KR20190104409A - Lag-3에 대하여 결합 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인 - Google Patents

Lag-3에 대하여 결합 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암, 감염성 질환 및 자가 면역 질환과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방을 위한 항암제 및/또는 면역 조절제와 같은 약제학적 응용에서 사용될 수 있는, LAG-3에 특이적으로 결합하는 인간 눈물 리포칼린 뮤테인을 제공한다. 본 발명은 인간 리포칼린 뮤테인이, MHC 클래스 II를 과발현하는 세포 상의 MHC 클래스 II로의 LAG-3의 결합을 억제할 수 있음을 추가로 보여준다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 LAG-3 결합 리포칼린 뮤테인의 제조 방법 및 이러한 리포칼린 뮤테인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 리포칼린 뮤테인 및 핵산 분자의 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 이들 리포칼린 뮤테인의 치료적 및/또는 진단적 용도 및 이러한 리포칼린 뮤테인 하나 이상을 포함하는 조성물을 개시한다.

Description

LAG-3에 대하여 결합 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인
I. 배경
림프구 활성화 유전자-3 또는 LAG-3(분화 클러스터 223 또는 CD223으로도 알려짐)은 면역글로불린 슈퍼유전자 패밀리의 막 단백질이다. LAG-3은 CD4와 구조적 및 유전적으로 관련이 있으며, CD4 유전자 근처 염색체 12번의 단완(short arm)의 원위 부분에 이의 인코딩 유전자가 위치하며, LAG-3 유전자가 유전자 중복을 통해 진화되었을 가능성이 있음을 시사한다(Triebel et al., J Exp Med, 1990). LAG-3은 휴지 말초혈액 림프구에서는 발현되지 않지만 활성화된 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포(Triebel et al., J Exp Med, 1990)에서 발현되며, 활성화된 B 세포(Kisielow et al., Eur J Immunol, 2005) 및 형질세포 모양(plasmacytoid) 수지상 세포(Workman et al., J Immunol, 2009)에서도 발현되는 것으로 보고되었다.
CD4와 마찬가지로, LAG-3은 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 II 분자에 결합하지만, 더 높은 친화성을 가지며 상이한 결합 부위에 결합한다(Huard et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1997). LAG-3에 의한 수지상 세포 상의 MHC 클래스 II 결합은 수지상 세포의 사이토카인 및 케모카인 프로파일의 변화를 유도한다(Buisson and Triebel, Vaccine, 2003). 또한, LAG-3은 수지상 세포에 의한 IL-12 및 TNF-α의 생성에 의해 입증되는 바와 같이 수지상 세포의 성숙을 일으키는 것으로 보고되었으며, 동종이형성 T-세포에 의한 증식 및 IFN-감마 반응을 자극하는 수지상 세포의 능력을 증진시킨다(Andreae et al., J Immunol, 2002). LAG-3 신호 전달 및 MHC 클래스 II 교차-결합은 인간 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 일차 활성화에서 초기 작용을 억제한다고 보고되었다(Macon-Lemaitre and Triebel, Immunology, 2005). 이는 T 세포의 세포 증식, 활성화 및 항상성을 음성적으로 조절한다.
CTLA-4 및 PD-1과 마찬가지로, LAG-3은 억제성 면역 수용체이다. T 세포 반응의 음성 조절 인자로서의 LAG-3의 탁월한 역할은 특히 녹아웃 마우스와 표적-특이적 항체 둘 모두를 기반으로 한 연구에서 PD-1과 관련해 인상적으로 입증되었다(Woo et al., Cancer Res, 2012). 이러한 연구에서, 이중(dual) 항-LAG-3/항-PD-1 항체 치료는 단일 항체 치료에 크게 저항하는 종양이 확립된 대부분의 마우스를 치유하였다. 또한, LAG-3/PD-1 이중(double) 녹아웃 마우스는 다중 이식 가능한 종양으로부터의 현저히 증가된 생존 및 이의 제거(clearance)를 보였다. 면역 체크포인트로서의 PD-1과 LAG-3의 강력한 결합된 역할에 대한 더욱 강력한 실험적 증거는 이중 녹아웃 마우스가 치명적 자가 염증에 걸리기 매우 쉽다는 사실에 의해 제공되었다.
따라서, 암, 장기 이식 거부의 치료 또는 예방, 또는 자가 면역 또는 자가 염증 질환의 치료에 중요한 용도를 가질 수 있는, T 세포, NK 세포, B 세포 및 형질세포 모양 수지상 세포와 같은 LAG-3+ 림프구의 반응을 조절하는 화합물에 대한 요구가 당업계에서 충족되지 않고 있다. 추가로, 높은 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있고, 향상된 생물학적 안정성을 가지고 있고, 약제학적 및/또는 진단적 응용에 사용될 수 있는 리포칼린 뮤테인을 갖는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 이러한 리포칼린 뮤테인을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 높은 결합 친화성 및 향상된 생물학적 안정성 특징을 갖는 이러한 리포칼린 뮤테인은 이전에 기술된 바 없다.
또한, 원숭이 대사가 인간의 대사와 가장 유사하다는 것이 자연스러운 것으로 간주되며, 이에 따라, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)가 새로운 생물학적 제제를 포함하는 새로운 치료법의 개발에서 약동학적 또는 약물-안전성 연구에 널리 사용되어 왔다. 이러한 연구는 추가적으로, 규제 승인에 필요한 전제조건일 수 있다. 따라서, 비슷하거나 유사한 결합 친화성을 포함해, 비슷한 결합 패턴으로 인간 및 사이노몰거스 LAG-3 둘 모두와 교차-반응성인 리포칼린 뮤테인을 갖는 것이 또한 바람직하다. 이들 교차-반응성 특징을 갖는 이러한 리포칼린 뮤테인은 이전에 기술된 바 없다.
본 출원에서의 임의의 참조문헌의 열거는 참조문헌이 본 출원에 대한 종래 기술임을 승인하는 것이 아니다.
이와 관련하여, 본 발명은 인간 및 사이노몰거스 원숭이 둘 모두의 LAG-3에 높은 친화성 및 향상된 생물학적 안정성 특징으로 특이적으로 결합함으로써, 면역 반응을 조절하는 신규한 화합물의 군을 제공한다. 이러한 화합물은 리포칼린으로부터 유래된 뮤테인이며, 약제학적, 진단적 또는 기타 응용에 사용될 수 있다. 리포칼린의 뮤테인은 급속하게 확대되고 있는 부류의 치료법이며, 원하는 표적에 대해 높은 친화성 및 특이성을 나타내도록 구성될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 WO 99/16873호, WO 00/75398호, WO 03/029471호, 및 WO 05/19256호 참조).
II. 정의
다음의 목록은 본 명세서 전체적으로 사용되는 용어, 어구 및 약어를 정의한다. 본 명세서에 열거되고 정의된 모든 용어는 모든 문법적 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "LAG-3"은 인간 LAG-3(huLAG-3)을 의미하며, 인간 LAG-3의 변이체, 이소형(isoform) 및 종 상동체를 포함한다. LAG-3은 "림프구-활성화 유전자 3", "분화 클러스터 223" 또는 "CD223"으로도 알려져 있으며, 이들은 상호 교환적으로 사용된다. 인간 LAG-3은 UniProt P18627(2009년 7월 7일자 버전 5)에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체를 의미한다. 사이노몰거스 LAG-3(cyLAG-3)은 사이노몰거스 원숭이의 LAG-3를 의미한다. CyLAG-3은 또한 서열번호: 56의 위치 1 내지 428에 개시된 cyLAG-3의 세포 외 도메인을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출 가능한 친화성"은 일반적으로 최대 약 10-5M 이하의 K d 또는 EC50(더 낮은 K d 또는 EC50 값은 더 나은 결합 활성을 반영한다)에 의해 측정되는 친화성으로 선택된 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 더 낮은 친화성은 ELISA(효소-연결 면역흡착 분석)와 같은 통상적인 방법에 의해 더 이상 측정 가능하지 않으며, 따라서 2차적 중요성을 가진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 선택된 표적(본원의 경우에, LAG-3)에 대해 본 발명의 단백질(예를 들어, 리포칼린 뮤테인) 또는 이의 융합 폴리펩타이드의 "결합 친화성"은 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다(이에 의해 뮤테인-리간드 복합체의 K d 값이 측정될 수 있다). 이러한 방법은 형광 적정, 경쟁 ELISA, 등온적정형 열량계(ITC)와 같은 열량 측정 방법, 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 당업계에 잘 확립되어 있으며, 이의 예를 또한 다음에 상술한다.
각각의 바인더와 이의 리간드 사이의 복합체 형성은 많은 상이한 인자들, 예컨대 각각의 결합 파트너들의 농도, 경쟁자의 존재, 사용되는 완충액 시스템의 pH 및 이온 강도, 및 해리 상수 K d의 측정을 위해 사용되는 실험 방법(예를 들어, 형광 적정, 경쟁 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 등의 단지 몇 가지 예) 또는 심지어 실험 데이터의 평가를 위해 사용된 수학적 알고리즘에 의해 영향을 받음을 주목한다.
따라서, 또한 K d 값(각각의 바인더와 이의 표적/리간드 사이에 형성된 복합체의 해리 상수)은 주어진 리간드에 대한 특정 리포칼린 뮤테인의 친화성을 측정하기 위해 사용한 방법 및 실험 설정에 따라, 특정 실험 범위 내에서 달라질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 이는, 예를 들어, K d 값이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 경쟁적 ELISA에 의해, 또는 직접적 ELISA에 의해 결정되었는지의 여부에 따라 측정된 K d 값 또는 허용 범위에서 약간의 편차가 있을 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뮤테인", "돌연변이된" 엔티티(단백질이든 또는 핵산이든) 또는 "돌연변이체"는, 천연 발생(야생형) 핵산 또는 단백질 "기준" 스캐폴드와 비교되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 상기 용어는 또한 본 명세서에 기술된 뮤테인의 단편 및 변이체를 포함한다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인, 이의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 LAG-3에 결합하는 기능을 보유한다.
본원의 뮤테인과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 N-말단 및/또는 C-말단이 단축된, 즉, N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산의 적어도 하나가 결여된 전장 성숙 인간 눈물 리포칼린(hTlc 또는 hTLPC)으로부터 유래된 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산의 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 5개, 최대 10개, 최대 15개, 최대 20개, 최대 25개 또는 최대 30개(중간의 모든 수 포함)를 결여할 수 있다. 예시적인 예로서, 이러한 단편은 4개의 N-말단 및 2개의 C-말단 아미노산을 결여할 수 있다. 단편은 바람직하게는 전장 눈물 리포칼린(뮤테인)의 기능적 단편이며, 이는 바람직하게는 그것이 유래된 전장 눈물 리포칼린(뮤테인)의 결합 포켓을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 예로서, 이러한 기능적 단편은 고유의 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 적어도 아미노산 5 내지 156을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 성숙 눈물 리포칼린의 1차 서열의 적어도 10개, 예컨대 20 또는 30개 이상의 연속 아미노산을 포함할 수 있고, 보통 성숙 리포칼린의 면역 분석에서 검출 가능하다.
일반적으로, 본원의 리포칼린 뮤테인의 또는 본원에 따른 조합물의, 또는 본 명세서에 기술된 융합 단백질의 상응하는 단백질 리간드 LAG-3에 대해 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 본원에 따른 뮤테인에 의해 인식되고/되거나 결합될 전장 리간드의 능력을 보유하는 N-말단 및/또는 C-말단이 단축된 단백질 또는 펩타이드 리간드에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이유발"은 성숙 리포칼린의 주어진 서열 위치에서 천연 발생하는 아미노산이 각각의 천연 폴리펩타이드 서열 내의 이 특정 위치에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산으로 치환될 수 있도록 실험 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 용어 "돌연변이유발"은 또한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의한 서열 세그먼트 길이의 (추가적인) 변형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 선택된 서열 위치에서 하나의 아미노산은 3개의 무작위 돌연변이의 신장에 의해 대체되어, 야생형 단백질의 각각의 세그먼트 길이에 비해 2개의 아미노산 잔기의 삽입을 야기한다는 것은 본 개시내용 범주 내이다. 이러한 삽입 또는 결실은 본원에서 돌연변이유발이 실시될 수 있는 임의의 펩타이드 세그먼트에서 서로 독립적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 하나의 예시적인 구현예에서, 선택된 리포칼린 스캐폴드의 루프 AB에 몇 가지 돌연변이의 삽입을 도입할 수 있다(본원에 전체가 참고로 인용된 국제 특허 공개 WO 2005/019256호 참조).
용어 "무작위 돌연변이유발"은 미리 결정된 단일 아미노산(돌연변이)이 특정 서열 위치에는 존재하지 않지만, 적어도 2개의 아미노산이 돌연변이유발 동안 미리 정해진 서열 위치에서 특정 확률로 혼입될 수 있음을 의미한다.
"동일성"은 서열의 유사성 또는 관계를 측정하는 서열의 특성이다. 본 개시내용에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 (당해 서열을 갖는 본원의 폴리펩타이드의 서열의 (상동성) 정렬 후에) 이들 두 서열 중 더 긴 것에서의 잔기 수에 대해 쌍별로 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기의 수를 잔기의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 측정한다.
용어 "상동성"은 본 명세서에서 이의 일반적인 의미로 사용되며, 동일한 아미노산뿐만 아니라 본원의 폴리펩타이드(예를 들어, 본 개시내용의 임의의 리포칼린 뮤테인)의 선형 아미노산 서열 내 동등한 위치에서 보존적 치환(예를 들어, 글루타메이트 잔기의 아스파르테이트 잔기에 의한 교환)으로 간주되는 아미노산을 포함한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성 백분율은, 예를 들어, 프로그램 BLASTP, 버전 blastp 2.2.5(2002년 11월 16일)(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997 참조)를 이용하여 본원에서 측정할 수 있다. 이 구현예에서, 상동성 백분율은 바람직하게는 쌍별 비교에서의 기준으로서 야생형 단백질 스캐폴드를 이용하여, 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 폴리펩타이드 서열(매트릭스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 컷 오프 값은 10-3으로 설정)의 정렬에 기반한다. 이는 BLASTP 프로그램 산출물에서의 결과로서 표시한 "양성"(상동성 아미노산)의 수를, 정렬을 위해 프로그램에 의해 선택된 아미노산의 총 수로 나눈 백분율로서 계산된다.
구체적으로, 리포칼린(뮤테인)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 야생형 리포칼린의 아미노산 서열에서 특정 위치에 상응하는 야생형 리포칼린과 상이한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 당업계에 잘 공지된 수단 및 방법, 예를 들어, 수동으로 또는 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 기본적 국소 정렬 검색 툴(Basic Local Alignment Search Tool)을 나타내는 BLAST 2.0 또는 클러스탈W(ClustalW) 또는 서열 정렬을 생성하는 데 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램을 이용하는 것에 의한 정렬을 사용할 수 있다. 따라서, 리포칼린의 야생형 서열은 "대상 서열" 또는 "기준 서열"로서 작용할 수 있는 반면, 본 명세서에 기재된 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린의 아미노산 서열은 "질의 서열"로서 작용한다. 용어 "야생형 서열" 및 "기준 서열" 및 "대상 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 바람직한 야생형 리포칼린의 서열은 서열번호: 1에 나타낸 hTlc의 서열이다.
"갭"은 아미노산의 부가 또는 결실의 결과인 정렬에서의 간격이다. 따라서, 정확하게 동일한 서열의 2개의 카피는 100%의 동일성을 갖지만, 덜 고도로 보존되고, 결실, 부가 또는 대체를 갖는 서열은 더 낮은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 당업자는 몇몇 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 BLAST(Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402), Blast2(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410), 및 스미스-워터만(Smith-Waterman)(Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197)이 표준 매개변수를 이용하여 서열 동일성을 결정하는 데 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 예를 들어 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형에 의한 아미노산 서열의 변형을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 유도체에 관한 것이다. 이러한 변형은 일부 구현예에서 단백질 또는 펩타이드의 작용기를 감소시키지 않는다. 이러한 변이체는 단백질을 포함하되, 하나 이상의 아미노산이 그들 각각의 D-입체이성질체에 의해 또는 천연 발생하는 20종의 아미노산 이외의 아미노산, 예를 들어, 오르니틴, 하이드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 하이드록시라이신, 노르발린에 의해 대체된 것이다. 그러나, 이러한 치환은 또한 보존적일 수 있으며, 즉, 아미노산 잔기는 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 대체이다: 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 본원의 리포칼린 뮤테인의 또는 본원에 따른 조합물의, 및/또는 융합 단백질의 상응하는 단백질 표적 LAG-3과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "변이체"는 LAG-3 또는 이의 단편과 관련이 있고, 본원에 기술된 바와 같이 UniProt에 기탁된 LAG-3 기준 단백질과 같은 야생형 LAG-3 단백질과 비교하여, 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 가진다. LAG-3 변이체는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 UniProt에 기탁된 인간 LAG-3 기준 단백질과 같은 야생형 LAG-3과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성을 가진다.
리포칼린의 "고유 서열"은 자연으로부터 유래된 상응하는 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 리포칼린의 서열을 의미한다. 따라서, 고유 서열 리포칼린은 임의의 유기체, 특히, 포유류로부터의 각각의 자연-발생 리포칼린의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 고유 서열 폴리펩타이드는 자연으로부터 분리될 수 있거나 또는 재조합체 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "고유 서열" 폴리펩타이드는 구체적으로는 리포칼린의 자연-발생 절단 또는 분비 형태, 리포칼린의 자연-발생 변이체 형태, 예컨대 대안적으로 스플라이싱된 형태 및 자연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드 "변이체"는 고유 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에서 부가되거나 또는 결실되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 변이체는 고유 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 약 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 예시적인 예로서, 본원의 hTlc 뮤테인에서 처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기(His-His-Leu-Leu, 서열번호: 51) 및 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(Ser-Asp)는 예를 들어, 서열번호: 7 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95의 단백질의 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 결실되거나 돌연변이될 수 있다.
본원에 따라 사용될 때 용어 "위치"는 본원에 도시된 아미노산 서열 내의 아미노산의 위치 또는 본원에 도시된 핵산 서열 내의 뉴클레오타이드 위치를 의미한다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열 위치와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "상응한다" 또는 "상응하는"을 이해하기 위해, 상응하는 위치는 선행하는 뉴클레오타이드/아미노산의 수에 의해서만 결정되지는 않는다. 따라서, 치환될 수 있는 본원에 따른 주어진 아미노산의 위치는 (돌연변이체 또는 야생형) 리포칼린에서 다른 곳에서의 아미노산의 결실 또는 부가에 기인하여 달라질 수 있다. 유사하게, 치환될 수 있는 본원에 따른 주어진 뉴클레오타이드의 위치는 프로모터 및/또는 임의의 다른 조절 서열 또는 유전자(엑손 및 인트론을 포함)를 포함하는 뮤테인 또는 야생형 리포칼린 5'-비번역 영역(UTR) 내 다른 곳에서의 결실 또는 추가적인 뉴클레오타이드에 기인하여 달라질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 "상응하는 위치"에 있어서, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치는 유사 이웃 뉴클레오타이드/아미노산과 표시된 번호가 상이할 수 있지만, 교환되거나 결실되거나 부가될 수 있는 상기 이웃 뉴클레오타이드/아미노산이 하나 이상의 "상응하는 위치"에 포함되는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 기준 서열에 기초한 리포칼린 뮤테인 내 상응하는 위치에 있어서, 비록 리포칼린 중에서 고도로 보존된 전체 폴딩 패턴에 비추어 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이 그들의 표시된 번호가 상이할 수 있을 지라도, 뉴클레오타이드/아미노산의 위치는 구조적으로 (돌연변이체 또는 야생형) 리포칼린 내에서 다른 위치에 상응하는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
용어 "알부민"은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 랫트 혈청 알부민과 같은 모든 포유류 알부민을 포함한다.
비-천연 표적에 대해 본원에서 사용되는 용어 "유기 분자" 또는 "소형 유기 분자"는 적어도 2개의 탄소 원자, 그러나 바람직하게는 7 또는 12개 이하의 회전 가능한 탄소 결합을 포함하는 유기 분자를 나타내며, 100 내지 2,000 달톤 범위, 바람직하게는 100 내지 1,000 달톤 범위의 분자량을 가지며, 선택적으로 1 또는 2개의 금속 원자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "검출한다", "검출", "검출 가능한" 또는 "검출하는"은 정량적 수준과 정성적 수준 둘 모두뿐만 아니라 이들의 조합으로도 이해된다. 따라서 이는 관심 대상 분자의 정량적, 반정량적 및 정성적 측정을 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는 제한은 없으나, 단지 몇 개의 예를 들면, 인간, 가축 및 농장 동물 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 반려 동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소, 랫트, 돼지, 유인원, 예컨대 사이노몰거스 원숭이를 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 바람직하게는, 본 명세서의 "포유류"는 인간이다.
"유효량"은 유리한 또는 목적으로 하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투약으로 투여될 수 있다.
"샘플"은 임의의 대상체로부터 취한 생물학적 샘플로서 정의된다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 대변, 정액 또는 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
III. 도면의 설명
도 1은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열과 비교하여, 최적화된 LAG-3 특이적인 인간 눈물 리포칼린(hTlc) 뮤테인의 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다. 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여, 이들 hTlc-유래, LAG-3-결합 뮤테인 (hTlc 뮤테인 서열번호: 7 내지 28 및 57 내지 70으로서 열거됨) 및 음성-대조군 뮤테인(서열번호: 3 및 4)에서 처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기(His, His, Leu, Leu; 서열번호: 50) 및 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(Ser, Asp)가 결실된다.
도 2는 실시예 5에 기재된 바와 같이 포유류 세포 상에서 발현되는 인간 LAG-3(도 2a) 및 사이노몰거스 LAG-3(도 2b)으로의 리포칼린 뮤테인의 특이적인 결합을 평가하기 위해 수행되는 형광-활성화 세포 분류(FACS) 연구의 결과를 각각 도시한 것이다. 인간 또는 사이노몰거스 LAG-3으로 안정적으로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 리포칼린 뮤테인과 인큐베이션시키고, 형광 표지된 항-hTlc 항체를 사용하여 결합된 뮤테인을 검출하였다. 모든 리포칼린 뮤테인은 시험된 벤치마크 항체(서열번호: 5 및 6)와 비슷한 EC50으로 CHO 세포 상에 발현되는 LAG-3으로의 결합을 보여준다. 음성 리포칼린 뮤테인 서열번호: 3 및 음성 대조군 인간 IgG4(hIgG4)(서열번호: 55 및 56, 시그마(Sigma) #I4639)는 결합을 보이지 않았다. 형광 세기의 기하 평균을 최대 평균으로 정규화시키고, 1:1 결합 모델과 핏팅시켰다. 초래된 EC50 값은 표 3에 제공되어 있다.
도 3은 경쟁적 FACS 실험에서 리포칼린 뮤테인이 LAG-3으로의 결합을 위하여 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 분자(LAG-3의 천연 리간드)와 경쟁하는 것을 보여준다. MHC 클래스 II 양성 인간 세포주 A375를 리포칼린 뮤테인 및 huLAG-3-Fc(인간 IgG1 Fc 단편에 융합된 인간 LAG-3 세포 외 도메인, 알앤디 시스템즈(R&D systems))와 인큐베이션시키고, 결합된 huLAG-3-Fc를 피코에리트린과 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 항체(잭슨 이뮤노리서치 래보러터리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), #109-1 16-098)를 사용하여 검출하였다. MHC 클래스 II 분자로의 huLAG-3-Fc 결합의, LAG-3 특이적 리포칼린 뮤테인에 의한, 용량 의존적 억제를 나타내었다. LAG-3 특이적 리포칼린 뮤테인 및 기준 분자(서열번호: 5 및 6)는 동일한 농도에서 LAG-3/MHC 클래스 II 결합에 억제 효과를 보였다. 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호: 3) 및 hIgG4 음성 대조군은 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 A375 세포로의 huLAG-3-Fc 결합의 측정 가능한 억제를 야기하지 않았다.
IV. 본 발명의 구체적인 내용
본 명세서에서 사용된 "리포칼린"은 한쪽 말단에서 복수의(바람직하게는 4개의) 루프에 의해 쌍별 연결되어, 결합 포켓을 정의하는 복수의(바람직하게는 8개의) β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트(β-pleated sheet) 슈퍼 2차 구조 영역을 갖는 약 18 내지 20 kDa 중량의 단량체 단백질로서 정의된다. 그 외에, 상이한 크기, 형상 및 화학적 특징을 가진 표적을 각각 수용할 수 있는, 리포칼린 패밀리 구성원들 사이에서 다양한 상이한 결합 방식을 야기하는 것은 경성의 리포칼린 스캐폴드 내 루프의 다양성이다(예를 들어, Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에 검토됨). 실제로, 리포칼린 단백질 패밀리는 비정상적으로 낮은 수준의 전체 서열 보존성(흔히 20% 미만의 서열 동일성)을 공유하지만 고도로 보존된 전체 폴딩 패턴을 유지하면서 넓은 범위의 리간드에 결합하여 자연적으로 진화해왔다. 다양한 리포칼린 내 위치 간의 상응성은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,250,297호 참조).
상기 언급한 바와 같이, 리포칼린은 한쪽 말단에서 4개의 루프에 의해 쌍별 연결되어, 결합 포켓을 정의하는 8개의 β-가닥을 포함하는 이의 슈퍼 2차 구조, 즉, 원통형 β-주름 시트 슈퍼 2차 구조 영역에 의해 정의된 폴리펩타이드이다. 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시된 리포칼린 뮤테인에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 본 발명은 한쪽 말단에서 4개의 루프에 의해 쌍별 연결되어, 결합 포켓을 정의하는 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트 슈퍼 2차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인에 관한 것이고, 여기서 상기 4개의 루프 중 적어도 3개의 각각의 적어도 하나의 아미노산이 기준 서열과 비교하여 돌연변이되고, 상기 리포칼린은 검출 가능한 친화성으로 LAG-3에 결합하는 데 효과적이다.
하나의 특정 구현예에서, 본원에 개시된 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린(hTlc 또는 hTLPC)의 뮤테인이며, 리포칼린-1, 인간 눈물 프리알부민 또는 폰 에브너 글랜드 단백질(von Ebner gland protein)로도 불린다. 본 명세서에서 사용된 용어 "인간 눈물 리포칼린" 또는 "hTlc" 또는 "리포칼린-1"은 SWISS-PROT/UniProt 데이터 은행 수탁 번호 P31025(이소형 1)를 갖는 성숙 인간 눈물 리포칼린을 나타낸다. SWISS-PROT/UniProt 데이터 은행 수탁 번호 P31025에 나타낸 아미노산 서열을 바람직한 "기준 서열"로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 "기준 서열"로서 본 명세서에서 사용한다.
일부 구현예에서, 검출 가능한 친화성으로 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인은 또 다른 아미노산, 예를 들어 세린 잔기에 의한 기준 서열의 고유 시스테인 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 검출 가능한 친화성으로 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인은, 야생형 리포칼린의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 하나 이상의 비-고유 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 추가의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 하나 이상의 시스테인 브릿지를 형성하기 위해, 시스테인 잔기에 의한 고유 아미노산의 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시스테인 브릿지는 적어도 2개의 루프 영역을 연결할 수 있다. 이들 영역의 정의는 본 명세서에서 Flower (Biochem J, 1996), (Biochim Biophys Acta, 2000) 및 Breustedt et al. (J Biol Chem, 2005)에 따라 사용된다. 관련된 구현예에서, 본원은 LAG-3에 결합함으로써 LAG-3의 하류 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 리포칼린 뮤테인을 교시한다.
LAG-3에 대해 유도되거나, 그에 특이적인 본 발명의 단백질은 정의된 단백질 스캐폴드, 바람직하게는 리포칼린 스캐폴드를 기본으로 하는 임의의 수의 특이적 결합 단백질 뮤테인을 포함한다. 또한 바람직하게는, 각각 교환, 결실 또는 삽입되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상, 예컨대 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개이고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개가 바람직하고, 9, 10 또는 11개가 더욱 바람직하다. 그러나, 본 발명의 단백질 뮤테인은 LAG-3에 여전히 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 검출 가능한 친화성으로 LAG-3에 결합하는 다양한 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 이러한 의미에서, LAG-3은 야생형 리포칼린의 비-천연 리간드로 간주될 수 있는데, 여기서 "비-천연 리간드"는 생리학적 조건하에서 야생형 리포칼린에 결합하지 않는 화합물을 의미한다. 특정 서열 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 야생형 리포칼린을 조작함으로써, 본 발명자는 비-천연 리간드, LAG-3에 대한 높은 친화성 및 높은 특이성이 가능함을 입증하였다. 일부 구현예에서, 야생형 리포칼린 상의 특정 서열 위치를 인코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 그 이상의 뉴클레오타이드 트리플렛(nucleotide triplet)에서, 무작위 돌연변이유발이 이들 위치에서 뉴클레오타이드 트리플렛의 서브세트에 의한 치환을 통해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 기준 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 특정 서열 위치에 상응하는 적어도 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 서열 위치를 포함하는, 임의의 하나 이상의 위치에서 돌연변이된 아미노산 잔기를 가질 수 있다.
본 발명의 단백질은 돌연변이된 아미노산 서열 위치 외부에 "모체(parental)" 단백질 스캐폴드(예컨대, 리포칼린 스캐폴드)의 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 또한 그러한 돌연변이가 적어도 본질적으로 뮤테인의 결합 활성 및 폴딩을 방해하거나 간섭하지 않는 한 하나 이상의 서열 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 지닐 수 있다. 이러한 돌연변이는 확립된 표준 방법(Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual)을 사용하여 DNA 수준에서 매우 쉽게 달성될 수 있다. 아미노산 서열의 변경의 예시적인 예는 아미노산 치환뿐만 아니라 삽입 또는 결실이다. 그러한 치환은 보존적일 수 있으며, 즉, 아미노산 잔기는 특히 극성 및 크기와 관련하여 화학적으로 유사한 성질의 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 대체이다: 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 다른 한편, 아미노산 서열에 비-보존적 변경을 도입하는 것도 가능하다. 또한, 결실 또는 삽입이 안정한 폴딩된/기능적 뮤테인을 야기한다면, 단일 아미노산 잔기를 대체하는 대신에, 바람직하게는 hTlc로서 기준 리포칼린의 1차 구조의 하나 이상의 연속 아미노산을 삽입하거나 결실시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 뮤테인에서, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 N- 또는 C- 말단에 부가되거나 결실된다(예를 들어, N-말단 및 C-말단이 절단된 hTlc 뮤테인). 일반적으로, 이러한 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)과 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 예로서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 hTlc 뮤테인을 포함하며, 성숙 인간 눈물 리포칼린의 서열의 처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기(His-His-Leu-Leu; 서열번호: 51; 위치 1 내지 4) 및/또는 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열의 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(Ser-Asp; 위치 157 내지 158)가 결실되어 있다(예를 들어, 서열번호: 7 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95 참조).
본 명세서에 개시된 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 다른 리포칼린과의 서열 동일성을 비교할 때 기준 리포칼린, 바람직하게는 hTlc에 대해 높은 서열 동일성을 갖는다. 이러한 일반적인 맥락에서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 기준 리포칼린의 아미노산 서열과 적어도 실질적으로 유사하지만, 정렬에서 아미노산의 부가 또는 결실의 결과인 갭(아래 정의된 바와 같은)이 있을 가능성을 가진다. 기준 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 각 서열은, 일부 구현예에서, 기준 리포칼린의 서열과 적어도 70%의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 75%의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 80%의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 82%의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 85%의 동일성 또는 서열 상동성, 적어도 87%의 동일성 또는 서열 상동성, 또는 적어도 90%의 동일성 또는 서열 상동성, 예를 들어, 적어도 95%의 동일성 또는 서열 상동성을 갖되, 단, 변경된 위치 또는 서열은 유지되고 하나 이상의 갭이 가능해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 결합 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이므로 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 그 표적과 하나 이상의 기준 표적을 구별할 수 있다면 표적(예를 들어, LAG-3)에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, "특이적인 결합"은 웨스턴 블롯, ELISA, FACS, RIA(방사면역분석), ECL(전기 화학 발광), IRMA(면역방사능측정 분석), IHC(면역조직화학) 및 펩타이드 스캔에 따라 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 단백질 도메인인 융합 파트너에 융합된다. 추가 특정 구현예에서, 단백질 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 또는 알부민 결합 단백질이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 화합물에 컨쥬게이트된다. 보다 바람직하게는, 뮤테인은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드록시에틸 스타치, 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 및 알부민 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 컨쥬게이트된다.
또 다른 구현예에서, 본원은 본 발명에 개시된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 상기 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
A. LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인
한 측면에서, 본원은 높은 친화성으로 인간 LAG-3에 결합하는 인간 리포칼린 뮤테인 및 이러한 뮤테인의 유용한 응용을 제공한다. 본원은 또한 본원에 기술된 LAG-3 결합 단백질을 제조하는 방법 및 상기 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원의 LAG-3 결합 단백질, 및 이의 조성물은, 샘플에서 LAG-3 단백질을 검출하는 방법 또는 면역 반응을 자극하거나 억제하기 위해 대상체에서 LAG-3을 결합시키는 방법에 사용될 수 있다. 개시된 LAG-3 결합 단백질은 향상된 생물학적 안정성을 가지며, 인간 및 사이노몰거스 LAG-3 둘 모두에 대하여 유사한 또는 비슷한 결합 패턴을 갖는다. 마지막으로, 본원은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 분자로의 LAG-3의 결합을 억제하기 위해 LAG-3에 대한 리포칼린의 뮤테인을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 용도에 부수하는 이들 특징을 갖는 인간 리포칼린 뮤테인은 이전에 알려져 있지 않았다.
1. LAG-3에 특이적인 예시적인 리포칼린 뮤테인.
본원의 일부 구현예는 약 80 nM, 60 nM, 40 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM 또는 심지어 더 낮은 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3, 바람직하게는 인간 LAG-3(huLAG-3)에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인에 관한 것이다. 이러한 친화성은 예를 들어, 본질적으로 실시예 4에 기술된 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, LAG-3 결합 리포칼린 뮤테인은 사이노몰거스 LAG-3(cyLAG-3)과 교차-반응성일 수 있으며, 일부 추가의 구현예에서, 약 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 또는 심지어 더 낮은, 예컨대 약 0.46 nM의 K d로 측정되는 친화성으로 cyLAG-3에 결합할 수 있다. 이러한 친화성은 예를 들어, 본질적으로 실시예 4에 기술된 SPR 분석에 의해 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 huLAG-3으로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 상의 LAG-3에 약 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.5 nM 또는 심지어 더 낮은, 예컨대 약 0.22 nM 또는 0.02 nM의 EC50 값으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 cyLAG-3으로 형질감염된 CHO 세포 상의 LAG-3에 약 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 심지어 더 낮은, 예컨대 약 9.3 nM의 EC50으로 결합할 수 있다. EC50 값은 예를 들어, 본질적으로 실시예 5에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APC) 또는 종양 세포에서 발현되는 것과 같은 MHC 클래스 II로의 LAG-3의 결합을 억제할 수 있다. 억제 작용 방식은 예를 들어 본질적으로 실시예 6에 기술된 저해제 FACS 분석에 의해 결정될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인을 제공한다.
이와 관련하여, 본원은 약 10 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 1.5 nM 이하, 1 nM 이하, 0.75 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.25 nM 이하, .1 nM 이하 또는 심지어 약 0.05 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는 하나 이상의 hTlc 뮤테인을 제공한다.
일부 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 14, 25 내지 26, 28, 31 내지 32, 52, 55, 58, 66, 79, 84, 86, 101, 105 내지 106, 108, 110, 112 내지 114 및 121에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 8, 26 내지 34, 56, 58, 60 내지 61, 65, 69, 85, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114 및 153 내지 154에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 14, 25 내지 26, 28, 32, 52, 55, 58, 66, 79, 84, 86, 101, 105, 106, 108, 110, 112, 114 및 121에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 26 내지 34, 56, 58, 60 내지 61, 65, 70, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114 및 153에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 26 내지 34, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114, 149 및 153에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 이러한 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 44, 46, 63, 65, 69 내지 70, 73, 80, 84, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 113, 124, 148 내지 150, 152 또는 154에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27개의 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
일부 추가의 구현예에서, hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 8, 65, 69, 85 및 154에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 LAG-3, 특히 huLAG-3에 결합한다.
일부 추가의 구현예에서, hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 63, 65 및 149에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에 적어도 1, 2 또는 3개의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 huLAG-3을 포함하는 LAG-3에 결합한다.
일부 추가의 구현예에서, hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 26, 84, 106 및 112에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 huLAG-3을 포함하는 LAG-3에 결합한다.
일부 추가의 구현예에서, 본원은 폴리펩타이드에 관한 것이며, 상기 폴리펩타이드는 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 서열 위치 84에 적어도 1개의 돌연변이된 아미노산 잔기(들)를 포함하는 hTlc 뮤테인이며, 상기 폴리펩타이드는 LAG-3, 특히 huLAG-3에 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 리포칼린 뮤테인은 예를 들어, 세린 잔기에 의한, 고유 시스테인 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 따른 hTlc 뮤테인은 세린 잔기와 같은 또 다른 아미노산에 의한 위치 61 및/또는 153에서의 고유 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 맥락에서, 시스테인 잔기 61 및 153에 의해 형성된 야생형 눈물 리포칼린(Breustedt et al., J Biol Chem, 2005 참조)의 구조적 이황화 결합(각각의 나이브 핵산 라이브러리 수준에서)의 제거가 안정하게 폴딩될 뿐만 아니라 높은 친화성으로 주어진 비-천연 리간드에도 결합할 수 있는 hTlc 뮤테인을 제공할 수 있음을 주목한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 따른 hTlc 뮤테인은 Cys61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro 또는 Trp, 및/또는 Cys153 → Ser 또는 Ala 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 치환은 Cys 61과 Cys 153을 연결하는 자연 발생 이황화 브릿지의 형성을 방지하고 따라서 뮤테인의 취급을 용이하게 하는 데 유용하다는 것이 입증되었다. 그러나, LAG-3에 결합하고, Cys 61과 Cys 153 사이에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 hTlc 뮤테인도 또한 본 발명의 일부이다.
일부 구현예에서, 구조적 이황화 결합의 제거는 본 발명의 뮤테인으로 비-천연 인공 이황화 결합의 (자발적인) 생성 또는 계획적인 도입을 가능하게 하여 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 위치 61, 101 및 153에서의 시스테인 코돈 중 2개 또는 3개 모두가 또 다른 아미노산의 코돈으로 대체된다. 또한, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 세린 잔기 또는 히스티딘 잔기에 의한 위치 101에서의 고유 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
그러나, LAG-3에 결합하고, Cys 61과 Cys 153 사이에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 hTlc 뮤테인도 또한 본 발명의 일부이다. 일부 특정 구현예에서, hTlc 뮤테인은 위치 61 및 153에 돌연변이된 아미노산을 포함하지 않으며 Cys 61과 Cys 153 사이에 형성된 이황화 결합을 갖는다. 일부 추가의 특정 구현예에서, 위치(들) 61 및/또는 153에 돌연변이된 아미노산(들)을 갖는 hTlc 뮤테인을 추가의 돌연변이유발로 처리하여, 위치 61 및/또는 153을 고유 시스테인으로 역 돌연변이시킴으로써 천연 이황화 결합을 복원한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 위치 28 또는 105에서의 시스테인 잔기에 의한 고유 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 프롤린 잔기에 의한 위치 111에서의 고유 아르기닌 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 트립토판 잔기 또는 글루탐산에 의한 위치 114에서의 고유 라이신 잔기의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 아스파라긴 잔기로 돌연변이되는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 12에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기를 가질 수 있다: Asp 12 → Asn.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5에 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 뮤테인은 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기를 가질 수 있다: Ala 5 → Thr.
또한, 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 중성 잔기에 의한 음으로 하전된 고유 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 음으로 하전된 고유 잔기는 LAG-3으로의 결합에 수반되지 않으며, 치환은 뮤테인의 등전점(pI)의 증가를 초래한다. 일부 특정 구현예에서, 이러한 음으로 하전된 고유 잔기 및 위치는 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)에 대하여 Asp 7, Glu 9, Asp 12, Glu 45, Asp 72, Glu 73, Asp 80 및 Asp 95를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 이러한 중성 아미노산 잔기는 Asn, Arg 및 Lys을 포함한다. 일부 추가의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 7, 9, 12, 45, 72, 73, 80 및 95에 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Asp 7 → Asn, Arg 또는 Lys; Glu 9 → Gln, Arg 또는 Lys; Asp 12 → Asn 또는 Arg; Glu 45 → Arg; Asp 72 → Asn, Arg 또는 Lys; Glu 73 → Arg; Asp 80 → Gly; 및 Asp 95 → Asn, Arg 또는 Lys. 예시적인 뮤테인은 서열번호: 57 내지 60, 63, 66을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 상응하는 하나 이상의 위치에 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Ser 14 → Pro; Thr 16 → Met; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys 또는 Asp; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile 또는 Leu; Asn 32 → Asp, Met 또는 Thr; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Arg; Val 53 → Ala; Met 55 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe 또는 Asp; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Ala 66 → Asn; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr 또는 Glu; Asp 80 → Gly; His 84 → Tyr 또는 Leu; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ala 86 → Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser 또는 Phe; Leu 105 → Cys 또는 Gly; His 106 → Ala, Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Lys 108 → Tyr 또는 Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Arg 111 → Pro; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Trp 또는 Ala; Lys 121 → Thr; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 이들 서열 위치에 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 그 이상의, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27개 또는 심지어 그 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 14, 25 내지 26, 28, 31 내지 32, 52, 55, 58, 66, 79, 84, 86, 101, 105 내지 106, 108, 110, 112 내지 114 및 121에 상응하는 하나 이상의 위치에 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Met 또는 Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr 또는 Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 이들 서열 위치에 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 그 이상의, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 111, 114, 121, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 상응하는 하나 이상의 위치에 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 이들 서열 위치에 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 그 이상의, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27개 또는 심지어 그 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 LAG-3-결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 선형 폴리펩타이드 서열의 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 상응하는 하나 이상의 위치에 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 하나 이상을 포함한다: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 이들 서열 위치에 2개 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 심지어 그 이상의, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27개 또는 심지어 그 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 추가로 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 또는 심지어 그 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; 및 Ser 154 → Ala을 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 및 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 심지어 그 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Leu 56 → Asp; His 84 → Tyr 또는 Leu; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu;을 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 및 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 심지어 그 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr 또는 Leu; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu;을 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 및 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 심지어 그 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser, Asp, Glu 또는 Ala; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Leu 56 → Asp; His 84 → Tyr 또는 Leu; His 106 → Glu, Lys 또는 Pro; Val 110 → Asn; Gly 112 → Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu;을 포함한다.
일부 추가의 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함한다:
(a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala;
(b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Gly; 및 Cys 153 → Ser;
(c) Asp 7 → Gly; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Arg 148 → Trp; Thr 152 → Pro; 및 Cys 153 → Ser;
(d) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; Tyr 97 → His; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; 및 Cys 153 → Ser;
(f) Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ile 89 → Ser; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(g) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Gln 149 → Leu; 및 Cys 153 → Ser;
(h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Lys 70 → Arg; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(i) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(j) Ile 10 → Phe; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; Val 93 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(k) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala;
(l) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(m) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(n) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(o) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Glu; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Val; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(p) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Leu; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(q) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(r) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ala; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Lys; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(s) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; Val 113 → Ala; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(t) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(u) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Val 113 → Leu; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
(v) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Met; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr; 또는
(w) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Gln 149 → Leu.
일부 추가의 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함한다:
(a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; 및 Ser 154 → Ala;
(b) Ala 5 → Thr; Gly 46 → Asp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; 및 Ser 150 → Gly
(c) Asp 7 → Gly; Val 85 → Asp; Arg 148 → Trp; 및 Thr 152 → Pro;
(d) Ala 5 → Thr; Val 53 → Ala; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; 및 Tyr 97 → His;
(e) Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; 및 Leu 124 → Gln;
(f) Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Lys 65 → Glu; 및 Ile 89 → Ser;
(g) Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; 및 Gln 149 → Leu;
(h) Lys 65 → Glu 및 Lys 70 → Arg;
(i) Ala 5 → Thr; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; 및 Ile 98 → Val
(j) Ile 10 → Phe; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; 및 Val 93 → Glu;
(k) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
(l) Arg 26 → Glu; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
(m) Arg 26 → Glu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Glu; 및 Gly 112 → Val;
(n) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Leu;
(o) Arg 26 → Ser; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
(p) Arg 26 → Ala; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Lys; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
(q) Asn 32 → Thr; His 106 → Gln; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; 및 Val 113 → Ala;
(r) Arg 26 → Gly; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Pro; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met; 또는
(s) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Leu; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; 및 Val 113 → Leu.
일부 추가의 구현예에서, LAG-3 결합 hTlc 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 아미노산 돌연변이를 포함한다: 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입.
나머지 영역, 즉, 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 157과 상이한 영역에서, 본 발명의 hTlc 뮤테인은 돌연변이된 아미노산 서열 위치의 외측에 성숙 hTlc의 야생형(천연) 아미노산 서열(서열번호: 1) 또는 이러한 위치에 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
다르게 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 hTlc 뮤테인의 잔기의 위치는 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 넘버링된다.
추가 구현예에서, 본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙 hTlc의 서열(서열번호: 1)과 적어도 70%의 서열 동일성 또는 적어도 70%의 서열 상동성을 갖는다. 예시적인 예로서, 서열번호: 8의 뮤테인은 성숙 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)과 대략 81.8%의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 hTlc 뮤테인은 서열번호: 7 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편이나 변이체를 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 hTlc 뮤테인은 서열번호: 8 내지 18, 20 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 이상, 적어도 90% 또는 그 이상, 적어도 95% 또는 그 이상, 적어도 97.5% 또는 그 이상, 적어도 98% 또는 그 이상 또는 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 서열번호: 7 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 hTlc 뮤테인의 구조적 상동체를 또한 포함하며, 상기 구조적 상동체는 상기 hTlc 뮤테인과 비교하여 약 60% 초과, 바람직하게는 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 92% 초과, 및 가장 바람직하게는 95% 초과의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 따른 hTlc 뮤테인은 자연 발생 형태의 성숙 hTlc(서열번호: 1)의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 돌연변이유발의 일부 구현예에서, 치환(또는 대체)은 보존적 치환이다. 그럼에도 불구하고, 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 결합하는 능력을 보유하는 한, 및/또는 성숙 hTlc의 아미노산 서열(서열번호: 1)과 적어도 60%, 예컨대 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가짐으로써 그 다음 치환된 서열과 서열 동일성을 갖는 한 (비-보존적 치환 또는 하기에 예시된 치환들 중 하나 이상을 포함하는) 임의의 치환이 예상된다.
일부 특정 구현예에서, 본 발명은 약 10 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.1 nM 이하 또는 0.05 nM 이하의 K d로 측정된 친화성으로 인간 LAG-3에 결합하는 리포칼린 뮤테인을 제공한다. 일부 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 서열번호: 7 및 19 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 그 이상, 예컨대 95% 또는 그 이상, 97.5% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
2. LAG-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 응용.
본 발명의 LAG-3 결합 리포칼린 뮤테인에 대한 수많은 가능한 응용이 의학분야에 존재한다.
추가의 한 측면에서, 본 발명은 샘플 내의 LAG-3을 검출하기 위한 본원에 개시된 LAG-3-결합 리포칼린 뮤테인의 용도 및 각각의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 LAG-3과의 복합체 형성에 대해 기술된 하나 이상의 LAG-3-결합 리포칼린 뮤테인의 용도를 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에서, 개시된 리포칼린 뮤테인은 LAG-3의 검출에 사용된다. 이러한 용도는 적합한 조건 하에서 하나 이상의 상기 뮤테인을 LAG-3을 함유할 것으로 의심되는 샘플과 접촉시켜 상기 뮤테인과 LAG-3 사이에 복합체를 형성시키는 단계, 및 적정 신호에 의해 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 가능한 신호는 상술한 바와 같이, 표지에 의해 또는 결합, 즉, 복합체 형성 그 자체에 기인한 물리적 특성의 변화에 의해 야기될 수 있다. 일 예로는 표면 플라스몬 공명이 있으며, 이의 값은 그 중 하나가 금박과 같은 표면에 고정화되는 결합 파트너의 결합 동안 변경된다.
본 명세서에 개시된 LAG-3 결합 리포칼린 뮤테인은 또한 LAG-3의 분리에 사용될 수 있다. 이러한 용도는 적합한 조건하에서 하나 이상의 상기 뮤테인을 LAG-3을 함유할 것으로 의심되는 샘플과 접촉시켜 상기 뮤테인과 LAG-3 사이에 복합체를 형성시키는 단계 및 상기 샘플로부터 상기 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
LAG-3의 검출뿐만 아니라 LAG-3의 분리를 위한 개시된 뮤테인의 용도에서, 뮤테인 및/또는 LAG-3 또는 이의 도메인 또는 단편은 적합한 고체상에 고정화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 LAG-3-결합 리포칼린 뮤테인을 포함하는 진단적 또는 분석적 키트를 특징으로 한다.
진단에서의 이들의 용도에 더하여, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 뮤테인 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 고려한다.
또한, 본 발명은 항암제 및/또는 면역 조절제로서 사용하기 위해 LAG-3에 결합하는 인간 리포칼린 뮤테인을 제공한다. 이와 같이, LAG-3에 결합하는 본원의 리포칼린 뮤테인은 암, 감염성 질환 및 자가 면역 질환과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용되는 것으로 생각된다. 따라서, LAG-3에 결합하는 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암, 감염성 질환 및 자가 면역 질환과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방 방법을 또한 제공한다.
B. 본원의 리포칼린 뮤테인
리포칼린은 리간드에 결합하도록 자연적으로 진화된 단백질성 결합 분자이다. 리포칼린은 척추동물, 곤충, 식물 및 박테리아를 비롯한 많은 유기체에서 나타난다. 리포칼린 단백질 패밀리(Pervaiz and Brew, FASEB J, 1987)의 구성원은 전형적으로 소형 분비 단백질이며 단일 폴리펩타이드 사슬을 갖는다. 이들은 상이한 분자 인식 특성의 범위에 의해 특징지어진다: 다양한, 주로 소수성인 소형 분자(예컨대, 레티노이드, 지방산, 콜레스테롤, 프로스타글란딘, 빌리버딘, 페로몬, 맛이 나는 물질 및 냄새 나는 물질) 및 특이적인 세포-표면 수용체로의 이들의 결합, 및 이들의 거대 분자 복합체의 형성. 과거에는 이들이 주로 수송 단백질로 분류되었지만, 리포칼린이 다양한 생리학적 기능을 수행하고 있다는 것이 현재는 분명해졌다. 여기에는 레티놀 수송, 후각, 페로몬 신호 전달 및 프로스타글란딘 합성에서의 역할이 포함된다. 리포칼린은 또한 면역 반응의 조절 및 세포 항상성(cell homoeostasis)의 매개와 관련되어 있다(예를 들어, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에 검토됨).
리포칼린은 흔히 20% 미만의 서열 동일성을 갖는 비정상적으로 낮은 수준의 전체 서열 보존을 공유한다. 매우 대조적으로, 그들의 전반적인 폴딩 패턴은 고도로 보존되어 있다. 리포칼린 구조의 중심부는 연속적으로 수소 결합된 β-배럴을 형성하도록 그 자체가 폐쇄된 단일 8-가닥 역평행 β-시트로 구성된다. 이 β-배럴은 중앙 공간(cavity)을 형성한다. 상기 배럴의 한쪽 말단은 β-가닥을 연결하는 3개의 펩타이드 루프뿐만 아니라 이의 바닥을 가로지르는 N-말단 펩타이드 세그먼트에 의해 입체적으로 차단된다. β-배럴의 다른 말단은 용매에 개방되어 있으며 4개의 유연한 펩타이드 루프에 의해 형성된 표적-결합 부위를 포함한다. 그 외에, 상이한 크기, 형상 및 화학적 특징을 가진 표적을 각각 수용할 수 있는 다양한 상이한 결합 방식을 야기하는 것은 경성의 리포칼린 스캐폴드 내 루프의 다양성이다(예를 들어, Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에 검토됨).
LAG-3에 결합하는 본 발명의 리포칼린 뮤테인과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "~에 특이적인"은 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 대해 유도되거나, 그에 결합하거나, 그와 반응하는 것을 포함한다. 따라서, 그에 대해 유도되거나, 그에 결합하거나, 그와 반응하는 것은 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 특이적으로 결합한다는 것을 포함한다. 이 문맥에서의 용어 "특이적으로"는 리포칼린 뮤테인이 본 명세서에 기술된 바와 같이 LAG-3 단백질과 반응하지만, 본질적으로 또 다른 단백질과는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. "또 다른 단백질"이란 용어는 본 명세서에 개시된 리포칼린이 유도되는 LAG-3과 밀접하게 관련되거나, 이와 상동성이 있는 단백질을 포함하여, 임의의 비-LAG-3 단백질을 포함한다. 그러나 인간 이외의 종으로부터의 LAG-3 단백질, 단편 및/또는 변이체는 "대상체"라는 정의의 문맥에서 기술된 것과 같이, "또 다른 단백질"이라는 용어에 의해 배제되지 않는다. "본질적으로 결합하지 않는다"는 용어는 본 발명의 리포칼린 뮤테인이 또 다른 단백질에 결합하지 않는 것을 의미하며, 즉 30%, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 10% 미만, 특히 바람직하게는 9, 8, 7, 6 또는 5% 미만의 교차-반응성을 나타낸다. 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같이 리포칼린이 특이적으로 반응하는지의 여부는 특히 본 발명의 리포칼린 뮤테인과 LAG-3의 반응 및 상기 리포칼린과 다른 단백질(들)의 반응을 비교함으로써 쉽게 시험할 수 있다. "특이적 결합"은 또한 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC 및 펩타이드 스캔에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 또 다른 리포칼린과 그러한 뮤테인의 서열 동일성과 비교하여, 기준 리포칼린, 예를 들면 hTlc에 대해 높은 서열 동일성을 갖는다. 이러한 일반적인 맥락에서, 본 발명에 따른 조합물의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 상응하는 야생형 또는 기준 리포칼린의 아미노산 서열과 적어도 실질적으로 유사하다. 상응하는 기준 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한, 본 발명에 따른 조합물의 리포칼린 뮤테인의 각각의 서열은 상응하는 리포칼린의 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%의 동일성, 예를 들어 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 이와 관련하여, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 비교하였을 때 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 결합할 수 있게 하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 치환을 물론 포함할 수 있다. 전형적으로, 리포칼린의 뮤테인은 리포칼린(상기 참조)의 리간드 결합 부위의 개방 말단에 있는 4개의 루프에 아미노산의 (기준 리포칼린의 서열에 대한) 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 상술한 바와 같이, 이들 영역은 원하는 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 결합 특이성을 결정하는 데 필수적이다.
본 발명의 뮤테인은 또한 리포칼린의 표적 결합 부위를 형성하는 4개의 유연한 펩타이드 루프 외부의 영역에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 뮤테인은 리포칼린의 폐쇄 말단에서 β-가닥을 연결하는 3개의 펩타이드 루프(BC, DE 및 FG로 표시) 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 예로서, 눈물 리포칼린 또는 이의 상동체의 폴리펩타이드로부터 유래된 뮤테인은 N-말단 영역 및/또는 천연 리포칼린 결합 포켓의 반대편에 위치한 β-배럴 구조의 말단에 배열된 세 개의 펩타이드 루프 BC, DE 및 FG 내의 임의의 서열 위치에서 1, 2, 3, 4개 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 추가의 예시적인 예로서, 눈물 리포칼린 또는 이의 상동체의 폴리펩타이드로부터 유래된 뮤테인은 눈물 리포칼린의 야생형 서열과 비교하여 β-배럴 구조의 말단에 배열된 펩타이드 루프 DE 내에 돌연변이된 아미노산 잔기를 가지지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 상응하는 천연 리포칼린과 비교하여 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 또는 심지어 20개의 치환을 포함하되, 이러한 리포칼린 뮤테인은 LAG-3에 결합할 수 있어야 한다. 예를 들어, 리포칼린 뮤테인은 예를 들어 hTlc의 야생형 서열을 갖는 야생형 리포칼린의 별개의 위치(즉, 상응하는 위치)에 상응하는 위치에 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 리포칼린 뮤테인은 아르기닌 잔기에 의한 고유 아미노산의 2, 3, 4 또는 5개, 심지어 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 "기준 단백질" 스캐폴드의 핵산은 LAG-3에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인을 생성하기 위한 목적으로 돌연변이유발된다.
또한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 리포칼린 뮤테인의 생물학적 활성(이의 표적, 예를 들어, LAG-3으로의 결합)에 영향을 미치지 않고, 예컨대 서열번호: 53 및 서열번호: 54에서 이의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에 Strep-태그 II 서열과 같은 이종 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 각각의 야생형 눈물 리포칼린; 예를 들어, 서열번호: 7 내지 28, 57 내지 70 및 85 내지 95와 비교하여 이의 N-말단에서 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 이의 C-말단에서 1, 2개 또는 그 이상의 아미노산을 결여할 수 있다.
일부 구현예에서, 치환(또는 대체)은 보존적 치환이다. 그럼에도 불구하고, 리포칼린 뮤테인이 LAG-3에 결합하는 능력을 보유하고/하거나 "기준 서열"과 적어도 60%, 예를 들어 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 이상 동일하다는 점에서 그 다음 치환된 서열과의 동일성을 갖는 한 (비-보존적 치환 또는 하기에 열거된 예시적인 치환 중 하나 이상의 치환을 포함하는) 임의의 치환이 예상된다.
보존적 치환은 일반적으로 돌연변이될 아미노산에 따라 열거되고, 각각은 보존적으로 취해질 수 있는 하나 이상의 대체(들)가 뒤따르는 다음의 치환이다: Ala → Gly, Ser, Val; Arg → Lys; Asn → Gln, His; Asp → Glu; Cys → Ser; Gln → Asn; Glu →Asp; Gly → Ala; His → Arg, Asn, Gln; Ile → Leu, Val; Leu → Ile, Val; Lys → Arg, Gln, Glu; Met → Leu, Tyr, Ile; Phe → Met, Leu, Tyr; Ser → Thr; Thr → Ser; Trp → Tyr; Tyr → Trp, Phe; Val → Ile, Leu. 다른 치환도 허용되며, 경험적으로 또는 다른 알려진 보존적 또는 비-보존적 치환에 따라 결정될 수 있다. 추가 배향으로서, 다음의 8개 그룹은 통상적으로 보존적 치환을 정의하기 위해 서로 취해질 수 있는 아미노산을 각각 함유한다:
a. 알라닌(Ala), 글라이신(Gly);
b. 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu);
c. 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln);
d. 아르기닌(Arg), 라이신(Lys);
e. 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 발린(Val);
f. 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp);
g. 세린(Ser), 트레오닌(Thr); 및
h. 시스테인(Cys), 메티오닌(Met)
그러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 다음과 같은, 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에서 추가로 기술되는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 특징에 대해 스크리닝될 수 있다. 그러한 보다 실질적인 변화의 예는 Ala → Leu, Ile; Arg → Gln; Asn → Asp, Lys, Arg, His; Asp → Asn; Cys → Ala; Gln → Glu; Glu → Gln; His → Lys; Ile → Met, Ala, Phe; Leu → Ala, Met, 노르류신; Lys → Asn; Met → Phe; Phe → Val, Ile, Ala; Trp → Phe; Tyr → Thr, Ser; Val → Met, Phe, Ala이다.
리포칼린의 생물학적 특성의 실질적인 변경은 (a) 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선형 형태로서의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 효과에 있어서 유의미하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 그룹들로 나뉘어진다: (1) 소수성: 노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신; (2) 중성 친수성: 시스테인, 세린, 트레오닌; (3) 산성: 아스파르트산, 글루탐산; (4) 염기성: 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: 글라이신, 프롤린; 및 (6) 방향족: 트립토판, 티로신, 페닐알라닌.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 각각의 리포칼린의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교 결합을 방지하기 위해, 일반적으로 세린으로도 치환될 수 있다. 반대로 시스테인 결합(들)은 안정성을 향상시키기 위해 리포칼린에 첨가될 수 있다.
상술한 바와 같이, 삽입을 포함하는 임의의 돌연변이는 핵산 상에서 예를 들어, DNA 수준에서 확립된 표준 방법을 사용하여 매우 용이하게 달성될 수 있다. 아미노산 서열의 변경의 예시적인 예는 아미노산 치환뿐만 아니라 삽입 또는 결실이다. 그러한 치환은 보존적일 수 있으며, 즉, 아미노산 잔기는 특히 극성 및 크기와 관련하여 화학적으로 유사한 성질의 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 대체이다: 1) 알라닌, 세린 및 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 라이신; 5) 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 다른 한편, 아미노산 서열에 비-보존적 변경을 도입하는 것도 가능하다. 또한, 단일 아미노산 잔기를 대체하는 대신에, 이러한 결실 또는 삽입이 안정한 폴딩된/기능적 뮤테인을 초래하는 한, 눈물 리포칼린의 1차 구조의 하나 이상의 연속 아미노산을 삽입하거나 결실시키는 것이 또한 가능하다.
아미노산 서열의 변경은 돌연변이된 리포칼린 유전자 또는 그의 부분의 서브 클로닝을 단순화하기 위해 특정 제한 효소에 대한 절단 부위를 혼입함으로써 단일 아미노산 위치의 지정 돌연변이유발을 포함한다. 또한, 이러한 돌연변이는 LAG-3과 같은 주어진 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화성을 더욱 향상시키기 위해 혼입될 수 있다. 또한, 돌연변이는 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 수용성을 개선하거나, 필요하다면 응집 경향을 감소시키는 것과 같은 뮤테인의 특정 특성을 조절하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 시스테인 잔기는 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 스타치(HES), 비오틴, 펩타이드 또는 단백질과 같은 다른 화합물로의 컨쥬게이션 또는 비-자연 발생 이황화 결합의 형성을 위해 새로운 반응성 기를 도입하도록 의도적으로 다른 아미노산 서열 위치를 시스테인으로 돌연변이시키는 것도 가능하다. 생성된 티올 모이어티는 예를 들어 각각의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 뮤테인을 PEG화 또는 HES화하는 데 사용될 수 있다. hT1c 뮤테인의 아미노산 서열에 시스테인 잔기를 도입시키는 그러한 돌연변이의 예시적인 가능성은 치환 Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys 및 Glu 131 → Cys를 포함한다. 임의의 아미노산 위치 40, 73, 90, 95 및/또는 131 측면에서 생성된 티올 모이어티는 예를 들어 각각의 hTlc 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 뮤테인을 PEG화 또는 HES화하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 모이어티 중 하나가 본 발명의 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트되는 경우, 아미노산 측쇄로의 컨쥬게이트가 유리할 수 있다. 적합한 아미노산 측쇄는 인간 리포칼린의 아미노산 서열에서 자연적으로 존재할 수 있거나 또는 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 적합한 결합 부위가 돌연변이유발을 통해 도입되는 경우, 하나의 가능성은 시스테인 잔기에 의해 적절한 위치에서의 아미노산을 대체하는 것이다. 예를 들어, 이러한 돌연변이는 인간 눈물 리포칼린의 야생형 서열에서 Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys 또는 Glu 131 → Cys 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 이들 중 임의의 위치에서 새로 생성된 시스테인 잔기는 이후에 상기 뮤테인, 예를 들어 PEG 또는 그의 활성화된 유도체의 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티에 상기 뮤테인을 컨쥬게이트시키는 데 이용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 화합물들 중 하나를 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트시키는 데 적합한 아미노산 측쇄를 제공하기 위해, 인공 아미노산을 돌연변이유발에 의해 도입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 인공 아미노산은 보다 반응성이 있고 따라서 목적하는 화합물과의 컨쥬게이트를 용이하게 하도록 설계된다. 인공 tRNA를 통해 도입될 수 있는 그러한 인공 아미노산의 한 예는 파라-아세틸-페닐알라닌이다.
본 명세서에 개시된 뮤테인의 여러 가지 응용에 있어서, 융합 단백질의 형태로 이들을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 리포칼린 뮤테인은 이의 N-말단 또는 C-말단에서 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드, 예를 들어, 신호 서열 및/또는 친화성 태그에 융합된다.
재조합 단백질의 용이한 검출 및/또는 정제를 가능하게 하는 Strep-태그 또는 Strep-태그 II(Schmidt et al., J Mol Biol, 1996), c-myc-태그, FLAG-태그, His-태그 또는 HA-태그 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase)와 같은 단백질과 같은 친화성 태그는 또한 적절한 융합 파트너의 추가의 예이다. 마지막으로, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)과 같은 발색 또는 형광 특성을 갖는 단백질은 또한 본 발명의 리포칼린 뮤테인에 적합한 융합 파트너이다.
일반적으로, 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 화학적, 물리적, 광학적 또는 효소 반응에서 검출 가능한 화합물 또는 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성시키는 임의의 적절한 화학 물질 또는 효소로 표지하는 것이 가능하다. 물리적 반응인 동시에 광학 반응/마커인 예는 방사능 표지를 사용할 때의 방사선 조사(irradiation) 또는 X선 방출 시의 형광 방출이다. 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 및 β-갈락토시다제(β-galactosidase)는 발색 반응 생성물의 형성을 촉매하는 효소 표지(인 동시에 광학 표지)인 예이다. 일반적으로, 항체(면역글로불린의 Fc 부분 내의 당 모이어티와 함께 독점적으로 사용되는 것을 제외함)에 일반적으로 사용되는 모든 표지들은 본 발명의 리포칼린 뮤테인과의 컨쥬게이트에도 사용될 수 있다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 또한, 예를 들어 주변의 정상 세포에는 영향을 미치지 않고 주어진 세포, 조직 또는 기관으로의 그러한 작용제의 표적화된 전달 또는 세포(예를 들어, 종양 세포)의 선택적인 표적화를 위해 임의의 적합한 치료적 활성제와 컨쥬게이트될 수 있다. 그러한 치료적 활성제의 예는 방사성 핵종, 독소, 소형 유기 분자 및 치료 펩타이드(예를 들어, 세포 표면 수용체의 효능제/길항제로서 작용하는 펩타이드 또는 주어진 세포 표적 상의 단백질 결합 부위에 대하여 경쟁하는 펩타이드)를 포함한다. 그러나, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 또한, 치료적 활성 핵산, 예컨대 안티센스 핵산 분자, 소형 간섭 RNA, 마이크로 RNA 또는 리보자임(ribozymes)과 컨쥬게이트될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트는 당업계에서 널리 알려된 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기와 같이, 본원의 리포칼린 뮤테인은 일부 구현예에서 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다(이와 관련하여 국제 특허 공개 번호 WO2006/056464호를 참조하며, 이러한 컨쥬게이트 전략은 CTLA-4에 대한 결합 친화성을 갖는 인간 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(hNGAL)의 뮤테인에 관련하여 기재되어 있다). 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티는 몇 개만 언급하자면, 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드록시에틸 스타치, 팔미트산(Vajo and Duckworth, Pharmacol Rev, 2000)과 같은 지방산 분자, 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 또는 알부민 결합 단백질, 트랜스페린일 수 있다. 알부민 결합 단백질은 세균성 알부민 결합 단백질, 항체, 도메인 항체를 포함하는 항체 단편(예를 들어, 미국 특허 제6,696,245호) 또는 알부민에 대한 결합 활성을 갖는 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 따라서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 반감기 연장에 적합한 컨쥬게이트 파트너는 알부민 결합 단백질, 예를 들어 연쇄상 구균 단백질 G(Konig and Skerra, J Immunol Methods, 1998) 중 하나와 같은 세균성 알부민 결합 도메인을 포함한다. 컨쥬게이트 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩타이드의 다른 예로는 예컨대, 미국 특허 공개 제20030069395호 또는 데니스(Dennis) 등(J Biol Chem, 2002)에 기술된 바와 같이, Xaa1이 Asp, Asn, Ser, Thr 또는 Trp이며; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu 또는 Lys이고; Xaa3은 Ala, Asp, Phe, Trp 또는 Tyr이고; Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser 또는 Thr인 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 컨센서스 서열을 갖는 것이다.
다른 구현예에서, 알부민 그 자체(Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther, 2002) 또는 알부민의 생물학적 활성 단편은 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 컨쥬게이트 파트너로서 사용될 수 있다. 용어 "알부민"은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 랫트 알부민과 같은 모든 포유류 알부민을 포함한다. 알부민 또는 이의 단편은 미국 특허 제5,728,553호 또는 유럽 특허 공개 번호 EP0330451 및 EP0361991에 기술된 바와 같이 재조합적으로 생산될 수 있다. 재조합 인간 알부민(예를 들어, 영국 노팅엄 소재의 노보자임즈 델타 리미티드(Novozymes Delta Ltd.)로부터의 Recombumin®)은 뮤테인의 반감기를 연장하기 위해 본원의 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트되거나 융합될 수 있다.
알부민-결합 단백질이 항체 단편인 경우, 이는 도메인 항체일 수 있다. 도메인 항체(dAb)는 생물 물리학적 특성 및 생체 내 반감기를 정밀하게 제어하여 최적의 안전성 및 효율적인 생성물 프로파일을 생성하도록 설계된다. 도메인 항체는 예를 들어 도만티스 리미티드(Domantis Ltd.)(영국 캠브리지 및 미국 매사추세츠주 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
트랜스페린이 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티로서 사용되는 경우, 상기 뮤테인은 비-글리코실화 트랜스페린의 N- 또는 C-말단 또는 둘 모두에 유전적으로 융합될 수 있다. 비-글리코실화 트랜스페린은 14 내지 17일의 반감기를 가지며, 트랜스페린 융합 단백질은 유사하게 연장된 반감기를 가질 것이다. 트랜스페린 담체는 또한 높은 생체 이용률, 생체 분포 및 순환 안정성을 제공한다. 이 기술은 BioRexis(미국 펜실베이니아주 소재의 바이오렉시스 파마슈티컬 코포레이션(BioRexis Pharmaceutical Corporation))에서 시판 중이다. 단백질 안정화제/반감기 연장 파트너로서 사용하기 위한 재조합 인간 트랜스페린(DeltaFerrinTM)은 또한 노보자임즈 델타 리미티드(Novozymes Delta Ltd.)(영국 노팅엄 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
면역글로불린의 Fc 부분이 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 목적으로 사용되는 경우, 신토닉스 파마슈티컬즈, 인코포레이티드(Syntonix Pharmaceuticals, Inc)(미국 매사추세츠주)로부터 상업적으로 입수 가능한 SynFusion™ 기술을 사용할 수 있다. 이 Fc-융합 기술을 사용하면 오래 작용하는 생물 의약품을 만들 수 있으며, 예를 들어 약물 동력학, 용해도 및 생산 효율을 향상시키기 위해 항체의 Fc 영역에 연결된 뮤테인의 2개의 카피로 구성될 수 있다.
본 발명의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장시키는 또 다른 대안은 긴, 구조화되지 않은, 유연한 글라이신-풍부 서열(예를 들어, 약 20 내지 80개의 연속 글라이신 잔기를 갖는 폴리-글라이신)을 뮤테인의 N- 또는 C-말단에 융합시키는 것이다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2007/038619에 개시된 이러한 접근법은 또한 "rPEG"(재조합 PEG)로 지칭된다.
PEG가 컨쥬게이트 파트너로서 사용되는 경우, 폴리알킬렌 글리콜은 치환되거나, 비치환되거나, 선형 또는 분지형일 수 있다. 이는 또한 활성화된 폴리알킬렌 유도체일 수 있다. 적합한 화합물의 예는 인터페론과 관련하여 국제 특허 공개 WO 99/64016, 미국 특허 제6,177,074호 또는 미국 특허 제6,403,564호에 기술된 바와 같은, 또는 PEG-변형된 아스파라기나제(PEG-modified asparaginase), PEG-아데노신 데아미나제(PEG-adenosine deaminase, PEG-ADA) 또는 PEG-수퍼옥사이드 디스뮤타아제(PEG-superoxide dismutase)와 같은 다른 단백질에 대해 기술된 바와 같은 PEG 분자이다(Fuertges and Abuchowski, Journal of Controlled Release, 1990). 이러한 중합체, 예컨대 PEG의 분자량은 약 300 내지 약 70,000 달톤의 범위, 예를 들어 약 10,000, 약 20,000, 약 30,000 또는 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,500,930호 또는 제6,620,413호에 기술된 바와 같이, HES와 같은 탄수화물 올리고머 및 중합체는 혈청 반감기 연장 목적으로 본 발명의 뮤테인에 컨쥬게이트될 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 리포칼린 뮤테인은 효소 활성 또는 다른 표적에 대한 결합 친화성과 같은 새로운 특징을 본 발명의 리포칼린 뮤테인에 부여할 수 있는 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 적합한 융합 파트너의 예는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 호스래디쉬 퍼옥시다제, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(gluthation-S-transferase), 단백질 G의 알부민-결합 도메인(albumin-binding domain of protein G), 단백질 A(protein A), 항체 또는 항체 단편, 올리고머화 도메인(oligomerization domains) 또는 독소이다.
특히, 얻어진 융합 단백질의 "성분"들 모두가 주어진 치료 표적에서 함께 작용되도록, 본 명세서에 개시된 리포칼린 뮤테인을 개별 효소 활성 부위와 융합시키는 것이 가능할 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 결합 도메인은 질환-유발 표적에 부착되어, 효소 도메인이 상기 표적의 생물학적 기능을 파괴하게 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)에 관한 것이다. 유전 암호의 축퇴성(degeneracy)은 동일한 아미노산을 특정하는 다른 코돈에 의한 특정 코돈의 치환을 허용하기 때문에, 본 발명은 본 명세서에 기재된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 특정 핵산 분자에 국한되지 않고, 기능적 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 모든 핵산 분자를 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 서열번호: 29 내지 50, 71 내지 84 및 96 내지 106에 나타낸 바와 같은 본 발명의 일부 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 구현예에서, hTlc를 인코딩하는 핵산 분자는 먼저 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 아미노산 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 157 중 하나 이상에서 돌연변이유발된다. 두 번째로, 인간 눈물 리포칼린을 인코딩하는 핵산 분자는 또한 성숙 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 아미노산 서열 위치 101, 111, 114 및 153 중 하나 이상에서 돌연변이유발된다.
본 발명은 또한 실험적 돌연변이유발의 표기된 서열 위치 외부에 추가적인 돌연변이를 포함하는 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 돌연변이는 종종 허용되거나, 예를 들어 그들이 뮤테인의 향상된 폴딩 효율, 혈청 안정성, 열 안정성, 제형 안정성 또는 리간드 결합 친화성에 기여하는 경우에 심지어 유리한 것으로 입증될 수 있다.
본 출원에 개시된 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열(들)에 "작동 가능하게 연결되어" 핵산 분자의 발현을 가능하게 할 수 있다.
전사 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 요소를 포함하고 이러한 서열들이 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 "작동 가능하게 연결되어" 있다면, DNA와 같은 핵산 분자는 "핵산 분자를 발현할 수 있다" 또는 "뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다"고 지칭된다. 작동 가능한 결합은 조절 서열 요소 및 발현되는 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되어 있는 결합(linkage)이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 종마다 다를 수 있지만, 일반적으로 이러한 영역은 원핵세포에서 프로모터 그 자체, 즉, 전사의 개시를 지시하는 DNA 요소와 RNA로 전사될 때 번역의 개시를 신호전달할 DNA 요소를 모두 포함하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터 영역은 예를 들어 원핵세포에서의 -35/-10 박스 및 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 요소, 또는 진핵세포에서의 TATA 박스, CAAT 서열 및 5'-캡핑 요소와 같은 일반적으로 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비-코딩 서열을 포함한다. 이러한 영역은 또한 고유 폴리펩타이드를 숙주 세포의 특정 구획으로 표적화하기 위한 인핸서 또는 리프레서 요소뿐만 아니라 번역된 신호 및 리더 서열을 포함할 수 있다.
또한, 3' 비-코딩 서열은 전사 종결, 폴리아데닐화 등에 관여하는 조절 요소를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 종결 서열이 특정 숙주 세포에서 만족스럽게 기능적이 아니면, 그 세포에서 기능적인 신호로 치환될 수 있다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자는 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 적합한 원핵세포 프로모터는 예를 들어 tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵세포에서 발현하는 데 유용한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 플라스미드, 파지미드, 파지, 바큘로바이러스, 코스미드 또는 인공 염색체와 같은 벡터 또는 임의의 다른 종류의 클로닝 비히클의 일부일 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 핵산 분자는 파지미드에 포함된다. 파지미드 벡터는 M13 또는 f1과 같은 템퍼런트 파지(temperent phage)의 유전자간(intergenic) 영역 또는 대상이 되는 cDNA에 융합된 그의 기능적 부분을 인코딩하는 벡터를 나타낸다. 이러한 파지미드 벡터 및 적절한 헬퍼 파지(예를 들어, M13K07, VCS-M13 또는 R408)로 박테리아 숙주 세포를 중복감염(superinfection)시킨 후, 손상되지 않은 파지 입자가 생산되고, 이에 따라 파지 표면에 디스플레이되는 그의 상응하는 폴리펩타이드로의 인코딩된 이종 cDNA의 물리적 커플링이 가능하게 된다(Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).
이러한 클로닝 비히클은 상술한 조절 서열 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 서열 외에, 발현에 사용되는 숙주 세포와 호환 가능한 종에서 유래된 복제 및 제어 서열뿐만 아니라 형질전환 또는 형질감염 세포에서 선택 가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 많은 수의 적절한 클로닝 벡터가 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용 가능하다.
본 명세서에 기술된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 DNA 분자, 및 특히 이러한 뮤테인의 코딩 서열을 함유하는 클로닝 벡터는 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 형질전환은 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
형질전환된 숙주 세포를 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 배양한다. 적절한 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵세포 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), SF9 또는 High5 곤충 세포, 불멸화된 포유류 세포주(예를 들어, HeLa 세포 또는 CHO 세포)와 같은 진핵세포, 또는 1차 포유동물 세포일 수 있다.
본원은 또한 본원에 기술된 리포칼린 뮤테인의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 뮤테인, 뮤테인의 단편 또는 뮤테인과 또 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 또 다른 리포칼린 뮤테인 또는 항체 또는 항체 단편)의 융합 단백질은 유전 공학적 방법에 의해 상기 뮤테인을 코딩하는 핵산으로부터 출발하여 생산된다. 상기 방법은 생체 내에서 수행될 수 있고, 리포칼린 뮤테인은 예를 들어 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체에서 생성된 다음 이 숙주 유기체 또는 그 배양물로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 시험관 내 번역 시스템을 사용하여 시험관 내에서 단백질을 생산하는 것도 가능하다.
리포칼린 뮤테인을 생체 내에서 생산할 때, 그러한 뮤테인을 인코딩하는 핵산은 재조합 DNA 기술(이미 상술한 바와 같이)에 의해 적합한 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체에 도입된다. 이러한 목적으로, 상기 숙주 세포는 먼저 확립된 표준 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터로 형질 전환된다. 그 다음 상기 숙주 세포를 이종 DNA의 발현 및 이에 따라 상응하는 폴리펩타이드의 합성을 가능하게 하는 조건하에 배양한다. 이어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 또는 배양 배지로부터 회수된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 DNA와 같은 핵산 분자는 본원의 융합 단백질의 발현이 가능하도록 본원의 또 다른 핵산 분자에 "작동 가능하게 결합"될 수 있다. 이와 관련하여, 작동 가능한 결합은 제1 핵산 분자의 서열 요소 및 제2 핵산 분자의 서열 요소가 단일 폴리펩타이드로서 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 결합이다.
또한, 본 발명의 hTlc 뮤테인에 대한 일부 구현예에서, Cys 61과 Cys 153 사이의 자연 발생 이황화 결합이 제거될 수 있다. 따라서, 그러한 뮤테인은 예를 들어 그람-음성 박테리아의 세포질에서, 환원성 산화 환원 환경(reducing redox milieu)을 갖는 세포 구획에서 생산될 수 있다.
본 발명의 리포칼린 뮤테인이 분자 내 이황화 결합을 포함하는 경우, 적절한 신호 서열을 사용하여 산화성 산화 환원 환경을 갖는 세포 구획에 초기 폴리펩타이드를 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 산화 환경은 그람 양성 박테리아의 세포 외 환경 또는 진핵 세포의 소포체 내강에서 에스케리키아 콜라이와 같은 그람 음성 박테리아의 주변세포질(periplasm)에 의해 제공될 수 있으며, 일반적으로 구조적 이황화 결합의 형성에 유리하다.
그러나, 숙주 세포, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이의 세포질에서 본 발명의 뮤테인을 생산하는 것도 가능하다. 이 경우, 상기 폴리펩타이드는 가용성 및 폴딩된 상태에서 직접 수득되거나 또는 봉입체의 형태로 회수되어 생체 외에서 재생될 수 있다. 추가적인 선택은 산화성 세포 내 환경을 갖는 특정 숙주 균주의 사용으로, 따라서 이는 세포질에서 이황화 결합의 형성을 가능하게 할 수 있다(Venturi et al., J. Mol. Biol. 2002).
그러나, 본 명세서에 기재된 리포칼린 뮤테인은 유전 공학의 활용을 통해서만 생성되거나 제조될 필요는 없다. 오히려, 이러한 뮤테인은 메리필드(Merrifield) 고체상 폴리펩타이드 합성과 같은 화학 합성 또는 시험관 내 전사 및 번역에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 가능성 높은 돌연변이를 분자 모델링을 사용하여 확인하고, 시험관 내에서 그러한 돌연변이를 계속하는 폴리펩타이드를 합성하고 LAG-3에 대한 결합 활성 및 (안정성과 같은) 다른 바람직한 성질을 조사하는 것이 가능하다. 폴리펩타이드/단백질의 고체상 및/또는 용액상의 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Bruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004 참조).
또 다른 구현예에서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 잘-확립된 방법을 사용하여 시험관 내 전사/번역에 의해 제조될 수 있다.
통상의 기술자는 본 명세서에 개시된 리포칼린 뮤테인을 제조하는 데 유용한 방법을 알 수 있을 것이나, 그의 단백질 또는 핵산 서열은 본 명세서에 명시적으로 개시되어 있지 않다. 개요로서, 아미노산 서열의 이러한 변형은 예를 들어, 돌연변이된 리포칼린 유전자 또는 그의 부분의 서브 클로닝을 단순화하기 위해 특정 제한 효소에 대한 절단 부위를 혼입시킴으로써 단일 아미노산 위치의 지정 돌연변이유발을 포함한다. 또한, 이들 돌연변이는 그의 표적(예를 들어, LAG-3)에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화성을 더욱 향상시키기 위해 혼입될 수 있다. 또한, 돌연변이는 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 수용성을 향상시키거나 또는 필요하다면 응집 경향을 감소시키는 것과 같은 뮤테인의 특정 특성을 조절하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 시스테인 잔기는 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
본 명세서에 개시된 리포칼린 뮤테인 및 이의 유도체는 항체 또는 이의 단편과 유사한 많은 분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 리포칼린 뮤테인은 효소, 항체, 방사성 물질 또는 생화학적 활성 또는 정의된 결합 특성을 갖는 임의의 다른 그룹으로 표지하기 위해 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써, 그들의 각각의 표적 또는 이의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질이 검출되거나 그들과 접촉될 수 있다. 또한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 확립된 분석 방법(예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 현미경 또는 면역 감지에 의해 화학 구조를 검출하는 역할을 할 수 있다. 이와 관련하여, 검출 신호는 적절한 뮤테인 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 사용에 의해 직접 생성될 수 있거나, 항체를 통해 결합된 뮤테인의 면역 화학적 검출에 의해 간접적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 특징은 하기 실시예 및 첨부된 도면을 검토함으로써 통상의 기술자에게 명백해질 것이며, 이는 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 발명은 예시적인 실시예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 발명들의 수정 및 변형이 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있고, 그러한 수정들 및 변형들은 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 추가로 하기의 항목을 특징으로 할 수 있다:
항목 1. 약 250 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인.
항목 2. 항목 1에 있어서, 뮤테인은 약 50 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
항목 3. 항목 1에 있어서, 뮤테인은 약 3 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
항목 4. 항목 1에 있어서, 뮤테인은 약 0.1 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
항목 5. 항목 1에 있어서, 뮤테인은 약 0.05 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
항목 6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, K d 값은 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같은 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 7. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 156 내지 157에 적어도 2개 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 8. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 14, 25 내지 26, 28, 31 내지 32, 52, 55, 58, 66, 79, 84, 86, 101, 105 내지 106, 108, 110, 112 내지 114 및 121에 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 9. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 111, 114, 121, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 156 내지 157에 적어도 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 추가로 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 44, 46, 63, 65, 69 내지 70, 73, 80, 84, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 113, 124, 148 내지 150, 152, 154 및 156 내지 157에 적어도 적어도 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 11. 항목 7에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 2개 이상을 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Ser 14 → Pro; Thr 16 → Met; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala, 또는 Gly; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys 또는 Asp; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile 또는 Leu; Asn 32 → Asp, Met 또는 Thr; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Arg; Val 53 → Ala; Met 55 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe 또는 Asp; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Ala 66 → Asn; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr 또는 Glu; Asp 80 → Gly; His 84 → Tyr 또는 Leu; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ala 86 → Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser 또는 Phe; Leu 105 → Cys 또는 Gly; His 106 → Ala, Gln, Glu, Lys, 또는 Pro; Lys 108 → Tyr 또는 Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Arg 111 → Pro; Gly 112 → Met, Val, 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Trp 또는 Ala; Lys 121 → Thr; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입.
항목 12. 항목 7에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은, 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Met 또는 Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr 또는 Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr.
항목 13. 항목 7에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입.
항목 14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, 리포칼린 뮤테인은 약 320 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 15. 항목 14에 있어서, 리포칼린 뮤테인은 약 10 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 16. 항목 14에 있어서, 리포칼린 뮤테인은 약 0.2 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 17. 항목 14 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 EC50 값은 본질적으로 실시예 5에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류에 의해 측정되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 18. 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 인간 LAG-3 및 사이노몰거스 LAG-3(서열번호: 1) 둘 모두와 교차-반응성인, 리포칼린 뮤테인.
항목 19. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합을 간섭할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
항목 20. 항목 19에 있어서, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합을 간섭하는 능력은 본질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류에 의해 분석되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 21. 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 하나 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;을 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 22. 항목 1 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 및 하나 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser, Asp, Glu, 또는 Ala; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Leu 56 → Asp; His 84 → Tyr 또는 Leu; His 106 → Glu, Lys, 또는 Pro; Val 110 → Asn; Gly 112 → Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu;을 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 23. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인:
(a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Gly; Cys 153 → Ser; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(c) Asp 7 → Gly; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Arg 148 → Trp; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(d) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; Tyr 97 → His; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; Cys 153 → Ser;
(f) Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ile 89 → Ser; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(g) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Gln 149 → Leu; Cys 153 → Ser; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Lys 70 → Arg; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(i) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(j) Ile 10 → Phe; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; Val 93 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(k) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(l) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;
(m) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(n) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(o) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Glu; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Val; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(p) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Leu; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(q) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(r) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ala; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Lys; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(s) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; Val 113 → Ala; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(t) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr;
(u) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Val 113 → Leu; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 또는
(v) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Met; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr.
항목 24. 항목 1 내지 22 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인:
(a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Ser 154 → Ala; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(b) Ala 5 → Thr; Gly 46 → Asp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; Ser 150 → Gly; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(c) Asp 7 → Gly; Val 85 → Asp; Arg 148 → Trp; Thr 152 → Pro; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(d) Ala 5 → Thr; Val 53 → Ala; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; Tyr 97 → His; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(e) Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; Leu 124 → Gln;
(f) Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Lys 65 → Glu; Ile 89 → Ser;
(g) Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Gln 149 → Leu; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(h) Lys 65 → Glu; Lys 70 → Arg;
(i) Ala 5 → Thr; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; Ile 98 → Val; 위치 156과 157 사이에의 Pro의 삽입;
(j) Ile 10 → Phe; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; Val 93 → Glu;
(k) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met;
(l) Arg 26 → Glu; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met;
(m) Arg 26 → Glu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Glu; Gly 112 → Val;
(n) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Leu;
(o) Arg 26 → Ser; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met;
(p) Arg 26 → Ala; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Lys; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met;
(q) Asn 32 → Thr; His 106 → Gln; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; Val 113 → Ala;
(r) Arg 26 → Gly; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Pro; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; 또는
(s) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Leu; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Val 113 → Leu.
항목 25. 항목 1 내지 24 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 서열번호: 8 내지 18 및 20 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 그의 단편이나 변이체를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 26. 항목 1 내지 25 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 서열번호: 서열번호: 8 내지 18 및 20 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97.5% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는, 리포칼린 뮤테인.
항목 27. 항목 1 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 유색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 세포증식 억제제, 독소, 금속 복합체, 금속 및 금콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 컨쥬게이트되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 28. 항목 1 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드인 융합 파트너에 융합되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 29. 항목 1 내지 28 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 항체 또는 항체 단편인 융합 파트너에 융합되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 30. 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 화합물에 컨쥬게이트되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 31. 항목 30에 있어서, 혈청 반감기를 연장시키는 화합물은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드로에틸스타치, 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 및 알부민 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리포칼린 뮤테인.
항목 32. 항목 31에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜 분자는 폴리에틸렌(PEG) 또는 이의 활성화된 유도체인, 리포칼린 뮤테인.
항목 33. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
항목 34. 항목 33의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
항목 35. 항목 34의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
항목 36. 뮤테인이 유전 공학적 방법에 의해 뮤테인 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산으로부터 시작하여 생성되는, 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 리포칼린 뮤테인의 생성 방법.
항목 37. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 LAG-3의 결합 방법.
항목 38. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 면역 반응의 자극 방법.
항목 39. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 T 림프구 증식의 유도 방법.
항목 40. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합의 간섭 방법.
항목 41. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II를 발현하는 세포로의 인간 LAG-3의 결합과 경쟁하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 42. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 있어서, 뮤테인은 본질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류 분석에서 측정되는 경우, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II를 발현하는 세포로의 인간 LAG-3의 결합과 경쟁하는, 리포칼린 뮤테인.
항목 43. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목의 리포칼린 뮤테인 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
항목 44. 치료제에 연결된 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목의 리포칼린 뮤테인 또는 이의 단편을 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 융합 단백질.
항목 45.
LAG-3의 결합/검출을 위한 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 뮤테인의 용도로서,
(a) 뮤테인을 LAG-3을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 접촉시켜, 뮤테인과 LAG-3 사이에 복합체가 형성되게 하고;
(b) 적정 신호에 의해 뮤테인과 LAG-3 간의 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 용도.
항목 46. 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목에 따른 뮤테인을 포함하는 진단적 또는 분석적 키트.
항목 47. 생물학적 샘플 내에서 LAG-3의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 뮤테인과 LAG-3의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 항목 1 내지 32 중 어느 한 항목의 뮤테인과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
항목 48. 항목 47에 있어서, 뮤테인과 LAG-3의 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
항목 49. 항목 47 또는 48에 있어서, 생물학적 샘플은 인간으로부터 분리되는, 방법.
항목 50. 항목 47 내지 49 중 어느 한 항목에 있어서, 샘플은 체액을 포함하는, 방법.
V. 실시예
실시예 1: 성숙 라이브러리의 생성 및 LAG-3에 특이적으로 결합하는 최적화된 뮤테인의 선택
LAG-3-특이적 뮤테인의 최적화를 위하여, 선택된 위치의 편향된 무작위화 또는 오류 유발 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반의 방법을 사용하여 뮤테인 서열번호: 7 또는 19에 기초하여 라이브러리를 생성하였다. 선택된 위치의 각각에 있어서, 인코딩된 아미노산이 50 내지 70% 확률로 각각의 모체 클론에서 관찰되는 아미노산에 상응하도록 편향된 설계가 이루어졌지만, 50 내지 30% 확률로 관찰되는 상이한 아미노산도 용인된다. N이 표적화된 위치의 수를 의미하고 B가 편향을 의미하는 경우, 클론당 가장 가능성이 높은 교환의 수는 N × (1-B)이다.
생성된 리포칼린 뮤테인을 본질적으로 기술된 바와 같이 파지미드 벡터 내로 높은 효율로 클로닝하였다(Kim et al., J Am Chem Soc, 2009). 파지 디스플레이를 사용하여 개선된 열 안정성 및 결합 친화성을 갖는 최적화된 뮤테인을 선택하였다. 초기 뮤테인 선택에 비하여 증가된 엄격성으로 파지미드 선택을 행하였으며, 여러 조건 중에서도 특히 표적 농도의 제한 및 상승된 온도에서의 사전인큐베이션 단계를 포함하였다.
실시예 2: 고 처리량 ELISA 스크리닝을 사용한 LAG-3에 특이적으로 결합하는 뮤테인의 동정
개별 콜로니를 사용하여 2x 효모 추출물 트립톤(2XYT)/Amp 배지에 접종하고 밤새(14 내지 18시간) 고정상으로 성장시켰다. 이어서 고정상 배양물로부터 50 ㎕ 2xYT/Amp를 접종하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.6 내지 0.8의 OD595에 도달할 때까지 22℃까지 온도를 변화시켰다. 뮤테인의 생성을 1.2 ㎍/㎖ 안하이드로테트라사이클린으로 보충된 10 ㎕ 2xYT/Amp의 첨가에 의해 유도하였다. 배양물을 다음날까지 22℃에서 인큐베이션시켰다. PBS/T 중 5%(w/v) BSA 40 ㎕의 첨가 및 25℃에서의 1시간 동안의 인큐베이션 후에, 배양물은 스크리닝 분석에 사용할 준비가 되었다.
역 스크리닝 포맷을 적용하였으며, 여기서 뮤테인을 항-Strep-태그 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상의 Strep-태그를 통해 포획하고 비오티닐화된 LAG-3-Fc를 첨가하고 엑스트라비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(시그마)를 통해 검출하였다.
증가된 친화성 및 안정성을 갖는 뮤테인을 선별하기 위해 i) 감소된 항원 농도, ii) 뮤테인을 항-Strep-태그 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상의 Strep-태그를 통해 포획하고, 상이한 농도의 표적을 엑스트라비딘-HRP(시그마)를 통해 첨가하고 검출하는 역 스트리닝 포맷의 사용, 그리고 부분적으로 iii) 표적 플레이트로의 첨가 이전에 이루어지는 75℃에서의 스크리닝 상청액 인큐베이션을 바탕으로 스크리닝을 수행하였다.
그 다음, 스크리닝 결과에 기초하여 클론을 시퀀싱하고, 추가의 특성화를 위해 뮤테인을 선별하였다.
실시예 3: 뮤테인의 발현
SA 링커의 C-말단 서열 SAWSHPQFEK 및 Strep-태그 II 펩타이드(WSHPQFEK)를 갖는 선별된 뮤테인을 2XYT/Amp 배지에서 에스케리키아 콜라이 내에서 발현시켜, Strep-Tactin 친화성 크로마토그래피 및 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 발현 후 뮤테인을 정제하였다. SEC 정제 후에, 단량체 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 분석적 SEC를 사용하여 다시 분석하였다. Strep-Tactin 친화성 크로마토그래피 및 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 후의 리포칼린 뮤테인의 수율, 및 Strep-Tactin 정제 후의 리포칼린 뮤테인의 단량체 함량이 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
실시예 4: 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 인간 및 사이노몰거스 LAG-3에 결합하는 뮤테인의 친화성
표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 본원에 개시된 대표적인 리포칼린 뮤테인의 결합 동력학 및 친화성을 측정하였다.
Biacore T200 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 huLAG-3-Fc(알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 및 cyLAG-3-Fc로의 예시적인 리포칼린 뮤테인의 결합을 측정하였다. 사이노몰거스 LAG-3(cyLAG-3)의 세포 외 도메인을 인자 Xa 절단 부위 및 (G4S)3 링커를 통해 인간 IgG1 Fc 단편에 융합시킴으로써 사이노몰거스 원숭이로부터의 재조합 LAG-3(cyLAG-3-Fc)을 생성하였다.
항-인간 IgG Fc 항체(지이 헬쓰케어)를 표준 아민 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 상에 고정화시켰다: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 칩 상의 카복실기를 활성화시켰다. 이어서, 10 mM 아세트산나트륨(pH) 5 중의 25 ㎍/㎖ 농도의 항-인간 IgG Fc 항체 용액(지이 헬스케어)을 9000 내지 14000 공명 단위(RU)의 고정화 수준이 달성될 때까지 5 ㎕/분의 유속으로 적용하였다. 1M 에탄올아민 용액을 표면에 통과시킴으로써 잔류 미반응 NHS-에스테르를 차단하였다. 기준 채널을 유사한 방식으로 처리하였다. 그 후, HBS-EP + 완충액 중 0.25 ㎍/㎖의 huLAG-3-Fc 또는 1.5 ㎍/㎖의 cyLAG-3-Fc를 10 ㎕/분의 유속에서 180초 동안 칩 표면에서 항-인간 IgG-Fc 항체로 포획하였다.
친화성 측정을 위해, 각 뮤테인의 희석물을 HBS-EP + 완충액에서 제조하고, 제조된 칩 표면에 적용하였다. 서열번호: 19 내지 28에 있어서, 100 nM에서 4 nM에 이르는, 일부 경우에 0.8 nM에 이르기까지의 농도를 적용하고, 서열번호: 7 및 85 내지 94에 있어서, 6 nM에서 0.5 nM에 이르기까지의 농도를 인간 LAG-3에 대한 친화성 측정을 위하여, 그리고 8 nM에서 0.5 nM에 이르기까지의 농도를 사이노몰거스 LAG-3에 대한 친화성 측정을 위하여 적용하였다. 결합 분석을 180초의 접촉 시간, 1500 또는 600초의 해리 시간 및 30 ㎕/분의 유속으로 수행하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 칩 표면의 재생을 10 ㎕/분의 유속에서 60초 동안 3 M MgCl2 및 180초 동안 10 mM 글라이신-HCl(pH 1.7)을 주입하여 달성한 후에, 러닝 완충액(HBS-EP + 완충액)으로의 여분의 세척 및 120초의 안정화 기간을 거쳤다. 리포칼린 뮤테인 서열번호: 3을 또한 음성 대조군으로서 시험하였다. 단백질 측정 이전에, 컨디셔닝 목적으로 3가지 스타트업 사이클을 수행하였다. 데이터는 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어(v2.0)로 평가하였다. 더블 레퍼런싱을 사용하고, 1:1 결합 모델을 사용하여, 미가공 데이터를 핏팅시켰다.
서열번호: 7 및 19, 및 서열번호: 85 내지 94, 20 내지 28, 57, 61 및 63 내지 68의 최적화된 리포칼린 뮤테인에 대한 k on, k off 및 생성된 평형 해리 상수(K d)에 대하여 결정된 값은 표 2에 요약되어 있다. 모든 최적화된 LAG-3 특이적 리포칼린 뮤테인은 피코몰 내지 낮은 나노몰의 친화성으로 인간 및 사이노몰거스 LAG-3에 결합하며, 친화성은 최적화 후에 최대 60배까지 개선된다.
Figure pct00002
실시예 5: 인간 및 사이노몰거스 LAG-3을 발현하는 세포에 결합하는 리포칼린 뮤테인의 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석
본 발명자들은 huLAG-3(CHO-huLAG-3) 또는 cyLAG-3(CHO-cyLAG-3)으로 안정적으로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 리포칼린 뮤테인 서열번호: 7, 19 내지 28 및 85 내지 94의 특이적 결합을 평가하기 위해 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 연구를 이용하였다. 서열번호: 3을 음성 대조군으로서 병행하여 시험하였다. 제조사의 지시에 따라 Flp-In 시스템(인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 세포주를 생성하였다. 모의-형질감염된 Flp-In CHO 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
형질감염된 CHO 세포를 10% 우태아혈청(FCS, Biochrom) 및 500 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B(Roth)가 보충된 햄스 F12 배지(Ham's F12 medium, 인비트로겐)에서 유지하였다. 세포를 제조사의 지시(37℃, 5% CO2 분위기)에 따라 표준 조건 하에서 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 계대배양(subculture) 또는 FACS 실험을 위하여 부착 세포를 분리하기 위해, 제조사의 지시에 따라 아큐타제(Accutase)(PAA)를 사용하였다.
실험을 수행하기 위해, LAG-3-양성 및 음성 Flp-In CHO 세포를 리포칼린 뮤테인과 인큐베이션하고, 결합된 뮤테인을 형광 표지된 항-hTlc 항체를 사용하여 표지한 다음, 본 실시예에 기술된 바와 같은 FACS 분석을 사용하여 신호를 검출하였다.
웰당 5x104개 세포를 5% 우태아혈청(PBS-FCS)을 함유하는 빙냉(ice-cold) PBS 중에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 이어서, 일반적으로 1 μM 내지 0.01 nM 범위의 리포칼린 뮤테인, 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호: 3) 및 벤치마크 항-LAG-3 항체(서열번호: 5 및 6)의 희석 시리즈를 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 500 xg에서 원심분리를 사용하여 빙냉 PBS에서 2회 세척한 다음, 얼음 상에서 30분 동안 형광 염료 알렉사(Alexa) 488로 표지된 토끼 항-리포칼린 항체(피어리스(Pieris)) 또는 알렉사 488로 표지된 염소 항-인간 IgG 항체(인비트로겐)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고, Intellicyt IQue 유세포계수기(Intellicyt)를 사용하여 분석하였다. LAG-3 발현 CHO 세포에 대하여 게이팅하고, Forecyt® 소프트웨어를 사용함으로써 LAG-3 발현 세포에 결합하는 리포칼린 뮤테인에 의해 생성되는 형광 데이터를 분석하고, 생성된 기하학적 형광 평균을 플롯팅하고, Graphpad 소프트웨어를 사용하여 핏팅시켰다. 서열번호: 7, 19 내지 28 및 85 내지 94에 대하여 생성되는 데이터는 도 2 및 표 3에 나타나 있다. 모든 최적화된 LAG-3 특이적 뮤테인(서열번호: 85 내지 94 및 20 내지 28)은 벤치마크 항체와 비슷한 EC50으로 huLAG-3 또는 cyLAG-3을 발현하는 CHO 세포로의 분명한 결합을 보인다. 최적화된 뮤테인의 대다수는 서열번호: 7 및 19에 비하여 더 낮은 EC50 값을 나타내며, 이는 모체 리포칼린 뮤테인에 비하여 개선된 결합을 나타낸다. 인간 및 사이노몰거스 LAG-3에 대한 결합 친화성 간의 차이는 대부분의 최적화된 뮤테인에 대하여 유의미하게 감소되었으며, 이는 잠재적인 약동학적 연구 또는 약물-안전성 연구에 대한 바람직한 특징을 나타낸다. LAG-3에 결합하지 않는 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호: 3)은 어떠한 결합도 보이지 않았다(미도시). 모의-형질감염된 Flp-In CHO 세포에서 리포칼린 뮤테인의 결합이 검출되지 않았다(미도시).
Figure pct00003
실시예 6: MHC 클래스 II 발현 세포와의, 인간 LAG-3에 대한 리포칼린 뮤테인의 경쟁적 결합의 FACS 분석.
주어진 리포칼린 뮤테인이 MHC 클래스 II-양성 세포 상의 MHC 클래스 II로의 LAG-3 결합을 간섭하는지를 평가하기 위해, 경쟁 FACS 실험을 이용하였다. 이 실험에서, 일정한 농도의 인간 LAG-3-Fc 융합체(huLAG-3-Fc, 알앤디 시스템) 및 각 리포칼린 뮤테인의 희석 시리즈를 MHC 클래스 II 양성 인간 세포주 A375와 함께 인큐베이션하고, 형광 표지된 항-IgG Fc 항체를 사용하여 세포-결합된 huLAG-3-Fc를 검출하였다. 이 분석에서, huLAG-3과 이의 리간드 MHC 클래스 II의 결합을 간섭하는 경쟁적 리포칼린 뮤테인은 MHC 클래스 II 양성 세포주 A375로의 huLAG-3-Fc 결합 감소를 초래한다.
흑색종 세포주 A375를 10% 우태아혈청(FCS, Biochrom)이 보충된 DMEM 배지(인비트로겐)에서 유지하였다. 세포를 제조사의 지시(37℃, 5% CO2 분위기)에 따라 표준 조건 하에서 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 계대 배양 또는 FACS 실험을 위하여 부착 세포를 분리하기 위해, 제조사의 지시에 따라 아큐타제(PAA Laboratories GmbH)를 사용하였다.
FACS 분석을 위해, 웰당 5x104개의 A375 세포를 PBS-FCS에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 3 nM의 huLAG-3-Fc 및 1 μM 내지 0.01 nM 범위의 다양한 농도의 LAG-3 특이적 리포칼린 뮤테인을 첨가하였다. 세포를 빙냉 PBS에서 2회 세척하고, PBS-FCS에 재현탁하고, 피코에리트린 표지된 항-인간 IgG Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고, Intellicyt IQue 유세포계수기(Intellicyt)를 사용하여 분석하였다. A375 세포에 결합하는 huLAG-3-Fc에 의해 생성된 형광 데이터를 Forecyt 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 얻어진 기하학적 형광 평균을 huLAG-3-Fc 최대 결합에 대해 정규화하였다. huLAG-3-Fc 결합 백분율을 플롯팅하고 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 핏팅시켰다. 서열번호: 7, 19 내지 28 및 85 내지 94의 IC50 값은 표 4에 요약되어 있으며, 선별된 경쟁 결합 곡선은 도 3에 제공되어 있다. 데이터는 모든 최적화된 리포칼린 뮤테인이 인간 MHC 클래스 II 발현 세포 상의 huLAG-3의 리간드 MHC 클래스 II로의 huLAG-3의 결합과 경쟁한다는 것을 보여준다. 이러한 실험에 대한 검출 한계에 도달하였으며, 이에 따라, 모체 뮤테인에 비하여 최적화된 리포칼린 뮤테인의 IC50의 개선은 존재하더라도 관찰되지 않았다. LAG-3에 결합하지 않는 음성 대조군 리포칼린 뮤테인(서열번호: 3)은 어떠한 경쟁도 보이지 않았다.
Figure pct00004
실시예 7: 리포칼린 뮤테인의 열 안정성 평가
전반적인 안정성에 대한 일반적인 지표인 리포칼린 뮤테인의 용융 온도(Tm)를 결정하기 위해, PBS(Gibco) 중 1 ㎎/㎖의 단백질 농도에서 LAG-3 특이적 뮤테인을 모세관 나노DSC 기기(CSC 6300, TA Instruments)를 사용하여 1℃/분에서 스캐닝하였다(25 내지 100℃). 통합 Nano Analyze 소프트웨어를 사용하여 디스플레이된 서모그램(thermogram)으로부터 Tm을 계산하였다.
예시적인 리포칼린 뮤테인(서열번호: 7, 19 내지 28, 85 내지 94 및 67)에 대하여 얻은 최대 용융 온도 및 용융의 개시는 하기 표 5에 열거되어 있다. 거의 모든 리포칼린 뮤테인이 60 내지 80℃ 범위의 Tm을 가지며, 이는 이들 뮤테인의 각각에 대한 우수한 전반적인 안정성을 나타낸다.
Figure pct00005
본원에 예시적으로 기술된 구현예들은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소나 요소들, 제한이나 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는", "내포하는" 등은 광범위하고 제한없이 읽혀져야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 용어들로서 사용되었을 뿐 제한은 아니며, 도시되고 기술된 특징들 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하는 그러한 용어들 및 표현들의 사용에 대한 의도는 없으나, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형들이 가능한 것으로 간주된다. 따라서, 본 구현예들이 바람직한 구현예들과 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었다고는 하나, 이의 변형 및 변이들이 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 그러한 변형 및 변이들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것으로 이해되어야 한다. 여기에 기재된 모든 특허, 특허 출원, 교과서 및 동료 검토 간행물은 그들의 전체가 참조로 여기에 포함된다. 또한, 여기에 참조로 포함된 참고문헌에서 정의 또는 용어의 사용이 여기에 제공된 용어의 정의와 모순되거나 반대되는 경우, 여기에 제공된 해당 용어의 정의와 참고문헌에서의 해당 용어의 정의가 적용되지 않는다. 일반 개시물에 속하는 더 좁은 종 및 아속(subgeneric) 그룹화 각각 역시 본 발명의 일부를 형성한다. 제외된 물질이 구체적으로 여기에서 인용되는지 여부와 무관하게 속(genus)으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 소극적 한정을 가진 발명의 일반적인 설명이 포함된다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹으로 기재되는 경우, 당업자는 개시물이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 서브그룹의 관점에서 기재됨을 인식할 것이다. 추가의 구현예들은 다음의 청구범위로부터 명백해질 것이다.
등가물: 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 여기에 기재된 발명의 특정 구현예들에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 여기에 참조로 포함되는 것처럼 동등한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.
[비특허 참고문헌]
Figure pct00006
Figure pct00007
<110> Pieris Pharmaceuticals GmbH <120> Lipocalin muteins with binding affinity for LAG-3 <130> PIE15921PCT_I19O10C0089P/DE <150> EP17151945.7 <151> 2017-01-18 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr 1 5 10 15 Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn 35 40 45 Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val 50 55 60 Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp 65 70 75 80 Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His 85 90 95 Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly 100 105 110 Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu 115 120 125 Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile 130 135 140 Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 659 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LAG-3 Fc fusion protein <400> 2 Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly 20 25 30 Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro 35 40 45 Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp 50 55 60 Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly 65 70 75 80 Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu 85 90 95 Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg 115 120 125 Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr 130 135 140 Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn 145 150 155 160 Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg 165 170 175 Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His 180 185 190 Leu Ala 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Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala 405 410 415 Leu Pro Ala Gly His Leu Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys 420 425 430 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly 435 440 445 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 450 455 460 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 465 470 475 480 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 485 490 495 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 500 505 510 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 515 520 525 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 530 535 540 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 545 550 555 560 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 565 570 575 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 580 585 590 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro 595 600 605 Val Leu Asp 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120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gatgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccct ggcagagcga acccagctct ccagggcca 459 <210> 33 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 33 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggccacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cgaccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcatcaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca 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ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gtggcctata tcagtcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccagggcca 459 <210> 36 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 36 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aaccagctct ccagggcca 459 <210> 37 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 37 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaggac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccagggcca 459 <210> 38 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 38 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagaaaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccggtgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcaatcgcag ccatgtgaaa gatcattacg tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagtatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccagggcca 459 <210> 39 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 39 gcctcagacg aggagtttca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgcaccg ggtaaatata cagccgatgg aggcaaacat 240 gttgcctata tcaatcgcag ccatgagaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggtacc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccagggcca 459 <210> 40 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 40 acctcagacc aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattccgatt gcttttggat 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gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 42 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 42 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgatgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccatggca ccccggggag gatggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 43 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 43 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgaggaag atccggaatt gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccagggca ccccgggtag gatggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 44 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 44 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgaggaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggcgagggca ccccggggag ggtggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 45 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 45 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgatgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccagggca ccccggggag gttggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 46 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 46 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcagtgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gtgctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccagggca ccccgggtag gatggttgcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 47 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 47 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgctgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggcaagggca ccccggggag gatggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 48 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 48 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agccgtgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gttctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaacat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccagggca ccccgaatag gatggcggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 49 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 49 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcggggaag atccggaatt gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gtgctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaatat 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccctggca ccccgggtag gatggtggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 50 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 50 gcctcagacg aggagattca ggatgtgcca gggacgtggt atctgaaagc gatgacggtt 60 agcgatgaag atccggaaat gaccctggaa tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tagggtgacc gtgctgattg atggccgctg ccaggaagtg 180 aaaaacgtgc tcgagaagac agatgaaccg ggtaaataca cggaagatgg cggcaaactt 240 gtggattata tcattagatc tcatgtgaaa gatcattaca tcttctactt tgaaggcgaa 300 ggccagggca ccccgggtag gatgctggcc ctggtgggca gagaccccac caataatctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 His His Leu Leu 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa cleavage site <400> 52 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA linker and strep-tag II 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gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaggac agatcgcccg ggtaaatata cggccggcgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 78 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 78 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg ccaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaggac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 79 <211> 456 <212> DNA <213> 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gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 81 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 81 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg ccaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 82 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 82 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 83 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 83 gcctcagacg aggagattca gaatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 84 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 84 gcctcagacg aggagattca gaatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg ccaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aacctgctct ccaggg 456 <210> 85 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 85 Thr Ser Asp Gln Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Gly Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly 145 150 <210> 86 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 86 Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Gly Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 87 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 87 Ala Ser Gly Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Trp 130 135 140 Gln Ser Glu Pro Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 88 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 88 Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Ala Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Thr Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His His Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 89 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 89 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Asp Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Asp Ala Tyr Ile Ile Ser Ser His Val Lys Asp Asn Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Gln Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 90 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 90 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Met Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr His Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ser Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 91 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 91 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Asp Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Leu Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 92 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 92 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 93 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 93 Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gly Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Asn Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Val Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 94 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 94 Ala Ser Asp Glu Glu Phe Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Ala Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Asn Arg Ser His Glu Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 95 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 95 Thr Ser Asp Gln Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Ser Asp Cys Phe Trp Ile Asp Asp Val Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Asp Ile Phe Gly Phe Trp Gln Glu Val Glu Ala Val Leu 50 55 60 Gly Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys Ala Gly Tyr Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ala Pro Gly 145 150 <210> 96 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 96 acctcagact aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattccgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagggaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gctgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggacttcga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagcgct ccaggg 456 <210> 97 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 97 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaagacggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgagccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gctgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagggcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 98 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 98 gcctcaggcg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gatgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccct ggcagagcga acccagctct ccaggg 456 <210> 99 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 99 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggccacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cgaccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcatcaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 100 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 100 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtct gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggatgtg 180 aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaagtata cggccgatgg cggcaaacat 240 gatgcctata tcattagcag tcatgtgaaa gataattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaaccag 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 101 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 101 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggatgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactacccat 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gtggcctata tcagtcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 102 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 102 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggatgtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata ccgccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagctgca ggagcccgcg gactcagtac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggctgagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 103 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 103 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaggac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 104 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 104 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagaaaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccggtgg cggcaaacat 240 gttgcctata tcaatcgcag ccatgtgaaa gatcattacg tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagtatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 105 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 105 gcctcagacg aggagtttca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattctgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagagaagac agatgcaccg ggtaaatata cagccgatgg aggcaaacat 240 gttgcctata tcaatcgcag ccatgagaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggtacc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 106 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 106 acctcagacc aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gattccgatt gcttttggat tgatgatgtg tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggatattt ttggcttttg gcaggaagtg 180 gaagcagtgt tagggaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggcaaacat 240 gctgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgaa 300 tgcgctggct atccggttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggacttcga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagcgct ccaggg 456

Claims (54)

  1. 약 250 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뮤테인은 약 50 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 뮤테인은 약 3 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 뮤테인은 약 0.1 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 뮤테인은 약 0.05 nM 이하의 K d로 측정되는 친화성으로 LAG-3에 결합할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    K d 값은 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같은 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되는, 리포칼린 뮤테인.
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 14, 16, 25 내지 34, 44, 46, 52 내지 53, 55 내지 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 84 내지 86, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 114, 121, 124, 148 내지 150 및 152 내지 154에 적어도 2개 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 14, 25 내지 26, 28, 31 내지 32, 52, 55, 58, 66, 79, 84, 86, 101, 105 내지 106, 108, 110, 112 내지 114 및 121에 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65 내지 66, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 110 내지 111, 114, 121, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 156 내지 157에 적어도 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 추가로 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 26 내지 34, 44, 46, 53, 56, 58, 60 내지 61, 63, 65, 69 내지 70, 73, 79 내지 80, 85, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 101, 105 내지 106, 108, 111, 114, 124, 148 내지 150, 152 내지 154 및 156 내지 157에 적어도 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 추가로 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 5, 7 내지 8, 10, 16, 44, 46, 63, 65, 69 내지 70, 73, 80, 84, 89 내지 90, 93, 96 내지 98, 113, 124, 148 내지 150, 152 및 154에 적어도 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열이 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 2개 이상을 포함하는 리포칼린 뮤테인: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Ser 14 → Pro; Thr 16 → Met; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys 또는 Asp; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile 또는 Leu; Asn 32 → Asp, Met 또는 Thr; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Arg; Val 53 → Ala; Met 55 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe 또는 Asp; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Ala 66 → Asn; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr 또는 Glu; Asp 80 → Gly; His 84 → Tyr 또는 Leu; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ala 86 → Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser 또는 Phe; Leu 105 → Cys 또는 Gly; His 106 → Ala, Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Lys 108 → Tyr 또는 Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Arg 111 → Pro; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Trp 또는 Ala; Lys 121 → Thr; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Ala 또는 Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Met 또는 Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr 또는 Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포칼린 뮤테인은 약 320 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 리포칼린 뮤테인은 약 10 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 리포칼린 뮤테인은 약 0.2 nM 이하의 EC50 값으로 LAG-3에 결합하는, 리포칼린 뮤테인.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EC50 값은 본질적으로 실시예 5에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류에 의해 측정되는, 리포칼린 뮤테인.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 인간 LAG-3 및 사이노몰거스 LAG-3 둘 모두와 교차-반응성인, 리포칼린 뮤테인.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합을 간섭할 수 있는, 리포칼린 뮤테인.
  21. 제20항에 있어서,
    주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합을 간섭하는 능력은 본질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류에 의해 분석되는, 리포칼린 뮤테인.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 하나 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Ala 5 → Thr; Asp 7 → Gly; Glu 8 → Gln; Ile 10 → Phe; Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Gly 46 → Asp; Val 53 → Ala; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Lys 70 → Arg; Glu 73 → Ala; Ala 79 → Thr; Asp 80 → Gly; Val 85 → Ala 또는 Asp; Ile 89 → Ser 또는 Asn; Arg 90 → Ser; Val 93 → Glu; His 96 → Asn; Tyr 97 → His; Ile 98 → Val; Leu 124 → Gln; Arg 148 → Trp; Gln 149 → Leu; Ser 150 → Gly; Thr 152 → Pro; 및 Ser 154 → Ala;을 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이: Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Lys 114 → Ala; Lys 121 → Thr; 및 하나 이상의 하기의 아미노산 돌연변이: Arg 26 → Ser, Asp, Glu, Gly 또는 Ala; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Leu 56 → Asp; His 84 → Tyr 또는 Leu; His 106 → Gln, Glu, Lys 또는 Pro; Val 110 → Gly 또는 Asn; Gly 112 → Met, Val 또는 Leu; Val 113 → Ala 또는 Leu;을 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인:
    (a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala;
    (b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Gly; 및 Cys 153 → Ser;
    (c) Asp 7 → Gly; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Arg 148 → Trp; Thr 152 → Pro; 및 Cys 153 → Ser;
    (d) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Val 53 → Ala; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; Tyr 97 → His; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Leu 124 → Gln; 및 Cys 153 → Ser;
    (f) Thr 16 → Met; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 44 → His; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Ile 89 → Ser; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (g) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Gln 149 → Leu; 및 Cys 153 → Ser;
    (h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Lys 70 → Arg; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (i) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; Ile 98 → Val; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (j) Ile 10 → Phe; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; Val 93 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (k) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser; 및 Ser 154 → Ala;
    (l) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Cys 61 → Trp; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
    (m) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (n) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (o) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Glu; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Glu; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Val; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (p) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Leu; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (q) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (r) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Ala; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Lys; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (s) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; Val 113 → Ala; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (t) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Tyr; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Pro; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (u) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Asp; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Thr; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; His 84 → Leu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Val 113 → Leu; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr;
    (v) Ser 14 → Pro; Asp 25 → Ser; Arg 26 → Gly; Phe 28 → Asp; Asn 32 → Met; Lys 52 → Arg; Met 55 → Val; Ser 58 → Asp; Ala 66 → Asn; Ala 79 → Glu; Ala 86 → Asp; Cys 101 → Phe; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Thr; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; Lys 114 → Ala; 및 Lys 121 → Thr; 또는
    (w) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Asp; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Phe; Glu 30 → Trp; Met 31 → Ile; Asn 32 → Asp; Leu 33 → Asp; Glu 34 → Val; Leu 56 → Asp; Ser 58 → Phe; Arg 60 → Phe; Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; Cys 101 → Ser; Leu 105 → Cys; His 106 → Ala; Lys 108 → Tyr; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Gln 149 → Leu.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 돌연변이의 세트 중 하나를 포함하는, 리포칼린 뮤테인:
    (a) Ala 5 → Thr; Glu 8 → Gln; Lys 65 → Glu; Glu 69 → Gly; Val 85 → Ala; 및 Ser 154 → Ala;
    (b) Ala 5 → Thr; Gly 46 → Asp; Lys 65 → Glu; Val 85 → Ala; 및 Ser 150 → Gly;
    (c) Asp 7 → Gly; Val 85 → Asp; Arg 148 → Trp; 및 Thr 152 → Pro;
    (d) Ala 5 → Thr; Val 53 → Ala; Lys 65 → Glu; Ala 79 → Thr; 및 Tyr 97 → His;
    (e) Glu 63 → Asp; Val 85 → Asp; Arg 90 → Ser; His 96 → Asn; 및 Leu 124 → Gln;
    (f) Thr 16 → Met; Leu 44 → His; Lys 65 → Glu; 및 Ile 89 → Ser;
    (g) Glu 63 → Asp; Lys 65 → Glu; 및 Gln 149 → Leu; 및
    (h) Lys 65 → Glu 및 Lys 70 → Arg;
    (i) Ala 5 → Thr; Lys 65 → Glu; Asp 80 → Gly; Ile 89 → Asn; 및 Ile 98 → Val;
    (j) Ile 10 → Phe; Lys 65 → Glu; Glu 73 → Ala; Ile 89 → Asn; 및 Val 93 → Glu;
    (k) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
    (l) Arg 26 → Glu; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
    (m) Arg 26 → Glu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Glu; 및 Gly 112 → Val;
    (n) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Leu;
    (o) Arg 26 → Ser; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
    (p) Arg 26 → Ala; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Lys; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met;
    (q) Asn 32 → Thr; His 106 → Gln; Val 110 → Asn; Gly 112 → Met; 및 Val 113 → Ala;
    (r) Arg 26 → Gly; Met 31 → Leu; Asn 32 → Thr; His 84 → Tyr; His 106 → Pro; Val 110 → Gly; 및 Gly 112 → Met; 또는
    (s) Arg 26 → Asp; Asn 32 → Thr; His 84 → Leu; His 106 → Gln; Val 110 → Gly; Gly 112 → Met; 및 Val 113 → Leu.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)의 서열 위치 61 및 153에 시스테인 잔기를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개를 추가로 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Ala 5 → Thr 및 Asp 12 → Asn.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(서열번호: 1)과 비교하여 하기의 돌연변이된 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 리포칼린 뮤테인: Asp 7 → Asn, Arg 또는 Lys; Glu 9 → Gln, Arg 또는 Lys; Asp 12 → Asn 또는 Arg; Glu 45 → Arg; Asp 72 → Asn, Arg 또는 Lys; Glu 73 → Arg; Asp 80 → Gly; 및 Asp 95 → Asn, Arg 또는 Lys.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 서열번호: 8 내지 18, 20 내지 28, 57 내지 70, 및 85 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편이나 변이체를 포함하는, 리포칼린 뮤테인.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 서열번호: 서열번호: 8 내지 18, 20 내지 28, 57 내지 70, 및 85 내지 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97.5% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는, 리포칼린 뮤테인.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 유색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 세포증식 억제제, 독소, 금속 복합체, 금속 및 금콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물에 컨쥬게이트되는, 리포칼린 뮤테인.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드인 융합 파트너에 융합되는, 리포칼린 뮤테인.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 항체 또는 항체 단편인 융합 파트너에 융합되는, 리포칼린 뮤테인.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 상기 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 화합물에 컨쥬게이트되는, 리포칼린 뮤테인.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 혈청 반감기를 연장시키는 화합물은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드로에틸스타치, 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드 및 알부민 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리포칼린 뮤테인.
  36. 제35항에 있어서,
    폴리알킬렌 글리콜 분자는 폴리에틸렌(PEG) 또는 이의 활성화된 유도체인, 리포칼린 뮤테인.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  38. 제37항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  39. 제38항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  40. 상기 뮤테인이 유전 공학적 방법에 의해 상기 뮤테인 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산으로부터 시작하여 생성되는,
    제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 리포칼린 뮤테인의 생성 방법.
  41. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 LAG-3의 결합 방법.
  42. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 면역 반응의 자극 방법.
  43. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 T 림프구 증식의 유도 방법.
  44. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 대상체 내의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II로의 인간 LAG-3의 결합의 간섭 방법.
  45. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II를 발현하는 세포로의 인간 LAG-3의 결합과 경쟁하는, 리포칼린 뮤테인.
  46. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뮤테인은 본질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같은 형광-활성화 세포 분류 분석에서 측정되는 경우, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II를 발현하는 세포로의 인간 LAG-3의 결합과 경쟁하는, 리포칼린 뮤테인.
  47. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 리포칼린 뮤테인 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  48. 치료제에 연결된 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 리포칼린 뮤테인 또는 이의 단편을 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 융합 단백질.
  49. LAG-3의 결합/검출을 위한 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인의 용도로서,
    (a) 뮤테인을 LAG-3을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 접촉시켜, 뮤테인과 LAG-3 간의 복합체가 형성되게 하고;
    (b) 적정 신호에 의해 뮤테인과 LAG-3 간의 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 용도.
  50. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 포함하는 진단적 또는 분석적 키트.
  51. 생물학적 샘플 내에서 LAG-3의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 뮤테인과 LAG-3의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 뮤테인과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 뮤테인과 LAG-3의 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 인간으로부터 분리되는, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 체액을 포함하는, 방법.
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