내로 클로닝하는데, 이는 유전자를 환자에게 전달하는 것을 촉진시켜 준다. 레트로바이러스성 벡터에 관한 보다 상세 내역은 문헌 [참고: Boesen, et al., Biotherapy 6:291 (1994)]에 보고되었는데, 이 문헌에는 줄기 세포를 화학요법에 보다 저항성이 되도록 하기 위해 mdrl 유전자를 조혈 줄기 세포에 전달하기 위해 레트로바이러스성 벡터를 사용하는 것에 관하여 기재되어 있다. 레트로바이러스성 벡터를 유전자 요법에 사용하는 것을 예시하는 기타 참고 문헌은 다음과 같다 [Clowes, et al., J Clin Invest 93:644 (1994); Kiem, et al., Blood 83:1467 (1994); Salmons, et al., Human Gene Therapy 4:129 (1993); and Grossman, et al., Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993)].
아데노바이러스를 본 발명에 사용할 수도 있다. 아데노바이러스는 항체를 호흡 상피에 전달하기 위해 본 발명에서 특히 주목되는 비히클이다. 아데노바이러스는 본래 호흡 상피를 감염시킨다. 아데노바이러스에 의거한 전달 시스템에 대한 기타 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 지니고 있다. 문헌 [참고: Kozarsky, et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993)]은 아데노바이러스에 의거한 유전자 요법에 관한 고찰을 제시하고 있다. 문헌 [참고: Bout, et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994)]은 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 붉은털 원숭이의 호흡 상피로 전이시키는 것을 입증하였다. 유전자 요법에 있어서의 아데노바이러스의 용도에 관한 기타 예는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Rosenfeld, et al., Science 252:431 (1991); Rosenfeld, et al., Cell 68:143 (1992); Mastrangeli, et al., J Clin Invest 91:225 (1993); PCT 공개공보 WO94/12649; Wang, et al., Gene Therapy 2:775 (1995)]. 아데노 관련 바이러스 (AAV)가 유전자 요법에 사용하는 것으로 또한 제안되었다 [참고: Walsh, et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993); 미국 특허 제5,436,146호; 제6,632,670호; 및 제6,642,051호].
유전자 요법에 대한 또 다른 접근 방식은 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 인산칼슘 매개된 형질감염, 또는 바이러스성 감염과 같은 방법에 의해, 유전자를 조직 배양 중인 세포로 전이시키는 것을 포함한다. 통상적으로, 이러한 전이 방법은 선별성 마커를 세포에 전이시키는 것을 포함한다. 이어서, 세포를 전이된 유전자를 흡수하고 이를 발현시키는 세포를 단리시키기 위한 선별 하에 놓아둔다. 이어서, 이들 세포를 환자에게 전달한다.
이러한 양태에서는, 생성되는 재조합 세포를 생체내 투여하기에 앞서, 핵산을 세포 내로 도입한다. 이러한 도입은 당해 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미소주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스성 또는 박테리오파아지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전이, 마이크로셀-매개된 유전자 전이, 스페로플라스트 (spheroplast) 융합 등에 의해 수행할 수 있다. 외래 유전자를 세포 내로 도입하기 위한 수 많은 기술이 당해 분야에 공지되어 있고 [참고: 예를 들어, Loeffler, et al., Meth Enzymol 217:599 (1993); Cohen, et al., Meth Enzymol 217:618 (1993); Cline, Pharmac Ther 29:69 (1985)], 이러한 기술은 수용자 세포의 필수 발생적 및 생리적 기능이 붕괴되지 않는다면, 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 해당 기술은 핵산을 세포에 안정적으로 전이시켜야 하므로, 핵산은 세포에 의해 발현 가능하고 바람직하게는, 그의 세포 자손에 의해 유전되고 발현 가능하다.
이로써 생성되는 재조합 세포는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 환자에게 전달할 수 있다. 재조합 혈액 세포 (예: 조혈 줄기 또는 원시 세포)는 정맥내 투여하는 것이 바람직하다. 사용하도록 고안된 세포의 양은 목적하는 효과, 환자 상태 등에 좌우되고, 이는 당업자에 의해 결정할 수 있다.
유전자 요법을 위하여 핵산을 도입할 수 있는 세포는 이용 가능한 모든 바람직한 세포 유형을 포괄하고, 이에는 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예를 들어 T 림프구, B 림프구, 단구, 대식 세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구; 각종 줄기 또는 원시 세포, 특히 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간으로부터 수득된 바와 같은 조혈 줄기 또는 원시 세포 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
한 양태에서, 유전자 요법을 위해 사용된 세포는 환자 자신으로부터 유래한다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하여, 이들 서열이 이러한 세포 또는 그의 자손에 의해 발현 가능하도록 한 다음, 재조합 세포를 치료 효과를 위해 생체내 투여한다. 구체적 양태에서는, 줄기 또는 원시 세포를 사용한다. 시험관 내에서 단리 및 유지될 수 있는 모든 줄기 및/또는 원시 세포를 본 발명의 상기 양태에 따라서 효능적으로 사용할 수 있다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 94/08598; Stemple, et al., Cell 71:973 (1992); Rheinwald, Meth Cell Bio 21A:229 (1980); Pittelkow, et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)].
실시예 1: 면역원의 생성: Notch3 세포외 도메인-Fc 융합 단백질
그의 카복시 말단 끝을 감마 1 Fc 영역과 융합시킨 Notch3 LIN12/이량체화 도메인 ("LD"로 후술됨)을 포함하는 면역원으로서 재조합 Notch3-Fc 융합 단백질을 사용하여, 인간 Notch3의 LD와 특이적으로 결합하는 항-Notch3 모노클로날 항체를 생성시켰다. 구체적으로 언급하면, 면역원은 Notch3 LD의 아미노산 잔기 1378 내지 1640 (도 1 참고)과 인간 γ1Fc 융합 단백질을 포함하였다 (Notch3 LD/Fc). 면역원으로서 아미노산 잔기 43 내지 1377로부터의 Notch3 EGF 반복 서열 영역을 사용하여 대조군 항체를 생성시켰다.
인터넷에 의거한 조사 소프트웨어 및 서비스 (Motif Search, http//motif.genome.ip/)를 이용하여 Notch3 단백질 서열을 분석하였다. 인간 간 및 췌장 RNA (공급처: Ambion, Inc. Austin, TX)를 주형으로서 사용하여, 표준 시판용 cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하였다. Notch3 LD와 EGF 반복 서열 영역을 암호화하는 cDNA를 베타인 (1 내지 2 M) 및 DMSO (5%)의 존재 하에 PCR-증폭시켰다. PCR-합성된 Notch3-LD DNA 단편 (약 0.8 kb) 및 Notch3-EGF 반복 서열 DNA 단편 (약 4 kb)을 시판용 벡터 pSec 또는 시판용 벡터 pCD3.1 (각각은 상이한 항생제 마커를 보유하고 있다) 중에 His-γ1Fc를 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 클로닝으로 인해 2개의 발현 플라스미드가 생성되었는데, 하나는 Notch3-LD/Fc 융합 단백질을 발현하고, 다른 하나는 Notch3-EGF/Fc 융합 단백질을 발현한다.
플라스미드 구축을 촉진시키고 각종 Notch3 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위해, Notch3 핵산 암호화 서열의 처음 135개 염기쌍을 포함하는 리더 펩티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 생성시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드는 워블 (wobble) 암호화 위치 상에서의 약간의 변화를 함유하여 GC 함량을 저하시켰다. 모든 뉴클레오티드 서열 변화는 무반응이었는데, 즉 아미노산 서열 변화가 전혀 없었다 (도 8A 및 8B). 올리고뉴클레오티드를 함께 어닐링한 후, 공학 처리시킨 리더 펩티드 암호화 서열을 PCR-SOE에 의해 나머지 암호화 서열에 연결시켰다 [참고: Ho, et al., Gene 77:51 (1989); Horton, et al., BioTechniques 8:528 (1990)] (도 9 참고). 이러한 리더 펩티드 암호화 서열을 Notch3-LD/Fc 및 Notch3 발현 구조물에 사용하였다. 따라서, Fc 융합 단백질 둘 다는 N-말단에 연결된 신호 펩티드 및 C-말단에 융합된 인간 γ1Fc 서열을 포함하고 있다. 리더 서열을 포함한, Notch3-LD의 아미노산 서열이 도 8B 및 서열 6에 제시되어 있다.
Notch3-EGF/Fc 및 Notch3-LD/Fc 융합 단백질의 발현은 Notch3 발현 플라스미드를 293T (ATCC 번호 CRL-11268, Manassas, VA) 및 CHO 세포 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 각각 일시적으로 형질감염시킴으로써 검증하였다. 형질감염에 앞서, 세포를 10% 태아 송아지 혈청 (FCS), 2 mM의 글루타민, 및 1 x 필수 아미노산 용액을 함유하는 DMEM (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 성장 배지에서 배양한 다음, 약 3 내지 5x105개 세포/웰을 6-웰 판에 시딩하고 대략 24시간 동안 성장시켰다. Notch3 융합 단백질 발현 플라스미드 각각의 3 마이크로그램을 각 웰에서 제조업자의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 형질감염 시스템 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 후, 세포를 신선한 성장 배지에서 배양하고, CO2 항온 배양기에서 대략 40 내지 48시간 동안 배양한 후, Notch3 융합 단백질 발현 분석을 수행하였다. 또 다른 한편, 형질감염시킨 후, 세포를 성장 배지에서 3 내지 4시간 동안 배양한 다음, 2% FCS를 함유하는 DMEM 배지롤 전환시키고 대략 60 내지 66시간 동안 배양한 후, 분비된 단백질 분석을 위해 적응용 배지를 활용하였다.
Notch3-LD/Fc (His-Fcγ/pSec 벡터) 및 Notch3-EGF/Fc (His-Fcγ/pSec 벡터) 둘 다에 대한 안정한 세포주를 생성시켰다. 각 플라스미드를 CHO 세포 내로 형질 감염시켰다. 형질감염시킨 후, 세포를 DMEM 성장 배지에서 밤새 배양한 다음, 800 ㎍/ml 히그로마이신을 수반한 성장 배지로 전환시키고, Notch3 발현 플라스미드를 수반하지 않는 세포가 상기 항생제에 의해 제거될 때까지 2주 이상 동안 배양하였다. 안정한 세포주로부터의 적응용 배지를 대상으로 하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
안정하거나 일시적으로 형질감염시킨 세포를 대상으로 하여 Notch3-LD/Fc 또는 Notch3-EGF/Fc 융합 단백질의 발현과 분비에 관하여 검정하였다. 배양 디쉬로부터 수거한 형질감염된 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 1회 세척하고 탈이온수에 재현탁시키며, 등 용적의 2 x 단백질 샘플 부하용 완충액 (공급처: BioRad, Hercules, CA)과 혼합한 다음, 약 100℃ 하에 10분 동안 가열하였다. 분비된 단백질은 등 용적의 2 x 단백질 샘플 부하용 완충액과 혼합되고 100℃ 하에 10분 동안 가열시킨 적응용 배지를 사용하여 분석하였다. 4 내지 15% 구배 SDS-PAGE를 사용하여 샘플을 분리시켰다. 단백질을 겔로부터 PVDF 막 (공급처: BioRad, Hercules, CA)로 전이시키고, 단백질을 전이시키기에 앞서 1시간 이상 동안 PBST (0.05% TWEEN-20®을 수반한 PBS) 중의 5% 탈지 분유에서 차단시켰다.
Notch3-EGF/Fc 및 Notch3-LD/Fc 융합 단백질은 차단용 완충액 중에서 실온 하에 1시간 동안 γFc-특이적, HRP-접합된 항체 (공급처: Sigma, St Louis, MO)와 함께 항온 배양함으로써 탐지하였다. 막을 PBST에서 3회 세척하고 화학발광성 기질로 전개하였다.
Notch3 도메인/Fc 융합 단백질 정제를 위해, 상기 언급된 바와 같은 CHO 안정한 세포주를 2% FCS를 수반한 DMEM에서 5일 정도 배양하였다. 1 리터의 적응용 배지를 수집하고, 친화 결합성을 알아보기 위해 단백질-A 비드-패킹된 칼럼을 적용하였다. 이 칼럼을 PBS로 세척하고, 결합된 단백질을 50 mM 시트레이트 완충제 (pH 2.8) 중에서 용출시키고, 1 M 트리스-HCl 완충제 (pH 8)를 가함으로써 pH를 중성으로 만들었다. 4 내지 15% 구배 SDS-PAGE를 사용하여 단백질 겔 분석함으로써 단백질 순도를 평가하였다. 제조업자의 프로토콜 (Pierce, Rockford, IL)에 따라서 쿠마시 (Coomassie) 블루 시약을 사용하여 단백질 농도를 검정하였다. 이러한 과정을 통하여, 면역 및 ELISA 결합 검정을 위해 밀리그램 양의 Notch3-LD/Fc 및 Notch3-EGF/Fc 단백질을 정제하였다.
실시예 2: 항-Notch3 MAb의 생성
8 내지 12주생 숫컷 A/J 마우스 (공급처: Harlan, Houston, TX)에게 200 ㎕의 PBS 중의 완전 프로인트 아주반트 (공급처: Difco Laboratories, Detroit, MI) 중의 25 ㎍의 Notch3-EGF/Fc 또는 Notch3-LD/Fc를 피하 주사하였다. 주사한지 2주 후 및 희생시키기 3일 전에, 마우스에게 PBS 중의 동일한 항원 25 ㎍을 다시 복강내 주사하였다. 각 융합을 위해, 면역시킨 마우스의 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하고, Sp2/0 골수종 세포와의 융합을 위해 사용하였으며; 5x108개의 Sp2/0와 5x108개의 비장 세포를, 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W. 1450) (공급처: Kodak, Rochester, NY) 및 5% 디메틸설폭시드 (공급처: Sigma, St. Louis, MO)를 함유하는 배지에서 융합시켰다. 이어서, 이러한 세포를, 10% 태아 소 혈청, 100 단위/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 0.1 μM 히포크산틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 보충시킨 이스코브 (Iscove) 배지 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 200 ㎕의 현탁액당 1.5x105개 비장 세포의 농도가 되도록 조정하였다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 약 60개의 96-웰 판의 각 웰에 가하였다. 대략 10일 후에, ELISA를 이용하여 그들의 항체-결합 활성을 스크리닝하기 위하여, 배양 상등액을 회수하였다.
96-웰 평저 임뮬론 (Immulon) II 마이크로테스트 판 (공급처: Dynatech, Laboratories, Chantilly, VA)을, 1 x 페놀 레드 및 3-4 방울 pHix/리터 (공급처: Pierce, Rockford, IL)를 함유하는 PBS 중의 100 ㎕의 Notch3-EGF/Fc 또는 Notch3-LD/Fc (0.1 ㎍/ml)를 사용하여 피복시키고, 실온 하에 밤새 항온 배양하였다. 판을 플리킹 (flicking)함으로써 피복 용액을 꺼낸 후, 0.1% 메르티올레이트를 함유하는 PBST 중의 2% BSA를 함유하는 200 ㎕의 차단용 완충액을 1시간 동안 각 웰에 가하여 비특이적 결합을 차단시켰다. 이어서, 웰을 PBST로 세척하였다. 각 융합 웰로부터의 50 마이크로리터의 배양 상등액을 수집하고 50 ㎕의 차단용 완충액과 혼합한 다음, 미세역가 판의 개별 웰에 가하였다. 항온 배양한지 1시간 후, 웰을 PBST로 세척하였다. 이어서, 결합된 뮤린 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된, Fc-특이적 염소 항-마우스 IgG (공급처: Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)와 반응시킴으로써 탐지하였다. 0.1% 3,3,5,5-테트 라메틸 벤지딘 및 0.0003% 과산화수소를 함유하는 HRP 기질 용액을 30분 동안 색 전개를 위해 웰에 가하였다. 50 ml의 2 M H2SO4/웰을 부가함으로써 상기 반응을 종결시켰다. ELISA 판 판독기 (공급처: Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm 하에서의 OD를 판독하였다.
단리되고 분석된 185개 하이브리도마 중에서, Notch3-LD/Fc로 면역시킨 마우스로부터의 1개 하이브리도마 클론이 Notch3 작동제 항체 256A-13을 생산하였고, 이러한 항체를 추가로 성상 확인하였다. MAb 256A-13을 생산하는 하이브리도마 클론으로부터의 상등액을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 이를 생성시킨 정제된 Notch3 LD/FC 융합 단백질에 대한 강력한 결합 활성이 나타났고, 인간 Notch1-LD/Fc (카복실 말단에서 Fc 영역과 융합된 LIN/이량체화 도메인) 또는 대조군 인간 Fc 단백질과는 결합하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음) (표 1).
하이브리도마 상등액을 이용한 256A-13의 ELISA OD 판독치
표적 단백질 Notch3-LD/Fc
하이브리도마 상등액 대조군 IgG1 MAb 256A-13
평균 0.019 2.828
S.D. 0.002 0.047
상기 일차 ELISA 스크리닝으로부터의 양성 하이브리도마 클론은 단일 집락을 골라냄으로써 추가로 단리시키고, 상기 언급된 바와 같은 제2 ELISA 검정을 수행하여 선택된 면역원에 대한 특이적 결합을 검증하였다. 이와 같이 확인된 하이브리도마 클론을 보다 대규모 배양 하에 확장시켰다. 단백질 A 친화 칼럼을 사용하여 이들 대규모 배양 배지로부터 모노클로날 항체 (MAb)를 정제하였다. 이어서, 세포에 의거한 결합 검정, 현미경 검사, 웨스턴 블롯 및 FACS 분석을 이용하여 항-Notch3 작동제 MAb를 성상 확인하였다.
실시예 3: 항-Notch3 MAb에 대한 세포에 의거한 결합 검정
세포에 의거한 결합 검정을 사용하여 완전한 길이의 인간 Notch3 개방 판독 프레임을 벡터 [본 경우에는 pcDNA3.1/Hygro (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)이다] 내로 클로닝시키는 데에 요구된 항-Notch3 Mab를 성상 확인하였다. Notch3-암호화 영역은 주형으로서 인간 간 종양 RNA (공급처: Ambion, Inc., Austin, TX)를 사용하여 RT-PCR함으로써 합성하였다. 최종 플라스미드 구조물인 Notch3/Hygro는 도 1에 도시된 바와 같이 완전한 길이의 Notch3 단백질을 발현하였다. Notch3을 발현하는 안정한 세포주는 실시예 1에 기재된 바와 동일한 과정에 따라서 리포펙타민 2000 키트를 이용하여 Notch3/Hygro 플라스미드 구조물을 293T 세포 (ATCC No. CRL-11268) 내로 형질감염시킴으로써 생성시켰다. 형질감염시킨 후, 세포를 DMEM 성장 배지에서 밤새 배양한 다음, 200 ㎍/ml 히그로마이신을 수반한 성장 배지에 재시딩하고 12 내지 14일 동안 배양하였다. 잘 단리된 단일 집락을 골라내고 충분한 클로날 세포가 증폭될 때까지 별개의 웰에서 성장시켰다. 히그로마이신 선별에 대해 내성이 있고 고 수준의 Notch3 단백질을 발현한 안정한 293T 클론은 폴리클로날 항-Notch3 항체 (공급처: R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 형광성 전자현미경 검사 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.
Notch LIN12/이량체화 (LD) 도메인과 막관통 (TM) 도메인 만을 함유하는 부분적 Notch3 발현 플라스미드를 또한 PCR에 의해 구축하고, 이를 pcDNA3.1 내로 서브클로닝하였다.
Notch3을 천연적으로 발현하는 인간 Sup-T1 세포주 (ATCC No. CRL-1942)를 웨스턴 블롯에 의해 또한 확인하였다. Sup-T1 세포를, 10% 태아 송아지 혈청, 2 mM의 글루타민 및 1 X 필수 아미노산 용액을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다.
제조업자가 제공한 프로토콜에 따라서 FMAT™ (형광 매크로-공촛점 고 처리량 스크리닝) 8100 HTS 시스템 (공급처: Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여, 세포에 의거한 항체 결합성을 평가하였다. Notch3을 천연적으로 발현하거나 Notch3 발현 구조물로 안정적으로 형질감염시킨 세포주를 96-웰 판에 시딩하였다. 또 다른 한편, 일시적으로 형질감염시킨 293T 또는 CHO 세포를 96-웰 판에 시딩하였다. 세포를 웰당 30,000 내지 50,000개 세포 밀도로 시딩하였다. 20 내지 24시간 후, 항-Notch3 MAb 및 1 x PBS 반응 완충액을 웰에 가하고 37℃ 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 일차 항체를 제거한 후, Cy-5-접합된 항-마우스 IgG 항체를 웰에 가하였다.
내부적으로 생성된 293T/Notch3-안정한 세포주와, 2개의 암 세포주, 즉 인간 Sup-T1 및 A2780 세포주 (UK ECACC No. Cat. No. 93112519) [둘 다 Notch3을 천연적으로 발현한다 (데이터는 제시되지 않음)]를 사용하여 형광-활성화 세포 분류기 (FACS)에 의해 세포에 의거한 항체 결합성을 평가하였다. 세포를 먼저, 1 x PBS 중의 항-Notch3 MAb와 함께 항온 배양하였다. 3회 세척한 후, 세포를 형광성 분자-접합된 이차 항체와 함께 항온 배양하였다. 세포를 재현탁시키고, 0.1% 파라포름알데히드를 수반한 1 x PBS에 고정시키며, FACS (공급처: BD Sciences, Palo Alto, CA)에 의해 분석하였다. 그 결과, 256A-13은 재조합 플라스미드 구조물로부터 발현되거나 또는 배양된 세포 중에서 천연 단백질로서 발현된 Notch3 수용체와 결합하는 것으로 나타났다 (표 2). Notch3/Hygro 플라스미드를 함유하는 일시적으로 형질감염시킨 293T 세포를 또한, 상기 언급된 바와 같이 면역형광으로 염색시키고 형광 현미경에 의해 관찰하였다.
평균 형광 세기로서 제시된, 세포에 의거한 FACS 분석에서의 256A-13의 결합 활성
대조군 IgG1 256A-13
Notch3/Hyg 24.16 32.2
Sup-T1 24.51 55.44
세포에 의거한 FMAT 및 FACS 분석 결과, MAb 256A-13이 실제로, 재조합 플라스미드 구조물로부터 발현되거나 또는 배양된 세포 중에서 천연 단백질로서 발현된 Notch3 수용체와 결합하는 것으로 확인되었다 (표 2 및 표 3).
세포에 의거한 FMAT에서 항-Notch3 MAb 결합 활성의 요약
항체 대조군 IgG1 256A-13
Notch3 (완전한 길이) 결합되지 않음 약한 결합
Notch3-LDTM 결합되지 않음 강한 결합
IgG1 대조군 및 기타 음성 하이브리도마 클론 보다 상당히 더 높은 FMAT 신호 판독정보 (p > 0.01)에 의거하여, 양성 결합 신호를 결정하였다. IgG1 대조군 결합성 판독정보를 배경으로 간주하였다. Notch3/Hygro 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 293T 세포를 또한, 상기 언급된 바와 같은 면역형광으로 염색시키고, 형광 현미경에 의해 관찰하였다.
MAb 256A-13의 결합 친화도를 비아코어 (Biacore) 시스템 (공급처: Biacore Inc., Piscataway, NJ)에 의해 분석하였다. 항체는 아민 커플링을 통하여 칩 상에 직접 고정화시키고 (고정화 수준: 200 RU), Notch3-LD/Fc 단백질 (항원)을 5가지 상이한 농도 (연합 시간 5 내지 8분과 해리 시간 1 및 2시간을 수반한 37.5 내지 120 nM 범위의 농도)로 주사하였다. 수행용 완충액과 샘플 완충액은 5 mM Ca2+를 함유한 PBS이다. 칩 표면을 10 mM 글리신, pH 2으로 재생시켰다. 항체를 두 번 되풀이 하여 성상 확인하였다. 표 4에는 통계학적 평균, 표준 오차 및 계산된 역학 해리 상수 (KD)가 기재되어 있다. 항체는 280 pM의 KD를 갖는 고 친화도와 느린 이탈 속도(off rate)를 나타낸다. 표준 오차와 카이 제곱 (chi square) 둘 다는 적합도가 낮았다 (동적 곡선은 제시되지 않음).
Figure 112009029534444-PCT00001
KD: 256A-13 및 Notch3-LD/Fc 해리 상수. Ka: Notch3-LD/Fc와 결합하는 256A-13의 속도 (또는 작동 속도). Kd: Notch3-LD/Fc로부터 해리되는 256A-13의 속도 (또는 이탈 속도). SE: 표준 오차.
실시예 4: 256A-13 결합 활성의 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯을 수행하여 변성 조건 하에 Notch3 수용체에 대한 256A-13의 결합 활성 뿐만 아니라 인간 세포주에서 Notch3 및 기타 Notch 관련 단백질의 발현 수준을 평가하였다. 정제된 Notch3-LD/Fc 융합 단백질을 단백질 부하용 완충액과 합하였다. 단백질 샘플을 또한, 실시예 1에 기재된 일시적 또는 안정적으로 형질감염된 세포로부터 제조하였는데, 이는 배양 디쉬로부터 수거하고, PBS로 1회 세척하며, 총 세포성 단백질 추출물 완충액 (공급처: Pierce, Rockford, IL)에 재현탁시키며, 등 용적의 2 x 단백질 샘플 부하용 완충액을 가한 후에 100℃에서 10분 동안 가열하였다. 모든 샘플을 4 내지 15% 구배 SDS-PAGE에서 전기영동함으로써 분리시켰다. 단백질을 겔로부터 PVDF 막에 옮기고, 256A-13을 일차 탐지 항체로서 웨스턴 블롯 막에 적용하였다. HRP-접합된 이차 항체를 탐지에 사용하였고, 상기 언급된 바와 같은 화학발광성 기질을 사용하여 신호를 생성시켰다. 인간 Fc, V5 태그, Notch3 및 Notch1에 대항한 양성 대조군 항체를 구입하였다 (구입처: Invitrogen, R&D Systems, Santa Cruz Biotechnologies, and Orbigen).
웨스턴 블롯 분석 결과, MAb 256A-13이 변성 조건 하에 Notch3-LD/Fc와 결합한다는 사실 뿐만 아니라 ELISA 및 FACS 분석에서 관찰된 바와 같은 천연 분자상 입체 형태가 밝혀졌다.
실시예 5: 루시퍼라제 리포터 검정에 의한 256A-13의 기능성 평가
A. 플라스미드 구조물
상기 실시예 3에 기재된 완전한 길이의 Notch3 발현 구조물은 서열 분석함으로써 확인하였는데, 이는 도 1에 도시된 공개된 서열과 동일하다. Notch3의 발현은 실시예 4에 기재된 바와 같은 일시적 형질감염 및 웨스턴 블롯에 의해 검증하였다.
Notch 신호 전달을 위한 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 생성시키기 위해, 다음 서열을 갖는, CBF1 결합성 모티프의 직렬식 반복 서열을 함유하는 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
Figure 112009029534444-PCT00002
이들 두 올리고프라이머를 100 mM의 NaCl 중에서 65℃ 하에 4 mM의 농도로 각 올리고와 어닐링하였다. 서로 어닐링한 후, 프라이머를 PCR에 의해 연장시켰다. 이러한 PCR 생성물을 시판용 벡터 내로 클로닝하였다. 삽입물을 서열 분석에 의해 검증하였는데, 이는 CBF1 결합성 모티프의 4개 직렬식 반복 서열과 2개의 플랭킹 XhoI 부위를 함유하고 있다. XhoI을 사용하여 삽입물을 절단하고, 개똥벌레 루시퍼라제 리포터 암호화 서열의 하류에 연결시켰다. 루시퍼라제 리포터 검정 및 서열 분석 후, CBF1 결합성 모티프의 8개 반복 서열을 수반한 플라스미드 클론을 선별하고 CBF1-Luc로 명명하였다.
B. 안정한 세포주 생성
인간 배아 신장 세포주 (HEK293)를 사용하여 기능성 검정을 위해 2개의 안정한 세포주를 생성시켰다. 하나의 세포주는 핵 게놈 내로 통합된 Notch3-발현성 플라스미드와 CBF1-Luc 리포터 플라스미드를 함유하였다. 이러한 세포주는 제조업자의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 2000을 이용하여 Notch3/히그로마이신과 CBF1-Luc 플라스미드를 293T 세포 내로 공동-형질감염시킴으로써 생성시켰다. DMEM 성장 배지에서 200 ㎍/ml 히그로마이신에 대항하여 안정한 형질감염 세포 클론을 선별하고, 루시퍼라제 리포터 검정 및 웨스턴 블롯에 의해 스크리닝하였다. 비교적 고 수준의 Notch3 수용체 발현 (웨스턴 블롯에 의거함)과 루시퍼라제 활성을 나타내는 세포주를 기능성 검정에 사용하기 위해 선별하고, 이를 NC85로 명명하였다.
C. Notch3 과발현성 세포 단독을 이용한 루시퍼라제 리포터 검정
NC85 세포를 MAb 256-A13의 존재 하에 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 흡인 제거하고, 세포를 1 x 수동 용해 완충액 (공급처: E1501, Promega, Madison, WI)에 용해시키고, TD-20/20 조도계 (공급처: Turner Designs Instrument, Sunnyvale, CA)에서 제조업자의 프로토콜 (공급처: E1501, Promega, Madison, WI)에 따라서 루시퍼라제 검정 시스템을 이용하여 루시퍼라제 활성을 검정하였다. 도 5에 예시된 바와 같이, NC85 세포를 MAb 256-A13의 존재 하에 배양하고, 루시퍼라제 활성은 대조군 항체 G3을 이용한 경우와 비교해서 거의 4배 증가하였다. 루시퍼라제 리포터 검정 결과, MAb 256-A13이 리간드 결합 없이도 루시퍼라제 활성의 현저한 증가를 유도시킨 반면, 길항제 항-Notch3 항체 MAb 256A-4 및 256A-8는 그렇치 못한 것으로 입증되었다 (도 5).
실시예 8: 256A-13의 결합성 에피토프의 지도화
A. Notch3 단일 도메인 및 Fc 융합 단백질 구조물을 이용한 에피토프-지도화 전략 및 이론적 근거
Notch3 LIN12-이량체화 도메인 (Notch3-LD)으로 지칭되기도 하는 Notch3 LIN12/이종-이량체화 도메인은 3개의 LIN12 도메인, 즉 제1 LIN12 (L1), 제2 LIN12 (L2) 및 제3 LIN12 (L3)으로 이루어졌다 (도 10 참고). 5개의 Notch3 단일 도메인/Fc 융합 단백질 발현 구조물 (도 7)이 생성되었고, 웨스턴 블롯을 수행하여 어느 도메인이 MAb 256A-13 결합에 충분하였는지를 평가하였다. 일시적으로 형질감염시킨 후, 분비된 Notch3 단일 도메인/Fc 융합 단백질을 수반한 상등액을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 그 결과, MAb 256A-13이 단지 Notch3-L1과만 결합하고, 기타 모든 도메인과는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. ELISA 실험 결과 또한, MAb 256A-13이 Notch3-L1과 극히 강력한 결합을 나타내고 Notch3-L3과는 약한 결합을 나타내지만, 기타 도메인과는 그렇치 못하다는 사실이 밝혀졌다 (표 5).
Figure 112009029534444-PCT00003
A. 서브도메인 스와프에 의한 결합성 에피토프(들)의 확인
첫째, 작동제 Notch3 MAb, 256A-13은 Notch3 LIN12/이량체화 도메인 (LD)과는 결합하지만, 상동성 인간 Notch1 LIN12/이량체화 도메인과는 결합하지 않는다 (도 5). 둘째, 항-Notch3 MAb는 실시예 4 및 8에 논의된 바와 같이 웨스턴 블롯에서 변성된 Notch3 단백질과 결합하는데, 이는 256A-13이 단일 에피토프와 결합하거나 서로 무관한 별개의 에피토프와 결합한다는 것을 나타낸다. 셋째, Notch3과 Notch1은 LIN12/이량체화 도메인에 있어서 대략 55% 아미노산 서열 상동성을 공유하므로, 이러한 영역 내에서 Notch3과 Notch1 간의 서브도메인 스와프가 단백질 입체 형태를 붕괴시키지 않을 것으로 결론지었다. Notch1-LD cDNA는 표준 PCR 방법을 사용하여 PCR-증폭시켰다. 제1 가닥 cDNA 주형을 PA-1 세포 총 RNA (ATCC No. CRL-1572)로부터 합성하였다. 인간 IgG 카파 쇄 리더 펩티드 암호화 서열을 PCR 증폭시키고, 리더 펩티드로서 사용하여 PCR-SOE에 의해 Notch1-LD의 5'에 연결시키고, His-γ1 Fc/pSec에 서브클로닝하였다.
Figure 112009029534444-PCT00004
B. 서브도메인 스와프 융합 단백질 구조물의 생성
상기 섹션 A에 제시된 ELISA 분석 결과를 근거로 하여, 제1 LIN12 도메인 또는 L1의 표적 도메인을 3개의 서브도메인으로 추가로 나누고, Notch1-L1의 상응하는 서브도메인과 개별적으로 스와핑하였다. 서브도메인 스와프 구조물은 도 9 및 10에 예시된 바와 같이 PCR-SOE [참고: Ho, et al., Gene 77:51 (1989); Horton, et al., BioTechniques 8:528 (1990)]를 사용하여 생성시켰다. PCR 및 PCR-SOE 반응은 PCR을 이용하여 수행하였는데, 1 M 베타인과 5% DMSO를 상기 반응에 가하였다. 최종 PCR-SOE 생성물을 서브클로닝하고, 서열 분석에 의해 검증하였다. 정확한 삽입 서열을 수반하는 플라스미드 클론을 NheI 및 XhoI로 절단하여 해당 삽입물을 절제하고, 이를 겔 정제한 다음 서브클로닝하였다. 5개 Notch3/Notch1 서브도메인 스와프 구조물이 도 7에 예시되었다. 에피토프 지도화를 촉진시키기 위하여, 인간 IgG 카파 쇄 신호 전달 펩티드를 도메인 스와프 구조물에서 리더 펩티드로서 사용하였다. 서브도메인 구조물의 아미노산 서열이 도 10에 제시되었다.
C. Notch3/Notch1 서브도메인 스와프 융합 단백질의 발현
리포펙타민 2000을 사용하여 Notch3/Notch1-LD 도메인 스와프 플라스미드를 CHO 세포에서 일시적으로 형질감염시켰다. CHO 세포를 6-웰 판에서 웰당 0.8 내지 1 X 106개 세포로 10% FCS를 수반한 DMEM 성장 배지에 시딩하고, CO2 항온 배양기에서 밤새 유지시킨 후 형질감염시켰다. 상기 성장 배지에서 약 3시간 동안 형질감염시킨 후에 세포를 회수한 다음, 2% FCS를 수반하는 DMEM으로 전환시키고, 3일 동안 배양하였다. 적응용 배지를 수거하고, 3500 rpm 하에 10분 동안 원심분리시켰다. CHO로부터 분비된 Notch3-LD 도메인 스와프 단백질을 함유하는 상등액을 수집하고, 웨스턴 블롯 및 ELISA 결합 분석용으로 준비하였다. ELISA는 모든 도메인-스와프 융합 단백질이 적응용 배지에서 발현되고 분비되었다는 것을 나타내었는데 (표 4), 이는 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음). ELISA 판독치는 탐지 항체로서 항-인간 Fc 항체를 사용하였는데, 이는 모든 단백질이 적응용 배지에서 발현되었다는 것을 나타낸다. 인간 IgG/Fc를 대조군으로서 사용하였다. 각 웰에서 피복된 인간 IgG/Fc의 출발 점은 100 ng이다.
D. ELISA를 이용한 에피토프 결합 분석
96-웰 평저 임뮬론 II 마이크로테스트 판 (공급처: Dynatech, Laboratories, Chantilly, VA)을, 1 x 페놀 레드 및 3-4 방울 pHix/리터 (공급처: Pierce, Rockford, IL)를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 100 ㎕의 상기 항체 (0.1 ㎍/ml)를 가함으로써 항-인간 Fc 항체 (공급처: Jackson ImmunoResearch)로 피복시키고, 실온 하에 밤새 항온 배양하였다. 판을 플리킹함으로써 피복 용액을 꺼낸 후, PBST 중의 2% BSA 및 0.1% 메르티올레이트를 함유하는 200 ㎕의 차단용 완충액을 1시간 동안 각 웰에 가하여 비특이적 결합을 차단시켰다. 이어서, 웰을 PBST로 세척하였다. Notch3/Notch1 도메인 스와프 구조물의 각 형질감염으로부터의 50 마이크로리터의 상기 적응용 배지를 수집하고 50 ㎕의 차단용 완충액과 혼합한 다음, 미세역가 판의 개별 웰에 가하였다. 항온 배양한지 1시간 후, Notch3/Notch1-LD 도메인 스와프 단백질을 상기 피복시킨 항-Fc 항체로써 포획하고, 웰을 PBST로 세척하였다. 항-Notch3 MAb 및 이소형-매칭된 대조군 MAb를 상기와 같은 차단용 완충액에서 일련으로 희석시키고, 이와 같이 희석된 MAb 50 ㎕을 각 웰에 가하여 결합된 Notch3/Notch1 도메인 스와프 단백질에 대한 결합을 평가하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된, Fc-특이적 염소 항-마우스 IgG를 탐지에 사용하였다. 0.1% 3,3,5,5-테트라메틸 벤지딘 및 0.0003% 과산화수소를 함유하는 HRP 기질 용액을 30분 동안 색 전개를 위해 웰에 가하였다. 50 ml의 2 M H2SO4/웰을 부가함으로써 상기 반응을 종결시켰다. ELISA 판독기를 이용하여 450 nm 하에서의 OD를 판독하였다. 돌연변이 군집과 서브도메인 스와프 구조물을 상기 ELISA 분석에 의해 유사하게 조사하였다.
서브도메인-스와프 단백질에 대항한 MAb 256A-13을 이용한 ELISA 결합성 실험 결과, Notch3-L1 도메인 (L1) 내의 제1 서브도메인의 스와프는 결합에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났는데, 이는 256A-13이 상기 영역과 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 한편, Notch3-L1 내의 제2 및 제3 서브도메인의 스와프는 상기 결합을 상당히 저하시켰다. 따라서, 이들 두 서브도메인은 MAb 256A-13에 대한 결합 에피토프(들)를 함유하고 있다 (도 10). 이와는 달리, 이소형-매칭된 음성 대조군 항체 G3은 ELISA 검정에서 어떠한 도메인 스와프 융합 단백질과도 결합하지 않는다 (도 10). 상기 실험으로부터, 제1 LIN12 도메인이 구체적으로 언급하면 제2 및 제3 서브도메인 영역 내에서 MAb 256A-13 결합에 요구되었다고 결론지었다.
MAb 256A-13과 결합하는 특이적 에피토프를 추가로 지도화하기 위하여, Notch3-L1 도메인의 제2 및 제3 서브도메인을 추가로 5개 아미노산 군집으로 나누고, Notch1 중의 상응하는 아미노산 잔기로 스와핑하였다 (도 10). ELISA 결합 검정 결과, DRE (Notch3 서열)로부터 SQL (Notch1 서열)로의 스와프가 ELISA 결합 활성을 완전히 없앤 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 에피토프 만이 Notch3-L1 도메인 내에서 MAb 256A-13 결합에 요구된다는 것을 표시한다.
MAb 256A-13 결합에 요구되는 아미노산 잔기의 위치를 정확히 지적하는 분석은 디-알라닌 펩티드 스캐닝을 사용함으로써 수행하였다. 알라닌 펩티드는 아미노산 스와프 분석에 의해 지도화된 DRE 에피토프를 포괄한다. 이러한 펩티드는 나일론 지지체 막과 가교 결합된 반점으로서 합성된다. 항체 블롯 결합은 도트 블롯에 의해 평가하였다. MAb G3을 대조군 IgG1로서 사용하였다. 펩티드 서열은 도 11에 제시되었다.
실시예 9: 항-Notch3 MAb의 서열 분석
항체 결합 특성은 중쇄와 경쇄 둘 다의 가변 영역에 완전히 의존적이기 때문에, 256A-13의 가변 서열을 아유형별로 나누고 서열 분석하였다. 항체 IgG 아유형은 이소스트립 (Isostrip) 마우스 모노클로날 항체 키트 (공급처: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 사용하여 결정하였다. 그 결과, 256A-13이 IgG1 중쇄와 카파 경쇄를 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.
RT-PCR 및 cDNA 클로닝을 통하여 중쇄와 경쇄의 가변 영역 서열을 해독하였다. 하이브리도마 클론 256A-13으로부터의 총 RNA는 제조업자의 프로토콜 (Qiagen Sciences, Valencia, CA)에 따라서 RNeasy 미니 키트를 이용하여 단리시켰다. 제1 가닥 cDNA는 RNA 주형 및 슈퍼스크립타제 (Superscriptase) III 키트를 사용하여 합성하였다. 경쇄 및 중쇄 cDNA의 가변 영역은 마우스 카파 쇄 암호화 영역의 5'-말단을 포괄하는 변성 정배향 프라이머와 가변 영역의 3'-말단에 대한 연접부에서 불변 영역과 매칭되는 역배향 프라이머를 사용하거나, 또는 마우스 중쇄 암호화 영역의 5'-말단을 포괄하는 변성 정배향 프라이머와 마우스 중쇄 내의 불변 영역 역배향 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA로부터 PCR 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 시판용 벡터 내로 클로닝시키고 론 스터 랩 (Lone Star Lab; Houston, TX)에 의해 서열 분석하였다. 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 DNAStar (공급처: DNASTAR, Inc., Madison, WI)를 활용하여 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 각 항-Notch3 MAb 서열은 동일한 하이브리도마 클론으로부터 유래된 다중 PCR 클론으로부터의 서열에 의해 결정하였다.
Mab 256A-13의 가변 중쇄 영역은 121개 아미노산 잔기를 함유하고 있고, 경쇄 가변 영역은 102개 아미노산 잔기를 함유하고 있다 (도 4A 및 4B).
실시예 10: Notch3의 메탈로프로테아제 절단에 대한 Notch3 작동성 항체의 영향력
Notch 수용체 활성화는 세포외 소단위체를 생성하는 막근방 부위 (S2)에서의 리간드 유도된 메탈로프로테이나제 절단과 관련이 있다. 이러한 절단은 활성화된 Notch 세포내 영역을 방출시키기 위한 S3 절단에 필수적인 요건이다. 항체를 작동시키는 것이 리간드-비의존성 순차적 Notch 활성화 사건 (2가지 단백질 분해적 절단 포함)을 유도시킬 수 있는지를 시험하기 위해, 재조합 Notch3 수용체를 안정적으로 발현하는 293T 세포 (NC85 세포)를 G3 또는 256-A13으로 처리하였다. 배양 배지 중에서의 단백질 분해적 절단에 의해 생성된 가용성 세포외 소단위체는 Notch3 절단 생성물을 인식하는 고체 표면과 결합된 항체를 사용하여 ELISA 검정함으로써 탐지하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, Notch3 작동성 MAb는 적응용 배지 중의 가용성 Notch3 세포외 소단위체의 생성을 상당히 증가시킨 반면, 대조군 항체 G3은 그렇치 못하였다.
실시예 11: Notch3 관련 질환에 대한 검정
기타 Notch3 관련 질환을 확인하기 위하여, 환자 샘플로부터 Notch3 유전자를 서열 분석할 수 있거나, 또는 환자 조직을 이용하여 Notch3 수용체의 불충분한 발현에 관하여 검사하기 위한 면역조직화학을 수행하였다. 또한, Notch3 관련 질환이 있는 것으로 추정되는 환자로부터 세포를 단리 및 배양할 수 있고, Notch3 신호 전달에 대한 본 발명의 작동성 항체의 영향력을 연구할 수 있다.
당업자는 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 양태에 대한 수 많은 등가 양태를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 양태는 다음 청구의 범위에 의해 포괄된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. LI, Kang ZHOU, Bin-Bing Stephen WU, Wenjuan FUNG, Sek Chung SINGH, Sanjaya <120> ANTI-NOTCH3 AGONIST ANTIBODIES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF NOTCH3-RELATED DISEASES <130> P4024R1 WO <150> US 60/852,861 <151> 2006-10-19 <150> US 60/879,218 <151> 2007-01-06 <160> 37 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2321 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Gly Pro Gly Ala Arg Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Met Ser 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Pro Pro Cys Leu Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Cys Ala Asn Gly Gly Arg Cys Thr Gln Leu Pro Ser Arg Glu Ala Ala 50 55 60 Cys Leu Cys Pro Pro Gly Trp Val Gly Glu Arg Cys Gln Leu Glu Asp 65 70 75 80 Pro Cys His Ser Gly Pro Cys Ala Gly Arg Gly Val Cys Gln Ser Ser 85 90 95 Val Val Ala Gly Thr Ala Arg Phe Ser Cys Arg Cys Pro Arg Gly Phe 100 105 110 Arg Gly Pro Asp Cys Ser Leu Pro Asp Pro Cys Leu Ser Ser Pro Cys 115 120 125 Ala His Gly Ala Arg Cys Ser Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Cys 130 135 140 Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Gln Gly Arg Ser Cys Arg Ser Asp Val Asp 145 150 155 160 Glu Cys Arg Val Gly Glu Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Leu Asn 165 170 175 Thr Pro Gly Ser Phe Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Gly Pro 180 185 190 Leu Cys Glu Asn Pro Ala Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn 195 200 205 Gly Gly Thr Cys Arg Gln Ser Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Cys Ala Cys 210 215 220 Leu Pro Gly Phe Glu Gly Gln Asn Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cys 225 230 235 240 Pro Gly His Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Val Asn 245 250 255 Thr Tyr Asn Cys Gln Cys Pro Pro Glu Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr 260 265 270 Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Gln Pro Asn Ala Cys His Asn Gly 275 280 285 Gly Thr Cys Phe Asn Thr Leu Gly Gly His Ser Cys Val Cys Val Asn 290 295 300 Gly Trp Thr Gly Glu Ser Cys Ser Gln Asn Ile Asp Asp Cys Ala Thr 305 310 315 320 Ala Val Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser Phe 325 330 335 Tyr Cys Ala Cys Pro Met Gly Lys Thr Gly Leu Leu Cys His Leu Asp 340 345 350 Asp Ala Cys Val Ser Asn Pro Cys His Glu Asp Ala Ile Cys Asp Thr 355 360 365 Asn Pro Val Asn Gly Arg Ala Ile Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Thr 370 375 380 Gly Gly Ala Cys Asp Gln Asp Val Asp Glu Cys Ser Ile Gly Ala Asn 385 390 395 400 Pro Cys Glu His Leu Gly Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Ser Phe Leu 405 410 415 Cys Gln Cys Gly Arg Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Thr Asp Val 420 425 430 Asn Glu Cys Leu Ser Gly Pro Cys Arg Asn Gln Ala Thr Cys Leu Asp 435 440 445 Arg Ile Gly Gln Phe Thr Cys Ile Cys Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr 450 455 460 Tyr Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Gln Ser Ser Pro Cys Val Asn 465 470 475 480 Gly Gly Val Cys Lys Asp Arg Val Asn Gly Phe Ser Cys Thr Cys Pro 485 490 495 Ser Gly Phe Ser Gly Ser Thr Cys Gln Leu Asp Val Asp Glu Cys Ala 500 505 510 Ser Thr Pro Cys Arg Asn Gly Ala Lys Cys Val Asp Gln Pro Asp Gly 515 520 525 Tyr Glu Cys Arg Cys Ala Glu Gly Phe Glu Gly Thr Leu Cys Asp Arg 530 535 540 Asn Val Asp Asp Cys Ser Pro Asp Pro Cys His His Gly Arg Cys Val 545 550 555 560 Asp Gly Ile Ala Ser Phe Ser Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Thr Gly 565 570 575 Thr Arg Cys Glu Ser Gln Val Asp Glu Cys Arg Ser Gln Pro Cys Arg 580 585 590 His Gly Gly Lys Cys Leu Asp Leu Val Asp Lys Tyr Leu Cys Arg Cys 595 600 605 Pro Ser Gly Thr Thr Gly Val Asn Cys Glu Val Asn Ile Asp Asp Cys 610 615 620 Ala Ser Asn Pro Cys Thr Phe Gly Val Cys Arg Asp Gly Ile Asn Arg 625 630 635 640 Tyr Asp Cys Val Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Pro Leu Cys Asn Val 645 650 655 Glu Ile Asn Glu Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gly Glu Gly Gly Ser Cys 660 665 670 Val Asp Gly Glu Asn Gly Phe Arg Cys Leu Cys Pro Pro Gly Ser Leu 675 680 685 Pro Pro Leu Cys Leu Pro Pro Ser His Pro Cys Ala His Glu Pro Cys 690 695 700 Ser His Gly Ile Cys Tyr Asp Ala Pro Gly Gly Phe Arg Cys Val Cys 705 710 715 720 Glu Pro Gly Trp Ser Gly Pro Arg Cys Ser Gln Ser Leu Ala Arg Asp 725 730 735 Ala Cys Glu Ser Gln Pro Cys Arg Ala Gly Gly Thr Cys Ser Ser Asp 740 745 750 Gly Met Gly Phe His Cys Thr Cys Pro Pro Gly Val Gln Gly 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Gly Val 965 970 975 Cys Ser Ala Ala His Pro Gly Phe Arg Cys Thr Cys Leu Glu Ser Phe 980 985 990 Thr Gly Pro Gln Cys Gln Thr Leu Val Asp Trp Cys Ser Arg Gln Pro 995 1000 1005 Cys Gln Asn Gly Gly Arg Cys Val Gln Thr Gly Ala Tyr Cys Leu 1010 1015 1020 Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Arg Leu Cys Asp Ile Arg Ser Leu 1025 1030 1035 Pro Cys Arg Glu Ala Ala Ala Gln Ile Gly Val Arg Leu Glu Gln 1040 1045 1050 Leu Cys Gln Ala Gly Gly Gln Cys Val Asp Glu Asp Ser Ser His 1055 1060 1065 Tyr Cys Val Cys Pro Glu Gly Arg Thr Gly Ser His Cys Glu Gln 1070 1075 1080 Glu Val Asp Pro Cys Leu Ala Gln Pro Cys Gln His Gly Gly Thr 1085 1090 1095 Cys Arg Gly Tyr Met Gly Gly Tyr Met Cys Glu Cys Leu Pro Gly 1100 1105 1110 Tyr Asn Gly Asp Asn Cys Glu Asp Asp Val Asp Glu Cys Ala Ser 1115 1120 1125 Gln Pro Cys Gln His Gly Gly Ser Cys Ile Asp Leu Val Ala Arg 1130 1135 1140 Tyr Leu Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Leu Gly Val Leu Cys Glu 1145 1150 1155 Ile Asn Glu Asp Asp Cys Gly Pro Gly Pro Pro Leu Asp Ser Gly 1160 1165 1170 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1770 Asp Ala Asp Ala Asp Gly Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp 1775 1780 1785 Gly Phe Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Phe Cys Gly Gly Ala Leu 1790 1795 1800 Glu Pro Met Pro Thr Glu Glu Asp Glu Ala Asp Asp Thr Ser Ala 1805 1810 1815 Ser Ile Ile Ser Asp Leu Ile Cys Gln Gly Ala Gln Leu Gly Ala 1820 1825 1830 Arg Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg 1835 1840 1845 Tyr Ala Arg Ala Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala 1850 1855 1860 Asp Thr Asn Ala Gln Asp His Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Thr 1865 1870 1875 Ala Val Thr Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg 1880 1885 1890 Asn Arg Ser Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met Ala Asp Gly Ser Thr 1895 1900 1905 Ala Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Val Glu 1910 1915 1920 Glu Leu Ile Ala Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Glu Leu 1925 1930 1935 Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu 1940 1945 1950 Ala Thr Leu Ala Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln 1955 1960 1965 Asp Ser Lys Glu Glu 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<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H1 of Mab 256A-13 <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr His Trp Met Asn Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H2 of Mab 256A-13 <400> 5 Ile Asn Pro Ser Asn Asp Phe Thr Asp Cys Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-H3 of Mab 256A-13 <400> 6 Thr Ala Arg Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-L1 OF MAB 256A-13 <400> 7 Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-L2 OF MAB 256A-13 <400> 8 Tyr Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> CDR-L3 of Mab 256A-13 <400> 9 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Notch 3 LIN 12 Domain <400> 10 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Notch 3 LIN 12 Subdomain <400> 11 Ala Lys Arg Gly Asp Gln Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly 1 5 10 15 Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 20 25 <160> 12 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 gctcgagctc gtgggaaaat accgtgggaa aatgaaccgt gggaaaatct 50 cgtgg 55 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 13 gctcgagatt ttcccacgag attttcccac ggttc 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 14 Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 15 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asn Lys 1 5 10 15 Val Cys Ser Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 16 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 17 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Glu Asp Ala Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 18 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asn Lys 1 5 10 15 Val Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 19 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Ser Leu Gln Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 20 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Asn His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Ser Val Gly 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> LIN 12 NOTCH 3/NOTCH 1 DOMAIN SWAP (FIG. 10) <400> 21 Glu Pro Arg Cys Pro Arg Ala Ala Cys Gln Ala Lys Arg Gly Asp Gln 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Glu Cys Asn Ser Pro Gly Cys Gly Trp Asp Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn 35 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 22 Ala Ala Cys Gln Ala Ala Ala Gly Asp Gln Arg Cys 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 23 Ala Cys Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gln Arg Cys Asp 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 24 Cys Gln Ala Lys Arg Ala Ala Gln Arg Cys Asp Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 25 Gln Ala Lys Arg Gly Ala Ala Arg Cys Asp Arg Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 26 Ala Lys Arg Gly Asp Ala Ala Cys Asp Arg Glu Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 27 Lys Arg Gly Asp Gln Ala Ala Asp Arg Glu Cys Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 28 Arg Gly Asp Gln Arg Ala Ala Arg Glu Cys Asn Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 29 Gly Asp Gln Arg Cys Ala Ala Glu Cys Asn Ser Pro 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 30 Asp Gln Arg Cys Asp Ala Ala Cys Asn Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 31 Gln Arg Cys Asp Arg Ala Ala Asn Ser Pro Gly Cys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 32 Arg Cys Asp Arg Glu Ala Ala Ser Pro Gly Cys Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 33 Cys Asp Arg Glu Cys Ala Ala Pro Gly Cys Gly Trp 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 34 Asp Arg Glu Cys Asn Ala Ala Gly Cys Gly Trp Asp 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 35 Arg Glu Cys Asn Ser Ala Ala Cys Gly Trp Asp Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 36 Glu Cys Asn Ser Pro Ala Ala Gly Trp Asp Gly Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ALANINE PEPTIDE SCANNING PEPTIDE (FIGURE 11) <400> 37 Cys Asn Ser Pro Gly Ala Ala Trp Asp Gly Gly Asp 1 5 10

Claims (37)

  1. 서열 2에 제시된 아미노산 서열과의 동일률이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 ("VH") 서열.
  2. 제1항에 있어서, 불변 영역을 추가로 포함하는 VH 영역.
  3. 제2항에 있어서, 불변 영역의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 VH 영역.
  4. 제2항에 있어서, 불변 영역이 IgG 항체로부터 유래되는 VH 영역.
  5. 제4항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체인 VH 영역.
  6. 서열 3에 제시된 아미노산 서열과의 동일률이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 ("VL") 서열.
  7. 제6항에 있어서, 불변 영역을 추가로 포함하는 VL 영역.
  8. 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 포함하는 VH 서열.
  9. 서열 7, 서열 8 및 서열 9를 포함하는 VL 서열.
  10. 제1항 또는 제6항의 가변 중쇄 서열 및/또는 가변 경쇄 서열을 암호화하는 핵산.
  11. 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8 또는 서열 9 중의 하나 이상을 암호화하는 핵산.
  12. 제10항 또는 제11항의 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제12항의 벡터를 포함하는 세포.
  14. Notch3과 특이적으로 결합하는, 제1항의 VH 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  15. Notch3과 특이적으로 결합하는, 제6항의 VL 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  16. 제13항에 있어서, 제6항의 VL 영역을 추가로 포함하는 항체.
  17. 제15항에 있어서, VL 영역이 서열 3을 포함하고, VH 영역이 서열 2를 포함하는 항체.
  18. Notch3과 특이적으로 결합하는, 제6항의 VL 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  19. 제17항에 있어서, 제1항의 VH를 추가로 포함하는 항체.
  20. 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 포함하는 항체.
  21. 제20항에 있어서, 서열 7, 서열 8 및 서열 9를 추가로 포함하는 항체.
  22. 제14항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 단일 쇄 Fv인 항체.
  23. 제14항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 항체.
  24. 제13항의 세포를, 항체 생성을 위해 적당한 조건 하에 배양하고, 이로써 생성된 항체를 단리시키는 것을 포함하는, 항체의 생성 방법.
  25. 약물을 제조하는 데에 있어서의, 제14항 내지 제22항 또는 제24항 중의 어느 한 항의 항체의 용도.
  26. Notch3 관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 제14항 내지 제22항 또는 제24항 중의 어느 한 항의 항체의 용도.
  27. 제26항에 있어서, 질환이 신경변성 질환인 용도.
  28. 제26항에 있어서, 질환이 CADASIL, 가족성 편마비성 편두통 (FHM), 가족성 발작성 운동실조, 또는 알라질 (Alagille) 증후군인 용도.
  29. Notch3 관련 질환을 탐지하기 위한, 제23항에 따르는 항체의 용도.
  30. 서열 10을 포함하는 Notch3 결합성 에피토프.
  31. 서열 11을 포함하는 Notch3 결합성 에피토프.
  32. 제30항 또는 제31항의 에피토프와 결합하는 항체.
  33. 제32항에 있어서, 작동제인 항체.
  34. 제33항에 있어서, 서열 2 및 서열 3을 포함하는 항체.
  35. 제33항에 있어서, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8 및 서열 9를 포함하는 항체.
  36. 제14항 내지 제22항 또는 제32항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  37. Notch3 관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 제36항의 조성물의 용도.
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