RS64002B1

RS64002B1 - Anti-kancerski fuzioni polipeptid

Info

Publication number: RS64002B1
Application number: RS20230084A
Authority: RS
Inventors: Marlon Hinner; Aiba Rachida Siham Bel; Christine Rothe; Shane Olwill; Corinna Schlosser
Original assignee: Pieris Pharmaceuticals Gmbh
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2023-03-31
Also published as: CN108112253B; SI3298030T1; HRP20230145T1; RU2021119777A; AU2016262845A1; RU2017135539A3; EP3298030A1; FI3298030T3; US20180148485A1; SMT202300026T1; ES2938525T3; MX2017014716A; RU2017135539A; AU2016262845B2; WO2016184882A1; MX390894B; DK3298030T5; RU2754466C2; PL3298030T3; JP2018519803A

Description

Opis

I. POZADINA

[0001] Glipikan-3 (GPC3) je onkofetalni antigen koji pripada glipikanskoj porodici proteoglikana usidrenih na glikozil-fosfatidilinozitolu. GPC3 se eksprimira u fetalnoj jetri i placenti tokom razvoja i nishodno je regulisan ili utišan u normalnim odraslim tkivima. Mutacije i deplecije u GPC3 genu su odgovorne za Simpson-Golabi-Behmel ili Simpsonov sindrom dismorfije kod ljudi. GPC3 se eksprimira u raznim kancerima, a, naročito u hepatocelularnom karcinomu ("HCC"), melanomu, melanomu Merkelovih ćelija, Vilmovom tumoru, i hepatoblastomu. (He, H. et al Applied Immunohistochem Mol Morphol.17:40-6 (2009); Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path.82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).). HCC je treći vodeći uzrok smrti povezanih sa kancerom širom sveta. Sveke godine, HCC je odgovoran za oko milion smrti. (Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)).

[0002] Efektivna terapija protiv kancera u kojima se eksprimira GPC3kao što je HCC zahteva terapijska jedinjenja koja ciljaju GPC3 i takođe proizvode anti-tumorske efekte.

[0003] CD137 je kostimulatorni imuni receptor i član super porodice receptora faktora tumorske nekroze (TNFR). Uglavnom se eksprimira na aktiviranim CD4+ i CD8+ T ćelijama, aktiviranim B ćelijama, I ćelijama prirodnim ubicama (NK) ali takođe može da se nađe na mirnim monocitima i dendritskim ćelijama (Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 20135(Suppl 1):47-53), ili endotelijalnim ćelijama (Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217). CD137 igra važnu ulogu u regulaciji imunih odgovora i samim tim predstavlja cilj za imunoterapiju. CD137 ligand (CD137L) je jedini poznati prirodni ligand CD137, i konstitutivno se eksprimira na nekoliko tipova APC, kao što su aktivirane B ćelije, monociti, i dendritske ćelije slezine, i može da se indukuje na T limfocitima.

[0004] CD137L je trimerni protein koji postoji kao oblik obmotan membranom i kao rastvorljiva varijanta. Mogućnost rastvorljivog CD137L da aktivira CD137 npr. na CD137-eksprimirajućim limfocitima je međutim ograničena, i velike koncentracije su potrebne da bi se izvukao efekat (Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1; 183(3):1851-1861). Prirodni put aktivacije CD137 je preko angažovanja CD137-pozitivne ćelije sa CD137L-pozitivnom ćelijom. Za CD137 aktivaciju se zatim smatra da je indukuje gomilanje putem CD137L na suprotnoj ćeliji, što dovodi do signaliziranja preko TRAF1, 2 i 3 (Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244(1):197-217, Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12(2):130-146) i dodatnih nishodnih efekata kod CD137-pozitivne T-ćelije. U slučaju T-ćelija aktiviranih prepoznavanjem njihovih odgovarajućih srodnih ciljeva, efekti dobijeni zajedničkom stimulacijom CD137 su dodatno pojačani aktivacijom, pojačanim preživljavanjem i proliferacijom, proizvodnjom pro-inflamatornih citokina i poboljšanim sposobnostima za ubijanjem.

[0005] Korist CD137 zajedničke stimulacije radi eliminacije kancerskih ćelija je utvrđena u brojnim pretkliničkim in-vivo modelima. Prinudna ekspresija CD137L na tumoru, na primer, dovodi do odbacivanja tumora (Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28(3):1116-1121). Slično tome, prinudna ekspresija anti-CD137 scFv na tumoru dovodi do CD4<+>T-ćelije i NK-ćelije u zavisnosti od tog tumora (Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8(4):343-348, Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5(1):149-155, Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67(5):2339-2344). Za sistemski primenjeno anti-CD137 antitelo je takođe utvrđeno da dovodi do retardacije rasta tumora (Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9(12):786-792).

[0006] Pokazano je da je CD137 odličan marker za tumorske reaktivne T ćelije koje se prirodno javljaju u humanim tumorima (Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20(1):44-55), i da anti-CD137 antitela mogu da se koriste za poboljšanje širenja i aktivnosti CD8+ melanoma tumor-infiltrirajućih limfocita za primenu u adoptivnoj T-ćelijskoj terapiji (Chacon, J. A. et al., PloS One 20138(4):e60031).

[0007] Pretkliničko utvrđivanje potencijalne terapijske koristi CD137 zajedničke stimulacije podstaklo razvoj terapijskih antitela koja ciljaju CD137, BMS-663513 (Jure-Kunkel, M. et al., US patent 7288638) i PF-05082566 (Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61(10):1721-1733); pri čemu su oba u ranoj fazi kliničkih ispitivanja.

[0008] Međutim, tek je nedavno procenjeno da bivalentno CD137-vezivo kao antitelo samo po sebi nije dovoljno za gomilanje CD137 na T-ćelijama ili NK-ćelijama i da dovodi do efikasne aktivacije, po analogiji sa nedostatkom aktivnosti trovalentnog rastvorljivog CD137L. U novijim publikacijama koje koriste pretkliničke mišje modele, in-vivo dokaz je pokazao da način delovanja drugih anti-TNFR antitela u suštini zahteva interakciju antitela preko njihovog Fc-dela sa Fc-gama receptorima na Fc-gamareceptorskim eksprimirajućim ćelijama (Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210(9):1685-1693, Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92(6):475-480). Načinom delovanja antitela koja su trenutno u kliničkom razvoju samim tim može dominirati neciljano gomilanje preko Fc-gama receptora koji mogu biti gotovo nasumično zavisni od prisustva Fc-γ-eksprimirajućih ćelija u blizini tumora.

[0009] Samim tim, postoji nezadovoljena potreba za stvaranjem terapeutika koji će gomilati i aktivirati CD137 sa specifičnim načinom delovanja koji cilja tumore.

[0010] Da bi se zadovoljila ova nezadovoljena potreba, ova prijava, obezbeđuje novi pristup simultanog uključivanja CD137 i tumorski antigen GPC3 preko fuzionog polipeptida sledećih svojstava:

(a) specifičnost vezivanja za CD137; i

(b) specifičnost vezivanja za GPC3;

[0011] Ovaj fuzioni polipeptid je dizajniran da obezbedi aktivaciju CD137 na limfocitima koja zavisi od ciljanog tumora, preko GPC3 eksprimiranog na tumorskim ćelijama. Za takav molekul se očekuje da dalje aktivira T-ćelije i/ili NK ćelije koje se nalaze u blizini GPC3-pozitivnog tumora. Takav bispecifik može pokazati poboljšane terapeutske efekte u odnosu ili na anti-GPC3 ili anti-CD137 antitela.

II. DEFINICIJE

[0012] Sledeća lista definiše pojmove, fraze, i skraćenice koji se koriste u ovoj specifikaciji. Predviđeno je da svi ovde navedeni i definisani pojmovi obuhvataju sve gramatičke oblike.

[0013] Kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, "CD137" označava humani CD137 i uključuje varijante, izoforme i homologe vrste Cd137. CD137 je takođe poznat kao "4-1BB" ili "član 9 superporodice faktora nekroze tumora (TNFRSF9)" ili "indukovan aktivacijom limfocita (ILA)". Humani CD137 označava protein pune dužine definisan UniProt Q07011, njegovim fragmentom, ili njegovom varijantom.

[0014] Kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, "GPC3" označava humani GPC3 i uključuje varijante, izoforme i homologe vrste humanog GPC3. GPC3 je takođe poznat kao "Glipikan-3, "glipikan proteoglikan 3," "GPC3, "OTTHUMP00000062492", "GTR2-2" "SGB," "DGSX", "SDYS", "SGBS", "OCI-5", i "SGBSI," koji se naizmenično koriste. Humani GPC3 označava protein pune dužine definisan UniProt P51654, njegov fragment, ili njegova varijanta. Kako se ovde koristi, "detektabilni afinitet" označava mogućnost vezivanja za izabrani cilj sa konstantom afiniteta generalno najmanje oko 10<-5>M ili manje. Niži afiniteti generalno ne mogu više da se mere uobičajenim postupcima kao što je ELISA i samim tim drugog značaja.

[0015] Kako se ovde koristi, "vezujući afinitet" proteina ovog otkrivanja (npr. mutein lipokalina) ili njegovog polipeptida za izabrani cilj (u ovom slučaju, CD137 i/ili GPC3), može da se izmeri (i samim tim određuju se KD vrednosti kompleksa mutein-ligand) jačinom postupaka poznatih stručnjacima. Takvi postupci uključuju, ali bez ograničenja na, fluorescentnu titraciju, kompetitivnu ELISA-u, kalorimetrijske postupke, kao što je kalorimetrija izotermalne titracije (ITC), i površinska rezonanca plazmona (BIAcore). Takvi postupci su dobro utvrđeni u tehnici i njihovi primeri su takođe detaljno opisani u nastavku.

[0016] Takođe je zabeleženo da na složenu formaciju između odgovarajućeg veziva i njegovog liganda utiču mnogi različiti faktori kao što su koncentracije odgovarajućih vezujućih partnera, prisustvo kompetitora, pH i jonska snaga sistema pufera koji se koristi, i eksperimentalni postupak koji se koristi za određivanje konstante disocijacije KD(na primer fluorescentna titracija, kompetitivna ELISA ili površinska rezonanca plazmona, tek da se nabroji nekoliko) ili čak matematički algoritam koji se koristi za procenu eksperimentalnih podataka.

[0017] Samim tim, stručnjaku je takođe jasno da KDvrednosti (konstanta disocijacije kompleksa formiranog između odgovarajućeg veziva i njegovog cilja/liganda) može da varira u okviru određenog eksperimentalnog opsega, u zavisnosti od postupka i eksperimentalnog podešavanja koje se koristi za određivanje afiniteta određenog lipokalinskog muteina za dati ligand. Ovo znači da može da postoji blago odstupanje kod izmerenih KDvrednosti ili opseg tolerancije u zavisnosti od, na primer, da li je KDvrednost određena površinskom rezonancom plazmona (Biacore), kompetitivnom ELISA-om, ili direktnom ELISA-om."

[0018] Kako se ovde koristi, "mutein," "mutirani" entitet (bilo protein ili nukleinska kiselina), ili "mutant" se odnosi na razmenu, deleciju, ili umetanje jednog ili više nukleotida ili aminokiselina, u odnosu na nukleinsku kiselinu koja se prirodno javlja (divljeg tipa) ili proteinsku “referentnu” osnovu. Pomenuti pojam takođe uključuje fragmente muteina i varijante kao što su ovde opisane. Lipokalinski muteini ovog pronalaska, njegovi fragmenti ili varijante poželjno zadržavaju funkciju vezivanje za CD137 i/ili GPC3 kao što je ovde opisano.

[0019] Pojam "fragment" kako se ovde koristi u vezi sa muteinima ovog otkrivanja se odnosi na proteine ili peptide izvedene iz lipokaina suze pune dužine zrelog čoveka ili humanog lipokaina 2 koji su N-terminalno i/ili C-terminalno skraćeni, tj. kojima nedostaje najmanje jedan N-terminal i/ili C-terminal aminokiseline. Takvi fragmenti mogu da uključuju najmanje 10, više kao što je 20 ili 30 ili više uzastopnih aminokiselina primarne sekvence zrelog lipokalina i obično mogu da se detektuju u imunološkoj probi zrelog lipokalina. Generalno, pojam "fragment", kako se ovde koristi u smislu odgovarajućeg proteinskog ligands CD137 i/ili GPC3 lipokalinskog muteina ovog otkrivanja ili kombinacije prema ovom otkrivanju ili ovde opisanog fuzionog proteina, se odnosi na N-terminalno i/ili C-terminalno skraćen protein ili peptidne ligande, koji zadržavaju sposobnost liganda pune dužine da budu prepoznati i/ili vezani muteinom prema ovom otkrivanju.

[0020] Pojam "mutageneza" kako se ovde koristi znači da su eksperimentalni uslovi izabrani tako da aminokiselina koja se javlja prirodno na položaju date sekvence zrelog lipokalina može biti supstituisana najmanje jednom aminokiselinom koja nije prisutna na ovom specifičnom položaju u odgovarajućoj prirodnoj polipeptidnoj sekvenci. Pojam "mutageneza" takođe uključuje (dodatnu) modifikaciju dužine segmenata delecijom ili umetanjem jedne ili više aminokiselina. Samim tim, u opsegu ovog otkrivanja je da, na primer, jedna aminokiselina na položaju odabrane sekvence bude zamenjena nizom tri nasumične mutacije, što dovodi do umetanja dva aminokiselinska ostatka u poređenju sa dužinom odgovarajućeg segmenta proteina divljeg tipa. Takvo umetanje ili delecija može nezavisno da se uvede u bilo koji od peptidnih segmenata koji mogu da budu podvrgnuti mutagenezi u ovom otkrivanju. U jednom primeru načina ostvarivanja ovog otkrivanja, umetanje nekoliko mutacija može da se uvede u petlju AB izabrane lipokalinske osnove (cf. Međunarodna patentna prijava WO 2005/019256).

[0021] Pojam "nasumična mutageneza" znači da nije prisutna nijedna prethodno odrađena aminokiselina (mutacija) na položaju određene sekvence već da najmanje dve aminokiseline mogu biti inkorporirane sa određenom verovatnoćom na prethodno definisanom položaju sekvence tokom mutageneze.

[0022] "Identitet" je svojstvo sekvenci da mere njihovu sličnost ili vezu. Pojam "identitet sekvence" ili "identitet" kako se koristi u ovom otkrivanju označava procenat upareno identičnih ostataka – nakon (homolognog) poravnanja sekvence polipeptida ovog otkrivanja sa predmetnom sekvencom – u smislu broja ostataka u dužoj od ove dve sekvence. Identitet sekvence se meri deljenjem broja identičnih aminokiselinskih ostataka ukupnim brojem ostataka i množenjem proizvoda sa 100.

[0023] Pojam "homologija" se ovde koristi u svom uobičajenom značenju i uključuje identične aminokiseline kao i aminokiseline za koje se smatra da su konzervativne supstitucije (na primer, razmena glutamatskog ostatka aspartatskim ostatkom) na jednakom položaju u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptida ovog otkrivanja (npr., bilo koji lipokalinski mutein ovog otkrivanja).

[0024] Procenat homolognosti sekvence ili identiteta sekvence može, na primer, biti određen ovde upotrebom programa BLASTP, verzija blastp 2.2.5 (16. novembra, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res.25, 3389-3402). U ovom načinu ostvarivanja procenat homologije je zasnovan na poravnanju čitavih polipeptidnih sekvenci (matrica: BLOSUM 62; troškovi praznine: 11.1; vrednost odsečka podešena na 10<-3>) uključujući propeptidne sekvence, poželjno upotrebom proteinske osnove divljeg tipa kao reference u poređenju parova. Računa se procenat brojeva "pozitivnih" (homolognih aminokiselina) označen kao rezultat u izlazu BLASTP programa podeljenom ukupnim brojem aminokiselina izabranih programom za poravnanje.

[0025] Konkretno, da bi se odredilo da li je aminokiselinski ostatak aminokiselinske sekvence lipokalina (mutein) različit od lipokalina divljeg tipa odgovara odgovarajućem položaju u aminokiselinskoj sekvenci lipokalina divljeg tipa, stručnjak iz oblasti može da koristi sredstva i postupke dobro poznate u ovoj oblasti, npr., poravnanja, ili ručno ili upotrebom računarskih programa kao što je BLAST2.0, što je oznaka za alat za pretraživanje osnovnih lokalnih poravnanja, ili ClustalW ili bilo kog drugog pogodnog programa koji je pogodan za stvaranje poravnanja sekvence. Shodno tome, lipokalin divljeg tipa može da služi kao "predmetna sekvenca" ili "referentna sekvenca", dok je aminokiselinska sekvenca lipokalina različita od lipokalin divljeg tipa ovde opisana služi kao "upitna sekvenca". Pojmovi "referentna sekvenca" i "sekvenca divljeg tipa" se ovde koriste naizmenično. Poželjan lipokalin divljeg tipa je prikazan u SEQ ID NO: 1 (Tlc) ili SEQ ID NO: 2 (NGAL), tim redom. U zavisnosti od toga da li je lipokalinski muteina ovog pronalaska baziran na Tlc ili NGAL, tim redom, odgovarajući lipokalin divljeg tipa može da se koristi kao referentna sekvenca ili sekvenca divljeg tipa.

[0026] "Praznine" su razmaci u poravnanju koje su rezultat dodavanja ili delecija aminokiselina. Stoga, dve kopije potpuno iste sekvence imaju 100% identitet, ali sekvence koje su manje očuvane, i imaju delecije, ili zamene, mogu da imaju niži stepen identiteta sekvence. Stručnjaci će prepoznati da je dostupno nekoliko računarskih programa za određivanje identiteta sekvence upotrebom standardnih parametara, na primer Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res.25, 3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215, 403-410), i Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol.147, 195-197).

[0027] Pojam "varijanta" kako se koristi u ovom otkrivanju se odnosi na derivate proteina ili peptida ili peptida koji uključuju modifikacije aminokiselinske sekvence, na primer supstitucijom, delecijom, umetanjem ili hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije u nekim načinima ostvarivanja ne smanjuju funkcionalnost proteina ili peptida. Takve varijante uključuju proteine, pri čemu je jedna ili više aminokiselina zamenjeno odgovarajućim D-steroizomerima ili aminokiselinama a da to nije 20 aminokiselina koje se prirodno javljaju, kao što su, na primer, ornitin, hidroksiprolin, citrulin, homoserin, hidroksilizin, norvalin. Ipak, takve supstitucije takođe mogu biti konzervativne, tj. aminokiselinski ostatak se zameni hemijski sličnim aminokiselinskim ostatkom. Primeri konzervativnih supstitucija su zamene među članovima sledećih grupa: 1) alanin, serin, i treonin; 2) asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; 3) asparagin i glutamin; 4) arginin i Lizin; 5) izoleucin, leucin, metionin, i valin; i 6) fenilalanin, tirozin, i triptofan. Pojam "varijanta", kako se ovde koristi u kontekstu odgovarajućeg proteinskog liganda CD137 i/ili GPC3 lipokalinskog muteina ovog otkrivanja ili kombinacije prema ovom otkrivanju ili ovde opisanog fuzionog proteina, se odnosi na CD137 ili njegov fragment, tim redom, koji ima jednu ili više kao što je 1, 2, 3, 4 ,5 ,6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili umetanja u poređenju CD137 ili GPC3 proteinom divljeg tipa, tim redom, kao što je CD137 ili GPC3 referentni protein kako je deponovan u UniProt kao što je ovde opisano. CD137 varijanta, tim redom, ima poželjno aminokiselinski identite od najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95% sa humanim CD137 ili GPC3 divljeg tipa, kao što je CD137 ili GPC3 referentni protein kako je deponovan u UniProt kao što je ovde opisano.

[0028] Pod lipokalinom "nativne sekvence" se misli na lipokalin koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao odgovarajući polipeptid izveden iz prirode. Stoga, lipokalin nativne sekvence može da ima aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg lipokalina koji se prirodno javlja iz bilo kog organizma, naročito sisara. Takav polipeptid nativne sekvence može da se izoluje iz priroda ili može da se proizvede rekombinantnim ili sintetičkim sredstvima. Pojam polipeptid "nativne sekvence" konkretno obuhvata okrnjene oblike koji se prirodno javljaju ili izabrane oblike lipokalina, oblike varijante koja se prirodno javlja kao što su alternativno splajsovani oblici i alelne varijante lipokalina koje se prirodno javljaju. Polipeptidna "varijanta" označava biološki aktivan polipeptid sa najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80% ili najmanje oko 85% identiteta aminokiselinske sekvence sa polipeptidom nativne sekvence. Takve varijante uključuju, na primer, polipeptide u kojima jedan ili više aminokiselinskih ostataka se dodaje ili briče na N- ili C- kraju polipeptida. Generalno, varijanta ima najmanje oko 70%, uključujući najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85% identiteta aminokiselinske sekvence, uključujući najmanje oko 90% identiteta aminokiselinske sekvence ili najmanje oko 95% identiteta aminokiselinske sekvence sa polipeptidom nativne sekvence. Kao ilustrativni primer, prva 4 N-terminalna aminokiselinska ostatka (His-His-Leu-Leu) i poslednja 2 C-terminalna aminokiselinska ostatka (Ser-Asp) mogu da se izbrišu u lipokalinskom (Tlc) muteinu iz suze ovog otkrivanja bez uticaja na biološku funkciju proteina. Pored toga, kao drugi ilustrativni primer, određeni aminokiselinski ostaci mogu da se izbrišu u lipokalinskom 2 (NGAL) muteinu ovog otkrivanja bez uticaja na biološku funkciju proteina, npr. (Lys-Asp-Pro, položaji 46-48).

[0029] Pojam "položaj" kada se koristi u skladu sa ovim otkrivanjem označava položaj ili aminokiseline unutar ovde prikazane aminokiselinske sekvence ili položaj nukleotida unutar ovde prikazane nukleinske sekvence. Da bi se razumeo pojam "odgovara" ili "koji odgovara" kako se ovde koristi u kontekstu položaja aminokiselinske sekvence jednog ili više lipokalinskih muteina, odgovarajući položaj ne određuje samo broj prethodnih nukleotida/aminokiselina. Shodno tome, položaj date aminokiseline u skladu sa ovim otkrivanjem koja može biti supstituisana može da varira usled delecije ili dodavanja aminokiseline bilo gde u (mutantu) lipokalina ili (divljeg tipa). Slično, položaj datog nukleotida prema ovom otkrivanju koji može biti supstituisan može da varira usled delecija ili dodatnih nukleotida bilo gde u muteinu ili 5'-netranslacionom regionu lipokalina divljeg tipa (UTR) uključujući promoter i/ili bilo koju drugu regulatornu sekvencu ili gen (uključujući eksone i introne).

[0030] Stoga, za odgovarajući položaj u skladu sa ovim otkrivanjem, poželjno je razumeti da položaji nukleotida/aminokiselina mogu da se razlikuju po naznačenom broju od sličnih susednih nukleotida/aminokiselina, ali su susedni nukleotidi/aminokiseline, koji mogu da se razmene, obrišu, ili dodaju, takođe obuhvaćeni jednim ili više odgovarajućih položaja.

[0031] Pored toga, za odgovarajući položaj u lipokalinskom muteinu baziranom na referentnoj strukturi prema ovom otkrivanju, poželjno je da se razume da položaji nukleotida/aminokiselina strukturno odgovaraju položajima bilo gde u (mutantnom) lipokalinu ili (divljeg tipa), čak i ako mogu da se razlikuju po naznačenom broju, kao što to procenjuju stručnjaci u smislu izuzetno očuvanog celokupnog modela savijanja među lipokalinima.

[0032] Reč "detektuju", "detekcije", "detektabilan" ili "koji detektuju" kako se ovde koriste se shvataju i u kvantitativnom i kvalitativnom smislu, kao i njihova kombinacija. To samim tim uključuje kvantitativna, polukvantitativna i kvalitativna merenja molekula od značaja.

[0033] "Subjekat" je kičmenjak, poželjno sisar, poželjnije čovek. Pojam "sisar" se ovde koristi da se označi blo koja životinja koja je klasifikovana kao sisar, uključujući, bez ograničenja, ljude, domaće i životinje sa farme, i zoološkog vrta, životinje za sport, ili kućne ljubimce, da se nabroje samo neke od njih kao ilustrativni primeri kao što su ovce, psi, mačke, krave, pacovi, svinje, gorile kao što su makaki majmuni i itd. Poželjno, u ovom tekstu sisar je čovek.

[0034] "Efektivna količina" je količina koja je dovoljna da se dobiju korisni ili željeni rezultati. Efektivna količina može da se primeni u jednom ili više davanja.

[0035] "Uzorak" je definisan kao biološki uzorak uzet od bilo kog subjekta. Biološki uzorci uključuju, ali bez ograničenja na, krv, serum, urin, feces, semenu tečnost, ili tkivo.

[0036] "Podjedinica" fuzionog polipeptida ovde otkrivenog je definisan kao niz aminokiselina polipeptida, pri čemu taj niz definiše jedinstvenu funkcionalnu jedinicu pomenutog polipeptida kao što obezbeđuje motiv vezivanja za cilj.

[0037] "Fuzioni polipeptid" kao što je ovde opisano obuhvata dve ili više podejdinica, pri čemu se najmanje jedna od tih podjedinica vezuje za GPC3 a dodatna podjedinica se vezuje za CD137. Unutar fuzionog polipeptida, ove podjedinice mogu biti povezane kovalentnom ili nekovalentnom vezom. Poželjno, fuzioni polipeptid je tranziciona fuzija između te dve ili više podjedinica. Translacione fuzije mogu da nastanu genetskim inženjeringom kodirajuće sekvence za jednu podjedinicu u okviru sa kodirajućom sekvencom dodatne podjedinice. Obe podjedinice mogu biti prošarane nukleotidnom sekvencom koja kodira linker. Ipak, podjedinice fuzionog polipeptida ovog otkrivanja takođe mogu biti pvoezane hemijskim linkerom.

[0038] "Linker" koji može da obuhvata fuzioni polipeptid ovog otkrivanja povezuje dve ili više podjedinica fuzionog polipeptida kao što je ovde opisano. Veza može biti kovalentna ili nekovalentna. Poželjna kovalentna veza je preko peptidne veze, kao što je peptidna veza između aminokiselina.

Shodno tome, u poželjnim načinima ostvarivanja pomenuti linker obuhvata jednu ili više aminokiselina, kao što su, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više aminokiselina. Poželjni linkeri su ovde opisani. Drugi poželjni linkeri su hemijski linkeri.

III. OPIS CRTEŽA

[0039]

Fig.1: obezbeđuje pregled dizajna fuzionih polipeptida opisanih u ovoj prijavi, koji su bispecifični u smislu ciljeva GPC3 i CD137. Korišćena su tri različita pristupa: na Fig.1(A) prvi skup fuzionih polipeptida je baziran na antitelu specifičnom za CD137 (na primer, antitelo SEQ ID NO: 34 i 35) i lipokalinskom muteinu specifičnom za GPC3 (na primer, lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10). Nastali polipeptidi predstavljaju pojedinačne fuzije lipokalinskog muteina sa jednim od četiri kraja antitela. Sve fuzije su povezane linkerom kao što je fleksibilni (G4S)3 linker (na primer, linker SEQ ID NO: 49); na Fig.1(B) drugi skup fuzionih polipeptida je baziran na dva lipokalinska muteina (na primer, GPC3-specifični lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10 i CD137-specifični lipokalinski mutein SEQ ID NO: 26), spojen sa konstruisanim IgG4-Fc fragmentom (SEQ ID NO: 73); i na Fig.1(C) treći skup fuzionih proteina je baziran na dva lipokalinska muteina (na primer, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 26), povezana jednim ili više linkera kao što su (G4S)2 linkeri (na primer, linkeri SEQ ID NO: 48), pri čemu je GPC3-specifični lipokalinski mutein spojen sa CD137-specifičnim lipokalinskim muteinom (na primer, u SEQ ID NO: 46) ili GPC3-specifičnim lipokalinskim muteinom i dva CD137-specifična lipokalinska muteina su spojena zajedno (na primer, u SEQ ID NO: 47).

Fig.2: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 i lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10 u odnosu na ciljani GPC3. GPC3 je obložen na mikrotitarskoj ploči i ispitivani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-humanog NGAL-specifičnog antitela kao što je opisano u primeru 2. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 1.

Fig.3: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i antitela SEQ ID NO: 34 i 35 u odnosu na ciljani CD137. Fc-fuzija humanog CD137 je obložena na mikrotitarskoj ploči, i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-humanog IgG Fc antitela kao što je opisano u primeru 3. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 2.

Fig.4: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena mogućnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 simultanog vezivanja oba cilja GPC3 i CD137. Rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein je obložen na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledila titracija fuzionog proteina. Nakon toga, dodata je konstantna koncentracija biotinilisanog humanog GPC3, koji je detektovan preko HRP-obeleženog ekstravidina kao što je opisano u primeru 4. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 3.

Fig.5: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određen afinitet fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 u odnosu na cilj GPC3 putem površinske rezonance plazmona (SPR). Biotinilisan GPC3 je imobilisan na senzorskom čipu, a vezivanje fuzionih polipeptida i lipokalinskog muteina je analizirana u različitim koncentracijama kao što je opisano u primeru 5. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 4.

Fig.6: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određen afinitet fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i antitela SEQ ID NO: 34 i 35 prema biotinilisanoj CD137-Fc fuziji putem površinske rezonance plazmona (SPR). Biotinilisan CD137-Fc je imobilisan na senzorskom čipu , a vezivanje fuzionih proteina je analizirano u različitim koncentracijama kao što je opisano u primeru 6. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 5.

Fig.7: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je specifičnost lipokalinskog muteina-Fc fuzioni polipeptidi SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 u odnosu na ciljani GPC3 je određen. GPC3 je obložen na mikrotitarskoj ploči i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-human NGAL-specifična antitelo kao što je opisano u primeru 7. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 6.

Fig.8: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 26 u odnosu na CD137. Fc-fuzija humanog CD137 je obložena na mikrotitarskoj ploči, i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-human IgG Fc antitela kao što je opisano u primeru 8. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 7.

Fig.9: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem mogućnost Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 da se vezuju za ciljeve, GPC3 i CD137, je

1

simultano određena. Rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein je obložen na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledila titracija lipokalinskog muteina-Fc fuzionih polipeptida. Nakon toga, konstantna koncentracija dodat je biotinilisani humani GPC3, koji je detektovan preko HRP-obeleženog ekstravidin kao što je opisano u primeru 9. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 8.

Fig.10: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem afinitet Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 u odnosu na cilj GPC3 je određen putem površinske rezonance plazmona (SPR). Biotinilisan GPC3 je imobilisan na senzorskom čipu a vezivanje fuzionih polipeptida i lipokalinskog muteina je analizirana u različitim koncentracijama. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 9.

Fig.11: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem afinitet Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 26 prema biotinilisani CD137-Fc je određen putem površinske rezonance plazmona (SPR). Biotinilisan CD137-Fc je imobilisan na senzorskom čipu a vezivanje fuzionih polipeptida i lipokalinskog muteina je analizirana u različitim koncentracijama. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 10.

Fig.12: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 53 i 54 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 u odnosu na ciljani GPC3. GPC3 je obložen na mikrotitarskoj ploči i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-humanog NGAL-specifičnog antitela kao što je opisano u primeru 12. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 11. Fig.13: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena mogućnost fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 53 i 54 da veže istovremeno oba cilja, GPC3 i CD137. Rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein je obložen na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledila titracija fuzionog proteina. Nakon toga, dodata je konstantna koncentracija biotinilisanog humanog GPC3, koji je detektovan preko HRP-obeleženog ekstravidin kao što je opisano u primeru 13. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu.

Fig.14: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost dva bispecifična polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 8 u odnosu na ciljani GPC3. GPC3 je obložen na mikrotitarskoj ploči i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog humanog NGAL-specifičnog antitela kao što je opisano u primeru 14. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 12.

Fig.15: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena specifičnost dva bispecifična polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 26 u odnosu na ciljani CD137. Fc-fuzija humanog CD137 je obložena na mikrotitarskoj ploči, i ispitani molekuli su titrirani. Vezani molekuli su detektovani preko HRP-obeleženog anti-humanog IgG Fc antitela kao što je opisano u primeru 15. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 13.

Fig.16: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određena mogućnost dva bispecifična polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 da se vezuju za ciljeve, GPC3 i CD137, simultano je određen. Rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein je obložen na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledila titracija fuzionog proteina. Nakon toga, dodata je konstantna koncentracija biotinilisanog humanog GPC3, koji je detektovan preko HRP-obeleženog ekstravidina kao što je opisano u primeru 16. Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1 sa EC50 vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 14.

Fig.17: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem afinitet dva bispecifična polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 i lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 8 u odnosu na cilj GPC3 je određen putem površinske rezonance plazmona (SPR). Biotinilisani GPC3 je imobilisan na senzorskom čipu i vezivanje fuzionih polipeptida je analizirano u različitim koncentracijama. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 15.

Fig.18: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je određen afinitet dva bispecifična polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 i lipokalinskog muteima SEQ ID NO: 26 prema CD137-Fc putem površinske rezonance plazmona (SPR). Humani CD137-Fc je imobilisan na senzorskom čipu , a vezivanje fuzionih proteina je analizirano u različitim koncentracijama. Dobijene KDvrednosti su date u tabeli 16.

Fig.19: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je ispitana mogućnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 da zajedno stimulišu odgovore T-ćelija kada su obloženi na plastičnoj posudi sa kulturom. Fuzioni polipeptidi u različitim koncentracijama su obloženi na plastičnom sudu zajedno sa anti-humanim CD3 antitelom i prečišćenim T-ćelijama su nakon toga inkubirani na obloženoj površini u prisustvu rastvorljivog antihumanog CD28 antitela. Nivoi supernatant interleukina 2 (IL-2) su izmereni ispitivanjem elektrohemiluminiscencije kao što je opisano u primeru 19. Kao negativna kontrola, korišćena je kontrola humanog IgG4 izotipa.

Fig.20: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je istražena mogućnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji je zavisan od GPC3-cilja. Kao kontrola, korišćeno je monospecifično, CD137-vezujuće antitelo SEQ ID NO: 34 i 35. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo (+) ili kontrola izotipa (-) su bili obloženi na plastičnoj posudi sa kulturom, i nakon toga GPC3-pozitivne HepG2 ćelije su kultivisane na posudi tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini u prisustvu 1 µg/mL bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 ili kontrolnog antitela SEQ ID NO: 34 i 35. Nivoi supernatant interleukina 2 (IL-2) su izmereni ispitivanjem elektrohemiluminiscencije kao što je opisano u primeru 20.

Fig.21: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je istražena mogućnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji je zavisan od GPC3-cilja. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo je oblagano na plastičnoj posudi sa kulturom, i nakon toga GPC3-pozitivne Hep3B-ćelije su kultivisane na posudi tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini u prisustvu raznih koncentracija bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 (A) i SEQ ID NO: 45 (C). Supernatant interleukin 2 (IL-2) su određeni ELISA. Za blokiranje vezivanja bispecifičnih fuzionih polipeptida za GPC3, eksperiment je takođe izveden u prisustvu viška SEQ ID NO: 10, i za SEQ ID NO: 44 (B) i SEQ ID NO: 45 (D). Podaci su uklopljeni sa modelom vezivanja 1:1.

Fig.22: obezbeđuje reprezentativni eksperiment u kojem je istražena mogućnost ispitivanih proizvoda da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija sa različitim ćelijskim linijama. Korišćene ćelijske linije su bile GPC3 pozitivne HepG2 i GPC3 negativne SKBR-3 i MCF7. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo je oblagano na plastičnoj posudi sa kulturom, a nakon toga je ispitivana ćelijska linija kultivisana na posudi tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini tri dana u prisustvu raznih koncentracija bispecifičnih fuzionih polipeptida na sledeći način: (A) SEQ ID NO: 44 (krugovi), SEQ ID NO: 45 (kvadratići) ili kontrolno antitelo trastuzumab (trouglovi). (B) Anti-CD137 antitelo SEQ ID NO: 74 i 75. Nivoi supernatant interleukina 2 su određeni ispitivanjem baziranim na elektrohemoluminiscenciji. Grafički prikazan relativni IL-2 odgovor odgovara odnosu odgovora dobijenih u prisustvu i odsustvu ("pozadini") ispitivanih proizvoda.

Fig.23: obezbeđuje rezultat in vitro ocene imunogenosti T ćelija bispecifičnih fuzionih polipeptida, kontrolnog antitela trastuzumab i pozitivne kontrolno hemocijanin vrtnog puža (KLH). Ispitivanje je izvedeno upotrebom formata baziranog na PBMC kao što je opisano u primeru 23, sa 32 davaoca i alotipova antigena humanog leukocita (HLA) koji predstavljaju distribuciju u globalnoj populaciji: (A) indeks stimulacije (proliferacija u prisustvu u odnosu na odsustvo ispitivanog proizvoda). Prosečni odgovori su naznačeni kao stupci. Prag koji definiše davaoca koji daje odgovor (indeks stimulacije > 2) je označen isprekidanom linijom. (B) Broj respondera.

Fig.24: obezbeđuje reprezentativni eksperiment o afinitetu polipeptida prema FcgRI, FcgRIII i FcRn kao što je opisano u primerima 24 i 25.

Fig.25: obezbeđuje rezultat farmakokinetičke analize bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 kod miševa. Mužjacima CD-1 miševa (3 miša po vremenskoj tački) su intravenski

1

ubrizgani fuzioni polipeptidi u dozi od 10mg/kg. Nivoi leka su detektovani pomoću sendvič ELISA-e koji detektuje puni bispecifični konstrukt putem ciljeva GPC3 i CD137. Podaci su uklopljeni upotrebom modela sa dva odeljka.

Fig.26: obezbeđuje rezultat farmakokinetičke analize bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 kod makaki majmuna. Mužjaci makaki majmuni su primali ispitivani proizvod u obliku intravenske infuzije u trajanju od 60 minuta u dozi od 3mg/kg. Nivoi leka su detektovani pomoću sendvič ELISA-e koje detektuje puni bispecifični konstrukt putem ciljeva GPC3 i CD137.

Podaci su uklopljeni upotrebom modela sa dva odeljka.

IV. DETALJAN OPIS OVOG OTKRIVANJA

[0040] Ovaj pronalazak definišu priloženi patentni zahtevi. Odnosi se na fuzioni protein kojeg karakteriše sposobnost fuzionog proteina da se vezuje i za CD137 i glipikan-3 (GPC3), i da taj fuzioni protein obuhvata najmanje dve podjedinice bilo kojim redom, pri čemu prva podjedinica obuhvata lipokalinski mutein specifičan za CD137 koji ima sekvencu najmanje 85% identičnu sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33, a druga podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, njegov antigenvezujući domen, ili lipokalinski mutein specifičan za GPC3.

[0041] U nekim načinima ostvarivanja, jedna podjedinica može biti povezana sa drugom podjedinicom kao što je suštinski opisano na Fig.1.

[0042] Na primer, jedan lipokalinski mutein može biti povezan, peptidnom vezom, sa C-krajem domena teškog lanca imunoglobulina (VH), N-krajem iz VH, C-krajem lakog lanca imunoglobulina (VL), i/ili N-krajem iz VL kao što je prikazano na Fig.1A. U nekim određenim načinima ostvarivanja, podjedinica lipokalinskog muteina može da se spoji na svom N-krajem i/ili svom C-krajem sa podjedinicom imunoglobulina. Na primer, lipokalinski mutein može biti povezan peptidnom vezom sa C-krajem konstantnog regiona teškog lanca (CH) i/ili C-krajem konstantnog regiona lakog lanca (CL) imunoglobulina. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, peptidna veza može biti linker, određenije nestrukturirani (G4S)3 linker, na primer, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49.

[0043] Kao drugi ilustrativni primer, jedan lipokalinski mutein može biti povezan, peptidnom vezom, sa C-krajem ili N-kraj Fc-fragmentom imunoglobulina kao što je prikazano na Fig.1B.

[0044] Kao dodatan primer, jedan lipokalinski mutein može biti povezan, peptidnom vezom, sa jednim ili više drugih lipokalinskih muteina, kao što je prikazano na Fig.1C.

[0045] U ovom smislu, jedna podjedinica može biti spojena na svom N-kraju i/ili svom C-kraju sa drugom podjedinicom. Na primer, kada jedna podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, druga podjedinica može biti povezana peptidnom vezom sa N-krajem druge podjedinice i C-krajem konstantnog regiona teškog lanca (CH) pomenutog imunoglobulina. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, treća podjedinica može biti povezana peptidnom vezom sa N-krajem trećeg domena vezivanja i C-krajem konstantnog regiona lakog lanca (CL) pomenutog imunoglobulina. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, peptidna veza može biti linker, određenije nestrukturirani (G4S)3 linker, na primer, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49, ili može biti nestrukturirani (G4S)2 linker, na primer, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 48.

[0046] U nekim načinima ostvarivanja, treća podjedinica je povezana sa prvom podjedinicom peptidnom vezom sa N-kraj lipokalinskog muteina treće podjedinice i C-krajem konstantnog regiona lakog lanca (CL) imunoglobulina prve podjedinice.

[0047] U nekim načinima ostvarivanja vezano za fuzioni polipeptid ovog otkrivanja, čija jedna podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, dok polipeptid istovremeno uključuje GPC3 i CD137, Fc funkcija Fc regiona imunoglobulina pune dužine sa pozitivnom ćelijom Fc receptora može istovremeno da se sačuva.

[0048] U nekim drugim načinima ostvarivanja vezano za fuzioni polipeptid ovog otkrivanja, čija jedna podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, dok polipeptid istovremeno uključuje GPC3 i CD137, Fc funkcija Fc regiona imunoglobulina pune dužine, tj. vezivanje za Fc gama ili pozitivne ćelije FcRn receptora, može biti smanjeno ili u potpunosti suzbijeno proteinskim inženjeringom. Ovo može da se postigne, na primer, korišćenjem srži koja pokazuje malu interakciju sa Fc-gama ili FcRn receptorima kao što je IgG2 ili IgG4. Kako bi se smanjilo rezidualno vezivanje za Fc-gama receptore, mutacije mogu da se uvedu u IgG srž kao što je F234A mutacija i/ili L235A mutacija. Pored toga, vezano za IgG4 srž, S228P mutacija može da se uvede kako bi se na minimum svela razmena IgG4 polu-antitela. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, dodatna N297A mutacija može biti prisutna u imunoglobulinskom teškom lancu fuzionog polipeptida kako bi se uklonio prirodni motiv glikosilacije.

[0049] U nekim načinima ostvarivanja, nastajući od simultanog vezivanja za GPC3 na tumorskim ćelijama i CD137 na površini ćelija efektora iz imunog sistema, kao što su T-ćelije ili NK ćelije, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu da ispolje aktivaciju ćelija efektora koje zavise od GPC3, pri čemu ćelija efektora imunog sistema aktivno lizuje GPC3-eksprimirajuću tumorsku ćeliju.

[0050] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid može da pokaže uporediv ili superioran nivo GPC3-zavisne CD137 aktivacije kao imunoglobulin uključen u takav fuzioni polipeptid, na primer, kada se meri u ispitivanju koje pokazuje širenje ciljno zavisnog tumor-infiltrirajućeg limfocita exvivo kao što je suštinski opisano kod Chacon, J. A. et al., PloS one 20138(4):e60031. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid može da demonstrira uporediv ili superioran nivo GPC3-zavisne CD137 aktivacije kao imunoglobulin uključen u takav fuzioni polipeptid, na primer, kada se meri u in-vivo modelu ksenotransplanta humanog hepatocelularnog karcinoma ("HCC"), melanoma, karcinoma Merkelovih ćelija, Vilmovog tumora, i hepatoblastoma, po analogiji sa onim što je suštinski opisano kod Kohrt, H. et al, J Clin Invest.2012 Mar;122(3):1066-75).

[0051] U nekim načinima ostvarivanja, Fc deo imunoglobulina uključen u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da doprinese održavanju nivoa seruma fuzionog polipeptida, kritične za njegovu stabilnost i postojanost u telu. Na primer, kada se Fc deo vezuje za Fc receptore na endotelijalnim

1

ćelijama i fagocitima, fuzioni polipeptid može da postane internalizovan i ponovo se vratiti u krvotok, čime se pojačava njegov poluživot u telu.

[0052] CD137-specifična podjedinica uključena u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja je lipokalinski mutein koji je specifičan za CD137, kao što je lipokalinski mutein SEQ ID NO: 26. Dodatna CD137-specifična podjedinica uključena u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može biti imunoglobulin pune dužine ili njegov antigen-vezujući domen koji je specifičan za CD137, kao što je monoklonalno antitelo (npr. antitelo SEQ ID NO: 34 i 35 ili antitelo SEQ ID NO: 51 i 52).

[0053] U nekim načinima ostvarivanja, GPC3-specifična podjedinica uključena u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može biti lipokalinski mutein koji je specifičan za GPC3, kao što je lipokalinski mutein SEQ ID NO: 8 ili lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10. U nekim načinima ostvarivanja, CD137-specifična podjedinica uključena u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može biti imunoglobulin pune dužine ili njegov antigenvezujući domen koji je specifičan za GPC3.

[0054] U nekim načinima ostvarivanja, u fuzionom polipeptidu ovog otkrivanja, CD137-specifična podjedinica je spojena sa GPC3-specifičnom podjedinicom.

[0055] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja ima dve GPC3-specifične podjedinice i jednu CD137-specifičnu podjedinicu. U nekim načinima ostvarivanja, te dve GPC3-specifične podjedinice su identične. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, te tri podjedinice su međusobno spojene kao što je strukturno prikazano na Fig.1A. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO od 36 i 37, 38 i 39, 40 i 41, ili 42 i 43.

[0056] U nekim drugim specifičnim načinima ostvarivanja, GPC3-specifična podjedinica obuhvata lipokalinski mutein, a CD137-specifična podjedinica obuhvata lipokalinski mutein. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, te dve podjedinice su međusobno spojene kao što je strukturno prikazano na Fig. 1C. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46.

[0057] U nekim dodatnim konkretnim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja ima dve CD137-specifične podjedinice i jednu GPC3-specifičnu podjedinicu. U nekim konkretnijim načinima ostvarivanja, GPC3-specifična podjedinica obuhvata lipokalinski mutein i CD137-specifične podjedinice od kojih svaka obuhvata lipokalinski mutein. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, te dve CD137-konkretne podjedinice su identične. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, te tri podjedinice su međusobno spojene kao što je strukturno prikazano na Fig.1C. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid obuhvata aminokiselinske sekvencu SEQ ID NO: 47.

[0058] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, u fuzionom polipeptidu ovog otkrivanja, GPC3-specifična podjedinica obuhvata a lipokalinski mutein, a CD137-specifična podjedinica obuhvata lipokalinski mutein, i te dve podjedinice su spojene sa FC-fragmentom imunoglobulina. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, te dve podjedinice su međusobno spojene sa Fc-fragmentom

1

imunoglobulina kao što je strukturno prikazano na Fig.1B. U nekim određenim načinima ostvarivanja, Fc fragment imunoglobulina je IgG4-Fc fragment. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, IgG4-Fc fragment je konstruisan da ima S228P mutaciju i da svede na minimum razmenu IgG4 poluantitela invitro i in-vivo. U nekim načinima ostvarivanja, IgG4-Fc fragment ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 45.

[0059] U nekim načinima ostvarivanja, imunoglobulin uključen u fuzioni polipeptid ovog otkrivanja ima IgG2 ili IgG4 srž. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja,IgG4 srž ima bilo koju od sledećih mutacija izabranu iz grupe koju čine S228P, N297A, F234A i L235A. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, IgG2 srž ima bilo koju od sledećih mutacija izabranu iz grupe koju čine N297A, F234A i L235A.

[0060] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid može da se vezuje za CD137 sa EC50 vrednošću od najmanje oko 5 nM ili čak manje, kao što je oko 1 nM ili manje, oko 0.6 nM ili manje, oko 0.5 nM ili manje, oko 0.4 nM ili manje, ili oko 0.3 nM ili manje, na primer, kada se polipeptid meri ELISA ispitivanjem suštinski kao što je opisano u primeru 3, primeru 8 ili primeru 15.

[0061] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da se vezuje za CD137 sa EC50 vrednošću najmanje dobrom kao ili većom od EC50 vrednosti lipokalinskog muteina specifične za CD137 kako je uključeno u takav fuzioni polipeptid, kao što je lipokalinski mutein SEQ ID NO: 26, ili antitelo specifično za CD137 kako je uključeno u takav fuzioni polipeptid, kao što je antitelo SEQ ID NO: 34 i 35 ili antitelo SEQ ID NO: 51 i 52, na primer, kada se pomenuti lipokalinski mutein ili antitelo i polipeptid mere u ELISA ispitivanju suštinski kao što je opisano u primeru 8 ili primeru 15.

[0062] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid može da se vezuje za CD137 sa afinitetom KDod najmanje oko 5 nM ili čak manje, kao što je oko 1 nM ili manje, oko 0.6 nM ili manje, oko 0.5 nM ili manje, oko 0.3 nM ili manje, oko 200 pM ili manje, oko 150 pM ili manje, oko 100 pM ili manje, ili oko 70 pM ili manje, ili oko 2 pM ili manje na primer, kada se meri analizom površinske rezonance plazmona (SPR) kao što je suštinski opisano u primeru 6, primeru 11, ili primeru 18.

[0063] U drugom aspektu, fuzioni polipeptid može da se vezuje za GPC3 sa EC50 vrednošću od najmanje oko 5 nM ili čak manje, kao što je oko 1 nM ili manje, oko 0.6 nM ili manje, oko 0.5 nM ili manje, oko 0.4 nM ili manje, oko 0.3 nM ili manje, ili oko 0.2 nM ili manje, na primer, kada se polipeptid meri ELISA ispitivanjem suštinski kao što je opisano u primeru 2, primeru 7, primeru 12 ili primeru 14.

[0064] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da se vezuje za GPC3 sa EC50 vrednošću uporedivom sa EC50 vrednošću lipokalinskog muteina specifičnom za GPC3 kako je uključeno u takav fuzioni polipeptid, kao što je lipokalinski mutein SEQ ID NO: 8 ili lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10, na primer, kada se pomenuti lipokalinski mutein i fuzioni polipeptid mere u ELISA ispitivanju suštinski kao što je opisano u primeru 7, primeru 12 ili primeru 14.

[0065] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid može da se vezuje za GPC3 sa afinitetom KDod najmanje oko 5 nM ili čak manje, kao što je oko 1 nM, oko 0.3 nM, oko 100 pM, oko 50 pM ili manje, oko

1

20 pM ili manje, ili oko 10 pM ili manje, na primer, kada se meri analizom površinske rezonance plazmona (SPR) kao što je suštinski opisano u primeru 5, primeru 10, ili primeru 17.

[0066] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja specifični za oba i CD137 i GPC3 mogu simultano da se vezuju i za CD137 i GPC3, na primer, kada se pomenuti fuzioni polipeptid meri u ELISA ispitivanju suštinski opisanom u primeru 4, primeru 9, primeru 13 ili primeru 16.

[0067] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja specifičan za oba i za CD137 i GPC3 mogu simultano da se vezuju i za CD137 i GPC3, sa EC50 vrednošću od najmanje oko 10 nM ili čak manje, kao što je oko 8 nM ili manje, oko 5 nM ili manje, oko 2.5 nM ili manje, oko 2 nM ili manje, ili oko 1.5 nM ili manje, na primer, na primer, kada se pomenuti fuzioni polipeptid meri u ELISA ispitivanju suštinski opisanom u primeru 4, primeru 9, primeru 13 ili primeru 16.

[0068] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja specifični za oba i za CD137 i GPC3 mogu zajedno da stimulišu odgovore T-ćelija u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 19. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu da indukuju proizvodnju IL-2 u prisustvu stimulacije T-ćelija u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 19 i mogu čak da demonstriraju tendenciju prema jačoj indukciji pri većoj koncentraciji oblaganja. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja ne indukuju proizvodnju IL-2 u odsustvu anti-CD3 stimulacije T-ćelija u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 19. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja specifični za oba i za CD137 i GPC3 mogu biti sposobni za zajedničko stimulisanje aktivacije T-ćelija stimulisanih anti-CD3 i anti-CD28 antitelima pri suboptimalnim koncentracijama u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 19.

[0069] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja specifični za oba i za CD137 i GPC3 mogu zajedno da stimulišu odgovore T-ćelija u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 20. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu da indukuju proizvodnju IL-2 u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u primeru 20. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu biti sposobni da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji je zavisan od GPC3 cilja u ispitivanju aktivacije funkcionalnih T-ćelija suštinski opisanom u

primeru 20.

A. Primeri imunoglobulina koji su uključeni u fuzione polipeptide.

[0070] U nekim načinima ostvarivanja, u smislu fuzionog polipeptida, prvi domen vezivanja obuhvata imunoglobulin pune dužine ili njegov antigen-vezujući domen specifičan za GPC3. Imunoglobulin, na primer, može biti IgG1, IgG2 ili IgG4. U dodatnim načinima ostvarivanja, imunoglobulin je monoklonalno antitelo u naspram GPC3. Ilustrativni primer GPC3-vezujućeg imunoglobulina je GC33 (Cancer Sci.2014 Apr; 105(4):455-62.). Ilustrativni primeri CD137-vezujućeg antitela su BMS-663513 (Jure-Kunkel, M. et

1

al., US patent 7288638) i PF-05082566 (Fisher, T. S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct;

61(10):1721-1733).

B. Primeri GPC3-specifičnih lipokalinskih muteina koji su uključeni u fuzione polipeptide.

[0071] Jedan aspekt ovog otkrivanja obezbeđuje lipokalinski mutein koji može da vezuje humani Glipikan-3 (GPC3) sa afinitetom merenim KD od oko 1 nM ili manje. Poželjnije, taj mutein može da ima afinitet meren KD od oko 1 nM ili 0.2 nM ili manje.

[0072] U drugom načinu ostvarivanja, otkrivanje se odnosi na lipokalinski mutein, pri čemu pomenuti mutein obuhvata na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence hNGAL (SEQ ID NO: 2) supstituciju, poželjno supstituciju kao što je ovde opisano.

[0073] U određenim načinima ostvarivanja, mutein ovog otkrivanja obuhvata najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20, ili čak više kao što su 21, 22, 23, 24, 25 i 26, supstitucije na položaju sekvence koji odgovara položaju sekvence 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2).

[0074] U dodatnim određenim načinima ostvarivanja, lipokalinski mutein prema trenutnom otkrivanju obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17. U drugom načinu ostvarivanja, taj mutein ima najmanje 70 % identiteta sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2). Poželjno, pomenuti mutein obuhvata 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20, ili čak više kao što je 21, 22, 23, 24, 25 i 26, ostaci mutiranih aminokiselinskih ostataka na položajima sekvence 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2).

[0075] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, kako bi se olakšala ekspresija u eukariotskim ćelijama, mesto prirodne N-glikosilacije Asn na položaju 65 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2) se uklanja na odgovarajući položaj sekvence lipokalinskog muteina prema trenutnom otkrivanju, na primer, mutacijom iz Asn u Asp na položaju 65. Dodatno, poželjno je da mesta N-glikozilacije (Asn-X-Ser/Thr) ne postoje na lipokalinskom muteinu prema trenutnom otkrivanju.

[0076] U nekim drugim načinima ostvarivanja, lipokalinski mutein prema trenutnom otkrivanju ne obuhvata mutaciju na položaju sekvence koji odgovara položaju sekvence 28 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2), na primer, da bi se dodatno optimizovala stabilnost.

[0077] U drugom načinu ostvarivanja, mutein ovog otkrivanja je antagonist GPC3.

[0078] Kako se ovde koristi, lipokalinski mutein ovog otkrivanja "specifično vezuje" cilj (ovde, GPC3) ako je u stanju da pravi razliku između tog cilja i više referentnih ciljeva, budući da specifičnost vezivanja nije apsolutno, već relativno svojstvo. "Specifično vezivanje" može da se odredi, na primer, prema Western blot-u, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-testovima, FACS, IHC i skeniranjima peptida.

[0079] Slično, u drugom aspektu, otkrivanje se odnosi na hNGAL mutein, pri čemu pomenuti mutein

1

obuhvata na jednom ili više položaja koji odgovaraju položaju 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, i/ili 134 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2) supstituciju, poželjno supstituciju kao što je ovde opisano.

[0080] U alternativnom aspektu, ovo otkrivanje se odnosi na polipeptid koji obuhvata hNGAL mutein, pri čemu taj hNGAL mutein obuhvata na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 ili čak više, kao što je 21, 22, 23, 24, 25 i 26, aminokiselinskim položajima koji odgovaraju položajima 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2) supstituciju, poželjno supstituciju kao što je ovde opisano.

[0081] Slično, otkrivanje se odnosi na lipokalinski mutein izveden iz hNGAL sa cilindričnim β-naboranim supersekundarnim strukturnim regionom koji obuhvata osam β –grana u paru povezanih sa četiri petlja na jednom kraju kako bi se time definisalo vezujući džep, pri čemu je najmanje jedna aminokiselina svake od najmanje četiri petlje mutirana i pri čemu je pomenuti lipokalin efektivan u vezivanju za GPC3 kao dati neprirodni cilj sa detektebilnim afinitetom. Poželjno, lipokalinski mutein obuhvata na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselinskom položaju(ima) koji odgovara aminokiselini na položaju 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence hNGAL (SEQ ID NO: 1) supstituciju, poželjno supstituciju kao što je ovde opisano. Ovo otkrivanje se takođe odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju ove proteine.

[0082] Uzimajući u obzir gore navedeno, stručnjak iz oblasti je samim tim u poziciji da odredi koji položaj aminokiseline mutiran u hNGAL kao što je ovde opisano odgovara aminokiselini osnove a da to nije hNGAL. Konkretno, stručnjak iz oblasti može da poravna aminokiselinsku sekvencu muteina kao što je ovde opisano, određenije hNGAL mutein ovog otkrivanja sa aminokiselinskom sekvencom različitog muteina da bi se odredilo koja aminokiselina(e) pomenutog muteina odgovara(ju) odgovarajućoj aminokiselini(ama) aminokiselinske sekvence pomenutog različitog lipokaina. Konkretnije, stručnjak iz oblasti samim tim može da odredi koja aminokiselina aminokiselinske sekvence pomenutog različitog lipokaina odgovara aminokiselini na položaju(ima) 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence hNGAL (SEQ ID NO: 2).

[0083] Proteini ovog otkrivanja, koji su usmereni protiv ili koji su specifični za GPC3, uključuju bilo koji broj specifično-vezujućih proteinskih muteina koji su bazirani na definisanoj proteinskoj osnovi. Kako se ovde koristi, "mutein," "mutirani" entitet (bilo da je to protein ili nukleinska kiselina) ili "mutant" odnosi se na razmenu, deleciju, ili umetanje jednog ili više nukleotida ili aminokiselina, tim redom, u poređenju sa nukleinskom kiselinom koja se prirodno javlja (divljeg tipa) ili proteinskom “referentnom” osnovom. Poželjno, broj nukleotida ili aminokiselina, tim redom, koji je razmenjen, obrisan ili umetnut je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili čak više kao što je 21, 22, 23, 24, 25 i 26.

2

Međutim, poželjno je da mutein ovog otkrivanja i dalje može da se vezuje za GPC3.

[0084] U nekim poželjnim načinima ostvarivanja, mutein prema ovom otkrivanju vezuje humani ili mišji GPC3 sa KDod oko 1 nM ili manje, uključujući 0.5 nM ili manje, 0.3 nM ili manje, i ili 0.2 nM ili manje. Mutein ovog otkrivanja može konkretno da vezuje jedan ili više kontinuiranih, isprekidanih ili konformacionih epitopa zrelog, uvijenog bioaktivnog oblika GPC3.

[0085] Afinitet vezivanja proteina ovog otkrivanja (npr. mutein lipokalina) za izabrani cilj (u ovom slučaju, GPC3), može da se izmeri (i samim tim KDvrednosti kompleksa mutein-ligand može da se odredi) većim brojem postupaka poznatih stručnjacima. Takvi postupci uključuju, ali bez ograničenja na, fluorescentnu titraciju, kompetitivnu ELISA, kalorimetrijske postupke, kao što je kalorimetrija izotermalne titracije (ITC), i površinsku rezonancu plazmona (BIAcore). Takvi postupci su dobro utvrđeni i njihovi primeri su takođe detaljno opisani u nastavku.

[0086] Aminokiselinska sekvenca muteina ovog otkrivanja može da ima visok identitet sekvence sa zrelim humanim lipokalinom 2. U ovom kontekstu, protein ovog otkrivanja može da ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 82%, najmanje 85%, najmanje 87%, najmanje 90% identiteta, uključujući najmanje 95% identiteta sa proteinom izabranim iz grupe koju čine sekvenca SEQ ID NO: 2 tako da mutein aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17.

[0087] Otkrivanje takođe uključuje strukturne homologe proteina izabrane iz grupe koju čine sekvenca SEQ ID NO: 4-17, koji imaju homologiju aminokiselinske sekvence ili identitet sekvence više od oko 60%, poželjno više od 65%, više od 70%, više od 75%, više od 80%, više od 85%, više od 90%, više od 92 % i najpoželjnije više od 95%.

[0088] U skladu sa gorenavedenim, mutein ovog otkrivanja poželjno dejstvuje kao antagonist GPC3. U nekim načinima ostvarivanja, mutein ovog otkrivanja može da dejstvuje kao antagonist GPC3 inhibiranjem mogućnosti GPC3 molekula da vezuje ili da na drugi način stupa u interakciju sa svojim kognatnim ligandom.

[0089] Opet u drugom aspektu, ovo otkrivanje uključuje muteine humanog lipokalina 2 koju specifično vezuju GPC3. U ovom smislu, GPC3 može da se posmatra kao neprirodni ligand humanog lipokalina 2 divljeg tipa, gde se "neprirodni ligand" odnosi na jedinjenje koje se ne vezuje za humani Lipokalin 2 u fiziološkim uslovima. Konstruisanjem lipokalina divljeg tipa kao što je humani lipokalin 2 sa mutacijama na određenim položajima, pronalazači ovog pronalaska su pokazali da afinitet i velika specifičnost za neprirodni ligand jeste moguća. U jednom aspektu najmanje na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, i/ili 20 nukleotidnih tripleta koji kodiraju za bilo koji od položaja na sekvenci 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina 2 (SEQ ID NO: 2), nasumična mutageneza može da se izvede čime se omogućava supstitucija na ovim položajima podskupom nukleotidnih tripleta.

[0090] Dalje, lipokalini mogu da se koriste za stvaranje muteina koji imaju mutirani aminokiselinski ostatak na bilo kojoj ili više, uključujući najmanje na bilo koje dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset, položaja sekvenci koji odgovaraju položajima sekvenci 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 i/ili 175 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog Lipokalin 2 (SEQ ID NO: 2).

[0091] Supstitucija na položaju sekvence 36 može na primer biti supstitucija Leu 36 → Val ili Arg.

Supstitucija na položaju sekvence 40 može na primer biti supstitucija Ala 40 → Leu, Val ili Gly.

Supstitucija na položaju sekvence 41 može na primer biti supstitucija Ile 41 → Leu, Arg, Met, Gly ili Ala. Supstitucija na položaju sekvence 49 može na primer biti supstitucija Gln 49 → Pro ili Leu. Supstitucija na položaju sekvence 52 može na primer biti supstitucija Tyr 52 → Arg ili Trp. Supstitucija na položaju sekvence 68 može na primer biti supstitucija Asn 65 → Asp. Supstitucija na položaju sekvence 68 može na primer biti supstitucija Ser 68 → Val, Gly, Asn ili Ala. Supstitucija na položaju sekvence 70 može na primer biti supstitucija Leu 70 → Arg, Ser, Ala ili Val. Supstitucija na položaju sekvence 72 može na primer biti supstitucija Arg 72 → Asp, Trp, Ala, ili Gly. Supstitucija na položaju sekvence 73 može na primer biti supstitucija Lys 73 → Gly, Arg, Asn, Glu ili Ser. Supstitucija na položaju sekvence 76 može na primer biti supstitucija Cys 76 → Val ili Ile. Supstitucija na položaju sekvence 77 može na primer biti supstitucija Asp 77 → His, Met, Val, Leu, Thr ili Lys. Supstitucija na položaju sekvence 79 može na primer biti supstitucija Trp 79 → Lys, Ser li Thr. Supstitucija na položaju sekvence 81 može na primer biti supstitucija Arg 81 → Gly. Supstitucija na položaju sekvence 81 može na primer biti supstitucija Cys 87 → Ser. Supstitucija na položaju sekvence 96 može na primer biti supstitucija Asn 96 → Arg, Asp, Gln ili Pro. Supstitucija na položaju sekvence 100 može na primer biti supstitucija Tyr 100 → Gly, Glu, Pro ili Gln. Supstitucija na položaju sekvence 103 može na primer biti supstitucija Leu 103 → Glu, Gln, Asn, Gly, Ser ili Tyr. Supstitucija na položaju sekvence 106 može na primer biti supstitucija Ser 105 → Ala. Supstitucija na položaju sekvence 106 može na primer biti supstitucija Tyr 106 → Asn, Ser ili Thr. Supstitucija na položaju sekvence 125 može na primer biti supstitucija Lys 125 → Glu. Supstitucija na položaju sekvence 127 može na primer biti supstitucija Ser 127 → Arg ili Tyr. Supstitucija na položaju sekvence 132 može na primer biti supstitucija Tyr 132 → Trp ili Ile. Supstitucija na položaju sekvence 134 može na primer biti supstitucija Lys 134 → Ala ili Phe. Supstitucija na položaju sekvence 134 može na primer biti supstitucija Thr 136 → Ile. Supstitucija na položaju sekvence 175 može na primer biti supstitucija Cys 175 → Ala. Važno je napomenuti da bilo koja od aminokiselina koja supstituiše odgovarajuću aminokiselinu u referentnoj sekvenci može da se zameni odgovarajućom aminokiselinom. Određenije, konzervativne supstitucije su zamene među članovima sledećih grupa: 1) alanin, serin, i treonin; 2) asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; 3) asparagin i glutamin; 4) arginin i lizin; 5) izoleucin, leucin, metionin, i valin; i 6) fenilalanin, tirozin, i triptofan.

[0092] U jednom načinu ostvarivanja, mutein ovog otkrivanja, koji se vezuje za GPC3 uključuje sledeće aminokiselinske zamene:

(a) Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Ala; (b) Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe; (c) Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe;

(d) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(e) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(f) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(g) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(h) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(i) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe;

(j) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Cys 76 → Val; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Thr; Arg 81 → Gly; Cys

2

87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Cys 175 → Ala;

(k) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala; ili

(l) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala.

[0093] Numerisanje je poželjno u vezi sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2). S tim u vezi, imajući u vidu učenje ovog otkrivanja, stručnjak iz oblasti lako može da odredi koje aminokiseline u poželjnoj referentnoj sekvenci zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2) odgovaraju onim prethodno opisanim u (a) do (I); tako da navedene aminokiseline mutiraju u referentnoj sekvenci.

C. Primerni CD137-specifični lipokalinski muteini koji su uključeni u fuzione polipeptide.

[0094] Ovo otkrivanje obezbeđuje humane lipokalinske muteine koji vezuju CD137 i njihove korisne primene i koji imaju najmanje 85% identiteta sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33. Otkrivanje takođe obezbeđuje postupke pravljenja ovde opisanih CD137 vezujućih proteina kao i kompoziciju koja obuhvata takve proteine. CD137 vezujući proteini ovog otkrivanja kao i njihove kompozicije mogu da se koriste u postupcima detektovanja CD137 u uzorku ili u postupcima vezivanja CD137 kod subjekta. Takvi humani lipokalinski muteini sa svojstvima povezanim sa upotrebama iz ovog otkrivanja nisu prethodno opisani.

[0095] Drugi način ostvarivanja ovog otkrivanja obezbeđuje lipokalinski mutein koji može da aktivira nishodne signalne puteve CD137 vezivanjem za CD137.

[0096] U jednom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje CD137-vezujuće humane lipokalinske muteine iz suza.

[0097] U ovom smislu, otkrivanje obezbeđuje jedan ili više Tlc muteina koji mogu da se vezuju za CD137 sa afinitetom merenim KD od oko 300 nM ili manje i čak oko 100 nM ili manje.

[0098] U nekim načinima ostvarivanja, takav Tlc mutein obuhvata mutirani aminokiselinski ostatak na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 i 153 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza (SEQ ID NO: 1).

[0099] U nekim određenim načinima ostvarivanja, takav Tlc mutein može da sadrži mutirani aminokiselinski ostatak na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza.

[0100] U dodatnim određenim načinima ostvarivanja, takav Tlc mutein može dodatno da obuhvata mutirani aminokiselinski ostatak na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 101, 111, 114 i 153 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza.

[0101] U drugim određenim načinima ostvarivanja, Tlc može da sadrži mutirani aminokiselinski ostatak na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 i 153 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza.

[0102] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, Tlc mutein može da obuhvata najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ili čak više, ostatke mutiranih aminokiselina na jednom ili više položaja sekvence koji odgovaraju položajima sekvence 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 i 153 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza i pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za CD137, u određenom humanom CD137.

[0103] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, otkrivanje se odnosi na polipeptid, pri čemu je pomenuti polipeptid Tlc mutein, u poređenju sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog humanog lipokalina iz suza, koja obuhvata najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili čak više, ostaci mutiranih aminokiselina na položajima sekvence 526-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 i 108 i pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za CD137, u određenom humanom CD137.

[0104] U nekim načinima ostvarivanja, lipokalinski mutein prema ovom otkrivanju može da obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju nativnog cisteinskog ostatka npr. serinskim ostatkom. U nekim načinima ostvarivanja, Tlc mutein prema ovom otkrivanju uključuje aminokiselinsku supstituciju nativnog cisteinskog ostatka na položajima 61 i/ili 153 drugom aminokiselinom kao što je serinski ostatak. U ovom kontekstu bi trebalo da se ima u vidu da je otkriveno da uklanjanje strukturne disulfidne veze (na nivou odgovarajuće biblioteke naivnih nukleinskih kiselina) lipokaina divljeg tipa iz suza koji nastaje od cisteinskih ostataka 61 i 153 (cf. Breustedt, et al., 2005, supra) može da obezbedi lipokalinskemuteine iz suza koji ne samo da su satbilno savijeni već takođe mogu da vezuju neprirodni ligand sa velikim afinitetom. U nekim određenim načinima ostvarivanja, Tlc mutein prema ovom otkrivanju uključuje aminokiselinske supstitucije Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro ili Trp i Cys 153 → Ser ili Ala. Takva supstitucija se pokazala korisnom u sprečavanju formiranja disulfidnog mosta koji se prirodno javlja koji povezuje Cys 61 i Cys 153, i samim tim olakšava rukovanje muteinom. Međutim, lipokalinski muteini iz suza koji vezuju CD137 i koji imaju disulfidni most obrazovan između Cys 61 i Cys 153 su takođe deo ovog otkrivanja.

[0105] U nekim načinima ostvarivanja, eliminacija strukturne disuldne veze može da obezbedi dodatnu prednost čime se omogućava (spontano) stvaranje ili namerno uvođenje neprirodnih površnih disulfidnih veza u mutein ovog otkrivanja, čime se povećava stabilnost muteina. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, ili dva ili sva tri cisteinska kodona na položaju 61, 101 i 153 su zamenjena kodonom druge aminokiseline. Dalje, u nekim načinima ostvarivanja, Tlc mutein prema ovom otkrivanju

2

uključuje aminokiselinsku supstituciju nativnog cisteinskog ostatka na položaju 101 serinskim ostatkom ili histidinskim ostatkom.

[0106] U nekim načinima ostvarivanja, mutein prema ovom otkrivanju uključuje aminokiselinsku supstituciju nativne aminokiseline cisteinskim ostatkom na položajima 28 ili 105 u odnosu na aminokiselinsku sekvencu zrelog humanog lipokalina iz suza.

[0107] Dalje, u nekim načinima ostvarivanja, mutein prema ovom otkrivanju uključuje aminokiselinsku supstituciju nativnog argininskog ostatka na položajima 111 prolinskim ostatkom. Dalje, u nekim načinima ostvarivanja, mutein prema ovom otkrivanju uključuje aminokiselinsku supstituciju nativnog lizinskog ostatka na položajima 114 triptofanskim ostatkom ili glutaminskom kiselinom.

[0108] U nekim načinima ostvarivanja, CD137-vezujućeg Tlc muteina prema ovom otkrivanju uključuje, na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 i 153 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza (SEQ ID NO: 1), jedan ili više sledećih ostataka mutiranih aminokiselina: Ala 5 → Val ili Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg ili Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg ili Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile i Cys 153 → Ser. U nekim načinima ostvarivanja, Tlc mutein prema ovom otkrivanju uključuje dva ili više, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, čak više kao što je 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ili sve ostatke mutiranih aminokiselina na ovim položajima sekvence zrelog humanog lipokalina iz suza.

[0109] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, Tlc mutein koji vezuje CD137 uključuje jedan od sledećih skupova aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog humanog lipokalina iz suza:

1. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Cys 153 → Ser;

2. Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;

3. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser;

2

4. Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;

5. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro;

6. Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro; ili

7. Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; Cys 153 → Ser; 157 → Pro.

[0110] U regionu ostataka, tj. regionu koji se razlikuje od položaja sekvenci 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 i 153, Tlc mutein ovog otkrivanja može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa (prirodnu) van položaja mutiranih aminokiselinskih sekvenci.

[0111] U dodatnim načinima ostvarivanja, Tlc mutein prema trenutnom otkrivanju ima najmanje 70% identiteta sekvence ili najmanje 70% homolognost sekvence sa sekvencom zrelog humanog lipokalina iz suza (SEQ ID NO: 1).

[0112] Tlc mutein prema ovom otkrivanju može da se dobije mutagenezom oblika koji se prirodno javlja humanog lipokalina iz suza. U nekim načinima ostvarivanja mutageneze, supstitucija (ili zamena) je konzervativna supstitucija. I pored toga, bilo koja supstitucija - uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više primernih supstitucija iz nastavka – je predviđena sve dok lipokalinski mutein zadržava svoju sposobnost da vezuje CD137, i/ili ima identitet sekvence supstituisane sekvence koji je najmanje 60%, kao što je najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% ili više identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom zrelog humanog lipokalina iz suza (SWISS-PROT Data Bank Accession Number P31025).

[0113] U drugom aspektu, ovo otkrivanje se odnosi na nove, specifično-vezujuće hNGAL muteine usmerene protiv ili specifične za CD137.

[0114] U ovom smislu, otkrivanje obezbeđuje jedan ili više hNGAL muteina koji mogu da vezuju CD137 sa afinitetom merenim KD od 200 nM ili manje, oko 140 nM ili manje, oko 50 nM ili manje, i čak oko 10 nM ili manje. Poželjnije, hNGAL muteini mogu da imaju afinitet meren KD od oko 5 nM ili manje.

2

[0115] U nekim načinima ostvarivanja, hNGAL mutein ovog otkrivanja uključuje na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2) supstitucija.

[0116] U određenim načinima ostvarivanja, lipokalinski mutein ovog otkrivanja obuhvata najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ili čak više, supstitucijana položaju sekvence koji odgovara položaju sekvence 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188; SEQ ID NO: 2). Poželjno, predviđeno je da se otkrivanje odnosi na lipokalinski mutein koji obuhvata, pored jedne ili više supstitucije na položajima koji odgovaraju položajima 36, 87 i/ili 96 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog NGAL, na jednom ili više položaja koji odgovaraju položajima 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL supstitucija.

[0117] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, otkrivanje se odnosi na polipeptid, pri čemu je pomenuti polipeptid hNGAL mutein, u poređenju sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog hNGAL (SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188; SEQ ID NO: 2), koji obuhvata najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ili čak više, ostataka mutiranih aminokiselina na položajima sekvence 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134, I pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za CD137, u određenom humanom CD137.

[0118] U nekim načinima ostvarivanja, CD137-vezujući NGAL mutein ovog otkrivanja uključuje, na bilo kom ili više položaja sekvence 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134 linearne polipeptidne sekvence zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2), jedan ili više sledećih ostataka mutiranih aminokiselina: Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg ili Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser ili Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala ili Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser ili Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr ili Asn; Trp 79 → Ala ili Asp; Arg 81 → Met, Trp ili Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu i Lys 134 → Tyr.

[0119] U nekim načinima ostvarivanja, hNGAL mutein ovog otkrivanja uključuje dva ili više, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, čak više kao što je 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili sve ostatke mutiranih aminokiselina na ovim položajima sekvence zrelog hNGAL.

[0120] U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, hNGAL mutein ovog otkrivanja, koji se vezuje za CD137 uključuje sledeće aminokiselinske zamene u poređenju sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog hNGAL:

(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn

2

96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr;

(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr; ili

(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; Lys 134 → Tyr.

[0121] U regionu ostataka, tj. regionu koji se razlikuje od položaja sekvenci 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 i 134, hNGAL mutein ovog otkrivanja

2

može da obuhvata aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa (prirodnu) izvan položaja mutirane aminokiselinske sekvence.

[0122] U drugom načinu ostvarivanja, hNGAL mutein ima najmanje 70 % ili čak više identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom zrelog humanog lipokalina 2 (SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188).

[0123] U dodatnim određenim načinima ostvarivanja, CD137-vezujući lipokalinski mutein prema trenutnom otkrivanju obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33 ili njen fragment ili varijanta.

[0124] Aminokiselinska sekvenca CD137-vezujućeg lipokalinskog muteina ovog otkrivanja ima visok identitet sekvence od najmanje 85%, najmanje 87%, najmanje 90% identiteta, uključujući najmanje 95% identiteta, sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33.

D. Primeri upotrebe, primene i proizvodnja fuzionih polipeptida.

[0125] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu da proizvode sinergijski efekat putem dvostrukog ciljanja CD137 i GPC3.

[0126] Brojne moguće primene za fuzione polipeptide ovog otkrivanja, samim tim, postoje u medicini.

[0127] U jednom aspektu, otkrivanje se odnosi na upotrebu ovde otkrivenih fuzionih polipeptida za detektovanje CD137 i GPC3 u uzorku kao i odgovarajući postupak dijagnoze.

[0128] U drugom aspektu, otkrivanje karakteriše upotreba jednog ili više ovde otkrivenih fuzionih polipeptida ili jedne ili više kompozicija koje obuhvataju takve polipeptide za istovremeno vezivanje CD137 i GPC3.

[0129] Ovo otkrivanje takođe uključuje upotrebu jednog ili više fuzionih polipeptida kako je opisano za kompleksno formiranje sa CD137 i GPC3.

[0130] Samim tim, u daljem aspektu ovog otkrivanja, otkriveni jedan ili više fuzionih polipeptida se koriste za detekciju CD137 i GPC3. Takva upotreba može da obuhvata faze stupanja u kontakt sa jednim ili više pomenutih fuzionih polipeptida, u odgovarajućim uslovima, sa uzorkom za koji postoji sumnja da sadrži CD137 i GPC3, čime se omogućava formiranje kompleksa između fuzionih polipeptida i CD137 i GPC3, i detektovanje kompleksa odgovarajućim signalom. Detektabilni signal može da uzrokuje etiketa, kao što je prethodno opisano, ili promena fizičkih svojstava usled vezivanja, tj. stvaranja samog kompleksa. Jedan primer je površinska rezonanca plazmona, čija se vrednost menja tokom vezivanja vezujućih partnera od kojih je jedan imobilisan na površini kao što je zlatna folija.

[0131] Ovde otkriveni fuzioni polipeptidi takođe mogu da se koriste za razdvajanje CD137 i GPC3. Takva upotreba može da obuhvata faze stupanja u kontakt jednog ili više pomenutih fuzionih polipeptida, u odgovarajućim uslovima, sa uzorkom za koji se pretpostavlja da sadrži CD137 i GPC3, čime se omogućava formiranje kompleks između fuzionih polipeptida i CD137 i GPC3, i razdvajanje kompleksa od uzorka.

[0132] Opet u drugom aspektu, ovo otkrivanje karakteriše dijagnostički ili analitički komplet koji obuhvata fuzioni polipeptid prema ovom otkrivanju.

[0133] Pored njihove upotrebe u dijagnostici, opet u drugom aspektu, otkrivanje uzima u razmatranje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata fuzioni polipeptid ovog otkrivanja i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0134] Dodatno, ovo otkrivanje obezbeđuje fuzione polipeptide koji istovremeno vezuju CD137 i GPC3 za upotrebu u obliku anti-kancerskih agenasa i imunoloških modulatora. Kao takav fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja su predviđeni da se koriste u postupku lečenja ili sprečavanja humanih bolesti kao što su različiti tumori uključujući hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i hepatoblastom. Shodno tome, takođe su obezbeđene upotrebe za lečenje ili sprečavanje humanih oboljenja kao što su različiti tumori uključujući hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i hepatoblastom kod subjekta kojem je to potrebno, koje obuhvataju davanje pomenutom subjektu terapeutski efektivne količine jednog ili više fuzionih polipeptida ovog otkrivanja.

[0135] Istovremenim ciljanjem tumorskih ćelija gde se eksprimira GPC3, kao što je hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom, i aktiviranjem ćelija prirodnih ubica (NK) u urođenom imunom sistemu domaćina u blizini takvih tumorskih ćelija ili T-ćelija adaptivnog imunog sistema, pri čemu fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da poveća aktivnost ciljanih anti-tumorskih limfocitnih ćelija, pojača anti-tumorski imunitet i, u isto vreme, ima direktan inhibirjaući efekat na rast tumora, čime se proizvode sinergijski anti-tumorski rezultati. Pored toga, lokalnim inhibiranjem onkogenske aktivnosti i indukovanjem citotoksičnosti posredovanje ćelijama od strane NK ćelija i/ili T-ćelija, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da smanji neželjena dejstva efektorskih limfocita prema zdravim ćelijama, tj. toksičnost van cilja.

[0136] Kod T-ćelija signaliziranje posredovano CD137 dovodi do biranja članova TRAF porodice i aktivacije nekoliko kinaza, uključujući ASK-1, MKK, MAPK3/MAPK4, p38, i JNK/SAPK. Aktivacija kinaze je zatim praćena aktivacijom i nuklearnom translokacijom nekoliko transkripcionih faktora, uključujući ATF-2, Jun, i NF-κB. Pored povećavanja suboptimalne ploriferacije indukovane TCR-om, signaliziranje posredovano CD137 štiti T ćelije, a naročito, CD8+T ćelije od ćelijske smrti indukovane aktivacijom (AICD).

[0137] Ovo otkrivanje obuhvata upotrebu fuzionog polipeptida ovog otkrivanja ili kompoziciju koja obuhvata takav fuzioni polipeptid za zajedničko stimulisanje T-ćelija, i/ili aktiviranje nishodnih signalnih puteva CD137 prilikom uključivanja tumorskih ćelija u kojima se GPC3 eksprimira kao što je hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom.

[0138] Ovo otkrivanje takođe karakteriše postupak zajedničkog stimulisanja T-ćelije i/ili aktiviranje nishodnih signalnih puteva CD137 prilikom uključivanja tumorskih ćelija u kojima se eksprimira GPC3,

1

kao što je hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom, koji obuhvata primenu jednog ili više fuzionih polipeptida ovog otkrivanja ili jedne ili više kompozicija koje obuhvataju takve fuzione polipeptide.

[0139] Dodatno, ovo otkrivanje uključuje postupak aktiviranja nishodnih signalnih puteva CD137 prilikom ukljućivanja tumorskih ćelija u kojima se eksprimira GPC3, hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom, koji obuhvata davanje jednog ili više fuzionih polipeptida ovog otkrivanja ili jedne ili više kompozicija koja obuhvata takve fuzione polipeptide.

[0140] Ovo otkrivanje takođe uzima u razmatranje postupak indukovanja proliferacije T limfocita prilikom ukljućivanja tumorskih ćelija u kojima se eksprimira GPC3, hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom, koji obuhvata davanje jednog ili više fuzionih polipeptida ovog otkrivanja ili jedne ili više kompozicija koje obuhvataju takve fuzione polipeptide.

[0141] Ovo otkrivanje obuhvata upotrebu fuzionog polipeptida ovog otkrivanja ili kompoziciju koja obuhvata takav fuzioni polipeptid za usmeravanje CD137 gomilanja i aktivacije na T-ćelijama na tumorske ćelije gde se GPC3 eksprimira, kao što je hepatocelularni karcinom ("HCC"), melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Vilmov tumor, i haepatoblastom.

[0142] U drugom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline (DNK i RNK) koji uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde otkriveni fuzioni polipeptidi. Opet u drugom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata ćeliju domaćina koja sadrži pomenuti molekul nukleinske kiseline. Budući da degeneracija genetskog koda dozvoljava supstitucije određenih kodona drugim kodonima koji naznačavaju istu aminokiselinu, ovo otkrivanje nije ograničeno na konkretan molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid kao što je ovde opisano ali obuhvata sve molekule nukleinske kiseline koji uključuju nukleotidne sekvence koji kodiraju funkcionalni polipeptid. U ovom smislu, ovo otkrivanje se takođe odnosi na nukleotidne sekvence koje kodiraju fuzione polipeptide ovog otkrivanja.

[0143] U nekim načinima ostvarivanja, molekul nukleinske kiseline koji kodira lipokalinski mutein otkriven u ovoj prijavi, kao što je DNK, može biti "operabilno povezan" sa drugim molekulom nukleinske kiseline koji kodira imunoglobulin ovog otkrivanja kako bi se omogućila ekspresija ovde otkrivenog fuzionog polipeptida. U ovom smislu, operabilna veza predstavlja vezu u kojoj su elementi sekvence jednog molekula nukleinske kiseline i elementi sekvence drugog molekula nukleinske kiseline povezani na način koji omogućava ekspresiju fuzionog polipeptida kao što je pojedinačni polipeptid.

[0144] Otkrivanje se takođe odnosi na postupak za proizvodnju fuzionog polipeptida ovog otkrivanja, ili se on proizvodi počevši od nukleinske kiseline koja kodira za polipeptid ili bilo koju podjedinicu postupcima genetskog inženjeringa. Polipeptid može, na primer, biti proizveden u bakterijskom ili eukariotskom organizmu domaćina, a zatim izolovan iz ovog organizma domaćina ili njegove kulture.

2

Takođe je moguće da se fuzioni polipeptid ovog otkrivanja proizvodi in vitro, na primer upotrebom in vitro sistema za translaciju.

[0145] Kada se proizvodi fuzioni polipeptid, nukleinska kiselina koja kodira takav polipeptid može biti uvedena u pogodan bakterijski ili eukariotski organizam domaćina pomoću rekombinantne DNK tehnologije (kao što je već prethodno navedeno). Za ovu svrhu, ćelija domaćina se prvo transformiše sa klonirajućim vektorom koji uključuje molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid kao što je ovde opisano korišćenjem standardnih postupaka. Ćelija domaćina se zatim kultiviše u uslovima, koji omogućavaju ekspresiju heterologne DNK i samim tim sinteze odgovarajućeg polipeptida. Nakon toga, polipeptid se obnavlja ili iz ćelije ili iz podloge za kultivisanje.

[0146] U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, postupak uključuje podvrgavanje najmanje jednog molekula nukleinske kiseline koji kodira hNGAL mutagenezi na nukleotidnim tripletima koji kodiraju za najmanje jedan, nekada čak i više, položaja sekvenci koji odgovaraju položajima sekvence 28, 40-52, 60, 68, 65, 70, 71-81, 87, 89, 96, 98, 100-106, 114, 118, 120, 125-137 i 145 linearne polipeptidne sekvence hNGAL (SEQ ID NO: 2).

[0147] Pored toga, u nekim načinima ostvarivanja, disulfidna veza koja se prirodno javlja između Cys 76 i Cys 175 može da se ukloni u NGAL muteinu ovog otkrivanja. Shodno tome, takav mutein može da se proizvede u ćelijskom delu sa smanjenim redoksnim okruženjem, na primer, u citoplazmi gramnegativnih bakterija.

[0148] Otkrivanje takođe uključuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lipokalinski muteine ovog otkrivanja, koji uključuju dodatne mutacije van naznačenih položaja sekvenci eksperimentalne mutageneze. Takve mutacije su često tolerisane ili ček mogu da se pokažu kao poželjne, na primer ako doprinose poboljšanoj efikasnosti savijanja, stabilnosti seruma, termalnoj stabilnosti ili afinitetu lipokalinskih muteina ka vezivanju za ligand.

[0149] Molekul nukleinske kiseline otkriven u ovoj prijavi može biti "operabilno povezan" sa regulatornom sekvencom (ili regulatornim sekvencama) da bi se obezbedila ekspresija ovog molekula nukleinske kiseline.

[0150] Molekul nukleinske kiseline, kao što je DNK, je označen kao "sposoban za eksprimiranje molekula nukleinske kiseline" ili sposoban za "omogućavanje ekspresije nukleotidne sekvence" ako uključuje elemente sekvence koji sadrže informacije vezano za transkripcionu i/ili translacionu regulaciju, i takve sekvence su "operabilno povezane" sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid. Operabilna veza je veza u kojoj su regulatorni elementi sekvence i sekvenca koja se eksprimira povezani tako da se omogućava genska ekspresija. Precizna priroda regulatornih regiona neophodnih za gensku ekspresiju može da varira među vrstama, ali generalno ovi regioni uključuju promoter koji, u prokariotama, sadrži promoter per se, tj. DNK elemente koji usmeravaju pokretanje transkripcije, kao i DNK elemente koji kada se transkribuju u RNK, će signalizirati početak translacije. Takvi regioni promotera normalno uključuju 5' nekodirajuće sekvence uključene u početak transkripcije i translacije, kao što su -35/-10 kutije i Shine-Dalgarno element u prokariotima ili TATA kutija, CAAT sekvence, i 5'-prekrivajuće elemente u eukariotima. Ovi regioni takođe mogu da uključuju pojačavajuće ili represorne elemente kao i translacioni signal i vodeće sekvence za ciljanje nativnog polipeptida ka specifičnom odeljku ćelije domaćina.

[0151] Pored toga, 3' nekodirajuće sekvence mogu da sadrže regulatorne elemente uključene u transkripcionu terminaciju, poliadenilaciju ili tome slično. Ako, ipak, ove terminacione sekvence nisu zadovoljavajuće funkcionalne u određenoj ćeliji domaćina, one onda mogu biti supstituisane signalina koji su funkcionalni u toj ćeliji.

[0152] Samim tim, molekul nukleinske kiseline ovog otkrivanja može da uključuje regulatornu sekvencu, kao što je sekvenca promotera. U nekim načinima ostvarivanja molekul nukleinske kiseline ovog otkrivanja uključuje sekvencu promotera i transkripcionu terminacionu sekvencu. Pogodni prokariotski promoteri su, na primer, tet promoter, /acUV5 promoter ili T7 promoter. Primeri promotera korisnih za ekspresiju u eukariotskim ćelijama su SV40 promoter ili CMV promoter.

[0153] Molekuli nukleinske kiseline ovog otkrivanja takođe mogu biti deo vektora ili bilo koje vrste vehikuluma kloniranja, kao što je plazmid, fagemid, fag, bakulovirus, kozmid ili veštački hromozom.

[0154] U jednom načinu ostvarivanja, molekul nukleinske kiseline je uključen u fazmid. Fazmidni vektor označava vektor koji kodira međugenski region temperentnog faga, kao što je M13 ili f1, ili njegov funkcionalni deo spojen sa cDNK od značaja. Posle superinfekcije bakterijskih ćelija domaćina sa takvim fagmidnim vektorom i odgovarajućim fagom pomagača (npr. M13K07, VCS-M13 ili R408) proizvode se čestice intektnog faga, čime se omogućava fizičko kuplovanje kodirane heterologne cDNKA sa cDNK odgovarajućim polipeptidom prikazanim na površini faga (videti npr. Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.26, 401-424, ili Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol.10, 87-93).

[0155] Takvi vehikulumi kloniranja mogu da uključuju, pored ovde opisanih regulatornih sekvenci i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni polipeptid kao što je ovde opisano, replikacionu i kontrolnu sekvencu izvedenu iz vrste koja je kompatibilna sa ćelijom domaćina koja se koristi za ekspresiju kao i za markere odabira koji daju fenotip na transformisanim ili transfektovanim ćelijama. Veliki brojevi pogodnih klonirajućih vektora su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni.

[0156] DNK molekul koji kodira fuzioni polipeptid kao što je ovde opisano (na primer, SEQ ID NO: 20 i 31), a naročito klonirajući vektor koji sadrži kodirajuću sekvencu takvog polipeptida može da se transformiše u ćeliju domaćina koja može da eksprimira taj gen. Transformacija može da se izvede standardnim tehnikama. Samim tim, ovo otkrivanje je takođe usmereno na ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je ovde otkriveno.

[0157] Transformisane ćelije domaćina su kultivisane u uslovima pogodnim za ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira fuzioni polipeptid ovog otkrivanja. Pogodne ćelije domaćina mogu biti prokariotske, kao što je Escherichia coli (E. coli) ili Bacillus subtilis, ili eukariotske, kao što

4

je Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 ili High5 ćelije insekata, ubijene ćelijske linije sisara (npr., HeLa ćelije ili CHO ćelije) ili primarne ćelije sisara.

[0158] U nekim načinima ostvarivanja gde lipokalinski mutein ovog otkrivanja, uključujući kao deo ovde otkrivenog fuzionog polipeptida, uključuje intramolekularne disulfidne veze, može biti poželjno da se usmeri novonastali polipeptid na ćelijski deo sa oksidirajućim redoksnim okruženjem upotrebom odgovarajuće signalne sekvence. Takvo oksidirajuće okruženje može biti obezbeđeno periplazmatskim gram-negativnim bakterijama kao što je E. coli, u ekstracelularnom okruženju gram-pozitivnih bakterija ili u lumenu endoplazmatskog retikuluma eukariotskih ćelijai obično i obično favorizuje obrazovanje strukturnih disulfidnih veza.

[0159] U nekim načinima ostvarivanja, takođe je moguće da se proizvede fuzioni polipeptid ovog otkrivanja u cistoli ćelije domaćina, poželjno E. coli. U ovom slučaju, polipeptid može ili direktno da bude dobijen u rastvorljivom i savijenom stanju ili se obnavlja u obliku inkluzionih tela, što je praćeno renaturalizacije in vitro. Dodatna opcija je upotreba specifičnih sojeva domaćina sa oksidirajućim intracelularnim okruženjem, što samim tim može da omogući obrazovanje disulfidnih veza u cistoli (Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol.315, 1-8.).

[0160] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja kao što je ovde opisano ne mora nužno da nastaje ili da se proizvodi samo upotrebom genetskog inženjeringa. Umesto toga, takvi polipeptidi takođe mogu dase dobiju hemijskom sintezom kao što je Merifieldova sinteza polipeptida čvrste faze ili in vitro transkripcijom i translacijom. Na primer moguće je da se obećavajuće mutacije identifikuju molekulskim modelovanjem a zatim da sintetišu željeni (napravljeni) mutein ili polipeptid in vitro i da se istraži aktivnost vezivanja za cilj od značaja. Postupci za sintezu proteina u čvrstoj fazi i/ili fazi rastvora dobro su poznate u tehnici (videti npr. Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol.

5, 29-43).

[0161] U drugom načinu ostvarivanja, fuzioni polipeptid ovog otkrivanja može da se proizvede in vitro transkripcijom/translacijom koja koristi dobro utvrđene postupke poznate stručnjacima.

[0162] Stručnjak će razumeti da postupci korisni za pripremu fuzionih polipeptida koji su ovim otkrivanjem uzeti u razmatranje ali čija proteinska, ili sekvenca nukleinske kiseline nisu izričito ovde otkriveni. Pregleda radi, takve modifikacije aminokiselinske sekvence uključuju, npr., usmerenu mutagenezu pojedinačnog aminokiselinskog položaja kako bi se pojednostavilo podkloniranje gena polipeptida ili njegovih delova inkorporisanjem mesta cepanja za određene restrikcione enzime. Pored toga, ove mutacije takođe mogu biti inkorporisane kako bi se dodatno poboljšao afinitet fuzionog polipeptida za svoje ciljeve (npr. CD137 i GPC3). Dodatno, mutacije mogu biti uvedene kako bi se modulirale određene karakteristike polipeptida kao što je poboljšanje stabilnosti savijanja, stabilnosti seruma, otpornosti na protein ili rastvorljivost u vodi kako bi se smanjila tendencija ka sakupljanju, ukoliko je potrebno. Na primer, cisteinski ostaci koji se prirodno javljaju mogu biti mutirani na aminokiselinama radi sprečavanja stvaranja disulfidnih veza.

[0163] Dodatni predmeti, prednosti, i karakteristike ovog otkrivanja će stručnjacima postati očigledne nakon ispitivanja sledećih primera i njihovih priloženih crteža, koji nisu predviđeni da budu ograničavajući. Samim tim, trebalo bi da se ima u vidu da iako se ovo otkrivanje konkretno otkriva primerima načina ostvarivanja i opcionim karakteristikama, stručnjaci iz oblasti mogu pribeći modifikaciji i varijaciji ovde obuhvaćenih otkrivanja, i za takve modifikacije i varijacije se smatra da su unutar opsega ovog otkrivanja.

V. PRIMERI

Primer 1: Ekspresija i analiza fuzionih proteina antitelo-lipokainskog muteina

[0164] Koriste se tri pristupa za generisanje bispecifičnih konstrukata koji mogu da se vezuju za ciljeve, GPC3 i CD137, u isto vreme.

[0165] U prvom pristupu, generisani su fuzioni proteini antitelo-lipokalinskog muteina bazirani na CD137-specifičnom antitelu, na primer, sa teškim i lakim lancima iz SEQ ID NO: 34 i 35, i GPC3 lipokalinskom muteinu, na primer, iz SEQ ID NO: 10. Nestrukturirani, linker neosetljiv na proteazu (G4S)3 (SEQ ID NO: 49) je korišćen za međusobno spajanje proteina u svim slučajevima. Različiti napravljeni formati su prikazani na Fig.1A. Napravljene varijante su fuzije lipokalinskog muteina sa jednim od četiri kraja antitela, koji sadrži IgG4 srž mutiranu da svede na minimum razmenu poluantitela (S228P mutacija, videti SEQ ID NO: 34): SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41, SEQ ID NO: 42 i 43. Gornja antitelo-lipokalinska fuzija bazirana na CD137-specifičnom antitelu nije obuhvaćena priloženim patentnim zahtevima.

[0166] U drugom pristupu, generisane su fuzije dva lipokalinska muteina (SEQ ID NO: 10 koja vezuje GPC3 i SEQ ID NO: 26 koja vezuje CD137) za konstruisani IgG4-Fc fragment (SEQ ID NO: 73) koji sadrži S228P mutaciju koji svodi na minimum Razmenu IgG4 poluantitela in-vitro i in-vivo (cf. Silva 2015) kao i F234A i L235A mutacije radi smanjenja interakcija Fc-gama receptora (Alegre 1992). Dobijeni fuzioni polipeptidi (SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45) su strukturno prikazani na Fig.1B.

[0167] Konstrukti prvog i drugog pristupa su generisani genskom sintezom i klonirani u ekspresioni vektor sisara. Zatim su privremeno eksprimirani u CHO ćelijama. Koncentracija fuzionih proteina antitelo-lipokainskog muteina i fuzionih polipeptida IgG4Fc-lipokalinskog muteina u podlozi ćelijske kulture je izmerena pomoću ForteBio ProteinA senzora (Pall Corp.) i kvantifikovana upotrebom humanog IgG1 standarda (podaci su prikazani).

[0168] U trećem pristupu, generisane su fuzije dva lipokalinska muteina (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 26), povezane jednim ili više (G4S)2 linkera (SEQ ID NO: 48), i pomoću dve različite konstrukcije kao što je prikazano na Fig.1C. U prvoj konstrukciji, SEQ ID NO: 26 je C-terminalno spojena sa SEQ ID NO: 10, što dovodi do fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 46; u drugoj konstrukciji, dve kopije SEQ ID NO: 26 su C-terminalno spojene sa SEQ ID NO: 10, što dovodi do fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 47. Konstrukti sadržani Strep-tag (SEQ ID NO: 50) za prečišćavanje afinitetne hromatografije. Konstrukti su klonirani standardnim postupcima i eksprimirani u E. coli koja koristi periplazmatsku sekreciju.

[0169] Fuzioni proteini antitelo-lipokalinskog muteina i fuzioni polipeptidi IgG4Fc fragment-lipokalinskog muteina su prečišćeni upotrebom hromatografije proteina A nakon koje je usledila hromatografija isključivanja po veličini (SEC) u 10 mM histidina pH 5.5150 mM NaCl ili PBS, pH7.4. Nakon SEC prečišćavanja frakcije koje sadrže monomerni protein su pulovane i analizirane pomoću analitičke SEC. Prema ovoj analizi, fuzioni polipeptidi su bili u potpunosti monomerni bez detektabilnih multimernih vrste ili agregata (podaci su prikazani).

Primer 2: Specifičnost fuzionih polipeptida prema GPC3

[0170] Korišćen je ELISA test da bi se odredila specifičnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 za rekombinantni humani GPC3 (R&D Systems #2119-GP-050/CF). Cilj je rastvoren u PBS (1 µg/mL) i oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploča je oprana nakon faze inkubacije sa 100 µL PBS sa dodatih 0.1% (v/v) Tween 20 (PBS-T) pet puta. Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-T tokom 1 h na sobnoj temperaturi i naknadno su oprane. Različite koncentracije lipokalinskog muteina (SEQ ID NO: 10) ili fuzioni polipeptidi se dodaju u bunarčiće i inkubiraju tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon faze pranja. Vezani fuzioni protein ili lipokalinski mutein se detektuje posle inkubacije sa 1:1000 razblaženim anti-humanim NGAL antitelom konjugovanim sa HRP u PBS-T kojem je dodato 2% (w/v) BSA (PBS-TB). Nakon dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) se dodaje svakom bunarčiću i detektuje se intenzitet fluorescencije pomoću čitača fluorescencije na mikroploči.

[0171] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.2, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 1, uključujući greške sigmoidno prilagođavanja podataka, što je slučaj sa svim podacima sažeto prikazanim u ovim tabelama. Primećene EC50 vrednosti su u sličnom opsegu za sve fuzione proteine antitelo-lipokalinskog muteina (0.25 - 0.28 nM), sve blago bolje od lipokalinskog muteina (SEQ ID NO: 10), koji je bio na 0.55 nM. Eksperiment pokazuje da kad je obuhvaćen gore opisanim fuzionim polipeptidima, lipokalinski mutein može biti spojen sa jednim od četiri kraja antitela bez gubitka aktivnosti prema GPC3.

Tabela 1 - ELISA podaci za GPC3 vezivanje

Primer 3: Specifičnost fuzionih polipeptida prema humanom CD137

[0172] Korišćen je ELISA test da bi se odredila specifičnost fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 za rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein (#838-4B-100, R&D Systems). Antitelo SEQ ID NO: 34 i 35 služi kao pozitivna kontrola. Cilj je rastvoren u PBS (1 µg/mL) i oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploča je oprana nakon faze inkubacije sa 100 µL PBS-T pet puta. Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-T tokom 1 h na sobnoj temperaturi i naknadno su oprane. Različite koncentracije CD137-specifičnog antitela ili fuzionih polipeptida se dodaju u bunarčiće i inkubiraju tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon faze pranja. Vezani fuzioni protein je detektovan nakon inkubacije tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa 1:5000 razblaženim mišjim antihumanim IgG Fab antitelom konjugovanim sa HRP (Jackson Laboratories) u PBS-TB. Nakon dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) se dodaje svakom bunarčiću i detektuje se intenzitet fluorescencije pomoću čitača fluorescencije na mikroploči.

[0173] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.3, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 2. Primećene EC50 vrednosti za sve ispitane molekule su bile veoma slične i u opsegu od 1.5 nM do 2.3 nM. Eksperiment pokazuje da kada je opisano antitelo uključeno u fuzione polipeptide može biti spojeno sa lipokalinskim muteinom na bilo kojem od četiri kraja antitela bez gubitka aktivnosti prema CD137.

Tabela 2 - ELISA podaci za CD137 vezivanje

Primer 4: Pokazivanje simultanog vezivanje cilja fuzionih polipeptida u ELISA okruženju

[0174] Kako bi se pokazalo simultano vezivanje fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 i za GPC3 i za CD137, korišćen je ELISA format dvostrukog vezivanja. Rekombinantni humani CD137-Fc fuzioni protein (R&D Systems) u PBS (1 µg/mL) je oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploča je oprana pet puta nakon svake faze inkubacije sa 100 µL PBS-T. Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-T tokom 1 h na sobnoj temperaturi i naknadno su ponovo oprane. Različite koncentracije fuzionih polipeptida se dodaju u bunarčiće i inkubiraju tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon faze pranja. Nakon toga, dodat je biotinilisani humani GPC3 pri konstantnoj koncentraciji od 1 µg/mL u PBS-TB tokom 1 h. Nakon pranja, Ekstravidin-HRP (Sigma-Adrich, 1:5000 u PBS-TB) je dodavan u bunarčiće tokom 1 h. Nakon dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) se dodaje svakom bunarčiću i detektuje se intenzitet fluorescencije pomoću čitača fluorescencije na mikroploči.

[0175] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.4, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 3. Svi fuzioni polipeptidi su pokazali jasne vezujuće signale sa EC50 vrednostima koje su u opsegu 1.7 - 2.1 nM, čime se pokazuje da fuzioni polipeptidi mogu da uključuju GPC3 i CD137 simultano.

Tabela 3 - ELISA podaci za simultano vezivanje cilja

Primer 5: Afinitet antitela i fuzionog proteina za humani GPC3

[0176] Vezujući afiniteti lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 i fuzioni polipeptidi SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 kao i SEQ ID NO: 42 i 43 za rekombinantni humani GPC3 (R&D Systems #2119-GP-050/CF) su određeni površinskom rezonancom plazmona (SPR) pomoću Biacore T200 instrumenta(GE Healthcare). U ispitivanju SPR afiniteta, biotinilisani GPC3 je uhvaćen na senzorskom čipu ("CAP chip") pomoću kompleta Biotin CAPture Kit (GE Healthcare): senzorski čip CAP je prethodno imobilisan sa ssDNK oligom. Nerazblaženi reagens za hvatanje biotina Biotin CAPture (streptavidin konjugovan sa komplementarnim ss-DNK oligom) se nanosi pri brzini protoka od 2 µL/min tokom 300 s. Za analizu lipokalinskog muteina, biotinilisani GPC3 u koncentraciji od 1 µg/mL se koristi i 0.25 µg/mL biotinilisanog GPC3 za fuzione proteine. Biotinilisani GPC3 se nanosi tokom 300 s pri brzini protoka od 5 µL/min. GPC3 je biotinilisani inkubacijom sa EZ-Link<®>NHS-PEG4-Biotin (5-struki molarni višak (Thermo Scientific)) tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Višak neizreagovanog biotinskog reagensa je uklonjen pokretanjem reakcione mešavine na ploči ZebaTM Spin Desalting Plate (Thermo Scientific). Referentni kanal je napunjen samo reagensom Biotin CAPture.

[0177] Da bi se odredio afinitet, GCP3 je bio imobilisan na površini čipa i četiri različite koncentracije (11.1, 3.7, 1.2 i 0.4 nM) svakog ispitanog agensa (fuzioni polipeptidi ilir lipokalinski mutein) su pripremljene u radnom puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfaktant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4 (GE Healthcare)) i nanesene na površinu čipa. Nanošenje pri brzini protoka od 30 µL/min, pri čemu je kontaktno vreme uzorka bilo 180 s a vreme disocijacije je bilo 1200 s. Sva merenja su izvedena na 25°C. Regeneracija senzorskog čipa površine CAP se postiže ubrizgavanjem 6 M gvanidinijum-HCI sa 0.25 M NaOH što je praćeno dodatnim pranjem sa radnim puferom i periodom stabilizacije od 120 s. Pre proteinskih merenja izvedena su tri ciklusa regeneracije zbog kondicioniranja. Podaci su procenjeni sa softverom Biacore T200 Evaluation (V 2.0). Korišćeno je duplo pozivanje i korišćen je model vezivanja 1:1 radi uklapanja sirovih podataka.

[0178] Podaci su prikazani na Fig.5, a rezultati uklapanja su ukratko prikazani u tabeli 4. Iz ovih podataka se može zaključiti da fuzioni polipeptidi vezuje GPC3 sa afinitetima koji su veoma slični lipokalinskim muteinom iz SEQ ID NO: 10. Očigledni vezujući afiniteti su u opsegu od 17 - 30 pM za fuzione polipeptide a očigledan vezujući afinitet je bio 12 pM za lipokalinski mutein SEQ ID NO: 10.

Tabela 4: Vezujući afiniteti za GPC3

Primer 6: Afinitet antitela i fuzionog proteina za humani CD137

[0179] Vezujući afiniteti antitela SEQ ID NO: 34 i 35 i fuzioni polipeptidi SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 za rekombinantni humani CD137-Fc fuzioni protein (#838-4B-100, R&D Systems) su određeni površinskom rezonancom plazmona (SPR) po analogiji sa primerom 5. Ukratko, biotinilisani CD137-Fc je uhvaćen na senzorskom čipu CAP i pripremljena su četiri razblaženja (20, 5, 1.3 i 0.3 nM) svakog ispitanog agensa (fuzioni protein ili SEQ ID NO: 34 i 35) u radnom puferu i nanesena na površinu čipa. Nanošenje pri brzini protoka od 30 µL/min, pri čemu je kontaktno vreme uzorka bilo 180 s, a vreme disocijacije je bilo 600 s. Sva merenja su inače izvedena i analizirana kako je opisano u primeru 5.

[0180] Rezultati su ukratko prikazani u tabeli 5. Podaci pokazuju da se fuzioni polipeptidi vezuju CD137 sa afinitetima koji su veoma slični tom antitelu. Očigledni vezujući afiniteti su u opsegu od 71 - 179 pM za fuzione proteine, a očigledan vezujući afinitet je bio 92 pM za antitelo 20H4.9 (SEQ ID NO: 34 i 35).

4

Tabela 5: Vezujući afiniteti za CD137

Primer 7: Specifičnost Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina prema GPC3

[0181] Korišćen je ELISA test kao što je opisano u primeru 2 da bi se odredila specifičnost fuzionih polipeptida, SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45, za rekombinantni humani GPC3.

[0182] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.7, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 6. Primećene EC50 vrednosti Fc-fuzione polipeptide lipokalinskog muteina su obe bile nego za GPC3-vezujući lipokalinski mutein (SEQ ID NO: 10).

Tabela 6 - ELISA podaci za GPC3 vezivanje

Primer 8: Specifičnost Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina prema humanom CD137

[0183] Korišćen je ELISA test da bi se odredila specifičnost Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 za rekombinantni CD137-Fc fuzioni polipeptid kao što je opisano u primeru 3.

[0184] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.8, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 7. Primećene EC50 vrednosti Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina su obe bile bolje od primećene EC50 vrednosti za CD137-vezujući lipokalinski mutein (SEQ ID NO: 26).

Tabela 7 - ELISA podaci za CD137 vezivanje

Primer 9: Pokazivanje simultanog vezivanja cilja Fc-fuzionih polipeptida lipokalinskog muteina u ELISA okruženju

[0185] Kako bi se pokazalo simultano vezivanje fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 za GPC3 i CD137, korišćen je ELISA format dvostrukog vezivanja po analogiji sa primerom 4.

[0186] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.9, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 8. Oba fuziona polipeptida su pokazala jasne vezujuće signale sa EC50 vrednostima blizu 1.7 nM, čime se pokazuje da fuzioni polipeptidi mogu da uključuju GPC3 i CD137 simultano.

Tabela 8 - ELISA podaci za simultano vezivanje cilja

Primer 10: Afinitet antitela i fuzionog proteina za humani GPC3

[0187] Vezujući afiniteti GPC3-vezujućeg lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 10 i fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 za rekombinantni humani GPC3 su određeni površinskom rezonancom plazmona kao što je opisano u primeru 5.

[0188] Podaci su prikazani na Fig.10, a uklopljene KDvrednosti su ukratko prikazane u tabeli 9. Podaci pokazuju da fuzioni polipeptidi vezuju GPC3 sa afinitetima koji su veoma slični lipokalinskom muteinu. Očigledni vezujući afiniteti su 23 pM i 29 pM za fuzione polipeptide, tim redom, u poređenju sa očiglednim vezujućim afinitetom od 33 pM za lipokalinski mutein.

Table 9: Vezujući afiniteti za GPC3

Primer 11: Afinitet antitela i fuzionog proteina za humani CD137

[0189] Vezujući afiniteti CD137-vezujućeg lipokalinskog muteina SEQ ID NO: 26 i fuzioni polipeptidi SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 za rekombinantni humani CD137-Fc fuzioni protein su određeni po analogiji sa primerom 6.

[0190] Podaci su prikazani na Fig.11 za fuzione polipeptide SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 a uklopljene KDvrednosti za sve ispitane molekule su u tabeli 10. Podaci pokazuju da fuzioni polipeptidi vezuju CD137 sa afinitetima od 1 nM ili 1.1 nM, tim redom, većim od KDvrednosti lipokalinskog muteina, koji ima vrednost od 2.3 nM.

Tabela 10: Vezujući afiniteti za CD137

Primer 12: Specifičnost fuzionog polipeptida prema GPC3

[0191] Generisan je dodatni fuzioni polipeptid baziran na CD137-vezujućem antitelu SEQ ID NO: 51 i 52 I GPC3-vezujućem lipokalinskom muteinu SEQ ID NO: 10. Lipokalinski mutein je C-terminalno spojen sa teškim lancem pomoću (G4S)3 linkera što dovodi do fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 53 i 54.

[0192] Korišćen je ELISA test kao što je opisano u primeru 2 da bi se odredila specifičnost fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 53 i 54 za rekombinantni humani GPC3.

[0193] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.12, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 11. EC50 prema GPC3 je uporediv za fuzioni polipeptid i lipokalinski mutein. Podaci pokazuju da kada je uključen u fuzioni polipeptid, lipokalinski mutein može da se spoji sa antitelom bez gubitka aktivnosti prema GPC3.

Tabela 11 - ELISA podaci za GPC3 vezivanje

Primer 13: Pokazivanje simultanog vezivanja cilja fuzionog polipeptida u ELISA okruženju

[0194] Kako bi se pokazalo simultano vezivanje fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 53 i 54 i za GPC3 i za

4

CD137, korišćen je ELISA format dvostrukog vezivanja po analogiji sa primerom 4.

[0195] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.13, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Fuzioni polipeptid je pokazao jasne vezujuće signale sa EC50 vrednošću 4.66 ± 0.65 nM, čime je pokazano da polipeptid može da uključuje GPC3 i CD137 simultano.

Primer 14: Specifičnost fuzionih polipeptida prema GPC3

[0196] Korišćen je ELISA test kao što je opisano u primeru 2 da bi se odredila specifičnost bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 kao i lipokalinski mutein SEQ ID NO: 8 za rekombinantni humani GPC3.

[0197] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.14, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 12. EC50 vrednosti za fuzione polipeptide su barem dobre koliko i ili čak veće od EC50 vrednosti lipokalinskog muteina. Podaci pokazuju da kad je uključen u dva fuziona polipeptida, lipokalinski mutein može biti spojen sa antitelom bez gubitka aktivnosti prema GPC3.

Tabela 12 - ELISA podaci za GPC3 vezivanje

Primer 15: Specifičnost fuzionih polipeptida prema humanom CD137

[0198] Korišćen je ELISA test da bi se odredila specifičnost bispecifičnih polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 kao i lipokalinski mutein SEQ ID NO: 26 za rekombinantni CD137-Fc fuzioni protein kao što je opisano u primeru 3.

[0199] Rezultat eksperimenta je grafički prikazan na Fig.15, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Dobijene EC50 vrednosti su date u tabeli 13. EC50 vrednosti za fuzione polipeptide su barem dobre koliko i, ili čak veće od EC50 vrednosti lipokalinskog muteina. Podaci pokazuju da antitela uključena u ta dva fuziona polipeptida mogu da se spoje u lipokalinski mutein bez gubitka aktivnosti prema CD137.

Tabela 13 - ELISA podaci za CD137 vezivanje

Primer 16: Pokazivanje simultanog vezivanje cilja fuzionih polipeptida u ELISA okruženju

[0200] Kako bi se pokazalo simultano vezivanje bispecifičnih polipeptida SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 za GPC3 i CD137, korišćen je ELISA format dvostrukog vezivanja po analogiji sa primerom 4.

[0201] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.16, zajedno sa prilagođenim krivama koje su rezultat 1:1 sigmoidnog prilagođavanja vezivanja, pri čemu su EC50 i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran na jedinici. Oba fuziona polipeptida su pokazala jasne vezujuće signale sa EC50 vrednošću od 7.3 - 7.5 nM, čime se pokazuje da oba fuziona polipeptida mog uda uključuju GPC3 i CD137 simultano.

Tabela 14 - ELISA podaci za simultano vezivanje cilja

Primer 17: Afinitet fuzionih polipeptida za humani GPC3

[0202] Vezujući afiniteti GPC3-vezujućeg lipokalinskog muteina, a bispecifični polipeptidi SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 za rekombinantni humani GPC3 i rekombinantni humani CD137 su određeni površinskom rezonancom plazmona na Biacore T200 instrumentu (GE Healthcare) pomoću HBS-EP+ (1x; BR-1006-69; GE Healthcare) kao radnim puferom, po analogiji sa postupkom opisanim u primeru 5.

[0203] Komplet Biotin CAPture Kit (GE Healthcare) se koristi za imobilizaciju biotinilisanih bispecifičnih polipeptida na površini čipa. Bispecifični polipeptidi su biotinilisani pomoću standardne NHS hemije. Nerazblaženi Biotin CAPture Reagens (streptavidin konjugovan sa ss-DNK oligom) je uhvaćen na senzorskom čipu CAP sa prethodno imobilisanim komplementarnim ss-DNK oligom. Posle toga, biotinilisani muteini na 1 µg/ml su nanošeni tokom 300 s pri brzini protoka od 5 µL/min.

[0204] GPC3 se nanosi u četiri koncentracije (300 nM, 100 nM, 33 nM i 11 nM) pri brzini protoka od 30 µL/min. GPC3 je ubrizgan sa tokom 180 s a naknadno verem disocijacije je bilo podešeno na od 1200 s. Regeneracija površine čipa je postignuta ubrizgavanjem 6 M gvandinijum-HCI 0.25 M NaOH (120 s) sa brzinom protoka od 10 µL/min. Ubrizgavanje regenerativnih rastvora je praćeno fazom dodatnog pranja sa HBS-EP+ (1x; BR-1006-69; GE Healthcare) radnim pufer i periodom stabilizacije od 120 s.

[0205] Podaci su dva puta naznačeni oduzimanje odgovarajućih signala izmerenih za kontrolni kanal (napunjen samo Biotin CAPture reagensima) i oduzimanjem injekcija pufera od odgovora vezivanja.

4

Konstanta brzine asocijacije kai konstanta brzine disocijacije kdza reakciju vezivanja su određeni pomoću softvera Biacore T200 Evaluation Software V2.0 za obradu podataka i kinetičko uklapanje.

[0206] Odgovarajući senzogrami su prikazani na Fig.17. Rezultati su ukratko prikazani u tabeli 15.

Podaci pokazuju da bispecifični polipeptidi vezuju GPC3 sa afinitetima od 4.3 nM (SEQ ID NO: 46) i 3.5 nM (SEQ ID NO: 47), tim redom.

Tabela 15: Vezujući afiniteti za GPC3

Primer 18: Afinitet fuzionih polipeptida za humani CD137

[0207] Vezujući afiniteti CD137-vezujućeg lipokalinskog muteina i bispecifični polipeptidi SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 47 za rekombinantni humani CD137-Fc fuzioni protein (#838-4B-100, R&D Systems) su određeni površinskom rezonancom plazmona pomoću Biacore T200 instrumenta (GE Healthcare) po analogiji sa primerom 6. Pre ispitivanja SPR afiniteta, CM5 senzorski čip je derivatizovan sa antihumanim Fc antitelom pomoću kompleta za hvatanje antitela Human Antibody Capture Kit (GE Healthcare # BR-1008-39) u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0208] Da bi se odredio afinitet, human CD137-Fc fuzioni protein je imobilisan na čipu u koncentraciji od 0.25 mg/lm pri brzini protoka od 10 µL/min i kontaktnim vremenom od 180. Četiri različite koncentracije (1000 nM, 200 nM, 40 nM i 8 nM) bispecifičnih polipeptida su pripremljene u radnom puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfaktant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4 (GE Healthcare)) i nanesene na površinu čipa. Nanošenje pri brzini protoka od 30 µL/min, pri čemu je kontaktno vreme uzorka bilo 180 s a vreme disocijacije je bilo 600 s. Sva merenja su izvedena na 25°C. Regeneracija senzorskog čipa površina se postiže ubrizgavanjem 10 mM glicina pH 1.7 što je praćeno dodatnim pranjem sa radnim puferom i periodom stabilizacije od 120 s. Pre proteinskih merenja izvedena su tri ciklusa regeneracije zbog kondicioniranja. Podaci su procenjeni sa softverom Biacore T200 Evaluation software (V 2.0). Dvostruko označavanje se koristi i model vezivanja 1:1 se koristi radi uklapanja sirovih podataka.

[0209] Rezultati su prikazani na Fig.18 I sažeti u tabeli 16. Podaci pokazuju da bispecifični polipeptidi vezuju CD137 sa afinitetima koji su barem dobri kao afinitet lipokalinskog muteina prema CD137.

Tabela 16: Vezujući afiniteti za CD137

4

Primer 19: Ispitivanje aktivacije funkcionalnih T-ćelija pomoću obloženih fuzionih polipeptida [0210] Korišćeno je ispitivanje aktivacije T-ćelija da bi se ocenila mogućnost fuzionih proteina SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43 da zajedno stimulišu odgovore T-ćelija. Za ovu svrhu, fuzioni polipeptidi u različitim koncentracijama su obloženi na plastičnom sudu zajedno sa anti-humanim CD3 antitelom (OKT3, eBioscience) i prečišćene T-ćelije su nakon toga inkubirane na obloženoj površini u prisustvu rastvorljivog anti-humanog CD28 antitela (Clone 28.2; eBioscience). Kao očitavanje, izmereni su nivoi supernatanta interleukina 2 (IL-2). Kao negativna kontrola, korišćen je humani IgG4 izotip kao negativna kontrola. U nastavku je obezbeđen detaljan opis eksperimenta.

[0211] Mononuklearne ćelije iz humane periferne krvi (PBMC) od zdravih dobrovoljaca su izolovane iz puferastih omotača centrifugacijom kroz gradijent gustine Polysucrose (Biocoll 1.077 g/mL od Biochrom), prema Biohromovim protokolima. T limfociti su izolovani iz dobijenih PBMC upotrebom kompleta za prečišćavanje Pan T-ćelija (Miltenyi Biotec GmbH) i protokola proizvođača. Prečišćene T-ćelije su ponovo suspendovane u puferu koji se sastoji od 90% FCS i 10% DMSO, neposredno zamrznute upotrebom tečnog azota i čuvane u tečnom azotu do dalje upotrebe. Za ispitivanje, T ćelije su otapane tokom 16 h i kultivisane u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) kojima je dodato 10% FCS i 1% penicilin-streptomicin (Life Technologies).

[0212] Sledeći postupak je izveden upotrebom triplikata za svaki eksperimantalni uslov. Ploče ravnog dna sa kulturama tkiva su oblagane tokom noći na 4°C upotrebom 200 µL mešavine 0.5 µg/mL anti-CD3 antitela i serije razblaženja fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41, i SEQ ID NO: 42 i 43 (25µg/mL, 25µg/mL, i 0.25µg/mL) ili negativne kontrole IgG4 izotipa (25 µg/mL). U drugom podešavanju sa istim eksperimentalnim uslovom fuzioni polipeptidi su oblagani zajedno sa IgG1 izotipom (kao dodatnom negativnom kontrolom) umesto anti-CD3 antitela. Sledećeg dana, bunarčići su dva puta oprani sa PBS-om, i 100 µL suspenzije T-ćelija (koje odgovaraju 5×10<4>T ćelijama) u podlogama sa kulturama kojima je dodato 2 µg/mL anti-hCD28 antitelo se dodaje svakom bunarčiću. Ploče su pokrivene gasno propusnim zatvaračem (4titude) i inkubirane na 37°C u vlažnoj 5%

CO2atmosferi tokom 3 dana. Nakon toga, određene su IL-2 koncentracija u supernatantu, kao i ćelijska proliferacija.

[0213] Nivoi humanog IL-2 u supernatantima ćelijskih kultura su kvantifikovani upotrebom kompleta IL-2 DuoSet DuoSet kit od R&D Systems. Postupak je izveden na način opisan u nastavku. U prvoj fazi, ploča sa 348 bunarčića je oblagana na sobnoj temperaturi tokom 2 h sa 1 µg/mL "Human IL-2 Capture Antibody" (R&D System) razblaženim u PBS-u. Nakon toga, bunarčići su oprani 5 puta sa 80 µl PBS-T (PBS koji sadrži 0.05% Tween20) pomoću uređaja za pranje Biotek EL405 select CW (Biotek). Nakon 1 h

4

blokiranja u PBS-T dodatno koji sadrži 1% kazein (w/w), pulovani supernatant i serija koncentracija IL-2 standarda razblaženog u podlozi sa kulturom su inkubirani u ploči sa 384 bunarčića tokom noći na 4°C. Kako bi se omogućila detekcija i kvantitacija uhvaćenog IL-2, mešavina 100 ng/mL biotinilisanog kozjeg anti-hIL-2-Bio detekcionog antitela (R&D System) i 1µg/mL Streptavidina obeleženog sulfotagom (Mesoscale Discovery) je dodato u PBS-T koji sadrži 0.5% kazein i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Nakon pranja, 25 µL pufer za očitavanje se dodaje svakom bunarčiću i očitava se elektrohemiluminiscencioni signal (ECL) svakog bunarčića pomoću čitača Mesoscale Discovery. Analiza i kvantifikacija se izvode pomoću softvera Mesoscale Discovery.

[0214] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.19. Za sva četiri fuziona polipeptida (SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 38 i 39, SEQ ID NO: 40 i 41 i SEQ ID NO: 42 i 43), postoji jasna indukcija IL-2 proizvodnje od strane korišćenih T-ćelija, u poređenju sa izotpipom IgG4 negativne kontrole. Podaci dalje pokazuju tendenciju prema jačoj IL-2 indukciji pri većoj koncentraciji oblaganja fuzija polipeptida. U odsustvu anti-CD3 stimulacije T-ćelija, fuzioni polipeptidi nisu indukovali IL-2 proizvodnju od strane T-ćelija. Ovo pokazuje da fuzioni polipeptidi mogu da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija stimulisanih sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelom pri suboptimalnim koncentracijama.

Primer 20: Ispitivanje aktivacije funkcionalnih T-ćelija korišćenjem fuzionih polipeptida vezanih za tumorske ćelije

[0215] Korišćena je aktivacija T-ćelija zavisna od ciljane ćelije da bi se ocenila mogućnost fuzionih proteina SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 - koji mogu da vezuju CD137 i GPC3 u isto vreme - da zajedno stimulišu odgovore T-ćelija kada su imobilisane na GPC3-pozitivnoj ćelijskoj liniji. Kao negativna kontrola, korišćeno je monospecifično, CD137-vezujuće antitelo SEQ ID NO: 34 i 35. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo (OKT3, eBioscience) je oblagano na plastičnoj posudi sa kulturom, i nakon toga GPC3-pozitivne HepG2 ćelije su kultivisane na posudi tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini u prisustvu 1 µg/mL fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 44, i SEQ ID NO: 45 ili kontrolnog antitela SEQ ID NO: 34 i 35. Kao očitavanje, izmereni su niovi supernatantnog interleukina 2 (IL-2)). U nastavku, eksperiment je detaljno opisan.

[0216] Mononuklearne ćelije iz humane periferne krvi (PBMC) od zdravih dobrovoljaca su izolovane iz puferastih omotača centrifugacijom kroz gradijent gustine Polysucrose (Biocoll 1.077 g/mL od Biochrom), prema Biohromovim protokolima. T limfociti su izolovani iz dobijenih PBMC pomoću kompleta Pan T-cell purification Kit (Miltenyi Biotec GmbH) i protokola proizvođača. Prečišćene T-ćelije su ponovo suspendovane u puferu koji se sastoji od 90% FCS i 10% DMSO, neposredno zamrznute upotrebom tečnog azota i čuvane u tečnom azotu do dalje upotrebe. Za ispitivanje, T ćelije su otapane tokom 16 h i kultivisane u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) kojima je dodato 10% FCS i 1% penicilin-streptomicina (Life Technologies).

[0217] Sledeći postupak je izveden upotrebom triplikata za svaki eksperimantalni uslov. Ploče ravnog

4

dna sa kulturama tkiva su prethodno oblagani ili ne tokom 1 h na 37°C upotrebom 200 µL 0.25 µg/mL anti-CD3 antitela. Bunarčići su nakon toga dva puta oprani sa PBS-om.1.25 ×10<4>HepG2 tumorske ćelije po bunarčiću su postavljene u ploču i ostavljene su da prijanjaju tokom noći na 37°C u vlažnoj 5% CO2atmosferi. HepG2 ćelije su pre gajene u kulturi u standardnim uslovima, odvojene pomoću Accutase i ponovo suspendovani u podlogama sa kulturama.

[0218] Narednih dana, tumorske ćelije su tretirane 2 sata na 37°C mitomicinom C (Sigma Aldrich) u koncentraciji od 10µg/ml kako bi se blokirala njihova proliferacija. Ploče su oprane dva puta sa PBS-om, i 100 µL T-ćelijske suspenzije (koja odgovara 5×10<4>T ćelije) i fuzioni polipeptidi ili negativna kontrola u koncentraciji od 1 µg/mL je dodata u svaki bunarčić. Ploče su pokrivene gasno propusnim zatvaračem (4titude) i inkubirane na 37°C u vlažnoj 5% CO2atmosferi tokom 3 dana. Nakon toga, IL-2 koncentracija u supernatantu je ocenjena kako je opisano u nastavku.

[0219] Nivoi humanog IL-2 u supernatantima ćelijske kulture su kvantifikovani upotrebom IL-2 DuoSet kit from R&D Systems. Postupak je izveden i opisan je u nastavku. U prvoj fazi, ploča sa 348 bunarčića je oblagana na sobnoj temperaturi tokom 2 h sa 1 µg/mL "Human IL-2 Capture Antibody" (R&D System) razblaženim u PBS-u. Nakon toga, bunarčići su oprani 5 puta sa 80 µl PBS-T (PBS koji sadrži 0.05% Tween20) upotrebom uređaja za pranje Biotek EL405 select CW washer (Biotek). Nakon 1 h blokiranja u PBS-T dodatno koji sadrži 1% kazein (w/w), pulovani supernatant i serija koncentracija IL-2 standarda razblaženog u podlozi sa kulturom su inkubirani u ploči sa 384 bunarčića tokom noći na 4°C. Kako bi se omogućila detekcija i kvantitacija uhvaćenog IL-2, mešavina 100 ng/mL biotinilisanog kozjeg anti-hIL-2-Bio detekcionog antitela (R&D System) i 1µg/mL Streptavidina obeleženog sulfotagom (Mesoscale Discovery) je dodata u PBS-T koji sadrži 0.5% kazein i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Nakon pranja, 25 µL pufer za očitavanje se dodaje svakom bunarčiću i očitava se elektrohemiluminiscencioni signal (ECL) svakog bunarčića pomoću čitača Mesoscale Discovery. Analiza i kvantifikacija se izvode pomoću softvera Mesoscale Discovery.

[0220] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.20. Za tri fuziona polipeptida SEQ ID NO: 36 i 37, SEQ ID NO: 44, i SEQ ID NO: 45, postoji jasna indukcija IL-2 proizvodnje od strane korišćenih T-ćelija, u poređenju sa kontrolnim antitelom SEQ ID NO: 34 i 35. Ovo pokazuje da fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu zajedno da stimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji je zavisan od cilja, što je i dokazano time što GPC3-vezujući fuzioni polipeptidi ispoljavaju veće nivoe IL-2 proizvodnje od kontrolnog antitela.

Primer 21: Ispitivanje aktivacije funkcionalnih T-ćelija korišćenjem fuzionih polipeptida vezanih za tumorske ćelije sa ili bez blokade bisepcifičnog vezivanja

[0221] Korišćeno je ispitivanje zavisno od ciljane ćelije aktivacije T-ćelija, slično eksperimentu opisanom u primeru 20, da bi se ocenila mogućnost fuzionih proteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 - koji mogu da vezuju CD137 i GPC3 u isto vreme - da zajedno stimulišu odgovore T-ćelija kada su vezani za GPC3-pozitivnu ćelijsku liniju. Kao kontrola, eksperiment je izveden u prisustvu viška monospecifičnog, GPC3-

4

vezujućeg antikalina SEQ ID NO: 10 kako bi se razmestili bispecifični konstrukti SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 45 od vezivanja za GPC3-pozitivne ćelije. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo (OKT3, eBioscience) je oblagano na plastičnoj posudi sa kulturom, i nakon toga GPC3-pozitivne Hep3B ćelije su kultivisane na posudi tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini u prisustvu četiri koncentracije fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 (1µg/mL, 0.1 µg/mL, 0.01 µg/mL, 0.001 µg/mL). Paralelno, eksperiment je izvedena uz dodavanje viška SEQ ID NO: 10 (1 mg/mL). Kao očitavanje, izmereni su nivoi supernatanta interleukina 2 (IL-2). U nastavku, eksperiment je detaljno opisan.

[0222] Mononuklearne ćelije iz humane periferne krvi (PBMC) od zdravih dobrovoljaca su izolovane iz puferastih omotača centrifugacijom kroz gradijent gustine Polysucrose (Biocoll 1.077 g/mL od Biochrom), prema Biohromovim protokolima. T limfociti su izolovani iz dobijenih PBMC korišćenjem kompleta Pan T-cell purification Kit (Miltenyi Biotec GmbH) i protokola proizvođača. Prečišćene T ćelije su kultivisane u podlogama sa kulturama (RPMI 1640, Life Technologies) kojima je dodato 10% FCS i 1% Penicilin-streptomicin (Life Technologies).

[0223] Sledeći postupak je izveden upotrebom triplikata za svaki eksperimantalni uslov. Ploče ravnog dna sa kulturama tkiva su prethodno oblagane tokom 1 h na 37°C upotrebom 200 µL 0.25 µg/mL anti-CD3 antitela. Bunarčići su nakon toga dva puta oprani sa PBS.1.25 × 10<4>Hep3B tumor ćelije po bunarčiću su postavljene u ploču i ostavljene su da prijanjaju tokom noći na 37°C u vlažnom 5% CO2atmosferi. Hep3B ćelije su pre gajene u kulturi u standardnim uslovima, rastavljene pomoću Accutase i ponovo suspendovani u podlogama sa kulturama.

[0224] Sledećeg dana, tumorske ćelije su tretirane 2 sata na 37°C mitomicinom C (Sigma Aldrich) u koncentraciji od 10µg/ml kako bi se blokirala njihova proliferacija. Ploče su oprane dva puta sa PBS-om, i 100 µL T-ćelijske suspenzije (koja odgovara 5×10<4>T ćelije) i fuzioni polipeptidi SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 u koncentraciji od 1µg/mL, 0.1 µg/mL, 0.01 µg/mL, 0.001 µg/mL su dodati u prisustvu ili odsustvu viška SEQ ID NO: 10 (1 mg/mL). Ploče su pokrivene gasno propusnim zatvaračem (4titude) i inkubirane na 37°C u vlažnom 5% CO2atmosferi tokom 3 dana. Nakon toga, IL-2 koncentracija u supernatantu je određena ELISA-om upotrebom humanog IL-2 ELISA seta od BD Bioscience u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0225] Rezultat eksperimenta je prikazan na Fig.21. Za dva fuziona polipeptida SEQ ID NO: 44 (Fig.21A) i SEQ ID NO: 45 (Fig.21C), postoji jasna indukcija IL-2 proizvodnje od strane korišćenih T-ćelija koja se povećava sa rastom koncentracije . Nasuprot tome, indukcija IL-2 proizvodnje je poništena u prisustvu viška SEQ ID NO: 10, koji inhibira vezivanje bispecifičnih SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 za Hep3B ćelije. Ovo pokazuje da fuzioni polipeptidi ovog otkrivanja mogu da zajedno stimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji je zavisan od cilja.

[0226] Značajno, količina indukovanog IL-2 je veća za SEQ ID NO: 44 u odnosu na SEQ ID NO: 45, čime se naznačava da geometrija bispecifične GPC3/CD137 fuzije igra glavnu ulogu u određivanju jačine aktivacije T ćelija.

Primer 22: Tumorske ćelije ispitivanja aktivacije funkcionalnih T-ćelija sa visokim ili niskim GPC3 nivoima

[0227] Korišćeno je ispitivanje aktivacije T-ćelija zavisno od ciljane ćelije, slično eksperimentu opisanom u primeru 20, da bi se ocenila mogućnost fuzionih proteina SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 da zajedno stimulišu odgovore T-ćelija u zavisnosti od GPC3 nivoa iskorišćene ćelijske linije. Kao negativna kontrola, korišćeno je HER2-vezujuće antitelo trastuzumab. Poređenja radi, ispitivano je ponašanje referentnog anti-CD137 monoklonalnog antitela SEQ ID NO: 74 i 75. U eksperimentu, anti-humano CD3 antitelo (OKT3, eBioscience) je oblagano na plastičnim posudama sa kulturama, i nakon toga HepG2, SKBR3 ili MCF7 ćelije su odvojeno kultivisane na posudama tokom noći. Sledećeg dana, prečišćene T-ćelije su inkubirane na obloženoj površini u prisustvu raznih koncentracija fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, referentnog antitela SEQ ID NO: 74 i 75, i negativnih kontrola trastuzumab vehikuluma (tj. bez dodavanja ispitivanog proizvoda). Kao očitavanje, izmereni su nivoi supernatanta interleukina 2 (IL-2). U nastavku, eksperiment je detaljno opisan.

[0228] Mononuklearne ćelije iz humane periferne krvi (PBMC) od zdravih dobrovoljaca su izolovane iz puferastih omotača centrifugacijom kroz gradijent gustine Polysucrose (Biocoll 1.077 g/mL od Biochrom), prema Biohromovim protokolima. T limfociti su izolovani iz dobijenih PBMC korišćenjem kompleta Pan T-cell purification Kit (Miltenyi Biotec GmbH) i protokola proizvođača. Prečišćene T-ćelije su ponovo suspendovane u puferu koji se sastoji od 90% FCS i 10% DMSO, neposredno zamrznute upotrebom tečnog azota i čuvane u tečnom azotu do dalje upotrebe. Za ispitivanje, T ćelije su otapane tokom 16 h i kultivisane u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) kojima je dodato 10% FCS i 1% Penicilin-streptomicin (Life Technologies).

[0229] Sledeći postupak je izveden upotrebom triplikata za svaki eksperimentalni uslov. Ploče ravnog dna sa kulturama tkiva su prethodno oblagane tokom 1 h na 37°C korišćenjem 200 µL 0.25 µg/mL anti-CD3 antitela. Ploče su nakon toga dva puta oprane sa PBS.5 × 10<4>ciljane tumorske ćelije po bunarčiću su postavljene u ploču i ostavljene su da prijanjaju tokom noći na 37°C u vlažnoj 5% CO2atmosferi. Ciljane ćelije su pre gajene u kulturi u standardnim uslovima, razdvojene korišćenjem Accutase i ponovo suspendovane u podlogama sa kulturama.

[0230] Sledećeg dana, tumorske ćelije su tretirane 2 sata na 37°C mitomicinom C (Sigma Aldrich) u koncentraciji od 30µg/ml kako bi se blokirala njihova proliferacija. Ploče su oprane dva puta sa PBS-om, i 100 µL T-ćelijske suspenzije (koja odgovara 5 × 10<4>T ćelije) je dodato u svaki bunarčić, zajedno sa ispitivanim proizvodima SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, referentnim antitelom SEQ ID NO: 74 i 75, negativnom kontrolom trastuzumab, u koncentraciji koja je u opsegu 0.05 nM do 5 nM. Ploče su pokrivene gasno propusnim zatvaračem (4titude) i inkubirane na 37°C u vlažnoj 5% CO2atmosferi tokom

1

3 dana. Nakon toga, IL-2 koncentracija u supernatantu je ocenjena kao što je opisano u nastavku.

[0231] Nivoi humanog IL-2 u supernatantima ćelijske kulture su kvantifikovani upotrebom kompleta IL-2 DuoSet od R&D Systems. Postupak je izveden i opisan je u nastavku. U prvoj fazi, ploča sa 348 bunarčića je oblagana na sobnoj temperaturi tokom 2 h sa 1 µg/mL "Human IL-2 Capture Antibody" (R&D System) razblaženim u PBS-u. Nakon toga, bunarčići su oprani 5 puta sa 80 µl PBS-T (PBS koja sadrži 0.05% Tween20) upotrebom uređaja za pranje Biotek EL405 select CW (Biotek). Nakon 1 h blokiranja u PBS-T dodatno koji sadrži 1% kazein (w/w), pulovani supernatant i serija koncentracija IL-2 standarda razblaženog u podlozi sa kulturom su inkubirani u ploči sa 384 bunarčića tokom noći na 4°C. Kako bi se omogućila detekcija i kvantitacija uhvaćenog IL-2, mešavina 100 ng/mL biotinilisanog kozjeg anti-hIL-2-Bio detekcionog antitela (R&D System) i 1µg/mL Streptavidina obeleženog sulfotagom (Mesoscale Discovery) je dodato u PBS-T koji sadrži 0.5% kazein i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Nakon pranja, 25 µL pufera za očitavanje se dodaje svakom bunarčiću i očitava se elektrohemiluminiscencioni signal (ECL) svakog bunarčića pomoću čitača Mesoscale Discovery. Analiza i kvantifikacija se izvode pomoću softvera Mesoscale Discovery.

[0232] Rezultat reprezentativnog eksperimenta je prikazan na Fig.22. Na ovoj Fig., vrednosti su grafički prikazane u odnosu na pozadinsku proizvodnju IL-2 u odsustvu ispitivanog proizvoda, i samim tim predstavljaju promenu savijanja u odnosu na pozadinu. Dok negativna kontrola trastuzumab (Fig.22A, trouglovi) ne dovodi do indukcije IL-2 na T-ćelijama sa bilo kojom od tri ćelijske linije, rastuće koncentracije bispecifičnog fuzionog polipeptida SEQ ID NO: 44 (Fig.22A, krugovi) i SEQ ID NO: 45 (Fig. 22A, kvadrati) indukuju T-ćelije da proizvode IL-2 u prisustvu GPC3-eksprimirajućih HepG2 ćelija.

Međutim, nijedan porast IL-2 usled SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 nije očigledan za GPC3 negativni SKBR3 i MCF7 ćelije (Fig.22). Ovo ponašanje je značajno različito u odnosu na anti-CD137 antitelo SEQ ID NO: 74 i 75, koje indukuje IL-2 na T-ćelijama u prisustvu sve treće ćelijske linije (Fig.22B).

[0233] Eksperiment jasno pokazuje da SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 aktiviraju T-ćelije na način koji je zavisan od prisustva GPC3 na ciljanim ćelijama. Dok GPC3-pozitivna HepG2 ćelijska linija pokazuje jasnu T-ćelijsku aktivaciju kako je izmereno IL-2 proizvodnjom, ova je fekat se ne javlja sa SKBR3 i MCF7 ćelijama, koje ne eksprimiraju detektabilne nivoe GPC3. To da ovaj efekat može da se pripiše prisustvu GPC3 a ne GPC3 negativnim ćelijskim linijama tokom ispitivanja koje potencijalno daje CD137 signaliziranje neefikasno postaje očigledno činjenicom da anti-CD137 antitelo SEQ ID NO: 74 i 75 može da aktivira T ćelije preko CD137 signaliziranja sa sva tri ćelijska tipa.

Primer 23: Ocena imunogenosti ex vivo T ćelija fuzionih polipeptida

[0234] Kako bi se istražio rizik od formiranja antilekovitih antitela kod čoveka, izvedena je in vitro ocena imunogenosti T ćelija bispecifičnih fuzionih polipeptida SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45, kontrolnog antitela trastuzumab i hemocijanina iz vrtnog puža (KLH) pozitivne kontrole. Kako bi se izveo eksperiment, PBMC od 32 donatora izabrana da pokrivaju HLA alotipove koji odražvaju distribuciju u

2

globalnoj populacije je otopljena, oprana i posejana u ploče sa 96 bunarčića u gustini od 3×10<5>ćelije po bunarčiću. Ispitivani proizvodi, razblaženi u podlogama za ispitivanje, su dodati u ćelije u koncentraciji od 30µg/mL. Sama podloga za ispitivanje je korišćena kao slepa proba, a hemocijanin vrtnog puža (KLH) je korišćen kao naivna pozitivna kontrola. PBMC su inkubirane tokom 7 dana u vlažnoj atmosferi na 37°C i 5% CO2.7. dana, PBMC su obeležene zbog površinskog fenotipskog CD3+ i CD4+ markera i DNK-inkorporisanog EdU (5-etinil-2'deoksiuridin), koji se koristi kao marker ćelijske proliferacije. Procenat CD3<+>CD4<+>EdU<+>proliferišućih ćelija je izmeren pomoću citrometra protoka Guava easyCyte 8HT i analiziran pomoću softvera GuavaSoft InCyte.

[0235] Fig.23 obezbeđuje rezultate ovog ispitivanja za svih 32 davalaca i sve ispitivane molekule iz ovog ispitivanja. Na Fig.23A, indeks stimulacije je grafički prikazana, koji je dobijen iz odnosa proliferacije u prisustvu nasport u odsustvu ispitivanog proizvoda. Prag koji definiše davaoca koji odgovara (indeks stimulacije > 2) je označen isprekidanom linijom. Na Fig.23B, grafički je prikazan broj davaoca koji daju odgovor kako je definisano pragom. Očigledno, broj davalaca koji daju odgovor na referentni trastuzumab je jedan i samim tim je mali, dok 32 davaoca odgovaraju na pozitivnu kontrolu KLH jakom proliferacijom iznad praga. Za bispecifične fuzione polipeptide SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45, broj davalaca koji daju odgovor je takođe jedan u oba slučaja.

[0236] Eksperiment samim tim pokazuje da bispecifični fuzioni polipeptidi indukuju mali odgovor u in vitro oceni imunogenosti T ćelija, što ukazuje da je rizik indukovanja imunogenih odgovora mali.

Primer 24: Afinitet prema Fc-gama receptorima hFcγ RI/CD64 i hFcγ RIIIA/CD16a

[0237] Kako bi se izmerili vezujući afiniteti polipeptidnih fuzija konstruisanom, srži baziranoj na IgG4 (SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45) prema Fc-gama receptorima hFcγ RI/CD64 (R&D Systems) i hFcγ RIIIA/CD16a (R&D Systems), korišćeno je ispitivanje bazirano na površinskoj rezonanci plazmona (SPR). Trastuzumab služi kao kontrola monospecifičnog antitela sa IgG1 srži. U ispitivanju SPR afiniteta, polipeptidbe fuzije su biotinilisane i uhvaćene na senzorskom čipu CAP pomoću kompleta Biotin CAPture Kit (GE Healthcare). Senzorski čip CAP je prethodno imobilisan sa ssDNK oligonukleotidom. Nerazblaženi Biotin CAPture Reagens (streptavidin konjugovan sa komplementarnim ss-DNK oligomnukleotidom) se nanosi pri brzini protoka od 2 µL/min tokom 300 s. Nakon toga, 10 µg/mL biotinilisanog polipeptid fuzioni se nanosi tokom 300 s pri brzini protoka od 5 µL/min. Trastuzumab i polipeptidne fuzije su biotinilisane inkubacijom sa EZ-Link<®>NHS-PEG4-Biotin (Thermo Scientific) tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Višak neizreagovanog biotinskog reagensa je uklonjen pokretanjem reakcione mešavine na ZebaTM Spin Desalting Plate (Thermo Scientific). Referentni kanal je napunjen samo reagensom Biotin CAPture Reagens.

[0238] Da bi se odredio afinitet, četiri razblaženja hFcγ RI/CD64 (na 100, 25 i 6.25 i 1.6 nM) ili četiri do pet razblaženja hFcγ RIIIA/CD16a (na 1000, 333, 111, 37 i 12 nM) su pripremljene u radnom puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v surfaktant P20, 3 mM EDTA, pH 7.4 (GE Healthcare)) i nanesene na površinu čipa. Nanošenje pri brzini protoka od 30 µL/min, pri čemu je kontaktno vreme uzorka bilo 180 s a vreme disocijacije je bilo 1800 / 2700 s za hFcγ RI/CD64 ili 300 s hFcγ RIIIA/CD16a. Sva merenja su izvedena na 25°C. Regeneracija senzorskog čipa CAP površina se postiže ubrizgavanjem 6 M Gua-HCI sa 0.25 M NaOH što je praćeno dodatnim pranjem sa radnim puferom i periodom stabilizacije od 120 s. Pre proteinskih merenja izvedena su tri ciklusa regeneracije zbog kondicioniranja. Podaci su procenjeni sa softverom Biacore T200 Evaluation (V 2.0). Korišćeno je dvostruko označavanje. Za hFcγ RI/CD64 korišćen je model vezivanja 1:1 radi uklapanja sirovih podataka. Za hFcγ RIIIA/CD16a model afiniteta stabilnog stanja je korišćen radi uklapanja sirovih podataka.

[0239] Tabela 17 pokazuje rezultate uklapanja podataka za hFcγ RI/CD64. Ispitivani proizvod baziran na IgG1 Trastuzumab je pokazao afinitet od 0.3 nM. Polipeptidne fuzije SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 nisu pokazale značajno vezivanje za hFcγ RI/CD64. Ovi

[0240] podaci pokazuju da vezivanje za hFcγ RI/CD64 može da se smanji do beznačajnih nivoa prebacivanjem izotipa sa IgG1 na konstruisani IgG4.

Tabela 17:

[0241] Tabela 18 pokazuje rezultate uklapanja podataka za hFcγ RIIIA/CD16a. Dobijeni afinitet vezivanja za hFcγ RIIIA/CD16a ispitivanih proizvoda baziranih na IgG1 Trastuzumab je iznosio oko 350 nM dok su polipeptidne fuzije SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 su pokazale značajno vezivanje za hFcγ RIIIA/CD16a. Ovi podaci pokazuju da vezivanje za hFcγ RI/CD64 može biti smanjeno do beznačajnih nivoa prebacivanjem izotipa sa IgG1 na konstruisani IgG4.

Tabela 18:

Primer 25: Afinitet prema neonatalnom Fc receptoru

[0242] Kako bi se izmerili vezujući afiniteti polipeptidnih fuzija sa konstruisanom, srži baziranoj na IgG4 (SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45) prema neonatalnom Fc receptoru (FcRn, Sino Biologicals, #CT009-

4

H08H), korišćeno je ispitivanje bazirano na površinskoj rezonanci plazmona (SPR). Trastuzumab je služio kao kontrola monospecifičnog antitela sa IgG1 srži. U ispitivanju SPR afiniteta, FcRn je kovalentno imobilisan na CM5 senzorskom čipu (GE Healthcare) u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, posle aktiviranja karboksilnih grupa matrice dekstrana sa 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimidom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS), primarni amini FcRn proteinima je ostavljeno da reaguju sa NHS estrom na površini do postizanja signala od ~200 RU. Konačno, nereagovani NHS-estri su blokirani prolazom rastvora 1M etanolamina preko površine. Brzina protoka kroz postupak imobilizacije je bila 10 µl/min.

[0243] Kako bi se odredio njihov afinitet, šest razblaženja (1000 nM, 333 nM, 111 nM, 37 nM, 12 nM i 4 nM) konstrukata je pripremljeno u radnom puferu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% v/v Surfaktant P20, 3 mM EDTA, pH 6.0) i naneseni su na površinu čipa. Nanošenje pri brzini protoka od 30 µL/min, pri čemu je kontaktno vreme uzorka bilo 180 s a vreme disocijacije je bilo 30 s. Sva merenja su izvedena na 25°C. Regeneracija senzorskog čipa CAP površina se postiže ubrizgavanjem 10 mM glicina pH 3.0. Pre proteinskih merenja tri ciklusa regeneracije su izvedena zbog kondicioniranja. Podaci su procenjeni sa softverom Biacore T200 Evaluation (V 2.0) sa dvostrukim označavanjem. Modela afiniteta stabilnog stanja je korišćen za uklapanje sirovih podataka.

[0244] Kako je prikazano u tabeli 19, dobijeni vezujući afiniteti svih polipeptidnih fuzija prema FcRn su iznosili oko 2 µM što pokazuje da prebacivanje izotipa sa IgG1 na konstruisanu IgG4 srž nema detektabilnog uticaja na FcRn vezivanje.

Tabela 19:

Primer 26: Farmakokinetika fuzionih polipeptida kod miševa

[0245] Analiza farmakokinetike fuzionih polipeptida definisanih sa SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 je izvedena kod miševa. Mužjacima CD-1 miševa približne starosti 5 nedelja (3 miša po vremenskoj tački; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) je ubrizgan u repnu venu fuzioni polipeptid u dozi od 10 mg/kg. Ispitivani proizvodi se daju kao bolus upotrebom zapremine od 5 mL/kg. Uzorci plazme od miševa su dobijeni u vremenskim tačkama od 5 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 4 d, 8d i 14 d. Dovoljno cele krvi – uzete pod izofluranskom anestezijom – je sakupljeno da bi se dobilo najmanje 100 µL Li-heparin plazme po životinji i vremenu. Nivoi leka su detektovani pomoću Sandwich ELISA koji detektuje puni bispecifični konstrukt putem ciljeva GPC3 i CD137. Podaci su uklopljeni upotrebom modela sa dva odeljka upotrebom Prism GraphPad 5 softvera.

Claims

[0246] Fig.25 prikazuje grafički prikaz koncentracije u plazmi tokom vremena za konstrukte SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45, sa umetanjem koje pokazuje iste podatke u polualgoritamskom grafičkom prikazu. Farmakokinetika je izgledala slično u oba slučaja. Počevši od koncentracije u plazmi od oko 150 µg/mL, nivoi u plazmi su pali do pozadinskih nivo za oko 100 sati. Bieksponencijalno propadanje modela sa dva odeljka je uspešno primenjeno da se tačno opišu podaci, i uklapanje podataka (Fig.25) upotrebom ovog modela je dovelo do terminalnih poluživota od 13.7 h za SEQ ID NO: 44 i 10.0 h za SEQ ID NO: 45.

[0247] Podaci pokazuju da bispecifične fuzije imaju polu-živote koji su u neposrednom opsegu od onoga šta može da se očekuje za Fc fuzione proteine.

Primer 27: Farmakokinetika fuzionih polipeptida kod makaki majmuna

[0248] Analiza farmakokinetike fuzionih polipeptida definisana SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45 je izvedena kod makaki majmuna. Mali makaki majmuni su primali intravensku infuziju tokom 60 minuta, sa dozom od 3 mg/kg ispitivanog proizvoda. Uzorci plazme od makaki majmuna su dobijeni u vremenskim tačkama od 15 min, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d, 7 d, 9 d, 11 d, 14 d, 18 d, i 24 d. Nivoi leka su detektovani upotrebom Sandwich ELISA koji detektuje puni bispecifični konstrukt putem ciljeva HER2 i CD137. Nivoi trastuzumaba u plazmi su određeni upotrebom Sandwich ELISA sa ciljevima HER2 i humanim Fc. Podaci su uklopljeni pomoću modela sa dva odeljka upotrebom Prism GraphPad 5 softvera.

Fig.26 prikazuje grafički prikaz koncentraciju u plazmi tokom vremena za konstrukte SEQ ID NO: 44 i SEQ ID NO: 45, sa umetanjem koje pokazuje iste podatke na polilogaritamskom grafičkom prikazu.

Farmakokinetika je izgledala slično u oba slučaja, sa SEQ ID NO: 44 koja prikazuje očigledno duži poluživot. Počevši od koncentracije u plazmi od oko 70 µg/mL, nivoi u plazmi opadaju do nivoa blizu nule tokom vremenskog trajanja od 200 h. Bieksponencijalno propadanje modela sa dva odeljka je uspešno primenjeno da se tačno opišu podaci, i uklapanje podataka (Fig.26) upotrebom ovog modela je dovelo do terminalnih poluživota od 39 h (SEQ ID NO: 44) i 24.1 h (SEQ ID NO: 45), tim redom.

[0249] Podaci samim tim pokazuju da bispecifična fuzije imaju terminalne poluživote kod makaki majmuna koji su se povećavali u odnosu na poluživot kod miševa, i u razumnom opsegu za biološki terapeutik.

[0250] Načini ostvarivanja ilustrativno ovde opisani mogu pogodno da se praktikuju u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ograničenja ili više njih, koji ovde nisu specifično otkriveni. Tako na primer, pojmovi "koji obuhvata", "koji uključuje", "koja sadrži", itd. će imati široko značenje i bez ograničenja.

Patentni zahtevi

1. Fuzioni protein naznačen time,

što je taj fuzioni protein sposoban da vezuje i CD137 i glipikan-3 (GPC3), i

što taj fuzioni protein obuhvata najmanje dve podjedinice bilo kojim redosledom, pri čemu prva podjedinica obuhvata lipokalinski mutein specifičan za CD137 koji ima sekvencu najmanje 85% identičnu sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33, a druga podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, njegov antigen-vezujući domen, ili lipokalinski mutein specifičan za GPC3.
2. Fuzioni protein prema zahtevu 1, pri čemu druga podjedinica obuhvata lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za GPC3.
3. Fuzioni protein prema zahtevu 2, pri čemu taj fuzioni protein dalje obuhvata treću podjedinicu koja je (i) fragment imunoglobulina-Fc,

(ii) specifična za CD137, ili

(iii) lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za CD137.
4. Fuzioni protein prema zahtevu 2 ili 3, pri čemu

lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za GPC3 obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom najmanje 85% identičnom sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17, ili sa sekvencom najmanje 90% identičnom sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17, ili sa sekvencom najmanje 95% identičnom sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17, ili koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-17.
5. Fuzioni polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu

lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za CD137 obuhvata sledeći skup ostataka mutiranih aminokiselina u poređenju sa linearnom polipeptidnom sekvencom zrelog hNGAL (SEQ ID NO: 2):

Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; i Lys 134 → Tyr.
6. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu

(i) lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za CD137 ima sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33;

(ii) lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za CD137 ima sekvencu najmanje 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33; ili

(iii) lipokalinski mutein sa specifičnošću vezivanja za CD137 obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18-33.
7. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu taj fuzioni polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 48 ili aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 49.
8. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu imunoglobulin predstavlja monoklonalno antitelo.
9. Fuzioni protein prema zahtevu 8, pri čemu

(a) monoklonalno antitelo ima IgG4 srž,

pri čemu opciono IgG4 srž ima bilo koju od sledećih mutacija izabranu iz grupe koju čine S228P, N297A, F234A, i L235A; ili

(b) monoklonalno antitelo ima IgG2 srž,

pri čemu opciono IgG2 srž ima bilo koju od sledećih mutacija izabranu iz grupe koju čine N297A, F234A, i L235A.
10. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu taj fuzioni protein obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 44, aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 45, aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 46, ili aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 47.
11. Molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-10.
12. Ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 11.
13. In vitro postupak proizvodnje fuzionog proteina prema bilo kom od zahteva 1-10, pri čemu se taj fuzioni protein proizvodi počevši od nukleinske kiseline koja kodira za fuzioni protein pomoću postupaka genetskog inženjeringa,

pri čemu se opciono fuzioni protein proizvodi u bakterijskom ili eukariotskom organizmu domaćina i izolovan je iz organizma domaćina ili njegove kulture.
14. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-10 za upotrebu u lečenju kancera.
15. Fuzioni protein za upotrebu prema zahtevu 14, koji obuhvata

(i) simultano aktiviranje nishodnih signalnih puteva CD137 i uključivanje GPC3-pozitivnih tumorskih ćelija, koje obuhvata primenu fuzionog proteina ili kompozicije koja obuhvata takav fuzioni protein; (ii) simultano zajedničko stimulisanje T ćelija i uključivanje GPC3-pozitivnih tumorskih ćelija, koje obuhvata primenu fuzionog proteina ili kompozicije koja obuhvata takav fuzioni protein;

(iii) simultano indukovanje proliferacije T limfocita i uključivanje GPC3-pozitivnih tumorskih ćelija, koje obuhvata primenu fuzionog proteina ili kompozicije koja obuhvata takav fuzioni protein; ili (iv) usmeravanje CD137 gomilanja i aktivacije T ćelija na GPC3-pozitivne tumorske ćelije, koje obuhvata primenu fuzionog proteina ili kompozicije koja obuhvata takav fuzioni protein.
16. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-10.