CN113316458A - 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂 - Google Patents

抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN113316458A
CN113316458A CN201980088309.1A CN201980088309A CN113316458A CN 113316458 A CN113316458 A CN 113316458A CN 201980088309 A CN201980088309 A CN 201980088309A CN 113316458 A CN113316458 A CN 113316458A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
formulation
lag
seq
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980088309.1A
Other languages
English (en)
Inventor
V·安托楚舒克
P·G·德赛
Y·克里希纳马查里
S·S·桑加尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Sharp and Dohme BV
Original Assignee
MERCK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MERCK filed Critical MERCK
Publication of CN113316458A publication Critical patent/CN113316458A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了抗PD‑1抗体和抗LAG3抗体的共制剂，及其在治疗各种病症中的用途。

Description

抗LAG3抗体和抗PD-1抗体的共制剂
发明领域
本发明总体涉及治疗性抗体的制剂，及其在治疗各种病症中的用途。
发明背景
抗体的恒定结构域的氨基酸序列或其可变结构域内的框架序列可能略有不同，但是通常，它们的CDR序列差异最显著。甚至结合相同蛋白、相同多肽或甚至潜在相同表位的抗体可包含完全不同的CDR序列。用于人类中的治疗性抗体也可从人种系抗体序列或非人(例如啮齿动物)种系抗体序列获得，例如在人源化抗体中，导致潜在序列的又进一步多样性。这些序列差异可能导致溶液中潜在不同的稳定性和对溶液参数不同的响应性。此外，氨基酸排列的小变化或一个或几个氨基酸残基的变化可导致显著不同的抗体稳定性和对序列特异性降解途径的敏感性。因此，目前不可能预测优化抗体稳定性所必需的溶液条件。必须单独研究每种抗体以确定最佳溶液制剂。Bhambhani等人(2012) J. Pharm. Sci. 101:1120。
抗体也是相当大的蛋白(~150,000 Da)，例如与其他治疗性蛋白如激素和细胞因子相比。抗体药物在储存期间必须是稳定的，以确保功效和一致的给药，因此关键的是，无论选择什么制剂都支持期望的特性，例如高浓度、澄清度和可接受的粘度，并且还在典型储存条件下在可接受的长保存期内保持这些特性和药物功效。
LAG3 (CD223)是在活化的T细胞(Huard等人，Immunogenetics 39: 213–217,1994)、NK细胞(Triebel等人，J Exp Med 171: 1393–1405, 1990)、B细胞(Kisielow等人，Eur J Immunol 35: 2081–2088, 2005)和浆细胞样树突细胞(Workman等人，J Immunol182: 1885–1891, 2009)上表达的细胞表面分子，其在这些淋巴细胞亚群的功能中发挥重要作用。此外，认为LAG3和其主要配体II类MHC之间的相互相用在调节树突状细胞功能中发挥作用(Andreae等人 J Immunol 168: 3874–3880, 2002)。近期的临床前研究已记载了LAG-3在CD8 T细胞耗竭中的作用(Blackburn等人 Nat Immunol 10: 29–37, 2009)。
如同慢性病毒感染，肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞展现受损的效应子功能和耗竭的表型，其特征在于促炎细胞因子的产生减少和对抗原再刺激的低应答性。这由细胞外源性机制(例如调节T细胞(Treg))和细胞内源性机制(例如在耗竭的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上上调的抑制性分子)介导。这些抑制性机制代表了对有效抗肿瘤免疫的强大的障碍。
LAG3在耐受的TIL上表达，表明其促成肿瘤介导的免疫抑制。LAG3的抑制可以导致抗原特异性T细胞的活化增强，由此可以获得治疗益处。
PD-1被视为在免疫调节以及在外周耐受性的维持中的重要分子。PD-1在初始T、B和NKT细胞上适度表达，并通过淋巴细胞、单核细胞和髓系细胞上的T/B细胞受体信号传导上调。PD-1、PD-L1 (B7-H1)和PD-L2 (B7-DC)的两种已知配体在起源于不同组织的人癌症中表达。在例如卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤的大样品集合中，显示了PD-L1表达与不良预后和降低的总存活率相关，不论后续治疗如何。类似地，发现在肿瘤浸润性淋巴细胞上的PD-1表达标志了乳腺癌和黑色素瘤中的功能障碍性T细胞并与肾癌中的不良预后有关。因而，已经提出，表达PD-L1的肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞相互作用以减弱T细胞活化和免疫监视的逃避，由此导致针对肿瘤的受损的免疫应答。
几种抑制PD-1及其配体PD-L1和PD-L2中的一个或两个之间的相互作用的单克隆抗体被FDA批准用于治疗癌症。已经提出，如果与其他经批准的或实验中的癌症疗法(例如，辐射、外科手术、化学治疗剂、靶向疗法、抑制在肿瘤中失调的其他信号传导途径的药剂和其他免疫增强剂)联合施用，可能增强此类抗体的功效。
因此，存在对于抗LAG3抗体和抗PD-1抗体的稳定共制剂的需要。此类稳定制剂优选在典型用于储存自我施用的药物的条件下，即在注射器中的冷藏温度下，将表现出超过数月至数年的稳定性，导致相应药物产物的长保存期。
发明概述
本发明提供了抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段的共制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含：约16-22 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约3-7 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段；约30-120 mg/mL的非还原性二糖；约0.02-2.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；pH为约4.5-6.5的缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐，其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ IDNO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2和SEQID NO:44的CDRH3，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。在一个实施方案中，所述制剂进一步包含约5-15或约5-10 mM L-甲硫氨酸。令人惊讶地，所述抗LAG3/抗PD-1共制剂显示比单独抗体制剂更好的稳定性。所述制剂可以被冻干用于重构或呈液体形式。
在本发明的另一个方面，所述制剂包含：摩尔比为4:1至5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的约3-300 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约3-300mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，总赋形剂浓度为约10-1000 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂，以及pH为约5-8的缓冲剂。
本发明还提供了治疗癌症或感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用重构的或液体的制剂(溶液制剂)。在进一步实施方案中，所述制剂用于治疗慢性感染中。还考虑溶液或冻干制剂在制备用于治疗癌症或感染的药物中的用途。
附图简述
图1：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的Ab6酸性变体。
图2：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的Ab6主要种类。
图3：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的Ab6碱性变体。
图4：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的MK-3475酸性变体。
图5：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的MK-3475主要种类。
图6：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HP-IEX稳定性数据的MK-3475碱性变体。
图7：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过UP-SEC稳定性数据的高分子量种类。
图8：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过UP-SEC稳定性数据的单体。
图9：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过非还原CE-SDS稳定性数据的完整IgG。
图10：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过非还原CE-SDS稳定性数据的总低分子量种类。
图11：显示色氨酸表面暴露的抗LAG3抗体Ab6的同源性模型。Trp102是如通过使用同源性模型计算的可及表面积(85.25Å2)测量的暴露表面。
图12：在pH 5.6的10mM组氨酸缓冲剂中，在盐(50mM NaCl)存在的情况下和在L-精氨酸盐酸盐(40mM)存在的情况下的抗LAG3抗体Ab6的自身相互作用(KD)的降低和胶体稳定性(OD350)和相对溶解度(%PEG中点(%PEGmid-point))的改善。
图13：L-精氨酸盐酸盐对10mM组氨酸缓冲剂(pH 5.8和pH 6.0)中的抗LAG3抗体Ab6的扩散相互作用参数(KD)和浊度(50mg/mL时的OD350)的影响。
图14：抗LAG3抗体Ab6 pH范围研究(5.3至6.4)。
图15：在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下，抗LAG3抗体Ab6 (25mg/mL，在pH 5.8的10mM L-组氨酸中)的扩散相互作用参数(kD)。
图16：在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下，抗LAG3抗体Ab6 (25mg/mL，在pH 5.8的10mM L-组氨酸中)的相对溶解度。
图17：在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下，抗LAG3抗体Ab6 (25mg/mL，在pH 5.8的10mM L-组氨酸中)的带电荷种类的变化百分比。
图18：使用第二维里系数(B22)测量优化含有L-精氨酸、氯化钠或其混合物的于pH5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂中的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6 制剂。
图19：在L-精氨酸、氯化钠或其混合物存在的情况下，在pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂中的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6 制剂的胶体稳定性(OD350)。
图20：在L-精氨酸、氯化钠或其混合物存在的情况下，在pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂中的抗LAG3抗体Ab6 (60mg/mL)的粘度。
图21：在L-精氨酸、氯化钠或其混合物存在的情况下，在pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂中的抗LAG3抗体Ab6 (25mg/mL)的重量摩尔渗透压浓度。
图22：在40℃和25℃储存条件下，抗LAG3抗体Ab6制剂(F1-F6)随时间的浊度分析。
图23：在40℃储存条件下，抗LAG3抗体Ab6制剂(F1-F6)随时间的混合模式色谱分析。对于制剂F1-F6，对每种mAb (抗LAG3和抗PD-1)的单体百分比随时间的变化作图。
图24：在具有2.5%至9%稳定剂的70mM L-精氨酸盐酸盐或具有2.5%至9.0%稳定剂的70mM氯化钠存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体制剂Ab6 (pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂)的高分子量(HMW)种类、单体和低分子量(LMW)种类的变化百分比。
图25：在具有2.5%至9%稳定剂的70mM L-精氨酸盐酸盐或具有2.5%至9.0%稳定剂的70mM氯化钠存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂)的带电荷种类的变化百分比。
图26：在具有2.5%至9%稳定剂的70mM L-精氨酸或具有2.5%至9.0%稳定剂的70mM氯化钠存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM pH 5.8的L-组氨酸)的Tm1、Tm2和T开始。
图27：在搅拌应力下，在不同浓度的聚山梨酯80存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸、5% w/v蔗糖，pH 5.8)的胶体稳定性(OD350)。
图28：在搅拌应力下，在不同浓度的聚山梨酯80存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(pH 5.8的10mM L-组氨酸缓冲剂、70mM L-精氨酸盐酸盐、5% w/v蔗糖)的高分子量(HMW)种类、单体和低分子量(LMW)种类的变化百分比。
图29：在搅拌应力下，在不同浓度的聚山梨酯80存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸、5% w/v蔗糖，pH 5.8)的带电荷种类的变化百分比。
图30：单独的和在递增浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸、5% w/v蔗糖，pH 5.8)的胶体稳定性(OD350)。
图31：单独的和在递增浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸，5% w/v蔗糖，pH 5.8)的高分子量(HMW)种类和单体的变化百分比。
图32：单独的和在递增浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸、5% w/v蔗糖，pH 5.8)的带电荷种类的变化百分比。
图33：单独的和在递增浓度的L-甲硫氨酸存在的情况下的25mg/mL抗LAG3抗体Ab6制剂(10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸、5% w/v蔗糖，pH 5.8)的氧化变化百分比。
图34：在pH 5.8的10mM缓冲剂与70mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下(单独和在不同稳定剂存在的情况下)，200mg/mL抗LAG3抗体Ab6的浊度(OD350)变化百分比。
图35：在pH 5.8的10mM缓冲剂与70mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下(单独和在不同稳定剂存在的情况下)，200mg/mL抗LAG3抗体Ab6的高分子量(HMW)种类、单体和低分子量(LMW)种类的变化百分比。
图36：在pH 5.8的10mM缓冲剂与70mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下(单独和在不同稳定剂存在的情况下)，200mg/mL抗LAG3抗体Ab6的带电荷种类的变化百分比。
图37：在40至70mM盐(氯化钠)和20至70mM氨基酸(单独以及某些组合)存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6的浊度(OD350)变化百分比。
图38：在40至70mM盐(氯化钠)和20至70mM氨基酸(单独以及某些组合)存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6的高分子量(HMW)种类、单体和低分子量(LMW)种类的变化百分比。
图39：在40至70mM盐(氯化钠)和20至70mM氨基酸(单独以及某些组合)存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6的带电荷种类的变化百分比。
图40：在40至70mM盐(氯化钠)和20至70mM氨基酸(单独以及一些组合)存在的情况下，25mg/mL抗LAG3抗体Ab6的流体动力学直径的变化百分比。
图41：在5℃、40℃或50℃下，关于%高分子量种类(HMW)的抗LAG3抗体Ab6和抗PD-1抗体MK-3475共制剂10-天(10D)聚集筛选研究。
图42：在5℃、40℃或50℃下，关于%主峰(单体)的抗LAG3抗体Ab6和抗PD-1抗体MK-3475共制剂10-天(10D)聚集筛选研究。
图43：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过还原的CE-SDS稳定性数据的重链+轻链。
图44：Ab6A产物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过还原的CE-SDS稳定性数据的总杂质。
图45：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下通过HIC稳定性数据的MK-3475总前峰。
图46：Ab6A药物产品在5℃、25℃和40℃储存条件下的浊度A350稳定性数据。
图47：从Ab6A药物产品全刻度(上图)和扩展刻度(下图)获得的代表性电荷概况图谱。
图48：DOPA产物的氧化和荧光标记后获得的荧光信号。在进行AAPH氧化和ABS标记反应之前，将单一实体和共制剂溶液在室温下孵育72小时的时段。
图49：在精氨酸和PS80存在和不存在的情况下，MK-3475和Ab6的共制剂溶液的FRET测量的实例。实验数据(圆圈)。非线性拟合(线)。
图50：在相同制剂基质中，在25℃下热应激的Ab6A和MK-3475制剂样品中通过HIC-SEC测定的M105氧化水平的比较。
图51：在相同制剂基质中，在40℃下热应激的Ab6A和MK-3475制剂样品中通过HIC-SEC测定的M105氧化水平的比较。
详述
如本文所用，包括所附权利要求书，词语的单数形式如"一(a)"、"一(an)"和"所述(the)"包括它们相应的复数指代，除非上下文另外清楚地指明。除非另有说明，否则本文所指的蛋白和受试者是人蛋白和人受试者，而不是另一物种的蛋白和受试者。
定义
如本文所用，除非另有说明，否则"抗原结合片段"是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。
"Fab片段"由一条轻链和一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。"Fab片段"可以是抗体的木瓜蛋白酶切割产物。
"Fc"区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
"Fab'片段"含有一条轻链和一条重链的一部分或片段，所述重链含有VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
"F(ab')2片段"含有两条轻链和两条重链，所述重链含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此F(ab')2片段由两个Fab'片段构成，这两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。"F(ab')2片段"可以是抗体的胃蛋白酶切割产物。
"Fv区"包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。
如本文所用，术语"高变区"是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34 (CDRL1)、50-56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)和重链可变结构域中的残基31-35 (CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102 (CDRH3))(Kabat等人，(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版. Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)和/或来自"高变环"的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的残基26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3))(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)。如本文所用，术语"框架"或"FR"残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基以外的那些可变结构域残基。上面的残基编号与Kabat编号系统有关，并且不必须与随附的序列表中的序列编号详细对应。
"增殖活性"包括促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成，对以上是必需的或与其特异性相关的活性。
术语"癌症"、"肿瘤"、"癌性"和"恶性"是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理病况。癌症的实例包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)如肝癌(hepatic carcinoma)和肝细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌如肾细胞癌和维尔姆斯瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌和各种类型的头颈癌。
随着癌细胞生长和繁殖，它们形成大量癌组织，即肿瘤，其侵入并破坏正常的邻近组织。恶性肿瘤是癌症。恶性肿瘤通常可以被去除，但是它们可以生长回来。来自恶性肿瘤的细胞可侵入并损害附近的组织和器官。此外，癌细胞可以脱离恶性肿瘤并进入血流或淋巴系统，这是癌细胞从原发肿瘤(即，原始癌症)扩散以在其他器官中形成新肿瘤的方式。癌症在体内的扩散称为转移(What You Need to Know About Cancer- an Overview，NIH出版号00-1566；2000年9月26日发布，2002年9月16日更新(2002))。
如本文所用，术语"实体瘤"是指通常不含有囊肿或液体区域的组织的异常生长或块。实体瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的(癌性的)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不形成实体瘤(国家癌症研究所(National Cancer Institute)，癌症术语词典(Dictionary of CancerTerms))。
如本文所用，术语"癌"是指上皮细胞的癌，所述上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素并组成腺体的细胞。癌的实例是皮肤癌、肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
药物组合物定义
如本文所用，"水性"药物组合物是适于药用的组合物，其中水性载体是无菌注射用水。适于药用的组合物可以是无菌的、均质的和/或等渗的。在某些实施方案中，本发明的水性药物组合物适合于肠胃外施用于人受试者。在一个具体实施方案中，本发明的水性药物组合物适合于静脉内和/或皮下施用。
当修饰物质或组合物的量(例如，mM或M)、制剂组分的百分比(v/v或w/v)、溶液/制剂的pH或表征方法步骤的参数的值等时，术语"约"是指例如通过在物质或组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和取样程序；通过这些程序中的仪器误差；通过用于制备或使用组合物或实施所述程序的成分的制造、来源或纯度的差异；等等而可能发生的数值量的变化。在某些实施方案中，"约"可指±0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或10%的变化。
如本文所用，"x% (w/v)"等于x g/100ml (例如5% w/v等于50mg/ml)。
术语"缓冲剂"包括在冻干之前和/或重构之后将液体制剂中的溶液pH维持在可接受范围内的那些试剂，并且可以包括但不限于琥珀酸盐(琥珀酸钠或琥珀酸钾)、组氨酸、乙酸盐、磷酸盐(磷酸钠或磷酸钾)、Tris (三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(柠檬酸钠)等。
如本文所用，"共配制的(Co-formulated)"或"共制剂(co-formulation或coformulation)"或"共配制的(coformulated)"是指至少两种不同的抗体或其抗原结合片段，其配制在一起并作为组合产品储存在单个小瓶或容器(例如注射装置)中，而不是单独配制和储存，且然后在施用前混合或单独施用。在一个实施方案中，所述共制剂含有两种不同的抗体或其抗原结合片段。
"二醇"是指具有两个羟基的烷基。
"糖醇"是指衍生自糖，并且具有通式HOCH2(CHOH)nCH2OH，n =1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的多元醇。实例包括但不限于甘露醇、山梨醇、赤藓醇、木糖醇和甘油。
如本文所用，"多元醇"包括二醇和糖醇。
术语"冻干"、"冻干的"和"冷冻干燥的"是指首先冷冻待干燥的材料，且然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻溶剂的过程。在预冻干制剂中可以包括赋形剂以增强冻干产品在储存后的稳定性。
"非还原糖"是不能用作还原剂的糖，因为它不含或不能被转化成含有游离醛基或游离酮基。非还原糖的实例包括但不限于二糖类，例如蔗糖和海藻糖。
术语"药物制剂"是指这样的制剂，其以允许活性成分有效的此类形式存在，并且其不包含对将施用所述制剂的受试者有毒的另外的组分。
"药学上可接受的"赋形剂(载体、添加剂)是可以合理地施用于哺乳动物受试者以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
"重构时间"是用溶液将冻干制剂再水合为无颗粒的澄清溶液所需的时间。
"稳定的"制剂是其中的蛋白在储存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs. (1991)和Jones，A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)中综述。可以在选定温度下在选定时间段内测量稳定性。例如，在一个实施方案中，稳定制剂是在冷藏温度(2-8℃)下至少12个月未观察到显著变化的制剂。在另一个实施方案中，稳定制剂是在冷藏温度(2-8℃)下至少18个月没有观察到显著变化的制剂。在另一个实施方案中，稳定制剂是在室温(23-27℃)下至少3个月没有观察到显著变化的制剂。在另一个实施方案中，稳定制剂是在室温(23-27℃)下至少6个月没有观察到显著变化的制剂。在另一个实施方案中，稳定制剂是在室温(23-27℃)下至少12个月没有观察到显著变化的制剂。在另一个实施方案中，稳定制剂是在室温(23-27℃)下至少18个月没有观察到显著变化的制剂。抗体制剂的稳定性标准如下。通常，如通过SEC-HPLC所测量的，不超过10%、优选不超过5%的抗体单体降解。通常，通过目视分析，制剂是无色的、或澄清至微乳白色的。通常，制剂的浓度、pH和重量摩尔渗透压浓度变化不超过+/-10%。效价典型在对照或参考的60-140%内，优选80-120%内。通常，观察到不超过10%、优选不超过5%的抗体截短，即，例如通过HP-SEC测定的%低分子量种类。通常，或形成不超过10%、优选不超过5%的抗体聚集，即例如通过HP-SEC测定的%高分子量种类。
"表面活性剂"是一种两亲性质的表面活性剂。
如果在目视检查颜色和/或透明度后，或通过UV光散射、尺寸排阻色谱(SEC)和动态光散射测量，抗体没有显示聚集、沉淀和/或变性的显著增加，则其在药物制剂中"保持其物理稳定性"。蛋白构象的变化可以通过测定蛋白三级结构的荧光光谱，和通过测定蛋白二级结构的FTIR光谱来评估。
如果抗体没有显示显著的化学变化，则它在药物制剂中"保持其化学稳定性"。化学稳定性可以通过检测和定量化学改变形式的蛋白来评价。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过方法如尺寸排阻色谱和SDS-PAGE评估)、氧化(通过方法如肽作图结合质谱或MALDI/TOF/MS评估)、脱酰胺(通过方法如离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽作图、异天冬氨酸测量评估)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽作图等评估)。
如果抗体在给定时间框内的生物学活性在制剂制备时表现出的生物学活性的预定范围内，则抗体在药物制剂中"保持其生物学活性"。抗体的生物学活性可以例如通过抗原结合测定来确定。在一个实施方案中，稳定的抗体制剂在12个月内的生物学活性在参考的60-140%内。
术语"等渗"是指目标制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约270-328mOsm的渗透压。微低渗压为250-269，且微高渗压为328-350 mOsm。渗透压可以例如使用蒸气压或冰冻型渗压计来测量。
"重构"制剂是通过将冻干的蛋白制剂溶解在稀释剂中、使得蛋白分散在重构制剂中而制备的制剂。重构的制剂适于施用(例如肠胃外施用)，并且可以任选地适于皮下施用。
“总赋形剂浓度”是指参考的可离子化赋形剂(例如组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐，NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2)的摩尔浓度的总和，其不考虑作为缓冲剂物质参考的赋形剂的浓度。
当提到pH值范围时，例如"pH 5.0-6.0的pH"，该范围旨在包括所提到的值。pH通常在25℃下使用标准玻璃灯泡pH计测量。如本文所用，包含"pH X的组氨酸缓冲剂"的溶液是指pH X且包含组氨酸缓冲剂的溶液，即pH旨在指溶液的pH。
分析方法
适于评估产物稳定性的分析方法包括尺寸排阻色谱(SEC)、动态光散射试验(DLS)、差示扫描量热法(DSC)、异天冬氨酸(iso-asp)定量、效价、350nm的 UV、UV光谱和FTIR。SEC (J. Pharm. Scien.，83:1645-1650，(1994)；Pharm. Res.，11:485 (1994)；J. Pharm. Bio. Anal.，15:1928 (1997)；J. Pharm. Bio. Anal.，14:1133-1140 (1986)) 测量产品中单体的百分比并给出有关可溶性聚集体数量的信息。DSC (Pharm. Res.，15:200(1998)；Pharm. Res.，9:109 (1982))给出蛋白变性温度和玻璃化转变温度的信息。DLS(American Lab.，November (1991))测量平均扩散系数，并给出可溶性和不溶性聚集体的量的信息。340 nm处的UV测量340 nm处的散射光强度，并给出关于可溶性和不溶性聚集体的量的信息。UV光谱测量278 nm处的吸光度，并给出蛋白浓度的信息。FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm.，45:231 (1998)；Pharm. Res.，12:1250 (1995)；J. Pharm. Scien.，85:1290 (1996)；J. Pharm. Scien.，87:1069 (1998))测量酰胺一区的IR光谱，并给出蛋白二级结构的信息。
使用Isoquant异天冬氨酸检测系统(Promega)测量样品中异天冬氨酸的含量。该试剂盒使用酶蛋白异天冬氨酰甲基转移酶(PIMT)特异性检测靶蛋白中异天冬氨酸残基的存在。PIMT催化甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸向异天冬氨酸的α-羧基位置的转移，在此过程中生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。这是相对小的分子，并且通常可以使用试剂盒中提供的SAH HPLC标准品通过反相HPLC来分离和定量。
抗体的效价或生物身份(bioidentity)可以通过其结合其抗原的能力来测量。抗体与其抗原的特异性结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法定量，例如免疫测定，如ELISA (酶联免疫吸附测定)。
抗LAG3抗体
CDR氨基酸残基在不同抗体之间高度可变，并且可以源自人种系序列(在完全人抗体的情况下)，或源自非人(例如啮齿动物)种系序列。框架区也可在抗体与抗体之间显著不同。恒定区的不同将取决于所选抗体具有λ还是κ轻链，以及取决于抗体的类(或同种型)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
下面举例说明的LAG3抗体具有源自非人(在该情况下为小鼠)种系序列或人种系序列的CDR序列。种系序列包括衍生出抗体CDR序列的序列库(sequence repertoire)，除了源自体细胞超突变来源的之外，并且因此预期从小鼠种系开始获得的CDR将系统地不同于从人种系开始的那些CDR。基于来自人种系的CDR序列在人体中的免疫原性低于源自其他物种的那些，人种系序列的使用通常被证明是合理的，这反映了CDR将根据其起源物种而系统性地不同的基本信念。尽管CDR多样性的增加增加了发现具有所需特性如高亲和性的抗体的可能性，但它进一步放大了开发所得抗体的稳定溶液制剂的困难。
甚至与相同抗原结合的抗体在序列上也可显著不同，并且与针对完全分开的抗原的抗体相比，在序列上不一定更紧密相关。基于低序列相似性，不能推测抗体的化学特性和因此它们对降解的敏感性是相似的，尽管它们共享靶。
如上所讨论的，抗体是大的、高度复杂的多肽复合物，其在溶液中经受各种形式的降解和不稳定性。抗体的序列多样性以及由此的结构多样性产生了广泛的化学特性。除了抗原结合特异性中明显的序列特异性差异之外，抗体表现出对各种降解途径、聚集和沉淀的不同易感性。氨基酸侧链的区别在于存在或不存在反应性基团，如羧基-(D，E)、氨基-(K)、酰胺- (N，Q)、羟基- (S，T，Y)、巯基- (C)、硫醚- (M)基团，以及组氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸残基上的潜在化学反应性位点。直接参与抗原结合相互作用的氨基酸侧链是通过侧链修饰而失活的明显候选物，但在其他位置的降解也可影响因素如CDR的空间取向(例如框架残基的变化)、效应子功能(例如Fc区的变化-参见例如Liu等人，(2008) Biochemistry 47:5088)或自缔合/聚集。
抗体经受任何数量的潜在降解途径。如果抗体中，特别是CDR中的甲硫氨酸残基的氧化破坏抗原结合，则它可能是一个问题。Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116: 731；Lam等人，(1997) J. Pharm. Sci. 86:1250。其他潜在的降解途径包括天冬酰胺脱酰胺(Harris等人，(2001) Chromatogr.，B 752:233；Vlasak等人，(2009) Anal. Biochem. 392:145)、色氨酸氧化(Wei等人，(2007) Anal. Chem. 79:2797)、半胱氨酸化(Banks等人，(2008) J. Pharm. Sci. 97:775)、糖化(Brady等人，(2007) Anal. Chem.79:9403)、焦谷氨酸形成(Yu等人，(2006) J. Pharm. Biomed. Anal. 42:455)、二硫化物重排(Liu等人，(2008) J. Biol. Chem. 283:29266)和水解(Davagnino等人，(1995) J. Immunol. Methods 185:177)。Ionescu & Vlasak (2010) Anal. Chem. 82:3198中进行了讨论。也参见Liu等人，(2008) J. Pharm. Sci. 97:2426。一些潜在的降解途径不仅依赖于特定氨基酸残基的存在，而且依赖于周围序列。脱酰胺和异天冬氨酸形成可由N或D残基后(C-末端)的肽键的自发分子内重排引起，其中N-G和D-G序列特别敏感。Reissner & Aswad(2003) CMLS Cell. Mol. Life Sci. 60:1281。
抗体在储存期间也经受序列依赖性非酶促片段化。Vlasak & Ionescu (2011)mAbs 3:253。反应性侧链如D、G、S、T、C或N的存在可导致切断多肽骨架的分子内切割反应。这种序列特异性水解反应典型取决于pH。同上。抗体也可能发生序列依赖性聚集，例如当CDR包括大量疏水残基时。Perchiacca等人，(2012) Prot. Eng. Des. Selection 25:591。聚集对于需要以高浓度配制用于皮下施用的抗体是特别成问题的，并且甚至已经导致一些通过添加带电残基以增加溶解度来修饰抗体序列。同上。
抗体潜在的序列特异性稳定性问题的多样性反映了，潜在的抗体制剂也是多样的。抗体的序列可变性导致所得抗体的化学异质性，这导致广泛的潜在降解途径。制剂可以在例如抗体浓度、缓冲剂、pH、表面活性剂的存在或不存在、张度剂(离子或非离子)的存在或不存在、分子拥挤剂的存在或不存在方面变化。市售的治疗性抗体以在磷酸盐缓冲剂(例如阿达木单抗)、磷酸盐/甘氨酸缓冲剂(例如巴利珠单抗)、Tris缓冲剂(例如伊匹单抗)、组氨酸(例如优妥木单抗)、柠檬酸钠(例如利妥昔单抗)中；并且从pH 4.7 (例如赛妥珠单抗)和pH 5.2 (例如阿达木单抗)至pH 7.0-7.4 (例如西妥昔单抗)的各种溶液制剂销售。它们也可以制剂的形式获得，所述制剂任选地含有依地酸二钠(例如阿仑单抗)、甘露醇(例如伊匹单抗)、山梨醇(例如戈利木单抗)、蔗糖(例如乌斯坦单抗)、氯化钠(例如利妥昔单抗)、氯化钾(例如阿仑单抗)和海藻糖(例如雷珠单抗)；所有都有和没有聚山梨酯-80，范围从0.001% (例如阿昔单抗)至0.1% (例如阿达木单抗)。
人源化抗LAG3和抗PD-1抗体的生物学活性
本发明的制剂包括重构或在液体制剂中时具有生物学活性的抗LAG3抗体及其片段和抗PD-1抗体及其片段。
示例性抗LAG3抗体提供如下(公开于WO2016/028672中，其整体通过引用并入本文)：
· Ab1：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 828976DEST_PATH_IMAGE001
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 746116DEST_PATH_IMAGE002
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 588170DEST_PATH_IMAGE003
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 983380DEST_PATH_IMAGE004
或包含CDR：
Figure 797752DEST_PATH_IMAGE005
· Ab2：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 682531DEST_PATH_IMAGE006
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 949565DEST_PATH_IMAGE007
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 148465DEST_PATH_IMAGE008
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 879660DEST_PATH_IMAGE009
或包含CDR：
Figure 873024DEST_PATH_IMAGE010
· Ab3：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 627353DEST_PATH_IMAGE011
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 426682DEST_PATH_IMAGE012
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 950067DEST_PATH_IMAGE013
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 379912DEST_PATH_IMAGE014
或包含CDR：
Figure 621537DEST_PATH_IMAGE015
Figure 979486DEST_PATH_IMAGE016
· Ab4：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 622956DEST_PATH_IMAGE017
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 958123DEST_PATH_IMAGE018
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 749361DEST_PATH_IMAGE019
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 828176DEST_PATH_IMAGE020
或包含CDR：
Figure 326153DEST_PATH_IMAGE021
· Ab5：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 160117DEST_PATH_IMAGE022
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 110756DEST_PATH_IMAGE023
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 993261DEST_PATH_IMAGE024
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 345745DEST_PATH_IMAGE025
或包含CDR：
Figure 350610DEST_PATH_IMAGE026
· Ab6：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 788544DEST_PATH_IMAGE027
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 209162DEST_PATH_IMAGE028
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 744048DEST_PATH_IMAGE029
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 857498DEST_PATH_IMAGE030
或包含CDR：
Figure 782728DEST_PATH_IMAGE031
· Ab7：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 69353DEST_PATH_IMAGE032
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 130850DEST_PATH_IMAGE033
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 415201DEST_PATH_IMAGE034
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 827728DEST_PATH_IMAGE035
或包含CDR：
Figure 918043DEST_PATH_IMAGE036
Figure 99626DEST_PATH_IMAGE037
· Ab8：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 289299DEST_PATH_IMAGE038
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 251439DEST_PATH_IMAGE039
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 817549DEST_PATH_IMAGE040
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 119218DEST_PATH_IMAGE041
或包含CDR：
Figure 545038DEST_PATH_IMAGE042
· Ab9：一种轻链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 932157DEST_PATH_IMAGE043
一种重链免疫球蛋白，其包含以下氨基酸序列：
Figure 301959DEST_PATH_IMAGE044
一种轻链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 254871DEST_PATH_IMAGE045
一种重链免疫球蛋白可变结构域，其包含以下氨基酸序列：
Figure 51926DEST_PATH_IMAGE046
或包含CDR：
Figure 660762DEST_PATH_IMAGE047
。
如本文所用，“Ab6变体”意指包含重链和轻链序列的单克隆抗体，所述重链和轻链序列与Ab6 (如下和WO2016028672 (通过引用以其整体并入)中所述)中的那些基本上相同，除了具有在位于轻链CDR之外的位置处的3个、2个或1个保守氨基酸取代和位于重链CDR之外的位置处的6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸取代，例如，变体位置位于FR区或恒定区中，且任选地具有重链的C-末端赖氨酸残基的缺失。换句话说，Ab6和Ab6变体包含相同的CDR序列，但是由于分别在其全长轻链和重链序列中的不超过3个或6个其他位置处具有保守氨基酸取代而彼此不同。Ab6变体与Ab6就以下特性而言基本上相同：与人LAG3的结合亲和力和阻断人LAG3与人MHC II类结合的能力。
本发明提供了抗LAG3抗体的制剂，所述抗LAG3抗体包含两条具有SEQ ID NO:35的序列的相同轻链和两条具有SEQ ID NO:36、45、48、51、54、57、60、63或66的序列的相同重链。本发明还提供了抗LAG3抗体的制剂，所述抗LAG3抗体包含两条具有SEQ ID NO:35的序列的相同轻链和两条具有SEQ ID NO:57的序列的相同重链。
本发明提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:37的轻链可变区序列和SEQ ID NO:38、46、49、52、55、58、61、64或67的重链可变区序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:37的轻链可变区序列和SEQ ID NO:58的重链可变区序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQID NO:39的轻链可变区CDRL1序列、SEQ ID NO:40的轻链可变区CDRL2序列和SEQ ID NO:41的轻链可变区CDRL3序列，和SEQ ID NO:42的重链可变区CDRH1序列、SEQ ID NO:43、47、50、53、56、59、62、65或68的重链可变区CDRH2序列和SEQ ID NO:44的重链可变区CDRH3序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的轻链可变区CDRL1序列、SEQ ID NO:40的轻链可变区CDRL2序列和SEQ IDNO:41的轻链可变区CDRL3序列，和SEQ ID NO:42的重链可变区CDRH1序列、SEQ ID NO:59的重链可变区CDRH2序列和SEQ ID NO:44的重链可变区CDRH3序列。
可包括在制剂中的其他抗LAG3抗体包括WO2014008218中公开的BMS-986016；IMP731和IMP701。因此，本发明提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:69的轻链可变区序列和SEQ ID NO:70的重链可变区序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:71的轻链可变区CDRL1序列、SEQ ID NO:72的轻链可变区CDRL2序列和SEQ IDNO:73的轻链可变区CDRL3序列，和SEQ ID NO:74的重链可变区CDRH1序列、SEQ ID NO:75的重链可变区CDRH2序列和SEQ ID NO:76的重链可变区CDRH3序列。
所述制剂进一步包含如下面举例说明的抗PD-1抗体或抗原结合片段。
表1. 示例性PD-1抗体序列
Figure 834254DEST_PATH_IMAGE048
Figure 907252DEST_PATH_IMAGE049
。
表2：可用于本发明的制剂、方法和用途中的额外的抗PD-1抗体和抗原结合片段
Figure 875208DEST_PATH_IMAGE051
Figure 971340DEST_PATH_IMAGE052
如本文所用，“派姆单抗变体”意指包含重链和轻链序列的单克隆抗体，所述重链和轻链序列与派姆单抗中的那些基本上相同，除了具有在位于轻链CDR之外的位置处的3个、2个或1个保守氨基酸取代和位于重链CDR之外的位置处的6个、5个、4个、3个、2个或1个保守氨基酸取代，例如，变体位置位于FR区或恒定区中，且任选地具有重链的C-末端赖氨酸残基的缺失。换句话说，派姆单抗和派姆单抗变体包含相同的CDR序列，但是由于分别在其全长轻链和重链序列中的不超过3个或6个其他位置处具有保守氨基酸取代而彼此不同。派姆单抗变体与派姆单抗就以下特性而言基本上相同：与PD-1的结合亲和力和阻断PD-L1和PD-L2中的每一种与PD-1结合的能力。
在本发明的另一个方面，所述制剂包含抗LAG3抗体或抗原结合片段，其包含SEQID NO:37的轻链可变区序列和SEQ ID NO:58的重链可变区序列；和抗PD-1抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:4的轻链可变区序列和SEQ ID NO:9的重链可变区序列。在另一个实施方案中，所述制剂包含抗LAG3抗体，其包含SEQ ID NO:35的轻链序列和SEQ ID NO:57的重链序列；和抗PD-1抗体，其包含SEQ ID NO:5的轻链序列和SEQ ID NO:10的重链序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体的制剂，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的轻链CDRL1序列、SEQ ID NO:40的轻链CDRL2序列和SEQID NO:41的轻链CDRL3序列，和SEQ ID NO:42的重链CDRH1序列、SEQ ID NO:59的重链CDRH2序列和SEQ ID NO:44的重链CDRH3序列；所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:1的轻链CDRL1序列、SEQ ID NO:2的轻链CDRL2序列和SEQ ID NO:3的轻链CDRL3序列以及SEQ ID NO:6的重链CDRH1序列、SEQ ID NO:7的重链CDRH2序列和SEQ ID NO:8的重链CDRH3序列。在本发明的一些制剂中，所述抗LAG3抗体是Ab6或Ab6变体。
在本发明的另一方面，制剂包含抗LAG3抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:69的轻链可变区序列和SEQ ID NO:70的重链可变区序列，和抗PD-1抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:14的轻链可变区序列和SEQ ID NO:19的重链可变区序列。本发明还提供了抗LAG3抗体或抗原结合片段和抗PD-1抗体或抗原结合片段的制剂，所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:71的轻链可变区CDRL1序列、SEQ ID NO:72的轻链可变区CDRL2序列和SEQ ID NO:73的轻链可变区CDRL3序列以及SEQ ID NO:74的重链可变区CDRH1序列、SEQ ID NO:75的重链可变区CDRH2序列和SEQ ID NO:76的重链可变区CDRH3序列，所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:11的轻链可变区CDRL1序列、SEQ ID NO:12的轻链可变区CDRL2序列和SEQ ID NO:13的轻链可变区CDRL3序列以及SEQ ID NO:16的重链可变区CDRH1序列、SEQ ID NO:17的重链可变区CDRH2序列和SEQ ID NO:18的重链可变区CDRH3序列。
制剂的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变区和重链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4的变体，并且重链可变区包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:9的变体。在另外的实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的变体，并且重链可变区包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的变体。在另外的实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:27的变体，并且轻链可变区包含SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:28的变体，SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:29的变体，或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:30的变体。在这样的实施方案中，变体轻链或重链可变区序列与参考序列相同，除了具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代以外。在一些实施方案中，所述取代位于框架区(即CDR之外)。在一些实施方案中，一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代是保守取代。
在另一个实施方案中，本发明的制剂包含具有VL结构域和/或VH结构域的抗体或抗原结合片段，所述VL结构域和/或VH结构域与上述VL结构域或VH结构域之一具有至少95%、90%、85%、80%、75%或50%的序列同源性，并且表现出与PD-1或LAG3的特异性结合。在另一个实施方案中，本发明制剂的抗体或抗原结合片段包含具有多达1、2、3、4或5个或更多个氨基酸取代的VL和VH结构域，并表现出与PD-1或LAG3的特异性结合。
在本发明的实施方案中，抗体是包含轻链和重链的抗PD-1抗体，所述轻链包含SEQID NO:5中所示的氨基酸残基的序列或由其组成，所述重链包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸残基的序列或由其组成。在替代实施方案中，抗体是包含轻链和重链的抗PD-1抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸残基的序列或由其组成，所述重链包含SEQ IDNO:20中所示的氨基酸残基的序列或由其组成。在其他实施方案中，抗体是包含轻链和重链的抗PD-1抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸残基的序列或由其组成，所述重链包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸残基的序列或由其组成。在其他实施方案中，抗体是包含轻链和重链的抗PD-1抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸残基的序列或由其组成，所述重链包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸残基的序列或由其组成。在其他实施方案中，抗体是包含轻链和重链的抗PD-1抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸残基的序列或由其组成，所述重链包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸残基的序列或由其组成。在本发明的一些制剂中，所述抗PD-1抗体是派姆单抗或派姆单抗变体。
通常，本发明的抗PD-1或抗LAG3抗体和抗原结合片段的氨基酸序列变体将具有与参考抗体或抗原结合片段的氨基酸序列(例如重链、轻链、VH、VL、框架或人源化序列)具有至少75%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，并且最优选至少95%、98或99%。关于序列的同一性或同源性在本文中定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与抗PD-1或抗LAG3残基相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列中的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响序列同一性或同源性。
在一个实施方案中，所述制剂中抗LAG3抗体与抗PD-1抗体的比率为1:1、1:2或1:3。在另一个实施方案中，所述制剂中抗LAG3抗体与抗PD-1抗体的摩尔比为1:1、2:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1或6:1。在一个实施方案中，所述制剂中抗LAG3抗体与抗PD-1抗体的摩尔比为4:1。在另一个实施方案中，所述制剂中抗LAG3抗体与抗PD-1抗体的摩尔比为5:1。
制剂
在本发明的一些方面，本发明的制剂使抗体聚集体(高分子量种类)和颗粒的形成最小化，改善胶体稳定性，使片段化(低分子量种类)最小化，或确保抗体随时间推移保持其生物学活性。在一个方面，所述制剂包含：摩尔比为4:1至5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的约3-300 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约3-300 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，总赋形剂浓度为约10-1000 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂，以及pH为约5-8的缓冲剂。在一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有4:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的摩尔比。在另一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的摩尔比。在另一个方面，所述制剂包含：约4-200 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约4-200 mg/ml的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂的总赋形剂浓度为约25-250mM。在另一个实施方案中，一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂的总赋形剂浓度为约40-250mM。
在一个方面，赋形剂是浓度为约15-250mM的精氨酸或其药学上可接受的盐。在一个方面，赋形剂是浓度为约25-250mM的精氨酸或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，赋形剂是浓度为约40-150mM的精氨酸或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，赋形剂是浓度为约40-100mM的精氨酸或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，赋形剂是浓度为约70mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，赋形剂是浓度为约70-150mM的精氨酸或其药学上可接受的盐。精氨酸(L或D型)的药学上可接受的盐的实例包括但不限于L-精氨酸盐酸盐和L-精氨酸琥珀酸盐。在上述实施方案的其他方面，所述制剂进一步包含非离子表面活性剂、糖或多元醇、或谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。
在另一个方面，赋形剂是总赋形剂浓度为约25-250mM的NaCl和精氨酸或其药学上可接受的盐的组合。在进一步的实施方案中，赋形剂是总赋形剂浓度为约70-100mM的NaCl和精氨酸或其药学上可接受的盐的组合。在一个实施方案中，NaCl与精氨酸的浓度比为1:1。在另一个实施方案中，NaCl浓度为约35mM，且精氨酸浓度为约35mM。在另一个实施方案中，NaCl浓度为约50mM，且精氨酸浓度为约50mM。
在进一步的方面，赋形剂是约40-150mM的NaCl、KCl或LiCl。在进一步的实施方案中，赋形剂是约40-100mM的NaCl、KCl或LiCl。在进一步的实施方案中，赋形剂是约70-130mM的NaCl、KCl或LiCl。在进一步的实施方案中，赋形剂是约70-100mM的NaCl、KCl或LiCl。在进一步的实施方案中，赋形剂是约70mM的NaCl。在上述实施方案的其他方面，所述制剂进一步包含非离子表面活性剂。
在进一步的方面，赋形剂是约25-200mM的L-组氨酸。在进一步的实施方案中，L-组氨酸为约50-200mM。在又进一步的实施方案中，L-组氨酸为约40-100mM。
在进一步的方面，赋形剂为约25-200mM的L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-脯氨酸或L-甲硫氨酸或其组合。在进一步的实施方案中，赋形剂为约50-200mM。在又进一步的实施方案中，赋形剂为约40-100mM。在又进一步的实施方案中，赋形剂为约70mM。
在一个实施方案中，赋形剂为约25-200mM的L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-天冬氨酸或其组合。在另一个实施方案中，赋形剂为约20-50mM。在进一步的实施方案中，赋形剂为约20mM。在又进一步的实施方案中，赋形剂为约40-100mM。在又进一步的实施方案中，赋形剂为约70mM。在另一个实施方案中，赋形剂为约20mM的L-天冬氨酸和约50mM的L-甘氨酸。在另一个实施方案中，赋形剂为约20mM的L-谷氨酰胺和约50mM的L-甘氨酸。
在一个实施方案中，共配制的组合物具有缓冲剂，所述缓冲剂具有中性或弱酸性pH (pH4.5-8)，和精氨酸或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，在组合物中使用pH为约5.5-6.5的缓冲剂。在一个实施方案中，在组合物中使用pH为约4.5-6.5的缓冲剂。在另一个实施方案中，在组合物中使用pH为约5.5-6.0的缓冲剂。在进一步的实施方案中，在组合物中使用pH为约5.0-6.0的缓冲剂。缓冲剂的浓度可为约5-1000mM。在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度可为约5-150mM。在进一步的实施方案中，缓冲剂的浓度可为约5-300mM。在进一步的实施方案中，缓冲剂的浓度为约1-300mM。在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度可为约1-30mM。在又进一步的实施方案中，缓冲剂的浓度可为5-30mM。在又进一步的实施方案中，缓冲剂的浓度可为约5-20mM。在又进一步的实施方案中，缓冲剂的浓度可为约8-12M。在一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐。优选的缓冲剂含有约10mM组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐。
在一个实施方案中，所述制剂包含：摩尔比为4:1至5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的约3-300 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和3-300 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，糖或多元醇；非离子表面活性剂，pH为约4.5-8的组氨酸缓冲剂或乙酸盐缓冲剂，约10-1000 mM精氨酸或其药学上可接受的盐和任选的甲硫氨酸(L或D形式)、EDTA、DTPA、色氨酸(L或D形式)或吡哆醇。在另一个实施方案中，所述制剂包含：摩尔比为4:1至5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的约4-250 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约4-250 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，糖或多元醇；非离子表面活性剂，约50-500 mM的pH为约5-8的组氨酸缓冲剂，约10-1000 mM的选自NaCl、KCl和LiCl的单价阳离子的盐或选自CaCl2、MgCl2、ZnCl2、FeCl2和FeCl3的多价阳离子的盐，任选地约10-1000 mM的精氨酸或其药学上可接受的盐和任选地甲硫氨酸(D或L形式)、EDTA、DTPA、色氨酸和吡哆醇。在另一个方面，所述制剂包含：约4-200 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约4-200 mg/ml的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有4:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的摩尔比。在另一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的摩尔比。
制剂可以包括约1-100 uM、约1-30 uM、约1-20 uM、约10 uM-30 uM的DTPA或EDTA。制剂还可以包括约1-30mM的L-甲硫氨酸。在一个实施方案中，制剂还可以包括约1-20mM的L-甲硫氨酸。制剂还可以包括约5-15mM的L-甲硫氨酸。制剂还可以包括约5-15mM的L-甲硫氨酸。制剂还可以包括约5-20mM的L-甲硫氨酸。制剂还可以包括约10mM或至少约10mM的L-甲硫氨酸。有时，在生产步骤期间和/或在封闭小瓶之前使用氮覆盖(覆盖，例如在氮覆盖后仅5%或10%残余O2)，以针对氧化稳定抗体。
在本发明的另一个方面，所述制剂还包含糖、多元醇或非离子表面活性剂或其组合。在一个实施方案中，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖和乳糖或其组合。在一个实施方案中，糖是二糖，例如蔗糖、海藻糖和麦芽糖。在一个实施方案中，糖是非还原糖。在另一个实施方案中，糖是非还原二糖，例如蔗糖或海藻糖，或其组合。在一个实施方案中，糖的浓度为约10-200mg/ml。在另一个实施方案中，糖的浓度为约30-120mg/ml。在另一个实施方案中，糖的浓度为约30-80mg/ml。在进一步的实施方案中，糖的浓度为约50-90mg/ml。
在一个实施方案中，多元醇选自甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇。在另一个实施方案中，多元醇是糖醇。在一个实施方案中，糖和多元醇选自蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘油和聚乙二醇。在进一步的实施方案中，多元醇是二醇。在一个实施方案中，二醇选自乙二醇、丙二醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，多元醇的浓度为约10-200mg/ml。在另一个实施方案中，多元醇的浓度为约10-50mg/ml。在进一步的实施方案中，多元醇的浓度为约5-30mg/ml。
在一个实施方案中，制剂包含约10-250mg/ml的蔗糖或海藻糖。在另一个实施方案中，制剂包含约20-200mg/ml的蔗糖或海藻糖。在进一步的实施方案中，制剂包含约50-80mg/ml的蔗糖或海藻糖。在进一步的实施方案中，制剂包含约30-80mg/ml的蔗糖或海藻糖。在另一个实施方案中，制剂包含约50-90mg/ml的蔗糖或海藻糖。在又进一步的实施方案中，制剂包含约70-80mg/ml的蔗糖或海藻糖。在又进一步的实施方案中，制剂包含至少约50mg/ml的蔗糖或海藻糖。在另一个实施方案中，制剂包含约20-200mg/ml的山梨醇、PEG400或甘油。在进一步的实施方案中，制剂包含约20-50mg/ml的山梨醇、PEG400或甘油。
在一个实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆。在又一个实施方案中，表面活性剂选自Tween80® (聚山梨酯80)、Tween20® (聚山梨酯20)、PluronicF88®、Pluoronic F-127®、PluronicF68®、Triton X-100®。在优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20或聚山梨酯80，并且糖是蔗糖或海藻糖。聚山梨酯80或20表面活性剂可以以约0.005至约1mg/ml的量存在于制剂中。聚山梨酯80或聚山梨酯20表面活性剂可以以约0.02至约2mg/ml的量存在于制剂中。聚山梨酯80或聚山梨酯20表面活性剂可以以约0.05至约1mg/ml的量存在于制剂中。聚山梨酯80或聚山梨酯20表面活性剂可以以约0.1至约0.5mg/ml的量存在于制剂中。在另一个实施方案中，聚山梨酯80或聚山梨酯20表面活性剂可以以约至少约0.005mg/ml的量存在于制剂中。聚山梨酯80或聚山梨酯20表面活性剂也可以以约至少约0.1mg/ml的量存在于制剂中。聚山梨酯80表面活性剂可以以约0.2mg/ml的量存在于制剂中。
在上述制剂的其他方面，在50℃下，如通过尺寸排阻色谱所测量，在10天后，在共配制的抗LAG3抗体和抗PD-1抗体制剂中，%高分子量(HMW)小于5%。
本发明提供了以下实施方案：
1. 制剂，其包含：约16-22 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约3-7 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段；约30-120 mg/mL的非还原性二糖；约0.02-2.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；pH为约4.5-6.5的缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐，其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ ID NO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2和SEQ ID NO:44的CDRH3，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。
2. 实施方案1的制剂，其包含：约18-22 mg/mL的抗LAG3抗体；约4-7 mg/mL的抗PD-1抗体；约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-30 mM的pH为约5.0-6.5的组氨酸缓冲剂；和约40-100 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
3. 实施方案1的制剂，其包含：约18-20 mg/mL的抗LAG3抗体；约4-7 mg/mL的抗PD-1抗体；约50-60 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约8-12 mM的pH为约5.0-6.5的组氨酸缓冲剂；和约40-70 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
4. 实施方案1至3中任一项的制剂，其进一步包含约5-15 mM L-甲硫氨酸。
5. 实施方案1至3中任一项的制剂，其进一步包含约5-10 mM L-甲硫氨酸。
6. 实施方案1的制剂，其包含：约18.75 mg/mL的抗LAG3抗体；约6.25 mg/mL的抗PD-1抗体；约55 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约52.5 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约7.5 mM L-甲硫氨酸。
7. 实施方案1的制剂，其包含：约20 mg/mL的抗LAG3抗体；约5 mg/mL的抗PD-1抗体；约54 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约56 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约8 mM L-甲硫氨酸。
8. 实施方案1的制剂，其包含：约20.83 mg/mL的抗LAG3抗体；约4.17 mg/mL的抗PD-1抗体；约53 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约58.3 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约8.3 mM L-甲硫氨酸。
9. 实施方案1的制剂，其包含：约18.02 mg/mL的抗LAG3抗体；约4.505 mg/mL的抗PD-1抗体；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约70 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约10 mM L-甲硫氨酸。
以下实施方案也是本发明的方面：
1. 制剂，其包含：摩尔比为4:1至5:1 (抗LAG3抗体与抗PD-1抗体，或其抗原结合片段)的约3-300 mg/mL的约3-300 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约3-300 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，总赋形剂浓度为约10-1000 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂，以及pH为约4.5-8的缓冲剂。
2. 实施方案1的制剂，其包含：约10-200 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ ID NO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ IDNO:59的CDRH2和SEQ ID NO:44的CDRH3；和约4-200 mg/ml的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ IDNO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQ IDNO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3；浓度为约25-250 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2和FeCl2的赋形剂，以及pH为约5-8的缓冲剂。
3. 实施方案1或2的制剂，其中所述赋形剂是浓度为约25-250 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
4. 实施方案1或2的制剂，其中所述赋形剂是浓度为约40-100 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
5. 实施方案1或2的制剂，其中所述赋形剂是浓度为约25-250 mM的NaCl和L-精氨酸或其药学上可接受的盐的组合。
6. 实施方案5的制剂，其中NaCl与L-精氨酸的浓度比为1:1。
7. 实施方案6的制剂，其中NaCl浓度为约35 mM，且L-精氨酸浓度为约35 mM。
8. 实施方案6的制剂，其中NaCl浓度为约50 mM，且L-精氨酸浓度为约50 mM。
9. 实施方案1或2的制剂，其中所述赋形剂是约40-150 mM的NaCl、KCl和/或LiCl。
10. 实施方案1或2的制剂，其中所述赋形剂是约25-200 mM的L-组氨酸。
11. 实施方案10的制剂，其中所述L-组氨酸为约40-100 mM。
12. 实施方案1至11中任一项的制剂，其中所述缓冲剂是L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐。
13. 实施方案12的制剂，其中所述缓冲剂具有约1-300 mM的浓度。
14. 实施方案1-13中任一项的制剂，其进一步包含糖、多元醇或非离子表面活性剂或其组合。
15. 实施方案14的制剂，其中所述糖是非还原性二糖。
16. 实施方案15的制剂，其中所述糖是海藻糖或蔗糖或其组合。
17. 实施方案15或16的制剂，其中所述糖的浓度为约10-200 mg/ml。
18. 实施方案14的制剂，其中所述多元醇是糖醇。
19. 实施方案14的制剂，其中所述多元醇选自甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇。
20. 实施方案18或19的制剂，其中所述多元醇的浓度为约10-200 mg/ml。
21. 实施方案14的制剂，其中所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆。
22. 实施方案14的制剂，其中所述非离子表面活性剂选自：Tween80®、Tween20®、PluronicF88®、Pluoronic F-127®、PluronicF68®和Triton X-100®。
23. 实施方案14的制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨酯80或聚山梨酯20。
24. 实施方案1至13中任一项的制剂，其进一步包含表面活性剂聚山梨酯20或聚山梨酯80，以及糖蔗糖或海藻糖，或其组合。
25. 实施方案1至11中任一项的制剂，其进一步包含：约10-250 mg/mL的蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇或甘油；约0.005-2.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；和约3-300 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
26. 实施方案1至11中任一项的制剂，其进一步包含：约30-120 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.5 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
27. 实施方案1至11中任一项的制剂，其进一步包含：约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80；约5-30 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
28. 实施方案1或2的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约5-20mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
29. 实施方案1或2的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约20-200 mg/mL甘油、山梨醇或PEG400；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mML-精氨酸或其药学上可接受的盐。
30. 实施方案1或2的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约40-150 mM L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-脯氨酸或L-甲硫氨酸；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
31. 实施方案1或2的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM NaCl或其药学上可接受的盐。
32. 实施方案1至31中任一项的制剂，其进一步包含约3-150 mM L-甲硫氨酸。
33. 实施方案1至31中任一项的制剂，其进一步包含约5-70 mM L-甲硫氨酸。
34. 实施方案1或2的制剂，其包含：约25 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的L-组氨酸缓冲剂；约70mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；和约10 mM L-甲硫氨酸。
35. 实施方案1或2的制剂，其包含：约3-250 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段，糖，多元醇，非离子表面活性剂，pH为约5-8的组氨酸或乙酸盐缓冲剂，和约10-1000 mML-精氨酸或其药学上可接受的盐。
36. 实施方案1或2的制剂，其包含：约20 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8-6.0的L-组氨酸缓冲剂；和约70 mM L-精氨酸或L-精氨酸-HCl。
37. 制剂，其包含：约10 mg/mL的抗LAG3抗体或抗原结合片段；约10 mg/mL的抗PD-1抗体或抗原结合片段；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；约70 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；和约10 mM L-甲硫氨酸；其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ ID NO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2和SEQ ID NO:44的CDRH3，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ IDNO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ IDNO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。
38. 实施方案1-37中任一项的制剂，其为液体制剂。
39. 实施方案1-37中任一项的制剂，其被冷冻至至少低于–70℃。
40. 实施方案1-37中任一项的制剂，其为从冻干制剂重构的溶液。
41. 实施方案1-40中任一项的制剂，其中在50℃下，如通过尺寸排阻色谱所测量，在10天后，%高分子量(HMW)小于5%。
42. 实施方案1-41中任一项的制剂，其中在5℃下，如通过尺寸排阻色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%单体为≥99.5%。
43. 实施方案1-41中任一项的制剂，其中在40℃下，如通过尺寸排阻色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%单体为≥98%。
44. 实施方案1-43中任一项的制剂，其中在5℃下，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于15%，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于20%。
45. 实施方案1-43中任一项的制剂，其中在25℃/60%相对湿度(RH)倒置(Relative Humidity (RH) Inverted)下，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于20%，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于25%。
46. 实施方案1-43中任一项的制剂，其中在40℃/75% RH倒置下，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于50%，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于53%。
47. 实施方案1-46中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含：SEQ ID NO:37的轻链可变区序列和SEQ ID NO:58的重链可变区序列。
48. 实施方案1-46中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:35的轻链序列和SEQ ID NO:57的重链序列。
49. 实施方案1-46中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体是Ab6或Ab6变体。
50. 实施方案47的制剂，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:4的轻链可变区。
51. 实施方案48的制剂，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链序列和SEQ ID NO:5的轻链序列。
52. 实施方案49的制剂，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗或派姆单抗变体。
冻干制剂
治疗性蛋白的冻干制剂提供了几个优点。冻干制剂通常提供比溶液制剂更好的化学稳定性，并因此增加了保存期。冻干制剂也可以根据临床因素，例如施用或给药途径，以不同的浓度重构。例如，如果皮下施用需要，冻干制剂可以以高浓度(即以小体积)重构，或者如果静脉内施用，可以以较低浓度重构。如果特定受试者需要高给药，特别是如果皮下施用，其中必须使注射体积最小化，则高浓度也可能是必需的。抗体药物的皮下施用使得能够自我施用。自我施用避免了与访问医疗机构进行施用(例如静脉内)相关的时间和费用。皮下递送受到在单次注射中实际上可以在注射部位递送的溶液体积的限制，其通常为约1至1.5mL。这种限制通常需要相对高浓度的溶液以递送所需量的药物。皮下自我施用典型使用预填充的注射器或自动注射器来完成，所述预填充的注射器或自动注射器填充有药物的液体溶液制剂，而不是冻干形式，以避免患者在注射之前重新悬浮药物的需要。
通常，冻干制剂的制备预期在高浓度药物产物(DP)下重构，即预期在低体积液体中重构。随后用水或等渗缓冲剂稀释则可容易地用于将DP稀释至较低浓度。通常，赋形剂以在高DP浓度重构时(例如用于皮下施用)将产生大致等渗的制剂的水平包含在本发明的冻干制剂中。在较大体积的水中重构以产生较低的DP浓度将必然降低重构溶液的张力，但这种降低在非皮下例如静脉内施用期间作为与等渗溶液(0.9%氯化钠USP或5%葡萄糖溶液USP)的混合物可能不太重要。如果在较低DP浓度下需要等渗性，则可将冻干粉末在标准低体积水中重构，并且然后用等渗稀释剂如0.9%氯化钠进一步稀释。
本发明的冻干制剂通过预冻干溶液的冻干(冷冻干燥)形成。冷冻干燥通过冷冻制剂并随后在适于初级干燥的温度下升华水来完成。在这种条件下，产品温度低于制剂的共晶点或塌陷温度。通常，用于初级干燥的搁板温度在合适的压力(典型为约50至250毫托)下为约-30至-25℃(条件是产品在初级干燥期间保持冷冻)。制剂、容纳样品的容器(例如玻璃小瓶)的尺寸和类型以及待冻干的制剂的体积将决定干燥所需的时间，其可以在几小时至几天(例如40-60小时)的范围内。第二干燥可以在约0-40℃进行，主要取决于容器的类型和尺寸以及所用蛋白的类型。第二干燥时间由产品中所需的残留水分含量决定，典型需要至少约5小时。通常，冻干制剂的水分含量小于约5%，且优选小于约3%。压力可以与在初级干燥步骤期间使用的压力相同。冷冻干燥条件可以根据制剂和小瓶尺寸而变化。
在一些情况下，可能期望在其中进行蛋白的重构的容器中冻干蛋白制剂以避免转移步骤。在这种情况下，容器可以是例如3、5、10、20、50或100 cc的小瓶。
本发明的冻干制剂在施用前重构。蛋白可以约3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或约100mg/mL或更高浓度如约150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或300mg/mL直至约500mg/mL的浓度重构。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约4-7 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-7 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约4mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约5 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约6 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约18-22 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约20 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约16-22 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-300 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约4-250 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约150-250 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约180-220 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约50-150mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约50 mg/ml。在一个实施方案中，重构后的抗PD-1抗体或其抗原结合片段或抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约25 mg/ml。高蛋白浓度在旨在皮下递送重构制剂的情况下特别有用。然而，对于其他施用途径，例如静脉内施用，可能需要较低浓度的蛋白(例如约5-25mg/mL)。
尽管可根据需要采用其他温度，但通常在约25℃的温度下进行重构以确保完全水合。重构所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂和蛋白的量。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
在本发明的一个实施方案中，将抗LAG3抗体(或其抗原结合片段)和抗PD-1抗体(或其抗原结合片段)共配制成用于静脉内施用的冻干粉末。在本发明另一个实施方案中，所述共配制的产品是用于皮下施用的冻干粉末。在某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)以约100-1200 mg/小瓶提供，并且在使用前用无菌注射用水重构。在其他实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)以约200 mg/小瓶提供，并且在使用前用无菌注射用水重构。在一个实施方案中，重构制剂的目标pH为约6.0。在各个实施方案中，本发明的冻干制剂能使抗LAG3抗体或抗PD-1抗体或其抗原结合片段重构至浓度，例如约5、10、20、25、30、40、50、60、75、100、150、200、250或更多mg/mL。在其他实施方案中，重构后抗LAG3抗体或抗PD-1抗体或其抗原结合片段浓度为约3-300、10-300、20-250、150-250、180-220、20-200、40-100或50-150mg/ml。在其他实施方案中，预冻干的抗LAG3抗体或抗PD-1抗体或其抗原结合片段浓度为约3-300、10-300、150-250、180-220、10-100、10-50或25-50mg/ml。
在其他实施方案中，抗LAG3抗体或抗原结合片段和抗PD-1抗体或抗原结合片段的冻干制剂根据由冻干制剂产生的重构溶液来定义。重构溶液可包含浓度为约4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100mg/mL或更高浓度如150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或至多约300mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，重构制剂可包含约3-300mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，重构制剂可包含约10-200mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，重构制剂可包含约10-100mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，重构制剂可包含约10-60或约15-50mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，重构制剂可包含约10-25mg/mL的抗体或其抗原结合片段。在优选的实施方案中，重构制剂可包含约20-30或25mg/mL的抗体或其抗原结合片段。
液体制剂
液体抗体制剂可以通过将例如在水性药物制剂中的药物物质和缓冲剂交换到所需缓冲剂中作为纯化过程的最后步骤来制备。在该实施方案中没有冻干步骤。将最终缓冲剂中的药物物质浓缩至所需浓度。将赋形剂如稳定剂和表面活性剂加入药物物质中，并用适当的缓冲剂将其稀释至最终的蛋白浓度。使用0.22μm过滤器过滤最终配制的药物物质，并填充到最终容器(例如玻璃小瓶)中。制剂可以储存在小瓶中，并通过注射装置或容器递送。
在本发明的另一个方面，对于包含所述抗PD-1抗体和抗LAG3抗体(或其抗原结合片段)的液体共配制的制剂，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-300 mg/ml。在另一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约4-250 mg/ml。在另一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约40-100 mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-60 mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约20-30 mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-30 mg/mL。在一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约15-50 mg/ml。在另一个实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-100 mg/mL。在又一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约20-30或25 mg/mL。在又一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约16-22 mg/mL。在又一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约18-22 mg/mL。在又一个进一步实施方案中，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的浓度为约20 mg/mL。
在本发明的另一个方面，所述液体制剂中的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-300 mg/ml。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约4-250 mg/ml。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约40-100mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-60mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约20-30mg/ml。在一个进一步实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-30mg/mL。在一个进一步实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约15-50mg/ml。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约10-100 mg/mL。在另一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约20-30或25 mg/mL。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-7 mg/ml。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约4-7 mg/ml。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约4 mg/ml。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约5 mg/ml。在一个实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约6 mg/ml。
在一个实施方案中，液体制剂包含pH为约4.5-8、5.0-6.5、5.5-6.5、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2的缓冲剂和精氨酸或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，液体制剂包含pH为约5-8的缓冲剂，在一个实施方案中，液体制剂包含pH为约5.0-6.5的缓冲剂。在一个实施方案中，液体制剂包含pH为约5.0-6.0的缓冲剂。在其他实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在另一个实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐或乙酸盐。在进一步的实施方案中，液体制剂包含pH为约5-8、5.0-6.5、5.5-6.5、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2的乙酸盐缓冲剂和精氨酸或其药学上可接受的盐。
本发明的液体抗体制剂适于肠胃外施用，例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射；特别适合皮下注射。
剂量和施用
毒性是选择治疗剂如人源化抗LAG3或抗PD-1抗体(或其抗原结合片段)的适当剂量中的考虑因素。单独施用或与免疫抑制剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可通过标准药学程序(例如用于测定LD50 (50%群体致死的剂量)和ED50 (50%群体治疗有效的剂量))在细胞培养物或实验动物中测定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，且它可以表示为LD50与ED50的比。优选显示高治疗指数的抗体。从这些细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内，具有很小或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。
合适的施用途径可以例如包括肠胃外递送，包括肌内、皮内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内。药物可以以各种常规方式施用，例如腹膜内、肠胃外、动脉内或静脉内注射。其中溶液体积必须受限的施用模式(例如皮下施用)需要冻干制剂以能够在高浓度下重构。
或者，可以局部而非全身方式施用抗体，例如，通过将抗体直接注射到以免疫病理学为特征的病原体诱导的病变中，通常在储库或持续释放制剂中施用。此外，可以在靶向药物递送系统中施用抗体，例如，在包被有组织特异性抗体的脂质体中，靶向例如以免疫病理学为特征的病原体诱导的病变。脂质体将被靶向到患病组织并选择性地被患病组织吸收。
选择用于治疗剂的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平一致。因此，递送的生物学物质的量部分取决于特定实体和所治疗病况的严重性。选择合适剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可用的。参见，例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy，Bios Scientific Pub. Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina (编) (1991) Monoclonal Antibodies，Cytokines andArthritis，Marcel Dekker，New York，NY；Bach (编) (1993) Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等人，(2003) New Engl. J. Med. 348:601-608；Milgrom等人，(1999) New Engl. J. Med.341:1966-1973；Slamon等人，(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792；Beniaminovitz等人，(2000) New Engl. J. Med. 342:613-619；Ghosh等人，(2003) New Engl. J. Med.348:24-32；Lipsky等人，(2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602；Physicians' DeskReference 2003 (Physicians' Desk Reference，第57版)；Medical Economics Company；ISBN: 1563634457；第57版(November 2002)。
合适剂量的确定由临床医师例如使用本领域已知或怀疑影响治疗或预计影响治疗的参数或因素进行。蛋白的适当剂量("治疗有效量")将取决于例如待治疗的病况、病况的严重程度和病程、施用蛋白是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对蛋白的反应、所用蛋白的类型和主治医师的判断。通常，剂量以略小于最佳剂量的量开始，且此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用达到所需或最佳效果。重要的诊断措施包括例如炎症或产生的炎性细胞因子水平的那些症状。蛋白适合一次或重复施用于患者。蛋白可单独施用或与其他药物或疗法联合施用。
抗体或抗体片段可以通过连续输注或通过以例如一天、每周1-7次、一周、两周、三周、每月、每两月等的间隔的剂量来提供。优选的剂量方案是涉及避免显著的不期望的副作用的最大剂量或剂量频率的方案。
在某些实施方案中，本发明的药物制剂将通过静脉内(IV)输注或注射施用。
在其他实施方案中，本发明的药物制剂将通过皮下施用来施用。皮下施用可以通过使用注射器注射或使用其他注射装置(例如Inject-ease®装置)；注射器笔；或无针装置(例如MediJector和BioJector®)进行。
皮下施用可以通过使用注射器、自动注射器、注射器笔或无针注射装置注射来进行。静脉注射可以在用合适的商业稀释剂如盐溶液或5%葡萄糖水溶液稀释制剂后进行。
尽管本发明的高浓度溶液制剂对于需要高浓度抗体的用途是特别有利的，但是没有理由认为在不需要或不期望高浓度的情况下，制剂不能以较低浓度使用。较低浓度的抗体可用于低剂量皮下施用，或用于其他施用模式(如静脉内施用)，其中可递送的体积基本上大于1ml。此类较低的浓度可以包括约15、10、5、2、1mg/ml或更低。
用途
本发明提供抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或抗原结合片段的冻干或液体制剂，其用于治疗癌症和感染。
本领域技术人员将认识到术语"癌症"是身体细胞变得异常并且分裂而不受控制的疾病的名称。可由本发明的化合物、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠：食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠多肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)结直肠；泌尿生殖道：肾(腺癌、威尔曼瘤[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：头盖骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、许旺细胞瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌、粘液囊腺癌、未分类的癌]、颗粒膜细胞肿瘤、塞尔托利-莱迪希细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎型横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)、乳房；血液学：血液(髓样白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、胎块发育异常痣(moles dysplasticnevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、银屑病；和肾上腺：神经母细胞瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自结直肠癌，胃癌和头颈癌。
实施例
实施例1：减少抗LAG3抗体Ab6自缔合的条件研究
扩散相互作用参数(k D )测量
发现10mM组氨酸pH 5.6中的B22是负的，这表明分子自缔合的固有特性。发现10mM组氨酸pH 5.6中存在50mM氯化钠增加了抗LAG3抗体Ab6 (SEQ ID NO:35和57，轻链和重链)的扩散相互作用参数(KD)或减少了其自身相互作用，改善了其相对溶解度并减少了浊度(OD350)，如图12所示。在40mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下，使用扩散相互作用参数(KD)、浊度(OD350)和相对溶解度(% PEG中点)测定研究了抗LAG3抗体在10mM组氨酸pH 5.6中的稳定性。如图13所示，发现自身相互作用和浊度急剧减少，而发现在10mM组氨酸缓冲剂pH 5.6中加入40mM L-精氨酸盐酸盐后，抗LAG3抗体的相对溶解度显著改善。在pH 5.8和pH6.0下用50mg/mL抗LAG3抗体进行L-精氨酸盐酸盐范围研究(40mM-100mM)，其中发现70mM(14.7mg/mL)的L-精氨酸盐酸盐浓度在减少自身相互作用和改善胶体稳定性方面是有效的(图13)。
因为已发现抗LAG3抗体在较低离子强度(10mM)的缓冲剂中相分离。为了评价在不同浓度(mM)水平的三种不同带电荷种类[L-精氨酸、L-组氨酸和氯化钠(NaCl)]存在的情况下抗LAG3抗体的自缔合特性以及胶体、物理、化学和热稳定性，制备九种不同的制剂，如下表3所列。将10mM L-组氨酸70mM L-精氨酸盐酸盐pH 5.8中的未配制的抗LAG3 (~37mg/mL)对三种10mM组氨酸pH 5.8缓冲溶液透析；每种缓冲溶液含有100mM L-精氨酸、100mM氯化钠或100mM L-组氨酸。使用各制剂的透析液以25mg/mL配制抗LAG3抗体。通过用L-组氨酸缓冲剂pH 5.8稀释各自的抗LAG3抗体储备溶液并将抗LAG3抗体浓缩至25mg/mL来制备含有40mM至130mM L-精氨酸或氯化钠的制剂。
Figure 745261DEST_PATH_IMAGE053
使用动态光散射(DLS)在20℃下进行五次采集，评价九种制剂的扩散相互作用参数(kD)。相互作用参数(kD)由记录的扩散系数值(cm2/s)对各制剂的一系列稀释浓度(mg/mL)的图的斜率和y截距计算。正扩散相互作用参数(kD)表明排斥相互作用。随着L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠浓度的增加(＞40mM)，抗LAG3抗体显示kD的增加，这表明分子自缔合的减少(分子拥挤更少)。该效果对于L-精氨酸是相对显著的，随后是氯化钠和L-组氨酸(按相对顺序) (参见图15)。
相对溶解度研究
使用聚乙二醇(PEG)诱导的沉淀(需要10mg/mL蛋白浓度)来评价九种制剂的自动相对溶解度筛选。在每种缓冲溶液中制备40% (w/v) PEG6000，然后使用JANUS G3自动液体处理系统制备各种增量的PEG-6000，2%-36%(w/v)的溶液。将10mg/mL蛋白溶液加入96孔Costar透明板中的PEG溶液中，以获得1mg/mL的最终测定浓度。将板在室温下平衡过夜并转移到Abgene PCR板上，并以4600 rpm旋转30分钟，以迫使蛋白沉淀到每孔的底部。将上清液从每个孔中转移到新的96孔Costar透明板上。在SpectraMax M5板读数器上在280和320 nm处读板，以确定过夜孵育期间由于沉淀导致的蛋白损失。分析吸光度(280-320)与PEG浓度的数据以确定% PEG中点。
抗LAG3抗体在存在浓度渐增的带电荷种类例如L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠(40mM直至100mM)的情况下显示改善的相对溶解度，表明在那些浓度下抗LAG3抗体的分子拥挤的减少。参见图16。三种带电荷种类之间相对溶解度的改善幅度相似。
带电荷种类的变化研究
使用ProteinSimple的毛细管等电聚焦(cIEF)系统评价在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下抗LAG3抗体的电荷异质性和等电点(pI)的变化。在注入毛细管之前将样品与载体两性电解质混合。通过向毛细管施加电场，通过毛细管中的载体两性电解质和迁移到毛细管中局部pH值等于等电pH (pI)值的位置的蛋白分子产生pH梯度。通过使用iCE系统(来自ProteinSimple的iCE3)对整个毛细管进行全扫描来实现对分离的蛋白的检测。由仪器拍摄的最后一张图像用于数据定量。通过取单个种类的面积除以蛋白的总面积来估计分辨的峰的面积百分比。通过线性校准将蛋白括在一起的两个pI标志物之间的距离来估计蛋白的pI值。操作参数包括10℃的自动进样器温度；氟碳化合物(FC)涂覆的套筒(catridge)，280 nm的检测波长，以及在1500V的一分钟的聚焦时段。将九种制剂转移到96孔板中，并使用cIEF在初始时间点评价带电荷种类的变化(%酸性变体、%主峰和%碱性变体)。将九种制剂的剩余样品转移至另一个96孔板，紧密密封并置于50℃热应激下10天。在应激后，重新评价带电荷种类的变化。图17中的数据报告了与初始相比在热应激后%酸性变体的变化(差异)、主峰的%变化以及碱性变体的%变化。
氯化钠显示抗LAG3抗体制剂的%酸性变体和%主峰的变化最小，随后是L-精氨酸和L-组氨酸。氯化钠在40-100mM的浓度范围内，尤其是在≥70mM浓度下，显示化学稳定性的改进。L-精氨酸在70mM浓度下显示较好的化学稳定性，而L-组氨酸在高达100mM浓度下显示较好的化学稳定性。
为了评价抗LAG3抗体在L-精氨酸或氯化钠(NaCl)存在的情况下的自缔合特性以及胶体稳定性，制备了十二种不同的制剂，如表4中所列。将10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸盐酸盐pH 5.8中的未配制的抗LAG3抗体(~37mg/mL)对四种10mM组氨酸pH 5.8缓冲溶液透析；每种缓冲溶液含有150mM L-精氨酸、150mM氯化钠或35mM L-精氨酸和35mM氯化钠的混合物或50mM L-精氨酸和50mM氯化钠的混合物。使用各制剂的透析液以25mg/mL配制抗LAG3抗体。通过用L-组氨酸缓冲剂pH 5.8稀释各自的抗LAG3抗体储备溶液并将抗LAG3抗体浓缩至25mg/mL来制备含有40mM至130mM L-精氨酸或氯化钠的制剂。
Figure 610449DEST_PATH_IMAGE054
第二维里系数(B 22 )测量
使用动态光散射(DLS)，在5mg/mL进行十二种制剂中的每一种的第二维里系数(B22)测量。在20℃下使用173°的反向散射进行自动测量。
正的第二维里系数(B22)表明制剂基质中蛋白分子之间的排斥相互作用(较低的拥挤)。浓度大于40mM的L-精氨酸和氯化钠似乎都有利于减少分子拥挤。参见图18。
浊度(OD 350 )测量
为了评价抗LAG3抗体在制剂基质中的胶体稳定性，使用紫外(UV)吸收分光光度计评价十二种制剂的浊度(OD350)。在96孔co-star透明板中，在350nm波长下测量样品的UV吸光度，并对板吸光度进行路径检查校正。
抗LAG3抗体显示随着L-精氨酸或氯化钠浓度的增加而改善的胶体稳定性(OD350)，两者之间的值相当。参见图19。抗LAG3抗体制剂基质中等量比(35:35或50:50)的L-精氨酸和氯化钠也显示了相当的胶体稳定性。
粘度测量
为了评价抗LAG3在不同制剂基质中的可浓缩性，使用Eppendorf离心机以3000rpm在15℃下将表4中列出的十二种抗LAG3抗体制剂浓缩至高达60mg/mL。使用RheoSenseVROC® Initium粘度计在20℃下在96孔板上测量十二种制剂的粘度。
在L-精氨酸或氯化钠混合物存在的情况下，在40至150mM浓度的范围内，60mg/mL的抗LAG3抗体的粘度是相当的。在存在等量比(35:35或50:50)的L-精氨酸和氯化钠的情况下，60mg/mL的粘度显示相似的粘度值。参见图20。
重量摩尔渗透压浓度测量
使用Vapro蒸汽压5520渗压计测量抗LAG3抗体的重量摩尔渗透压浓度。在测量前，用100mmol/kg、290mmol/kg和1000mmol/kg校准标准品校准该单元。
发现表4中列出的十二种抗LAG3抗体制剂的重量摩尔渗透压浓度在L-精氨酸或氯化钠存在的情况下是相当的。在存在等量比(50:50)的L-精氨酸和氯化钠的情况下，重量摩尔渗透压浓度显示相似的粘度值，而35:35的等量比显示较低的重量摩尔渗透压浓度值。参见图21。
实施例2：用抗LAG3抗体Ab6制剂的带电荷种类(盐和氨基酸)进行预制剂筛选
为了评价在带电荷种类(盐和氨基酸)存在的情况下的抗LAG3抗体的稳定性，制备了表5中列出的十种制剂，并通过高通量分析筛选了抗LAG3抗体的物理化学特性的变化。将制剂适当地密封在96孔板中，并在干热烘箱中于50℃下施加应激10天。还评价热应激样品的抗LAG3抗体的物理化学特性的变化。基于其溶解度极限选择20mM浓度的L-天冬氨酸或L-谷氨酸。
Figure 749307DEST_PATH_IMAGE055
浊度(OD 350 )的方案
使用紫外(UV)吸收分光光度计评价九种制剂的浊度(OD350)。在96孔co-star透明板中，在350nm波长下测量样品的UV吸光度，并对板吸光度进行路径检查校正。
如图37所示，在热应激后，40mM氯化钠或L-精氨酸与20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸之间，抗LAG3抗体的胶体稳定性(OD350)的变化是相当的。类似地，在70mM氯化钠或L-精氨酸与20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸和50mM甘氨酸的组合(70mM总强度)之间，抗LAG3的胶体稳定性(OD350)的变化相当。在40mM或70mM L-组氨酸存在的情况下，抗LAG3抗体的胶体稳定性(OD350)的变化相对高。
UP-SEC
通过UP-SEC评价样品的纯度，其中确定单体的百分比，以及高分子量种类(HMW)和后洗脱峰(LMW种类)的百分比。通过在流动相(100mM磷酸盐，100mM氯化钠，pH 7.0)中将样品稀释至1.0mg/mL，在Acquity H类(DS)上进行UP-SEC。柱温保持在25±3℃，并且流速保持在0.5mL/min，使用等度洗脱。将稀释的样品(1μL)注入到装备有Waters BEH200柱和UV检测器的UPLC中。样品中的蛋白通过尺寸分离并通过在214 nm的UV吸收检测。
如图38所示，在热应激后，抗LAG3抗体的可溶性聚集体水平(%高分子量种类，HMW)的变化和单体%的变化在单独的40至70mM氯化钠和20至70mM氨基酸以及一些组合之间是相当的。对于20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸、40mM L-组氨酸、70mM氯化钠、以及20mM L-天冬氨酸和50mM甘氨酸的组合，低分子量种类的变化相对较低。
cIEF
使用ProteinSimple的毛细管等电聚焦(cIEF)系统评价在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下抗LAG3的电荷异质性和等电点(pI)的变化。在注入毛细管之前将样品与载体两性电解质混合。通过向毛细管施加电场，通过毛细管中的载体两性电解质和迁移到毛细管中局部pH值等于等电pH (pI)值的位置的蛋白分子产生pH梯度。通过使用iCE系统(来自ProteinSimple的iCE3)对整个毛细管进行全扫描来实现对分离的蛋白的检测。由仪器拍摄的最后一张图像用于数据定量。通过取单个种类的面积除以蛋白的总面积来估计分辨的峰的面积百分比。通过线性校准将蛋白括在一起的两个pI标志物之间的距离来估计蛋白的pI值。操作参数包括10℃的自动进样器温度；氟碳化合物(FC)涂覆的套筒(catridge)，280 nm的检测波长，和在1500V的一分钟的聚焦时段。
图39中的数据报告了与初始相比，在热应激后%酸性变体的变化(差异)、主峰的%变化以及碱性变体的%变化。
如图39所示，抗LAG3抗体的%酸性变体和主峰的变化在20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸、40mM L-组氨酸和40mM L-精氨酸之间是相当的。40mM氯化钠的变化最低。类似地，在70mM下，%酸性变体和主峰的变化在L-组氨酸与20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸与50mM甘氨酸的组合之间是相当的。对于70mM氯化钠和70mM L-精氨酸，变化最小。对于表5中列出的所有十种制剂，%碱性变体的变化是最小的。
DLS
使用Wyatt的动态光散射(DLS)仪器在96孔玻璃底板上进行流体动力学直径的测量。将样品稀释至5mg/mL的蛋白浓度，并在自动模式下运行，使用在20℃下158°的散射检测，运行持续时间为5秒，进行五次测量。
如图40所示，对于20mM L-天冬氨酸或L-谷氨酸及其与50mM甘氨酸的组合，抗LAG3抗体直径的变化百分比是最小的。氯化钠(40至70mM)、L-精氨酸(40至70mM)和L-组氨酸(40至70mM)的直径变化在6-11%，并且在测定可变性之内。
实施例3：抗LAG3抗体Ab6制剂的稳定剂筛选
为了评价在不同稳定剂如糖和多元醇存在的情况下的抗LAG3抗体Ab6 (25mg/mL，在10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸盐酸盐中或在70mM氯化钠中，pH 5.8)的稳定性，制备了十一种如表6中所列的制剂。
Figure 395052DEST_PATH_IMAGE056
超高效尺寸排阻色谱(UP-SEC)
通过UP-SEC评价样品的纯度，其中确定单体的百分比，以及高分子量种类(HMW)和后洗脱峰(LMW种类)的百分比。通过在流动相(100mM磷酸盐，100mM氯化钠，pH 7.0)中将样品稀释至1.0mg/mL，在Waters Acquity UPLC系统H类Bio上进行UP-SEC。柱温保持在25±3℃，并且流速保持在0.5mL/min，使用等度洗脱。将稀释的样品(5μL)注入到装备有WatersBEH200柱和UV检测器的UPLC中。样品中的蛋白通过尺寸分离并通过在214nm的UV吸收检测。
如图24所示，发现抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸pH 5.8，70mM L-精氨酸中)的高分子量种类和%单体的变化百分比在稳定剂例如蔗糖、海藻糖、PEG 400和甘油存在的情况下更低。与单独的抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸pH 5.8，70mM L-精氨酸盐酸盐中)相比，在较高的蔗糖和海藻糖浓度(9% w/v)下，该效果是显著的。类似地，发现与单独的抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸pH 5.8，70mM氯化钠中)相比，抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸pH 5.8，70mM氯化钠中)的高分子量种类和%单体的变化百分比在蔗糖存在的情况下更低，在较高的蔗糖和海藻糖浓度(9% w/v)下该效果显著。
带电荷种类的变化(cIEF)
使用ProteinSimple的毛细管等电聚焦(cIEF)系统评价在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下抗LAG3抗体的电荷异质性和等电点(pI)的变化。在注入毛细管之前将样品与载体两性电解质混合。通过向毛细管施加电场，通过毛细管中的载体两性电解质和迁移到毛细管中局部pH值等于等电pH (pI)值的位置的蛋白分子产生pH梯度。通过使用iCE系统(来自ProteinSimple的iCE3)对整个毛细管进行全扫描来实现对分离的蛋白的检测。由仪器拍摄的最后一张图像用于数据定量。通过取单个种类的面积除以蛋白的总面积来估计分辨的峰的面积百分比。通过线性校准将蛋白括在一起的两个pI标志物之间的距离来估计蛋白的pI值。操作参数包括10℃的自动进样器温度；氟碳化合物(FC)涂覆的套筒(catridge)，280 nm的检测波长，和在1500V的一分钟的聚焦时段。
将十一种制剂装入2mL无菌小瓶(2.0mL填充物)，密封和加盖，并目视检测。十一种制剂的初始时间点是在2-8℃下储存(避光)，且将意图用于热应激的样品倒置放置在50℃干热烘箱中的容器中10天(避光)。图25中的数据报告了与初始相比，在热应激后%酸性变体的变化(差异)、主峰的%变化以及碱性变体的%变化。
如图25所示，抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸pH 5.8中)在5%蔗糖存在的情况下显示化学不利因素(liability)减少。海藻糖(5% w/v和10% w/v)、山梨醇、PEG 400和甘油的稳定效果是相当的。抗LAG3抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸，70mM氯化钠pH 5.8中)在不存在蔗糖的情况下显示更好的化学稳定性。
DSC
使用差示扫描微量量热法(DSC)以1mg/mL测量表6中列出的十一种抗LAG3抗体制剂的以kcal/℃计的热容(cp)。十一种制剂的Tm1、Tm2和T开始由cp (cal/mol/℃)对温度(℃)的图确定。
如图26所示，基于Tm1、Tm2和T开始值，蔗糖和海藻糖(各为5% w/v至9% w/v)对抗LAG3(25mg/mL，在10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸盐酸盐pH 5.8中)以及对抗LAG3 抗体(25mg/mL，在10mM L-组氨酸、70mM氯化钠pH 5.8中)具有稳定效果。山梨醇、PEG 400和甘油的稳定效果是相当的。
实施例4：抗LAG3抗体Ab6制剂的聚山梨酯浓度范围研究
为了确定制剂基质(25mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸盐酸盐、5% w/v蔗糖，pH 5.8中)中聚山梨酯80的最佳浓度，制备八种不同的制剂，每种制剂含有如表7所示的0mg/mL高至1.0mg/mL范围内的聚山梨酯。将制剂暴露于300 rpm的搅拌振荡下长达7天。两种制剂由安慰剂(0.1mg/mL或1.0mg/mL聚山梨酯80，在不含抗LAG3抗体的相同制剂基质中，即表7中的制剂#1)组成。
Figure 644767DEST_PATH_IMAGE057
浊度
为了评价抗LAG3抗体在含有不同浓度的聚山梨酯80的制剂基质中的胶体稳定性，使用紫外(UV)吸收分光光度计评价八种制剂的浊度(OD350)。在96孔co-star透明板中，在350nm波长下测量样品的UV吸光度，并对板吸光度进行路径检查校正。
如图27所示，在不存在聚山梨酯80的情况下，制剂基质 (25mg/mL抗LAG3，在10mML-组氨酸，70mM L-精氨酸盐酸盐，5% w/v蔗糖，pH 5.8中)中的抗LAG3抗体在搅拌后显示浊度增加。在制剂基质(25mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸盐酸盐，5% w/v蔗糖，pH 5.8中)中存在0.1mg/mL至1.0mg/mL聚山梨酯80浓度的情况下，发现抗LAG3抗体是稳定的。从0.1mg/mL至1.0mg/mL，对安慰剂的胶体稳定性没有影响。
UP-SEC
通过UP-SEC评价样品的纯度，其中确定单体的百分比，以及高分子量种类(HMW)和后洗脱峰(LMW种类)的百分比。通过在流动相(0.1M磷酸二氢钠一水合物，0.1M磷酸氢二钠二水合物，0.1M L-精氨酸，pH 7.0)中将样品稀释至1.0mg/mL，在Waters Acquity液相色谱系统上进行UP-SEC。将稀释的样品(5μL)注入到装备有蛋白BEH SEC柱和UV检测器的液相色谱中。样品中的蛋白通过尺寸分离并通过在214 nm的UV吸收检测。
如图28所示，在聚山梨酯80 (0.1至1.0mg/mL浓度)存在的情况下，可溶性聚集体水平(%高分子量种类)或碎片(%低分子量种类)或%单体的变化没有变化。发现抗LAG3抗体在制剂基质中在聚山梨酯80存在的情况下是胶体稳定的。
HP-IEX
为了确定抗LAG3抗体制剂中的电荷变体，使用高效离子交换色谱(HP-IEX)。使用Dionex MabPac® SCX-10，10μm 4×250mm柱和25mM MES，14mM Tris，pH 6.25至25mM MES，22mM Tris，100mM LiCl，pH 6.85的流动相梯度进行分析。在280nm进行UV检测。该方法还包括任选的剥离缓冲剂(15mM EDTA，40mM Tris，10mM CHES，500mM NaCl，pH 8.1)以改善测定的可靠性和可持续性。样品以5mg/mL制备，进样量为10μL。
如图29所示，在聚山梨酯80(0.1至1.0mg/mL浓度)存在的情况下，带电荷种类水平(%酸性变体、%主峰、%碱性变体)没有变化。发现抗LAG3抗体在制剂基质中存在聚山梨酯80的情况下是胶体稳定的。
实施例5：抗LAG3抗体Ab6的pH范围研究
在5.3至6.4的pH范围(考虑5.8的目标制剂pH)内筛选抗LAG3抗体Ab6制剂A：25mg/mL抗LAG3抗体；50 mg/mL蔗糖；0.2 mg/mL聚山梨酯80；10 mM组氨酸缓冲剂；70 mM L-精氨酸-HCl。如图14所示，在pH 5.3至pH 6.4，浓度、浊度、%高分子量种类、%低分子量种类或%单体没有显著变化。从pH 5.3直至pH 6.4，观察到在%主峰(例如，在pH 5.5的64.0%至在pH6.0的66.9%)的增加过程中，%酸性变体的降低(例如，在pH 5.5的17.28%至在pH 6.0的14.10%)。从pH 5.3直至pH 6.4，Z-平均流体动力学直径的变化最小(小于1 nm)。在pH接近~6.3的等电点(即pH 6.0和pH 6.4)时，注意到每毫升的亚可见微粒(≥5μm、≥10μm和≥25μm尺寸范围)的少量增加。总之，发现抗LAG3抗体在pH 5.3至pH 6.4之间是稳定的，证实选择pH 5.8作为目标制剂pH。
实施例6：抗LAG3抗体Ab6制剂的抗氧化剂筛选
为了确定抗氧化剂对制剂(25mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸盐酸盐，5% w/v蔗糖，pH 5.8中)中抗LAG3抗体的影响，评估了制剂中三种不同水平的L-甲硫氨酸。制备四种不同的制剂，如表8中所列，填充(2.2mL)在2mL 1型玻璃小瓶中并适当密封。将四种制剂暴露于0.2 ICH、0.5 ICH和1 ICH光应激(紫外和冷白光或可见光)。四种制剂各自的暗对照(用箔纸覆盖)(对照)也暴露于高达1 ICH的光应激。
Figure 630041DEST_PATH_IMAGE058
浊度
使用紫外(UV)吸收分光光度计评价四种制剂的浊度(OD350)。在96孔co-star透明板中，在350nm波长下测量样品的UV吸光度，并对板吸光度进行路径检查校正。
如图30所示，发现L-甲硫氨酸(5mM至10mM)与表8中所列对照相比，胶体稳定抗LAG3抗体(25mg/mL抗LAG3抗体，10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸，5% w/v蔗糖，pH 5.8)；且10mM L-甲硫氨酸为最佳量。在1 ICH光暴露后，对于暗对照样品的胶体不稳定性没有影响。
UP-SEC
通过UP-SEC评价样品的纯度，其中确定单体的百分比，以及高分子量种类(HMW)和后洗脱峰(LMW种类)的百分比。通过在流动相(100mM磷酸盐和100mM氯化钠，pH 7.0)中将样品稀释至1.0mg/mL，在UPLC acquity H类系统上进行UP-SEC。将稀释的样品(5μL)注入装备有蛋白BEH SEC柱和UV检测器的液相色谱中，流速为0.5mL/min。样品中的蛋白通过尺寸分离并通过在214nm和280nm的UV吸收检测。
如图31所示，发现L-甲硫氨酸(5mM-10mM)与表8所列对照相比，减少了抗LAG3抗体制剂(25mg/mL抗LAG3抗体，10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸，5% w/v蔗糖，pH 5.8)中的可溶性聚集体形成(%HMW)；且10mM L-甲硫氨酸为最佳量。在1 ICH光暴露后，对于暗对照样品，没有看到可溶性聚集体的形成。
HP-IEX
为了确定抗LAG3抗体制剂中的电荷变体，使用高效离子交换色谱(HP-IEX)。使用Dionex MabPac® SCX-10，10μm 4×250mm柱和25mM MES，14mM Tris，pH 6.25至25mM MES，22mM Tris，100mM LiCl，pH 6.85的流动相梯度进行分析。在280 nm进行UV检测。该方法还包括任选的剥离缓冲剂(15mM EDTA，40mM Tris，10mM CHES，500mM NaCl，pH 8.1)以改善测定的可靠性和可持续性。以5mg/mL制备样品，进样量为10μL，并且流速为0.5-1.0mL/min。
如图32所示，直至1 ICH光暴露，与对照相比，发现5mM-10mM L-甲硫氨酸有效减少抗LAG3抗体(25mg/mL抗LAG3，在10mM L-组氨酸、70mM L-精氨酸盐酸盐、5% w/v蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酯80中)的带电荷种类(%酸性变体和%碱性变体)的增加。对于1 ICH暗对照样品，没有对带电荷种类的影响。
还原肽作图
使用还原肽作图评价抗LAG3抗体的氧化性翻译后修饰的氧化水平的变化。在Waters Acquity H Bio Class系统上用流动相A (在LC/MS级水中的0.1%三氟乙酸)、流动相B (在LC/MS级乙腈中的0.1%三氟乙酸)进行还原肽作图。进样量为50μL，装备有HALO肽ES-C18柱，且流速为0.2mL/min，并且检测吸光度为214 nm。质谱由以下组成：毛细管3.0，样品锥30，源温度120℃，锥孔气30，脱溶剂气，m/z范围为100-200，从2-110min收集MS。在柱运行之前，将样品还原并用合适的试剂烷基化。进行空白(非样品)消化以鉴定在目标区域中洗脱的非样品相关峰。
如图33所示，发现与对照相比，5mM-10mM L-甲硫氨酸在1 ICH光暴露后有效减少抗LAG3抗体(25mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸，70mM L-精氨酸盐酸盐，5% w/v蔗糖，0.2mg/mL聚山梨酯80中)的翻译后修饰的氧化。
实施例7：抗LAG3抗体Ab6的高浓度研究
为了评价抗LAG3抗体在三种不同的pH 5.8的缓冲剂(组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐；每种含有70mM L-精氨酸盐酸盐)中，和在不同稳定剂存在的情况下的含有L-组氨酸、70mML-精氨酸盐酸盐pH 5.8的制剂的高浓度(200mg/mL)可行性，制备了九种制剂，如表9所列。将九种制剂中的每一种填充到96孔板中并适当密封。将制剂在干热烘箱中于50℃下施加应激10天。对初始样品和受应激样品进行分析。
Figure 2116DEST_PATH_IMAGE059
浊度
使用紫外(UV)吸收分光光度计评价九种制剂的浊度(OD350)。在96孔co-star透明板中，在350 nm波长下测量样品的UV吸光度，并对板吸光度进行路径检查校正。
如图34所示，与对照(200mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸70mM L-精氨酸，pH5.8中)相比，在作为稳定剂的70mM L-甲硫氨酸存在的情况下，抗LAG3抗体(200mg/mL抗LAG3抗体，在10mM L-组氨酸70mM L-精氨酸，pH 5.8中)的胶体稳定性(OD350)较低。在200mg/mL抗LAG3抗体制剂中70mM L-谷氨酰胺和70mM脯氨酸的稳定作用(胶体)是相当的。类似地，200mg/mL抗LAG3抗体制剂中5% w/v甘油和70mM L-甘氨酸的稳定作用(胶体)是相当的。在5% w/v蔗糖存在的情况下，200mg/mL抗LAG3抗体的胶体稳定性相对高。
UP-SEC
通过UP-SEC评价样品的纯度，其中确定单体的百分比，以及高分子量种类(HMW)和后洗脱峰(LMW种类)的百分比。通过在流动相(100mM磷酸盐，100mM氯化钠，pH7.0)中将样品稀释至1.0mg/mL，在Acquity H类(DS)上进行UP-SEC。柱温保持在25±3℃，并且流速保持在0.5mL/min，使用等度洗脱。将稀释的样品(5μL)注入到装备有Waters BEH200柱和UV检测器的UPLC中。样品中的蛋白通过尺寸分离并通过在214 nm的UV吸收检测。
如图35所示，对于高浓度的抗LAG3抗体制剂(200mg/mL)，与10mM L-乙酸盐或10mM柠檬酸盐缓冲剂相比，在70mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下，10mM L-组氨酸缓冲剂在减少可溶性聚集体水平方面是有效的。5% (w/v)蔗糖作为稳定剂在减少可溶性聚集体水平方面是进一步有效的，接着是5% (w/v)甘油。氨基酸即70mM L-谷氨酰胺、70mM L-甘氨酸、70mM脯氨酸和70mM L-甲硫氨酸的稳定作用是相当的。
带电荷种类的变化(cIEF)
使用ProteinSimple的毛细管等电聚焦(cIEF)系统评价在L-精氨酸、L-组氨酸或氯化钠存在的情况下抗LAG3抗体的电荷异质性和等电点(pI)的变化。在注入毛细管之前将样品与载体两性电解质混合。通过向毛细管施加电场，通过毛细管中的载体两性电解质和迁移到毛细管中局部pH值等于等电pH (pI)值的位置的蛋白分子产生pH梯度。通过使用iCE系统(来自ProteinSimple的iCE3)对整个毛细管进行全扫描来实现对分离的蛋白的检测。由仪器拍摄的最后一张图像用于数据定量。通过取单个种类的面积除以蛋白的总面积来估计分辨的峰的面积百分比。通过线性校准将蛋白括在一起的两个pI标志物之间的距离来估计蛋白的pI值。样品以5mg/mL制备，并且操作参数包括10℃的自动进样器温度；氟碳化合物(FC)涂覆的套筒(catridge)，280 nm的检测波长，且在1500V的一分钟的聚焦时段。
与在pH 5.8的70mM L-精氨酸盐酸盐存在的情况下的10mM乙酸盐缓冲剂相比，在10mM L-组氨酸和10mM柠檬酸盐缓冲剂中200mg/mL抗LAG3抗体的化学稳定性相当。5% (w/v)甘油在减少带电荷种类(%酸性和碱性变体)的变化方面是有效的，随后是5% (w/v)蔗糖(%碱性变体)。氨基酸即70mM L-谷氨酰胺、70mM L-甘氨酸、70mM脯氨酸和70mM L-甲硫氨酸的稳定效果是相当的。
实施例8：抗PD-1和抗LAG3抗体的共制剂的稳定性研究
如表10中制备抗PD-1抗体(MK-3475，派姆单抗，重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ IDNO:5)和抗LAG3抗体Ab6 (重链SEQ ID NO:57和轻链SEQ ID NO:37)的共制剂。
表10
Figure 72841DEST_PATH_IMAGE060
。
热稳定性研究
使用在具有13 mm血清塞的2mL小瓶中的1.0mL F1-F6液体制剂，在5℃(环境湿度)、25℃(60%湿度)和40℃(75%相对湿度)储存条件下长达12周，进行热稳定性研究。稳定性样品通过浊度和混合模式色谱(MMC)评价。
混合模式色谱
混合模式色谱使得能够分离共制剂中的单个抗体(抗LAG3抗体和抗PD-1抗体)，并且还使得能够监测共制剂中的抗LAG3抗体聚集体和抗PD-1聚集体和氧化。在MMC中，通过每种mAb的主峰面积确定每种mAb的单体百分比。对于抗LAG3抗体，计算高分子量(聚集体)和低分子量种类(片段)的百分比。对于抗PD-1抗体，基于对应于每个种类的单个峰面积计算高分子量(聚集体)和低分子量种类(片段)以及氧化种类(Ox1和Ox2)的百分比。通过在流动相(PBS，pH7.4)中将样品稀释至1.0mg/mL进行混合模式色谱。柱温保持在25℃，并且流速保持在0.5mL/min，使用等度洗脱。将稀释的样品(15μL)注入配备有定制Sepax Zenix SEC-300柱的HPLC中。样品中的不同成分通过尺寸和疏水性二者分离，并通过280nm的UV吸收检测。
浊度测量
在SpectrMax M5读板器上使用UV-可见光谱学对稳定性样品进行浊度分析。在350nm和500 nm处测量吸光度。通过从350 nm处的吸光度减去500 nm处的吸光度来计算浊度。
结论
共制剂(F3、F5和F6)显示与单独制剂相似或更好的稳定性(图22和23)。制剂F2在40℃下储存时，随时间推移表现出比制剂F4相比更少的浊度和单体损失，表明抗PD-1抗体在具有精氨酸的制剂中表现出更好的稳定性(图22和23)。与单独制剂相比，F5和F6共制剂在40℃下储存12周后随时间推移表现出最小的单体变化。L-甲硫氨酸有助于使共制剂(F5、F6)中的单体损失最小化(图23)。
将抗LAG3抗体Ab6和派姆单抗(MK-3475)药物物质(DS)以如下比率混合：1:1(12D)、3:1 (12E)、4:1 (12F)和5:1 (12G)。制剂12A和12C在其原始组成上分别是Ab6单一实体(SE)和MK-3475单一实体(SE)对照。制剂12B是12A的赋形剂组合物中的对照MK-3475SE。12F-12H是Ab6:MK-3475比率为4:1的共制剂，其具有(12H)和没有稀释剂(12F)。将稀释剂添加至制剂组合物中以恢复Ab6组合物(具有70 mM精氨酸浓度)。
表11 制剂
制剂ID # 比率Ab6:MK-3475 最终组成
12A 1:0 Ab6 25 mg/mL，70 mM L-精氨酸HCl，5%蔗糖，10 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12B 0:1 MK-3475 25 mg/mL，70 mM L-精氨酸HCl，5%蔗糖，10 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12C 0:1 MK-3475 25 mg/mL，7%蔗糖，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12D 1:1 Ab6 10 mg/mL与MK-3475 10 mg/mL，70 mM L-精氨酸HCl，5%蔗糖，10 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12E 3:1 Ab6 18.75 mg/mL与MK-3475 6.25 mg/mL，52.5 mM L-精氨酸HCl，5.5%蔗糖，7.5 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12F 4:1 Ab6 20 mg/mL与MK-3475 5 mg/mL，56 mM L-精氨酸HCl，5.4%蔗糖，8.0 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12G 5:1 Ab6 20.83 mg/mL与MK-3475 4.17 mg/mL，58.3 mM L-精氨酸HCl，5.3%蔗糖，8.3 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
12H 4:1 Ab6 18.02 mg/mL与MK-3475 4.505 mg/mL，70 mM L-精氨酸HCl，5%蔗糖，10 mM甲硫氨酸，0.02% PS-80，10 mM组氨酸缓冲剂
通过0.22 µm醋酸纤维素膜滤器过滤制剂。将每种制剂的滤液填充至2R小瓶中，其中每个小瓶填充2.2 mL。针对稳定性，将制剂在5℃、25℃和40℃下放置10天。通过检查质量属性(包括浊度，亚可见微粒总蛋白浓度，聚集，MK-3475的氧化，纯度和电荷概况)来分析制剂的稳定性。主要评价制剂12A、12B、12F和12H的稳定性。
浊度和总蛋白浓度
使用Spectramax UV吸收分光光度计(MRK0406661)测量浊度。将200 µL样品填充至96-孔Co-star透明板中，在350 nm和500 nm处测量吸光度，并分别用0.025和0.020的板吸光度进行路径检查校正。
使用SoloVPE可变光程长度扩展(MRK0416083)使用Quick Slope测量浓度。使用(对于MK-3475为1.42，且对于Ab6为1.45)的加权比-比平均消光系数和280 nm的波长来测量总蛋白浓度。
表12：浊度和总蛋白浓度
Figure 126247DEST_PATH_IMAGE061
。
所有样品都是澄清的，无色的并且没有任何可见的颗粒。Ab6:MK-3475比率对浊度没有影响。在共制剂中具有200-1000 mg的Ab6剂量范围的所有原型都显示在所有稳定性条件下相似的浊度。基质的组成不影响浊度。
通过UP-SEC的聚集分析
使用UP-尺寸排阻色谱法(UP-SEC)来评价总蛋白聚集，和高分子量(HMW)、低分子量(LMW)和总单体含量的鉴定。将样品和参考物质两者均稀释至5 mg/mL，并使用200 µL的稀释样品。流动相由50 mM磷酸钠、450 mM精氨酸HCl，pH 7.0组成。使用0.5 mL/min的等度流速，280 nm的检测波长，6 µL的进样量，和30℃的柱温。对于每个测试样品，计算单体(Mon)、HMW种类和LMW种类(以前称为晚期洗脱)峰的面积百分比。
%单体= PMon x 100 ÷ Σ P (所有峰)
%HMW种类= PHMW x 100 ÷ Σ P (所有峰)
%LMW种类= PLMW x 100 ÷ Σ P (所有峰)
PMon、PHMW、PLMW是单独峰的面积，且Σ P是所有峰面积的总和(不包括人为峰，出现在空隙体积中的峰，和缓冲剂相关的峰)。
具有单独的MK-3475的制剂# 12B显示最高量的高分子量(HMW)种类(参见图41和42)。70 mM精氨酸的存在导致MK-3475 HMW种类的水平升高。随着共制剂中Ab6:MK-3475的比率从(1:1)增加至(5:1)，HMW种类的水平降低。Ab6浓度增加似乎针对聚集(HMW形成)稳定MK-3475。与12A制剂中的Ab6相比，12C制剂中的MK-3475具有更高的聚集倾向。对于具有(12H)或不具有稀释剂(12F)的800:200共制剂原型，未观察到可测量的差异。
通过微流成像(MFI)的粒径分析
使用MFI通过合并足够的样品以使用Brightwell微流成像系统分析最少3次重复，来分析>1微米、>2微米、>5微米、>10微米、>25微米、>50微米的范围内的亚可见微粒。
表13：亚可见微粒
Figure 28344DEST_PATH_IMAGE062
Figure 509004DEST_PATH_IMAGE063
。
与低浓度制剂(12D和12E)相比，高浓度制剂(单一实体和共制剂)的颗粒计数更高。在50℃下经10天，对于Ab6单一实体(12A)观察到所有粒径的计数的显著增加。类似地，与制剂12D和12E相比，具有更高蛋白含量的共制剂(12F、12G和12H)显示在所有储存条件下的所有粒径的更高计数。然而，在50℃下，≥10μm和≥25μm颗粒计数显著低于对于Ab6单一实体(12A)观察到的颗粒计数。
用于定量共制剂中的MK-3475氧化的疏水相互作用色谱法(HIC)
HIC用于评价共制剂中的MK-3475的所有氧化产物的鉴定和定量。使用的柱是Tosoh Phenyl-5PW 10μm 7.5 x 75 mm，并使用30℃的柱温。将样品稀释以得到5 mg/mL的总蛋白浓度，其中总样品体积为至少200 µL。梯度方法使用以下的组合：流动相A：2% ACN/5mM Na3(PO4), pH 7.0；和流动相B：2% ACN/400 mM硫酸铵，5 mM Na3(PO4)，pH 6.9，且进样量为10 µL。使用280和214 nm的检测波长，并且仅在280 nm处报告结果。对于结果报告，前峰3的相对%面积等于前峰3的%。前峰1和2的总和等于前峰1+2的%。
表14：共制剂中的MK-3475氧化
Figure 801445DEST_PATH_IMAGE064
。
Ab6/MK-3475共制剂(12H)显示MK-3475中Fab (Met 105)的最高氧化程度。(12F)组合物显示较低程度的氧化。
用于评价共制剂中的单个mAb的电荷分布的离子交换色谱法(IEX)
离子交换色谱法(IEX)用于评价共制剂的每种mAb中的所有带电和主要种类的鉴定和定量。稀释每种样品，以125 µL的最大进样量得到50 µg总蛋白的总蛋白量。使用Dionnex MabPac SCX-10 10 um, 4x250 mm柱，其使用35℃的柱温。使用的流动相是以下的组合：(A)：5 mM MES，14 mM Tris，pH 6.25，(B)：20 mM Na3(PO4)，95 mM NaCl，pH 8.0，4%乙腈(ACN)，和(C): 15 mM EDTA，40 mM Tris，10 mM CHES，500 mM NaCl，pH 8.1。使用总运行时间为70分钟的梯度方法，其中检测波长为280 nm。使用该方法鉴定并定量共制剂中每种mAb的酸性、碱性和主要种类。总体而言，随着温度增加，电荷概况变化，并且在50℃下观察到最大变化(参见表15)。对于具有(12H)和不具有稀释剂(12F)的800:200共制剂原型，在5℃、40℃和50℃下10天后，在主峰或酸性和碱性变体中没有观察到可测量的差异。
表15：通过IEX的电荷概况
Figure 720860DEST_PATH_IMAGE065
。
通过毛细管电泳-SDS(CE-SDS)的纯度分析
使用非还原CE-SDS进行mAb纯度分析。根据内部方法方案制备样品，并在加热块上在70℃下孵育10分钟。然后将样品平衡至环境温度，以10,000 g离心，并将95 uL样品用于分析。
表16：通过CE-SDS的纯度
Figure 415146DEST_PATH_IMAGE066
Figure 66707DEST_PATH_IMAGE067
。
上表显示，Ab6:MK-3475比率对纯度没有影响。
实施例9：共制剂药物产品Ab6A (抗LAG3抗体和抗PD-1抗体的比率为4:1)的长期稳定性研究
Ab6A注射液是一种无菌、不含防腐剂的溶液，其需要稀释才用于静脉内输注。Ab6A是抗LAG3抗体Ab6和抗PD-1抗体MK-3475(派姆单抗，重链SEQ ID NO:10和轻链SEQ ID NO:5)的固定剂量组合，每个一次性小瓶在2.0 mL填充液中含有40 mg的Ab6和10 mg的MK-3475。药物产品组合物为0.56 mg/mL L-组氨酸、1.35 mg/mL L-组氨酸一盐酸盐一水合物、11.80 mg/mL L-精氨酸盐酸盐、1.19 mg/mL L-甲硫氨酸、54.0 mg/mL蔗糖、0.20 mg/mL聚山梨酯80 (pH 5.8)中的20.0 mg/mL Ab6，5.0 mg/mL MK-3475 (实施例8中的制剂12F)。推荐的储存条件是5℃ ± 3℃(2-8℃)，避光。
当在推荐的5℃(5℃±3℃)的储存条件下储存时，玻璃小瓶中的Ab6A药物产品三个月稳定性数据基本上保持不变。当在25℃ (25℃，60% RH(相对湿度))的加速条件下储存时，在几种属性中观察到轻微的变化，最长达三个月。在40℃(40℃，75% RH)的应激条件下的变化比25℃下的变化更显著。在所有温度条件(包括40℃、75%RH的应激条件下)，以下测定在三个月的时间点内基本上保持不变：外观和可见颗粒，澄清和乳光度，颜色，功效，蛋白浓度，pH和微粒物质。可用的稳定性数据支持该产品的使用，当在5℃±3℃下储存时，保存期限为12个月。
以下概述了根据ICH指南，Ab6A药物产品在5℃±3℃(倒置)的储存条件下、在25℃(25℃±2℃，60%相对湿度，倒置)的加速条件下和在40℃(40℃±2℃，75%相对湿度，倒置)的应激条件下的三个月稳定性数据。
外观和可见颗粒
使用配备有白光源的灯箱在透明小瓶中对样品进行外观和可见颗粒分析。迄今为止评估的所有条件下，药物产品Ab6A的外观和可见颗粒的测试结果均为“液体基本上没有可见颗粒”。观察值不随着储存条件或时间而变化。
澄清和乳光度
使用HACH™ 2100AN浊度计测量澄清和乳光度。在样品分析之前，将HACH™StablCal参考溶液(<0.1、1.0、3.0、6.0、10.0、18.0和30.0 NTU))和纯净水(作为空白)用于系统适用性测试(SST)。在所有条件下，在初始时间点直至3个月时间点，药物产品Ab6A的澄清和乳光度都没有变化。
通过HP-IEX的电荷变体
使用Dionex MabPac® SCX-10,10 um 4 x 250 mm, 部件# 074625，在具有2489UV Vis检测器的Waters e2695分离模块上进行高性能-离子交换色谱(HP-IEX)。流动相A含有20mM MES，14mM Tris (pH 6.25)。流动相B含有20mM NaPO4，96mM NaCl，4%乙腈(pH8.0)，且流动相C含有15 mM EDTA，40 mM Tris，10 mM CHES，500 mM NaCl，pH 8.1。柱和样品温度分别设置为35℃和4℃。进行70 min的总运行，梯度设置为0.5mL/min的流速，并在280nm处进行UV检测。对于每个分子色谱图(Ab6和MK-3475)，对于每种抗体，计算5个峰(酸性2，酸性1，主要，碱性1和碱性)的相对百分比面积，并且进行组合以仅具有三个类别(酸性变体，主要和碱性变体)。另外，将每种抗体的每组的%归一化，使得所计算的每种抗体的总峰%等于100%。通过离子交换柱分开MK-3475和Ab6酸性和碱性峰，并且相对于主峰更早(酸性变体)或更晚(碱性变体)洗脱。图47显示代表性色谱图。
HP-IEX方法是一种组合方法，其分开Ab6和MK-3475两者的电荷变体。对于Ab6(图1)和MK-3475(图4)酸性变体两者，在3个月稳定性数据中对于5℃条件没有变化。在25℃条件下，对于Ab6和MK-3475酸性变体两者存在轻微增加，并且在40℃条件下对于两者存在急剧增加。
在5℃下，Ab6和MK-3475两者的主要种类经3个月显示没有变化(图2和图5)。在25℃下，两者的主要种类存在轻微减少，这与酸性变体的增加有关，并且在40℃下，对于Ab6和MK-3475的主要种类存在急剧减少。
Ab6的碱性变体在5℃和25℃条件两者下最长达3个月显示没有变化(图3)。对于Ab6碱性变体，在40℃下，碱性种类存在轻微增加，最长达3个月。MK-3475的碱性变体在5℃条件下也显示没有变化，最长达3个月(图6)。在3个月内，就稳定性而言，在25℃下的MK-3475的碱性变体显示轻微降低，且40℃显示较大的降低(表17、表18和表19)。
表17 在5℃下，倒置的Ab6A的电荷变体的概述
Figure 171411DEST_PATH_IMAGE068
。
表18 在25℃/60%RH下，倒置的Ab6A的电荷变体的概述
Figure 566620DEST_PATH_IMAGE069
。
表19 在40℃/75%RH下，倒置的Ab6A的电荷变体的概述
Figure 115413DEST_PATH_IMAGE070
。
通过UP-SEC的纯度
尺寸排阻色谱法是基于大小的分离技术。Ab6和MK-3475单体的大小相似，因此单体共洗脱。实现了HMW种类与共洗脱单体的充分分离，且因此该方法适合于确定Ab6A药物产品(DP)的纯度。通过UP-SEC解析，Ab6A DP含有低水平的高分子量(HMW)种类。通常检测到低分子量(LMW)，但水平低。使用具有HALO C4 UHPLC COLUMN, 2.1 x 75 mm的Waters H-Class Acquity UPLC进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)。流动相是含有0.1% (v/v)三氟乙酸的水(流动相A)和含0.1% (v/v)三氟乙酸的乙腈(流动相B)。用水将MK-3475和Ab6的参考标准品制备至4 mg/mL，并用于生成标准曲线，并将所有样品稀释至4 mg/mL，并注入5uL用于测量。柱和自动进样器分别维持在75℃和4℃。在280nm处进行UV检测，并使用WaterEmpower软件进行数据分析。通常，MK-3475和Ab6的浓度可以基于测量中建立的标准曲线。
关于稳定性，经3个月，Ab6A的UP-SEC显示在5℃条件下高分子量种类没有变化，以及在25℃下仅轻微增加，其中单体相应轻微减少(图7和图8)。在40℃条件下，高分子量种类增加，其中%单体相应减少，最长达3个月。
非还原(NR) CE-SDS和还原(R) CE-SDS
非还原(NR) CE-SDS和还原(R) CE-SDS分析利用Beckman PA800 Plus CE仪器和裸露熔融石英毛细管(总长度为30.2 cm，且内径为50 μm)，其中孔径为100 x 200 μm。使用IgG纯度/异质性测定试剂盒制备样品，并进行处理，然后根据透视方案在仪器上进行分析，其中在还原条件下，将mAb样品在1.0% SDS存在的情况下变性，并使用5% β-巯基乙醇还原，和在非还原条件下，将mAb样品在1.0% SDS存在的情况下变性，并用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理，随后在70℃下进行加热10 min。在15kV下进行分离40分钟，并在220nm处进行UV检测，并使用Water Empower软件进行数据分析。对于NR-CE-SDS，完整的IgG(纯度)和总的低分子量杂质被报告为百分比。对于R-CE-SDS，总纯度(重链 + 轻链)和总杂质被报告为百分比。
关于稳定性，对于Ab6A药物产品，将非还原的CE-SDS运行最长达3个月。在5℃条件下未观察到变化(图9和图10)。在25℃条件下，总低分子量种类存在轻微增加，且完整IgG相应减少。关于稳定性，在40℃下，最长达3个月，总低分子量种类存在更急剧增加，且完整IgG急剧减少。
关于稳定性，对于Ab6A药物产品，将还原的CE-SDS运行最长达3个月。在5℃条件下未观察到变化(图43和图44)。在25℃条件下，总杂质存在轻微增加，且重链+轻链相应减少。关于稳定性，在40℃下，最长达3个月，总杂质存在更急剧增加，且重链+轻链急剧减少。
微粒物质
使用Brightwell微流成像系统进行亚可见微粒表征。通过轻轻倒入将每个样品从多个容器(最少三个)倒入50mL聚丙烯管中，并使管在环境条件下静置30分钟，然后进行测试。通过在仪器软件MVSS(版本2-R5.0.0.43.5864)中应用标准过滤器来分析>1微米、>2微米、>5微米、>10微米、>25微米、>50微米的范围内的亚可见微粒。
通过HIAC计算Ab6A药物产品的微粒物质数据。在5℃、25℃和40℃条件下，从最初至3个月，结果远低于每个容器≤6000个颗粒(对于≥10 µm)和每个容器≤600个颗粒(对于≥25 µm)的接受标准)。在作为报告结果的≥2 µm和≥5 µm粒径，在长达3个月的所有条件下，均未观察到数据中的主要趋势。
HP-HIC MK-3475氧化
在使用Tosoh柱Phenyl-5PW 10 μm, 7.5 x 75 mm (PN 05753)的Agilent 1260系统上进行疏水相互作用色谱HPLC (HP-HIC)。流动相是2.0%乙腈/5 mM磷酸钠(pH7.0) (流动相A)和2.0%乙腈/400 mM硫酸铵和5 mM磷酸钠(pH 6.9) (流动相B)。流速为0.5 mL/min。将柱和自动进样器分别维持在30℃和4℃。将样品用Milli-Q水稀释至5 mg/mL，将10μL负载至柱上(总注入量50μg)。将检测波长设置为280 nm以进行分析。报告前峰3的相对%面积。前峰1和2总和等于前峰1+2的%。同样，后峰1和2的相对%面积总和等于疏水变体的%。
运行HP-HIC测定以评价Ab6A药物产品中MK-3475的氧化。5℃下的总前峰没有变化(图45)。在25℃条件下，总前峰值存在轻微增加，并且关于稳定性，在40℃下，最长达3个月，总前峰存在更大增加。
浊度A350
使用Spectramax UV吸收分光光度计测量浊度。将200 µL样品填充在96-孔Co-star透明板中，在350 nm和500 nm处测量吸光度，并分别用0.025和0.020的板吸光度进行路径检查校正。
对于Ab6A药物产品评价浊度A350。关于稳定性，在5℃条件下，最长达3个月，确定没有显著的变化(图46)。然而，在25℃条件下，存在轻微增加，并且在40℃下，最长达3个月，存在甚至更明显的增加。
实施例10：用于检测蛋白-蛋白相互作用的酪氨酸测定和FRET测定
酪氨酸测定
在10 mM组氨酸、56 mM精氨酸、54.0 mg/mL蔗糖、0.20 mg/mL聚山梨酯80、pH 5.8存在的情况下混合Ab6和MK-3475。以MK-3475:Ab6 0:1、1:0、1:1的蛋白比率制备三种溶液，其中Ab6、MK-3475浓度和Ab6/MK-3475浓度分别为20 mg/mL、20 mg/ml和10 mg/ml。仅当样品间的总蛋白浓度相同时，对于单一蛋白制剂和共制剂获得的荧光结果才是相当的。将溶液在室温下孵育72小时的时段，并以规则间隔取出等分试样，并进行氧化，随后进行荧光标记反应。
将在预先指定时间点采集的样品与2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)混合，并在黑暗中在37℃下孵育3小时以氧化蛋白。通过添加甲硫氨酸来淬灭该反应。以下发荧光反应由在弱氧化剂(K3Fe(CN)6)存在的情况下将氧化的蛋白样品与(2-氨基甲基)-苯磺酸(ABS)混合组成。
AAPH氧化反应导致在酪氨酸残基处形成3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)。荧光标记反应允许对DOPA产物进行特异性标记。最终的荧光团由与ABS分子的苯部分共振的苯并
Figure 10000242338466
唑基团组成。这种荧光团允许在最终样品在λex=360 nm处激发后通过λem=490 nm处的荧光监测DOPA的形成。
如果储存最长达72小时的样品中发生蛋白聚集，则预期荧光信号随着从不同蛋白制剂取等分试样时的时间而衰减(图48，条)。荧光的减少可以解释为蛋白构象的变化，其限制了某些酪氨酸残基对氧化和/或荧光标记反应的可及性。从Ab6+MK-3475的共制剂获得的荧光信号在孵育72小时内是稳定的(图48，点)。后者导致以下结论：在1:1共制剂中没有发生MK-3475和Ab6之间的相互作用，这会影响溶液中的蛋白稳定性。
FRET测定
研究双分子相互作用的一种广泛使用的荧光技术是FRET (Förster共振能量转移)，其利用从荧光供体至受体的非辐射(偶极-偶极)能量转移，其只有当两个荧光团以<10nm的距离定位时才可以发生。在两种用供体和受体标签标记的蛋白的情况下，这意味着仅当两种蛋白相互作用时才发生FRET。
纯化的Ab6和MK-3475蛋白分别用荧光染料Dylight - 488®和Dylight - 596®衍生化。Dylight - 488®和Dylight - 596®是胺反应性染料，其优先与赖氨酸残基的伯胺反应。荧光标记的Ab6和MK-3475被命名为Ab6-488和MK-3475-596，其中标记488和596分别是指荧光染料Dylight - 488®和Dylight - 596®。
将Ab6-488和MK-3475-596在10 mM组氨酸、54.0 mg/mL蔗糖(pH 5.8)存在的情况下，在i)精氨酸(56 mM)和/或ii)聚山梨酯80 (0.20 mg/mL)不存在或存在的情况下进行混合。MK-3475-596/Ab6-488比率为1:4、1:1和4:1。由于测定的敏感性，荧光标记蛋白的摩尔浓度为3.2 uM或800 nM，这取决于蛋白比率。在λem=620 nm (λex=488 nm)下记录FRET荧光信号72小时(图49)。
如果发生蛋白相互作用，则我们预期看到荧光信号随着时间的生长(图49)。通过荧光的生长速率和荧光信号的最大值评估相互作用。不存在相互作用(或降低的相互作用)通过以下表征：i)荧光信号的低生长速率，和ii)低平台最大值。在10 mM组氨酸、56 mM精氨酸、54.0 mg/mL蔗糖、0.20 mg/mL聚山梨酯80 (pH 5.8)存在的情况下，具有MK-3475/Ab61/4比率的制剂的荧光信号在荧光基线的范围内(图49)。在标记蛋白不存在的情况下测量荧光基线。当混合比率为4:1时，精氨酸和PS80的组合消除了Ab6和MK-3475之间的蛋白相互作用。
考虑来自酪氨酸测定和FRET测定的数据，当在10 mM组氨酸、54.0 mg/mL蔗糖、56mM精氨酸和0.20 mg/mL聚山梨酯 80(pH 5.8)存在的情况下，制备MK-3475和Ab6的共制剂时，对于相同的赋形剂基质，共制剂的稳定性与单一抗体制剂相比得到提高。对于1:1和1:4共制剂，分别基于酪氨酸测定和FRET测定，共制剂将不太可能驱动蛋白-蛋白相互作用，因此，蛋白聚集没有增加。
实施例11：共制剂和单一实体制剂的氧化研究
表20
Ab6A Ab6 (20 mg/mL) + MK-3475 (5 mg/mL)，0.56 mg/mL L-组氨酸，1.35 mg/mL L-组氨酸盐酸盐，11.8mg/mL L-精氨酸盐酸盐，1.19 mg/mL L-甲硫氨酸，54.0 mg/mL蔗糖，0.20 mg/mL聚山梨酯80，pH5.8
MK-3475 MK-3475 (5 mg/mL)，0.56 mg/mL L-组氨酸，1.35 mg/mL L-组氨酸盐酸盐，11.8 mg/mL L-精氨酸盐酸盐，1.19 mg/mL L-甲硫氨酸，54.0 mg/mL蔗糖，0.20 mg/mL聚山梨酯80，pH 5.8
在相同的制剂基质中在25℃和40℃下热应激的Ab6A和MK-3475制剂样品的比较显示，与单独的MK-3475相比，Ab6A组合物中的MK-3475的M105氧化水平更低(参见图50和51)。因此，Ab6A组合物中Ab6的存在导致MK-3475的M105氧化减少。与相同制剂基质中的MK-3475单一实体相比，Ab6:MK-3475 4:1共制剂具有增加的氧化稳定性。用实施例9中所述的HIC和SEC测定法测量M105氧化水平。
Figure IDA0003152027460000011
Figure IDA0003152027460000021
Figure IDA0003152027460000031
Figure IDA0003152027460000041
Figure IDA0003152027460000051
Figure IDA0003152027460000061
Figure IDA0003152027460000071
Figure IDA0003152027460000081
Figure IDA0003152027460000091
Figure IDA0003152027460000101
Figure IDA0003152027460000111
Figure IDA0003152027460000121
Figure IDA0003152027460000131
Figure IDA0003152027460000141
Figure IDA0003152027460000151
Figure IDA0003152027460000161
Figure IDA0003152027460000171
Figure IDA0003152027460000181
Figure IDA0003152027460000191
Figure IDA0003152027460000201
Figure IDA0003152027460000211
Figure IDA0003152027460000221
Figure IDA0003152027460000231
Figure IDA0003152027460000241
Figure IDA0003152027460000251
Figure IDA0003152027460000261
Figure IDA0003152027460000271
Figure IDA0003152027460000281
Figure IDA0003152027460000291
Figure IDA0003152027460000301
Figure IDA0003152027460000311
Figure IDA0003152027460000321
Figure IDA0003152027460000331
Figure IDA0003152027460000341
Figure IDA0003152027460000351
Figure IDA0003152027460000361
Figure IDA0003152027460000371
Figure IDA0003152027460000381
Figure IDA0003152027460000391
Figure IDA0003152027460000401
Figure IDA0003152027460000411
Figure IDA0003152027460000421
Figure IDA0003152027460000431
Figure IDA0003152027460000441
Figure IDA0003152027460000451
Figure IDA0003152027460000461
Figure IDA0003152027460000471
Figure IDA0003152027460000481
Figure IDA0003152027460000491
Figure IDA0003152027460000501
Figure IDA0003152027460000511
Figure IDA0003152027460000521
Figure IDA0003152027460000531
Figure IDA0003152027460000541
Figure IDA0003152027460000551
Figure IDA0003152027460000561
Figure IDA0003152027460000571
Figure IDA0003152027460000581
Figure IDA0003152027460000591
Figure IDA0003152027460000601

Claims (48)

1.制剂，其包含：16-22 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；3-7 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段；约30-120 mg/mL的非还原性二糖；约0.02-2.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；pH为约4.5-6.5的缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐，其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ ID NO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2和SEQ ID NO:44的CDRH3，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ IDNO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ IDNO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。
2.权利要求1的制剂，其包含：18-22 mg/mL的抗LAG3抗体；4-7 mg/mL的抗PD-1抗体；约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-30 mM的pH为约5.0-6.5的组氨酸缓冲剂；和约40-100 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
3.权利要求1的制剂，其包含：18-20 mg/mL的抗LAG3抗体；4-7 mg/mL的抗PD-1抗体；约50-60 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约8-12 mM的pH为约5.0-6.5的组氨酸缓冲剂；和约40-70 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
4.权利要求1至3中任一项的制剂，其进一步包含约5-15 mM L-甲硫氨酸。
5.权利要求1至3中任一项的制剂，其进一步包含约5-10 mM L-甲硫氨酸。
6.权利要求1的制剂，其包含：约18.75 mg/mL的抗LAG3抗体；约6.25 mg/mL的抗PD-1抗体；约55 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约52.5 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约7.5 mM L-甲硫氨酸。
7.权利要求1的制剂，其包含：约20 mg/mL的抗LAG3抗体；约5 mg/mL的抗PD-1抗体；约54 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约56 mML-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约8 mM L-甲硫氨酸。
8.权利要求1的制剂，其包含：约20.83 mg/mL的抗LAG3抗体；约4.17 mg/mL的抗PD-1抗体；约53 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约58.3 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；且进一步包含约8.3 mM L-甲硫氨酸。
9.权利要求1的制剂，其包含：约18.02 mg/mL的抗LAG3抗体；约4.505 mg/mL的抗PD-1抗体；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；和约70 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐；和进一步包含约10 mM L-甲硫氨酸。
10.制剂，其包含：约3-300 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段和约3-300 mg/mL的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中抗LAG3抗体与抗PD-1抗体或其抗原结合片段的摩尔比为4:1，总赋形剂浓度为约25-250 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐、NaCl和KCl的赋形剂，以及pH为约4.5-8的缓冲剂，其中所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:39的CDRL1、SEQ ID NO:40的CDRL2和SEQ ID NO:41的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2和SEQ ID NO:44的CDRH3，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含可变轻链区和可变重链区，所述可变轻链区包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3，且所述可变重链区包含SEQ ID NO:6的CDRH1、SEQ ID NO:7的CDRH2和SEQ ID NO:8的CDRH3。
11.权利要求10的制剂，其包含：约10-200 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段，和约4-200 mg/ml的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，总赋形剂浓度为约25-250 mM的一种或多种选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或其药学上可接受的盐和NaCl的赋形剂，以及pH为约5-8的缓冲剂。
12.权利要求10的制剂，其中所述赋形剂是浓度为约25-250 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
13.权利要求10的制剂，其中所述赋形剂是浓度为约40-100 mM的L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
14.权利要求10的制剂，其中所述赋形剂是总赋形剂浓度为约25-250 mM的NaCl和L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
15.权利要求14的制剂，其中NaCl与L-精氨酸的浓度比为1:1。
16.权利要求15的制剂，其中NaCl浓度为约35 mM，且L-精氨酸浓度为约35 mM。
17.权利要求15的制剂，其中NaCl浓度为约50 mM，且L-精氨酸浓度为约50 mM。
18.权利要求10的制剂，其中所述赋形剂是约40-150 mM的NaCl。
19.权利要求10的制剂，其中所述赋形剂是约25-200 mM的L-组氨酸。
20.权利要求10的制剂，其中所述L-组氨酸为约40-100 mM。
21.权利要求10-20中任一项的制剂，其中所述缓冲剂是L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐并且具有约1-30 mM的浓度。
22.权利要求10-21中任一项的制剂，其进一步包含非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂是聚山梨酯。
23.权利要求22的制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨酯80或聚山梨酯20。
24.权利要求1-23中任一项的制剂，其进一步包含糖，所述糖是非还原性二糖。
25.权利要求24的制剂，其中所述糖是海藻糖或蔗糖或其组合。
26.权利要求25的制剂，其中所述糖的浓度为约10-200 mg/ml。
27.权利要求10-23中任一项的制剂，其进一步包含多元醇，所述多元醇选自甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇。
28.权利要求27的制剂，其中所述多元醇的浓度为约10-200 mg/ml。
29.权利要求10至18中任一项的制剂，其进一步包含：约10-250 mg/mL的蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇或甘油；约0.005-2.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；和约3-300 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
30.权利要求10至18中任一项的制剂，其进一步包含：约30-120 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.5 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；和约3-150 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
31.权利要求10至20中任一项的制剂，其进一步包含：约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80；和约5-30 mM的pH为约5.0 -6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
32.权利要求10的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约50-90 mg/mL蔗糖或海藻糖；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约5-20 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
33.权利要求10的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约20-200 mg/mL甘油、山梨醇或PEG400；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
34.权利要求10的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约40-150 mM L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-脯氨酸或L-甲硫氨酸；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM L-精氨酸或其药学上可接受的盐。
35.权利要求10的制剂，其包含：约20-220 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约0.05-1.0 mg/mL聚山梨酯80或聚山梨酯20；约3-150 mM的pH为约5.0 - 6.5的L-组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；和约40-150 mM NaCl或其药学上可接受的盐。
36.权利要求10至35中任一项的制剂，其进一步包含约3-150 mM L-甲硫氨酸。
37.权利要求10至35中任一项的制剂，其进一步包含约5-70 mM L-甲硫氨酸。
38.权利要求10至37中任一项的制剂，其包含约20 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段。
39.权利要求10或37的制剂，其包含：约20 mg/mL的抗LAG3抗体或其抗原结合片段；约50 mg/mL蔗糖；约0.2 mg/mL聚山梨酯80；约10 mM的pH为约5.8-6.0的L-组氨酸缓冲剂；和约70 mM L-精氨酸或L-精氨酸-HCl。
40.权利要求1-39中任一项的制剂，其为液体制剂。
41.权利要求1-39中任一项的制剂，其被冷冻至至少低于–70℃。
42.权利要求1-39中任一项的制剂，其为从冻干制剂重构的溶液。
43.权利要求1-40中任一项的制剂，其中在40℃下，如通过尺寸排阻色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段和抗PD-1抗体或其抗原结合片段的百分比(%)单体为≥98%。
44.权利要求1-40中任一项的制剂，其中在5℃下，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于15%，如通过离子交换色谱所测量，在3个月后，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的%酸性变体小于20%。
45.权利要求1-44中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体或抗原结合片段包含：SEQ IDNO:37的轻链可变区序列和SEQ ID NO:58的重链可变区序列，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的重链可变区和SEQ ID NO:4的轻链可变区。
46.权利要求45的制剂，其中所述抗LAG3抗体包含SEQ ID NO:35的轻链序列和SEQ IDNO:57的重链序列，且所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链序列和SEQ ID NO:5的轻链序列。
47.权利要求1-44中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体是Ab6或Ab6变体，且所述抗PD-1抗体是派姆单抗或派姆单抗变体。
48.权利要求1-44中任一项的制剂，其中所述抗LAG3抗体是Ab6，且所述抗PD-1抗体是派姆单抗。
CN201980088309.1A 2018-11-07 2019-11-06 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂 Pending CN113316458A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862756678P 2018-11-07 2018-11-07
US62/756678 2018-11-07
PCT/US2019/059954 WO2020097139A1 (en) 2018-11-07 2019-11-06 Co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113316458A true CN113316458A (zh) 2021-08-27

Family

ID=70612309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980088309.1A Pending CN113316458A (zh) 2018-11-07 2019-11-06 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220002410A1 (zh)
EP (1) EP3876990A4 (zh)
JP (1) JP7503056B2 (zh)
KR (1) KR20210089215A (zh)
CN (1) CN113316458A (zh)
AU (1) AU2019377456A1 (zh)
BR (1) BR112021008873A8 (zh)
CA (1) CA3118144A1 (zh)
MX (1) MX2021005394A (zh)
WO (1) WO2020097139A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11845798B2 (en) 2017-05-02 2023-12-19 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
CN115484983B (zh) * 2020-06-19 2024-05-24 神州细胞工程有限公司 一种重组抗pd-1单克隆抗体的稳定制剂
US20230295329A1 (en) * 2020-07-31 2023-09-21 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody pharmaceutical composition and use thereof
WO2022126173A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 CSL Innovation Pty Ltd Protein formulations and uses thereof
WO2023059900A2 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Invivyd, Inc. Pharmaceutical formulations comprising anti-coronavirus s protein antibodies and uses thereof
WO2023211868A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Merck Sharp & Dohme Llc Stable formulations of anti-ilt4 antibodies or antigen-binding fragments thererof in combination with anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429264A (zh) * 2011-03-31 2013-12-04 默沙东公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体的稳定制剂和有关的治疗
US20160222116A1 (en) * 2013-09-20 2016-08-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
WO2017112621A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Formulations of engineered anti-il-10 antibodies
CN107001470A (zh) * 2014-08-19 2017-08-01 默沙东公司 抗‑lag3抗体和抗原结合片段
CN107743401A (zh) * 2015-04-17 2018-02-27 百时美施贵宝公司 包含抗pd‑1抗体和另外的抗体的组合的组合物
TW201806974A (zh) * 2016-05-18 2018-03-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之抗體分子
CN107922470A (zh) * 2015-08-07 2018-04-17 皮里斯制药有限公司 对lag‑3和pd‑1特异性的新型融合多肽
CN108025018A (zh) * 2015-05-29 2018-05-11 默沙东公司 用于治疗癌症的pd-1拮抗剂和cpg-c型寡核苷酸的组合产品

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003527334A (ja) * 1999-10-22 2003-09-16 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ａ３３抗原特異的免疫グロブリン産物を用いるａ３３抗原を発現する癌の影響を低減する方法
BR112018005349A2 (zh) 2015-09-28 2018-10-09 Suzhou Suncadia Biopharmaceuticals Co., Ltd. An anti-PD-1 antibody preparation and its application in medicine
US11845798B2 (en) * 2017-05-02 2023-12-19 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
AU2018277824A1 (en) * 2017-05-30 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of LAG-3 positive tumors
BR112021008679A8 (pt) * 2018-11-05 2023-04-11 Merck Sharp & Dohme Métodos para tratar câncer, e composição farmacêutica

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429264A (zh) * 2011-03-31 2013-12-04 默沙东公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体的稳定制剂和有关的治疗
CN107854439A (zh) * 2011-03-31 2018-03-30 默沙东公司 针对人程序性死亡受体pd‑1的抗体的稳定制剂和有关的治疗
US20160222116A1 (en) * 2013-09-20 2016-08-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
CN107001470A (zh) * 2014-08-19 2017-08-01 默沙东公司 抗‑lag3抗体和抗原结合片段
US20170267759A1 (en) * 2014-08-19 2017-09-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-lag3 antibodies and antigen-binding fragments
CN107743401A (zh) * 2015-04-17 2018-02-27 百时美施贵宝公司 包含抗pd‑1抗体和另外的抗体的组合的组合物
CN108025018A (zh) * 2015-05-29 2018-05-11 默沙东公司 用于治疗癌症的pd-1拮抗剂和cpg-c型寡核苷酸的组合产品
CN107922470A (zh) * 2015-08-07 2018-04-17 皮里斯制药有限公司 对lag‑3和pd‑1特异性的新型融合多肽
WO2017112621A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Formulations of engineered anti-il-10 antibodies
TW201806974A (zh) * 2016-05-18 2018-03-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之抗體分子

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022512855A (ja) 2022-02-07
US20220002410A1 (en) 2022-01-06
JP7503056B2 (ja) 2024-06-19
EP3876990A1 (en) 2021-09-15
CA3118144A1 (en) 2020-05-14
EP3876990A4 (en) 2023-09-06
WO2020097139A1 (en) 2020-05-14
BR112021008873A8 (pt) 2023-04-11
MX2021005394A (es) 2021-07-06
KR20210089215A (ko) 2021-07-15
AU2019377456A1 (en) 2021-05-27
BR112021008873A2 (zh) 2021-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7382232B2 (ja) 抗ｌａｇ３抗体の製剤および抗ｌａｇ３抗体と抗ｐｄ－１抗体との共製剤
JP7503056B2 (ja) 抗ｌａｇ３抗体および抗ｐｄ－１抗体の共－製剤
KR102624564B1 (ko) 항-ctla4 항체 단독의, 및 프로그램화된 사멸 수용체 1 (pd-1) 항체와 조합된 항-ctla4 항체의 안정한 제제 및 그의 사용 방법
US20190076532A1 (en) Formulation for anti-alpha4beta7 antibody
JP2024016177A (ja) 単独のおよびプログラム死受容体１（ｐｄ－１）抗体と組み合わされた抗ｔｉｇｉｔ抗体の安定な製剤、ならびにその使用方法
TWI761869B (zh) 包含抗cd47/pd-l1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途
WO2021023267A1 (zh) 包含抗pd-1/her2双特异性抗体的制剂及其制备方法和用途
CN116710071A (zh) Pd1/pd-l1抗体的皮下施用
EA034583B1 (ru) ПРИМЕНЕНИЯ АНТИ-α4β7 АНТИТЕЛА

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220829

Address after: new jersey

Applicant after: MERCK SHARP & DOHME B.V.

Address before: new jersey

Applicant before: MERCK SHARP & DOHME Corp.