JP2003527334A

JP2003527334A - Ａ３３抗原特異的免疫グロブリン産物を用いるａ３３抗原を発現する癌の影響を低減する方法

Info

Publication number: JP2003527334A
Application number: JP2001532810A
Authority: JP
Inventors: バーバス、カルロス、エフ．、スリー; レイダー、クリストフ; リター、ガード; ウェルト、シドニー; オールド、ロイド、ジェイ．
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2003-09-16
Also published as: AU1097301A; AU1102401A; WO2001030393A8; EP1233790A2; WO2001030393A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、１または複数の新規相補性決定領域およびフレームワーク領域を含む免疫グロブリン産物に結合した抗癌剤の薬学的に有効な量を患者に投与することにより、患者における癌の影響を低減する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）（関連出願）本出願は、１９９９年１０月２３日に出願された米国特許出願０９／４２５，
６３８（本明細書中で参考として援用される）の一部継続出願である。

【０００２】（発明の分野）本発明は、Ａ３３抗原に特異的に結合する免疫グロブリン産物に関する。特に
、本発明は、Ａ３３抗原特異的ＣＤＲに関する。タンパク質などの抗体をヒト化
することができる。

【０００３】（背景および先行技術）治療薬としての抗体の使用は、種々の病態（癌型）の治療における重要且つ価
値のあるアプローチとして認められつつある。抗体の特異性により、「マーカー
」が異常細胞の特性を示す病態の治療に特に有用である。抗体は、目的の型の細
胞中、特に細胞上に存在する分子であるこれらのマーカーへの結合によってこの
ような細胞を有効に標的する。

【０００４】最初の抗体製造への進出には、対象動物としてマウスが使用された。要約する
と、マウスに目的の分子を注射した。この分子はマウスにとって外来物であるの
で、抗体応答が生じる。ついで、最終的に診断または治療用にマウスの血液また
は血清から抗体を精製した。

【０００５】しかしながら、多数の理由によりマウス抗体のｉｎｖｉｖｏでの使用は縮小
されている。ヒト宿主によって外来物として認識されるマウス抗体は、いわゆる
「ヒト抗マウス抗体」すなわち「ＨＡＭＡ」応答を惹起する。例えば、Ｓｃｈｉ
ｆｆ，ｅｔａｌ．、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、４５、８７９〜８８５（１９８５）
を参照のこと。さらに、マウス抗体のＦｃ部分は、ヒト捕体または細胞媒介毒性
の刺激に有効ではない。

【０００６】このような問題を回避するための広範且つ徹底的な努力が払われてきた。この
ようなアプローチの１つは、キメラ抗体の開発である。例えば、一般的アプロー
チを開示している欧州特許出願１２０６９４および１２５０２３を参照のこと。
キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変部
およびヒト抗体の定常部など）を含む。このようなキメラの利点は、マウス抗体
の特異性を保持するが、ヒトＦｃ捕体固定も刺激することである。しかし、この
ようなキメラは依然としてＨＡＭＡ応答を惹起することができる。例えば、Ｂｒ
ｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０、２１５３〜
２１５７、１９８９を参照のこと。

【０００７】これらの問題を多少とも解決するさらなるアプローチが考えられている。英国
特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａおよび米国特許第５，５８５，０８９号は、本分
野における技術の例である。これらの引例は、置換された抗体の一部のみが相補
性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体を産生する過程を開示して
いる。ＣＤＲ移植技術を使用して、マウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク、
および定常部からなる抗体が産生されている。例えば、このような「ヒト化」抗
体に関する教示については、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ
、３３２、３２３〜３２７、１９８８を参照のこと。これらの抗体は、Ｆｃ依存
性エフェクター機能に必要であるがＨＡＭＡ応答をほとんど惹起しないヒト定常
部を保持する。

【０００８】一般に、マウスＣＤＲのヒトＣＤＲへの置換では、有効なヒト化抗体は生成さ
れない。ヒト化抗体は、ヒト可変部に少数の重要なマウス抗体残基を含まなけれ
ばならない。重要な特定の残基は、マウス抗体およびヒト抗体の両構造に依存す
る。例えば、Ｈａｒｒｉｓｅｔａｌ．のＷＯ０４３８１を参照のこと。

【０００９】これらの問題にもかかわらず、Ｗａｌｌａｃｅｅｔａｌ．に付与された米
国特許第５，９５２，５８４号およびＷｅｌｔｅｔａｌ．に付与された同第
５，９５８，４１２号（その両方が参考として援用される）で証明されているよ
うに、ヒト化抗体はさらにより利用可能となりつつある。

【００１０】米国特許第５，９５８，４１２号は、「Ａ３３」といわれる分子に対するヒト
化抗体を記載している。この分子は、結腸癌に関連することが公知である。例え
ば、米国特許第５，６４３，５５０号および同第５，１６０，７２３号（参考と
して援用される）を参照のこと。Ａ３３分子の単離および特徴づけを教示してい
るＯｌｄｅｔａｌ．に付与された米国特許第５，７１２，３６９号（参考と
して援用される）も参照のこと。

【００１１】ファージディスプレイは、組換え抗体を発現および選択するために使用されて
いる方法である。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．、１６（６）、５３５〜５３９、１９９８（参考として援用される
）を参照のこと。以下に開示の方法を使用する。

【００１２】ウサギＩｇ遺伝子レパートリーは十分に特徴づけられている。例えば、Ｋｎｉ
ｇｈｔ，ｅｔａｌ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５６、１７９〜２１８、１
９９４を参照のこと。ファージ上に表示された組み合わせ抗体ライブラリーのス
クリーニングによる特徴づけによって、モノクローナル抗体の選択が可能である
（Ｒｉｄｄｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９５（１５）
、８９１０〜１５、１９９８）。以下で考察の情報と共にこの情報を使用して、
本明細書中に記載の発明を開発した。

【００１３】免疫グロブリンの構造は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮｅｗＹ
ｏｒｋ、１９９３などの標準的なテキストブック（参考として援用される）で考
察されている。

【００１４】（好ましい実施形態の詳細な説明）Ａ．定義インサート：構造遺伝子および任意に追加したＤＮＡ配列からなる、宿主にと
って外来性のＤＮＡ配列。

【００１５】構造遺伝子：ポリペプチドをコードし、適切なプロモーター、終結配列、およ
び任意に他のＤＮＡ調節配列と作動可能に連結されている核酸分子。

【００１６】プロモーター：遺伝子の発現調節エレメントを提供し、ＲＮＡポリメラーゼが
特異的に結合して、その配列のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列および
ＤＮＡ配列群上の認識部位。

【００１７】誘導可能プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始速度を外部刺激に
よって調整するプロモーター。このような刺激には、光、熱、嫌気ストレス、栄
養状態の変化、代謝産物の有無、リガンドの存在、微生物の攻撃、損傷などが含
まれる。

【００１８】多量体タンパク質：１つを超える別のポリペプチドまたはタンパク質が互いに
会合して１つのタンパク質を形成している球状タンパク質。ヘテロ二量体および
ホモ二量体は共に多量体タンパク質である。

【００１９】ポリペプチドおよびペプチド：隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基と
の間がペプチド結合によって互いに連結している直鎖状の連続するアミノ酸残基
。

【００２０】タンパク質：ポリペプチドとして互いに連結した直鎖状の連続する約５０個を
超えるアミノ酸残基。

【００２１】Ｆａｂ断片：互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽
鎖の免疫学的に活性な部分を含み、抗原と特異的に結合することができる免疫グ
ロブリン分子の一部からなるタンパク質。Ｆａｂ断片は、典型的には、当該分野
で周知の方法を使用した実質的に無傷の免疫グロブリン分子のパパインでのタン
パク質分解消化によって調製されるが、Ｆａｂ断片はまた、当該分野で周知の方
法を使用した宿主細胞中での免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の所
望の部分の発現によっても調製することができる。

【００２２】Ｆ_v 断片：互いに共有結合した免疫グロブリン重鎖可変部および免疫グロブリ
ン軽鎖可変部の免疫学的に活性な部分からなり、抗原と特異的に結合することが
できるタンパク質。Ｆ_v 断片は、典型的には、当該分野で周知の方法を使用した
宿主細胞中での免疫グロブリン重鎖可変部および免疫グロブリン軽鎖可変部の所
望の部分の発現によって調製される。

【００２３】Ｖ_L ＣＤＲ１、Ｖ_L ＣＤＲ２、およびＶ_L ＣＤＲ３は、それぞれ、免疫グロブ
リン軽鎖相補性決定領域１、２、および３を示す。

【００２４】Ｖ_H ＣＤＲ１、Ｖ_H ＣＤＲ２、およびＶ_H ＣＤＲ３は、それぞれ、免疫グロブ
リン重鎖相補性決定領域１、２、および３を示す。

【００２５】Ｖ_L ＦＲ１、Ｖ_L ＦＲ２、Ｖ_L ＦＲ３、およびＶ_L ＦＲ４は、それぞれ、免疫
グロブリン軽鎖フレームワーク領域１、２、３、および４を示す。

【００２６】Ｖ_H ＦＲ１、Ｖ_H ＦＲ２、Ｖ_H ＦＲ３、およびＶ_H ＦＲ４は、それぞれ、免疫
グロブリン重鎖フレームワーク領域１、２、３および４を示す。

【００２７】免疫グロブリンスーパーファミリー分子：免疫グロブリンまたは免疫グロブリ
ン関連ドメインに有意に類似のドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する
分子。類似性の有意性は、Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．、９１、５２４〜５４５、１９８３（参考として援用される）に記載の
Ａｌｉｇｎプログラムなどのコンピュータプログラムを使用して統計的に決定さ
れる。３未満の典型的なＡｌｉｇｎスコアは、試験した分子が免疫グロブリン遺
伝子スーパーファミリーのメンバーであることを示す。免疫グロブリンスーパー
ファミリーの例には、以下のメンバーが含まれる：免疫グロブリン重鎖（すなわ
ち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥの重鎖および軽鎖κおよび
λ）、Ｔ細胞レセプター（α、β、γ、Ｘ、ＣＤ３）、主要組織適合抗原（クラ
スＩＨ鎖、β₂ ミクログロブリン、クラスＩＩ（αおよびβ））、β₂ ミクログ
ロブリン関連抗原（ＴＬＨ鎖、Ｑａ−２Ｈ鎖、ＣＤ１ａＨ鎖）、Ｔリンパ球抗原
（ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８鎖Ｉ、ＣＤ８鎖ＩＩｄ、ＣＤ２８、およびＣ
ＴＬＡ４）、造血／内皮抗原（ＬＦＡ−３、ＭＲＣＯＸ−４５）、脳／リンパ
系抗原（Ｔｈｙ−１、ＭＲＣＯＸ−２）、免疫グロブリンレセプター（ポリＩ
ｇＲ、Ｆｃγ２ｂ／γ１Ｒ、ＦｃεＲＩ（α））、神経分子（神経接着分子、ミ
エリン関連ｇｐ、Ｐ₀ ミエリンタンパク質、腫瘍抗原（癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
）、成長因子レセプター（血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター、コロニ
ー刺激因子１（ＣＳＦ１）レセプター）、非細胞表面分子（α₁ Ｂ−糖タンパク
質、基底膜結合タンパク質）、およびＡ３３抗原（Ｈｅａｔｈｓｅｔａｌ．
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４、４６９〜４７４、１９９７
）（例えば、ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＢａｒｃｌａｙ、「免疫グロブリン遺
伝子」、３６１頁、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９および「
免疫学的に重要なグロブリンタンパク質配列」、第４版、米国保健社会福祉省、
１９８７を参照のこと）。

【００２８】エピトープ：免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部。決
定基または抗原決定基ともいう。

【００２９】二重特異性抗体（または異種抗体）：２つの異なる抗原決定基に特異的な結合
部位を含む多価抗体。各抗体または抗体断片が異なる抗原特異性を有する場合、
２つの完全なモノクローナル抗体（「全ＡＨＣ」）の共有結合（Ｂ．Ｋａｒｐｏ
ｖｓｋｙ，ｅｔａｌ．、１９８４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６０（６）、１
６８６〜１７０１）によるか、２つのモノクローナル抗体ＦａｂまたはＦａｂ’
断片（「一価ＡＨＣ」）の結合（Ｍ．Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、１９８５、２２９（１７０８）、８１〜８３）によって二重特異性抗体
を抗体ヘテロコンジュゲートとして化学合成することができる。あるいは、二重
特異性抗体を、「ハイブリッドハイブリドーマ」（２つのモノクローナル抗体産
生細胞の細胞融合物）から産生することができる（Ｃ．Ｌ．Ｒｅａｄｉｎｇ、「
ハイブリドーマおよび細胞不死」、Ｂ．Ｈ．Ｔｏｍｅｔａｌ．編、１９８４
、（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、２３５；Ｕ．Ｄ．Ｓｔａ
ｅｒｚｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８６、
８３、１４５３〜１４５７；Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａｅｔａｌ．、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８７、１７、１０５〜１１１；Ｄ．Ｂ．Ｒｉ
ｎｇｅｔａｌ．、「乳房上皮抗原：臨床適用への分子生物学」、Ｒ．Ｃｅｄ
ａｎｉ編、１９９１、（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、９１
〜１０４）。

【００３０】Ｂ．ヒト化抗体の産生法本発明の１つの実施形態は、特異的抗原に結合するヒト化抗体の一部としての
ヒト化抗体の産生法に関する。本方法は、免疫応答を惹起する量の特異的抗原で
ウサギを免疫化する工程と、ウサギの抗体産生細胞からＲＮＡを単離する工程と
、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程と、抗原に結合するウサギ抗体の一部をコー
ドするｃＤＮＡの一部とヒト抗体の非結合部分をコードするｃＤＮＡとを組み合
わせてウサギｃＤＮＡおよびヒトｃＤＮＡからなるハイブリッド分子を形成する
工程を包含する。その後、ハイブリッド分子を宿主細胞に挿入し、宿主細胞を培
養してハイブリッド分子のタンパク質産物を発現させる。最後に、ハイブリッド
タンパク質を単離する。

【００３１】ヒト化抗体またはヒト化抗体の一部は、ウサギＣＤＲおよびヒト定常部からな
り得る。ヒト化抗体は、Ｆａｂ断片であり得る。さらに、抗体は、細胞表面上に
存在する分子または分子の一部であり得る。例えば、抗原は、新生物（例えば、
癌）細胞の細胞表面上に存在する分子または分子の一部であり得る。癌細胞は、
結腸癌細胞であり得る。本発明の１つの特定の実施形態では、抗原はＡ３３抗原
であり得る。使用する宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞であり得る。

【００３２】本発明の別の実施形態は、上記の任意の方法によって作製されたヒト化抗体に
関する。ヒト化抗体は、配列番号２０、２１、２２、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、
５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、
または６７のアミノ酸配列を含み得る。

【００３３】Ｃ．Ａ３３抗原に対する免疫グロブリン産物本発明の１つの実施形態は、Ａ３３抗原に特異的に結合する免疫グロブリン産
物に関する。免疫グロブリン産物は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の免疫学的
に活性な部分または少なくとも免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含
むことで抗原と特異的に結合することができるポリペプチド、タンパク質、また
は多量体タンパク質である。免疫グロブリン産物の例は、免疫グロブリン重鎖、
免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン分子、二重特異性抗体、実質的に無傷の免
疫グロブリン分子、パラトープを含む免疫グロブリンの任意の部分（当該分野で
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂ 断片、およびＦｖ断片として公知の
部分を含む）である。免疫グロブリン産物の構造は、当業者に周知であり、「基
礎および臨床免疫学」、Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔａｌ．、第４版、ＬａｎｇｅＭ
ｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＬｏｓＡｌｔｏｓ、Ｃａｌｉｆに
記載されている。

【００３４】本発明の別の実施形態は、Ａ３３抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子
などの免疫グロブリン産物に関する。免疫グロブリン分子は、互いに共有結合し
た免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含み
、抗原と特異的に結合することができる多量体タンパク質である。免疫グロブリ
ン分子は、Ａ３３および第２の非Ａ３３エピトープにアフィニティーを有する二
重特異性抗体であり得ることに留意すべきである。

【００３５】本発明の別の実施形態は、Ａ３３抗原に特異的に結合する一本酸抗原結合タン
パク質に関する。単鎖抗原結合タンパク質は、（１）Ｖ_L 配列のカルボキシル末
端がＶ_H 配列のアミノ末端に連結しているか、（２）Ｖ_H 配列のカルボキシル末
端がＶ_L 配列のアミノ末端に連結しているペプチドによって免疫グロブリン重鎖
可変部アミノ酸配列（Ｖ_H ）につながれている免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ
酸配列（Ｖ_L ）から構成されるポリペプチドである。Ａ３３抗原に特異的に結合
する単鎖抗原結合タンパク質をコードする単鎖抗原結合タンパク質コード遺伝子
、単鎖抗原結合タンパク質をコードする組換え遺伝子もまた、本発明で意図され
る。単鎖抗原結合タンパク質の構造は、例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６、１９８８およびＬａｄｎｅｒに付与され
た米国特許第４，７０４，６９２号に記載されている。

【００３６】免疫グロブリン（すなわち、抗体分子）は、いくつかの分子型（ＩｇＤ、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）を含む大きな分子ファミリーである。抗体
分子は、典型的には、２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）（それぞれが可
変部（Ｖ）および定常部（Ｃ）を有する）を含む。免疫グロブリン分子のいくつ
かの異なる領域は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する免疫グロブリン遺伝子の単
離に有用な保存配列を含む。免疫グロブリン分子についての模範的に保存された
配列を表示する広範なアミノ酸および核酸配列データは、Ｋａｂａｔｅｔａ
ｌ．によって「免疫学的に重要なタンパク質配列」、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ，Ｍｄ．、１９８７（参考として援用される）にまとめられている。

【００３７】ＨまたはＬ鎖のＶ領域は、典型的には、それぞれが保存配列の長さを含む相対
的に可変性の程度が低いフレームワーク（ＦＲ）領域（図１）を含む。

【００３８】１つの特に有用な免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖である。免疫グ
ロブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖可変部および免疫グロブリン重鎖定常部か
らなる。免疫グロブリン重鎖可変部は、抗原結合部位（および抗体結合部位）を
含むポリペプチドである。免疫グロブリン重鎖可変部は、特定のエピトープに特
異的に結合することができる。好ましくは、Ｖ_H は、約１１０〜約１２５アミノ
酸残基長である。アミノ酸残基配列は、Ｖ_H が結合することができる特定のエピ
トープに依存して広範に変化する。

【００３９】本発明の１つの実施形態は、患者の結腸癌の影響の低減法に関する。この方法
では、薬学的有効量の抗癌剤を、Ａ３３抗原に特異的に結合する免疫グロブリン
産物に結合する。この抗癌剤−免疫グロブリン産物は、結腸癌の患者に投与して
癌の影響を低減するコンジュゲートである。特に、免疫グロブリン産物は、ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）、ＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）、ＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）、ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）、ＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）、ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）、ＮＮＧＩＳ（配列番号７５）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、ＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）、ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）およびＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）からなる群から選択される配列を有する１または複数のＣＤＲを含む。抗癌剤は
、カリケアミシン、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、および５
−フルオロウラシルからなる群から選択される薬物であり得る。さらに、抗癌剤
は、前記結腸癌のＤＮＡ活性を特異的に阻害するペプチドであり得る。使用する
ことができる他の抗癌剤には、放射性同位元素（ ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、⁹⁰Ｙ
、または ¹¹¹Ｉｎなど）が含まれる。

【００４０】本発明の免疫グロブリン産物はまた、例えば、ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列
番号６８）またはＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）の配列を有するＶ_L
ＣＤＲ１領域；配列ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）またはＧＡＳＤＬＥＴ（配
列番号７１）の配列を有するＶ_L ＣＤＲ２領域；およびＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ
（配列番号７２）またはＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）からなる配列
を有するＶ_L ＣＤＲ３領域を有する免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分
を含み得る。好ましい実施形態では、Ｖ_L ＣＤＲ１は配列ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶ
Ｓ（配列番号６８）を有し、Ｖ_L ＣＤＲ２は配列ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０
）を有し、Ｖ_L ＣＤＲ３は配列ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）を有す
る。

【００４１】免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン軽鎖の免疫活性部分を含み得る。この
軽鎖は、以下の配列：ＥＬＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号８１）、ＥＦＤＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８２）、ＥＬＶＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８３）、もしくは
ＥＬＶＬＴＱＴＰＰＳＬＳＰＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８４）の１つに対応するＶ_L ＦＲ１領域；または以下の配列：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８５）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８６）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＦＬＩＹ（配列番号８７）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹ（配列番号８８）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹ（配列番号８９）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＦＬＩＳ（配列番号９０）、もしくはＷＹＱＱＫＰＥＫＰＰＴＬＬＩＳ（配列番号９１）の１つに対応するＶ_L ＦＲ２領域；または以下の配列：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９２）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９３）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９４）、ＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９５）、もしくはＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番
号９６）の１つに対応するＶ_L ＦＲ３領域；または以下の配列：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９７）もしくはＦＧＡＧＴＮＶＥＩＫ（配列番号９８）の１つに対応するＶ_L ＦＲ４領域中の配列を含み得る。

【００４２】別の実施形態では、免疫グロブリン産物はまた、例えば、ＨＹＧＩＳ（配列番
号７４）またはＮＮＧＩＳ（配列番号７５）の配列を有するＶ_H ＣＤＲ１；配列
ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤ
ＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、またはＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ
（配列番号７８）のＶ_H ＣＤＲ２配列；およびＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ
（配列番号７９）またはＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）のＶ _H ＣＤＲ３配列を有する免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分を含み得る
。好ましい実施形態では、Ｖ_H ＣＤＲ１はＨＹＧＩＳ（配列番号７４）の配列を
有し、Ｖ_H ＣＤＲ２はＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）の
配列を有し、Ｖ_H ＣＤＲ３はＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）
の配列を有する。

【００４３】免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖の免疫活性部分を含み得る。この
重鎖は、以下の配列：ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号９
９）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
００）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＧＦＳ（配列番号１
０１）、ＱＱＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＴＬＴＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０２）、ＱＥＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０３）もしくはＱＥＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０４）の１つに対応するＶ_H ＦＲ１領域；または以下の配列：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＬ（配列番号１０５）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡ（配列番号１０６）、もしくはＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号１０７）の１つに対応するＶ_H ＦＲ２領域；または以下の配列：ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１０８）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１０９）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１０）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１１）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１２）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１３）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１４）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１５）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１６）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１７）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１８）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１９）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２０）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１２１）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２２）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１２３）、もしくはＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２４）、の１つに対応するＶ_H ＦＲ３領域；または以下の配列：ＷＧＱＧＴＬＶＴＩＳＳ（配列番号１２５）、もしくはＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２６）の１つに対応するＶ_H ＦＲ４領域中の配列を含み得る。

【００４４】別の実施形態では、免疫グロブリン産物は、（Ａ）ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（
配列番号６８）またはＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）の配列を有する
Ｖ_L ＣＤＲ１領域；ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）またはＧＡＳＤＬＥＴ（配
列番号７１）の配列を有するＶ_L ＣＤＲ２領域；およびＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ
（配列番号７２）またはＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）の配列を有す
るＶ_L ＣＤＲ３領域を有する免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分；なら
びに（Ｂ）ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）またはＮＮＧＩＳ（配列番号７５）の配
列を有するＶ_H ＣＤＲ１；配列ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号
７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、またはＹＩＹ
ＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）のＶ_H ＣＤＲ２配列；およびＤ
ＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）またはＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴ
ＲＬＤＬ（配列番号８０）のＶ_H ＣＤＲ３配列を含み得る。

【００４５】好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリン産物は、５００ｐＭより高い
アフィニティーでＡ３３抗原に結合する。より好ましくは、本発明の免疫グロブ
リン産物は、１００ｐＭより高いアフィニティーでＡ３３抗原に結合する。

【００４６】本発明の別の実施形態は、Ａ３３抗原に特異的に結合する実質的に純粋な免疫
グロブリン産物に関する。免疫グロブリン産物は、以下の配列：ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）、ＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）、ＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）、ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）、ＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）、ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）、ＮＮＧＩＳ（配列番号７５）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、ＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）、ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）またはＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）を有するアミノ酸の１または複数の配列を含みうる。

【００４７】１つの実施形態では、Ａ３３抗原に結合する実質的に純粋な免疫グロブリン産
物は、１または複数の軽鎖ＣＤＲもまた含む免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活
性な部分を含む。例えば、免疫グロブリン軽鎖Ｖ_L ＣＤＲ１は配列ＬＡＳＥＦＬ
ＦＮＧＶＳ（配列番号６８）またはＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）を
有し、Ｖ_L ＣＤＲ２は配列ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）またはＧＡＳＤＬＥ
Ｔ（配列番号７１）を有し、Ｖ_L ＣＤＲ３は配列ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列
番号７２）またはＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）を有し得る。好まし
い実施形態では、Ｖ_L ＣＤＲ１はＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）であ
り、Ｖ_L ＣＤＲ２はＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）であり、Ｖ_L ＣＤＲ３はＬ
ＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）である。

【００４８】別の実施形態では、Ａ３３抗原に結合する実質的に純粋な免疫グロブリン産物
は、１または複数の重鎖ＣＤＲもまた含む免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性
な部分を含む。例えば、免疫グロブリン重鎖では、Ｖ_H ＣＤＲ１は配列ＨＹＧＩ
Ｓ（配列番号７４）またはＮＮＧＩＳ（配列番号７５）を有し、Ｖ_H ＣＤＲ２は
配列ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳ
ＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、またはＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶ
ＮＧ（配列番号７８）を有し、Ｖ_H ＣＤＲ３は配列ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬ
ＤＬ（配列番号７９）またはＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）
を有し得る。好ましい実施形態では、Ｖ_H ＣＤＲ１はＨＹＧＩＳ（配列番号７４
）であり、Ｖ_H ＣＤＲ２はＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６
）であり、Ｖ_H ＣＤＲ３はＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）で
ある。

【００４９】別の好ましい実施形態では、以下から選択される少なくとも２つのポリペプチ
ド配列を含む：ウサギＶＬ１およびウサギＶＨ１；ウサギＶＬ２およびウサギＶ
Ｈ２；ウサギＶＬ３およびウサギＶＨ３；ヒトＶＬＡおよびヒトＶＨＡ、ヒトＶ
ＬＢおよびヒトＶＨＢ、ヒトＶＬＣおよびヒトＶＨＣ、ヒトＶＬＤおよびヒトＶ
ＨＤ、ヒトＶＬＥおよびヒトＶＨＥ；またはヒトＶＬＦおよびヒトＶＨＦ。

【００５０】別の実施形態では、実質的に純粋な免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重
鎖の免疫学的に活性な部分および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を
含み得る。例えば、免疫グロブリン軽鎖の活性な部分では、Ｖ_L ＣＤＲ１は配列
ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）またはＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列
番号６９）を有し、Ｖ_L ＣＤＲ２は配列ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）または
ＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）を有し、Ｖ_L ＣＤＲ３は配列ＬＧＧＹＳＧＳＳ
ＧＬＴ（配列番号７２）またはＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）を有し
得る。さらに、免疫グロブリン重鎖の活性な部分では、Ｖ_H ＣＤＲ１は配列ＨＹ
ＧＩＳ（配列番号７４）またはＮＮＧＩＳ（配列番号７５）を有し、Ｖ_H ＣＤＲ
２は配列ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹ
ＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、またはＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳ
ＷＶＮＧ（配列番号７８）を有し、Ｖ_H ＣＤＲ３は配列ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴ
ＲＬＤＬ（配列番号７９）またはＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８
０）を有し得る。

【００５１】本発明の免疫グロブリン産物は、抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ₂ 断片
、もしくは単鎖抗体またはその組み合わせもしくは多量体であり得る。多量体は
、免疫グロブリン産物の任意の連結された組み合わせであり得る。例えば、多量
体は、２つを超える、好ましくは４つを超える、または６つを超える抗体、抗体
断片、または互いに連結した単鎖抗体を含み得る。連結は、共有結合であり得る
。抗体およびポリペプチドならびにタンパク質の連結法は公知である。さらに、
連結はイオン結合であり得る。例えば、アビジンに連結したある抗体を、ビオチ
ンに連結させた別の抗体にイオン結合によって連結させることができる。連結し
た免疫グロブリン産物は、同一のアフィニティーを有する必要がない。例えば、
１つの連結した免疫グロブリン産物は、Ａ３３抗原に対して高いアフィニティー
を有し、別の連結した免疫グロブリン産物はＡ３３抗原に対して低いアフィニテ
ィーを有し、第３の連結した免疫グロブリン産物は、リシンなどの有毒な治療化
学薬品にアフィニティーを有し得る。

【００５２】免疫グロブリン産物は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥなど
の抗体分子またはこれらの分子の断片であり得る。免疫グロブリン産物は、１ｐ
Ｍより高い、好ましくは１０ｐＭより高い、より好ましくは１００ｐＭより高い
、さらにより好ましくは３００ｐＭより高い（例えば、５００ｐＭより高い）ア
フィニティーでＡ３３抗原と結合することができる。

【００５３】免疫グロブリン産物は、ウサギ由来のＡ３３抗原免疫グロブリン産物であり得
る。ウサギ由来抗Ａ３３抗原免疫グロブリン産物を、例えば、ウサギへのＡ３３
抗原の注射によって作製することができる。ウサギ抗Ａ３３抗原免疫グロブリン
産物の別の産生法を実施例の部に示す。

【００５４】本発明の別の実施形態は、ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）、ＬＡＳ
ＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）、ＧＡＳ
ＤＬＥＴ（配列番号７１）、ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）、ＬＧＧ
ＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）、ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）、ＮＮＧＩＳ
（配列番号７５）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、Ｙ
ＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、ＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹ
ＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）、ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７
９）、ＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）の配列を有する１また
は複数のＣＤＲペプチドを含むＣＤＲペプチドおよびタンパク質に関する。

【００５５】本発明の免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞レセプター、主
要組織適合抗原、β₂ ミクログロブリン関連抗原、Ｔリンパ球抗原、造血／内皮
抗原、脳／リンパ系抗原、免疫グロブリンレセプター、神経分子、腫瘍抗原など
の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり得る。

【００５６】さらに、本発明の免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活
性な部分を含み得る。活性部分は、ＥＬＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ
ＩＴＣ（配列番号８１）、ＥＦＤＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（
配列番号８２）、ＥＬＶＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号
８３）、またはＥＬＶＬＴＱＴＰＰＳＬＳＰＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８
４）の配列を有するＶ_L ＦＲ１であり得る。また、活性部分は、配列ＷＹＱＱＫ
ＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８５）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配
列番号８６）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＦＬＩＹ（配列番号８７）、ＷＹＱＱＫ
ＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹ（配列番号８８）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹ（配
列番号８９）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＦＬＩＳ（配列番号９０）、またはＷＹ
ＱＱＫＰＥＫＰＰＴＬＬＩＳ（配列番号９１）を有するＶ_L ＦＲ２であり得る。
活性部分は、配列ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡ
ＴＹＹＣ（配列番号９２）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱ
ＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号９３）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ
ＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号９４）、ＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴ
ＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号９５）、またはＧＶＰＰＲ
ＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号９６）を
有するＶ_L ＦＲ３であり得る。活性部分はまた、配列ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配
列番号９７）またはＦＧＡＧＴＮＶＥＩＫ（配列番号９８）を有するＶ_L ＦＲ４
であり得る。

【００５７】本発明の免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分
を含み得る。活性部分は、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡ
ＳＧＦＴＦＳ（配列番号９９）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳ
ＣＡＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１００）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳ
ＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＧＦＳ（配列番号１０１）、ＱＱＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴ
ＬＧＧＳＬＴＬＴＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１０２）、ＱＥＱＬＭＥＳＧＧ
ＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１０３）、またはＱＥ
ＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１０４
）の配列を有するＶ_H ＦＲ１であり得る。また、活性部分は、配列ＷＶＲＱＡＰ
ＧＫＧＬＥＷＩＬ（配列番号１０５）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡ（配列番
号１０６）、またはＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号１０７）を有する
Ｖ_H ＦＲ２であり得る。活性部分はまた、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬ
ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１０８）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡ
ＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１０９）、ＲＦＴ
ＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１１
０）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（
配列番号１１１）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶ
ＹＹＣＡＲ（配列番号１１２）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲ
ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１１３）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬ
ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１１４）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡ
ＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１１５）、ＲＦＴ
ＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１１
６）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（
配列番号１１７）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶ
ＹＦＣＡＲ（配列番号１１８）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲ
ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１１９）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬ
ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１２０）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡ
ＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１２１）、ＲＦＴ
ＩＳＳＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１２
２）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（
配列番号１２３）、またはＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ
ＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号１２４）を有するＶ_H ＦＲ３であり得る。活性部分
はまた、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＩＳＳ（配列番号１２５）またはＷＧＱＧＴＬＶ
ＴＶＳＳ（配列番号１２６）を有するＶ_H ＦＲ４であり得る。

【００５８】本発明の実施形態では、実質的に純粋な免疫グロブリン産物は、ヒト化免疫グ
ロブリンであり得る。

【００５９】別の実施形態は、本発明の実質的に純粋な免疫グロブリン産物をコードする精
製核酸分子に関する。本発明の免疫グロブリン産物をコードする核酸分子を、従
来技術を使用して作製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドを合成し
、互いにライゲーションして本発明の免疫グロブリン産物をコードする機能的読
み取り枠を形成させることができる。核酸分子は、一旦合成されると、核酸ベク
ターにクローン化することができる。プラスミド、コスミド、ファージミド、酵
母プラスミド、ファージベクター、ＴＩプラスミドなどの核酸ベクターは、当該
技術分野で公知である。ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターお
よび発現系は、市販されている。

【００６０】本発明の別の実施形態は、本発明の核酸を含む細胞に関する。細胞はトランス
フェクションによって作製することができる。トランスフェクション法は公知で
あり、原核細胞および真核細胞のトランスフェクト用キットを、業者から購入す
ることができる。

【００６１】本発明の別の実施形態は、免疫グロブリン産物とＡ３３抗原との間で複合体を
形成可能な条件下で患者由来の組織サンプルと本発明の実質的に純粋な免疫グロ
ブリン産物とを接触させる工程と、前記複合体の形成を決定する工程とを包含す
る、障害の検出または診断法に関する。

【００６２】本発明の別の態様は、本発明の免疫グロブリン産物または本発明の核酸を患者
に投与する工程を包含する、新生物障害患者の治療法に関する。癌の免疫療法は
公知である。例えば、Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、「癌の免疫療法」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１９９６、米国特許第５，８５
１，５２６号、および同第５，７１２，３６９号（全てが本明細書中で参考とし
て援用される）を参照のこと。

【００６３】別の実施態様は、本発明の免疫グロブリン産物を含む治療組成物に関する。本
発明の免疫グロブリン産物を、免疫グロブリンおよび薬学的に許容されうる担体
または希釈剤を含む組成物の形態で得ることができる。治療組成物を、ヒトなど
の哺乳動物の障害の治療に使用することができる。本発明はまた、治療有効量の
本発明の免疫グロブリン産物を哺乳動物に投与する工程を包含し、前記哺乳動物
が抗体での治療を必要とする癌などの障害を有する、哺乳動物の治療法を提供す
る。

【００６４】治療薬としてのその使用では、本発明の免疫グロブリン産物を、薬剤に連結す
ることができる。連結は、共有結合であるか抗体−エピトープ結合によってもよ
い。例えば、免疫グロブリン産物を、第２の抗体が薬剤に対してアフィニティー
を有し得る第２の抗体に架橋させることができる。薬剤は、細胞傷害剤であり得
る。本明細書中で使用される、用語「細胞傷害剤」は、細胞機能を阻害または防
止し、そして／または細胞破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同
位元素（例えば、 ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、⁹⁰Ｙ、 ¹¹¹Ｉｎ）、化学療法剤、ト
キシン（細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性トキシンなど）またはそ
の断片を含むことを意図する。薬剤は、化学療法剤であり得る。「化学療法剤」
は、癌治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ド
キソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」
）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール
、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマ
イシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、
ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン
、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エ
スペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン
、および他の関連ナイトロジェンマスタードが含まれる。薬剤は、サイトカイン
であり得る。用語「サイトカイン」は、細胞内媒介物として別の細胞上で作用す
る１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般的用語である。このよう
なサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチ
ドホルモンである。サイトカインのうち、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン、Ｎ
−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなど）；副甲状腺ホル
モン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン
；糖タンパク質ホルモン（濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（
ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）など）；肝成長因子；線維芽細胞成
長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子；ミューラー阻害物質；
マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因
子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（ＮＧＦなど）
；血小板増殖因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成
長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェ
ロン（インターフェロンα、β、およびγなど）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）
；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（
Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、
ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、Ｉ
Ｌ−１１、ＩＬ−１２、など）；腫瘍壊死因子；および他のポリペプチド因子（
ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む）が含まれる。本明細書中で使用さ
れる、用語「サイトカイン」には、天然の供給源または組換え細胞培養物由来の
タンパク質および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる
。

【００６５】診断用に、本発明の免疫グロブリン産物を標識に結合させることができる。本
明細書中で使用される、用語「標識」は、抗体に直接または間接的に結合した検
出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体が検出可能であっても
（放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合には検出可能な基質化合
物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。

【００６６】本発明は、１または複数のＣＤＲの配列中に１または複数のアミノ酸の変異に
よる開示されたＣＤＲの変異体の作製も意図していた。アフィニティーを向上さ
せるにはＣＤＲ中に適切に存在する１アミノ酸置換で十分であり得ることが公知
である。研究者は、いくつかの免疫グロブリン産物のアフィニティーを約１０倍
増大させるために部位特異的変異誘発を使用してきた。ＣＤＲの変異によるこの
抗体のアフィニティーの増減法は、一般的に知られている（例えば、Ｐａｕｌ，
Ｗ．Ｅ．、基礎免疫学、第２３章、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮＹ、ＮＹ１９
９３を参照のこと）。従って、結合アフィニティーおよび特異性を増減するため
の本発明のＣＤＲへのアミノ酸の置換、欠失、または付加もまた、本発明の範囲
内である。

【００６７】実施例１：ヒトＡ３３抗原に対する抗体の作製ヒトＡ３３抗原に対するモノクローナル抗体を作製するために、ニュージーラ
ンドホワイトラビットを、大量のＡ３３抗原を発現することが公知のヒト結腸癌
細胞株ＬＩＭ１２１５で４〜５ヶ月間免疫した。Ａ３３抗原を発現するのでＬ
ＩＭ１２１５を選択したことに留意すべきである。Ａ３３抗原を発現する任意
の他の細胞株を、ＬＩＭ１２１５の代わりに使用することができる。対象動物
に１０⁶ ＬＩＭ１２１５細胞を３回皮下注射後、ＬＩＭ１２１５細胞から精
製した１μｇのヒトＡ３３の細胞外ドメインを３回皮下注射した。１ｍｌのＲＩ
ＢＩアジュバントのリン酸緩衝化生理食塩水の乳濁液の形態のＡ３３を投与した
。

【００６８】このアプローチを使用して、治療に有用な抗体の開発の鍵となる細胞表面上で
アクセス可能なタンパク質の天然のエピトープに対する液性免疫応答を標的した
。

【００６９】ＬＩＭ１２１５細胞を３回注射後、抗原を３回注射した対象動物由来の抗血
清を試験した。抗血清を、組換えヒトＡ３３およびアルカリホスファターゼ結合
ヤギ抗ウサギＦｃポリクローナル抗体と組み合わせることによって試験を行った
。

【００７０】結果は、細胞注射後に弱い免疫応答が認められ、３回の抗原の注射後に強い免
疫応答が認められることを示した。

【００７１】実施例２：可変部配列の増幅およびキメラ抗体の作製前述の６回の免疫後から５日目に、脾臓細胞および片足由来の骨髄細胞を各動
物から回収した。標準的な方法を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。次いで
、標準的技術を使用して、第１のストランドｃＤＮＡをＲＮＡから合成した。次
いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ（３５サイクル）を介して増幅した。以下の種々のプラ
イマーを使用した： V _k 5'センスプライマー: 1.5'-gggcccaggcggccgagctcgtgmtgacccagactcca-3' (配列番号1) 2.5'-gggcccaggcggccgagctcgatmtgacccagactcca-3' (配列番号2) 3.5'-gggcccaggcggccgagctcgtgatgacccagactgaa-3' (配列番号3) V _k 3'アンチセンスプライマー: 1.5'-acagatggtgcagccacagttaggatctccagctcggtccc-3' ( 配列番号4) 2.5'-gacagatggtgcagccacagttttgatttccacattggtgcc-3' (配列番号5) 3.5'-gacagatggtgcagccacagttttgacsaccacctcggtccc-3' (配列番号6) V λ5'センスプライマー: 5'-gggcccaggcggccgagctcgtgctgactcagtcgccctc-3' (配列番号7) V λ3'アンチセンスプライマー: 5'-cgagggggcagccttgggctggcctgtgacggtcagctgggtccc-3' ( 配列番号8)。

【００７２】ＰＣＲを行うために、Ｖκを得るための単一の組み合わせだけでなくＶκ増幅
についての９つ全ての可能な組み合わせを使用した。さらに、配列番号９〜１３
によって４つの可能な組み合わせが得られた。すなわち、 V _H 5'センスプライマー: 1.5'-gctgcccaaccagccatggcccagtcggtggaggagtccrgg-3' (配列番号9) 2.5'-gctgcccaaccagccatggcccagtcggtgaaggagtccgag-3' (配列番号10) 3.5'-gctgcccaaccagccatggcccagtcgytggaggagtccggg-3' (配列番号11) 4.5'-gctgcccaaccagccatggcccagsagcagctgrtggagtccgg-3' (配列番号12) V _H 3'アンチセンスプライマー: 5'-cgatgggcccttggtggaggctgargagayggtgaccagggtgcc-3' ( 配列番号13) を使用してＶ_H を増幅した。アンチセンスプライマー（配列番号４〜６、８、お
よび１３）はウサギとヒト配列とのハイブリッドを示し、ウサギの可変ドメイン
とヒト定常部とを融合させる（すなわち、ウサギＶλまたはＶ_H とヒトＣκおよ
びＣ_H １への融合）ように設計されていることに留意すべきである。これらのヒ
ト定常部は、破傷風類毒素に対するヒトＦａｂを含む発現ベクターから増幅され
ている。例えば、Ｒａｄｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ、８（４）、５０３〜５０８、１９９７を参照のこと。

【００７３】この方法により、キメラウサギ／ヒト軽鎖およびＦｄ断片コード配列の構築お
よび融合ならびに２つの連続する重複伸長ＰＣＲ工程が可能である。第１の工程
では、gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c ( 配列番号14) および
gccatggctg gttgggcagc (配列番号15) を使用してウサギＶλおよびヒトＣκ断
片を融合し、 gctgcccaac cagccatggc c(配列番号16) および gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc (配列番号17) を使用してウサギ
Ｖ_H およびヒトＣ_H １を融合した。次いで、構築したキメラ軽鎖およびＦｄ断片
コード配列を、配列番号１４および配列番号１７を使用して融合した。同一の動
物由来の軽鎖およびＦｄ断片コード配列のみを組み合わせた。前述のＲａｄｅｒ
，ｅｔａｌ．に従って最終構築物をファージミドベクターにクローン化して、
２×１０⁷ 個の独立した形質転換体を得た。この方法は、所与の種由来の元の定
常ドメインを有する均一なＦａｂ形式を使用するアプローチを超えるいくつかの
利点を有する。第１に、抗原結合が可変ドメインに限定され、定常ドメインスワ
ッピングに影響を受けると予想されないという事実にもかかわらず、ヒト定常ド
メインにより複数の種由来のＦａｂと比較して確立され且つ標準化された検出お
よび精製様式が得られる。さらに、Ｕｌｒｉｃｈｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２（２５）、１１９０７〜１１、１９９
５では、このアプローチは、Ｆａｂの大腸菌発現レベルを改良することが示され
ている。また、Ｒａｄｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、９５（１５）、８９１０〜８９１５、１９９８（参考として援用
される）に報告のように、ヒト定常ドメインを有するＦａｂ分子は部分的にヒト
化され、完全なヒト化ストラテジーを容易に導くことができる。

【００７４】実施例３：キメラ抗体のスクリーニング実施例２（前述）で調製したファージライブラリーを、９６ウェルプレートの
１ウェルの被覆用に２００ｎｇのタンパク質の２５μｌＴＢＳ溶液を使用し、洗
浄用に０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＴＢＳ溶液を使用し、溶出用に
１０ｍｇ／ｍｌのトリプシンのＴＢＳ溶液を用いて組換えヒトＡ３３抗原に対し
て探索した。３７℃で３０分間トリプシン処理を行った。洗浄工程の回数を５回
（第１ラウンド）、１０回（第２ラウンド）、１５回（第３および第４ラウンド
）に増加した。

【００７５】西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗Ｍ１３ファージポリクローナル抗体
を使用したファージＥＬＩＳＡによって、各ラウンドのファージプールの産生を
モニターした。ラウンドからラウンドまでのバックグラウンドを超えるシグナル
の増加が認められ、第３および第４ラウンド後に産生数が大きく増加し、これは
選択が成功したことを示す。

【００７６】最終産生由来の４０個のクローンを成長させ、１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。
クローン由来の上清を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂
ポリクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡによって固定化組換えヒトＡ３３への
結合について試験した。全クローンは、バックグラウンドを超える強いシグナル
を発し、これを標準的な方法を使用したＤＮＡフィンガープリンティングに供し
た。簡単に述べれば、隣接プライマー： AAGACAGCTA TCGCGAATTG CAC ( 配列番号18) および GCCCCCTTAT TAGCCTTTGC CATC (配列番号19) を使用し、４塩基対を切断するＢｓｔＸＩを使用して消化した。３つの異なるが
非常に類似したフィンガープリントを得た。１３クローンで第１が、２６クロー
ンで第２が、１クローンで第３が認められた。図１にこれらを示す。配列番号２
０〜２２も参照のこと。

【００７７】分析により、可変ドメインに対応する配列はウサギであり、３クローンが高度
に関連していることが示された。クローン１および２（配列番号２０および２１
）は、同一のＶκコード配列を有し、Ｖ_H 配列と９０％同一であった。配列番号
２２は、配列番号２０および２１に９０％同一のＶκコード配列を有し、そのＶ _H 配列は配列番号２２の配列と同一であった。超可変ＶＤＪおよびＶＪ連結部Ｈ
ＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３は非常に類似しており、これにより、全ての選択した
配列が体細胞変異による多様化を受けた１つのＢ細胞クローンに由来することが
示唆される。

【００７８】実施例４：発現Ｆａｂの特徴づけウサギＶＨ１、ＶＬ１、およびウサギＶＨ２およびＶＬ２由来の可溶性Ｆａｂ
を、前述のＲａｄｅｒ，ｅｔａｌ．にしたがって大腸菌から生成させた。１ｍ
ＭＩＰＴＧで誘導後、平衡化および洗浄緩衝液としてＰＢＳを使用し、溶出用
に０．５Ｍ酢酸を使用したアフィニティークロマトグラフィーを行って、一晩培
養物の濃縮上清および超音波処理溶解物からＦａｂ分子を精製した。溶出画分を
０．５倍容積の１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を使用して即座に中和後
、プールした。物質を濃縮し、ＰＢＳと合わせた。標準的な方法を用いたＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって性質を分析した（図５）。次い
で、これをＦＡＣＳスキャンを使用したフローサイトメトリーに供した。各同定
用に、１×１０⁴ 細胞を分析した。２ｍｇ／ｍｌのＦａｂ、１％ｗ／ｖＢＳＡ、
２５ｍＭＨｅｐｅｓ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムのＰＢＳ溶液を
使用して、間接的免疫蛍光染色を行った。ＦＩＴＣ結合ロバ抗ヒトＦ（ａｂ¹ ） ₂ ポリクローナル抗体の希釈物（１：１００）を検出に使用した。一次抗体と共
に１時間および二次抗体と共に３０分間室温でインキュベーションを行った。結
果を図３にプロットする。

【００７９】フローサイトメトリーによって、Ｆａｂは共に天然のＡ３３抗原を発現する細
胞に特異的に結合することが明らかとなった。Ｒａｄｅｒ，ｅｔａｌ．、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５（１５）、８９１０〜８９１
５、１９９８（参考として援用される）にしたがって表面プラスモン共鳴によっ
て結合強度を決定した。簡単に述べれば、ウサギおよびヒト化Ｆａｂと組換えヒ
トＡ３３抗原との結合についての会合（ｋ_on）および解離（ｋ_off ）速度定数の
決定を、Ｂｉａｃｏｒｅインスツルメント（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エ
チル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドでの固定化のため
に、標準的方法に従ってＣＭ５センサーチップ（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を活性
化させた。組換えヒトＡ３３抗原を、３０μｌ〜４０μｌの１ｎｇ／μｌサンプ
ルの１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）溶液の注入によって表面に低密度で
カップリングした。約５００共鳴単位を固定した。その後、センサーチップを、
１Ｍエタノールアミンヒドロクロリド（ｐＨ８．５）で失活させた。Ｆａｂと固
定化Ａ３３抗原との結合を、７５ｎＭ〜２００ｎＭの範囲の５つの異なる濃度の
Ｆａｂ注射によって研究した。ランニング緩衝液としてＰＢＳを使用した。セン
サーチップを２０ｍＭＨＣｌで再生すると、少なくとも５０回の測定で活性な
ままであった。ＢｉａｃｏｒｅＡＢ評価ソフトウェアを使用して、ｋ_onおよび
ｋ_off 値を計算した。平衡解離定数Ｋ_d を、ｋ_off ／ｋ_onから計算した。異なる
センサーチップから得たデータにより、高い一貫性が明らかとなり、Ｒａｄｅｒ
ｅｔａｌ．（Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄＢａ
ｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．、ＩＩＩ、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９５、８９１０〜８９１５（参考として援用される））に記載の手
順にしたがってさらに評価した。

【００８０】Ｆａｂの結合は非常に強力であった（すなわち、１ｎＭ範囲のアフィニティー
）（図４）。配列番号２０および２１に関するＫｄ値は、それぞれ３９０ｐＭお
よび１．６ｎＭであった（図６、表Ｉ）。配列番号２０がより高い会合速度およ
び解離速度を示し、配列番号２１は一貫して高収量であった。これは、クローン
の大部分が配列番号２１を含んでいるという事実と併せて、高発現レベルは配列
番号２０の強力なアフィニティーと十分に競合することが示唆される。

【００８１】

【表１】実施例５：選択したウサギ可変ドメインのヒト化これらの実験は、前述の選択したウサギ可変ドメインのヒト化を記載する。第
１に、アミノ酸配列アラインメントを使用してヒトＶ遺伝子配列のＶＢＡＳＥデ
ィレクトリ（http://www.mrc-.cpe.cam.ac.uk/imt-doc1）（参考として援用され
る）をスクリーニングし、本明細書中に記載のウサギ配列に最も高い相同性を有
するヒト生殖系列ＶλおよびＶκ配列を同定した。詳しく調べるために、まずウ
サギ配列をヒトＶおよびＪ遺伝子と整列させた。Ｖ_H ３ファミリー由来のヒトＶ
遺伝子ＤＰ−７７（３〜２１）およびヒトＪ遺伝子Ｊ_H １は最も高い相同性を示
した。使用したＶκ配列（ウサギ）は、Ｖκ１ファミリー由来のヒトＶ遺伝子Ｄ
ＰＫ−４（Ａ２０）およびヒトＪ遺伝子Ｊκ４と最も適合した。これらのヒト配
列は、ウサギ配列と最高のアラインメントが得られるだけでなく、ヒト抗体レパ
ートリーに頻繁に認められる。例えば、ｄｅＷｉｌｄｔ，ｅｔａｌ．，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８５（３）、８９５〜９０１、１９９９を参照のこと。
さらに、これらはヒトＶ遺伝子ＤＰ−４７（３〜２３）およびＤＰＫ−９（０２
）に非常に関連し、そのフレームワークは、マウス抗体ハイブリッド形成に使用
されており、両者は大腸菌で発現させた場合高収量であった。例えば、Ｐｒｅｓ
ｔａ，ｅｔａｌ．、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５７（２０）、４５９３〜９、１９
９７を参照のこと。実際、Ｖ_H ３ファミリー重鎖とＶκ１ファミリー軽鎖との対
は、天然のヒト抗体中で最も頻繁に認められる組み合わせである。これにより、
組み合わせが免疫沈黙であることが示唆される。

【００８２】高発現の理由により、配列番号２のＣＤＲ配列を使用した。前述のＫａｂａｔ
，ｅｔａｌ．に記載の６つの可変ドメインをヒトフレームワーク配列に移植し
た。ウサギ「ＨＣＤＲ２」（前述のＫａｂａｔｅｔａｌ．）中の第６２位に
潜在的な免疫原性トリプトファンが存在し、これをセリンに変換した。

【００８３】ヒトＶ_H フレームワーク中の６つの位置およびヒトＶκフレームワーク中の４
つの位置の多様化によりフレームワークの「細かい調整」を行った（表２）。選
択した残基は、抗原結合に関連することが公知のキーフレームワーク残基から選
択した。これらのヒト配列の分析により、ヒト配列は、抗原結合に潜在的に関与
する位置で多様化していることが示された。これらの配列をＫａｂａｔ，ｅｔ
ａｌ．、「免疫学的に重要なタンパク質配列」（第５版、米国保健社会福祉省、
公衆衛生省、国立衛生研究所、１９９１）（参考として援用される）に記載の６
つのウサギＣＤＲの移植用のフレームワークとして使用した。

【００８４】

【表２】重複ヌクレオチドを設計し、ＰＣＲを用いて、合成および構築して合成Ｖλお
よびＶ_H コード配列を作製した。ウサギ抗体ライブラリーの作製について前述の
手順に従い、最終構築物が完成された場合、構築物は、ウサギ抗体由来のファー
ジでの汚染を回避するためにクロラムフェニコール耐性遺伝子を保有するベクタ
ーにＳｆｉＩでクローン化された。得られたライブラリーは、１×１０⁷ 個の独
立形質転換体からなる（理論上の複雑性は２×１０⁷ ）ものである。

【００８５】以下のオリゴヌクレオチドをヒト化に使用し、ＬはＶ_L アセンブリ用のプライ
マーを示し、ＨはＶ_H アセンブリ用のプライマーを示す。

【００８６】 L1, 5 ’-gagctccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc tggccagtga gttccttttt aatggtgtat cc-3’（配列番号23） L2, 5 ’-agatgggacc ccagattcta aattggatgc accatagatc aggarcttag garctttccc tggtttctgc tgataccagg atacaccatt aaaaaggaac tc-3' （配列番号24） L3, 5'-aatttagaat ctggggtccc atctcggttc agtggcagtg gatctgggac agattwcact ctcaccatca gcagcctgca gsctgaagat gttgcaact -3'（配列番号25） L4, 5'-tttgatctcc accttggtcc ctccgccgaa agtcaaacca ctactaccac tataaccgcc tagacagtaa taagttgcaa catcttcags ctgcag-3' （配列番号26） L 隣接センス, 5'-gaggaggagg aggagggccc aggcggccga gctccagatg acccagtctc ca-3'（配列番号27） L アンチセンス隣接, 5'-gacagatggt gcagccacag ttcgtttgat ctccaccttg gtccctcc-3' （配列番号28） H1, 5'-gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctgga-3'（配列番号29） H2A, 5'-ccagctaatg ccatagtgac tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtct-3'（配列番号30） H2B, 5 ’-ccagctaatg ccatagtgac tgaagtcgat tccagaggct gcacaggaga gtct - 3’；（配列番号31） H3, 5 ’-ttcagtcact atggcattag ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc gcctacattt atcctaatta tgggagtgta gactacgcga gc - 3’；（配列番号32） H4A, 5 ’-gttcatttgc agatacastg agttcttggc gttgtctctg gagatggtga atcggccatt cacgctgctc gcgtagtcta cactcccata - 3 ’；（配列番号33） H4B, 5 ’-gttcatttgc agatacastg agttctgggc gttgtcgagg gagatggtga atcggccatt cacgctgctc gcgtagtcta cactcccata - 3 ’；（配列番号34） H5, 5 ’-aactcastgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt atattwctgt gcgagagatc ggggttatta ttctggtagt - 3 ’；（配列番号35） H6, 5 ’-tgaggagacg gtgaccaggg tgccctggcc ccagagatcc aaccgagtcc ccctactacc agaataataa ccccgatc - 3’；（配列番号36） H 隣接センス, 5 ’-gctgcccaac cagccatggc cgaggtgcag ctggtggagt ctggggga - 3’；（配列番号37） H 隣接アンチセンス, 5 ’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgacc agggtgcc-3’（配列番号38）。

【００８７】形質転換体を前記のように探索したが、使用抗原量は一連の探索を通して減少
させた。最初の２ラウンドでは、１００ｎｇを使用し、その後の２ラウンドは５
０ｎｇを使用し、２ラウンドは２５ｎｇを使用した。０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅ
ｅｎ２０のＴＢＳ溶液を使用して、各ラウンドについて洗浄工程を１０回行っ
た。ラウンド３および４、ならびにラウンド５および６をファージ増幅を行わな
いで連結した。これを行うために、ラウンド３および５のファージを５０μｌの
１００ｍＭＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）を用いて溶出させ、室温で１０分
間インキュベートし、回収し、３μｌの２ＭＴｒｉｓ塩基および５０μｌの１
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＴＢＳ溶液で中和した。ついで、ファージを別のラウンド
の選択に直接供した。ラウンド１、２、４、および６由来のファージを前記のよ
うにトリプシン処理によって溶出させた。

【００８８】最終産生から７０個のクローンが得られた。その全ては、ＥＬＩＳＡによって
陽性であることが見出された。７０個のクローンのうちの２４個を、ＤＮＡ配列
決定によってさらに分析した。

【００８９】これらのクローン（全部で１２配列）のうち６個の重鎖および軽鎖配列を、図
１でヒトＶＬＡ、ＶＬＢ、ＶＬＣ、ＶＬＤ、ＶＬＥ、ＶＬＦ、ＶＨＡ，ＶＨＢ、
ＶＨＣ、ＶＨＤ、ＶＨＥ、ＶＨＦと示す。Ｖ_H の多様化フレームワークにコンセ
ンサス配列が見出され、２４クローン中１６クローンでフレームワーク１中の第
２７位および２８位、ならびにフレームワーク３中の第７１位および７５位には
それぞれ元のウサギ残基であるイソロイシン、アスパラギン酸、ロイシン、およ
びグルタミンを含むことが見出された。３クローンは、第２７位および２８位に
ヒト残基であるフェニルアラニンおよびトレオニンを含み、第７１位および７５
位には、ヒト残基は含んでいなかった。多様化した位置のうち２つは変異を含ん
でいた。両者は、１つの点変異によるようであり、おそらくオリゴヌクレオチド
合成または構築の間の誤組み込みによって得られたようである。３クローンは第
２８位にグリシンを有し、フェニルアラニンは２クローンで第７１位に認められ
た。これらの５クローンは、特に、ＥＬＩＳＡで最も強い反応性を示した。フレ
ームワーク中の２つの残りの多様化された位置（すなわち、第７８位および９１
位）には有意なコンセンサス配列が得られなかったが、ヒト／ウサギ残基が無作
為に選択された。これはまた、Ｖλフレームワーク中の４つの多様化した位置の
うち３つの位置（フレームワーク２中の第４３位および４６位、フレームワーク
３中の第７１位）の場合であった。プロリン（ヒト残基）は、２４クローンのう
ち１８クローン（ＥＬＩＳＡで最も強力な反応性を示す５つの変異クローンを含
む）中のフレームワーク３中第８０位で見出された。

【００９０】次いで、前述の６クローン（ヒトＡ〜Ｆ、図１に記載のようにそれぞれＶＨお
よびＶＬを含む）を大腸菌によって可溶性Ｆａｂ分子として生成し、前記のよう
に精製した。１リットルの震盪フラッシュ培養物あたりの収量は０．５〜２ｍｇ
の範囲であった。フローサイトメトリーに供した場合、全Ｆａｂは天然のＡ３３
抗原を発現する細胞に結合した。ヒトＡ３３を発現しない細胞は認識されなかっ
た。

【００９１】上記のように行った表面プラスモン共鳴によって測定した蛍光強度はわずかに
異なり、これは固定化組換えヒトＡ３３に対するアフィニティーの相違に対応す
る。これにより、固定化組換え抗原について選択した抗体は細胞表面上で完全に
アクセス可能な天然のエピトープに結合するので相応する治療標的を構成するこ
とが強く示唆される。

【００９２】実施例６：新規のＡ３３抗体の特徴づけ組換えＡ３３抗原の調製：Ａ３３の全長コード配列を含む１．６ｋｂのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩｃＤＮＡ断
片をｐＢｌｕｅＢａｃ４輸送ベクターにサブクローン化した。Ａ３３の細胞外ド
メインのみを保有する輸送ベクター（ＥＣＤ−Ａ３３）を作製するために、３４
０ｂｐのＢｇＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅＢａｃ４／Ａ３３ベクターから
除去し、得られたプラスミドを２つの重複オリゴヌクレオチド（gatctccctccatg
aaccatcatcatcatcatcattgactgca およびgtcaatgatgatgatgatgatggttcatggaggga
（配列番号１２７））を使用して再ライゲーションした。アニーリングした場合
、これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ５’および３’末端にＢｇＩＩＩお
よびＰｓｔＩ部位およびＳＰＳＭＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２８）をコードする
配列ならびに両制限部位の間の終止コドンを作出する。ｐＢｌｕｅＢａｃ４／Ａ
３３およびｐＢｌｕｅＢａｃ４／Ａ３３−ＥＣＤ輸送ベクターでのＳｆ９細胞の
トランスフェクションおよび組換えウイルスの単離を、製造者（Ｉｎｖｉｔｏｒ
ｏｇｅｎ）の指示にしたがって行った。大規模発現のために、Ｓｆ９細胞を感染
多重度（ＭＯＩ）１０で組換えウイルスに感染させた。感染から３日後、細胞を
遠心分離によって回収し、組換えタンパク質の精製に直ちに使用した。発現タン
パク質を、以前に記載のように（Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、７９８、９１〜１０１）ジメチルピメリミデートを含
むプロテインＡ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズに固定したマウスｍＡｂＡ
３３を使用した免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

【００９３】ウェスタンブロット：結腸癌細胞のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．３％ＰＢＳ
溶液（ｐＨ７．５））溶解物を、還元（５％β−ＭＥ）および非還元条件下での
１０〜２０％のポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンプレキャストゲルによる
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦにブロットし、０．
５μｇ／ｍｌマウスＡ３３ｍＡｂまたはヒト化ＦａｂＢとともに４℃で一晩イ
ンキュベートした。アルカリホスファターゼ結合種特異的二次Ａｂによって特異
的結合を検出し、化学発光検出を使用して視覚化した。製造者の指示に従ってブ
ロッキングおよび洗浄工程を行った。

【００９４】血球吸着アッセイ：プロテインＡ被覆ヒトＲＢＣ（血液型Ｏ）の標的細胞への
接着によって表面結合Ｆａｂを検出するプロテインＡ、ウサギ抗ヒトＦ（ａｂ’
）₂ 混合血球吸着アッセイを、以前に記載のように行った（Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃ
ｈｕｈ，Ｍ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｗａｓ
ｈ．）、７５、５１２２〜５１２６、１９７８））。

【００９５】結果：ＦａｂＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＦを、ウェスタンブロットアッセイによ
って結腸癌細胞株から抽出したＡ３３抗原との反応性について分析した（図２）
。新規の全てのＦａｂは、非還元条件下で約４３ｋＤタンパク質のバンドと反応
した。還元条件下ではウェスタンブロット反応性は認められなかった（図２）。
ウサギファージディスプレイライブラリーから調製したＦａｂのこれらのウェス
タンブロット反応性は、マウスｍＡｂＡ３３を用いて得た反応性と同一であり
、これによりｍＡｂＡ３３について以前に記載のようにＡ３３抗原上の立体配
座エピトープの認識が示唆される（Ｃａｔｉｍｅｌ，Ｂ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２５６６４〜２５６７０）。

【００９６】混合血球吸着アッセイ：ＦａｂＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＦを混合血球吸着アッセイを使用してヒト癌細
胞株の細胞表面上に発現したＡ３３抗原との反応性について分析した。５つ全て
のＦａｂはＡ３３⁺ に結合したが、Ａ３３^- 癌細胞には結合しなかった（以下に
列挙）。ＦａｂＡおよびＢは、細胞表面発現Ａ３３抗原と最も強い反応性を示し
た。

【００９７】

【表３】ヒト化クローン間の相違は、固定化組換えヒトＡ３３抗原に対するアフィニテ
ィーの相違に相関することが見出された。ヒト化Ｆａｂを、ウェスタンブロッテ
ィングによって結腸癌細胞株から抽出したヒトＡ３３抗原との反応性についてさ
らに分析した。ヒト化クローンＢ（図２）で示されるように、ヒト化Ｆａｂは、
非還元条件下で約４３ｋＤのバンドと強く反応した。還元条件下では反応性は認
められず、ヒトＡ３３抗原上の立体配座エピトープの認識が示唆される（Ｃａｔ
ｉｍｅｌ，Ｂ．ｅｔａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、
２５６６４〜２５６７０）。まとめると、これらの結果は、選択されたヒト化抗
体は細胞表面で完全にアクセス可能なヒトＡ３３抗原上の天然のエピトープに結
合することを示す。

【００９８】実施例７：免疫組織化学。

【００９９】より複雑な独立系でヒト化Ｆａｂの選択性を評価するために、免疫組織化学に
よって腫瘍組織切片との反応性を分析した。瞬間冷凍し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物
（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した組織サンプルに
全ての免疫化学的染色を行い、０．５μｍの切片（ＨＭ５０３クリオスタット、
Ｚｅｉｓｓ、Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を免疫組織化学用にスライド
に置いた（ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）。異なる抗体調製物の染色結果を比較する
ために、連続切片を使用した。切断後、スライドを冷アセトンで１０分間固定し
、風乾した。ヌードマウスに異種移植した結腸癌細胞株ＳＷ１２２２を使用して
、ヒト化Ｆａｂの反応性を分析した。Ｆａｂの作用濃度（１ｐｇ／ｍｌ）を滴定
によって確立した。ヒト化Ｆａｂを、ビオチン化ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）₂ ポリク
ローナル抗体（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）およ
びアビジン−ビオチン複合体系（ＡＢＣ／Ｅｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ）に
よって検出した。色素原としてジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡ
Ｂ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、ＳａｎＲａｍｏｎ、ＣＡ）を使用した。ヒト結腸腺癌
サンプルにおいてもヒト化Ｆａｂの反応性を評価した。内因性ヒト免疫グロブリ
ンの免疫反応性を防止するために、特別なヒト化Ｆａｂ検出技術を利用した。組
織への添加前に、試験管中でヒト化Ｆａｂ（１μｇ／ｍｌ）をビオチン化ヤギ抗
ヒトＦ（ａｂ）₂ ポリクローナル抗体とインキュベートした。ヒト化Ｆａｂと二
次抗体との最適な比を、別の滴定アッセイで決定した。ヒト化Ｆａｂおよび二次
抗体のインキュベーションを室温で１時間行った後、ヒト血清を添加して、未結
合の二次抗体の活性をブロックした。別の滴定アッセイにおいて、ヒト血清と二
次抗体との最適な比を再度決定した。

【０１００】図８で認められるように、ヒト化Ｆａｂは、ヌードマウスで成長させたヒト結
腸癌細胞株ＳＷ１２２２の異種移植片と強力に反応した（図８Ａおよび８Ｂ）。
ヒト化Ｆａｂにより、内因性ヒト免疫グロブリンのブロッキング後のヒト結腸腺
癌の組織切片における形成異常腺構造が強く染色するマウスモノクローナル抗体
Ａ３３に類似の免疫反応性が明らかとなった（図８Ｃおよび８Ｄ）。内因性ヒト
免疫グロブリンの完全なブロッキング工程での染色とブロッキングを行わないで
染色した対応する組織切片との比較により、内部反応量（図８Ｆ）および完全な
ブロッキング（図８Ｅ）が示される。

【０１０１】本明細書で使用した用語および表現は、説明を目的として使用されたものであ
って、限定を目的とするものではなく、これらの用語および表現の使用に、上に
示し説明した特徴またはその一部と均等なものを排除する意図はなく、様々な変
更態様が本発明の範囲内で可能であると考えられる。引用したすべての参考文献
は、参照により本明細書に取り込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウサギ抗Ａ３３抗原の抗体のＶ領域のアミノ酸配列を示す図である。特に、３
つのウサギ抗体（ウサギ１、ウサギ２、およびウサギ３）を示す。さらに、ヒト
化抗体のＶ配列を示す。最後に、６つのヒト抗体（標識ヒトＡ〜Ｆ）のアミノ酸
配列を示す。ＶＬ鎖のアミノ酸１〜２２（ＦＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５
７〜８８（ＦＲ３）、および９８〜１０７（ＦＲ４）ならびにＶＨ鎖のアミノ酸
１〜３０（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、および１
０３〜１１３（ＦＲ４）におよそ対応するフレームワーク領域。ＣＤＲ領域は、
ＶＬ鎖のアミノ酸２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、および８
９〜９７（ＣＤＲ３）ならびにＶＨ鎖のアミノ酸３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０
〜６５（ＣＤＲ２）、および９５〜１０９（ＣＤＲ３）におよそ対応する。

【図２】ヒトＦａｂＢのヒトＡ３３抗原発現（ＬＩＭ１２１５、ＳＷ１２２２）お
よび非発現（ＳＷ６２０）ヒト結腸癌細胞株のＴｒｉｔｏｎＸ−１００抽出物
とのウェスタンブロット反応性を示す図である。アルカリホスファターゼ結合ヤ
ギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂ ポリクローナル抗体によって特異的結合を検出し、化学
発光を使用して視覚化した。左側に付した番号は、標準タンパク質の分子量（キ
ロダルトン（「ｋＤ」））を示す。

【図３】選択したウサギクローン１および２ならびに選択したヒトクローンＡ〜Ｆが、
細胞表面上で発現した天然のヒトＡ３３抗原に特異的に結合することを示すフロ
ーサイトメトリーのヒストグラムを示す図である。間接的免疫蛍光染色のために
、細胞をＦａｂとインキュベート後（コントロールを除く）、ＦＩＴＣ結合二次
抗体とインキュベートした。ヒト結腸癌細胞株ＬＩＭ１２１６（太線）およびＳ
Ｗ１２２２（細線）はヒトＡ３３抗原を発現することが公知であるが、ＨＴ２９
（点線）は公知ではない。ｙ軸は、均等目盛で事象数を示し、ｘ軸は対数目盛で
蛍光強度を示す。

【図４】ヒトＦａｂに対するアフィニティー測定の結果を示す図である。ヒトＡは、ヒ
トＶＬＡおよびＶＨＡをいい、ヒトＢは、ヒトＶＬＢおよびＶＨＢをいい、ヒト
Ｃは、ヒトＶＬＣおよびＶＨＣをいい、ヒトＤは、ヒトＶＬＤおよびＶＨＤをい
い、ヒトＥは、ヒトＶＬＥおよびＶＨＥをいい、ヒトＦは、ヒトＶＬＦおよびＶ
ＨＦをいう。

【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色による精製ウサギおよびヒト化
Ｆａｂの分析を示す。Ｆａｂを、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィ
ーによって大腸菌培養物から精製した。右側に付した数字は、標準タンパク質の
分子量（ｋＤ）を示す。

【図６】ウサギＦａｂ１と固定化ヒトＡ３３抗原との結合によって得られた代表的なＢ
ｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す図である。会合のために、Ｆａｂをｔ＝１２
５ないしｔ＝３７０秒の間、５μｌ／分の流速で、５つの異なる濃度（２００ｎ
Ｍ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ（上から下））を注入した
。解離のために、流速を５０μｌ／分の共鳴単位（ＲＵ）に増加した。

【図７】ヒト結腸癌組織切片におけるヒト化ＦａｂＢの免疫組織化学反応性を示す図
である。ＡおよびＢはヌードマウスにおけるヒト結腸癌細胞株ＳＷ１２２２の異
種移植片を示し、Ｃ〜Ｆは中程度に分化したヒト結腸腺癌の連続切片を示す。ス
ケールバー＝３００μｍ。ビオチン化ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）₂ ポリクローナル
抗体と、アビジン−ビオチン複合体系および色素原としてジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロリドを使用した視覚化によって特異的結合を検出した。（Ａ）ヒ
ト化ＦａｂＢによりＳＷ１２２２異種移植片で強い染色が認められた。（Ｂ）
ヒト化Ｆａｂを使用しない緩衝液のみの使用（ネガティブコントロール）では、
ＳＷ１２２２異種移植片の染色は認められなかった。（Ｃ）マウスモノクローナ
ル抗体Ａ３３は、ヒト結腸腺癌の形成異常腺構造に強い染色が認められた。（Ｄ
）ヒト化ＦａｂＢは、内因性ヒト免疫グロブリンのブロッキング後に対応する
癌領域で類似の染色を示した。内因性ヒト免疫グロブリンによるさらなる組織構
成成分の染色は検出不可能である。（Ｅ）ヒト化Ｆａｂを使用せず緩衝液のみを
使用する（ネガティブコントロール）が、内因性ヒト免疫グロブリンをブロッキ
ングすると、染色は認められなかった。（Ｆ）ヒト化Ｆａｂを使用せず緩衝液の
みを使用し（ネガティブコントロール）、内因性ヒト免疫グロブリンのブロッキ
ングを省略すると、内因性ヒト免疫グロブリンに強い染色が認められた。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/7034 Ａ６１Ｋ 31/7034 ４Ｃ２０６ 38/00 39/395 Ｄ４Ｈ０４５ 39/395 ＮＹ 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 1/00 51/00 35/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ｃ０７Ｋ 16/32 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 16/32 43/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (71)出願人ザスクリプスリサーチインスティチュートアメリカ合衆国カリフォルニア州ラジョラノーストリーパインズロード 10550 (72)発明者バーバス、カルロス、エフ．、スリーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92075、ソラナビーチ、パシフィックサーフドライブ 755 (72)発明者レイダー、クリストフアメリカ合衆国カリフォルニア州 92103、サンディエゴ、クレーブランドアベニューシャープ110 3950 (72)発明者リター、ガードアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、ヨークアベニュー 1275 (72)発明者ウェルト、シドニーアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、ヨークアベニュー 1275 (72)発明者オールド、ロイド、ジェイ．アメリカ合衆国ニューヨーク州 10021、ニューヨーク、ヨークアベニュー 1275 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA45 CA04 CA11 DA06 EA03 HA17 4C076 BB11 CC07 CC27 EE41 FF68 4C084 AA02 AA12 AA14 AA17 BA01 BA08 BA16 BA17 BA18 BA19 BA23 BA31 BA44 CA17 CA59 DA01 DA39 NA13 NA14 ZA662 ZB072 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA16 AA33 AA34 BB11 BB17 BB31 BB34 BB36 BB37 BB41 BB43 CC01 CC05 CC21 CC22 CC23 CC31 CC32 CC33 EE01 4C086 AA01 AA02 BC43 CB21 EA02 EA03 GA16 MA01 MA04 ZA66 ZB07 ZB26 4C206 AA01 AA02 HA26 MA01 MA04 NA13 NA14 ZA66 ZB07 ZB26 4H045 AA11 BA10 CA42 DA76 EA22 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者におけるＡ３３抗原を発現する癌の影響を低減する方法
であって、免疫グロブリン産物に結合した抗癌剤の薬学的に有効な量を前記患者
に投与することを含み、前記免疫グロブリン産物は、Ａ３３抗原に特異的に結合
し、下記：ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）、ＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）、ＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）、ＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）、ＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）、ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）、ＮＮＧＩＳ（配列番号７５）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）、ＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）、ＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）およびＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する１または複数の相補性決定領域（
ＣＤＲ）を含む、方法。
【請求項２】前記免疫グロブリン産物が、下記：ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）およびＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ１；ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）およびＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ２；ならびにＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）およびＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ３を含有する免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含む請求項１に記載の
方法。
【請求項３】前記免疫グロブリン産物が、下記：ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）およびＮＮＧＩＳ（配列番号７５）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ１；ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）およびＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ２；ならびにＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）およびＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ３を含有する免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分を含む請求項１に記載の
方法。
【請求項４】前記産物が免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分およ
び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含み、免疫グロブリン軽鎖の前記免疫学的に活性な部分は、下記：ＬＡＳＥＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６８）およびＬＡＳＤＦＬＦＮＧＶＳ（配列番号６９）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ１；ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７０）およびＧＡＳＤＬＥＴ（配列番号７１）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ２；ならびにＬＧＧＹＳＧＳＳＧＬＴ（配列番号７２）およびＬＧＧＹＳＧＳＡＧＬＴ（配列番号７３）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_L ＣＤＲ３を含有し、免疫グロブリン重鎖の前記免疫学的に活性な部分は、下記：ＨＹＧＩＳ（配列番号７４）およびＮＮＧＩＳ（配列番号７５）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ１ポリペプチド；ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＳＶＮＧ（配列番号７６）、ＹＩＹＰＮＹＧＳＶＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７７）およびＹＩＹＰＤＹＧＳＴＤＹＡＳＷＶＮＧ（配列番号７８）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ２ポリペプチド；ならびにＤＲＧＹＹＳＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号７９）およびＤＲＧＡＹＡＧＳＲＧＴＲＬＤＬ（配列番号８０）からなる群より選ばれた配列を有するＶ_H ＣＤＲ３ポリペプチドを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記癌が結腸癌または胃癌である請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記免疫グロブリン産物が抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ
ａｂ２断片、単鎖抗体、二重特異性抗体およびそれらの多量体からなる群より選
ばれたものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記抗体がＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥか
らなる群より選ばれたものである請求項５に記載の方法。
【請求項８】前記免疫グロブリン産物がウサギ免疫グロブリン分子の一部
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記免疫グロブリン産物が５００ｐＭよりも強いアフィニテ
ィーでＡ３３抗原に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記免疫グロブリン産物が１００ｐＭよりも強いアフィニ
ティーでＡ３３抗原に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記免疫グロブリン産物が免疫グロブリン遺伝子スーパー
ファミリーのタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記免疫グロブリン産物が配列番号６８、配列番号７０お
よび配列番号７２を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記免疫グロブリン産物が配列番号７４、配列番号７６お
よび配列番号７９を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】免疫グロブリン軽鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＥＬＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号８１）、ＥＦＤＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８２）、ＥＬＶＭＴＱＴＰＰＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８３）、およびＥＬＶＬＴＱＴＰＰＳＬＳＰＳＶＧＥＴＶＲＩＲＣ（配列番号８４）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_L ＦＲ１を有する請求項１に記載の方
法。
【請求項１５】免疫グロブリン軽鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８５）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号８６）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＦＬＩＹ（配列番号８７）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹ（配列番号８８）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹ（配列番号８９）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＦＬＩＳ（配列番号９０）、およびＷＹＱＱＫＰＥＫＰＰＴＬＬＩＳ（配列番号９１）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_L ＦＲ２を有する請求項１に記載の方
法。
【請求項１６】免疫グロブリン軽鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９２）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９３）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９４）、ＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番
号９５）、およびＧＶＰＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＧＧＶＱＡＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番
号９６）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_L ＦＲ３を有する請求項２に記載の方
法。
【請求項１７】免疫グロブリン軽鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９７）およびＦＧＡＧＴＮＶＥＩＫ（配列番号９８）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_L ＦＲ４を有する請求項２に記載の方
法。
【請求項１８】免疫グロブリン重鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号９
９）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
００）、ＥＶＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＧＦＳ（配列番号１
０１）、ＱＱＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＴＬＴＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０２）、ＱＥＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０３）およびＱＥＱＶＭＥＳＧＧＧＬＶＴＬＧＧＳＬＫＬＳＣＫＡＳＧＩＤＦＳ（配列番号１
０４）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_H ＦＲ１を有する請求項３に記載の方
法。
【請求項１９】免疫グロブリン重鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＬ（配列番号１０５）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡ（配列番号１０６）、およびＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号１０７）からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_H ＦＲ２を有する請求項３に記載の方
法。
【請求項２０】免疫グロブリン重鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１０８）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１０９）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１０）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１１）、ＲＦＴＩＳＦＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１２）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１３）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１４）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１５）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１６）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１７）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１１８）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１１９）、ＲＦＴＩＳＬＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２０）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１２１）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２２）、ＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番
号１２３）、およびＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番
号１２４）、からなる群より選ばれた配列を含有するＶ_H ＦＲ３を有する請求項３に記載の方
法。
【請求項２１】免疫グロブリン重鎖の前記免疫学的に活性な部分が、その
フレームワーク領域中に、下記：ＷＧＱＧＴＬＶＴＩＳＳ（配列番号１２５）、およびＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２６）からなる群より選ばれた配列を有するものからなる群より選ばれた配列を含有す
るＶ_H ＦＲ４を有する請求項３に記載の方法。
【請求項２２】前記免疫グロブリン産物がヒト化免疫グロブリンである請
求項１に記載の方法。
【請求項２３】前記免疫グロブリン産物がモノクローナル抗体である請求
項１に記載の方法。
【請求項２４】前記免疫グロブリン産物がヒト化抗体、キメラ抗体、三量
体化抗体、ヘテロ化抗体、単鎖抗体および抗体断片からなる群より選ばれたもの
である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】前記抗癌剤がカリケアミシン、ＱＦＡ、ＢＣＮＵ、ストレ
プトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選ば
れた薬剤である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】前記抗癌剤が前記結腸癌のＤＮＡ活性を特異的に阻害する
ペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項２７】前記抗癌剤が細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン
および放射性同位体からなる群より選ばれたものである請求項１に記載の方法。
【請求項２８】前記放射性同位体が ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、⁹⁰Ｙおよび
¹¹¹Ｉｎからなる群より選ばれたものである請求項２７に記載の方法。