JP7312168B2 - Cd137に結合するシングルドメイン抗体 - Google Patents
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Description
a)本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
b)腫瘍特異抗原に結合する部分
を含んでなる結合性分子も提供される。
(a)実施例において測定されるKDでヒトCD137に結合する;
(b)CD137を発現する細胞に結合するが、CD137を発現しない細胞には結合しない。これは、実施例6に示されるように測定することができる;
(c)最小限の細胞内部移行を示す。これは、実施例に示されるように測定することができる;
(d)CD137リガンドと細胞の表面に発現したCD137との間の相互作用を阻害する。これは、実施例6に示されるように測定することができる;
(e)T細胞におけるCD137シグナル伝達を活性化しない。これは、実施例に示されるように測定することができる;
(f)CD8+細胞からのIL-2産生を刺激しない。これは、実施例9に示されるように測定することができる;
(g)マウスCD137に結合しない;
(h)実施例に示される良好な安定性を提供する;
(i)レポーター遺伝子活性を増加させず、このため、アゴニストCD137活性を有さない。これは、実施例9に示されるように測定することができる;
(j)カニクイザルCD137に結合する、かつ/または
(k)PSMAに結合するVHと連結された場合、in vivoでの腫瘍成長を阻害する。これは、例えば、実施例、例えば実施例10のように測定することができる。
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表1に示されるシングルドメイン抗体のうちの1つに関して示されるCDR1、CDR2および/またはCDR3を含んでなる。一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表1に示されるシングルドメイン抗体のうちの1つに関して示されるCDRの組から選択される一組のCDR1、CDR2またはCDR3を含んでなる。一つの実施形態において、CDR1、CDR2、CDR3は、表1におけるCDRのうちの1つと少なくとも40%、少なくとも75%または少なくとも80%の相同性を有する。一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号1もしくはそれと少なくとも40%、少なくとも75%もしくは少なくとも80%の相同性を有する配列を含んでなるCDR1、配列番号2もしくはそれと少なくとも40%、少なくとも75%、少なくとも80%もしくは少なくとも90%の相同性を有する配列を含んでなるCDR2、および配列番号3もしくは少なくとも40%、少なくとも75%、少なくとも80%もしくは少なくとも90%の相同性を有する配列を含んでなるCDR3、または配列番号5もしくはそれと少なくとも40%、少なくとも75%、少なくとも80%もしくは少なくとも90%の相同性を有する配列を含んでなるCDR1、配列番号6もしくはそれと少なくとも40%の相同性を有する配列を含んでなるCDR2、および配列番号7などを含んでなるCDR3を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号309、310および311またはそれと少なくとも75%の相同性を有する配列に示されるCDR1、CDR2またはCDR3を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号873、874および875またはそれと少なくとも40%、少なくとも75%、少なくとも80%または少なくとも90%の相同性を有する配列に示されるCDR1、CDR2またはCDR3を含んでなる。CDRは、Kabatに従って定義される。
一つの実施形態において、変異体は、配列番号4(VH1.1)に関する1つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ:
・F37V、
・E61V + E65K
・E65K
・V70I
・V79L
・F37V + E61V + E65K + V70I +V79L
・E61V + E65K + V70I +V79L
・F37V + E61V + E65K + V70I + V79L + G55E + D101V + D105I
・F37V + E61V + E65K + V70I +V79LFGL + G55E + D101E + D105I
・E61V + E65K + V70I +V79L + G55E
・E61V + E65K + V70I +V79L + G55E + D105I
・E61V + E65K + V70I +V79L + D54G、E61V + E65K + V70I + V79L + D54E、
・E61V + E65K + V70I + V79L + D101E
・E61V + E65K + V70I +V79L + D101Vまたは
・E61V + E65K + V70I +V79L + G55E + D101V + D105I、E61V + E65K + V70I +V79L + G55E + D101E + D105I
を含んでなる。
a)E61V + E65K + V70I + V79L + G55E + D101→以下のF、L、I、M、V、S、P、T、A、Y、H、Q、K、D、W、R、Gから選択される任意のアミノ酸;
b)E61V + E65K + V70I + V79L + G55E + D105→以下のF、L、M、S、P、T、A、Y、H、Q、N、K、D、E、W、R、Gから選択される任意のアミノ酸、または
c)E61V + E65K + V70I + V79L + G55E、D101→以下のF、L、I、M、V、S、P、T、A、Y、H、Q、K、D、W、R、Gから選択される任意のアミノ酸 + D105→以下のF、L、M、S、P、T、A、Y、H、Q、N、K、D、E、W、R、Gから選択される任意のアミノ酸
を含んでなる。
・Q1E + T25S
・Q1E + S84N
・Q1E + F95Y
・Q1E + T25S + S84N
・Q1E + T25S + F95Y
・Q1E + S84N + F95Y
・Q1E + T25S + S84N + F95Yまたは
・Q1E + T25S + G55E + S84N + F95Y
を含んでなる。
・V20L、
・F37I、
・N85S、
・N95Y、
・V20L + H95Y
・V20L + F37I + N85S + H95Y、V20L + N85S + H95Y、
・V20L + F37I + N85S + H95Y + S101A、
・V20L + F37I + N85S + H95Y + S101Pまたは
・V20L + N85S + H95Y + S101A、V20L + N85S + H95Y +S101A
配列番号624(VH2.50)に関する1つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ:
・S35T + V48I + I57T + L103M + T104R + T107I
・S35T + A101T + L103V + T104R + T107V
・S35T + V48I + I57T + A101E + L103L + T104W + T107V
・S35T + V48I + L103T + T104R + T107V
・Y32H + S35T + V48I + S52G + S54D + D56A + I58L + A101L + T104P + T107I + N111H
・S35T + A101T + L103V + T104R + T107V + N111S
・A28T + S30T + Y33W + S35T + V48I + G53S + S54D + D56K + I57T + L103M + T104P + T107I + N111Y
・S35T + V48I + L103T + T104R + T107V + N111S
・S35T + V48I + I57T + S101E + T104W + T107V + N111Sまたは
・S35T + V48I + I57T + L103M + T104R + T107I + N111S
を含んでなる。
本明細書に記載されるシングルVHドメイン抗体は、優れた安定性を示す。さらに、本明細書に記載されるVHシングルドメイン抗体は、ヒトCD137に対して特異性を示す。本明細書に記載されるVHシングルドメイン抗体はまた、CD137に対するCD137Lの結合も阻害する。
本発明はさらに、本発明のシングルドメイン抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、DNAおよび/またはRNAを含み得る。一つの態様において、本発明は、CDR、例えばCDR3、2つもしくは3つのCDRの組、または上記に示される本発明の完全長シングルVHドメイン抗体をコードする核酸を提供する。
一つの態様において、本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および第2の抗原、例えば腫瘍特異抗原に結合する少なくとも第2の部分を含んでなる結合性分子が提供される。用語 結合性物質および結合性分子は、本明細書において互換的に使用される。結合性分子は、融合タンパク質であってもよい。
a)本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
b)腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体
を含んでなる結合性分子が提供される。
(a)実施例において測定されるKDでヒトCD137に結合する;
(b)ヒトCD137リガンドと細胞CD137リガンドの表面に発現したヒトCD137との間の相互作用を阻害する。これは、実施例6に示されるように測定することができる。
(c)マウスCD137に結合しない;
(d)CD137を発現する細胞に結合するが、CD137を発現しない細胞には結合しない。これは、実施例6に示されるように測定することができる;
(e)レポーター遺伝子活性を増加させる。これは、実施例9に示されるように測定することができる。
(f)実施例10に示されるように、in vivoでの腫瘍細胞成長を阻害する;
(g)CD8+T細胞増殖を促進する;
(h)細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化を誘導する;
(i)CD8+細胞からのIL-2産生を刺激する。これは、実施例9に示されるように測定することができる;
(j)腫瘍特異的T細胞活性化を誘導する;
(k)実施例において測定されるように、T細胞におけるCD137シグナル伝達を活性化する;
(l)活性化誘導細胞死を阻害する;
(m)T細胞生存を増強する;
(n)全身性のT細胞活性化を制限する;
(o)T細胞の細胞傷害性エフェクター機能を増強する;
(p)腫瘍抗原陽性腫瘍における抗腫瘍細胞の局所活性化を促進する;
(q)CD137陽性NK細胞活性化を介した抗体依存性細胞傷害性を増強する;
(r)腫瘍特異抗原に結合する部分に連結された場合、CD137および腫瘍特異抗原、例えばPSMAに同時に結合する;
(s)カニクイザルCD137に結合する;
(t)T-reg細胞の制御因子機能を逆転させる;
(u)NK細胞を活性化する;
(v)T細胞を腫瘍細胞に動員する。
一つの実施形態において、上記のシングルドメイン抗体または結合性物質は、さらなる結合性分子を含んでなる。このように、結合性物質は、例えば、三特異性または四特異性であり得る。さらなる特異性も同様に想像される。上記の分子の任意の組合せを、多特異性の結合性物質、例えば本明細書に記載されるCD137に結合するシングルドメイン抗体ならびに第2および第3の結合特異性を含む三特異性の結合性物質において作製することができる。
本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、CD137抗原による刺激時に重鎖のみの抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物、例えば齧歯類から得ることができる。トランスジェニック齧歯類、例えばマウスは、好ましくは内因性の抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。このように、一つの実施形態において、齧歯類は、内因性の軽鎖および/または重鎖抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。従って、齧歯類、例えばマウスは、例えば以下に詳しく説明するように、機能的な軽鎖および/または重鎖が産生されないように、内因性のカッパおよびラムダ軽鎖ならびに/または重鎖抗体遺伝子の発現を妨害する改変を含んでなり得る。
a)トランスジェニック齧歯類、例えばマウスをCD137抗原によって免疫する工程であって、前記齧歯類が、再構成されていないヒト重鎖V遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、
b)ヒト重鎖のみの抗体を単離する工程
を含んでなる方法にも関する。
a)トランスジェニック齧歯類をCD137抗原によって免疫する工程であって、前記齧歯類、例えばマウスが、再構成されていないヒト重鎖V遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、
b)前記齧歯類、例えばマウスからVHドメイン配列を含んでなる配列のライブラリを生成する工程、および
c)前記ライブラリからVHドメイン配列を含んでなる配列を単離する工程
を含んでなる方法にも関する。
a)アミノ酸配列をコードする核酸配列の組、コレクション、またはライブラリを提供する工程;および
b)CD137に結合することができる/CD137に対して親和性を有するアミノ酸配列に関して、前記組、コレクション、またはライブラリをスクリーニングする工程;および
c)CD137に結合することができる/CD137に対して親和性を有するアミノ酸配列(複数)を単離する工程
を含んでなり得る。
一つの態様において、本発明者らは、抗がん剤または免疫調節剤として使用するための、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体および本明細書に記載される結合性物質を提供する。
本発明の分子または医薬組成物は、唯一の活性成分として、または1つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与してもよい。治療剤は、疾患の処置において有用である化合物または分子である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。抗体分子には、完全な抗体またはその断片(例えば、Fab、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv断片(scFv)、またはシングルドメイン抗体、例えばVHドメイン、または抗体模倣タンパク質が挙げられる。
さらに別の態様において、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、対象に、本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、CD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。好ましくは、結合性分子は、対象における免疫応答を増強する、刺激する、または増加させる。
別の態様において、少なくとも1つの治療剤および/または診断剤にコンジュゲートされた本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子を含んでなる免疫コンジュゲートが提供される。
別の態様において、本発明は、例えば本明細書に記載される疾患もしくは免疫応答を処置もしくは予防するため、および/または本発明のシングルドメイン抗体を含んでなる疾患を診断する、予後を判定する、もしくはモニターするためにPD-1を検出するためのキットを提供する。そのようなキットは、CD137タンパク質の検出を補助する他の構成要素、包装、説明書、または材料を含み得る。キットは、標識されたCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、および標識を検出するための1つまたは複数の化合物を含み得る。
別の態様において、本明細書に記載されるCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、診断試験およびアッセイなどの非治療目的のために使用される。試験試料中のヒトCD137の存在を検出する方法は、前記試料を、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体、および少なくとも1つの検出可能な標識と接触させる工程、ならびにヒトCD137に対する前記シングルドメイン抗体の結合を検出する工程を含んでなる。
内因性の重鎖および軽鎖抗体発現に関して沈黙化されているバックグラウンド内の生殖系列構成にヒト重鎖抗体トランスジェニック座を有するマウス(トリプルノックアウト、またはTKO)を、既に記述されている通りに作製した(WO2004/076618, WO2003/000737, Ren et al., Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003およびWO2016/062990)。要約すると、トランスジェニックマウスを、CH1ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて過剰なヒトVH、D、およびJ遺伝子を含んでなる酵母人工染色体(YAC)を、新鮮な受精卵母細胞の前核へのマイクロインジェクション後に誘導した。使用したYACは、複数のヒト重鎖V遺伝子、複数のヒト重鎖DおよびJ遺伝子、マウスCH1遺伝子、およびマウス3’エンハンサー遺伝子を含んだ。これはCH1エクソンを欠如する。
8~12週齢のTg/TKOマウスを、ヒトCD137-ヒトFcキメラタンパク質(Acro Biosystems、カタログ番号41B-H5258)、ヒトCD137-Hisタグタンパク質(R&D Systems、カスタム製品)、ヒトCD137を過剰発現するCHO細胞(標準的な方法を使用して施設内で生成された細胞株)、または組換えタンパク質およびCHOヒトCD137発現細胞の組合せによって免疫した。
血清を免疫の前後にマウスから回収し、CD137抗原による免疫に応答した血清中ヒトCD137反応性重鎖抗体の存在に関してELISAによってチェックした。
上記の免疫したマウスからのライブラリの生成は、以下に概要するライブラリ生成の標準プロトコールに従った。
ライブラリファージストックの調製およびファージディスプレイ選択は、公表された方法(Antibody Engineering, Benny Lo編, 8章, 161~176頁, 2004)に従って実施した。ほとんどの場合、パニングアプローチと組み合わせたファージディスプレイを使用して、結合VHドメインを単離した。しかしながら、可溶性タンパク質選択、細胞に基づく選択、およびストレス(例えば、熱)下で実施する選択を含む、多様な異なる選択方法が当技術分野において十分に記載されている。
ライブラリの選択後、ヒトCD137を発現するCHO細胞に結合し、CHO親細胞に結合せず、CHO細胞の表面に発現したヒトCD137と組換えヒトCD137リガンドタンパク質との間の相互作用を阻害する特定のVHを、細菌ペリプラズム抽出物のシングルポイントスクリーニングによって同定した。小規模細菌ペリプラズム抽出物を、標準的な技術に従って深型ウェルプレートにおいて成長させた1ml培養物から調製した。上清中のHisタグVHのCHOヒトCD137細胞および非CD137特異的結合の決定のためのCHO親細胞に対する結合を、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術(FMAT)を使用して評価した。TTP Mirrorballプレートリーダーにおいて、488nmおよび640nmで励起後、FL2(502nm~537nm)およびFL5(677~800nm)チャネルにおいて蛍光発光を測定した。データを、FL5の境界およびピーク強度でゲートを設定し、ゲート設定したデータのFL2平均蛍光強度の中央値を、VH結合の決定のために使用した。
表1に、ファミリー1のVHの配列を示し、表2に、ファミリー2のVHの配列を示す。上記のように同定した各々の個々のVHクローンをファージミドからシークエンシングし、VH生殖系列およびCDR3アミノ酸類似性に基づいて群分けした。代表的なクローンをさらに特徴付けした。さらなるクローンを、それぞれクローンHumabody(登録商標)VH1.1およびHumabody(登録商標)VH2.1の配列最適化によって生成し、結合活性を改善し、生殖系列に配列を復帰させ、または生物物理学的配列ライアビリティ(liabilities)、例えば異性化または脱アミド部位を除去した。
a)精製VHの調製
精製VHを、標準的な手順に従って、ペリプラズム抽出物のニッケル-アガロースアフィニティクロマトグラフィー精製のために、VH C末端6xHISタグを使用することによって得た。精製VHの収率を、分光光度法によって推定し、SDS PAGEを使用して純度を評価した。あるいは、VHを、標準的な手順に従って、pJExpressベクターを有するW3110大腸菌の上清から精製した。精製VHの収率を、分光光度法によって推定し、SDS PAGEを使用して純度を評価した。必要に応じて、Vivaspin 20、3kDa MWCO PES、濃縮器(Sartorius、# VS2092)を使用して試料を濃縮し、Etoxiclear樹脂(Prometic、# 3250-00010)を使用してエンドトキシンを枯渇させた。
CD137に対して特異的であるHumabody(登録商標)VHおよびPSMAに対して特異的であるVHをコードするDNA配列を、PCRにより増幅した。それらを、VH配列がグリシン/セリンリッチ配列をコードするリンカーと隣接するより大きな断片に構築し、制限酵素に基づく方法によって発現ベクターにライゲートした。プラスミドを、標準的な技術に従って微生物発現系に形質転換した。Humabody(登録商標)VH配列の存在を、標準的なコロニーPCR法によって確認した。次に、ベクター特異的および内部プライマーを使用して、Sangerシークエンシングによってインサート配列を確認し、完全な配列包括度を確実なものとした。例示的な構築物に関する配列を以下に示す。
1 MWNLLHETDS AVATARRPRW LCAGALVLAG GFFLLGFLFG WFIKSSNEAT NITPKHNMKA
61 FLDELKAENI KKFLYNFTQI PHLAGTEQNF QLAKQIQSQW KEFGLDSVEL AHYDVLLSYP
121 NKTHPNYISI INEDGNEIFN TSLFEPPPPG YENVSDIVPP FSAFSPQGMP EGDLVYVNYA
181 RTEDFFKLER DMKINCSGKI VIARYGKVFR GNKVKNAQLA GAKGVILYSD PADYFAPGVK
241 SYPDGWNLPG GGVQRGNILN LNGAGDPLTP GYPANEYAYR RGIAEAVGLP SIPVHPIGY
301 DAQKLLEKMG GSAPPDSSWR GSLKVPYNVG PGFTGNFSTQ KVKMHIHSTN EVTRIYNVIG
361 TLRGAVEPDR YVILGGHRDS WVFGGIDPQS GAAVVHEIVR SFGTLKKEGW RPRRTILFAS
421 WDAEEFGLLG STEWAEENSR LLQERGVAYI NADSSIEGNY TLRVDCTPLM YSLVHNLTKE
481 LKSPDEGFEG KSLYESWTKK SPSPEFSGMP RISKLGSGND FEVFFQRLGI ASGRARYTKN
541 WETNKFSGYP LYHSVYETYE LVEKFYDPMF KYHLTVAQVR GGMVFELANS IVLPFDCRDY
601 AVVLRKYADK IYSISMKHPQ EMKTYSVSFD SLFSAVKNFT EIASKFSERL QDFDKSNPIV
661 LRMMNDQLMF LERAFIDPLG LPDRPFYRHV IYAPSSHNKY AGESFPGIYD ALFDIESKVD
721 PSKAWGEVKR QIYVAAFTVQ AAAETLSEVA
b)結合アッセイ
精製Humabody(登録商標)VHを、ヒトCD137タンパク質、アカゲザルCD137Fc組換えタンパク質、マウスCD137タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーOX40およびGITR(グルココルチコイド誘導性TNFR関連)、CHOヒトCD137細胞、CHO親細胞ならびにヒトT細胞に対する結合に関して試験した。
精製Humabody VHが、CHOヒトCD137細胞に対するCD137リガンドの結合を阻害する能力を、本質的に実施例6に記載の通りに、FMATリガンド阻害アッセイにおいて測定した。連続希釈したVHから決定したIC50値を表12に示す。VHは、ヒトCD137に対するヒトCD137リガンドの結合を阻害した。
精製Humabody(登録商標)VHをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。簡単に説明すると、精製VHを、PBS緩衝液中の8.98~9.26mg/mlの間で、4℃または40℃のいずれかで0~14日間保存した後、Waters ACQUITY BEH 125Å SECカラム上での分離のために、PDA検出器(280nmでの検出)を含むWaters H-Class Bio UPLCを使用して様々な時点で分析した。試料を、10μl体積で注入し、200mM NaCl、100mMリン酸ナトリウム、pH7.4+5%プロパン-1-オールを含む移動相によって流速0.4ml/分で実行した。データを6分間収集し、貯蔵後の単量体を含んでなる試料の百分率を計算した(代表的なデータについては表13)。これらのデータは非最適化緩衝液条件下で収集されたことに留意するべきである。
Humabody(登録商標)VHの血清中安定性を、マウス血清(Sigma、M5905)またはヒト血清(Sigma、H4522)において0、1、3/4、または7日間インキュベーション後のそれらの活性の測定によって評価した。プレインキュベートした試料を、連続希釈し、実施例6において既に記載されているFMAT CHO CD137リガンド阻害およびCHO CD137結合アッセイにおいて試験した。血清によるインキュベーションの後、活性の最小限の損失が認められた(代表的なデータについては表14)。
一価VHがCD137アゴニストとして作用する能力を、CD137およびNF-kBルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するJurkat細胞を使用してレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。それらの活性を、相互作用を回避する可能性が増加している二価および三価分子、ならびに腫瘍抗原PSMAに結合したVHと連結したCD137 VHからなる二特異性分子と比較した。二特異性分子において、CD137アゴニズムは、CD137およびPSMAを発現した細胞の両方の同時関与から生じた。
CHOヒトCD137細胞を、ポリ-L-リシンをコーティングしたカバーガラスに播種し、一晩接着させた。一価VH(500nM)、三価VH(500nM)および抗CD137ベンチマーク抗体(100nM)を、10%FBS/0.5%脂肪酸不含BSAを補充したRPMIにおいて調製し、細胞で4℃にて30分間インキュベートした。次に、試料を、37℃で2時間インキュベートした後、室温にて10分間4%PFAで固定し、PBSで3回洗浄したか、または4℃でのインキュベーションの直後に固定した(対照試料)。洗浄工程の後、試料を室温にてPBS中0.5%サポニンで10分間透過処理し、PBSで3回洗浄し、1%BSA/10%FBS/0.05%Tween-20を含むPBSで45分間ブロックした。PBS/0.5%BSA/0.05%Tween-20を含む染色緩衝液中の抗ヒトAlexa Fluor-488抗体(1:2000希釈)で1時間染色することによって、抗体を検出した。Humabody(登録商標)VHは、抗His抗体(1:500希釈)に次いで、抗マウスAlexa Fluor-488二次抗体(1:2000希釈)で染色することによって、検出した。試料をPBS/0.05%Tween-20(PBS-T)で洗浄した後、LAMP-1に対する一次抗体(染色緩衝液中1:200希釈)を使用して、リソソームを1時間染色した。PBS-Tで3回洗浄した後、試料を抗ウサギAlexa Fluor-647(染色緩衝液中1:500希釈)で染色し、次いで再度洗浄した。カバーガラスをスライドに載せ、Apo 60x Oil λS DIC N2対物レンズを備えたNILON A1R共焦点システム(レーザー線488nmおよび640nm)を使用して画像化した。
雄NCGマウス(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl、Charles River)に対し、50%マトリゲル中1×107個のDU145 PSMA細胞を右側腹部に皮下注射した。8日目に、hPBMC(HemaCare BioResearch Products)を、尾静脈を介して移植した。非移植マウスを対照群として使用した。次に、マウスを、腹膜内投与したHumabody(登録商標)または対照CD137アゴニスト抗体で処置し、体重、臨床観察、および腫瘍容積を記録した。拘束、飼育、外科手技、食餌および液体の調節、ならびに獣医学的ケアに関してGuide for Care and Use of Laboratory Animalsの推奨に特別に従い、AAALACによって公認されているCharles River Discovery Services North Carolina(CR Discovery Services)において試験を実施した。半減期延長二特異性Humabody(登録商標)処置群は、対照群と比較して減少した腫瘍容積を示した(図7)。
健常ドナーからのPBMCを、処置前に16時間、10ng/ml SEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB)で刺激した。CHO細胞またはPSMAを発現するCHO細胞を、10,000個/ウェルで96ウェルプレートに播種した。Humabody(登録商標)構築物を添加し、終濃度50nMおよび4倍希釈シリーズとした。SEB刺激PBMCを、1ng/ml SEBを含む培地に75,000個/ウェルで添加した。プレートを37℃、5%CO2で3日間インキュベートした。サイトカイン測定のために上清を回収した。TNF-αを、製造元の説明書に従ってCisbio HTRFキット(62HTNFAPEG)を使用して測定した。TNF-αは、PSMAを発現する細胞の存在下で、二特異性Humabody(登録商標)依存的な用量反応様式で増加した。PSMAの非存在下では誘導はみられなかった。
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Claims (27)
- ヒトCD137に結合するが、単一特異性エンティティとしてCD137に結合した場合、CD137シグナル伝達を誘発しない、単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体であって、
前記シングル可変重鎖ドメイン抗体が、CD137に対するCD137Lの結合を阻害し、
前記シングル可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号873を含んでなるCDR1、配列番号874を含んでなるCDR2および配列番号875を含んでなるCDR3を含んでなる、シングル可変重鎖ドメイン抗体。 - ヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項1に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
- 配列番号876またはそれと少なくとも90%の相同性を有する配列を含んでなる、請求項1に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
- 0.4nMまたは3nMのKDの親和性でCD137に結合することができる、請求項1~3のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
- ヒトV、DおよびJ領域を含んでなるトランスジーンを発現するトランスジェニック齧歯類から得られたまたは得ることができる、請求項1~4のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
- 前記齧歯類が、機能的な内因性の軽鎖および重鎖を産生しない、請求項5に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
- a)請求項1~6のいずれか一項に記載のCD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
b)腫瘍特異抗原に結合する部分
を含んでなる、結合性分子。 - 腫瘍特異抗原に結合する部分が、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、重鎖、軽鎖、シングル可変ドメイン抗体またはシングル可変重鎖ドメイン抗体から選択される、請求項7に記載の結合性分子。
- CD137に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ペプチドリンカーにより、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されている、請求項7または8に記載の結合性分子。
- 前記リンカーが(G4S)nリンカー(式中、nは1~4である)から選択される、請求項9に記載の結合性分子。
- 腫瘍特異抗原が、PSMA、Her2、CD123、CD19、CD20、CD22、CD23、CD74、BCMA、CD30、CD33、CD52、EGRF、CECAM6、CAXII、CD24、CEA、メソセリン、cMet、TAG72、MUC1、MUC16、STEAP、EphvIII、FAP、GD2、IL-13Ra2、L1-CAM、PSCA、GPC3、Her3、gpA33、5T4およびROR1から選択される、請求項7~10のいずれか一項に記載の結合性分子。
- 前記シングル可変重鎖ドメイン抗体または結合性分子が、毒素、酵素、放射性同位体、半減期延長部分、標識または治療分子から選択される1つまたは複数の部分とコンジュゲートされている、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体または請求項7~11のいずれか一項に記載の結合性分子。
- 前記半減期延長部分が、アルブミン結合性部分、トランスフェリン結合性部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、および、アルブミン結合性ペプチドまたはヒト血清アルブミンに結合するシングルドメイン抗体からなる群から選択される、請求項12に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体または結合性分子。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子と、薬学的担体とを含んでなる、医薬組成物。
- 疾患の処置に使用するための、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項14に記載の医薬組成物。
- 疾患が、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症または免疫不全から選択される、請求項15に記載の使用のための、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項14に記載の医薬組成物。
- がんが、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、乳がん、脳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、腎臓がん、軟部組織肉腫、尿道がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫、尿路上皮癌、白血病、前立腺がん、中皮腫、副腎皮質癌、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、胃がん、および多発性骨髄腫から選択される、請求項15もしくは16に記載の使用のための、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項14に記載の医薬組成物。
- 試薬および/または使用説明書とともに、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項14に記載の医薬組成物を含んでなる、キット。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸配列を含んでなる、核酸分子。
- 配列番号887を含んでなる、請求項19に記載の核酸分子。
- 請求項19または20のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 請求項19もしくは20のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項21に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、細菌、酵母、ウイルスまたは哺乳動物細胞である、請求項22に記載の宿主細胞。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体を産生する方法であって、
宿主細胞において前記シングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸を発現させる工程、および
宿主細胞から前記シングル可変重鎖ドメイン抗体を単離する工程を含んでなる、方法。 - CD137による免疫の後にトランスジェニックマウスから得られたまたは得ることができるヒトCD137に結合する、請求項1~6のいずれか一項に記載のVHドメインを含んでなる重鎖のみの抗体であって、前記マウスは、ヒトV、DおよびJ座を発現するが、機能的な内因性のラムダおよびカッパ軽鎖ならびに重鎖を産生しない、抗体。
- CD8+T細胞増殖を促進し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性化および/またはサイトカイン放出を誘導するin vitroの方法であって、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項7~13のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項14に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
- 腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子における、請求項1~6のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体の使用。
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