ES2938525T3 - Polipéptido de fusión anticanceroso - Google Patents

Abstract

La descripción proporciona un polipéptido de fusión específico tanto para CD137 como para GPC3, cuyo polipéptido de fusión puede ser útil para dirigir la agrupación y activación de CD137 a células tumorales positivas para GPC3. Tal polipéptido de fusión puede usarse en muchas aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, como agentes anticancerígenos y/o inmunomoduladores para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas tales como una variedad de tumores. La presente descripción también se refiere a los métodos para preparar el polipéptido de fusión descrito en el presente documento, así como a las composiciones que comprenden dicho polipéptido de fusión. La presente descripción se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican dicho polipéptido de fusión ya métodos para la generación de dicho polipéptido de fusión y moléculas de ácido nucleico. Además, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido de fusión anticanceroso

I. Antecedentes

El glipicano-3 (GPC3, por sus siglas en inglés) es un antígeno oncofetal que pertenece a la familia de glipicanos de los heparinsulfato proteoglicanos anclados por glicosilfosfatidilinositol. El GPC3 se expresa en el hígado fetal y la placenta durante el desarrollo y está regulado negativamente o silenciado en tejidos adultos normales. Las mutaciones y los agotamientos en el gen GPC3 son responsables del síndrome de Simpson-Golabi-Behmel o síndrome dismórfico de Simpson en los seres humanos. El GPC3 se expresa en varios cánceres y, en particular, el carcinoma hepatocelular (“HCC”, por sus siglas en inglés), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma. (He, H. et al Applied Immunohistochem Mol Morphol. 17:40-6 (2009); Jakubovic y Jothy; Ex. MoI. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura y Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). El HCC es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. Cada año, el HCC se cobra aproximadamente un millón de muertes. (Nakatsura y Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)).

Un tratamiento eficaz contra los cánceres expresados por GPC3, como HCC, requiere compuestos terapéuticos que seleccionan como diana GPC3 y que también producen efectos antitumorales.

El CD137 es un receptor inmune coestimulatante y un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR, por sus siglas en inglés). Se expresa principalmente en células T CD4+ y CD8+, células B activadas y células citolíticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) pero también puede hallarse en monocitos en reposo y células dendríticas (Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5(Supl 1):47-53), o células endoteliales (Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217). El CD137 juega un papel importante en la regulación de respuestas inmunes y así es una diana para inmunoterapia del cáncer. El ligando de CD137 (CD137L) es el único ligando natural conocido de CD137, y se expresa constitutivamente en diversos tipos de APC, tales como células B activadas, monocitos, y células dendríticas esplénicas, y puede inducirse en linfocitos T.

El CD137L es una proteína trimérica que existe como una forma ligada a membrana y como una variante soluble. La capacidad del CD137L soluble de activar CD137, por ejemplo, en linfocitos que expresan CD137 es limitada, sin embargo, y se requieren grandes concentraciones para producir un efecto (Wyzgol, A. et al., J Immunol 1 de agosto de 2009; 183(3):1851-1861). El modo natural de activación de CD137 es mediante el acoplamiento de una célula CD137 positiva con una célula CD137L positiva. Se cree entonces que la activación de CD137 se induce mediante la formación de agrupamientos (del inglés, clustering) a través de CD137L en la célula opuesta, conduciendo a señalización mediante TRAF1, 2 y 3 (Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217, Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12(2):130-146) y efectos aguas abajo concomitantes adicionales en la célula T CD137 positiva. En el caso de células T activadas por reconocimiento de sus respectivas dianas cognadas, los efectos producidos por coestimulación de CD137 son una activación adicionalmente aumentada, supervivencia y proliferación aumentadas, la producción de citoquinas proinflamatorias y capacidad para matar mejorada.

El beneficio de la coestimulación de CD137 para la eliminación de células cancerosas se ha demostrado en un número de modelos in vivo preclínicos. La expresión forzada de CD137L en un tumor, por ejemplo, conduce al rechazo del tumor (Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28(3):1116-1121). De manera similar, la expresión forzada de un scFv anti-CD137 en un tumor conduce a eliminación del tumor dependiente de células T CD4+ y células NK (Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Abril; 8(4):343-348, Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Enero; 5(1):149-155, Yang, Y. et al., Canc Res 1 de marzo de 2007; 67(5):2339-2344). Un anticuerpo anti-CD137 administrado sistemáticamente también ha demostrado conducir al retardo en el crecimiento tumoral (Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9(12):786-792).

Se ha demostrado que CD137 es un excelente marcador para células T naturales reactivas a tumor en tumores humanos (Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 1 de enero de 2014; 20(1):44-55), y que los anticuerpos anti-CD137 pueden emplearse para mejorar la expansión y actividad de linfocitos infiltrantes de tumor de melanoma CD8+ para la aplicación en terapia de células T adoptivas (Chacon, J. A. et al., PloS One 20138(4):e60031).

La demostración preclínica del beneficio terapéutico potencial de la coestimulación de CD137 ha estimulado el desarrollo de anticuerpos terapéuticos con diana en CD137, BMS-663513 (Jure-Kunkel, M. et al., patente US 7288638) y PF-05082566 (Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61(10):1721-1733); ambos están actualmente en ensayos clínicos tempranos.

Sin embargo, solo recientemente se ha apreciado que un ligando de CD137 bivalente tal como un anticuerpo puede en sí mismo no ser suficiente para la formación de agrupamientos de CD137 en células T o células NK y conducir a una activación eficiente, en analogía a la falta de actividad del CD137L soluble trivalente. En recientes publicaciones que utilizan modelos de ratón preclínicos, se ha presentado evidencia in vivo de que el modo de acción de otros anticuerpos anti-TNFR en realidad requiere la interacción de los anticuerpos mediante su parte Fc con receptores Fcgamma en células que expresan receptores Fc-gamma (Bulliard, Y. et al., J Exp Med 26 de agosto de 2013; 210(9):1685-1693, Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92(6):475-480). El modo de acción de los anticuerpos actualmente en desarrollo clínico puede, por consiguiente, estar dominado por una formación de agolpamientos sin diana mediante receptores Fc-gamma que puede ser dependiente casi aleatoriamente de la presencia de células que expresan Fc-y en las proximidades del tumor.

Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha para la generación de agentes terapéuticos que formen agrupamientos y activen CD137 con un modo de acción con diana específico en tumor.

Para cumplir esta necesidad insatisfecha, la presente solicitud proporciona un novedoso enfoque para acoplarse simultáneamente a CD137 y antígeno tumoral GPC3 mediante un polipéptido de fusión que tiene las siguientes propiedades:

(a) especificidad de unión para CD137; y

(b) especificidad de unión para GPC3;

Este polipéptido de fusión está diseñado para proporcionar una activación de CD137 dependiente de diana tumoral en linfocitos, mediante GPC3 expresado en células tumorales. Se espera que una molécula de este tipo active además células T y/o células NK que están situadas en las proximidades de un tumor GPC3 positivo. Dicho polipéptido biespecífico puede exhibir efectos terapéuticos mejorados sobre anticuerpos o bien anti-GPC3 o bien anti-CD137.

II. Definiciones

La siguiente lista define términos, expresiones y abreviaturas utilizados a lo largo de la presente memoria descriptiva. Todos los términos listados y definidos en la presente están destinados a abarcar todas las formas gramaticales.

Como se utiliza en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo, “CD137” significa CD137 humano e incluye variantes, isoformas y especies homólogas de CD137 humano. CD137 también se conoce como “4-1BB” o “miembro 9 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral” (TNFRSF9) o “ inducido por activación de linfocitos (ILA, por sus siglas en inglés)”. El CD137 humano significa una proteína de longitud completa definida por UniProt Q07011, un fragmento de la misma, o una variante de la misma.

Como se utiliza en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo, “GPC3” significa GPC3 humano e incluye variantes, isoformas y especies homólogas de GPC3 humano. El GPC3 también se conoce como “glipicano-3”, “proteoglicano glipicano-3”, “GPC3”, “OTTHUMP00000062492”, “GTR2-2”, “SGB”, “DGSX”, “SDYS”, “SGBS”, “OCI-5” y “SGBSl” que se utilizan de manera intercambiable. GPC3 humano significa una proteína de longitud completa definida por UniProt P51654, un fragmento o una variante de la misma. Como se utiliza en el presente documento, “afinidad detectable” significa la capacidad de unirse a una diana seleccionada con una constante de afinidad de generalmente al menos aproximadamente 10'5 M o inferior. Las afinidades inferiores ya no son generalmente medibles con métodos comunes tales como ELISA y, por lo tanto, son de importancia secundaria.

Como se utiliza en el presente documento, la “afinidad de unión” de una proteína de la divulgación (por ejemplo, una muteína de una lipocalina) o un polipéptido de fusión de la misma a una diana seleccionada (en el presente caso, CD137 y/o GPC3), puede medirse (y por lo tanto pueden determinarse los valores de K^d de un complejo muteínaligando) mediante una multitud de métodos conocidos para los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, titulación por fluorescencia, ELISA de competición, métodos calorimétricos, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés), y resonancia de plasmones de superficie (BIAcore). Tales métodos están bien establecidos en la técnica y también se detallan ejemplos de los mismos a continuación.

También se indica que la formación de complejo entre el respectivo agente de unión y su ligando está influenciada por muchos factores diferentes tales como las concentraciones de los respectivos pares de unión, la presencia de competidores, el pH y la fuerza iónica del sistema tampón utilizado, y el método experimental utilizado para la determinación de la constante de disociación K^d (por ejemplo, titulación por fluorescencia, ELISA de competición o resonancia de plasmones de superficie, para nombrar sólo algunos) o incluso el algoritmo matemático que se usa para la evaluación de los datos experimentales.

Por lo tanto, también será evidente para la persona experta que los valores de Kd (constante de disociación del complejo formado entre el respectivo agente de unión y su diana/ligando) pueden variar dentro de un determinado intervalo experimental, dependiendo del método y la configuración experimental que se utiliza para determinar la afinidad de una muteína de lipocalina particular para un ligando dado. Esto significa que puede haber una ligera desviación en los valores medidos de K^d o un intervalo de tolerancia dependiendo, por ejemplo, de si el valor de K^d se determinó mediante resonancia de plasmones de superficie (Biacore), mediante ELISA de competición, o mediante “ELISA directo”.

Como se utiliza en el presente documento, una “muteína”, una entidad “mutada” (ya sea proteína o ácido nucleico), o “mutante” se refiere al intercambio, deleción o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, en comparación con la estructura principal de ácido nucleico o proteína natural (de tipo salvaje) de “referencia”. Dicho término también incluye fragmentos de una muteína y variantes como se describen en el presente documento. Las muteínas de lipocalina de la presente invención, fragmentos o variantes de las mismas preferiblemente retienen la función de unión a CD137 y/o GPC3 como se describe en el presente documento.

El término “fragmento” como se utiliza en el presente documento en relación a las muteínas de la divulgación se refiere a proteínas o péptidos derivados a partir de la lipocalina lagrimal humana madura de longitud completa o lipocalina 2 humana que están acortadas en el extremo N-terminal y/o C-terminal, es decir, que carecen de al menos uno de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales. Tales fragmentos pueden incluir al menos 10, más tal como 20 o 30 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de la lipocalina madura y pueden detectarse normalmente en un inmunoensayo de la lipocalina madura. En general, el término “fragmento”, como se utiliza en el presente documento con respecto al correspondiente ligando proteico de CD137 y/o GPC3 de una muteína de lipocalina de la divulgación o de la combinación según la divulgación o de una proteína de fusión descrita en el presente documento, se refiere a ligandos de proteína o péptido acortados en el extremo N-terminal y/o C-terminal, que retienen la capacidad del ligando de longitud completa de ser reconocidos y/o unidos por una muteína según la divulgación.

El término “mutagénesis” como se utiliza en el presente documento significa que las condiciones experimentales están elegidas de tal modo que el aminoácido natural en una posición de secuencia dada de la lipocalina madura puede sustituirse por al menos un aminoácido que no está presente en esta posición específica en la respectiva secuencia natural del polipéptido. El término “mutagénesis” también incluye la modificación (adicional) de la longitud de segmentos de secuencia mediante deleción o inserción de uno o más aminoácidos. Por lo tanto, está dentro del alcance de la divulgación que, por ejemplo, un aminoácido en una posición de secuencia elegida sea reemplazado por un tramo de tres mutaciones aleatorias, conduciendo a una inserción de dos residuos de aminoácido en comparación con la longitud del respectivo segmento de la proteína de tipo salvaje. Una inserción o deleción de este tipo, puede introducirse independientemente entre sí en cualquiera de los segmentos peptídicos que pueden ser sometidos a mutagénesis en la divulgación. En una realización a modo de ejemplo de la divulgación, una inserción de varias mutaciones puede introducirse dentro del bucle AB de la estructura principal de lipocalina elegida (véase la solicitud de patente internacional WO 2005/019256).

La expresión “mutagénesis aleatoria” significa que no hay un único aminoácido predeterminado (mutación) en una determinada posición de secuencia sino que al menos dos aminoácidos pueden incorporarse con una determinada probabilidad en una posición de secuencia predefinida durante la mutagénesis.

La “ identidad” es una propiedad de secuencias que mide su similitud o relación. La expresión “identidad de secuencia” o “ identidad” como se utiliza en el presente documento descripción significa el porcentaje de residuos idénticos por pares, a continuación del alineamiento (homólogo) de una secuencia de un polipéptido de la divulgación con una secuencia en cuestión, con respecto al número de residuos en la más larga de estas dos secuencias. La identidad de secuencia se mide dividiendo el número de residuos de aminoácido idénticos por el número de residuos totales, y multiplicando el producto por 100.

El término “homología” se usa en el presente documento en su significado habitual e incluye aminoácidos idénticos así como aminoácidos que son considerados como sustituciones conservativas (por ejemplo, intercambio de un residuo de glutamato por un residuo de aspartato) en posiciones equivalentes en la secuencia de aminoácidos lineal de un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, cualquier muteína de lipocalina de la divulgación).

El porcentaje de homología de secuencia o de identidad de secuencia puede determinarse, por ejemplo, en el presente documento utilizando el programa BLASTP, versión blastp 2.2.5 (16 de noviembre de 2002; véase Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). En esta realización el porcentaje de homología está basado en el alineamiento de las secuencias polipeptídicas completas (matriz: BLOSU^m 62; costes de hueco (del inglés, gap costs): 11,1; valor de corte establecido en 10'3) incluyendo las secuencias propeptídicas, preferiblemente utilizando la estructura principal de la proteína de tipo salvaje como referencia en una combinación por pares. Se calcula como el porcentaje de números de “positivos” (aminoácidos homólogos) indicados como resultado en la salida del programa BLASTP dividido por el número total de aminoácidos seleccionados por el programa para el alineamiento.

Específicamente, con el fin de determinar si un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de una lipocalina (muteína) diferente de una lipocalina de tipo salvaje corresponde a una determinada posición en la secuencia de aminoácidos de una lipocalina de tipo salvaje, una persona experta puede utilizar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos, o bien manualmente o bien mediante el uso de programas informáticos tales como BLAST2.0, por sus siglas en inglés: Basic Local Alignment Search Tool, o ClustalW o cualquier otro programa adecuado que sea adecuado para generar alineamientos de secuencia. Por consiguiente, una lipocalina de tipo salvaje puede servir como “secuencia sujeto” o “secuencia de referencia”, mientras que la secuencia de aminoácidos de una lipocalina diferente de la lipocalina de tipo salvaje descrita en el presente documento sirve como “secuencia de incógnita”. Las expresiones “secuencia de referencia” y “secuencia de tipo salvaje” son utilizadas de manera intercambiable en el presente documento. Una lipocalina de tipo salvaje preferida se muestra en la SEQ ID NO: 1 (Tlc) o SEQ ID NO: 2 (NGAl ), respectivamente. Dependiendo de si una muteína de lipocalina de la presente invención está basada en Tlc o NGAL, respectivamente, la lipocalina de tipo salvaje correspondiente puede usarse como secuencia de referencia o secuencia de tipo salvaje.

Los “huecos” son espacios en un alineamiento que son el resultado de adiciones o deleciones de aminoácidos. Por lo tanto, dos copias de exactamente la misma secuencia tienen un 100 % de identidad, pero las secuencias que están menos altamente conservadas, y tienen deleciones, adiciones o reemplazos, pueden tener un grado más bajo de identidad de secuencia. Los expertos en la técnica reconocerán que varios programas informáticos están disponibles para la determinación de identidad de secuencia utilizando parámetros estándar, por ejemplo, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410), y Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197).

El término “variante” como se utiliza en la presente divulgación se refiere a derivados de una proteína o péptido que incluyen modificaciones de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, por sustitución, deleción, inserción o modificación química. Tales modificaciones no reducen en algunas realizaciones la funcionalidad de la proteína o péptido. Tales variantes incluyen proteínas, donde uno o más aminoácidos se han reemplazado por sus respectivos D-estereoisómeros o por aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos naturales, tales como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. No obstante, tales sustituciones también pueden ser conservativas, es decir, un residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido químicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina, y treonina; 2) ácido aspártico y ácido glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina, y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptófano. El término “variante”, como se utiliza en el presente documento con respecto al correspondiente ligando proteico CD137 y/o GPC3 de una muteína de lipocalina de la divulgación o de la combinación según la divulgación o de una proteína de fusión descrita en el presente documento, se refiere a CD137 o fragmento del mismo, respectivamente, que tiene uno o más, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína GPC3 o CD137 de tipo salvaje, respectivamente, tal como una proteína de referencia CD137 o GPC3, como se ha depositado en UniProt como se describe en el presente documento. Una variante de CD137, respectivamente, tiene preferiblemente una identidad de aminoácidos de al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % con un CD137 o GPC3 humano de tipo salvaje, tal como una proteína de referencia CD137 o GPC3 como se ha depositado en UniProt como se describe en el presente documento.

Se entiende que una lipocalina de “secuencia nativa” es una lipocalina que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido derivado de la naturaleza. Por lo tanto, una lipocalina de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de la respectiva lipocalina natural de cualquier organismo, en particular de un mamífero. Tal polipéptido de secuencia nativa puede ser aislado a partir de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. La expresión polipéptido de “secuencia nativa” específicamente abarca formas truncadas o secretadas naturales de la lipocalina, formas variantes naturales tales como formas producto de corte y empalme alternativo y variantes alélicas naturales de la lipocalina. Una “variante” polipeptídica significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 % o al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los cuales uno o más residuos de aminoácido están añadidos o eliminados en el extremo N- o C-terminal del polipéptido. Generalmente una variante tiene al menos aproximadamente un 70 %, incluyendo al menos aproximadamente un 80 %, tal como al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, incluyendo al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos o al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa. A modo de ejemplo ilustrativo, los primeros 4 residuos de aminoácido N-terminales (His-His-Leu-Leu) y los últimos 2 residuos de aminoácido C-terminales (Ser-Asp) pueden estar eliminados en una muteína de lipocalina lagrimal (Tlc) de la divulgación sin afectar la función biológica de la proteína. Además, a modo de otro ejemplo ilustrativo, determinados residuos de aminoácido pueden estar eliminados en una muteína de lipocalina 2 (NGAL) de la divulgación sin afectar la función biológica de la proteína, por ejemplo, (Lys-Asp-Pro, posiciones 46-48).

El término “posición” cuando se utiliza según la divulgación significa la posición de o bien un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos mostrada en el presente documento, o bien la posición de un nucleótido dentro de una secuencia de ácidos nucleicos representada en el presente documento. Para entender el término “corresponde” o “correspondiente” como se utiliza en el presente documento en el contexto de las posiciones de secuencia de aminoácidos de una o más muteínas de lipocalina, una posición correspondiente no está solamente determinada por el número de los nucleótidos/aminoácidos precedentes. Por consiguiente, la posición de un aminoácido dado según la divulgación que puede estar sustituida puede variar debido a la deleción o adición de aminoácidos en otros sitios en una lipocalina (mutante o de tipo salvaje). Similarmente, la posición de un nucleótido dado según la presente descripción que puede estar sustituida puede variar debido a deleciones o nucleótidos adicionales en otros sitios en una muteína o región no traducida 5' (u Tr ) de lipocalina de tipo salvaje incluyendo el promotor y/o cualquiera de otras secuencias o genes reguladores (incluyendo exones e intrones).

Por lo tanto, para una posición correspondiente según la descripción, es preferible que se entienda que las posiciones de nucleótidos/aminoácidos pueden diferir en el número indicado de nucleótidos/aminoácidos vecinos similares, pero dichos nucleótidos/aminoácidos vecinos, que pueden ser intercambiados, eliminados, o añadidos, también están comprendidos por una o más de las posiciones correspondientes.

Además, para una posición correspondiente en una muteína de lipocalina basada en una estructura principal de referencia según la divulgación, es preferible que se entienda que las posiciones de nudeótidos/aminoácidos son estructuralmente correspondientes a las posiciones en otros sitios en una lipocalina (mutante o de tipo salvaje), incluso si pueden diferir en el número indicado, como puede apreciar el experto a la luz del patrón de plegamiento global altamente conservado entre las lipocalinas.

La palabra “detectar”, “detección”, “detectable” o “que detecta” como se utiliza en el presente documento se entiende tanto a un nivel cuantitativo como cualitativo, así como también una combinación de los mismos. Por lo tanto, incluye mediciones cuantitativas, semicuantitativas y cualitativas de una molécula de interés.

Un “sujeto” es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. El término “mamífero” se usa en el presente documento para referirse a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo, sin limitación, seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico o para deportes, o mascotas, tales como oveja, perros, caballos, gatos, vacas, ratas, cerdos, simios tales como macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys), etc., para nombrar sólo algunos pocos ejemplos ilustrativos. Preferiblemente, el mamífero en el presente documento es un ser humano.

Una “cantidad efectiva” es una cantidad suficiente para obtener resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones.

Una “muestra” se define como una muestra biológica tomada a partir de cualquier sujeto. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, heces, semen o tejido.

Una “subunidad” de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento se define como un tramo de aminoácidos del polipéptido, tramo el cual define una única unidad funcional de dicho polipéptido de manera que proporciona un motivo de unión hacia una diana.

Un “polipéptido de fusión” como se describe en el presente documento comprende dos o más subunidades, al menos una de estas subunidades se une a GPC3 y una unidad adicional se une a CD137. Dentro del polipéptido de fusión, estas subunidades pueden estar unidas por un enlace covalente o no covalente. Preferiblemente, el polipéptido de fusión es una fusión de traducción entre las dos o más subunidades. La fusión de traducción puede generarse modificando mediante ingeniería genética la secuencia codificante para una subunidad en el mismo marco de la secuencia codificante de una subunidad adicional. Ambas subunidades pueden tener intercaladas una secuencia de nucleótidos que codifica un conector. Sin embargo, las subunidades de un polipéptido de fusión de la presente divulgación también pueden estar unidas por un conector químico.

Un “conector”, que puede estar compuesto por un polipéptido de fusión de la presente divulgación, une dos o más subunidades de un polipéptido de fusión, tal como se describe en el presente documento. El enlace puede ser covalente o no covalente. Un enlace covalente preferido es a través de una unión peptídica, tal como una unión peptídica entre aminoácidos. Por consiguiente, en una realización preferida dicho conector comprende uno o más aminoácidos, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos. Conectores preferibles se describen en el presente documento. Otros conectores preferibles son conectores químicos.

MI. Descripción de las figuras

La figura 1 proporciona una visión general sobre el diseño de los polipéptidos de fusión que se describen en esta solicitud, los cuales son biespecíficos con respecto a las dianas GPC3 y CD137. Se emplearon tres enfoques diferentes: en la figura 1(A), el primer conjunto de polipéptidos de fusión se basa en un anticuerpo específico para CD137 (por ejemplo, el anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35) y una muteína de lipocalina específica para GPC3 (por ejemplo, la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10). Los polipéptidos generados son fusiones simples de la muteína de lipocalina a uno cualquiera de los cuatro extremos terminales del anticuerpo. Todas las fusiones están conectadas por un conector, tal como un conector (G4S)3 flexible (por ejemplo, el conector de SEQ ID NO: 49); en la figura 1(B) el segundo conjunto de polipéptidos de fusión se basa en dos muteínas de lipocalina (por ejemplo, la muteína de lipocalina específica para GPC3 de SEQ ID NO: 10 y la muteína de lipocalina específica para CD137 de SEQ ID NO: 26), fusionadas con un fragmento Fc de IgG4 modificado por ingeniería (SEQ ID NO: 73); y en la figura 1(C), el tercer conjunto de proteínas de fusión se basa en dos muteínas de lipocalina (por ejemplo, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 26), conectadas por uno o más conectores, tales como conectores (G4S)2 (por ejemplo, los conectores de SEQ ID NO: 48), por medio de los cuales una muteína de lipocalina específica para GPC3 está fusionada con la muteína de lipocalina específica para CD137 (por ejemplo, en la SEQ ID NO: 46) o una muteína de lipocalina específica para GPC3 y dos muteínas de lipocalina específicas para CD137 se fusionan entre sí (por ejemplo, en la SEQ ID NO: 47).

La figura 2 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43, y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10 por la diana GPC3. Se recubrió una placa de microtitulación con GPC3 y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo específico anti-NGAL humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 2. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 1.

La figura 3 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y el anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 por la diana CD137. Se recubrió una placa de microtitulación con una fusión de CD137 humano-Fc y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 3. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 2.

La figura 4 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la capacidad de los polipéptidos de ^{fusión de s}E^{q ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 para unirse a ambas dianas,} G^pC3 ^{y CD137,} simultáneamente. Se recubrió una placa de microtitulación con proteína de fusión de CD137-Fc, seguido por una titulación de la proteína de fusión. Posteriormente, se añadió una concentración constante de GPC3 humano biotinilado, que se detectó a través de extravidina marcada con HRP, como se describe en el ejemplo 4. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 3.

La figura 5 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10 por la diana GPC3 a través de la resonancia de plasmones de superficie (SPR, por sus siglas en inglés). El GPC3 biotinilado se inmovilizó en el chip sensor y se analizó la unión de los polipéptidos de fusión y muteína de lipocalina a ^{diferentes concentraciones, como se describe en el ejemplo 5. Los valores de} K^{d resultantes se proporcionan en la} tabla 4.

La figura 6 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41, y el anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 por la fusión de CD137-Fc biotinilada a través de la resonancia de plasmones de superficie (SPR). La CD137-Fc biotinilada se inmovilizó en un chip sensor y se analizó la unión de las proteínas de fusión en diferentes concentraciones, como se ^{describe en el ejemplo 6. Los valores de} K^{d resultantes se proporcionan en la tabla 5.}

La figura 7 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de los polipéptidos de ^{fusión de muteína de lipocalina-Fc de} S^eQ ^{ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 y la muteína de lipocalina de} S^eQ ⁱD ^{NO: 10} por la diana GPC3. Se recubrió una placa de microtitulación con GPC3 y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo específico anti-NGAL humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 7. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 6.

La figura 8 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de los polipéptidos de ^{fusión de muteína de lipocalina-Fc de} S^eQ ^{ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 y la muteína de lipocalina de} S^eQ ^{iD NO: 26} por CD137. Se recubrió una placa de microtitulación con una fusión CD137 humano-Fc y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 8. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 7.

La figura 9 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la capacidad de los polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 para unirse simultáneamente a las dianas, GPC3 y CD137. Se recubrió una placa de microtitulación con la proteína de fusión de CD137-Fc recombinante, seguido por la titulación de los polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc. Posteriormente, se añadió una concentración constante de GPC3 humano biotinilado, que se detectó mediante extravidina marcada con HRP, como se describe en el ejemplo 9. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 8.

La figura 10 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de los polipéptidos de fusión ^{de muteína de lipocalina-Fc de SEQ ID n}O: ^{44 y SEQ ID NO: 45 y la muteína de lipocalina de} S^eQ ^{ID NO: 10 por la} diana GPC3 a través de resonancia de plasmones de superficie (SPR). El GPC3 biotinilado se inmovilizó en un chip sensor y se analizó la unión de los polipéptidos de fusión y la muteína de lipocalina a diferentes concentraciones. Los ^{valores de} K^{d resultantes se proporcionan en la tabla 9.}

La figura 11 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de los polipéptidos de fusión ^{de muteína de lipocalina-Fc de SEQ ID n}O: ^{44 y SEQ ID NO: 45, y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26 por} CD137-Fc biotinilada a través de resonancia de plasmones de superficie (SPR). La CD137-Fc biotinilada se inmovilizó en un chip sensor y se analizó la unión de los polipéptidos de fusión y la muteína de lipocalina a diferentes ^{concentraciones. Los valores de} K^{d resultantes se proporcionan en la tabla 10.}

La figura 12 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad del polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 53 y 54 y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10 por la diana GPC3. Se recubrió una placa de microtitulación con GPC3 y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo específico anti-NGAL humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 12. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 11.

La figura 13 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la capacidad del polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 53 y 54 para unirse simultáneamente a ambas dianas, GPC3 y CD137. Se recubrió una placa de microtitulación con la proteína de fusión de CD137-Fc recombinante, seguido por la titulación de la proteína de fusión. Posteriormente, se añadió una concentración constante de GPC3 humano biotinilado, que se detectó a través de extravidina marcada con HRP, como se describe en el ejemplo 13. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad.

La figura 14 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de dos polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 8 por la diana GPC3. Se recubrió una placa de microtitulación con GPC3 y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo específico de NGAL humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 14. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 12.

La figura 15 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la especificidad de dos polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26 por la diana CD137. Se recubrió una placa de microtitulación con una fusión CD137 humano-Fc y se titularon las moléculas de ensayo. Se detectaron las moléculas unidas a través de un anticuerpo anti-Fc de IgG humana marcado con HRP, como se describe en el ejemplo 15. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 13.

La figura 16 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la capacidad de dos polipéptidos de ^{fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y s}E^{q ID NO: 47 para unir simultáneamente las dianas, GPC3 y c}D137. ^Se recubrió una placa de microtitulación con proteína de fusión de CD137-Fc recombinante, seguido por la titulación de la proteína de fusión. Posteriormente, se añadió una concentración constante de GPC3 humano biotinilado, que se detectó a través de extravidina marcada con HRP, como se describe en el ejemplo 16. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con el valor de CE50 y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 14.

La figura 17 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de dos polipéptidos de ^{fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y s}E^{q ID NO: 47 y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 8 por la diana} GPC3 a través de resonancia de plasmones de superficie (SPR). El GPC3 biotinilado se inmovilizó en un chip sensor ^{y se analizó la unión de los polipéptidos de fusión a diferentes concentraciones. Los valores de} K^{d resultantes se} proporcionan en la tabla 15.

La figura 18 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la afinidad de dos polipéptidos de ^{fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y} S^eQ ^{ID NO: 47, y la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26 por CD137-Fc} a través de resonancia de plasmones de superficie (SPR). La CD137 humano-Fc se inmovilizó en un chip sensor y se ^{analizó la unión de las proteínas de fusión a diferentes concentraciones. Los valores de} K^{d resultantes se proporcionan} en la tabla 16.

La figura 19 proporciona un experimento representativo en el cual se investigó la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 de coestimular las respuestas de células T cuando se usa a los mismos para recubrir una placa de cultivo de plástico. Se recubrió una placa de plástico con polipéptidos de fusión a diferentes concentraciones junto con un anticuerpo anti-CD3 humano, y posteriormente se incubaron células T purificadas sobre la superficie recubierta en presencia de anticuerpo anti-CD28 humano soluble. Se midieron los niveles de interleucina (IL-2) sobrenadante mediante ensayo de electroquimioluminiscencia (ELC, por sus siglas en inglés), tal como se describe en el ejemplo 19. Como control negativo, se utilizó un control de un isotipo de IgG4 humana.

La figura 20 proporciona un experimento representativo en el cual se determinó la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 para coestimular la activación de células T de una manera dependiente de la diana GPC3. Como control, se empleó el anticuerpo monoespecífico de unión a CD137 de SEQ ID NO: 34 y 35. En el experimento, se recubrió una placa de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano (+) o un control de isotipo (-) y, posteriormente, se cultivaron células HepG2 GPC3 positivas sobre la placa durante la noche. Al día siguiente, se incubaron células T purificadas sobre la superficie recubierta en presencia de 1 |ig/ml de polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, o el anticuerpo de control de SEQ ID NO: 34 y 35. Se midieron los niveles de interleucina (IL-2) sobrenadante mediante ensayo de electroquimioluminiscencia (ELC), tal como se describe en el ejemplo 20.

La figura 21 proporciona un experimento representativo en el cual se investigó la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, para coestimular la activación de células T de una manera dependiente de la diana GPC3. En el experimento, se recubrió una placa de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano y, posteriormente, se cultivaron células Hep3B GPC3 positivas sobre la placa durante la noche. Al día siguiente, se incubaron células T purificadas sobre la superficie recubierta en presencia de varias concentraciones de los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 44 (A) y SEQ ID NO: 45 (C). Se determinaron los niveles de interleucina (IL-2) sobrenadante mediante ELISA. Para bloquear la unión de los polipéptidos de fusión biespecíficos a GPC3, el experimento también se realizó en presencia de un exceso de SEQ ID NO: 10, tanto para SEQ ID NO: 44 (B) como para SEQ ID NO: 45 (D). Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1.

La figura 22 proporciona un experimento representativo en el que se investigó la capacidad de los artículos de ensayo de coestimular la activación de células T con diferentes líneas celulares. Las líneas celulares utilizas fueron HepG2 GPC3 positivas, y SKBR-3 y MCF7 GPC3 negativas. En el experimento, se recubrió una placa de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano y, posteriormente, se cultivó la línea celular en estudio sobre la placa durante la noche. Al día siguiente, se incubaron células T purificadas sobre la superficie recubierta durante tres días en presencia de varias concentraciones de polipéptidos de fusión biespecíficos de la siguiente manera: (A) SEQ ID NO: 44 (círculos), SEQ ID NO: 45 (cuadrados) o el anticuerpo de control trastuzumab (triángulos). (B) Anticuerpo anti-CD137 SEQ ID NO: 74 y 75. Se determinaron los niveles de interleucina 2 sobrenadante por medio de un ensayo basado en electroquimioluminiscencia. La respuesta relativa de IL-2 representada gráficamente corresponde a la proporción de las respuestas obtenidas en presencia y en ausencia (“de base”) de los artículos de ensayo.

La figura 23 proporciona el resultado de una evaluación in vitro de inmunogenicidad de células T de los polipéptidos de fusión biespecíficos, el anticuerpo de control trastuzumab y la hemocianina de lapa californniana de control positivo (KLH, por sus siglas en inglés). El ensayo se realizó utilizando un formato basado en PBMC, como se describe en el ejemplo 23, con 32 donantes y alotipos de antígeno leucocitario humano (HLA, por sus siglas en inglés) que reflejan la distribución en una población global: (A) índice de estimulación (proliferación en presencia frente a en ausencia de artículo de ensayo). Las respuestas promedio se indican como barras. El umbral que define a un donante respondedor (índice de estimulación > 2) se indica como una línea de puntos. (B) Número de respondedores.

La figura 24 proporciona un experimento representativo de la afinidad de los polipéptidos por FcgRI, FcgRIII y FcRn, tal como se describe en los ejemplos 24 y 25.

La figura 25 proporciona el resultado de un análisis farmacocinético de los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 en ratones. Se inyectaron por vía intravenosa ratones CD-1 machos (3 ratones por punto de tiempo) con polipéptidos de fusión a una dosis de 10 mg/kg. Los niveles de fármaco se detectaron utilizando un ELISA de tipo sándwich que detectó el constructo biespecífico completo a través de las dianas GPC3 y CD137. Los datos se ajustaron usando un modelo de dos compartimentos.

La figura 26 proporciona el resultado de un análisis farmacocinético de los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 44 y ^s E^q ID NO: 45 en macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys). Macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys) machos recibieron los artículos de ensayo como una infusión intravenosa durante 60 minutos, con una dosis de 3 mg/kg. Los niveles de fármaco se detectaron utilizando un ELISA de tipo sándwich que detectó el constructo biespecífico completo mediante las dianas GPC3 y CD137. Los datos se ajustaron usando un modelo de dos compartimentos.

IV Descripción detallada de la divulgación

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La misma se refiere a una proteína de fusión caracterizada porque la proteína de fusión es capaz de unirse tanto a CD137 como a glipicano-3 (GPC3), y porque la proteína de fusión comprende al menos dos subunidades en cualquier orden, en donde la subunidad comprende una muteína de lipocalina específica para CD137 que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33 y la segunda subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa, un dominio de unión a antígeno de la misma, o una muteína de lipocalina específica para GPC3.

En algunas realizaciones, una subunidad puede estar conectada a otra subunidad como se describe esencialmente en la figura 1.

Por ejemplo, una muteína de lipocalina puede estar conectada, mediante un enlace peptídico, al extremo C-terminal del dominio de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina, al extremo N-terminal de la VH, el extremo C-terminal de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulina, y/o el extremo N-terminal de la VL tal como se representa en la figura 1A. En algunas realizaciones particulares, una subunidad de muteína de lipocalina puede fusionarse en su extremo N-terminal y/o su extremo C-terminal a una subunidad de inmunoglobulina. Por ejemplo, la muteína de lipocalina puede unirse mediante un enlace peptídico al extremo C-terminal de una región constante de cadena pesada (CH) y/o el extremo C-terminal de una región constante de cadena ligera (CL) de la inmunoglobulina. En aún algunas realizaciones adicionales, el enlace peptídico puede ser un conector, en particular un conector (G4S)3 no estructurado, por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 49.

Como otro ejemplo ilustrativo, una muteína de lipocalina puede unirse, mediante un enlace peptídico, al extremo C-terminal o N-terminal de un fragmento Fc de inmunoglobulina, como se representa en la figura 1B.

Como un ejemplo adicional, una muteína de lipocalina puede unirse, mediante un enlace peptídico, a una o más de otras muteínas de lipocalina, tal como se representa en la figura 1C.

En este sentido, una subunidad puede fusionarse en su extremo N-terminal y/o su extremo C-terminal a otra subunidad. Por ejemplo, cuando una subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa, otra subunidad puede unirse mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal de la segunda subunidad y al extremo C-terminal de una región constante de cadena pesada (CH) de dicha inmunoglobulina. En algunas realizaciones adicionales, la tercera subunidad puede unirse mediante un enlace peptídico al extremo N-terminal del tercer dominio de unión y al extremo C-terminal de una región constante de cadena ligera (CL) de dicha inmunoglobulina. En aún algunas realizaciones adicionales, el enlace peptídico puede ser un conector, particularmente un conector (G4S)3 no estructurado, por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 49, o puede ser un conector (G4S)2 no estructurado, por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 48.

En algunas realizaciones, la tercera subunidad está unida a la primera subunidad a través de un enlace peptídico al extremo N-terminal de la muteína de lipocalina de la tercera subunidad y al extremo C-terminal de una región constante de cadena ligera (CL) de la inmunoglobulina de la primera subunidad.

En algunas realizaciones con respecto a un polipéptido de fusión de la divulgación, una de cuyas subunidades comprende una inmunoglobulina de longitud completa, mientras el polipéptido se acopla simultáneamente a GPC3 y CD137, la función de Fc de la región Fc de la inmunoglobulina de longitud completa para células positivas para receptor Fc puede preservarse al mismo tiempo.

En algunas otras realizaciones con respecto a un polipéptido de fusión de la divulgación, una de cuyas subunidades comprende una inmunoglobulina de longitud completa, mientras el polipéptido se acopla simultáneamente a GPC3 y CD137, la función de Fc de la región Fc de la inmunoglobulina de longitud completa, es decir, unión a células positivas para receptor FcRn o para Fc gamma, puede reducirse o suprimirse totalmente por ingeniería de proteínas. Esto puede lograrse, por ejemplo, empleando una cadena principal que muestra baja interacción con los receptores FcRn o Fcgamma, tales como IgG2 o IgG4. Para reducir la unión residual a receptores Fc-gamma, pueden introducirse mutaciones en la cadena principal de IgG, tal como una mutación F234A y/o una mutación L235A. Además, con respecto a la cadena principal de IgG4, puede introducirse una mutación S228P para minimizar el intercambio del semianticuerpo IgG4. En aún algunas otras realizaciones, puede estar presente una mutación adicional N297A en la cadena pesada de inmunoglobulina del polipéptido de fusión con el fin de eliminar el motivo de glicosilación natural.

En algunas realizaciones, como resultado de la unión simultánea a GPC3 en células tumorales y a CD137 sobre la superficie de células efectoras del sistema inmune, tales como células T o células NK, los polipéptidos de fusión de la divulgación pueden exhibir activación de células efectoras dependiente de GPC3, mediante lo cual la célula efectora del sistema inmune lisa activamente la célula tumoral que expresa GPC3.

En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido de fusión es capaz de demostrar un nivel de activación de CD137 dependiente de GPC3 comparable o superior al de la inmunoglobulina incluida en tal polipéptido de fusión, por ejemplo, cuando se mide en un ensayo que demuestra la expansión ex vivo de linfocitos infiltrantes de tumor dependiente de diana, como se describe esencialmente en el documento de Chacon, J. A. et al., PloS one 2013 8(4):e60031. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido de fusión es capaz de demostrar un nivel de activación de CD137 dependiente de GPC3 comparable o superior al de la inmunoglobulina incluida en tal polipéptido de fusión, por ejemplo, cuando se mide en un modelo de xenotrasplante in vivo de carcinoma hepatocelular humano (“HCC”, por sus siglas en inglés), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de WiIm, y hepatoblastoma, en analogía con lo esencialmente descrito en el documento de Kohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar; 122(3):1066-75).

En algunas realizaciones, la porción Fc de la inmunoglobulina incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación puede contribuir a mantener los niveles en suero del polipéptido de fusión, críticos para su estabilidad y persistencia en el cuerpo. Por ejemplo, cuando la porción Fc se une a receptores Fc en células endoteliales y en fagocitos, el polipéptido de fusión pasa a internalizarse y reciclarse de regreso a la corriente sanguínea, aumentando su semivida dentro del cuerpo.

La subunidad específica para CD137 incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación es una muteína de lipocalina que es específica para CD137, tal como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26. Una subunidad específica para CD137 adicional incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación puede ser una inmunoglobulina de longitud completa o un dominio de unión a antígeno de la misma que es específico para CD137, tal como un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, el anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 o el anticuerpo de SEQ ID NO: 51 y 52).

En algunas realizaciones, la subunidad específica para GPC3 incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación puede ser una muteína de lipocalina que es específica para GPC3, tal como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 8 o la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, la subunidad específica para CD137 incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación puede ser una inmunoglobulina de longitud completa o un dominio de unión a antígeno de la misma que es específica para GPC3.

En algunas realizaciones, en un polipéptido de fusión de la divulgación, una subunidad específica para CD137 se fusiona con una subunidad específica para GPC3.

En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido de fusión de la divulgación tiene dos subunidades específicas para GPC3 y una subunidad específica para CD137. En algunas realizaciones, las dos subunidades específicas para GPC3 son idénticas. En aún algunas realizaciones adicionales, las tres subunidades están fusionadas entre sí, tal como se representa estructuralmente en la figura 1A. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 36 y 37, 38 y 39, 40 y 41, o 42 y 43.

En algunas otras realizaciones específicas, la subunidad específica para GPC3 comprende una muteína de lipocalina y la subunidad específica para CD137 comprende una muteína de lipocalina. En otras realizaciones, las dos subunidades están fusionadas entre sí, tal como se representa estructuralmente en la figura 1C. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

En algunas realizaciones específicas adicionales, el polipéptido de fusión de la descripción tiene dos subunidades específicas para CD137 y una subunidad específica para GPC3. En algunas realizaciones más específica, la subunidad específica para GPC3 comprende una muteína de lipocalina, y cada una de las subunidades específicas para CD137 comprende una muteína de lipocalina. En algunas realizaciones adicionales, las dos subunidades específicas para CD137 son idénticas. En algunas realizaciones adicionales, las tres subunidades están fusionadas entre sí, tal como se representa estructuralmente en la figura 1C. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.

En algunas realizaciones adicionales, en un polipéptido de fusión de la divulgación, la subunidad específica para GPC3 comprende una muteína de lipocalina y la subunidad específica para CD137 comprende una muteína de lipocalina, y las dos subunidades están fusionadas a un fragmento Fc de inmunoglobulina. En realizaciones adicionales, cada una de las dos subunidades está fusionada al fragmento Fc de inmunoglobulina, tal como se representa estructuralmente en la figura 1B. En algunas realizaciones particulares, el fragmento Fc de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG4. En algunas realizaciones adicionales, el fragmento Fc de IgG4 está diseñado mediante ingeniería para tener una mutación S228P y minimizar el intercambio del semianticuerpo IgG4 in vitro e in vivo. En algunas realizaciones, el fragmento Fc de IgG4 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 o de SEQ ID NO: 45.

En algunas realizaciones, la inmunoglobulina incluida en un polipéptido de fusión de la divulgación tiene una cadena principal de IgG2 o IgG4. En algunas realizaciones adicionales, la cadena principal de IgG4 tiene cualquiera de las siguientes mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P, N297A, F234A y L235A. En algunas realizaciones adicionales, la cadena principal de IgG2 tiene cualquiera de las siguientes mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en N297A, F234A y L235A.

En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión puede ser capaz de unirse a CD137 con un valor de CE50 de al menos aproximadamente 5 nMo incluso inferior, tal como aproximadamente 1 nM o inferior, aproximadamente 0,6 nM o inferior, aproximadamente 0,5 nM o inferior, aproximadamente 0,4 nM o inferior, o aproximadamente 0,3 nM o inferior, por ejemplo, cuando el polipéptido se mide en un ensayo ELISA esencialmente como se describe en el ejemplo 3, el ejemplo 8 o el ejemplo 15.

En algunas realizaciones, un polipéptido de fusión de la divulgación puede ser capaz de unirse a CD137 con un valor de CE50 al menos iguales, o superior a, el valor de CE50 de la muteína de lipocalina específica para CD137 como se incluye en tal polipéptido de fusión, tal como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26, o el anticuerpo específico para CD137 como se incluye en tal polipéptido de fusión, tal como el anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 o el anticuerpo de SEQ ID NO: 51 y 52, por ejemplo, cuando dicha muteína de lipocalina o anticuerpo y el polipéptido se miden en un ensayo ELISA esencialmente como se describe en el ejemplo 8 o el ejemplo 15.

En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión puede ser capaz de unirse a CD137 con una afinidad mediante una K^d de al menos aproximadamente 5 nM o incluso inferior, tal como aproximadamente 1 nM o inferior, aproximadamente 0,6 nM o inferior, aproximadamente 0,5 nM o inferior, aproximadamente 0,3 nM o inferior, aproximadamente 200 pM o inferior, aproximadamente 150 pM o inferior, aproximadamente 100 pM o inferior, o aproximadamente 70 pM o inferior, o aproximadamente 2 pM o inferior, por ejemplo, cuando se mide mediante un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) como se describe esencialmente en el ejemplo 6, el ejemplo 11o el ejemplo 18.

En otro aspecto, el polipéptido de fusión puede ser capaz de unirse a GPC3 con un valor de CE50 de al menos aproximadamente 5 nM o incluso inferior, tal como aproximadamente 1 nM o inferior, aproximadamente 0,6 nM o inferior, aproximadamente 0,5 nM o inferior, aproximadamente 0,4 nM o inferior, aproximadamente 0,3 nM o inferior, o aproximadamente 0,2 nM o inferior, por ejemplo, cuando el polipéptido se mide en un ensayo ELISA esencialmente como se describe en el ejemplo 2, el ejemplo 7, el ejemplo 12 o el ejemplo 14.

En algunas realizaciones, un polipéptido de fusión de la divulgación puede ser capaz de unirse a GPC3 con un valor de CE50 comparable al valor de CE50 de la muteína de lipocalina específica para GPC3 como se incluye en tal polipéptido de fusión, tal como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 8 o la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10, por ejemplo, cuando dicha muteína de lipocalina y el polipéptido de fusión se miden en un ensayo ELISA esencialmente como se describe en el ejemplo 7, el ejemplo 12 o el ejemplo 14.

En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión puede ser capaz de unirse a GPC3 con una afinidad mediante una Kd de al menos aproximadamente 5 nM o incluso inferior, tal como aproximadamente 1 nM, aproximadamente 0,3 nM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM o inferior, aproximadamente 20 pM o inferior, o aproximadamente 10 pM o inferior, por ejemplo, cuando se mide mediante un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) como se describe esencialmente en el ejemplo 5, el ejemplo 10 o el ejemplo 17.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación específicos tanto para CD137 como para GPC3 pueden ser capaces de unirse simultáneamente a CD137 y GPC3, por ejemplo, cuando dicho polipéptido de fusión se mide en un ensayo ELISA esencialmente descrito en el ejemplo 4, el ejemplo 9, el ejemplo 13 o el ejemplo 16.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación específicos tanto para CD137 como para GPC3 pueden ser capaces de unirse simultáneamente a CD137 y GPC3 con un valor de CE50 de al menos aproximadamente 10 nM o incluso inferior, tal como aproximadamente 8 nM o inferior, aproximadamente 5 nM o inferior, aproximadamente 2,5 nM o inferior, aproximadamente 2 nM o inferior, o aproximadamente 1,5 nM o inferior, por ejemplo, cuando dicho polipéptido de fusión se mide en un ensayo ELISA esencialmente descrito en el ejemplo 4, el ejemplo 9, el ejemplo 13 o el ejemplo 16.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación específicos tanto para CD137 como para GPC3 pueden ser capaces de coestimular respuestas de células T en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 19. En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación pueden ser capaces de inducir la producción de IL-2 en presencia de estimulación de las células T en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 19, e incluso pueden demostrar una tendencia hacia una inducción más fuerte de IL-2 a concentraciones de recubrimiento más altas. En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación no inducen la producción de IL-2 en ausencia de estimulación anti-CD3 de las células T en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 19. En algunas realizaciones adicionales, los polipéptidos de fusión de la descripción específicos tanto para CD137 como para GPC3 pueden ser capaces de coestimular la activación de células T estimuladas con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 a concentraciones subóptimas en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 19.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación específicos tanto para CD137 como para GPC3 pueden ser capaces de coestimular respuestas de células T en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 20. En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación pueden ser capaces de inducir la producción de IL-2 en un ensayo funcional de activación de células T como se describe esencialmente en el ejemplo 20. En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión de la divulgación pueden ser capaces de coestimular la activación de las células T de manera dependiente de diana GPC3 en un ensayo funcional de activación de células T esencialmente como se describe en el ejemplo 20.

A. Inmunoglobulinas a modo de ejemplo como se incluyen en los polipéptidos de fusión.

En algunas realizaciones, con respecto al polipéptido de fusión, el primer dominio de unión comprende una inmunoglobulina de longitud completa o un dominio de unión a antígeno específico para GPC3. Por ejemplo, la inmunoglobulina puede ser IgG1, IgG2 o IgG4. En realizaciones adicionales, la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal contra GPC3. Un ejemplo ilustrativo de una inmunoglobulina de unión a GPC3 es GC33 (Cancer Sci. Abril de 2014;105(4):455-62.). Ejemplos ilustrativos de anticuerpos de unión a CD137 son BMS-663513 (Jure-Kunkel, M. et al., patente US 7288638) y P^f-05082566 (Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61(10):1721-1733).

B. Muteínas de lipocalina específicas para GPC3 a modo de ejemplo como se incluye en los polipéptidos de fusión.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona una muteína de lipocalina que es capaz de unirse a glipicano-3 humano (GPC3) con una afinidad medida mediante una Kd de aproximadamente 1 nM o inferior. Más preferiblemente, la muteína puede tener una afinidad medida mediante una Kd de aproximadamente 1 nM o 0,2 nM o inferior.

En otra realización, la divulgación se refiere a una muteína de lipocalina, donde dicha muteína comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a la posición 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL (SEQ ID NO: 2), preferiblemente una sustitución como se describe en el presente documento.

En realizaciones particulares, la muteína de la divulgación comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, o incluso más, tal como 21,22, 23, 24, 25 y 26, sustituciones en una posición de secuencia correspondiente a la posición de secuencia 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2).

En realizaciones particulares adicionales, una muteína de lipocalina según la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-17. En otra realización, la muteína tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2). Preferiblemente, dicha muteína comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, o incluso más tal como 21, 22, 23, 24, 25 y 26, residuos de aminoácidos mutados en las posiciones de secuencia 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2).

En algunas realizaciones adicionales, con el fin de facilitar la expresión en células eucariotas, el sitio de N-glicosilación natural Asn en la posición 65 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2) se retira en la correspondiente posición de secuencia de una muteína de lipocalina según la presente divulgación, por ejemplo, mediante la mutación de ASN a ASP en la posición 65. Además, se prefiere que no existan sitios de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr) en una muteína de lipocalina según la presente divulgación.

En algunas otras realizaciones, una muteína de lipocalina según la presente divulgación no comprende una mutación en la posición de secuencia correspondiente a la posición 28 de secuencia de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2), por ejemplo, con el fin de optimizar aún más la estabilidad.

En otra realización, la muteína de la presente divulgación es un antagonista de un GPC3.

Como se utiliza en el presente documento, una muteína de lipocalina de la divulgación “se une específicamente” a una diana (en este caso, GPC3) si es capaz de discriminar entre esa diana y una o más dianas de referencia, ya que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. La “unión específica” puede determinarse, por ejemplo, según ensayos de inmunoelectrotransferencia (de tipo Western Blot), ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC y escaneos de péptidos.

Asimismo, en otro aspecto, la divulgación se refiere a una muteína de hNGAL, donde dicha muteína comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a la posición 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, y/o 134 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2), preferiblemente una sustitución como se describe en el presente documento.

En un aspecto alternativo, la presente divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una muteína de hNGAL, donde la muteína de hNGAL comprende una sustitución en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o incluso más, tal como 21,22, 23, 24, 25 y 26, posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2), preferiblemente una sustitución como se describe en el presente documento.

Asimismo, la divulgación se refiere a un derivado de muteína de lipocalina proveniente de hNGAL que tiene una región estructural supersecundaria de lámina p plegada cilíndrica que comprende ocho hebras p conectadas por pares por cuatro bucles en un extremo para definir, de ese modo, un bolsillo de unión, donde al menos un aminoácido de cada uno de al menos tres de dichos cuatro bucles se han mutado y donde dicha lipocalina es efectiva para unirse a GPC3 como diana no natural dada con afinidad detectable. Ventajosamente, la muteína de lipocalina comprende una sustitución en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 posiciones de aminoácidos correspondientes a los aminoácidos en la posición 36, 40, 41,49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL (SEQ ID NO: 1), preferiblemente una sustitución como se describe en el presente documento. La presente divulgación también se refiere a ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.

Teniendo en cuenta lo anterior, un experto en la técnica está de ese modo en posición de determinar fácilmente qué posición de aminoácido mutado en hNGAL como se describe en el presente documento corresponde a un aminoácido de una estructura principal distinta de hNGAL. Específicamente, un experto en la técnica puede alinear la secuencia de aminoácidos de una muteína como se describe en el presente documento, en particular una muteína de hNGAL de la divulgación con la secuencia de aminoácidos de una muteína diferente para determinar qué aminoácido(s) de dicha muteína corresponde(n) a los respectivos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de dicha lipocalina diferente. Más específicamente, un experto en la técnica puede determinar de ese modo qué aminoácido de la secuencia de aminoácidos de dicha lipocalina diferente corresponde al aminoácido en la(s) posición/posiciones 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL (SEQ ID NO: 2).

Proteínas de la presente divulgación, que están dirigidas contra, o que son específicas para GPC3, incluyen cualquier número de muteínas de proteínas de unión específica que están basadas en una estructura principal de proteína definida. Tal como se utiliza en el presente documento, una “muteína”, una entidad “mutada” (sea proteína o ácido nucleico) o “mutante” se refiere al intercambio, deleción o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con la estructura principal de “referencia” de proteína o ácido nucleico natural (tipo salvaje). Preferiblemente, el número de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, que se intercambia, elimina o inserta es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más, tal como 21,22, 23, 24, 25 y 26. No obstante, se prefiere que una muteína de la presente divulgación sea aún capaz de unirse a GPC3.

En algunas realizaciones preferidas, una muteína según la divulgación se une a GPC3 humano o de ratón con una Kd de aproximadamente 1 nM o menos, incluso 0,5 nM o menos, 0,3 nM o menos, y/o 0,2 nM o menos. Una muteína de la divulgación puede unirse específicamente a uno o más epítopos continuos, discontinuos o conformacionales de la forma bioactiva plegada madura de GPC3.

La afinidad de unión de una proteína de la presente divulgación (por ejemplo, una muteína de una lipocalina) a una diana seleccionada (en el presente caso, GpC3), puede medirse (y, por ende, pueden determinarse los valores de K^d de un complejo muteína-ligando) por múltiples métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, titulación de fluorescencia, ELISA de competición, métodos calorimétricos como calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés), y resonancia de plasmones de superficie (BIAcore). Tales métodos están bien establecidos en la técnica y ejemplos de los mismos también se detallan a continuación.

La secuencia de aminoácidos de una muteína de la divulgación puede tener una alta identidad de secuencia con la lipocalina 2 humana madura. En este contexto, una proteína de la presente divulgación puede tener al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 82 %, al menos un 85 %, al menos un 87 %, al menos un 90 % de identidad, incluyendo al menos un 95 % de identidad con una proteína seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2, una muteína de este tipo de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-17.

La divulgación también incluye homólogos estructurales de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4-17, que tienen una homología de secuencia o identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente más del 60 %, preferiblemente más del 65 %, más del 70 %, más del 75 %, más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 92 % y lo más preferiblemente más del 95 % en relación con las mismas.

En línea con lo anterior, una muteína de la divulgación preferiblemente actúa como un antagonista de GPC3. En algunas realizaciones, una muteína de la divulgación puede actuar como un antagonista de GPC3 inhibiendo la capacidad de la molécula de GPC3 para unirse o interactuar de otro modo con su ligando cognado.

En aún otro aspecto, la presente divulgación incluye muteínas de lipocalina 2 humana que se unen específicamente a GPC3. En este sentido, GPC3 puede considerarse como un ligando no natural de lipocalina 2 humana de tipo salvaje, donde “ligando no natural” se refiere a un compuesto que no se une a lipocalina 2 humana bajo condiciones fisiológicas. Mediante modificación por ingeniería de lipocalinas de tipo salvaje, tal como lipocalina 2 humana con mutaciones en determinadas posiciones, los presentes inventores han demostrado que son posibles alta afinidad y alta especificidad para un ligando no natural. En un aspecto, puede llevarse a cabo una mutagénesis aleatoria al menos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y/o 20 tripletes de nucleótidos que codifican para cualquiera de las posiciones de secuencia 36, 40, 41,49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de una lipocalina 2 humana madura (SEQ ID NO: 2), permitiendo la sustitución en estas posiciones por un subconjunto de tripletes de nucleótidos.

Además, las lipocalinas pueden utilizarse para generar muteínas que tienen un residuo de aminoácido mutado en una cualquiera o más, incluyendo al menos en cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte posiciones de secuencia de las posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones de secuencia 36, 40, 41,49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 y/o 175 de la secuencia de polipéptido lineal de una lipocalina 2 humana madura (SEQ ID NO: 2).

Una sustitución en la posición de secuencia 36 puede ser, por ejemplo, una sustitución Leu 36 ^ Val o Arg. Una sustitución en la posición de secuencia 40 puede ser, por ejemplo, una sustitución Ala 40 ^ Leu, Val o Gly. Una sustitución en la posición de secuencia 41 puede ser, por ejemplo, una sustitución Ile 41 ^ Leu, Arg, Met, Gly o Ala. Una sustitución en la posición de secuencia 49 puede ser, por ejemplo, una sustitución Gln 49 ^ Pro o Leu. Una sustitución en la posición de secuencia 52 puede ser, por ejemplo, una sustitución Tyr 52 ^ Arg o Trp. Una sustitución en la posición de secuencia 68 puede ser, por ejemplo, una sustitución Asn 65 ^ Asp. Una sustitución en la posición de secuencia 68 puede ser,

por ejemplo, una sustitución Ser 68 ^ Val, Gly, Asn o Ala. Una sustitución en la posición de secuencia 70 puede ser,

por ejemplo, una sustitución Leu 70 ^ Arg, Ser, Ala o Val. Una sustitución en la posición de secuencia 72 puede ser, por ejemplo, una sustitución Arg 72 ^ Asp, Trp, Ala o Gly. Una sustitución en la posición de secuencia 73 puede ser, por ejemplo, una sustitución Lys 73 ^ Gly, Arg, Asn, Glu o Ser. Una sustitución en la posición de secuencia 76 puede ser, por ejemplo, una sustitución Cys 76 ^ Val o Ile. Una sustitución en la posición de secuencia 77 puede ser, por ejemplo, una sustitución Asp 77 ^ His, Met, Val, Leu, Thr o Lys. Una sustitución en la posición de secuencia 79 puede ser, por ejemplo, una sustitución Trp 79 ^ Lys, Ser o Thr. Una sustitución en la posición de secuencia 87 puede ser, por ejemplo, una sustitución Arg 81 ^ Gly. Una sustitución en la posición de secuencia 87 puede ser, por ejemplo, una sustitución Cys 87 ^ Ser. Una sustitución en la posición de secuencia 96 puede ser, por ejemplo, una sustitución Asn 96 ^ Arg, Asp, Gln o Pro. Una sustitución en la posición de secuencia 100 puede ser, por ejemplo, una sustitución Tyr 100 ^ Gly, Glu, Pro o Gln. Una sustitución en la posición de secuencia 103 puede ser, por ejemplo, una sustitución Leu 103 ^ Glu, Gln, Asn, Gly, Ser o Tyr. Una sustitución en la posición de secuencia 106 puede ser, por ejemplo, una sustitución Ser 105 ^ Ala. Una sustitución en la posición de secuencia 106 puede ser, por ejemplo, una sustitución Tyr 106 ^ Asn, Ser o Thr. Una sustitución en la posición de secuencia 125 puede ser, por ejemplo, una sustitución Lys 125 ^ Glu. Una sustitución en la posición de secuencia 127 puede ser, por ejemplo, una sustitución Ser 127 ^ Arg o Tyr. Una sustitución en la posición de secuencia 132 puede ser, por ejemplo, una sustitución Tyr 132 ^ Trp o Ile. Una sustitución en la posición de secuencia 134 puede ser, por ejemplo, una sustitución Lys 134 ^ Ala o Phe. Una sustitución en la posición de secuencia 134 puede ser, por ejemplo, una sustitución Thr 136 ^ Ile. Una sustitución en la posición de secuencia 175 puede ser, por ejemplo, una sustitución Cys 175 ^ Ala. Cabe destacar que cualquiera de los aminoácidos que sustituye al aminoácido correspondiente en la secuencia de referencia puede intercambiarse por un aminoácido conservativo correspondiente. En particular, las sustituciones conservativas son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina y treonina; 2) ácido aspártico y ácido glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6), fenilalanina, tirosina y triptófano.

En una realización, una muteína de la presente divulgación, que se une a GPC3 incluye los siguientes reemplazos de aminoácidos:

(a) Leu 36 ^ Val; Ile 41 ^ Leu; Gln 49 ^ Leu; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Val; Leu 70 ^ Ser; Arg 72 ^ Trp; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ His; Trp 79 ^ Lys; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Asp; Tyr 100 ^ Gly; Leu 103 ^ Gln; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Arg; Tyr 132 ^ Trp; Lys 134 ^ Ala;

(b) Leu 36 ^ Val; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Ser; Lys 73 ^ Gly; Asp 77 ^ His; Trp 79 ^ Lys; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Asp; Tyr 100 ^ Gly; Leu 103 ^ Glu; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Arg; Tyr 132 ^ Trp; Lys 134 ^ Phe;

(c) Leu 36 ^ Val; Ala 40 ^ Gly; Ile 41 ^ Met; Gln 49 ^ Leu; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Leu 70 ^ Ala; Lys 73 ^ Asn; Asp 77 ^ His; Trp 79 ^ Lys; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Gly; Leu 103 ^ Glu; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Arg; Tyr 132 ^ Trp; Lys 134 ^ Phe;

(d) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Trp; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ Leu; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Asn; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile;

(e) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Trp; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Gly; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile;

(f) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Gly; Ile 41 ^ Ala; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Trp; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ Val; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Pro; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Asn; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile;

(g) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Ala; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Ala; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ Leu; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Arg; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Tyr; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile;

(h) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Ala; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Val; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Gly; Asp 77 ^ Lys; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Arg; Tyr 100 ^ Pro; Leu 103 ^ Asn; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile;

(i) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Leu; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Trp; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Arg; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Ser; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Asn; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe;

(j) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Trp; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Asn; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Ala; Lys 73 ^ Gly; Cys 76 ^ Val; Asp 77 ^ Lys; Trp 79 ^ Thr; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Asn; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Thr; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Cys 175 ^ Ala;

(k) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Gly; Lys 73 ^ Glu; Cys 76 ^ Ile; Asp 77 ^ Lys; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Gln; Leu 103 ^ Asp; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Thr; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile; Cys 175 ^ Ala; o

(l) Leu 36 ^ Arg; Ala 40 ^ Val; Ile 41 ^ Gly; Gln 49 ^ Pro; Tyr 52 ^ Arg; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Arg; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Ser; Cys 76 ^ Val; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ser; Arg 81 ^ Gly; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Gln; Tyr 100 ^ Glu; Leu 103 ^ Asn; Ser 105 ^ Ala; Tyr 106 ^ Thr; Lys 125 ^ Glu; Ser 127 ^ Tyr; Tyr 132 ^ Ile; Lys 134 ^ Phe; Thr 136 ^ Ile; Cys 175 ^ Ala.

La numeración es preferiblemente en relación con la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2). Por consiguiente, habida cuenta de las enseñanzas de la divulgación, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué aminoácidos en la secuencia de referencia preferida de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2) corresponden a los descritos en los puntos (a) a (l); para mutar dichos aminoácidos en la secuencia de referencia.

C. Muteínas de lipocalina específicas para CD137 a modo de ejemplo como se incluyen en los polipéptidos de fusión.

La presente divulgación proporciona muteínas de lipocalina humana que se unen a CD137 y aplicaciones útiles para las mismas y que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33. La divulgación también proporciona métodos para preparar proteínas de unión a CD137 descritas en el presente documento así como también composiciones que comprenden tales proteínas. Las proteínas de unión a CD137 de la divulgación así como composiciones de las mismas pueden usarse en método de detección de CD137 en una muestra o en métodos de unión de CD137 en un sujeto. Ninguna de tales muteínas de lipocalina humana que tienen estas características asociadas a los usos proporcionados por la presente divulgación se han descrito previamente.

Otra realización de la presente divulgación proporciona una muteína de lipocalina que es capaz de activar aguas abajo las rutas de señalización de CD137 mediante la unión a CD137.

En una realización, la presente divulgación proporciona muteínas de lipocalina lagrimal humana de unión a CD137.

En este aspecto, la divulgación proporciona una o más muteínas de Tlc que son capaces de unirse a CD137 con una afinidad medida mediante una Kd de aproximadamente 300 nM o inferior e incluso aproximadamente 100 nM o inferior.

En algunas realizaciones, tal muteína de Tlc comprende un residuo de aminoácido mutado en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 y 153 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones particulares, tal muteína de Tlc puede contener un residuo de aminoácido mutado en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 y 108 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura.

En realizaciones particulares adicionales, tal muteína de Tlc puede además incluir un residuo de aminoácido mutado en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 101, 111, 114 y 153 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura.

En otras realizaciones particulares, la Tlc puede contener un residuo de aminoácido mutado en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 y 153 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura.

En algunas realizaciones adicionales, la muteína de Tlc puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 o incluso más, residuos de aminoácido mutados en una o más posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones de secuencia 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 y 153 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura y en donde dicho polipéptido se une a CD137, en particular a CD137 humano.

En aún otras realizaciones adicionales, la divulgación se refiere a un polipéptido, en donde dicho polipéptido es una muteína de Tlc, que en comparación con la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura, que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o incluso más, residuos de aminoácido mutados en las posiciones de secuencia 526-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 y 108 y en donde dicho polipéptido se une a CD137, en particular a CD137 humano.

En algunas realizaciones, una muteína de lipocalina según la divulgación puede incluir al menos una sustitución de aminoácido de un residuo de cisteína nativa por, por ejemplo, un residuo de serina. En algunas realizaciones, una muteína de Tlc según la divulgación incluye una sustitución de aminoácido de un residuo de cisteína nativa en las posiciones 61 y/o 153 por otro aminoácido tal como un residuo de serina. En este contexto, debe indicarse que se ha encontrado que la retirada del enlace disulfuro estructural (a nivel de una respectiva biblioteca de ácidos nucleicos originales sin modificar (naive)) de la lipocalina lagrimal de tipo salvaje, que está formado por los residuos de cisteína 61 y 153 (véase Breustedt, et al., 2005, como se mencionó anteriormente) puede proporcionar muteínas de lipocalina lagrimal que no solamente están plegadas de manera estable sino que también son capaces de unirse a un dado ligando no natural con alta afinidad. En algunas realizaciones particulares, la muteína de Tlc según la divulgación incluye las sustituciones de aminoácido Cys 61 ^ Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro o Trp y Cys 153 ^ Ser o Ala. Una sustitución de este tipo ha demostrado ser útil para evitar la formación del puente disulfuro natural que enlaza Cys 61 y Cys 153, y, por lo tanto, para facilitar la manipulación de la muteína. Sin embargo, las muteínas de lipocalina lagrimal que se unen a CD137 y que tienen el puente disulfuro formado entre Cys 61 y Cys 153 también son parte de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la eliminación del puente disulfuro estructural puede proporcionar la ventaja adicional de permitir la generación (espontánea) o la introducción deliberada de enlaces disulfuro artificiales, no naturales, en las muteínas de la divulgación, incrementando de ese modo la estabilidad de las muteínas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, o bien dos o bien todos los tres codones de cisteína en posición 61, 101 y 153 están reemplazados por un codón de otro aminoácido. Además, en algunas realizaciones, una muteína de Tlc según la divulgación incluye una sustitución de aminoácido de un residuo de cisteína nativa en la posición 101 por un residuo de serina o un residuo de histidina.

En algunas realizaciones, una muteína según la divulgación incluye una sustitución de aminoácido de un aminoácido nativo por un residuo de cisteína en las posiciones 28 o 105 con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lagrimal humana madura.

Además, en algunas realizaciones, una muteína según la divulgación incluye una sustitución de aminoácido de un residuo de arginina nativa en la posición 111 por un residuo de prolina. Además, en algunas realizaciones, una muteína según la divulgación incluye una sustitución de aminoácido de un residuo de lisina nativa en la posición 114 por un residuo de triptófano o un ácido glutámico.

En algunas realizaciones, una muteína de Tlc de unión a CD137 según la divulgación incluye, en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 y 153 de la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), uno o más de los siguientes residuos de aminoácido mutados: Ala 5 ^ Val o Thr; Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Thr 42 ^ Ser; Gly 46 ^ Asp; Lys 52 ^ Glu; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Lys 65 ^ Arg o Asn; Thr 71 ^ Ala; Val 85 ^ Asp; Lys 94 ^ Arg o Glu; Cys 101 ^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Lys 121 ^ Glu; Ala 133 ^ Thr; Arg 148 ^ Ser; Ser 150 ^ Ile y Cys 153 ^ Ser. En algunas realizaciones, una muteína de Tlc según la divulgación incluye dos o más, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, incluso más tal como 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o todos los residuos de aminoácido mutados en estas posiciones de secuencia de la lipocalina lagrimal humana madura.

En algunas realizaciones adicionales, la muteína de Tlc de unión a CD137 incluye uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de polipéptido lineal de la lipocalina lagrimal humana madura:

1. Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Cys 101 ^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Cys 153 ^ Ser;

2. Ala 5 ^ Thr; Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Lys 65 ^ Arg; Val 85 ^ Asp; Cys 101 ^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Lys 121 ^ Glu; Ala 133 ^ Thr; Cys 153 ^ Ser; 157 ^ Pro;

3. Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29

Arg; Glu 30^ Pro; Met 31^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Lys 65 ^ Asn; Lys 94^ Arg; Cys 101 ^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Lys 121 ^ Glu; Ala 133

^ Thr; Cys 153 ^ Ser;

4. Ala 5 ^ Val; Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^

Ile; Glu 34 ^ Phe; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Lys 65 ^ Arg; Lys 94 ^ Glu; Cys 101

^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Lys 121 ^ Glu; Ala 133 ^ Thr; Cys 153 ^ Ser; 157 ^ Pro;

5. Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Thr 42 ^ Ser; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Cys 101 ^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu

105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Ser 150 ^ Ile; Cys 153 ^ Ser; 157 ^

Pro;

6. Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30^ Pro; Met 31^ Trp; Leu 33 ^ Ile; Glu 34 ^ Phe; Lys 52 ^ Glu; Leu 56 ^ Ala; Ser 58^ Asp; Arg 60^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Thr 71 ^ Ala; Cys 101 ^ Ser; Glu

104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Ala 133 ^ Thr; Arg 148

^ Ser; Ser 150 ^ Ile; Cys 153 ^ Ser; 157 ^ Pro; o

7. Ala 5 ^ Thr; Arg 26 ^ Glu; Glu 27 ^ Gly; Phe 28 ^ Cys; Pro 29 ^ Arg; Glu 30 ^ Pro; Met 31 ^ Trp; Leu 33 ^

Ile; Glu 34 ^ Phe; Gly 46 ^ Asp; Leu 56 ^ Ala; Ser 58 ^ Asp; Arg 60 ^ Pro; Cys 61 ^ Ala; Thr 71 ^ Ala; Cys 101

^ Ser; Glu 104 ^ Val; Leu 105 ^ Cys; His 106 ^ Asp; Lys 108 ^ Ser; Arg 111 ^ Pro; Lys 114 ^ Trp; Ser 150 ^

Ile; Cys 153 ^ Ser; 157 ^ Pro.

En la región residual, es decir, la región que difiere de las posiciones de secuencia 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 y 153, una muteína de Tlc de la divulgación puede incluir la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje (natural) fuera de las posiciones de secuencia de aminoácidos mutadas.

En aún realizaciones adicionales, una muteína de Tlc según la presente divulgación tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia o al menos un 70 % de homología de secuencia con respecto a la secuencia de la lipocalina lagrimal humana madura (SEQ ID NO: 1).

Una muteína de Tlc según la presente divulgación puede obtenerse por medio de mutagénesis de una forma natural de lipocalina lagrimal humana. En algunas realizaciones de la mutagénesis, una sustitución (o reemplazo) es una sustitución conservativa. No obstante, se contempla cualquier sustitución, incluyendo sustitución no conservativa o una o más de las sustituciones a modo de ejemplo a continuación, siempre que la muteína de lipocalina retenga su capacidad para unirse a CD137, y/o tenga una identidad de secuencia con respecto a la secuencia entonces sustituida que es de al menos un 60 %, tal como al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 % o una identidad de secuencia superior con la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lagrimal humana madura (número de acceso P31025 del ^sW ⁱSS-PROT Data Bank).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a muteínas de hNGAL de unión específica novedosas dirigidas contra o específicas para CD137.

En este aspecto, la divulgación proporciona una o más muteínas de hNGAL que son capaces de unirse a CD137 con una afinidad medida mediante una Kd de 200 nM o inferior, aproximadamente 140 nM o inferior, aproximadamente 50 nM o inferior, e incluso aproximadamente 10 nM o inferior. Más preferiblemente, las muteínas de hNGAL pueden tener una afinidad medida mediante una K^d de aproximadamente 5 nM o inferior.

En algunas realizaciones, una muteína de hNGAL de la divulgación incluye una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134 de la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura (SEQ ID NO: 2).

En realizaciones particulares, una muteína de lipocalina de la divulgación comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o incluso más, sustituciones en una posición de secuencia correspondiente a la posición de secuencia 28, 36, 40-41,49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134 de la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura (número de acceso P80188 del SWISS-PROT Data Bank; SEQ ID NO: 2). Preferiblemente, está contemplado que la divulgación se refiere a una muteína de lipocalina la cual comprende, además de una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 36, 87 y/o 96 de la secuencia de polipéptido lineal de la NGAL humana madura, una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134 de la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura.

En aún algunas realizaciones adicionales, la divulgación se refiere a un polipéptido, en donde dicho polipéptido es una muteína de hNGAL, que en comparación con la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura (número de acceso P80188 del sW iSS-PROT Data Bank; SEQ ID NO: 2), que comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o incluso más, residuos de aminoácido mutados en las posiciones de secuencia 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134, y en donde dicho polipéptido se une a CD137, en particular a CD137 humano.

En algunas realizaciones, una muteína de hNGAL de unión a CD137 de la divulgación incluye, en una o más de cualquiera de las posiciones de secuencia 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134 de la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura (SEQ ID NO: 2), uno o más de los siguientes residuos de aminoácido mutados: Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg o Lys; Gln 49 ^ Val, Ile, His, Ser o Asn; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met, Ala o Gly; Leu 70 ^ Ala, Lys, Ser o Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met, Arg, Thr o Asn; Trp 79 ^ Ala o Asp; Arg 81 ^ Met, Trp o Ser; Phe 83 ^ Leu; Cys 87 ^ Ser; Leu 94 ^ Phe; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu y Lys 134 ^ Tyr.

En algunas realizaciones, una muteína de hNGAL de la divulgación incluye dos o más, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, incluso más tal como 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o todos los residuos de aminoácidos mutados en estas posiciones de secuencia de la hNGAL madura.

En algunas realizaciones adicionales, una muteína de hNGAL de la divulgación, la cual se une a CD137 incluye los siguientes reemplazos de aminoácidos en comparación con la secuencia de polipéptido lineal de la hNGAL madura:

(a) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Lys; Gln 49 ^ Asn; Tyr 52 ^ Met; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ala; Arg 81 ^ Ser; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(b) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ile; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met; Leu 70 ^ Lys; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(c) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Asn; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Ala; Leu 70 ^ Ala; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(d) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Lys; Gln 49 ^ Asn; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Ala; Leu 70 ^ Ala; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(e) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Lys; Gln 49 ^ Ser; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Ser; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ala; Arg 81 ^ Met; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(f) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Lys; Gln 49 ^ Val; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Arg; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Ser; Cys 87 ^ Ser; Leu 94 ^ Phe; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(g) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ His; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ala; Arg 81 ^ Ser; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr;

(h) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Lys; Gln 49 ^ Asn; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Gly; Leu 70 ^ Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Thr; Trp 79 ^ Ala; Arg 81 ^ Ser; Phe 83 ^ Leu; Cys 87 ^ Ser; Leu 94 ^ Phe; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr; o

(i) Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ser; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Ala; Leu 70 ^ Thr; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Asn; Trp 79 ^ Ala; Arg 81 ^ Ser; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; Lys 134 ^ Tyr.

En la región residual, es decir, la región que difiere de las posiciones de secuencia 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 y 134, una muteína de hNGAL de la divulgación puede incluir la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje (natural) fuera de las posiciones de secuencia de aminoácidos mutadas.

En otra realización, la muteína de hNGAL tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 % o incluso superior con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina 2 humana madura (número de acceso P80188 del SWISS-PROT Data Bank).

En realizaciones particulares adicionales, una muteína de lipocalina de unión a CD137 según la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33 o un fragmento o variante de las mismas.

La secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina de unión a CD137 de la divulgación tiene una alta identidad de secuencia de al menos un 85 %, al menos un 87 %, al menos un 90 % de identidad, incluyendo al menos un 95 % de identidad, con respecto a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33.

D. Usos, aplicaciones y producción a modo de ejemplo de los polipéptidos de fusión.

En algunas realizaciones, polipéptidos de fusión de la divulgación pueden producir un efecto sinérgico a través de la selección de diana doble de CD137 y GPC3.

Por lo tanto, existen en medicina numerosas aplicaciones posibles para los polipéptidos de fusión de la divulgación.

En un aspecto, la divulgación se refiere al uso de los polipéptidos de fusión dados a conocer en el presente documento para detectar CD137 y GPC3 en una muestra así como un respectivo método de diagnóstico.

En otro aspecto, la divulgación presenta el uso de uno o más polipéptidos de fusión dados a conocer en el presente documento o de una o más composiciones que comprenden tales polipéptidos para unión de manera simultánea de CD137 y GPC3.

La presente divulgación también implica el uso de uno o más polipéptidos de fusión como se describen para la formación de complejos con CD137 y GPC3.

Por lo tanto, en aún un aspecto adicional de la divulgación, los uno o más polipéptidos de fusión dados a conocer se usan para la detección de CD137 y GPC3. Tal uso puede incluir las etapas de poner en contacto uno o más de dichos polipéptidos de fusión, bajo condiciones adecuadas, con una muestra que se sospecha que contiene CD137 y GPC3, permitiendo de ese modo la formación de un complejo entre los polipéptidos de fusión y CD137 y GPC3, y detectando el complejo mediante una señal adecuada. La señal detectable puede causarse por una marca, como se explicó anteriormente o por un cambio de propiedades físicas debido a la unión, es decir, la formación de complejo en sí misma. Un ejemplo es resonancia de plasmones de superficie, el valor de la cual cambia durante la unión de compañeros de unión de los cuales uno se inmoviliza sobre una superficie tal como una lámina de oro.

Los polipéptidos de fusión dados a conocer en el presente documento pueden también usarse para la separación de CD137 y GPC3. Tal uso puede incluir las etapas de poner en contacto uno o más de dichos polipéptidos de fusión, bajo condiciones adecuadas, con una muestra que se sospecha que contiene CD137 y GPC3, permitiendo de ese modo la formación de un complejo entre los polipéptidos de fusión y CD137 y GPC3, y separando el complejo de la muestra.

En aún otro aspecto, la presente divulgación presenta un kit de diagnóstico o analítico que comprende un polipéptido de fusión según la divulgación.

Además de su uso en diagnóstico, en aún otro aspecto, la divulgación contempla una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión de la divulgación y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Adicionalmente, la presente divulgación proporciona polipéptidos de fusión que simultáneamente se unen a CD137 y GPC3 para uso como agentes anticancerosos e inmunomoduladores. Como tales, los polipéptidos de fusión de la presente divulgación se consideran para usarse en un método de tratamiento o prevención de enfermedades humanas tal como una variedad de tumores, incluyendo carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma. Por consiguiente, también se proporcionan usos para el tratamiento o la prevención de enfermedades humanas tales como una variedad de tumores incluyendo carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polipéptidos de fusión de la divulgación.

Al seleccionar como diana simultáneamente células tumorales donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma, y al activar células citolíticas naturales (NK) en el sistema inmune innato de anfitrión adyacente a tales células tumorales o células T del sistema inmune adaptativo, el polipéptido de fusión de la divulgación puede aumentar la actividad de células de linfocito anti-tumor seleccionadas como diana, aumentar la inmunidad anti-tumor y, al mismo tiempo, tener un efecto de inhibición directo sobre el crecimiento de tumor, produciendo de ese modo resultados anti-tumor sinérgicos. Además, a través de la inhibición de manera local de la actividad oncogénica e inducción de la citotoxicidad mediada por células por parte de células NK y/o células T, el polipéptido de fusión de la divulgación puede reducir efectos secundarios de linfocitos efectores hacia células sanas, es decir, la toxicidad fuera de la diana.

En células T, la señalización mediada por CD137 conduce al reclutamiento de miembros de la familia TRAF y activación de varias quinasas, incluyendo ASK-1, MKK, MAPK3/MAPK4, p38, y JNK/SAPK. La activación de quinasas es luego seguida por la activación y translocación nuclear de varios factores de transcripción, incluyendo ATF-2, Jun y NF-^kB. Además de aumentar la proliferación inducida por TCR subóptima, la señalización mediada por CD137 protege células T, y en particular células T CD8+ de la muerte celular inducida por activación (AICD, por sus siglas en inglés).

La presente divulgación abarca el uso de un polipéptido de fusión de la divulgación o una composición que comprende tal polipéptido para coestimular células T, y/o activar aguas abajo rutas de señalización de CD137 al acoplarse a células tumorales en donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma.

La presente divulgación también presenta un método de coestimulación de células T y/o activación aguas abajo de rutas de señalización de CD137 al acoplarse a células tumorales en donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma, que comprende aplicar uno o más polipéptidos de fusión de la divulgación o una o más composiciones que comprende tales polipéptidos de fusión.

Adicionalmente, la presente divulgación implica un método de activación aguas abajo de rutas de señalización de CD137 al acoplarse a células tumorales en donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma, que comprende aplicar uno o más polipéptidos de fusión de la divulgación o una o más composiciones que comprenden tales polipéptidos de fusión.

La presente divulgación también contempla un método de inducción de la proliferación de linfocitos T al acoplarse a células tumorales en donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma, que comprende aplicar uno o más polipéptidos de fusión de la divulgación o de una o más composiciones que comprenden tales polipéptidos de fusión.

La presente divulgación abarca el uso de un polipéptido de fusión de la divulgación o una composición que comprende tal polipéptido de fusión para dirigir la formación de agrupamientos de CD137 y activación en células T hacia células tumorales en donde GPC3 se expresa, tales como carcinoma hepatocelular (“HCC”), melanoma, carcinoma de células de Merkel, tumor de Wilm y hepatoblastoma.

En otra realización, la presente divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN) que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión dados a conocer en el presente documento. En aún otra realización, la divulgación abarca una célula anfitriona que contiene dicha molécula de ácido nucleico. Ya que la degeneración del código genético permite sustituciones de determinados codones por otros codones que especifican el mismo aminoácido, la divulgación no está limitada a una molécula de ácido nucleico específica que codifica un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento sino que abarca todas las moléculas de ácido nucleico que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido funcional. En este sentido, la presente divulgación también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión de la divulgación.

En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína de lipocalina dada a conocer en esta solicitud, tal como ADN, puede estar “conectada de manera operativa” a otra molécula de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina de la divulgación para permitir la expresión de un polipéptido de fusión dado a conocer en el presente documento. En este sentido, un enlace que puede hacerse operar es un enlace en el cual los elementos de secuencia de una molécula de ácido nucleico y los elementos de secuencia de otra molécula de ácido nucleico están conectados de una manera que permite la expresión del polipéptido de fusión como un único polipéptido.

La divulgación también se refiere a un método para la producción de, o un polipéptido de fusión de la divulgación se produce partiendo del ácido nucleico que codifica para el polipéptido o cualquier subunidad en el mismo mediante métodos de ingeniería genética. El polipéptido puede, por ejemplo, producirse en un organismo anfitrión bacteriano o eucariota y luego aislarse de este organismo anfitrión o su cultivo. También es posible producir un polipéptido de fusión de la divulgación in vitro, por ejemplo, mediante el uso de un sistema de traducción in vitro.

Cuando se produce el polipéptido de fusión, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido se introduce en un organismo anfitrión bacteriano o eucariota adecuado mediante tecnología de ADN recombinante (como ya se indicó anteriormente). Para este propósito, la célula anfitriona primero se transforma con un vector de clonación que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento utilizando métodos estándar establecidos. La célula anfitriona se cultiva luego bajo condiciones que permiten la expresión de ADN heterólogo y de ese modo la síntesis del correspondiente polipéptido. Subsiguientemente, el polipéptido se recupera a partir de la célula o del medio de cultivo.

En una realización de la divulgación, el método incluye someter al menos una molécula de ácido nucleico que codifica hNGAL para mutagénesis en tripletes de nucleótidos que codifican para al menos una, a veces incluso más, de las posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones de secuencia 28, 40-52, 60, 68, 65, 70, 71-81, 87, 89, 96, 98, 100-106, 114, 118, 120, 125-137 y 145 de la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL (SEQ ID NO: 2).

Además, en algunas realizaciones, el enlace disulfuro natural ente Cys 76 y Cys 175 puede eliminarse en las muteínas de hNGAL de la divulgación. Por consiguiente, tales muteínas pueden producirse en un compartimento celular que tiene un medio redox reductor, por ejemplo, en el citoplasma de bacterias Gram negativas.

La divulgación también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican las muteínas de lipocalina de la divulgación, las cuales incluyen mutaciones adicionales fuera de las posiciones de secuencia indicadas de mutagénesis experimental. Tales mutaciones son a menudo toleradas o pueden incluso probar ser ventajosas, por ejemplo, si contribuyen a una mejorada eficiencia de plegado, estabilidad en suero, estabilidad térmica o afinidad de unión a ligando de las muteínas de lipocalina.

Una molécula de ácido nucleico dada a conocer en esta solicitud puede estar “conectada de manera operativa” a una secuencia reguladora (o secuencias reguladoras) para permitir la expresión de esta molécula de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, se denomina “capaz de expresar una molécula de ácido nucleico” o capaz “de permitir la expresión de una secuencia de nucleótidos” si incluye elementos de secuencia los cuales contienen información con respecto a regulación transcripcional y/o de traducción, y tales secuencias están “conectadas de manera operativa” a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un enlace que puede hacerse operar es un enlace en el cual los elementos de secuencia reguladores y la secuencia que va a expresarse están conectadas de una manera que permite la expresión génica. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies, pero en general estas regiones incluyen un promotor el cual, en procariotas, contiene el promotor per se, es decir, elementos de ADN que dirigen el inicio de la transcripción, así como elementos de ADN que, cuando se transcriben en ARN, señalarán el inicio de la traducción. Tales regiones promotoras normalmente incluyen regiones no codificantes de extremo 5' involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, tales como las cajas -35/-10 y el elemento Shine-Dalgarno en procariotas o la caja TATA, secuencias CAAT, y elementos de terminación de extremo 5' en eucariotas. Estas regiones pueden también incluir elementos potenciadores o represores así como secuencias líder y señal traducidas para hacer que el polipéptido nativo seleccione como diana a un compartimento específico de una célula anfitriona.

Además, las secuencias no codificantes de extremo 3' pueden contener elementos reguladores involucrados en la terminación transcripcional, poliadenilación o similares. Si, sin embargo, estas secuencias de terminación no son satisfactoriamente funcionales en una célula anfitriona particular, entonces pueden sustituirse con señales funcionales en esa célula.

Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico de la divulgación puede incluir una secuencia reguladora, tal como una secuencia promotora. En algunas realizaciones una molécula de ácido nucleico de la divulgación incluye una secuencia promotora y una secuencia de terminación transcripcional. Promotores procariotas adecuados son, por ejemplo, el promotor tet, el promotor /acUV5 o el promotor T7. Ejemplos de promotores útiles para expresión en células eucariotas son el promotor SV40 o el promotor CMV.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden también ser parte de un vector o cualquier otra clase de vehículo de clonación, tal como un plásmido, un fagómido, un fago, un baculovirus, un cósmido o un cromosoma artificial.

En una realización, la molécula de ácido nucleico está incluida en un fásmido. Un vector de fásmido indica un vector que codifica la región intergénica de un fago moderado, tal como M13 o f1, o una parte funcional del mismo fusionada con el ADNc de interés. Después de superinfección de las células anfitrionas bacterianas con un vector de fagómido de este tipo y un apropiado fago auxiliar (por ejemplo, M13K07, VCS-M13 o R408) se producen partículas de fago intactas, permitiendo de ese modo el acoplamiento físico del ADNc heterólogo codificado a su correspondiente polipéptido exhibido en la superficie de fago (véase por ejemplo, Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomo/. Struct. 26, 401-424, o Rodi, D.J., y Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechno/. 10, 87-93).

Tales vehículos de clonación pueden incluir, además de las secuencias reguladoras descritas anteriormente y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento, secuencias de replicación y control derivadas de una especie compatible con la célula anfitriona que se utiliza para expresión así como marcadores de selección que confieren un fenotipo seleccionable en células transformadas o transfectadas. Se conoce un gran número de vectores de clonación adecuados en la técnica, y están comercialmente disponibles.

La molécula de ADN que codifica un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 20 y 31), y en particular un vector de clonación que contiene la secuencia codificante de un polipéptido de este tipo, puede transformarse para dar una célula anfitriona capaz de expresar el gen. La transformación puede llevarse a cabo utilizando técnicas estándar. Por lo tanto, la divulgación está también dirigida a una célula anfitriona que contiene una molécula de ácido nucleico como se da a conocer en el presente documento.

Las células anfitrionas transformadas se cultivan bajo condiciones adecuadas para expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de la divulgación. Células anfitrionas adecuadas pueden ser procariotas, tal como Escherichia coli (E. coli) o Bacillus subtilis, o eucariotas, tal como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células de insectos SF9 o High5, líneas celulares de mamífero inmortalizadas (por ejemplo, células HeLa o células CHO) o células de mamífero primarias.

En algunas realizaciones en donde una muteína de lipocalina de la divulgación, incluyendo tal como se comprende en un polipéptido de fusión dado a conocer en el presente documento, incluye enlaces disulfuro intramoleculares, puede preferirse dirigir el polipéptido naciente a un compartimento celular que tiene un medio redox oxidante utilizando una secuencia señal apropiada. Un entorno oxidante de este tipo puede proporcionarse por el periplasma de bacterias Gram negativas tal como E. coli, en el medio extracelular de bacterias Gram positivas o en la luz del retículo endoplásmico de células eucariotas y habitualmente favorece la formación de enlaces disulfuro estructurales.

En algunas realizaciones, también es posible producir un polipéptido de fusión de la divulgación en el citosol de una célula anfitriona, preferiblemente E. coli. En este caso, el polipéptido puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperado en forma de cuerpos de inclusión, seguido por renaturalización in vitro. Una opción adicional es el uso de cepas anfitrionas específicas que tienen un medio intracelular oxidante, las cuales pueden permitir de ese modo la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8.).

En algunas realizaciones, un polipéptido de fusión de la divulgación como se describe en el presente documento puede no necesariamente generarse o producirse solamente mediante el uso de ingeniería genética. En cambio, tal polipéptido puede también obtenerse mediante síntesis química tal como síntesis de polipéptidos en fase sólida de Merrifield o mediante transcripción y traducción in vitro. Por ejemplo, es posible que se identifiquen mutaciones prometedoras utilizando modelado molecular y luego se sintetice la muteína o polipéptido (diseñado) deseado in vitro y se investigue la actividad de unión para una diana de interés. Métodos para la síntesis en fase sólida y/o en fase de disolución de proteínas son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43).

En otra realización, un polipéptido de fusión de la divulgación puede producirse mediante transcripción/traducción in vitro empleando métodos bien establecidos conocidos para los expertos en la técnica.

El trabajador experto apreciará métodos útiles para preparar polipéptidos de fusión contemplados por la presente divulgación pero cuyas secuencias de ácidos nucleicos o proteínas no están explícitamente dadas a conocer en el presente documento. Como una visión general, tales modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen, por ejemplo, mutagénesis directa de posiciones de aminoácidos simples con el fin de simplificar la subclonación de un gen del polipéptido o sus partes mediante la incorporación de sitios de escisión para determinadas enzimas de restricción. Además, estas mutaciones pueden también incorporarse para mejorar adicionalmente la afinidad de un polipéptido de fusión para sus dianas (por ejemplo, CD137 y GPC3). Adicionalmente, pueden introducirse mutaciones para modular determinadas características de los polipéptidos tal como mejorar la estabilidad de plegado, estabilidad en suero, resistencia proteica o solubilidad en agua o reducir la tendencia a la agregación, si es necesario. Por ejemplo, residuos de cisteína naturales pueden mutarse a otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro.

Objetos, ventajas y características adicionales de esta divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos y las figuras adjuntas de la misma, los cuales no están destinados a ser limitantes. Por lo tanto, debe entenderse que, aunque la presente divulgación está específicamente dada a conocer por realizaciones y características opcionales a modo de ejemplo, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de las divulgaciones incluidas en el presente documento y que tales modificaciones y variaciones están consideradas dentro del alcance de esta invención.

V. Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión y análisis de polipéptidos de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina

Se utilizaron tres estrategias para generar constructos biespecíficos que pueden unirse a las dianas, GPC3 y CD137, al mismo tiempo.

En la primera estrategia, se generaron polipéptidos de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina basándose en el anticuerpo específico para CD137, por ejemplo, que tiene las cadenas pesada y ligera proporcionadas por SEQ ID NO: 34 y 35, y la muteína de lipocalina GPC3, por ejemplo, de SEQ ID NO: 10. Un conector no estructurado, insensible a proteasas (G4S)3 (SEQ ID NO: 49) se utilizó para fusionar las proteínas entre sí en todos los casos. Los diferentes formatos que se diseñaron se muestran en la figura 1A. Las variantes generadas son fusiones de la muteína de lipocalina a cualquiera de los cuatro extremos terminales del anticuerpo, que contiene una cadena principal de IgG4 mutada para minimizar el intercambio del semianticuerpo (mutación S228P, véase la SEQ ID NO: 34); SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41, SEQ ID NO: 42 y 43. La fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina anterior basada en un anticuerpo específico para CD137 no se abarca por las reivindicaciones adjuntas.

En la segunda estrategia, se generaron fusiones de dos muteínas de lipocalina (SEQ ID NO: 10 de unión a GPC3 y SEQ ID NO: 26 de unión a CD137) a un fragmento Fc de IgG4 modificado por ingeniería (SEQ ID NO: 73) que contiene una mutación S228P para minimizar el intercambio de semianticuerpo IgG4 in vitro e in vivo (véase Silva 2015), así como las mutaciones F234A y L235A para reducir las interacciones de receptor Fc-gamma (Alegre 1992). Los polipéptidos de fusión resultantes (SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45) se representan estructuralmente en la figura 1B.

Los constructos de la primera y segunda estrategia se generaron por síntesis de genes y se clonaron para dar un vector de expresión de mamíferos. Luego se expresaron transitoriamente en células CHO. La concentración de polipéptidos de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina y polipéptidos de fusión de Fc de IgG4-muteína de lipocalina en el medio de cultivo celular se midió usando un sensor de ForteBio ProteinA (Pall Corp.) y se cuantificó usando una IgG1 humana estándar (datos no mostrados).

En la tercera estrategia, se generaron fusiones de dos muteínas de lipocalina (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 26), unidas por uno o más conectores (G4S)2 (SEQ ID NO: 48), y usando dos diseños diferentes, como se representa en la figura 1C. En el primer diseño, la SEQ ID NO: 26 se fusionó en el extremo C-terminal a SEQ ID NO: 10, dando como resultado el polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 46; en el segundo diseño, dos copias de SEQ ID NO: 26 se fusionaron en el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 10, dando como resultado el polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 47. Los constructos contenían un marcador Strep-tag (SEQ ID NO: 50) para la purificación por cromatografía de afinidad. Los constructos se clonaron utilizando métodos estándar y se expresaron en E. coli utilizando secreción periplásmica.

Los polipéptidos de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina y los polipéptidos de fusión de fragmento Fc de IgG4-muteína de lipocalina se purificaron usando cromatografía de proteína A, seguida por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) en histidina 10 mM a pH 5,5, NaCl 150 mM o PBS a pH 7,4. Después de la purificación por SEC, las fracciones que contenían proteína monomérica se agruparon y analizaron de nuevo utilizando SEC analítica. Según este análisis, los polipéptidos de fusión resultaron totalmente monoméricos sin agregados o especies multiméricas detectables (datos no mostrados).

Ejemplo 2: Especificidad de polipéptidos de fusión hacia GPC3

Se empleó un ensayo ELISA para determinar la especificidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ⁱD NO: 38 y 39, SEQ ID N^o : 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 para G^p C3 recombinante humano (R&D Systems N° 2119-GP-050/CF). La diana se disolvió en PBS (1 |ig/ml) y se recubrió una placa de microtitulación durante la noche a 4°C. La placa se lavó después de cada etapa de incubación con 100 |il de PBS suplementado con 0,1 % (v/v) de Tween 20 (PBS-T) cinco veces. Las placas se bloquearon con 2 % de BSA (p/v) en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se lavaron. Diferentes concentraciones de la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 10), o los polipéptidos de fusión se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Se detectaron la proteína de fusión o muteína de lipocalina unidas tras la incubación con anticuerpo anti-NGAL humana diluido 1:1000 conjugado con HRP en PBS-T suplementado con 2 % (p/v) de BSA (PBS-TB). Después de una etapa de lavado adicional, se agregó sustrato HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

El resultado del experimento se muestra en la figura 2, junto con las curvas de ajuste que son el resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 1, incluyendo los errores del ajuste sigmoidal de los datos, que es el caso para todos los datos que se resumen en las tablas del presente documento. Los valores de CE50 observados se encuentran en un intervalo similar para todos los polipéptidos de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina (0,25 - 0,28 nM), todos ligeramente mejores que la muteína de lipocalina (SEQ ID NO: 10), que fue de 0,55 nM. El experimento demuestra que al incluirse en polipéptidos de fusión descritos anteriormente, la muteína de lipocalina puede fusionarse con uno cualquiera de los cuatro extremos terminales del anticuerpo sin pérdida de actividad hacia GPC3.

Tabla 1 - Datos de ELISA para unión a GPC3

Nombre CE50 GPC3 [nM]

Ejemplo 3: Especificidad de polipéptidos de fusión hacia CD137 humano

Se empleó un ensayo ELISA para determinar la especificidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ iD NO: 38 y 39, SEQ ID No : 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 para la proteína de fusión de CD137-Fc recombinante (n.° 838-4B-100, R&D Systems). El anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 se utilizó como control positivo. La diana se disolvió en PBS (1 |ig/ml) y se recubrió una placa de microtitulación durante la noche a 4°C. La placa se lavó después de cada etapa de incubación con 100 |il de PBS-T cinco veces. Las placas se bloquearon con 2 % de BSA (p/v) en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se lavaron. Se añadieron a los pocillos diferentes concentraciones del anticuerpo específico para CD137 o los polipéptidos de fusión y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Se detectó la proteína de fusión unida después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo Fab anti-IgG humana de ratón con una dilución de 1:5000 conjugado con HRP (Jackson Laboratories) en PBS-TB. Después de una etapa de lavado adicional, se agregó sustrato HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

El resultado del experimento se representa en la figura 3, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 2. Los valores de CE50 observados para todas las moléculas sometidas a ensayo eran muy similares y se encontraban en el intervalo de 1,5 nM a 2,3 nM. El experimento demuestra que cuando se incluye en los polipéptidos de fusión descritos, el anticuerpo puede fusionarse con la muteína de lipocalina en uno cualquiera de los cuatro extremos terminales del anticuerpo sin una pérdida de actividad hacia CD137.

Tabla 2 - Datos de ensayo ELISA para unión a CD137

Ejemplo 4: Demostración de unión simultánea a diana de polipéptidos de fusión en un entorno basado en ELISA

Con el fin de demostrar la unión simultánea de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 tanto a GPC3 como a CD137, se utilizó un formato ELISA de unión doble. Se recubrieron placas de microtitulación con proteína de fusión de CD137 humano-Fc recombinante (R&D Systems) en PBS (1 |ig/ml) durante la noche a 4°C. La placa se lavó cinco veces después de cada etapa de incubación con 100 |il de PBS-T. Las placas se bloquearon con 2 % de BSA (p/v) en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se lavaron de nuevo. Se añadieron diferentes concentraciones de los polipéptidos de fusión a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Posteriormente, se agregó GPC3 humano biotinilado a una concentración constante de 1 |ig/ml de PBS-TB durante 1 hora. Después del lavado, se agregó extravidina-HRP (Sigma-Aldrich, 1:5000 en PBS-TB) a los pocillos durante 1 hora. Después de una etapa de lavado adicional, se agregó el sustrato HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo, y la intensidad de fluorescencia se detectó utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

El resultado del experimento se representa en la figura 4, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 3. Todos los polipéptidos de fusión mostraron claras señales de unión con valores de CE50 que oscilaban entre 1,7 - 2,1 nM, lo cual demuestra que los polipéptidos de fusión son capaces de acoplarse a GPC3 y CD137 simultáneamente.

Tabla 3 - Datos del ensayo ELISA para unión simultánea a diana

SEQ ID NO: 36 y 37_________________| 1,74 ± 0,25

Ejemplo 5: Afinidad de anticuerpo y polipéptidos de fusión con respecto a GPC3 humano

Las afinidades de unión de la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10 y los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41, así como las SEQ ID NO: 42 y 43 para GPC3 recombinante humano (R&D Systems n.° 2119-GP-050/CF) se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (SPR) utilizando un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). En el ensayo de afinidad por SPR, se capturó GPC3 biotinilado en un chip ^{sensor (“chip CAP”) utilizando el kit Biotin CAPture} (G^{e Healthcare); el chip sensor CAP se inmovilizó previamente} con oligonucleótidos de ADN monocatenario (ss-DNA)). Se aplicó reactivo Biotin CAPture sin diluir (estreptavidina conjugada con oligonucleótido de ADN monocatenario complementario (ss-DNA)) a un caudal de 2 |il/minuto durante 300 segundos. Para el análisis de la muteína de lipocalina, se utilizó GPC3 biotinilado a una concentración de 1 |ig/ml y 0,25 |ig/ml de GPC3 biotinilado para las proteínas de fusión. El GPC3 biotinilado se aplicó durante 300 segundos con un caudal de 5 |il/minuto. El GPC3 se biotiniló mediante incubación con NHS-PEG4-Biotin EZ-Link® (5 veces el exceso molar (Thermo Scientific)) durante dos horas a temperatura ambiente. El exceso de reactivo de biotina no reaccionado se retiró cargando la mezcla de reacción en una placa de centrífuga y desalado ZebaTM (ZebaTM Spin Desalting Plate) (Thermo Scientific). El canal de referencia se cargó solo con reactivo Biotin CAPture.

Para determinar la afinidad, se inmovilizó GCP3 sobre la superficie del chip y se prepararon cuatro concentraciones (11,1, 3,7, 1,2 y 0,4 nM) de cada agente de ensayo (polipéptidos de fusión o muteína de lipocalina) en tampón de migración (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, EDTA 3 mM, pH 7,4 (GE Healthcare)) y se aplicaron a la superficie del chip. Aplicando un caudal de 30 |il/min, el tiempo de contacto de muestra fue de 180 segundos y el tiempo de disociación fue de 1200 segundos. Todas las mediciones se realizaron a 25°C. La regeneración de la superficie del chip sensor CAP se logró con una inyección de guanidina-HCl 6 M con NaOH 0,25 M seguida de un lavado adicional con tampón de migración y un período de estabilización de 120 segundos. Antes de las mediciones de proteínas, se realizaron tres ciclos de regeneración para propósitos de acondicionamiento. Los datos se evaluaron con el software de evaluación Biacore T200 (V 2.0). Se usó doble referencia y se utilizó el modelo de unión 1:1 para ajustar los datos en bruto.

Los datos se representan en la figura 5, y los resultados ajustados se resumen en la tabla 4. A partir de los datos se puede llegar a la conclusión de que los polipéptidos de fusión se unen a GPC3 con afinidades que son muy similares a la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10. Las afinidades de unión aparentes estuvieron en el intervalo de 17 - 30 pM para los polipéptidos de fusión y la afinidad de unión aparente fue de 12 pM para la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 10.

Tabla 4: Afinidades de unión para GPC3

Ejemplo 6: Afinidad de anticuerpo y polipéptidos de fusión para CD137 humano

Las afinidades de unión del anticuerpo de SEQ ID NO: 34 y 35 y los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 para la proteína de fusión de CD137 humano-Fc recombinante (n.° 838-4B-100, R&D Systems) se determinaron por resonancia de plasmones de superficie (SPR) en analogía al ejemplo 5. En resumen, CD137-Fc biotinilada se capturó en un chip sensor CAP y se prepararon cuatro diluciones (20, 5, 1,3 y 0,3 nM) de cada agente sometido a ensayo (proteína de fusión o SEQ ID NO: 34 y 35) en el tampón de migración y se aplicaron a la superficie del chip. Aplicando un caudal de 30 |il/min, el tiempo de contacto de muestra fue de 180 segundos y el tiempo de disociación fue de 600 segundos. Todas las mediciones se realizaron y analizaron de la manera que se describe en el ejemplo 5.

Los resultados se resumen en la tabla 5. Los datos muestran que los polipéptidos de fusión se unen a CD137 con afinidades que son muy similares a las del anticuerpo. Las afinidades de unión aparentes estuvieron en el intervalo de 71-179 pM para las proteínas de fusión y la afinidad de unión aparente fue de 92 pM para el anticuerpo 20H4.9 (SEQ ID NO: 34 y 35).

Tabla 5: Afinidades de unión para CD137

Ejemplo 7: Especificidad de polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc hacia GPC3

Se empleó un ensayo ELISA como se describe en el ejemplo 2 para determinar la especificidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, para GPC3 recombinante humano.

El resultado del experimento se representa en la figura 7, junto con las curvas de ajuste que son el resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 6. Los valores de CE50 observados para los polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc fueron ambos mejores que los de la muteína de lipocalina de unión a GPC3 (SEQ ID NO: 10).

Tabla 6 - Datos de ensayo ELISA para la unión a GPC3

Ejemplo 8: Especificidad de lo polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc hacia CD137 humano

Se empleó un ensayo ELISA para determinar la especificidad de los polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 para el polipéptido de fusión de CD137-Fc recombinante como se describe en el ejemplo 3.

El resultado del experimento se representa en la figura 8, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 7. Los valores de CE50 observados para los polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc fueron ambos mejores que el valor de CE50 observado para la muteína de lipocalina de unión a CD137 (SEQ ID NO: 26).

Tabla 7 - Datos de ELISA para unión a CD137

Ejemplo 9: Demostración de unión simultánea a diana de polipéptidos de fusión de muteína de lipocalina-Fc en un entorno basado en ELISA

Con el fin de demostrar la unión simultánea de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 a GPC3 y CD137, se utilizó un formato de ELISA de unión doble en analogía al ejemplo 4.

El resultado del experimento se representa en la figura 9, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 8. Ambos polipéptidos de fusión mostraron claras señales de unión con valores de CE50 cercanos a 1,7 nM, lo cual demuestra que los polipéptidos de fusión son capaces de acoplarse a GPC3 y CD137 simultáneamente.

Tabla 8 - Datos de ELISA para unión simultánea a diana

Ejemplo 10: Afinidad de anticuerpo y polipéptidos de fusión a GPC3 humano

Las afinidades de unión de la muteína de lipocalina de unión a GPC3 de SEQ ID NO: 10 y los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 a GPC3 humano recombinante se determinaron por resonancia de plasmones de superficie como se describe en el ejemplo 5.

Los datos se representan en la figura 10, y los valores Kd ajustados se resumen en la tabla 9. Los datos muestran que los polipéptidos de fusión se unen a GPC3 con afinidades que son muy similares a las de la muteína de lipocalina. Las afinidades de unión aparentes son 23 pM y 29 pM para los polipéptidos de fusión, respectivamente, comparados con la afinidad de unión aparente de 33 pM para la muteína de lipocalina.

Tabla 9: Afinidades de unión para GPC3

Ejemplo 11: Afinidad de anticuerpo y polipéptidos de fusión para CD137 humano

Las afinidades de unión de la muteína de lipocalina de unión a CD137 de SEQ ID NO: 26 y los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 a proteína de fusión de CD137 humano-Fc recombinante se determinaron en analogía al ejemplo 6.

Los datos se representan en la figura 11 para los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, y los valores de Kd ajustados para todas las moléculas sometidas a ensayo se proporcionan en la tabla 10. Los datos muestran que los polipéptidos de fusión se unen a CD137 con afinidades de 1 nM o 1,1 nM, respectivamente, superior al valor de K^d de la muteína de lipocalina, que tiene un valor de 2,3 nM.

Tabla 10: Afinidades de unión para CD137

Ejemplo 12: Especificidad de polipéptido de fusión hacia GPC3

Se generó un polipéptido de fusión adicional en base al anticuerpo de unión a CD137 de SEQ ID NO: 51 y 52, y la muteína de lipocalina de unión a GPC3 de SEQ ID NO: 10. La muteína de lipocalina se fusionó por el extremo C-terminal a la cadena pesada utilizando un conector (G4S)3 al resultante polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 53 y 54. Se empleó un ensayo ELISA como se describe en el ejemplo 2 para determinar la especificidad del polipéptido de ^{fusión de SEQ ID n}O: ^{53 y 54 a GPC3 recombinante humano.}

El resultado del experimento se representa en la figura 12, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 11. La CE50 para GPC3 es comparable para el polipéptido de fusión y para la muteína de lipocalina. Los datos muestran que cuando se incluye en el polipéptido de fusión, la muteína de lipocalina puede fusionarse con el anticuerpo sin una pérdida de actividad hacia GPC3. Tabla 11 - Datos de ELISA para unión a GPC3

Ejemplo 13: Demostración de unión simultánea a diana de polipéptido de fusión en un entorno basado en ELISA

Con el fin de demostrar la unión simultánea de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 53 y 54 tanto a GPC3 como a CD137, se utilizó el formato ELISA de unión doble en analogía al ejemplo 4.

El resultado del experimento se representa en la figura 13, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. El polipéptido de fusión mostró claras señales de unión con un valor de CE50 de 4,66 ± 0,65 nM, lo cual demuestra que el polipéptido es capaz de acoplarse a GPC3 y CD137 simultáneamente.

Ejemplo 14: Especificidad de polipéptidos de fusión hacia GPC3

Se empleó un ensayo ELISA como se describe en el ejemplo 2 para determinar la especificidad de los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, así como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 8 para GPC3 recombinante humano.

El resultado del experimento se representa en la figura 14, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 12. Los valores de CE50 para los polipéptidos de fusión son al menos iguales o incluso superiores al valor de CE50 de la muteína de lipocalina. Los datos demuestran que, cuando se incluye en los dos polipéptidos de fusión, la muteína de lipocalina puede fusionarse con el anticuerpo sin una pérdida de actividad hacia GPC3.

Tabla 12 - Datos de ensayo ELISA para unión a GPC3

Ejemplo 15: Especificidad de polipéptidos de fusión para CD137 humano

Se empleó un ensayo ELISA para determinar la especificidad de los polipéptidos biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, así como la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 26 para la proteína de fusión de CD137-Fc recombinante como se describe en el ejemplo 3.

El resultado del experimento se representa gráficamente en la figura 15, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Los valores de CE50 resultantes se proporcionan en la tabla 13. Los valores de c E50 para los polipéptidos de fusión son al menos iguales o incluso superiores al valor de CE50 de la muteína de lipocalina. Los datos demuestran que, cuando se incluye en los dos polipéptidos de fusión, el anticuerpo puede fusionarse con la muteína de lipocalina sin una pérdida de actividad hacia CD137.

Tabla 13 - Datos de ensayo ELISA para unión a CD137

Ejemplo 16: Demostración de unión simultánea a diana de polipéptidos de fusión en un entorno basado en ELISA

Con el fin de demostrar la unión simultánea de polipéptidos biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 a GPC3 y CD137, se utilizó un formato ELISA de unión doble en analogía al ejemplo 4.

El resultado del experimento se representa en la figura 16, junto con las curvas de ajuste que son resultado de un ajuste sigmoidal de unión 1:1, donde el valor de CE50 y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó a la unidad. Ambos polipéptidos de fusión mostraron claras señales de unión con los valores de CE50 de 7,3-7,5 nM, lo cual demuestra que ambos polipéptidos de fusión son capaces de acoplarse a GPC3 y CD137 simultáneamente. Tabla 14 - Datos de ELISA para unión simultánea a diana

Ejemplo 17: Afinidad de polipéptidos de fusión para GPC3 humano

Las afinidades de unión de la muteína de lipocalina de unión a GPC3 y los polipéptidos biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 para GPC3 recombinante humano y CD137 recombinante humano se determinaron por resonancia de plasmones de superficie en un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) con HBS-EP+ (1x; BR-1006-69; GE Healthcare) como tampón de migración, en analogía al procedimiento descrito en el ejemplo 5.

El kit Biotin CAPture (GE Healthcare) se utilizó para inmovilizar polipéptidos biespecíficos biotinilados sobre la superficie del chip. Los polipéptidos biespecíficos se biotinilaron utilizando química de NHS estándar. El reactivo Biotin CAPture sin diluir (estreptavidina conjugada con oligonucleótido de ADN monocatenario (ss-DNA)) se capturó en un chip sensor CAP con el oligonucleótido de ADN monocatenario complementario (ss-DNA) inmovilizado previamente.

Posteriormente, las muteínas biotiniladas a 1 |ig/ml se aplicaron durante 300 segundos a un caudal de 5 |il/min.

GPC3 se aplicó en cuatro concentraciones (300 nM, 100 nM, 33 nM y 11 nM) a un caudal de 30 |il/min. Se inyectó GPC3 durante 180 segundos y el tiempo de disociación posterior se estableció en 1200 segundos. La regeneración de la superficie del chip se logró inyectando guanidina-HCl 6 M NaOH 0,25 M (120 segundos) con un caudal de 10 |il/min. A la inyección de disoluciones de regeneración le siguió una etapa de lavado adicional con tampón de migración HBS-EP+ (1x; BR-1006-69; GE Healthcare) y un período de estabilización de 120 segundos.

Los datos se evaluaron con doble referencia restando las señales correspondientes medidas para el canal de control (cargado solo con reactivo Biotin CAPture) y restando las inyecciones de tampón de las respuestas de unión. La constante de tasa de asociación ka y la constante de tasa de disociación Kd para la reacción de unión se determinaron utilizando el software de evaluación Biacore T200 V2.0 para el procesamiento de datos y ajuste cinético.

Los respectivos sensogramas se muestran en la figura 17. Los resultados se resumen en la tabla 15. Los datos muestran que los polipéptidos biespecíficos se unen a GPC3 con afinidades de 4,3 nM (SEQ ID NO: 46) y 3,5 nM (SEQ ID n O: 47), respectivamente.

Tabla 15: Afinidades de unión para GPC3

Ejemplo 18 Afinidad de polipéptidos de fusión para CD137 humano

Las afinidades de unión de la muteína de lipocalina de unión a CD137 y los polipéptidos biespecíficos de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 para la proteína de fusión de CD137 humano-Fc recombinante (n.° 838-4B-100, R&D Systems) se determinaron por resonancia de plasmones de superficie usando de un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) en analogía al ejemplo 6. Antes del ensayo de afinidad por SPR, se derivatizó un chip sensor CM5 con un anticuerpo anti-Fc humano utilizando el kit de captura de anticuerpos humanos (Human Antibody Capture Kit) (GE Healthcare n.° BR-1008-39) según las instrucciones del fabricante.

Para determinar la afinidad, se inmovilizó la proteína de fusión de CD137 humano-Fc en el chip en una concentración de 0,25 mg/ml a un caudal de 10 |il/min y un tiempo de contacto de 180 segundos. Se prepararon cuatro concentraciones diferentes (1000 nM, 200 nM, 40 nM y 8 nM) de los polipéptidos biespecíficos en tampón de migración (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, EDTA 3 mM, pH 7,4 (GE Healthcare)) y se aplicaron a la superficie del chip. Aplicando un caudal de 30 |il/min, el tiempo de contacto de muestra fue de 180 segundos y el tiempo de disociación fue de 600 segundos. Todas las mediciones se realizaron a 25°C. La regeneración de la superficie del chip sensor se logró con una inyección de glicina 10 mM, pH 1,7, seguida de un lavado adicional con tampón de migración y un período de estabilización de 120 segundos. Antes de las mediciones de proteínas, se realizaron tres ciclos de regeneración para propósitos de acondicionamiento. Los datos se evaluaron con el software de evaluación Biacore T200 (V 2.0). Se usó doble referencia y se utilizó el modelo de unión 1:1 para ajustar los datos en bruto.

Los resultados se muestran en la figura 18 y se resumen en la tabla 16. Los datos muestran que los polipéptidos biespecíficos se unen a CD137 con afinidades que son al menos iguales a la afinidad de la muteína de lipocalina para CD137.

Tabla 16: Afinidades de unión para CD137

Ejemplo 19: Ensayo de activación de células T funcionales utilizando polipéptidos de fusión recubiertos

Se empleó un ensayo de activación de células T para determinar la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43 para coestimular respuestas de células T. Para este propósito, se recubrió una placa de plástico con polipéptidos de fusión a diferentes concentraciones junto con un anticuerpo anti-CD3 humano (OKT3, eBioscience) y se incubaron posteriormente células T purificadas sobre la superficie recubierta en presencia de anticuerpo anti-CD28 humano soluble (Clon 28.2; eBioscience). Como lectura de salida, se midieron los niveles de interleucina 2 (IL-2) sobrenadante. Como control negativo, se utilizó un isotipo de IgG4 humana. A continuación, se proporciona una descripción detallada del experimento.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de donantes voluntarios sanos a partir de capas leucocitarias mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad de Polysucrose (Biocoll 1,077 g/ml de Biochrom), siguiendo los protocolos de Biochrom. Los linfocitos T se aislaron de las PBMC resultantes utilizando un kit de purificación de células Pan T (Pan T-cellpurifícation Kit) (Miltenyi Biotec GmbH) y los protocolos del fabricante. Las células T purificadas se resuspendieron en un tampón que consistía en 90% de FCS y 10% de DMSO, se congelaron inmediatamente utilizando nitrógeno líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta uso posterior. Para el ensayo, las células T se descongelaron durante 16 h y se cultivaron en medios de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) suplementados con FCS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % (Life Technologies).

El siguiente procedimiento se llevó a cabo utilizando triplicados para cada condición experimental. Placas de cultivo tisular de fondo plano se recubrieron durante la noche a 4°C usando 200 |il de una mezcla de anticuerpo anti-CD30,5 |ig/ml y una serie de dilución de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 40 y 41, y SEQ ID NO: 42 y 43 (25 |ig/ml, 2,5 |ig/ml y 0,25 |ig/ml) o del control negativo de isotipo de IgG4 (25 |ig/ml). En otro entorno con la misma condición experimental, los polipéptidos de fusión se usaron para recubrir junto con un isotipo de IgG1 (como control negativo adicional) en lugar del anticuerpo anti-CD3. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 2 veces con PBS, y se añadieron a cada pocillo 100 |il de la suspensión de células T (correspondiente a 5 x 104 células T) en medios de cultivo suplementados con anticuerpo anti-hCD282 |ig/ml. Las placas se cubrieron con un sello permeable a gas (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante 3 días. Posteriormente, se evaluaron la concentración de IL-2 en el sobrenadante, así como la proliferación celular.

Los niveles de IL-2 humana en los sobrenadantes de cultivo celular agrupados se cuantificaron usando el kit IL-2 DuoSet de R&D Systems. El procedimiento se llevó a cabo como describe a continuación. En la primera etapa, se recubrió una placa de 384 pocillos a temperatura ambiente durante 2 horas con 1 |ig/ml de “anticuerpo de captura de IL-2 humana” (“Human IL-2 Capture Antibody”) (R&D System) diluido en PBS. Posteriormente, los pocillos se lavaron 5 veces con 80 |il de PBS-T (PBS que contenía Tween20 al 0,05 %) usando una lavadora Biotek EL405 Select CW (Biotek). Después de 1 hora de bloqueo en PBS-T que contenía adicionalmente caseína al 1 % (p/p), el sobrenadante agrupado y una serie de concentraciones de un estándar de IL-2 diluido en medio de cultivo se incubaron en la placa de 384 pocillos durante la noche a 4°C. Para permitir la detección y cuantificación de IL-2 capturada, se añadieron una mezcla de anticuerpo de detección anti-hIL-2-Bio de cabra biotinilado (R&D System) 100 ng/ml y estreptavidina marcada con Sulfotag 1 |ig/ml (Mesoscale Discovery) en PBS-T que contenía 0,5 % de caseína y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se añadieron 25 |il de tampón de lectura a cada pocillo y se leyó la señal de electroquimioluminiscencia (ECL) de cada pocillo usando un lector Mesoscale Discovery. El análisis y la cuantificación se realizaron utilizando el software Mesoscale Discovery.

El resultado del experimento se representa en la figura 19. Para los cuatro polipéptidos de fusión (SEQ ID NO: 36 y ^{37, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID} N^o: ^{40 y 41 y SEQ ID NO: 42 y 43) existe una clara inducción de la producción de} IL-2 por las células T empleadas, en comparación con el isotipo de IgG4 de control negativo. Los datos muestran además una tendencia hacia la inducción más fuerte de IL-2 a altas concentraciones de recubrimiento de las fusiones polipeptídicas. En la ausencia de estimulación anti-CD3 de las células T, los polipéptidos de fusión no indujeron la producción de IL-2 por las células T. Esto demuestra que los polipéptidos de fusión son capaces de coestimular la activación de las células T estimuladas con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en concentraciones subóptimas.

Ejemplo 20: Ensayo de activación de células T funcional utilizando polipéptidos de fusión unidos a células tumorales

Se empleó un ensayo de activación de células T dependiente de células diana para evaluar la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37; SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, con capacidad de unirse a CD137 y GPC3 al mismo tiempo, para coestimular respuestas de células T cuando se inmovilizan en una línea celular GPC3 positiva. Como control negativo, se empleó el anticuerpo de unión a CD137 monoespecífico de SEQ ID NO: 34 y 35. En el experimento, se recubrió una placa de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano (OKT3, eBioscience), y posteriormente se cultivaron células HepG2 GPC3 positivas sobre la placa durante la noche. Al día siguiente, las células T purificadas se incubaron sobre la superficie recubierta en presencia de 1 |ig/ml de polipéptidos ^{de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 44, y SEQ ID NO: 45 o el anticuerpo de control de SEQ} I^d N^o: ^{34 y} 35. Como lectura de salida, se midieron los niveles de interleucina 2 (IL-2) sobrenadante. A continuación, el experimento se describe en detalle.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana de donantes voluntarios sanos a partir de capas leucocitarias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de Polysucrose (Biocoll 1,077 g/ml de Biochrom), siguiendo los protocolos de Biochrom. Los linfocitos T se aislaron de las PBMC resultantes utilizando un kit de purificación de células Pan T (Miltenyi Biotec GmbH) y los protocolos del fabricante. Las células T purificadas se resuspendieron en un tampón que consistía en 90 % de FCS y 10 % de DMSO, se congelaron inmediatamente usando nitrógeno líquido, y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior. Para el ensayo, las células T se descongelaron durante 16 horas y se cultivaron en medios de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) suplementados con FCS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % (Life Technologies).

El siguiente procedimiento se llevó a cabo utilizando triplicados para cada condición experimental. Placas de cultivo tisular de fondo plano se recubrieron previamente o no durante 1 hora a 37°C utilizando 200 |il de anticuerpo anti-CD3 0,25 |ig/ml. Posteriormente, los pocillos se lavaron dos veces con PBS. Se sembraron en placa 1,25 x 104 células tumorales HepG2 por pocillo y se permitió que se adhiriesen durante la noche a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada. Las células HepG2 se habían dejado crecer antes en cultivo en condiciones estándar, se separaron usando Accutase y se resuspendieron en medios de cultivo.

En los días siguientes, las células tumorales se trataron durante 2 horas a 37°C con mitomicina C (Sigma Aldrich) a una concentración de 10 |ig/ml para bloquear su proliferación. Las placas se lavaron dos veces con PBS y se añadieron a cada pocillo 100 |il de la suspensión de células T (correspondiente a 5 x 104 células T), y los polipéptidos de fusión 0 control negativo a una concentración de 1 |ig/ml. Las placas se cubrieron con un sello permeable a gas (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante 3 días. Posteriormente, la concentración de IL-2 en el sobrenadante se evaluó de la manera que se describe a continuación.

Los niveles de IL-2 humana en los sobrenadantes de cultivo celular se cuantificaron usando el kit IL-2 DuoSet de R&D Systems. El procedimiento se lleva a cabo y se describe a continuación. En la primera etapa, se recubrió una placa de 384 pocillos a temperatura ambiente durante 2 h con 1 |ig/ml de “anticuerpo de captura de IL-2 humana” (“Human IL-2 Capture Antibody”) (R&D System) diluido en PBS. Posteriormente, los pocillos se lavaron 5 veces con 80 |il de PBS-T (PBS que contenía Tween20 al 0,05 %) usando una lavadora Biotek EL405 select CW (Biotek). Después de 1 h de bloqueo en PBS-T que contenía adicionalmente 1 % de caseína (p/p), el sobrenadante agrupado y una serie de concentraciones de un estándar de IL-2 diluido en medio de cultivo se incubaron en la placa de 384 pocillos durante la noche a 4°C. Para permitir la detección y cuantificación de IL-2 capturada, se añadieron una mezcla de 100 ng/ml de anticuerpo de detección anti-hIL-2-Bio de cabra biotinilado (R&D System) y estreptavidina marcada con Sulfotag 1 |ig/ml (Mesoscale Discovery) en PBS-T que contenía 0,5 % de caseína y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavado, se añadieron 25 |il de tampón de lectura a cada pocillo y se leyó la señal de electroquimioluminiscencia (ECL) de cada pocillo usando un lector Mesoscale Discovery. El análisis y la cuantificación se realizaron utilizando el software Mesoscale Discovery.

El resultado del experimento se representa en la figura 20. Para los tres polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 36 y 37, SEQ ID NO: 44, y SEQ ID NO: 45, existe una clara inducción de la producción de IL-2 por las células T empleadas, en comparación con el anticuerpo de control de SEQ ID NO: 34 y 35. Esto muestra que los polipéptidos de fusión de la divulgación son capaces de coestimular la activación de células T de una manera dependiente de diana, como lo demuestra que los polipéptidos de fusión de unión a GPC3 exhiben mayores niveles de producción de IL-2 que el anticuerpo de control.

Ejemplo 21: Ensayo de activación de células T funcional usando polipéptidos de fusión unidos a células tumorales con y sin bloqueo de unión biespecífica

Se empleó un ensayo de activación de células T dependiente de células diana, similar al experimento que se describió en el ejemplo 20, para evaluar la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, con capacidad de unirse a CD137 y GPC3 al mismo tiempo, para coestimular respuestas de células T cuando se unen a una línea celular de GPC3 positiva. Como control, el experimento se realizó en presencia de un exceso de anticalina de unión a GPC3 monoespecífica de SEQ ID NO: 10 con el fin de desplazar los constructos biespecíficos de SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45 a partir de la unión a las células GPC3 positivas. En el experimento, se recubrió una placa de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano (OKT3, eBioscience), y posteriormente se cultivaron células Hep3B GPC3 positivas en la placa durante la noche. Al día siguiente, las células T purificadas se incubaron sobre la superficie recubierta en presencia de cuatro concentraciones de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 (1 |ig/ml, 0,1 |ig/ml, 0,01 |ig/ml, 0,001 |ig/ml). En paralelo, el experimento se realizó con la adición de un exceso de SEQ ID NO: 10 (1 mg/ml). Como lectura de salida, se midieron los niveles de interleucina 2 (IL-2) sobrenadante. A continuación, el experimento se describe en detalle.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de donantes voluntarios sanos a partir de capas leucocitarias mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad de Polysucrose (Biocoll 1,077 g/ml de Biochrom), siguiendo los protocolos de Biochrom. Los linfocitos T se aislaron de las PBMC resultantes utilizando un kit de purificación de células Pan T (Miltenyi Biotec GmbH) y los protocolos del fabricante. Las células T purificadas se cultivaron en medios de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) suplementados con FCS al 10% y penicilinaestreptomicina al 1 % (Life Technologies).

El siguiente procedimiento se llevó a cabo utilizando triplicados para cada condición experimental. Placas de cultivo tisular de fondo plano se recubrieron previamente durante 1 hora a 37°C con 200 |il de anticuerpo anti-CD30,25 |ig/ml. Posteriormente, los pocillos se lavaron dos veces con PBS. Se sembraron en placa 1,25 x 104 células tumorales Hep3B por pocillo y se permitió que se adhiriesen durante la noche a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada. Las células Hep3B se habían dejado crecer antes en cultivo en condiciones estándar, se separaron usando Accutase y se resuspendieron en medios de cultivo.

Al día siguiente, las células tumorales se trataron durante 2 horas a 37°C con mitomicina C (Sigma Aldrich) en la concentración de 10 |ig/ml para bloquear su proliferación. Las placas se lavaron dos veces con PBS y se añadieron a cada pocillo 100 |il de la suspensión de células T (correspondiente a 5 x 104 células T), y los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 a una concentración de 1 |ig/ml, 0,1 |ig/ml, 0,01 |ig/ml, 0,001 |ig/ml se añadieron en presencia o ausencia de un exceso de SEQ ID NO: 10 (1 mg/ml). Las placas se cubrieron con un sello permeable a gas (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante 3 días. Posteriormente, se determinó la concentración de IL-2 en el sobrenadante mediante ELISA utilizando el conjunto ELISA IL-2 humana de BD Bioscience según las instrucciones del fabricante.

El resultado del experimento se representa en la figura 21. Para los dos polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 (figura 21A) y SEQ ID NO: 45 (figura 21C), existe una clara inducción de la producción de IL-2 por las células T empleadas que aumenta cuando se eleva la concentración. En contraste, la inducción de producción de IL-2 es suprimida en presencia de un exceso de SEQ ID NO: 10, que inhibe la unión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 biespecíficas a las células Hep3B. Esto muestra que los polipéptidos de fusión de la divulgación son capaces de coestimular la activación de las células T de una manera dependiente de la diana.

De manera notable, la cantidad de IL-2 inducida es mayor para SEQ ID NO: 44 en comparación con SEQ ID NO: 45, lo cual indica que la geometría de una fusión de GPC3/CD137 biespecífica juega un papel importante en la determinación de la fuerza de la activación de células T.

Ejemplo 22: Ensayo funcional de activación de células T utilizando células tumorales con altos y bajos niveles de GPC3

Se empleó un ensayo de activación de células T dependiente de células diana, similar al experimento que se describió en el ejemplo 20, para evaluar la capacidad de los polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 para coestimular respuestas de células T de manera dependiente del nivel de GPC3 de la línea celular empleada. Como control negativo, se empleó el anticuerpo de unión a HER2 trastuzumab. Para la comparación, se investigó el comportamiento del anticuerpo monoclonal anti-CD137 de referencia de SEQ ID NO: 74 y 75. En el experimento, se recubrió en placas de cultivo de plástico con un anticuerpo anti-CD3 humano (OKT3, eBioscience), y posteriormente se cultivaron por separado células HepG2, SKBR3 o MCF7 sobre las placas durante la noche. Al día siguiente, las células T purificadas se incubaron sobre la superficie recubierta en presencia de varias concentraciones del polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, el anticuerpo de referencia de SEQ ID NO: 74 y 75, y los controles negativos de trastuzumab y el vehículo (es decir, sin adición de artículo de ensayo). Como lectura de salida, se midieron los niveles de interleucina 2 (IL-2) sobrenadante. A continuación, el experimento se describe en detalle.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana de donantes voluntarios sanos a partir de capas leucocitarias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de Polysucrose (Biocoll 1,077 g/ml de Biochrom), siguiendo los protocolos de Biochrom. Los linfocitos T se aislaron de las PBMC resultantes utilizando un kit de purificación de células Pan T (Miltenyi Biotec GmbH) y los protocolos del fabricante. Las células T purificadas se resuspendieron en un tampón consistía en un 90% de FCS y un 10% de DMSO, se congelaron inmediatamente usando nitrógeno líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior. Para el ensayo, las células T se descongelaron durante 16 horas y se cultivaron en medios de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) suplementados con FCS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % (Life Technologies).

El siguiente procedimiento se llevó a cabo utilizando triplicados para cada condición experimental. Placas de cultivo tisular de fondo plano se recubrieron previamente durante 1 hora a 37°C usando 200 |il de anticuerpo anti-CD3 0,25 |ig/ml. Las placas se lavaron posteriormente dos veces con PBS. Se sembraron en placa 5 x 104 células tumorales diana por pocillo y se permitió que se adhiriesen durante la noche a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada. Las células diana se habían dejado crecer antes en cultivo en condiciones estándar, se separaron usando Accutase y se resuspendieron en medios de cultivo.

Al día siguiente, las células tumorales se trataron durante 2 horas a 37°C con mitomicina C (Sigma Aldrich) a una concentración de 30 |ig/ml para bloquear su proliferación. Las placas se lavaron dos veces con PBS y se añadieron a cada pocillo 100 |il de la suspensión de células T (correspondiente a 5 x 104 células T), junto con los artículos de ensayo de SEQ iD NO: 44, s Eq ID NO: 45, el anticuerpo de referencia de SEQ ID NO: 74 y 75, y el control negativo, trastuzumab, en concentraciones que oscilan desde 0,05 nM hasta 5 nM. Las placas se cubrieron con un sello permeable a gas (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante 3 días. Posteriormente, se evaluó la concentración de IL-2 en el sobrenadante como se describe a continuación.

Los niveles de IL-2 humana en los sobrenadantes de cultivo celular se cuantificaron usando el kit IL-2 DuoSet de R&D Systems. El procedimiento se lleva a cabo y se describe a continuación. En la primera etapa, se recubrió una placa de 384 pocillos a temperatura ambiente durante 2 h con 1 |ig/ml de “anticuerpo de captura de IL-2 humana” (“Human IL-2 Capture Antibody”) (R&D System) diluido en PBS. Posteriormente, los pocillos se lavaron 5 veces con 80 |il de PBS-T (PBS que contenía Tween20 al 0,05 %) usando una lavadora Biotek EL405 Select CW (Biotek). Después de 1 h de bloqueo en PBS-T que contenía adicionalmente 1 % de caseína (p/p), sobrenadante agrupado y una serie de concentraciones de un estándar de IL-2 diluido en medio de cultivo se incubaron en la placa de 384 pocillos durante la noche a 4°C. Para permitir la detección y cuantificación de IL-2 capturada, se añadieron una mezcla de 100 ng/ml de anticuerpo de detección anti-hIL-2-Bio de cabra biotinilado (R&D System) y estreptavidina marcada con Sulfotag 1 |ig/ml (Mesoescale Discovery) en PBS-T que contenía 0,5 % de caseína y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadieron 25 |il de tampón de lectura a cada pocillo y se leyó la señal de electroquimioluminiscencia (ECL) de cada pocillo usando un lector Mesoscale Discovery. El análisis y cuantificación se realizaron utilizando el software Mesoscale Discovery.

El resultado de un experimento representativo se representa en la figura 22. En esta figura, los valores se representan gráficamente en relación con la producción de IL-2 de base en ausencia de artículo de ensayo y, por lo tanto, representan la cantidad de veces de cambio en comparación con el nivel de base. Mientras el control negativo, trastuzumab (figura 22A, triángulos) no conduce a la inducción de IL-2 en células T con ninguna de las tres líneas celulares, concentraciones crecientes del polipéptido de fusión biespecífico de SEQ ID NO: 44 (figura 22A, círculos) y SEQ ID NO: 45 (figura 22A, cuadrados) inducen a las células T a producir IL-2 en presencia de células HepG2 que expresan GPC3. Sin embargo, no se aprecia aumento de IL-2 debido a SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 para las células SKBR3 y MCF7 GPC3 negativas (figura 22). Este comportamiento es marcadamente diferente al del anticuerpo anti-CD137 de SEQ ID NO: 74 y 75, que induce a IL-2 en células T en presencia de las tres líneas celulares (figura 22B).

El experimento demuestra claramente que SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 activan células T de una manera dependiente de la presencia de GPC3 en las células diana. Mientras que la línea celular HepG2 GPC3 positiva muestra una clara activación de células T medida por la producción de IL-2, este efecto no se produce con células SKBR3 y MCF7, las cuales no expresan niveles detectables de GPC3. Dado que este efecto es atribuible a la presencia de GPC3 y no debido a las líneas celulares GPC3 negativas bajo estudio que potencialmente hacen que la señalización de CD137 sea ineficaz resulta evidente por el hecho de que el anticuerpo anti-CD137 de SEQ ID NO: 74 y 75 es capaz de activar células T a través de la señalización de CD137 con los tres tipos de células.

Ejemplo 23: Evaluación de inmunogenicidad de células T ex vivo de polipéptidos de fusión

Para investigar el riesgo de la formación de anticuerpos anti-fármaco en seres humanos, se realizó una evaluación de inmunogenicidad de células T in vitro de los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, el anticuerpo de control trastuzumab y la hemocianina de lapa californiana de control positivo (KLH). Para realizar el experimento, PBMC de 32 donantes seleccionados para cubrir alotipos de HLA que reflejan la distribución en una población global se descongelaron, se lavaron y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3x105 células por pocillo. Se añadieron artículos de ensayo a las células, diluidos en medios de ensayo, a una concentración de 30 |ig/ml. El medio de ensayo se usó solo, como blanco, y se utilizó hemocianina de lapa californiana (KLH) como control positivo sin modificar (naive). Las PBMC se incubaron durante 7 días en una atmósfera humidificada a 37°C y de CO2 al 5 %. El día 7, las PBMC se marcaron para marcadores CD3+ y CD4+ fenotípicos de superficie y para EdU (5-etinil-2'desoxiuridina) incorporada en ADN, se usó como marcador de proliferación celular. El porcentaje de células CD3+ CD4+ EdU+ que proliferan se midió usando un citómetro de flujo Guava easyCyte 8HT y se analizó usando el software GuavaSoft InCyte.

La figura 23 proporciona los resultados de este ensayo para los 32 donantes y todas las moléculas de ensayo bajo estudio. En la figura 23A, se representó gráficamente el índice de estimulación, que se obtuvo por la relación de proliferación en presencia frente a en ausencia de artículo de ensayo. El umbral que define a un donante respondedor (índice de estimulación > 2) se indica como una línea de puntos. En la figura 23B, se representó gráficamente el número de donantes respondedores según lo definido por este umbral. Evidentemente, el número de donantes respondedores al trastuzumab de referencia es uno y, por lo tanto, es pequeño, mientras que los 32 donantes responden al control positivo de KLH con una fuerte proliferación por encima del umbral. Para los polipéptidos de fusión biespecíficos de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, el número de donantes respondedores también es uno en ambos casos.

Por lo tanto, el experimento demuestra que los polipéptidos de fusión biespecíficos inducen poca respuesta en la evaluación de inmunogenicidad de células T in vitro, lo que indica que el riesgo de inducir respuestas inmunogénicas es bajo.

Ejemplo 24: Afinidad para receptores Fc-gamma hFcY RI/CD64 y hFcY RIMA/CD16a

Para medir las afinidades de unión de fusiones polipeptídicas con una cadena principal basada en IgG4 diseñada por ingeniería (SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45) para los receptores Fc-gamma hFcY RI/CD64 y hFcY RIIIA/CD16a (R&D Systems) se empleó un ensayo basado en resonancia de plasmones de superficie (SPR). Trastuzumab se utilizó como control de un anticuerpo monoespecífico con una cadena principal de IgG1. En el ensayo de afinidad de SPR, las fusiones polipeptídicas se biotinilaron y se capturaron en un chip sensor CAP utilizando el kit Biotin CAPture (GE Healthcare). El chip sensor CAP se inmovilizó previamente con un oligonucleótido de ADN monocatenario (ss-DNA).

Se aplicó reactivo de Biotin CAPture sin diluir (estreptavidina conjugada con el oligonucleótido de ADN monocatenario complementario (ss-DNA)) a un caudal de 2 |il/min durante 300 segundos. Posteriormente, se aplicaron 10 |ig/ml de fusión polipeptídica biotinilada durante 300 segundos a un caudal de 5 |il/min. Trastuzumab y las fusiones polipeptídicas se biotinilaron mediante incubación con NHS-PEG4-Biotin EZ-Link® (Thermo Scientific) durante dos horas a temperatura ambiente. El exceso de reactivo de biotina no reaccionado se retiró cargando la mezcla de reacción en una placa de centrífuga y desalado ZebaTM (Thermo Scientific). El canal de referencia se cargó solamente con reactivo Biotin CAPture.

Para determinar la afinidad, se prepararon cuatro diluciones de hFcY RI/CD64 (a 100, 25 y 6,25 y 1,6 nM) o de cuatro a cinco diluciones de hFcY RIIIA/cDl6a (a 1000, 333, 111, 37 y 12 nM) en tampón de migración (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, EDTA 3 mM, pH 7,4 (GE Healthcare)) y se aplicaron a la superficie de chip. Aplicando un caudal de 30 |il/min, el tiempo de contacto de muestra fue de 180 segundos y el tiempo de disociación fue de 1800 / 2700 segundos para hFcY RI/CD64 o 300 segundos para hFcY RIIIA/CD16a. Todas las mediciones se realizaron a 25°C. La regeneración de la superficie de chip sensor CAP se logró con una inyección de Gua-HCl 6 M con NaOH 0,25 M seguido de un lavado adicional con tampón de migración y un período de estabilización de 120 segundos. Antes de las mediciones de proteínas, se realizaron tres ciclos de regeneración para propósitos de acondicionamiento. Los datos se evaluaron con el software de evaluación Biacore T200 (V 2.0). Se usó doble referencia. Para hFcY RI/CD64, se utilizó el modelo de unión 1: 1 para ajustar los datos en bruto. Para hFcY RNIA/CD16a, se utilizó el modelo de afinidad de estado estacionario para ajustar los datos en bruto.

La tabla 17 muestra los resultados del ajuste de los datos para hFcY RI/CD64. El artículo de ensayo a base de IgG1, trastuzumab, mostró una afinidad de 0,3 nM. Las fusiones polipeptídicas de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 no mostraron unión significativa a hFcY RI/CD64.

Estos datos demuestran que la unión a hFcY RI/CD64 puede reducirse a niveles insignificantes cambiando el isotipo de IgG1 a IgG4 modificada por ingeniería.

Tabla 17:

La tabla 18 muestra los resultados del ajuste de los datos para hFcY RIIIA/CD16a. La afinidad de unión resultante a hFcY RIIIA/CD16a de los artículos de ensayo a base de IgG1, trastuzumab, fue de alrededor de 350 nM, mientras que las fusiones polipeptídicas de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 no mostraron unión significativa a hFcY RIIIA/CD16a. Estos datos demuestran que la unión a hFcY RI/CD64 puede reducirse a niveles insignificantes cambiando el isotipo de IgG1 a IgG4 modificada por ingeniería.

Tabla 18:

Ejemplo 25: Afinidad para receptor Fc neonatal

Para medir las afinidades de unión de fusiones polipeptídicas con una cadena principal basada en IgG4 modificada por ingeniería (SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45) al receptor de Fc neonatal (FcRn, Sino Biologicals, n.° CT009-H08H), se empleó un ensayo basado en resonancia de plasmones de superficie (SPR). Trastuzumab sirvió como control de un anticuerpo monoespecífico con una cadena principal de IgG1. En el ensayo de afinidad por SPR, FcRn se inmovilizó covalentemente en un chip sensor CM5 (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. En resumen, después de activar los grupos carboxilo de la matriz de dextrano con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), las aminas primarias de la proteína FcRn se dejaron reaccionar con el éster de NHS en la superficie hasta que se alcanzó una señal de ~200 RU. Finalmente, los ésteres de NHS no reaccionados fueron bloqueados haciendo pasar una disolución de etanolamina 1M a través de la superficie. El caudal durante todo el procedimiento de inmovilización fue de 10 |il/min.

Para determinar su afinidad, se prepararon seis diluciones (1000 nM, 333 nM, 111 nM, 37 nM, 12 nM y 4 nM) de todos los constructos en tampón de migración (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, EDTA 3 mM, pH 6,0) y se aplicaron a la superficie del chip. Aplicando un caudal de 30 |il/min, el tiempo de contacto de muestra fue de 180 segundos y el tiempo de disociación fue de 30 segundos. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25°C. La regeneración de la superficie de chip sensor CAP se logró con una inyección de glicina 10 mM, pH 3,0. Antes de las mediciones de proteínas, se realizaron tres ciclos de regeneración para fines de acondicionamiento. Los datos se evaluaron con el software de evaluación Biacore T200 (V 2.0) con doble referencia. El modelo de afinidad de estado estacionario se usó para ajustar los datos en bruto.

En la tabla 19 se refleja que las afinidades de unión resultantes de todas las fusiones polipeptídicas a FcRn eran de alrededor de 2 |iM, lo que demuestra que el cambio del isotipo de IgG1 a una cadena principal de IgG4 modificada por ingeniería no tiene impacto detectable sobre la unión a FcRn.

Tabla 19:

Ejemplo 26: Farmacocinética de polipéptidos de fusión en ratones

Un análisis de la farmacocinética de polipéptidos de fusión definidos por SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 se realizó en ratones. Se inyectaron ratones CD-1 macho de aproximadamente 5 semanas de edad (3 ratones por punto de tiempo; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Alemania GmbH) en una vena de la cola con un polipéptido de fusión a una dosis de 10 mg/kg. Los artículos de ensayo se administraron como un bolo utilizando un volumen de 5 ml/kg. Las muestras de plasma de los ratones se obtuvieron en los puntos de tiempo de 5 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 4 días, 8 días, 14 días y 20 días. Se recogió suficiente sangre completa, tomada con anestesia de isoflurano, para obtener al menos 100 |il de plasma con heparina de litio por animal y tiempo. Los niveles de fármaco se detectaron utilizando un ELISA de tipo sándwich que detecta el constructo biespecífico completo a través de las dianas GPC3 y CD137. Los datos se ajustaron utilizando un modelo de dos compartimentos utilizando el software Prism GraphPad 5.

La figura 25 muestra los gráficos de la concentración plasmática a lo largo del tiempo para los constructos de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, con una inserción que muestra los mismos datos en un gráfico semilogarítmico. La farmacocinética tiene apariencia similar en ambos casos. A partir de una concentración plasmática de alrededor de 150 |ig/ml, los niveles plasmáticos cayeron a los niveles de base en aproximadamente 100 horas. El decaimiento biexponencial de un modelo de dos compartimentos se aplicó satisfactoriamente para describir con precisión los datos, y un ajuste de los datos (figura 25) utilizando este modelo dio como resultado las semividas terminales de 13,7 horas para SEQ ID NO: 44 y 10 horas para SEQ ID NO: 45.

Los datos demuestran que las fusiones biespecíficas tienen semividas que están en el intervalo intermedio de lo que podría esperarse para proteínas de fusión de Fc.

Ejemplo 27: Farmacocinética de polipéptidos de fusión en macaco cangrejero (cynom olgus m onkey)

Un análisis de la farmacocinética de polipéptidos de fusión definidos por SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, se realizó en macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys). Macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys) machos recibieron una infusión intravenosa durante 60 minutos, con una dosis de 3 mg/kg de artículo de ensayo. Se obtuvieron muestras de plasma de los macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys) en los puntos de tiempo de 15 min, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 9 días, 11 días, 14 días, 18 días y 24 días. Los niveles de fármaco se detectaron utilizando un ELISA de tipo sándwich que detecta el constructo biespecífico completo a través de las dianas HER2 y CD137. Los niveles en plasma de trastuzumab se determinaron usando un ELISA de tipo sándwich con dianas HER2 y Fc humano. Los datos se ajustaron utilizando un modelo de dos compartimentos utilizando el software Prism GraphPad 5.

La figura 26 muestra los gráficos de la concentración plasmática a lo largo del tiempo para los constructos de SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, con la inserción que muestra los mismos datos en un gráfico semilogarítmico. La farmacocinética tiene apariencia similar en ambos casos, con SEQ ID NO: 44 mostrando aparentemente una semivida más prolongada. A partir de una concentración plasmática de alrededor de 70 |ig/ml, los niveles plasmáticos caen a niveles cercanos a cero durante el transcurso de 200 horas. El decaimiento biexponencial de un modelo de dos compartimentos se aplicó satisfactoriamente para describir con precisión los datos, y un ajuste de los datos (figura 26) utilizando este modelo dio como resultado semividas terminales de 39 horas (SEQ ID NO: 44) y 24,1 horas (SEQ ID NO: 45), respectivamente.

Por lo tanto, los datos demuestran que las fusiones biespecíficas tienen semividas terminales en macacos cangrejeros (cynomolgus monkeys) que aumentaron con respecto a la semivida en los ratones, y en un intervalo razonable para un agente terapéutico biológico.

Realizaciones descritas de manera ilustrativa en el presente documento pueden ponerse en práctica de manera

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   i. Una proteína de fusión caracterizada porque la proteína de fusión es capaz de unirse tanto a CD137 como a glipicano-3 (GPC3), y

   porque la proteína de fusión comprende al menos dos subunidades en cualquier orden, en la que la primera subunidad comprende una muteína de lipocalina específica para CD137 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33 y la segunda subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa, un dominio de unión a antígeno de la misma, o una muteína de lipocalina específica para GPC3.
2. 2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la segunda subunidad comprende una muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para GPC3.
3. 3. La proteína de fusión según la reivindicación 2, en la que la proteína de fusión comprende además una tercera subunidad que es

   (i) un fragmento Fc de inmunoglobulina,

   (ii) específica para CD137, o

   (iii) una muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para CD137.
4. 4. La proteína de fusión según la reivindicación 2 o 3, en la que

   la muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para GPC3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-17, o que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-17, o que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-17, o que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-17.
5. 5. La polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que

   la muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para CD137 comprende el siguiente conjunto de residuos de aminoácido mutado en comparación con la secuencia de polipéptido lineal de hNGAL madura (SEQ ID NO: 2):

   Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ile; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met; Leu 70 ^ Lys; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; y Lys 134 ^ Tyr.
6. 6. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que

   (i) la muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para CD137 tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33;

   (ii) la muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para CD137 tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33; o

   (iii) la muteína de lipocalina que tiene especificidad de unión para CD137 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-33.
7. 7. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el polipéptido de fusión comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 48 o la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 49.
8. 8. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal.
9. 9. La proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que

   (a) el anticuerpo monoclonal tiene una cadena principal de IgG4,

   en la que opcionalmente la cadena principal de IgG4 tiene una cualquiera de las siguientes mutaciones seleccionada del grupo que consiste en S228P, N297A, F234A, y L235A; o

   (b) el anticuerpo monoclonal tiene una cadena principal de IgG2,

   en la que opcionalmente la cadena principal de IgG2 tiene una cualquiera de las siguientes mutaciones seleccionada del grupo que consiste en N297A, F234A, y L235A.
10. 10. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 44, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 45, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 46, o la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 47.
11. 11. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. 12. Una célula anfitriona que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11.
13. 13. Un método de producción in vitro de la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la proteína de fusión se produce comenzando a partir del ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión por medio de métodos de ingeniería genética,

    en el que opcionalmente la proteína de fusión se produce en un organismo anfitrión eucariota o bacteriano y se aísla de este organismo anfitrión o su cultivo.
14. 14. Una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en el tratamiento de cáncer.
15. 15. La proteína de fusión para el uso según la reivindicación 14, que comprende

    (i) activar simultáneamente rutas de señalización aguas abajo de CD137 y acoplarse a células de tumor GPC3 positivas, que comprende aplicar la proteína de fusión o una composición que comprende tal proteína de fusión;

    (ii) coestimular simultáneamente células T y acoplarse a células de tumor GPC3 positivas, que comprende aplicar la proteína de fusión o una composición que comprende tal proteína de fusión;

    (iii) inducir simultáneamente proliferación de linfocitos T y acoplarse a células de tumor GPC3 positivas, que comprende aplicar la proteína de fusión o una composición que comprende tal proteína de fusión; o (iv) dirigir formación de agrupamientos de CD137 y activación de células T a células de tumor GPC3 positivas, que comprende aplicar la proteína de fusión o una composición que comprende tal proteína de fusión.
16. 16. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.