CN111683968A - 结合至cd137和psma的分子 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及同时结合CD137和PSMA并且包含对CD137特异的单结构域抗体和结合PSMA的部分的试剂。本公开还涉及此类试剂例如在癌症的治疗或检测中的治疗和诊断应用。
Description
背景技术
癌症仍然是世界上主要的死亡原因之一。最近的研究已经表明,全世界估计有1270万癌症病例。预计到2030年,这一数字将增加到2100万(Vinay和Kwon 2014)。
CD137(4-1BB,TNFRS9)是属于TNF受体超家族的1型跨膜糖蛋白。它最初是由Kwon等人(1989)从激活的鼠T细胞的cDNA中克隆的。随后显示其具有在T细胞、B细胞、NK和NK T细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上发现的广泛的免疫细胞表达模式。还已经报道了在非造血细胞,例如上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上以及在肿瘤细胞系上的表达。CD137表达主要是激活诱导的,尽管已经在一些细胞类型包括Treg和DC’s上证明了低水平的组成型表达。。
255个氨基酸的人CD137蛋白(Genbank登录号NP_001552)由17个氨基酸的信号肽序列,含有四个富半胱氨酸结构域的细胞外区域,27个氨基酸的跨膜区域和短的42个氨基酸的细胞内结构域组成。它作为单体和二聚体同时存在于细胞表面。CD137的主要配体是CD137配体(CD137L,4-1BB-L,TNFS9),尽管与促进受体聚集的半乳凝素-9(Madireddi等,2014)和诸如纤连蛋白的基质蛋白(Chalupny等,1992)具有相互作用也已经被报道。CD137配体主要在激活的抗原呈递细胞如树突状细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。
三聚体CD137配体与CD137的相互作用导致受体簇集和信号传导分子(例如蛋白质的TRAF家族)的招募,导致激酶调节和NfKB途径的激活。因此,CD137的簇集对于下游信号传导的启动和调节至关重要。
使用激动剂抗CD137单克隆抗体进行的体外和体内研究已经表明,激活后CD137迅速内化到称为“信号小体”的内体区室中,并从中保持信号传导(在Sanchez-Paulete等2016中进行了综述)。
共刺激性TNFR家族成员(例如CD137、CD27、OX40(CD134)、HVEM、CD30和GITR)参与维持初始T细胞激活后的T细胞应答。在CD4+和CD8+T细胞中,CD137充当调节T细胞受体(TCR)介导的信号传导的共刺激受体。CD137的连接以及TCR激活可通过诱导抗凋亡超大B细胞淋巴瘤(anti-apoptotic B-cell lymphoma-extra large)(Bcl-xl)和B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)途径来促进增殖、细胞因子产生并抑制细胞凋亡。已显示NK细胞上CD137的交联可刺激IFN-γ的分泌和增殖。树突状细胞对CD137刺激的应答包括增强的成熟和抗原呈递以及细胞因子IL-6、IL12和IL-27以及诸如吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的酶的分泌,其能够调节T细胞功能。CD137还能够上调肿瘤血管内皮细胞上的细胞间粘附分子1(ICAM1)和血管细胞粘附分子1(VCAM1),从而诱导效应细胞迁移并在肿瘤微环境中保留激活的T细胞。
通过抗CD137抗体的CD137的交联已显示在许多模型(包括肉瘤、肥大细胞瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、骨髓瘤和肝细胞癌)中具有有效的体内抗肿瘤作用。CD8+细胞耗竭研究已表明,这种作用主要涉及细胞溶解性T细胞的扩增和浸润,从而导致肿瘤细胞溶解。然而,在一些肿瘤模型中,已经报道了其他类型的细胞,如DC、NK细胞或CD4+T细胞的贡献。此外,已经显示抗CD137疗法触发免疫记忆应答并抑制自身免疫反应(综述于Vinay等2012)。
已经显示,现有的激动疗法导致全身性CD137效应,从而导致不良副作用。CD137信号传导的激活与小鼠模型中的严重毒性有关。完全人IgG4抗CD137激动性抗体(BMS-663513)的临床试验报告了中性粒细胞减少症、升高的肝酶以及高剂量时的严重肝毒性,导致试验终止。对于完全人IgG2(PF-05082566)尚未观察到这种严重的毒性,临床试验中无论是作为单一疗法还是联合疗法也是这样。
已经显示靶向共刺激性TNFR的激动性抗体需要FcγRs的接合(Bulliard等)。因此,经由FcγRs的非靶向簇集可影响激动性抗体作用于这些靶标的机制。
鉴于现有疗法观察到的毒性概况,需要基于使用具有降低的毒性的备选的CD137结合分子的备选癌症疗法。特别地,临床上需要有效地与细胞表面上的CD137接合并具有降低的毒性(包括肝毒性)的靶向CD137激动剂。
前列腺癌是发达国家男性中最常见的非皮肤相关性恶性肿瘤。据估计,六分之一的男性将被诊断患有前列腺癌。
前列腺癌的当前治疗包括手术、放射线治疗和辅助激素疗法。虽然这些疗法在疾病的早期阶段相对有效,但最初诊断为局限性前列腺癌的大多数患者最终复发。虽然化疗是对抗晚期前列腺癌最广泛使用的方法之一,但由于缺乏特异性和相关毒性,其疗效通常不足。缺乏针对前列腺癌细胞的靶向递送是实现可行治疗效果的主要障碍之一。因此,对于增加抗前列腺癌剂的选择性的策略仍然存在迫切需求(Barve等)。
在使用基于血清的标志物(例如前列腺特异性抗原(PSA))之后,前列腺癌的诊断已经大大改善。此外,前列腺肿瘤相关抗原为肿瘤成像、诊断和靶向治疗提供了靶点。前列腺特异性膜抗原(PSMA)(是一种前列腺肿瘤相关标志物)就是这样一种靶标。
PSMA是一种高度限制于前列腺分泌上皮细胞膜的750个残基的II型跨膜糖蛋白。它在前列腺癌细胞中和非前列腺实体瘤新血管系统中高度表达,并在其他组织(包括健康的前列腺、肾、肝、小肠和脑)中表达较低。PSMA表达随着前列腺疾病进展和转移而增加,并且其表达水平因此与肿瘤侵袭性相关。各种免疫组织学研究已经表明,与良性前列腺上皮细胞中的PSMA水平相比,在几乎所有前列腺癌病例中PSMA水平均增加。在疾病(包括前列腺上皮内瘤变,晚期雄激素非依赖性前列腺癌和局限于淋巴结、骨、软组织和肺的继发性前列腺肿瘤)的所有阶段均可发现强烈的PSMA染色。因此PSMA被广泛用作前列腺癌细胞的生物标志物。
PSMA具有3部分结构:19个氨基酸的内部部分、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的外部部分。它基于其处理神经肽N-乙酰天冬氨酰谷氨酸盐和谷氨酸缀合的叶酸衍生物的能力而形成具有谷氨酸羧肽酶活性的非共价同二聚体。PSMA通过内吞途径快速有效地内化,并迅速再循环到膜上。
本发明满足了对用于治疗癌症的基于抗体的备选疗法的需求。
发明概述
本发明涉及对CD137和PSMA都具有特异性的新型结合分子。发明人已经鉴定了结合至CD137并抑制CD137L与CD137结合的单可变重链结构域抗体。当以单特异性形式(即不与结合第二靶标的另一部分连接)与CD137结合时,它们不会引起CD137信号传导。然而,当与结合肿瘤特异性抗原的部分连接时,所述单可变重链结构域抗体引发CD137信号传导。因此,尽管结合CD137的单可变重链结构域抗体在没有靶向第二抗原的结合配偶体的情况下结合CD137时不诱导受体的簇集并且不具有激动活性,但双特异性分子中CD137和肿瘤特异性抗原的双重接合导致CD137激动。因此,结合至CD137的单可变重链结构域抗体能够用作同时接合CD137和PSMA的多特异性结合分子中的亚基。
本文所述的双特异性和多特异性分子与CD137和PSMA结合并同时与两个靶标接合。这种双重接合导致CD137激活,从而将作用位点限制在肿瘤微环境上,并可能最小化现有CD137治疗的不良作用。
在一个方面,提供分离的结合分子,其包含以下或由以下组成:
a)结合至CD137的单可变重链结构域抗体和
b)结合至PSMA的部分。
在一个实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含含有SEQ IDNO.1或与其具有至少40%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.2或与其具有至少40%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.3或与其具有至少40%同源性的序列的CDR3,或含有SEQ ID NO.425或与其具有至少40%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.426或与其具有40%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.427或与其具有至少40%同源性的序列的CDR3。
在一个实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含人构架区。
在一个实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含如表2或3中列出的全长序列或与其具有至少75%同源性的序列。
在一个实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含以下序列之一或由其组成:SEQ ID NO.4、312、428、852、856、860、864、868、872、876或880或与其具有至少50%同源性的序列。
在一个实施方案中,结合至PSMA的部分选自抗体、抗体片段、抗体模拟物、模拟CD137的天然配体的蛋白质或其他多肽。
在一个实施方案中,所述抗体片段选自Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)、单结构域抗体或其片段。
在一个实施方案中,所述单结构域抗体是单VH结构域抗体。
在一个实施方案中,所述单VH结构域抗体包含含有SEQ ID NO.812或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.813或与其具有至少75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.814或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3,或其中所述VH单结构域抗体包含含有SEQ ID NO.837或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ IDNO.838或与其具有75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.839或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3。
在一个实施方案中,所述结合至PSMA的单可变重链结构域抗体包含如表6或7中列出的全长序列或与其具有至少50%同源性的序列。
在一个实施方案中,所述结合至PSMA的单可变重链结构域抗体包含SEQ IDNO.815、816、817、818、819、820、821、822、823,824、825或840或与其具有至少50%同源性的序列。
在一个实施方案中,具有SEQ ID No.4、312、852、856、860、864、868、872、876、880或428之一或变体t(例如具有1至10个或1至20个氨基酸置换的分子)的单结构域抗体1.1或2.1分别与具有SEQ ID No.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1连接。
在一个实施方案中,分离的结合分子能够以约至少约10-6M,备选地至少约10-7M,备选地至少约10-8M,备选地至少约10-9M,备选地至少约10-10M,备选地至少约10-11M,备选地至少约10-12M的Kd的亲和力,或者更大的亲和力结合CD137。
在一个实施方案中,分离的结合分子能够以约至少约10-6M,备选地至少约10-7M,备选地至少约10-8M,备选地至少约10-9M,备选地至少约10-10M,备选地至少约10-11M,备选地至少约10-12M的Kd的亲和力,或者更大的亲和力结合PSMA。
在一个实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体通过肽接头与所述结合至PSMA的部分连接。
在一个实施方案中,所述接头选自(G4S)n接头,其中n为1至10。
本发明的分离的结合分子可包含与结合至PSMA的部分连接的结合至CD137的单可变重链结构域抗体。在一个实施方案中,分离的结合分子与毒素、酶、放射性同位素、半衰期延长部分、标记物、治疗性分子或其他化学部分缀合。
在一个实施方案中,所述半衰期延长部分选自由以下各项组成的组:白蛋白结合部分、转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段,和结合至人血清白蛋白的白蛋白结合肽或单结构域抗体。
通常,当作为单特异性实体结合至CD137时,所述结合至人CD137单可变重链结构域抗体不引起CD137信号传导。
在一个实施方案中,所述结合至人CD137的单可变重链结构域抗体是从表达包含人V、D和J区的转基因的转基因啮齿动物获得或可获得的。
在一个实施方案中,所述啮齿动物(例如小鼠)不产生功能性内源性轻链和重链。
还提供药物组合物,其包含本文所述的结合分子,例如本文所述的单可变重链结构域抗体,和药物载体。
还提供本文所述的结合分子或药物组合物,其用于治疗疾病(例如癌症、前列腺癌或PSMA阳性肿瘤)。
还提供用于治疗癌症的方法,其包括施用治疗有效量的本文所述的结合分子或药物组合物。
在一个实施方案中,所述癌症是前列腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、神经内分泌癌、结肠癌和乳腺癌。
还提供核酸分子,其包含编码如本文所述的结合分子的核酸序列。
还提供包含本文描述的核酸分子的载体。
还提供包含本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。
在一个实施方案中,所述宿主细胞是细菌、酵母、病毒、植物或哺乳动物细胞。
还提供用于产生本文所述的结合分子的方法,其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸,并从宿主细胞中分离所述结合分子。
还提供用于促进CD8+T细胞扩增、诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活和/或细胞因子释放的方法,所述方法包括施用如本文所述的结合分子或药物组合物。
还提供用于降低人PSMA活性的体内或体外方法,其包括使人PSMA与如上所述的结合分子接触。
还提供试剂盒,其包含如本文所述的结合分子或如本文所述的药物组合物。
还提供如上所述的结合分子或药物组合物在激活(例如同时激活)CD137和PSMA的下游信号传导途径中的用途。
还提供用于激活(例如同时激活)CD137和PSMA的下游信号传导途径的方法,其包括施用本文所述的结合分子或药物组合物。
还提供用于CD137和PSMA双重接合的方法,其包括施用本文所述的结合分子或药物组合物。
还提供本文所述的结合分子或药物组合物在PSMA阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部T细胞应答中的用途。
还提供在PSMA阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部T细胞应答的方法,包括施用根据本文所述的结合分子或药物组合物。
附图说明
在以下非限制性附图中进一步描述了本发明。
图1:基于双重结合细胞的ELISA。
将CHO人PSMA表达细胞接种到平板上,并添加单价VH或双特异性分子。随后加入CD137huFc,并使用抗人Fc-HRP检测结合。仅双特异性分子显示出增加的结合信号,证实了双靶结合。
图2:Jurkat NF-kB荧光素酶报告基因测定中CD137信号传导的激活。
(A)CHO PSMA细胞,(B)DU145 PSMA细胞或(C)DU145亲本细胞(双特异性试验)/仅培养基(抗体试验)与Jurkat人CD137 NF-kB-荧光素酶报告细胞一起培养。测量相对发光信号(RLU),作为由CD137介导的NF-kB信号传导途径激活产生的荧光素酶报告基因活性的读数。单价VH 1.1和2.1不能刺激应答。双特异性VH以PSMA依赖和浓度依赖的方式刺激CD137信号传导。应答水平是PSMA表达水平依赖性的,在存在较高PSMA表达的情况下观察到较高的最大应答。抗CD137抗体应答是PSMA表达非依赖性的。在存在PSMA表达细胞的情况下,双特异性分子能够有效刺激CD137信号传导。
图3.T细胞中细胞因子产生的增强。
在平板结合的抗CD3抗体存在下,将人CD8+T细胞与PSMA表达细胞或非PSMA表达的亲本细胞共培养。VH 1.1单价和双特异性分子,VH 2.1单价和双特异性分子,抗CD137比较抗体和抗PSMA抗体。48小时后收获上清液,测定IL-2水平。(A)在PSMA表达和非PSMA表达细胞存在下的IL-2应答的增强(B)在PSMA表达细胞存在下3种不同的T细胞供体的IL-2应答。(C和D)IL-2应答的浓度依赖性。(E)在存在PSMA表达细胞的情况下γ干扰素的产生。单价VH在测定中不刺激IL2或IFN-γ的产生。在存在PSMA表达细胞的情况下,双特异性分子能够有效增强细胞因子IL-2的产生。抗CD137抗体(可溶/非交联)在PSMA非依赖性应答中增强了IL-2的产生。
图4.双特异性分子的作用方式。该图说明了结合CD137和PSMA二者的结合分子的作用方式,导致肿瘤选择性T细胞激动。
图5:TNFα产生的增强。SEB预刺激的PBMC用1ng/ml SEB和Humabody构建体4.1-6GS-1.1、3.8-6GS-1.1或对照VH在(A)CHO PSMA细胞或(B)CHO亲本细胞和1ng/ml SEB存在的情况下处理3天。从3个重复孔中确定TNF-α浓度(平均值±标准偏差)。
图6:体内实验:在DU145PSMA/hu PBMC移植的NCG小鼠中的作用来自植入了DU145 PSMA前列腺细胞系的HuPBMC移植NCG小鼠的合并肿瘤体积数据。组4-6(3只huPBMC供体,每组n=5只小鼠/供体)在第9-32天用PBS(BIW)处理,在第33-45天用4.1-6GS-1.1-VH(MSA)(每日3mg/kg)处理。组7-9(3只huPBMC供体,n=5只小鼠/供体)在第9-32天用对照抗CD137抗体(3mg/kg,BIW)处理。组3(非hPBMC移植组,n=5只小鼠)未处理。肿瘤体积在肿瘤植入后第46天测量。统计学显著性(Mann-Whitney U检验):**=P<0.01,与第3组相比。
实施方案的详述
现在将进一步描述本发明的实施方案。在以下段落中,描述了不同的实施方案。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合,除非明确地相反地指出。特别地,指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或更多个特征组合。
通常,与以下有关的术语和以下的技术是本领域众所周知和常用的:本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交。除非另有说明,否则本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知和如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述的常规方法进行。参见,例如,Green和Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012);TherapeuticMonoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,Zhiqiang An(编者),Wiley,(2009);和Antibody Engineering,第二版,卷1和2,Ontermann和Dubel编,Springer-Verlag,Heidelberg(2010)。
根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术,如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医疗和药物化学相关使用的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。实施例中还描述了测量上述性质的合适测定。
如本文所使用的,术语“抗体”广泛地指包含四个多肽链(两个重链(H)和两个轻链(L))的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分,或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物(其保留了Ig分子的基本表位结合特征)。
在全长抗体中,每个重链包含重链可变区或结构域(本文缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区或结构域(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。
重链和轻链可变区能够进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区,其间散布有称为构架区(FR)的更保守的区域。每个重链和轻链可变区含有三个CDR和四个FR,按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
免疫球蛋白分子能够是任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY),类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中都有三个CDR,针对每个可变区,分别称为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”指出现在能够结合抗原的单可变区中的一组三个CDR。能够根据本领域已知的不同的系统对这些CDR的确切边界进行了不同的定义。
Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性,是最常用的(Kabat等,(1971)Ann.NYAcad.Sci.190:382-391和Kabat,等,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当提及可变结构域中的残基时(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113),通常使用Kabat编号系统。另一个系统是ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案。IMGT编号方案描述于Lefranc等,Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005)。
本文使用由Kabat描述的系统。术语“Kabat编号”,“Kabat定义”和“Kabat标记”在此可互换使用。这些术语在本领域中是公认的,是指对氨基酸残基进行编号的系统,该氨基酸残基比抗体或抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即,高变)。
嵌合抗体是重组蛋白,其包含可变结构域,该可变结构域包括衍生自一种物种的抗体(优选啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR),而抗体分子的恒定结构域源自人抗体的恒定结构域。
人源化抗体是重组蛋白,其中将来自一个物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移到人重链和轻链可变结构域(例如构架区序列)中。抗体分子的恒定结构域源自人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中,可以将来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的构架区氨基酸残基置换到人抗体构架区序列中。
术语“抗原结合位点”是指抗体或抗体片段的包含特异性结合至抗原的区域的部分。抗原结合位点可以由一个或更多个抗体可变结构域提供。抗原结合位点通常包含在抗体或抗体片段的相关VH和VL内。
抗体片段是抗体的一部分,例如F(ab')2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、重(VH)、可变轻(VL)链结构域等。全长抗体的功能片段保留完整抗体的靶特异性。因此,重组功能性抗体片段如Fab(片段,抗体),scFv(单链可变链片段)和单结构域抗体(dAb)已被用于开发治疗剂作为基于mAb的治疗剂的备选方案。
scFv片段(~25kDa)由两个可变结构域VH和VL组成。自然地,VH和VL结构域通过疏水相互作用非共价结合并倾向于解离。然而,通过将这些结构域与亲水性柔性接头连接以产生单链Fv(scFv),可以工程改造稳定的片段。
最小的抗原结合片段是单可变片段,即单可变重链(VH)或单可变轻链(VL)结构域。VH和VL结构域分别能够结合抗原。靶标结合不需要分别与轻链/重链配偶体的结合或实际上完整抗体的其他部分的存在。大小减小到一个单结构域(对应于VH或VL结构域)的抗体的抗原结合实体通常被称为“单结构域抗体”或“单免疫球蛋白可变结构域”。因此,单结构域抗体(~12至15kDa)由VH或VL结构域组成,但不包含全长抗体的其他部分。已经描述了源自天然缺乏轻链的仅具有骆驼重链的抗体的单结构域抗体以及具有人重链结构域的单结构域抗体(Muyldermans 2001,Holliger2005)。还已经从例如从免疫小鼠脾脏的基因组DNA扩增的鼠VH基因文库中鉴定了抗原结合的单VH结构域,并在E.coli表达(Ward等人,1989,Nature341:544-546)。Ward等人命名分离的单VH结构域“dAb”为“结构域抗体”。术语“dAb”或“sdAb”通常是指特异性结合抗原的单免疫球蛋白可变结构域(VH、VHH或VL)多肽。这样的分子分别仅具有VH或VL结合结构域,但不包含全长抗体的其他部分。除非另有说明,如本文所用,该术语是指具有VH结构域的单结构域抗体。为了用于治疗,优选人单结构域抗体,主要是因为当施用于患者时,它们不太可能引起免疫应答。
术语“单结构域抗体”,“VH结构域抗体”,“单VH结构域抗体”,“VH单结构域抗体”,“单可变结构域”,“单可变结构域抗体”,“单可变重链结构域抗体”或“免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”在本领域中都是众所周知的,并且描述结合至靶抗原的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。上面的这些术语,特别是“单重链结构域抗体”,“单可变重链结构域抗体”,“单VH结构域抗体”,“ISV”和“VH单结构域”,如本文所用,描述抗体的一部分,即抗体的单重链可变体片段,例如VH结构域,其在不存在轻链或其他抗体片段的情况下保留对抗原的结合特异性。这样的分子,例如在不存在轻链的情况下,单可变重链结构域抗体能够与抗原结合。单可变重链结构域抗体不包含全长抗体的其他部分;它仅包括VH结构域。因此,如本文所用,这些术语,特别是单结构域抗体,指定了仅由VH结构域组成并且不具有抗体的其他部分的结合部分。如本文中所解释,以下所示的CD137结合实体是VH单结构域抗体,并且在优选的实施方案中,PSMA结合实体也是VH单结构域抗体。
如下所述,实施方案涉及分离的结合分子,所述分离的结合分子包含结合CD137抗原的单可变重链结构域抗体/免疫球蛋白单可变重链结构域或由其组成,并且还包含结合PSMA的部分。因此,单可变重链结构域抗体(即VH结构域)能够在不存在轻链的情况下结合CD137。人单可变重链结构域抗体(“VH结构域抗体”)是特别优选的。这样的结合分子在本文中也称为是Crescendo Biologics Ltd.的注册商标。
术语“分离的”是指从其天然环境分离的部分。例如,术语“分离的”是指基本上不含其他单结构域抗体或结合分子、抗体或抗体片段的单结构域抗体或结合分子。此外,分离的单结构域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
每个VH结构域抗体包含三个CDR和四个FR,按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此,在本发明的一个实施方案中,该结构域是具有式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的人可变重链(VH)结构域。
可以对本发明的单结构域抗体进行C或N末端VH构架序列的修饰,以改善其特性。例如,VH结构域可以包含C或N末端延伸。能够将C末端延伸添加至以残基VTVSS(SEQ IDNo.788)终止的VH结构域的C末端。
在一个实施方案中,本发明的单结构域抗体包含1至50个残基,例如1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)、1-20、1-30或1-40个额外的氨基酸的C末端延伸。在一个实施方案中,本发明的单结构域抗体包含人CH 1结构域的额外的氨基酸,从而C末端延伸到CH 1结构域中。例如,C末端延伸可以包含中性、非极性氨基酸,例如A、L、V、P、M、G、I、F或W,或中性极性氨基酸,例如S或T。C末端延伸也可以选自肽接头或标签,例如SEQ ID No.790-797。
额外的C或N末端残基可以是例如用于将本发明的单结构域抗体缀合至另一部分的肽接头,或有助于检测分子的标签。这样的标签在本领域中是众所周知的,并且包括例如接头His标签,例如hexa-His(HHHHHH,SEQ ID No.789)或myc标签。
如本文所用的,术语“同源性”或“同一性”通常是指在比对序列后,在一些实施方案中在引入缺口(如果需要)以获得最大百分比同源性之后,序列中与其比较的参考多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比,并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。因此,两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。N或C末端延伸、标签或插入都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。可以使用众所周知的数学算法确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
根据本发明各个方面的一些实施方案,如本文所述的单结构域抗体的可变结构域是人可变结构域(如本文所用,VH是指人结构域),骆驼科可变结构域(VHH),人源化的VHH结构域,骆驼源化的VH结构域,序列修饰的VH或VHH结构域。在一个实施方案中,本文所述的单结构域抗体的可变结构域是VH结构域。
如本文所用,人VH结构域包括完全人或基本完全人VH结构域。如本文所用,术语人VH结构域还包括从仅具有重链的抗体分离的VH结构域,所述抗体由表达完全人免疫球蛋白重链基因座的转基因小鼠(特别是应答于用感兴趣的抗原进行的免疫)(例如如WO 2016/062990和以下实施例中所描述的)而制备。在一个实施方案中,人VH结构域还可包括源自或基于人VH结构域氨基酸或由人VH核酸序列产生的VH结构域。因此,术语人VH结构域包括这样的可变重链区:源自人种系免疫球蛋白序列或由人种系免疫球蛋白序列编码,并且例如获得自在表达完全人VH基因的转基因小鼠中产生的仅具有重链的抗体。在一些实施方案中,基本上人VH结构域或源自或基于人VH结构域的VH结构域可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外引入的突变,例如通过随机或位点特异性诱变,或通过体内体细胞突变引入的)。因此术语“人VH结构域”还包括基本上人VH结构域,即其中一个或更多个氨基酸残基已被修饰以例如除去序列易感性的人VH结构域。例如,与种系人序列相比,基本上人VH结构域的VH结构域可以包括多达10个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或多达20个氨基酸修饰。
然而,如本文所使用的,术语“人VH结构域”或“基本上人VH结构域”不意在包括其中源自另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。在一个实施方案中,如本文所用的,术语“人VH结构域”也不意在包括骆驼源化VH结构域,即,已经例如通过以下在体外被特异性修饰的人VH结构域:利用常规诱变方法以选择VH结构域序列中的预定位置并在预定位置引入一个或更多个点突变以将一个或更多个预定残基改变为可在骆驼科VHH结构域中发现的特定残基。
术语“KD”是指“平衡解离常数”并且是指在平衡时的滴定测量中获得的值,或者通过将解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)得到的值。“KA”是指亲和常数。结合速率常数,解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法在本领域中是公知的。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡状态下检查生理缓冲液中样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器,例如分析法。
用于如在本公开中使用的特定多肽或特定多肽靶标上的表位的术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“是特异性的”能够例如通过针对所述靶标具有以下KD的分子来展示:至少约10-6M、可替代地至少约10-7M、可替代地至少约10-6M、可替代地至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、可替代地至少约10-11M、可替代地至少约10-12M或更大亲和力。在一个实施方案中,术语“特异性结合”指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
在一些实施方案中,提供包含VH单结构域抗体的结合分子,所述VH单结构域抗体是本文描述的任何单VH结构域抗体的变体,具有一个或更多个氨基酸置换、缺失、插入或其他修饰,并保留了单结构域抗体的生物学功能。因此,变体VH单结构域抗体能够被序列工程化。修饰可包括编码单结构域抗体或多肽的一个或更多个密码子的一个或更多个置换、缺失或插入,与天然序列VH单结构域抗体或多肽相比,其导致在氨基酸序列中的改变。氨基酸置换可以是用具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸代替一个氨基酸的结果,例如用丝氨酸代替亮氨酸,即保守氨基酸置换。插入或缺失可以任选地在大约1至25个氨基酸,例如1至5、1至10、1至15或1至20个氨基酸,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的范围内。所允许的变化可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或置换并测试所得变体的针对全长或成熟天然序列所显示的活性来确定。本文所述的VH单结构域抗体的变体与非变体分子具有至少50%,例如至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性,优选至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
在一个实施方案中,修饰是保守序列修饰。如本文所用,术语“保守序列修饰”意指这样的氨基酸修饰,其不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。这种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的sdAb。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括以下氨基酸:具有碱性侧链(例如赖氨酸,精氨酸,组氨酸),酸性侧链(例如天冬氨酸,谷氨酸),不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸,半胱氨酸,色氨酸),非极性侧链(例如丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸),β-分支侧链(例如苏氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,组氨酸)。因此,本发明的单结构域抗体的CDR区内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换,并且能够使用本文所述的功能测定法来测试改变的抗体的保留功能(即,CD137结合)。
因此,这些氨基酸改变通常能够在不改变多肽的生物学活性、功能或其他所需性质,例如其对抗原的亲和力或特异性的情况下进行。在某些情况下,进行这些改变以改善抗体(例如单VH结构域抗体)对其靶抗原的亲和力。通常,多肽非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不会改变生物学活性。此外,在结构或功能上相似的氨基酸的置换不太可能破坏多肽的生物活性。包含本文描述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写,以及这些氨基酸残基的保守置换显示在下表1中。
表1.氨基酸残基和保守氨基酸置换实例
在一些实施方案中,结合分子包括VH单结构域抗体,其是选自表2、3和4中所示的那些单结构域抗体的变体,所述变体包含一个或更多个序列修饰,并且与未修饰的单结构域抗体相比,具有一种或更多种性质(例如结合亲和力、特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性等)的改善。
技术人员将知道,有不同的方式来鉴定、获得和优化如本文所述的抗原结合分子,包括体外和体内表达文库。这在实施例中进一步描述。可以使用本领域已知的优化技术,例如展示(例如,核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如易错突变)。因此本发明还包含本文所述的单结构域抗体的序列优化的变体。
在一个实施方案中,能够进行修饰以降低单结构域抗体的免疫原性。例如,一种方法是将一个或更多个构架残基恢复到相应的人种系序列。更具体而言,已经历体细胞突变的单结构域抗体可含有不同于单结构域抗体所源自的种系序列的构架残基。这些残基能够通过将单结构域抗体构架序列与单结构域抗体所源自的种系序列进行比较来鉴定。在一个实施方案中,所有构架残基均为种系序列。
为了使构架区序列中的一个或更多个氨基酸残基返回到其种系构型,体细胞突变能够通过例如定点诱变或PCR介导的诱变被“回复突变”为种系序列。
另一种类型的构架修饰包括突变构架区内或甚至一个或更多个CDR区内的一个或更多个残基,以除去T细胞表位,从而降低抗体的潜在免疫原性。
在另一个实施方案中,糖基化被修饰。例如,能够制备去糖基化抗体(即,抗体缺乏糖基化)。能够改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰能够通过例如改变抗体序列内的一个或更多个糖基化位点来完成。例如,能够进行一个或更多个氨基酸置换,其导致一个或更多个可变区构架糖基化位点的消除,从而消除该位点的糖基化。这种去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。
在一个实施方案中,一个或更多个置换在CDR1、2或3区域中。例如,CDR1、2或3中可有1、2、3、4或5个氨基酸置换。在另一个实例中,可有1或2个氨基酸缺失。在一个实施方案中,一个或更多个置换在构架区中。例如,CDR1、2或3中可有1至10个或更多个氨基酸置换。在另一个实例中,可有1至10个或更多个氨基酸缺失。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白、抗体或抗体片段(包括VH单结构域抗体)特异性结合的抗原(例如PSMA或CD137)表面上的位点。通常,抗原具有若干个或许多个不同的表位并与许多不同的抗体反应。该术语具体包括线性表位和构象表位。蛋白抗原内的表位可以由连续的氨基酸(通常是线性表位)或通过蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸(通常为构象性表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留,而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特空间构象包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定给定抗体或抗体片段结合哪些表位的方法(即表位映射)在本领域中是公知的,并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定,其中测试来自的重叠或连续肽与给定抗体或抗体片段的反应性。当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时,抗体结合“基本上相同的表位”作为参考抗体。用于确定两个表位是否结合至相同或空间上重叠的表位的最广泛使用和快速的方法是竞争测定,其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。
发明人惊奇地鉴定了单可变重链结构域抗体,当其以单特异性形式靶向至CD137时,即不与对第二抗原特异性的另一部分连接时,其特异性结合至CD137,但不诱导CD137受体的簇集。因此,单价或单特异性形式的本文所述的单可变重链结构域抗体的结合不激活CD137信号传导,也不会导致CD137信号传导。本文所述的单可变重链结构域抗体的结合不激动(agonise)CD137信号传导,除非他们与另外的对第二抗原特异性的部分(例如作为双特异性融合蛋白)一起提供,其中本文所述的单可变重链结构域抗体连接至结合至肿瘤特异性抗原的部分,例如结合至肿瘤特异性抗原的单可变重链结构域抗体。
当将如本文所述的单可变重链结构域抗体作为结合分子的一部分提供时,例如作为融合蛋白与结合至PSMA的部分(例如结合至PSMA的单可变重链结构域抗体)一起提供,结合至CD137和靶标部分导致CD137受体的簇集和CD137信号传导。因此,CD137信号传导的诱导需要两个靶标,即CD137和PSMA的双重接合。这导致肿瘤微环境中的局部CD137信号传导。只有通过双特异性分子的两个靶标的同时接合才导致CD137激活。肿瘤附近的靶标特异性激活可能避免导致不可控制的副作用的全身性CD137效应。结合分子通过除结合Fc受体以外的机制有效地在细胞表面接合CD137,因此也避免了不想要的肝毒性。同时,它们接合表达PSMA的细胞。
我们描述了与CD137和PSMA都结合的结合分子。术语“结合分子”和“结合剂”在本文可互换使用。本文所用的结合分子是指特异性结合至少两个靶即CD137和PSMA的结合分子,其中结合CD137的一个亚基/实体/部分缀合/连接至结合PSMA的第二亚基/实体/部分。如本文所述,在一些实施方案中,结合分子是融合蛋白,其中结合CD137的一个多肽缀合/连接至结合PSMA的第二多肽。
在一个方面,本发明涉及分离的多特异性结合分子,其与CD137和PSMA都结合并且包含结合至CD137的单可变重链结构域抗体。在一些实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体如本文所述。
可以在本文所述的治疗方法和用途以及药物制剂中开发本发明的多特异性结合分子的性质。
在一个方面,本发明涉及分离的结合分子,其包含以下或由以下组成:
a)结合至CD137的单可变重链结构域抗体和
b)结合至PSMA的部分。
因此,结合至CD137的实体不是包含轻链和重链的完整抗体,而是单可变重链结构域,即仅具有VH结构域。在一些实施方案中,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体选自结合至CD137的具有如本文所述的如下表(表2和3)中列出的SEQ ID No.的单可变重链结构域抗体之一,其中CDR是根据Kabat定义的。
结合至CD137的单可变重链结构域抗体和结合至PSMA的部分例如通过肽接头连接。例如,所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体可以在其N或C末端与结合至PSMA的部分连接。
结合至PSMA的部分可以选自抗体、抗体模拟物、抗体支架、抗体片段或其他多肽。抗体片段可以选自抗体的一部分,例如F(ab')2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、重或可变轻链结构域、重或可变轻链结构域或其部分,例如CDR。
在一个实施方案中,结合至PSMA的实体是结合至PSMA的单可变重链结构域抗体,例如人VH结构域抗体。在一些实施方案中,所述结合至PSMA的单可变重链结构域抗体选自结合至PSMA的具有如本文所述的且在下表中的SEQ ID No.的单可变重链结构域抗体之一。
在一个实施方案中,提供包含以下或由以下组成的结合分子
a)结合至CD137的单可变重链结构域抗体和
a)结合至PSMA的单可变重链结构域抗体
因此,结合分子具有两个单可变重链结构域,一个结合CD137,一个结合PSMA。不存在完整抗体的其他结构域/链。在一些实施方案中,结合至CD137的单可变重链结构域抗体和结合至PSMA的单可变重链结构域抗体是人VH结构域抗体。
在一个方面,我们提供结合分子,该结合分子包含结合至CD137的单可变重链结构域抗体,所述单可变重链结构域抗体例如具有如本文所述的SEQ ID No.(例如,如表2或3所示),并连接至结合至PSMA的另一部分,例如所述另一部分具有本文所述的SEQ ID No.,其中结合分子显示以下一种或更多种特性:
(a)以如实施例中所测量的KD结合至人CD137;
(b)抑制人CD137配体与细胞表面表达的人CD137之间的相互作用。这可以如实施例4所示进行测量;
(c)不结合至小鼠CD137;
(d)结合至表达CD137的细胞,同时结合至表达PSMA的细胞。这可以如实施例5所示进行测量;
(e)增加报告基因的活性。这可以如实施例5所示进行测量;
(f)抑制体内肿瘤细胞的生长;
(g)促进CD8+T细胞扩增;
(h)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活;
(i)刺激IL-2从CD8+细胞产生。这可以如实施例5所示进行测量;
(j)诱导肿瘤特异性T细胞激活;
(k)激活如实施例中所测量的T细胞中的CD137信号传导;
(l)抑制激活诱导的细胞死亡;
(m)提高T细胞存活率;
(n)限制全身性T细胞激活;
(o)增强T细胞的细胞毒效应子功能;
(p)促进肿瘤抗原阳性肿瘤中抗肿瘤细胞的局部激活;
(q)增强抗体依赖性细胞的细胞毒性;
(r)同时结合至CD137和PSMA;
(s)结合至食蟹猴CD137;
(t)逆转T-reg细胞的调节子功能;
(u)激活NK细胞和/或
(v)如实施例6中所示,在小鼠中,与对照组相比,减少肿瘤体积。
在一个实施方案中,所述结合分子表现出多于一种的性质,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或从以上列表中选择的所有性质,包括性质的任意组合。在一个实施方案中,所述结合剂抑制人CD137配体与细胞表面表达的人CD137之间的相互作用。
在一个实施方案中,所述结合分子是融合蛋白,其包含至少两个亚基,即融合至PSMA结合亚基的CD137结合亚基,其中CD137结合亚基是结合至CD137的单可变重链结构域抗体。在一个实施方案中,所述结合分子是融合蛋白,其包含结合至CD137的单可变重链结构域抗体,该单可变重链结构域抗体与结合至PSMA的单可变重链结构域抗体连接。接头是例如具有GS残基如(Gly4Ser)n的肽接头,其中n=1至10,例如如下文进一步描述的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
结合剂是多特异性的,例如双特异性或三特异性的。双特异性分子结合至2个不同的靶标。三特异性分子结合至2个不同的靶标。单价分子具有一个结合实体。二价分子具有两个结合至相同或不同靶标的结合实体。
在一个实施方案中,所述结合分子包含结合至CD137的第一VH单结构域抗体(VH(A))和结合至PSMA的第二VH单结构域抗体(VH(B)),因此具有下式:VH(A)-L-VH(B)。VH(A)与VH(B)缀合,其是例如用肽接头连接的。L表示接头。
每个VH包含CDR和FR区。因此,所述结合分子可具有下式:FR1(A)-CDR1(A)-FR2(A)-CDR2(A)-FR3(A)-CDR3(A)-FR4(A)-L-FR1(B)-C DR1(B)-FR2(B)-CDR2(B)-FR3(B)-CDR3(B)-FR4(B)。单VH结构域A和B的次序没有特别限制,使得在本发明的多肽内,单可变结构域A可位于N末端并且单可变结构域B可以位于C末端,反之亦然。
如本文所述的各种实施方案中所用的术语“肽接头”是指包含一个或更多个氨基酸的肽。肽接头包含1至44个氨基酸,更特别地2至20个氨基酸。肽接头是本领域已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽是,例如,包括G和/或S残基、(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头的接头,其中“n”通常为1和10之间的数字,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中,该肽例如选自GGGGS(SEQ ID NO:790)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:791)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:792)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:793)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:794)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:795)、GGSGSG(SEQ ID NO:796)、GGSG(SEQ ID NO:797)组成的组。
上述融合蛋白能够双重的,例如,同时的接合/结合至效应细胞表面上的CD137和肿瘤细胞的细胞表面展示的PSMA。双重的,例如,同时的结合,导致CD137受体的簇集,导致CD137信号传导。这导致T细胞激活。在一些实施方案中,双重的,例如,同时的结合导致肿瘤抗原特异性效应细胞激活并导致肿瘤细胞杀伤。
在一些实施方案中,融合蛋白能够以与单价单重链结构域抗体结合至CD137的EC50值相似或至少等同的EC50值结合CD137。在一些实施方案中,融合蛋白以如实施例中所示的EC 50值结合CD137。
在一些实施方案中,本文所述的融合蛋白可能基本上如实施例中所述的能够在功能性T细胞激活中共刺激T细胞应答。在一些实施方案中,本文所述的融合蛋白可能能够在功能性T细胞激活中诱导IL-2和/或IFNγ分泌和T细胞增殖。在一些实施方案中,本文所述的融合多肽还能够在被靶向的肿瘤附近局部诱导IL-2和/或IFNγ分泌,所述被靶向的肿瘤是对融合蛋白结合的肿瘤抗原呈阳性的细胞。
在一些实施方案中,融合蛋白可能能够通过CD137表达细胞和肿瘤抗原表达细胞的双重靶向而产生协同作用。
双重的,例如,同时的在肿瘤的微环境中靶向CD137和PSMA可能会增强抗肿瘤活性并减少肿瘤的生长。此外,通过局部引发CD137信号传导,可减少副作用。CD137信号传导导致TRAF家族成员的募集和激酶的激活。T细胞介导的信号传导保护CD8+细胞免于激活诱导的死亡。还提供本文所述的融合蛋白在共刺激T细胞中的用途。
在一个实施方案中,如本文所述的结合分子以根据在实施例中所述的方法测量的至少约10-6M,备选地至少约10-7M,备选地至少约10-8M,备选地至少约10-9M,备选地至少约10-10M,备选地至少约10-11M,备选地至少约10-12M的KD,或者更大的亲和力结合至CD137。在一个实施方案中,如本文所述的结合分子以根据在实施例中所述的方法测量的至少约10-6M,备选地至少约10-7M,备选地至少约10-8M,备选地至少约10-9M,备选地至少约10-10M,备选地至少约10-11M,备选地至少约10-12M的KD,或者更大的亲和力结合至PSMA。结合可以如实施例中所述进行测量。在一些实施方案中,本发明的结合分子具有如本文进一步描述和如实施例所示的IC50和/或EC50值。本文所述的结合分子已显示出优异的稳定性。
在另一个方面,提供编码本文描述的融合蛋白的核酸分子。
例如,核酸分子包含编码如本文所述的结合至CD137的单可变重链结构域抗体的核酸和编码如本文所述的结合至PSMA的单可变重链结构域抗体的核酸。
核酸可以包含DNA或RNA,并且可以全部或部分合成或重组产生。除非上下文另有要求,否则本文提出的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子,并且包括具有其中用U置换T的特定序列的RNA分子。
此外,本发明涉及包含至少一种如上定义的核酸的核酸构建体。构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式。
本发明还涉及包含一种或更多种如上所述的核酸构建体的分离的重组宿主细胞。宿主细胞可以是细菌、病毒、植物,哺乳动物或其他合适的宿主细胞。在一个实施方案中,细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中,细胞是酵母细胞。在另一个实施方案中,细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个实施方案中,提供制备如本文所述的融合蛋白的方法,其中该方法包括在适于表达编码融合蛋白的多核苷酸的条件下培养宿主细胞,并分离单结构域抗体。
结合分子中包括的示例性免疫球蛋白
如上所述,所述结合分子包含结合至CD137的单可变重链结构域抗体(CD137结合亚基)和结合至PSMA的部分(PSMA结合亚基)。例如,所述结合分子可以是融合蛋白,其中结合至CD137的单可变重链结构域抗体与结合至PSMA的另一多肽连接。以下提供CD137结合亚基和PSMA结合亚基的实例。
包含在结合分子中且结合CD137的示例性免疫球蛋白
结合至CD137并且可形成结合至CD137和PSMA两者的结合分子的亚基之一的单可变重链结构域抗体的实例,被描述并可用于本发明的各种实施方案中。
CD137是免疫应答的重要调节剂,因此是癌症治疗中的重要靶标。T细胞共刺激受体CD137在激活的T细胞上被诱导并起多种关键作用:防止激活诱导的细胞死亡(AICD),促进细胞周期进程,增强细胞毒性和1型细胞因子(例如IL-2,IFN-γ和TNF-α)的产生,并增加记忆CD8+T细胞。使用激动性抗体的体内CD137触发增强了针对肿瘤的CD8+T细胞应答。CD137介导的抗癌作用是基于其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活的能力等以及其中大量的IFN-γ。CD137/CD137L相互作用也被认为是CD8+T细胞针对诸如流感病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和单纯疱疹病毒(HSV)等病毒的应答的正调节剂。CD137参与初始T细胞激活后维持T细胞应答。
重要的是,CD137信号传导需要CD137受体的簇集。这种簇集由三聚体CD137配体与CD137受体的相互作用介导,导致信号传导分子如TRAF家族蛋白的招募。这进而导致激酶调节和Nf-KB信号传导途径的激活。转录因子NF-κB家族在炎症和先天免疫中起重要作用。此外,NF-κB在癌症的起始和发展的许多步骤中被越来越多地认为是至关重要的参与者。
本文所述的单结构域抗体特异性结合野生型人CD137(UniProt登录号Q07011,GenBank登录号NM_001561)。针对野生型人CD137的氨基酸序列(SEQ ID No.786)和核苷酸序列(SEQ ID No.787)如下所示。
除非另有说明,否则本文所用的术语CD137指人CD137。CD137也被称为“4-1BB”,“TNF受体超家族成员9”,“TNFRS9”,“淋巴细胞激活诱导”和“ILA”,这些术语可以互换使用,并包括人类CD137的变体、同种型。
术语“CD137结合分子/蛋白质/多肽/剂/部分”,“CD137抗原结合分子分子/蛋白质/多肽/剂/部分”,“抗CD137单结构域抗体”,“抗CD137单免疫球蛋白可变结构域”,“仅具有抗CD137重链的抗体”或“抗CD137抗体”均指能够特异性结合人CD137抗原的分子。结合反应可以通过标准方法来显示,例如参考使用无关特异性抗体的阴性对照试验。
本文所述的多特异性结合剂,“其结合”或“能够结合”感兴趣的抗原,例如人CD137,是这样的多特异性结合剂:以足够的亲和力结合该抗原,使该抗体可用作靶向表达抗原CD137的细胞或组织的治疗剂。结合是结合至CD137的细胞外结构域。
本发明的结合分子特异性结合至人CD137。换句话说,与CD137抗原的结合明显不同于非特异性相互作用。它们不会与鼠CD137交叉反应。在一个实施方案中,sdAb结合至人CD137并且还结合至猴子(例如食蟹猴)CD137。
在一个方面,多特异性分子中使用的单价单结构域抗体表现出以下一种或更多种作为单价实体的特性(即当未以多特异性形式与结合至PSMA的实体一起提供时):
(a)以如实施例中所测量的KD结合至人CD137;
(b)结合至表达CD137的细胞,但不结合至不表达CD137的细胞。这可以在FMAT分析中进行测量;
(c)显示最小的细胞内化。这可以如实施例中所示进行测量。
(d)抑制CD137配体与细胞表面表达的CD137之间的相互作用。这可以在FMAT分析中进行测量。
(e)不激活T细胞中的CD137信号传导。这可以如实施例中所示进行测量。
(f)不刺激IL-2从CD8+细胞产生。这可以如实施例5所示进行测量;
(g)不结合至小鼠CD137;
(h)如实施例中所示提供良好的稳定性和/或
(i)不提高报告基因的活性,因此不引起CD137信号传导。可以如实施例5中所示进行测量。
示例性序列特征
在一个方面,单可变重链结构域抗体包含如表2所示的针对单结构域抗体之一所示的CDR1、CDR2或CDR3或一组CDR(即CDR1、CDR2、CDR3),其中所述组是针对表2中所示的单结构域抗体之一而显示的。在一个方面,它包含与其至少40%或75%同源性的CDR1,CDR2,CDR3。例如,所述单可变重链结构域抗体包含含有SEQ ID NO.1或与其具有至少40%、75%或80%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.2或与其具有至少40%、75%或80%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.3或与其具有至少40%、75%或80%同源性的序列的CDR3,或含有SEQ ID NO.5或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.6或与其具有40%、75%或80%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.7或与其具有至少40%、75%或80%同源性的序列的CDR3,等等。
如上所述和本文一般使用的序列同源性可以是至少40%、50%、60%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。
在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含人构架区。
在另一个方面,根据本发明的单可变重链结构域抗体包含表2所示的全长序列或与其具有至少50%同源性的序列,或由其组成。例如,所述单可变重链结构域抗体具有选自表2中列出的序列的序列,即SEQ ID NO.4、8、12、16、20等等,或与其具有至少50%同源性的序列。序列同源性可以是至少50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含如针对VH单结构域抗体1.1至1.89或1.90至1.106所示的CDR1、2和3,或包含如针对VH单结构域抗体1.1至1.89或1.90至1.106所示的全长序列(即SEQ ID NO.364、368、372、376、380、384、388、392、396、400、404、408、412、416、420或424)或由其组成。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含如表2所示的针对VH单结构域抗体VH 1.107至1.114所示的CDR1、2和3,例如SEQ ID No.873、874、875)或与其具有至少75%、80%或90%同源性的序列。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体选自表2中所示的VH 1.107至1.114,即VH 1.107、1.108、1.109、1.110、1.111、1.112、1.113或1.114,即SEQ ID NO.852、856、860、864、868、872、876或880或与其具有至少75%、80%或90%同源性的序列。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体是VH 1.113或与其具有至少75%、80%或90%同源性的序列。
表2 VH单结构域抗体(家族1)的全长序列和CDR序列
在一个方面,所述单可变重链结构域抗体包含如表3所示针对单结构域抗体之一的所示的CDR1、CDR2或CDR3或包含与其具有至少75%同源性的CDR1、CDR2、CDR3。例如,所述单可变重链结构域抗体包含含有SEQ ID NO.425或与其具有至少80%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.426或与其具有至少75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.427或具有至少75%同源性的序列的CDR3,或含有SEQ ID NO.429或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.430或与其具有75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ IDNO.431的CDR3等等。
序列同源性可以是至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。
在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含人构架区。
在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含表3中所示的全长序列或与其具有至少50%同源性的序列,或由其组成。例如,所述单可变重链结构域抗体具有选自表3中所示的那些的序列,例如SEQ ID NO.428、432、436、440等等,或与其具有至少50%同源性的序列。序列同源性可以是至少50%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。
在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含如针对VH单结构域抗体2.41至2.51所示的CDR1、2和3,或包含如针对VH单结构域抗体2.41至2.51所示的全长序列(即SEQ ID NO.588、592、596、600、604、608、612、616或620)或由其组成。
表3 VH单结构域抗体(家族2)的全长序列和CDR序列
在一个实施方案中,所述结合分子可包含一个或更多个结合至CD137的单结构域抗体,例如如上文表2和表3中所述的一个或两个单结构域抗体。
在一些实施方案中,提供VH单结构域抗体,所述VH单结构域抗体是表2或表3中所示的上述单VH结构域抗体中任何一个的变体,所述变体具有一个或更多个氨基酸置换、缺失、插入或其他修饰,并保留了单结构域抗体的生物学功能。因此,变体VH单结构域抗体能够被序列工程化。修饰在本文其他地方描述。在一个实施方案中,提供VH 1.07至1.113的变体,例如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个置换的VH 1.113。
置换的例子
在一个实施方案中,变体包含一个或多个以下关于SEQ ID NO.4(VH1.1)的置换或其组合
·F37V
·E61V+E65K
·E65K
·V70I
·V79L
·F37V+E61V+E65K+V70I+V79L
·E61V+E65K+V70I+V79L
·F37V+E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D101V+D105I
·F37V+E61V+E65K+V70I+V79LFGL+G55E+D101E+D105I
·E61V+E65K+V70I+V79L+G55E
·E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D105I
·E61V+E65K+V70I+V79L+D54G,E61V+E65K+V70I+V79L+D54E,
·E61V+E65K+V70I+V79L+D101E
·E61V+E65K+V70I+V79L+D101V或
·E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D101V+D105I,E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D101E+D105I
在一个实施方案中,变体包含一个或多个以下关于SEQ ID NO.4(VH1.1)的置换或其组合
a)E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D101→选自下列F、L、I、M、V、S、P、T、A、Y、H、Q、K、D、W、R、G的任何氨基酸;
b)E61V+E65K+V70I+V79L+G55E+D105→选自下列F、L、M、S、P、T、A、Y、H、Q、N、K、D、E、W、R、G的任何氨基酸或
c)E61V+E65K+V70I+V79L+G55E,D101→选自下列F、L、I、M、V、S、P、T、A、Y、H、Q、K、D、W、R、G的任何氨基酸,+D105→选自下列F、L、M、S、P、T、A、Y、H、Q、N、K、D、E、W、R、G的任何氨基酸。
在一个实施方案中,变体包含一个或多个以下关于SEQ ID NO.312(VH1.78)的置换或其组合
·Q1E+T25S
·Q1E+S84N
·Q1E+F95Y
·Q1E+T25S+S84N
·Q1E+T25S+F95Y
·Q1E+S84N+F95Y
·Q1E+T25S+S84N+F95Y或
·Q1E+T25S+G55E+S84N+F95Y
在一个实施方案中,变体包含一个或多个以下关于SEQ ID NO.428(VH2.1)的置换或其组合
·V20L,
·F37I,
·N85S,
·N95Y,
·V20L+H95Y,
·V20L+F37I+N85S+H95Y,V20L+N85S+H95Y,
·V20L+F37I+N85S+H95Y+S101A,
·V20L+F37I+N85S+H95Y+S101P或
·V20L+N85S+H95Y+S101A,V20L+N85S+H95Y+S101A。
在一个实施方案中,变体包含一个或多个以下关于SEQ ID NO.624(VH2.50)的置换或其组合
·S35T+V48I+I57T+L103M+T104R+T107I
·S35T+A101T+L103V+T104R+T107V
·S35T+V48I+I57T+A101E+L103L+T104W+T107V
·S35T+V48I+L103T+T104R+T107V
·Y32H+S35T+V48I+S52G+S54D+D56A+I58L+A101L+T104P+T107I+N111H
·S35T+A101T+L103V+T104R+T107V+N111S
·A28T+S30T+Y33W+S35T+V48I+G53S+S54D+D56K+I57T+L103M+T104P+T107I+N111Y
·S35T+V48I+L103T+T104R+T107V+N111S
·S35T+V48I+I57T+S101E+T104W+T107V+N111S或
·S35T+V48I+I57T+L103M+T104R+T107I+N111S
编码CD137多肽的示例性核酸
下文列出了编码如上所示的单结构域抗体的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个方面,本发明提供编码CDR(例如CDR3)、一组两个或三个CDR或如上所示的本发明的VH单结构域抗体的核酸。
表4编码VH 1.1至1.114的核酸
表5编码VH 2.1至2.51的核酸
在一个实施方案中,核酸序列与以上选择的序列之一具有至少50%的序列同源性。在一个实施方案中,所述序列同源性为至少50%、60%、70%,71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个实施方案中,核酸选自SEQ ID No.629、706、881、882、883、884、885、886、887或735之一。
包含在结合分子中且结合PSMA的示例性免疫球蛋白
部分的实例,例如,结合至PSMA并且可形成结合至CD137和PSMA两者的结合分子的亚基之一的单可变重链结构域抗体,被描述并可用于本发明的各种实施方案中。
PSMA结合分子结合至野生型人PSMA(UniProt登录号NO.Q04609)。
单体的序列如下所示(SEQ ID No.842)。
在一个实施方案中,本发明的PSMA结合分子结合至野生型人PSMA和/或食蟹猴PSMA。本文所用的术语“PSMA结合分子”、“PSMA结合蛋白”、“抗PSMA单结构域抗体”或“抗PSMA抗体”均是指能够结合至人PSMA抗原的分子。术语“PSMA结合分子”包括PSMA结合蛋白。可以通过标准方法(定性测定)显示结合反应,所述方法包括例如结合测定,竞争测定或用于确定PSMA与其受体结合的抑制的生物测定或任何种类的结合测定,参照其中具有不相关特异性的抗体的阴性对照试验。实施例中显示了合适的测定。
本发明的结合分子,包括本文所述的单结构域抗体和多价或多特异性结合剂,“其结合”或“能够结合”感兴趣的抗原例如PSMA,是以足够的亲和力结合(即靶向)PSMA抗原的结合分子,使其可用于靶向表达该抗原的细胞或组织的治疗。
示例性序列
结合PSMA的单VH结构域抗体可以如WO2017/122017中所述,其通过引用并入本文。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含含有SEQ ID NO.812或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.813或与其具有至少75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.814或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含含有SEQ ID NO.837或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.838或与其具有75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.839或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3。
序列同源性可以是75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。
在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含人构架区。在一个实施方案中,单可变重链结构域抗体选自表6或7所示的单可变重链结构域抗体,或选自与其具有至少80%同源性的序列。PSMA结合实体也可以选自其一部分,例如CDR3。
在一个实施方案中,单可变重链结构域抗体包含选自SEQ ID NO.815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825或840的序列。在一个实施方案中,该序列是SEQ IDNO.822或来自与其具有至少50%、60%、70%或75%同源性的序列。序列同源性可以是75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。在一个实施方案中,所述单可变重链结构域抗体包含选自SEQ ID NO.815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825或840的序列或其变体,例如具有1至10或1至20个置换的变体。
表6a PSMA结合单VH结构域抗体
表6b PSMA结合单VH结构域抗体
表7 PSMA结合单VH结构域抗体
在一个实施方案中,所述变体包括置换。典型的修饰将在本文其他地方进行说明。
示例性核酸
编码上文所示的单结构域抗体的核酸示于下文的表7b中。
在一个实施方案中,所述结合分子可包含一个或更多个结合至PSMA的单结构域抗体,例如如上所述的一种或两种单结构域抗体。
在一个实施方案中,所述结合分子可包含一个或更多个结合至PSMA的单结构域抗体,例如如上所述的一个或两个单结构域抗体。在一个实施方案中,所述结合分子包含结合至PSMA的两个单结构域抗体,其中各自结合至提供双互补位PSMA粘合剂的PSMA hus的不同表位。
示例性结合分子
分别结合至CD137和PSMA的前述单可变重链结构域抗体的任何组合可以用于结合剂中用于CD137和PSMA表达细胞的双重接合。因此,在一个实施方案中,以上公开的任何单可变重链结构域抗体,例如如表2或表3的任一个中列出的,能够与如表6a、6b或7的任一个中所列的任何单可变重链结构域抗体组合在融合蛋白中。
因此,在一个实施方案中,所述融合蛋白包含具有选自以下的单结构域抗体:SEQID No 4、8、12、16、20、24、28、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、272、276、280、284、288、292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336、340、344、448、352、356、360、364、368、372、376、380、384、388、392、396、400、404、408、412、416、420、424、852、856、860、864、868、872、876或880或与其具有至少75%同源性的序列,以及具有选自SEQ ID No 815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825或840的序列或与其具有至少75%同源性的序列的单结构域抗体。在一个实施方案中,该序列选自SEQ IDNo 852、856、860、864、868、872、876或880或与其具有至少75%同源性的序列。
在另一个实施方案中,所述融合蛋白包含具有选自以下序列的单结构域抗体:SEQID No 428、432、436、440、444、448、452、456、460、464、468、472、476、480、484、488、492、496、500、508、512、516、520、524、528、532、536、540、544、548、552、556、560、564、568、572、576、580、584、588、592、596、600、604、608、612、616、620、624或628或与其具有至少75%同源性的序列,以及具有选自SEQ ID No815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825或840的序列或与其具有至少75%同源性的序列的单结构域抗体。在一个实施方案中,具有SEQ ID No.4或428的单结构域抗体1.1或2.1,或具有SEQ ID No 312、852、856、860、864、868、872、876、880或428的单结构域抗体分别连接至具有SEQ ID No.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1。在一个实施方案中,具有SEQ ID No.876的单结构域1.113分别连接至具有SEQ ID No.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1。在一个实施方案中,具有SEQ ID No.876的单结构域1.113连接至具有SEQ ID No.840的单结构域抗体4.1。在一个实施方案中,所述融合蛋白包含连接至单结构域抗体4.1或3.8的单结构域抗体1.113和如SEQ ID No.901中所示的单结构域抗体,或由其组成。单结构域抗体的次序可以变化,例如CD137结合单结构域抗体可以位于PSMA结合分子的3'或5'。SEQ ID No.901所示的单结构域抗体优选位于C末端。
两个单结构域抗体可以在融合蛋白中与肽接头例如本文所述的G4S接头连接。在一个实施方案中,本发明涉及如下表8中所列的融合蛋白和编码此类融合蛋白的核酸之一(即,选自该蛋白之一和(即,选自SEQ ID NO.806-811的蛋白和核酸构建体之一),或如实施例中表10中列出的融合蛋白和编码此类融合蛋白的核酸(即,选自SEQ ID NO.889-900的蛋白和核酸构建体之一)。在一个实施方案中,该蛋白质包含与(G4S)n肽接头连接的如本文所述的定义为4.1或1.113的单结构域抗体,其中n如本文所定义,例如是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(即4.1-(G4S)n-1.113)。在一个实施方案中,该蛋白质选自SEQ ID Nos.844、846、890或894。在一个实施方案中,该蛋白质包含SEQ ID NO.890或由其组成,任选地包括HSA结合sdAb。在一个实施方案中,该蛋白质由SEQ ID NO.891的核酸序列编码。
表8
结合分子的示例性修饰
在一个实施方案中,上述结合剂包含另外的结合分子。因此,所述结合剂可以是例如三特异性或四特异性的。
在一个实施方案中,所述结合分子包含结合至CD137的第一VH单结构域抗体(VH(A))和结合至PSMA的第二部分例如VH单结构域抗体(VH(B))。它进一步包含第三、第四、第五等部分,例如结合至另一种抗原的VH单结构域抗体(即VH(C)、VH(D)、VH(E))。因此,在一个实施方案中,所述结合分子具有下式(其中VH代表本文定义的单结构域抗体,即不包含完整抗体的其他部分并保留与抗原的结合的单VH结构域):VH(A)-L-VH(B)-L-VH(X)n其中X表示与除了结合至VH(A)和VH(B)的靶标以外的靶标结合的VH,且其中X为1至10,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。L表示接头,例如肽接头。如在别处解释的,结合至PSMA或另一靶标的部分可以选自抗体或其片段或其他多肽。
在另一个实施方案中,另外的部分可用于延长结合分子的半衰期。另外的部分可包含结合血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA)的蛋白质,例如肽、抗体或其部分,诸如VH或CDR。在一个实施方案中,另外的部分可以包含结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA))的VH结构域。在一个实施方案中,结合HSA的VH结构域是SEQ ID NO.901或与其具有至少90%序列同源性的序列。所述另外的部分可以包含血清白蛋白,例如HSA或其变体,例如HSA C34S。还提供如本文所述的包含VH结构域和Fc结构域的结合分子,例如,其中VH结构域与Fc结构域融合。
如本文所用,术语“半衰期”是指例如由于序列或化合物的降解和/或序列或化合物通过自然机制的清除或隔离(sequestration)而在体内使氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度降低50%所花费的时间。半衰期可以比本发明的相应的VH单结构域抗体的半衰期提高至少1.5倍,优选至少2倍,例如至少5倍,例如至少10倍或大于20倍。例如,与本发明的相应的VH单结构域抗体或融合蛋白相比,增加的半衰期可以大于1小时,优选大于2小时,更优选大于6小时,例如大于12小时,或甚至大于24、48或72小时。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式(例如通过药代动力学分析)确定。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的。半衰期例如可以使用诸如t1/2-αt1/2-β和曲线下面积(AUC)之类的参数表示。
在一个实施方案中,所述结合剂用可检测的或功能性标记物标记。标记物能够是产生或可被诱导产生信号的任何分子,包括但不限于荧光基团、荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂、核磁共振活性标记或光敏剂。因此,可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测量结合。
在其他实施方案中,结合剂偶联至至少一种治疗部分,例如药物、酶或毒素。在一个实施方案中,所述治疗部分是毒素,例如细胞毒性放射性核素、化学毒素或蛋白质毒素。
在另一个方面,本发明的结合剂被修饰以增加半衰期,例如通过化学修饰,特别是通过聚乙二醇化,或通过掺入脂质体或使用血清白蛋白蛋白质。增加的半衰期也可以通过将所述分子与抗体片段,例如增加半衰期的VH结构域缀合而赋予。
为了生成如上所述的多价结合剂,两个结合分子可以通过接头(例如多肽接头)连接。合适的接头包括例如具有GS残基的接头,例如(Gly4Ser)n,其中n=从1至10或更大,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并且实例的具体序列在其他地方提供。
制备单结构域抗体和结合分子的示例性方法
本文所述的用于多特异性分子的单结构域抗体可获自转基因啮齿动物,所述转基因啮齿动物在分别用CD137或PSMA抗原刺激后表达仅具有重链的抗体。转基因啮齿动物,例如小鼠,优选具有降低的表达内源性抗体基因的能力。因此,在一个实施方案中,啮齿动物具有降低的表达内源性轻链和/或重链抗体基因的能力。啮齿动物因此可以包含修饰以破坏内源性κ和λ轻链和/或重链抗体基因的表达,从而不产生功能性轻链和/或重链,例如如下文进一步解释的。
产生能够结合靶抗原的仅具有人重链的抗体的方法包括
a)用靶抗原(即PSMA或CD137)免疫转基因啮齿动物(例如小鼠),其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链V基因的核酸构建体并且不能够产生功能性内源轻链或重链,
b)分离仅具有人重链的抗体。
进一步的步骤可以包括从所述仅具有重链的抗体分离VH结构域,例如通过从所述啮齿动物(例如小鼠)生成包含VH结构域序列的序列文库,并从所述文库中分离包含VH结构域序列的序列。
产生能够结合至靶抗原的单VH结构域抗体的方法包括
a)用靶抗原免疫转基因啮齿动物(例如小鼠),其中所述啮齿动物例如小鼠表达包含未重排的人重链V基因的核酸构建体并且不能够产生功能性内源轻链或重链,
b)生成包含来自所述啮齿动物(例如小鼠)的VH结构域序列的序列文库,
c)从所述文库分离包含VH结构域序列的序列。
进一步的步骤可以包括鉴定结合至靶抗原的单VH结构域抗体或仅具有重链的抗体,例如通过使用如实施例中所示的功能测定法。
使用体外表达文库制备或生成本文所述的多肽,核酸,宿主细胞,产物和组合物的方法可包括以下步骤:
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库;和
b)在所述组、集合或文库中筛选能够结合至靶抗原/对靶抗原具有亲和力的氨基酸序列和
c)分离能够结合至靶抗原/对靶抗原具有亲和力的氨基酸序列。
在上述方法中,氨基酸序列的组、集合或文库可展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)上,例如以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的合适方法、技术和宿主生物体对于本领域技术人员而言是清楚的(参见例如PhageDisplay of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press;第一版(1996年10月28日)Brian K.Kay,Jill Winter,John McCafferty)。
文库,例如噬菌体文库,是通过分离表达抗原特异性的、仅具有重链的抗体的细胞或组织,从源自分离的细胞或组织的mRNA克隆编码VH结构域的序列,并使用文库展示编码的蛋白而生成的。一个或更多个VH结构域可以在细菌、酵母或其他表达系统中表达。
在本文的各个方面和实施方案中,术语啮齿动物可以涉及小鼠或大鼠。在一个实施方案中,啮齿动物是小鼠。小鼠可以包含非功能性内源λ轻链基因座。因此,小鼠不会产生功能性内源λ轻链。在一个实施方案中,通过插入、倒位、重组事件、基因编辑或基因沉默,部分或完全缺失λ轻链基因座或使其无功能。例如,如上所述,至少恒定区基因C1、C2和C3可以通过插入或其他修饰而被删除或使其无功能。在一个实施方案中,所述基因座被功能性沉默,使得所述小鼠不产生功能性λ轻链。
此外,小鼠可以包含非功能性内源κ轻链基因座。因此,小鼠不产生功能性内源κ轻链。在一个实施方案中,通过插入,倒位,重组事件,基因编辑或基因沉默,部分或完全缺失κ轻链基因座或使其无功能。在一个实施方案中,所述基因座功能性沉默,使得所述小鼠不产生功能性κ轻链。
例如,可以如WO 2003/000737(其在此通过引用以其整体并入)中所公开的那样制备具有功能沉默的内源λ和κL链基因座的小鼠。
此外,小鼠可以包含非功能性内源重链基因座。因此,小鼠不产生功能性内源重链。在一个实施方案中,通过插入,倒位,重组事件,基因编辑或基因沉默,部分或完全缺失重链基因座或使其无功能。在一个实施方案中,所述基因座被功能性沉默,使得所述小鼠不产生功能性重链。
例如,如WO 2004/076618(全文以引用的方式并入本文中)中所述,全部8个内源性重链恒定区免疫球蛋白基因(μ,δ,γ3,γ1,γ2a,γ2b,ε和α)在小鼠中不存在或部分不存在达到其失去功能的程度,或者基因δ,γ3,γ1,γ2a,γ2b和ε不存在并且侧翼基因μ和α部分不存在达到其失去功能的程度,或者基因μ,δ,γ3,γ1,γ2a,γ2b和ε不存在并且α部分不存在达到其失去功能的程度,或者δ,γ3,γ1,γ2a,γ2b,ε和α不存在并且μ部分不存在达到其失去功能的程度。部分缺失是指内源基因座基因序列例如通过插入被缺失或破坏,以至于没有功能性内源基因产物被基因座编码,即没有功能性产物从基因座表达。在另一个实施方案中,所述基因座功能性沉默。
在一个实施方案中,小鼠包含非功能性内源重链基因座、非功能性内源λ轻链基因座和非功能性内源κ轻链基因座。因此小鼠不产生任何功能性内源轻链或重链。因此,该小鼠是三重敲除(TKO)小鼠。
转基因小鼠可包含载体,例如用于表达异源的,优选人,重链基因座的酵母人工染色体(YAC)。YAC是能够采用用于在酵母中克隆非常大的DNA插入的载体。除了包含对像天然酵母染色体的行为必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS),着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))外,它们接受大DNA插入的能力使它们达到酵母细胞中染色体样稳定性以及传递的保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用在本领域是公知的(例如,Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopedia of LifeSciences,2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group)。
例如,YAC可以包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的未重排的人VH、D和J基因。人VH、D和J基因是人VH、D和J基因座,它们是完全人的未重排基因。
本领域已知的备选方法可用于内源小鼠或大鼠免疫球蛋白基因的缺失或失活以及与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的人VH、D和J基因的导入。
可以根据实施例中所示的标准技术来产生转基因小鼠。用于产生转基因小鼠的两种最具特征的途径是通过将遗传物质原核显微注射到新鲜受精的卵母细胞中或通过将稳定转染的胚胎干细胞引入桑椹胚或囊胚期胚胎。不管如何引入遗传材料,被操纵的胚胎都会转移到假妊娠的雌性接受者内,在那里继续妊娠并生出候选的转基因幼崽。这些广泛的方法之间的主要区别在于ES克隆可以在用于产生转基因动物之前被广泛筛选。相反,原核显微注射依赖于在引入遗传物质后整合到宿主基因组的遗传物质,并且一般而言,转基因的成功整合直到幼仔出生后才能被证实。
本领域已知许多方法可协助并确定是否发生转基因的成功整合。转基因动物能够通过多种手段生成,包括将构建体随机整合到基因组中,位点特异性整合或同源重组。有多种工具和技术可用于驱动和选择转基因整合和后续修饰,包括使用药物抗性标记(阳性选择),重组酶,重组介导的盒式交换,阴性选择技术和核酸酶来改善重组效率。大多数这些方法通常用于修饰ES细胞。然而,一些技术可用于增强通过原核注射介导的转基因。
能够使用进一步的改进来在所需背景下更有效地生成转基因系。如上所述,在优选的实施方案中,内源性小鼠免疫球蛋白表达被沉默以允许仅使用引入的转基因来表达能够用于药物开发的仅具有重链的储库(repertoire)。如上所述,能够使用遗传操作的小鼠,例如针对所有内源性免疫球蛋白基因座(小鼠重链,小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的TKO小鼠。任何导入的转基因向这种TKO背景的转移能够通过育种(常规的或包含IVF步骤)来实现,以提供该过程的有效规模化。但是,也可以在转基因过程中包括TKO背景。例如,对于显微注射,卵母细胞可以源自TKO供体。类似地,可衍生来自TKO胚胎的ES细胞用于转基因。
导入转基因以表达免疫球蛋白基因座的三重敲除小鼠在本文中称为TKO/Tg。在一个实施方案中,小鼠如WO2016/062990中所述。
如本文所述的融合蛋白可通过例如使用编码肽接头的核酸序列,将编码结合至CD137的单可变重链结构域抗体的核酸与编码结合至PSMA的单可变重链结构域抗体的核酸连接而生成。然后将此类融合核酸分子在合适的宿主细胞中表达。
结合分子的示例性治疗应用
在另一个方面,提供药物组合物,其包含如本文所述的结合分子和任选地药学上可接受的载体。本文所述的结合分子或本发明的药物组合物可以通过任何方便的途径施用,包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、透皮、透粘膜(transmucosal)、通过吸入或局部施用,尤其是耳朵、鼻子、眼睛或皮肤或通过吸入。
肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地,所述组合物肠胃外施用。
药学上可接受的载体或媒介物可以是颗粒状的,使得该组合物为例如片剂或粉末形式。术语“载体”是指与本发明的药物抗体一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这样的药物载体可以是液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水,阿拉伯胶,明胶,淀粉糊,滑石粉,角蛋白,胶体二氧化硅,尿素等。另外,可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中,当施用于动物时,本发明的单结构域抗体或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当本发明的药物抗体静脉内施用时,水是优选的载体。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体,特别是用于注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂,例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要,本发明的组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。
本发明的组合物能够是液体形式,例如溶液,乳液或悬浮液。该液体能够用于通过注射,输注(例如IV输注)或皮下递送。
当打算口服施用时,该组合物优选为固体或液体形式,其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文认为是固体或液体的形式中。
作为用于口服施用的固体组合物,可以将所述组合物配制成粉剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊剂、口香糖、薄片(wafer)等形式。这样的固体组合物通常包含一种或更多种惰性稀释剂。此外,可以存在以下一种或更多种:粘合剂(binder),例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶;赋形剂,例如淀粉、乳糖或糊精,崩解剂,例如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等;润滑剂,例如硬脂酸镁;助流剂,例如胶体二氧化硅;甜味剂,如蔗糖或糖精;调味剂,例如薄荷、水杨酸甲酯或橘子调味剂;和着色剂。当该组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时,除上述类型的材料外,它还可包含液体载体,例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
该组合物可以是液体的形式,例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于口服施用或通过注射递送。当打算口服施用时,组合物可包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于注射施用的组合物中,还可以包括表面活性剂,防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或更多种。
组合物能够采取一个或更多个剂量单位的形式。
在具体的实施方案中,可希望的是组合物局部施用于需要治疗的区域,或通过静脉内注射或输注。
在治疗特定病症或病况中有效/有活性的治疗剂的量将取决于病症或病况的性质,并且能够通过标准临床技术来确定。此外,能够任选地采用体外或体内测定法来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重程度,并应根据医师的判断和每位患者的情况来决定。应考虑年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主病况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度等因素。
通常,该量为组合物重量的至少约0.01%的本发明的单结构域抗体。当打算口服施用时,该量可以在组合物重量的约0.1%至约80%的范围内变化。优选的口服组合物可以包含占组合物重量的约4%至约50%的本发明的单结构域抗体。
制备本发明的优选组合物,使得肠胃外剂量单位含有约0.01%至约2%重量的本发明的单结构域抗体。本发明还涉及装置,例如包含本发明的结合分子的预填充注射器。
对于注射施用,组合物能够包含约通常约0.1mg/kg至约250mg/kg受试者体重,优选约0.1mg/kg至约20mg/kg受试者体重,以及更多优选约1mg/kg至约10mg/kg受试者体重。在一个实施方案中,组合物以约1至30mg/kg,例如约5至25mg/kg,约10至20mg/kg,约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药时间表可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。
如本文所用,“治疗(treat)”,“正在治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或缓解疾病或病症。例如,治疗可以包括推迟与疾病或病症有关的症状的发展,和/或降低将或预期将随所述疾病发展的这类症状的严重性。这些术语包括改善现有症状,预防额外症状以及改善或预防此类症状的根本原因。因此,该术语表示对至少一些被治疗的哺乳动物,例如人类患者,给予了有益的结果。许多药物治疗对一些但并非全部接受治疗的患者有效。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅作为示例,受试者包括但不限于哺乳动物,包括但不限于人类或非人类哺乳动物,例如非人类灵长动物、鼠、牛、马、犬、羊或猫。
如本文所用,术语“有效量”是指如本文所述的结合分子的量,当其单独或与额外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时,该量在施用条件下有效实现所需的治疗或预防作用。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症特别是前列腺癌的方法,其包括向受试者施用本发明的结合分子,所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子和/或药物组合物。特别地,本发明涉及用于预防和/或治疗癌症特别是前列腺癌的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子或药物组合物。
本发明还涉及用于治疗疾病的本发明的结合分子。本发明还涉及用于治疗癌症特别是前列腺癌或前列腺病症的本发明的结合分子。“前列腺癌”是指由前列腺组织引起的所有阶段和所有形式的癌症。本发明还涉及特征在于PSMA异常表达的疾病的治疗。
在另一个方面,本发明涉及本发明的结合分子在治疗疾病中的用途。在另一个方面,本发明涉及本发明的结合分子在制备用于治疗癌症例如前列腺癌或前列腺病症的药物中的用途。
本发明的结合分子也可用于治疗、预防或改善疾病。在一个实施方案中,所述疾病与PSMA阳性细胞有关。在一个实施方案中,所述疾病是癌症。在一个实施方案中,所述癌症与PSMA阳性肿瘤有关。
已在其他癌症中检测到PSMA的表达,更具体地在与这些癌症相关的新血管系统中检测到PSMA的表达。包括常规(透明细胞)肾细胞,膀胱移行细胞,睾丸-胚胎,神经内分泌,结肠和乳腺以及不同类型的恶性肿瘤在内的许多各种不同的癌症在其新生血管系统中被一致发现且强烈地表达PSMA。在一个实施方案中,待治疗的癌症选自表达PSMA的新血管系统中的肿瘤,例如选自肾癌、膀胱癌、睾丸癌、神经内分泌癌,结肠癌和乳腺癌。
在一个方面,所述癌症是局部晚期不可切除、转移或复发的癌症。
在一个实施方案中,所述癌症选自以下非限制性列表:前列腺癌、肺癌或成胶质细胞瘤。在一个实施方案中,该疾病是前列腺病症,所述前列腺病症是指折磨男性生殖系统中的前列腺的任何疾病。前列腺依赖于睾丸的激素分泌。
本发明的结合分子可以作为唯一活性成分或与一种或更多种其他治疗和/或细胞毒性部分组合施用。在一个实施方案中,所述结合分子可以与毒性部分缀合。
在一个实施方案中,所述单结构域抗体与手术组合使用。
与其他试剂的示例性组合
本发明的分子或药物组合物,包括单价或多价分子,可以作为唯一的活性成分或与一种或更多种其他治疗剂组合施用。治疗剂是可用于治疗疾病的化合物或分子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂(pro-apoptotic agents)、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。抗体分子包括完整抗体或其片段(例如,Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单结构域抗体,例如VH结构域、抗体模拟蛋白或模拟CD137天然配体的蛋白。
抗癌疗法可包括治疗剂或放射疗法,并且包括基因疗法、病毒疗法、RNA疗法骨髓移植、纳米疗法、靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其他治疗剂的实例包括其他检查点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性试剂、减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如IL-2,IFNα2,GM-CSF)、靶向小分子和生物分子(例如信号转导途径的组分例如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂,以及与肿瘤特异性抗原结合的试剂,包括EGFR拮抗剂)、抗炎剂、细胞毒性剂、放射性毒剂或免疫抑制剂和用编码免疫刺激性细胞因子(例如GM-CSF)的基因转染的细胞,化学疗法。在一个实施方案中,施用与手术结合。本发明的结合分子可与其他治疗同时或在不同时间施用,例如同时、分开或顺序施用。
调节免疫应答、抑制肿瘤生长等的示例性方法
在又再一个方面,提供在受试者中调节免疫应答的方法,其包括向所述受试者施用本文所述的结合分子或药物组合物,从而调节受试者中的免疫应答。优选地,所述结合分子增强、刺激或增加受试者的免疫应答。
在又一个方面,提供在受试者中抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤退化的方法,其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的结合分子或药物组合物。
在又一个方面,提供激活CD137的下游信号传导途径的方法,该方法包括向受试者施用本文所述的结合分子或药物组合物。
在又一个方面,提供诱导T淋巴细胞激活和/或增殖的方法,该方法包括向受试者施用本文所述的结合分子或药物组合物。
在又一个方面,提供用于双重靶向CD137表达细胞和肿瘤抗原即PSMA表达细胞的方法,该方法包括向受试者施用包含结合CD137的单可变重链结构域抗体的结合分子或本文所述的药物组合物。
在又一个方面,提供用于双重靶向CD137表达细胞和肿瘤抗原即PSMA表达细胞的结合分子或本文所述的药物组合物,所述结合分子包含结合CD137的单可变重链结构域抗体。例如,所述结合分子包含本文所述的结合至CD137的单可变重链结构域抗体和本文所述的结合至PSMA的单可变重链结构域抗体。
示例性免疫缀合物
在另一个方面,提供免疫缀合物,其包含与至少一种治疗剂和/或诊断剂(即显像剂)缀合的本文所述的结合分子。
示例性试剂盒
在另一个方面,本发明提供用于检测前列腺癌以进行诊断、治疗、预后或监测的试剂盒,其包含本发明的结合分子。试剂盒还可以包含使用说明。试剂盒可包括如上所述的本发明的标记的结合分子和一种或更多种用于检测标记物的化合物。还提供以冻干形式包装或包装在水性介质中的本发明的结合分子。试剂盒可包括试剂(例如用于重构)和/或使用说明和/或施用装置。
示例性非治疗性应用
本发明还涉及使用本发明的结合分子的检测方法。考虑到它们结合人PSMA的能力,本文公开的人PSMA结合分子能够用于使用常规免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA),放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学)检测PSMA(例如,在生物样品例如血清或血浆中)。特别地,本发明还涉及用于诊断或监测癌症特别是前列腺癌的进展的体外或体内方法。体外方法包括检测测试样品中PSMA蛋白的存在并将其与正常受试者的对照样品或正常受试者的标准值或标准值范围进行比较。样品可以选自血液、血浆、血清、精液、尿液或组织活检。
该方法可以包括:(a)使样品(和任选的参照物,例如阳性和/或阴性对照样品)与本发明的PSMA结合分子接触,和(b)检测样品中结合至PSMA的结合分子或未结合的结合分子,从而检测生物样品中的PSMA。结合分子可以用可检测物质直接或间接标记,以便于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
体内方法可包括检测体内PSMA的存在,例如通过在受试者中成像。在该方法中,标记本发明的PSMA结合分子以检测结合。因此,本发明的标记分子可以用作显像剂。
作为标记本发明的结合分子的替代,能够利用标记有可检测物质的PSMA标准品和未标记的人PSMA结合分子,通过竞争免疫测定法测定生物流体中的人PSMA。在该测定中,组合生物样品、标记的PSMA标准品和人PSMA结合分子,并确定与未标记的结合分子结合的标记的PSMA标准品的量。生物样品中人PSMA的量与结合至PSMA结合分子的标记的PSMA标准品的量成反比。类似地,还能够利用标记有可检测物质的PSMA标准品和未标记的人PSMA结合分子,通过竞争免疫测定法测定生物流体中的人PSMA。
本文公开的结合分子可以用于抑制例如在含有PSMA的细胞培养物中的、在具有与本文公开的结合分子交叉反应的PSMA的人受试者中或其他哺乳动物中的PSMA活性。在一个实施方案中,提供抑制或增加PSMA活性的方法,包括将PSMA与本文公开的结合分子接触,使得PSMA活性被抑制或增加。例如,在含有或怀疑含有PSMA的细胞培养物中,能够将本文公开的结合分子加入到培养基中以抑制培养物中的PSMA活性。
因此,在一个实施方案中,本发明还涉及消融或杀死表达PSMA的细胞例如癌性或非癌性前列腺细胞的方法。本发明的方法包括使细胞与足以消融或杀死细胞的量的本发明的PSMA结合分子接触。这些方法能够用于(例如体外或离体)培养中的细胞。
还提供参考附图和实施例的本文所述的结合分子或药物组合物。除非在此另外定义,否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供涵盖在本发明的范围内的主题的一般描述,包括制造和使用本公开的方法及其最佳模式,提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本公开。然而,本领域技术人员将理解,这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制,其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开,本公开的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本说明书中提及的所有文件均通过引用以其全文并入本文,包括对基因登录号的参考,科学出版物和对专利公开的参考。
本文中使用的术语“和/或”被认为是两个特定特征或部件在具有或不具有另一的情况下每一个的具体公开。例如,“A和/或B”将被视为(i)A,(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开内容,就像它们在本文中分别列出一样。除非上下文另有规定,否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案,并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
现在在非限制性实施例中进一步描述本发明。
具体实施方式
实施例1对CD137和PSMA特异性的HumabodyVH的分离
在沉默内源重链和轻链抗体表达(三重敲除,或TKO)的背景中携带种系构型的人重链抗体转基因基因座的小鼠如先前所述产生(WO2004/076618,WO2003/000737,Ren等,Genomics,84,686,2004;Zou等,J.Immunol.,170,1354,2003和WO2016/062990)。简言之,用酵母人工染色体(YAC)原核显微注射新鲜受精的卵母细胞之后取得转基因小鼠,所述酵母人工染色体包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的人VH、D和J基因。使用的YAC包括多个人重链V基因、多个人重链D和J基因、鼠CH1基因和鼠3'增强子基因。它缺少CH1外显子。
用重组人CD137或PSMA蛋白免疫小鼠。免疫程序结束时,收集淋巴结和脾脏进行RNA提取。通过PCR扩增重链可变结构域(VH)序列,并将其克隆到噬菌粒载体中。使用标准噬菌体展示技术来分离结合至靶蛋白的VH,包括按照上述标准的文库生成方案,细菌周质提取物的标准筛选程序,优化,测序和纯化方法,从上述免疫小鼠中生成文库。表2、3、5、6和7显示了克隆1.1、2.1、3.1和4.1的氨基酸和核酸序列。
例如,可以如WO2017/122017中所公开的那样生成PSMA结合亚基。为了生成结合CD137的VH,用人CD137-人Fc嵌合蛋白(Acro Biosystems cat no.41B-H5258),人CD137-His标记的蛋白(R&D Systems,定制产品),过表达人CD137的CHO细胞(使用标准方法自制的细胞系)或重组蛋白与CHO人CD137表达细胞的组合免疫8-12周龄的Tg/TKO小鼠。然后在免疫之前和之后从小鼠收集血清,并通过ELISA检查血清人CD137反应性重链抗体对CD137抗原免疫的应答的存在。
从上述免疫小鼠生成的文库遵循如下所述的文库生成的标准方案。将来自数个免疫动物的组织(包括总的脾脏、腹股沟淋巴结和臂部淋巴结)收集到中。从上清液中提取总RNA,使用Superscript III RT-PCR高保真试剂盒(Invitrogen目录号12574-035)根据制造商说明书并从RNA样品中挖掘(mine)VH序列。根据公开的方法(AntibodyEngineering,Benny Lo编,第8章,p161-176,2004)进行文库噬菌体原液的制备和噬菌体展示选择。在大多数情况下,噬菌体展示结合淘选方法用于分离结合性VH结构域。然而,在本领域中充分描述了多种不同的选择方法,包括可溶性蛋白选择,基于细胞的选择和在应激(例如热)下进行的选择。选择文库后,通过单点筛选细菌周质提取物鉴定特异性VH,所述特异性VH结合至表达人CD137的CHO细胞,不结合至CHO亲本细胞并且抑制CHO细胞表面表达的人CD137与重组人CD137配体蛋白之间的相互作用。使用荧光微体积测定技术(FMAT)评估上清液中His标记的VH与CHO人CD137细胞的结合以及上清液中His标记的VH与用于确定非CD137特异性结合的CHO亲本细胞的结合。与结合测定平行地,以FMAT形式测试周质提取物抑制人CD137配体蛋白与CHO人CD137细胞的相互作用的能力。鉴定出结合至CHO人CD137细胞、不结合CHO亲本细胞且抑制CD137与CD137配体结合的VH的家族。如上鉴定的每个单独的VH克隆从噬菌粒测序,并基于VH种系和CDR3氨基酸相似性分组。代表性克隆进一步被表征。通过对克隆VH 1.1和VH 2.1分别进行序列优化以提高结合活性,将序列回复种系或除去生物物理序列倾向例如异构化或脱酰胺位点,从而产生进一步的克隆。通过使用标准程序获得纯化的VH。表2显示了家族1VH的序列,表3显示了家族2VH的序列。
测试纯化的VH与人CD137蛋白、恒河猴CD137Fc重组蛋白、小鼠CD137蛋白、肿瘤坏死因子受体家族成员OX40和GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关)、CHO人CD137细胞、CHO亲本细胞和人T细胞的结合。VH结合人和恒河猴CD137,但不结合小鼠CD137蛋白。使用FMAT测定形式进行连续稀释的VH与CHO人CD137细胞和CHO亲本细胞的结合。VH结合至CHO人CD137表达细胞,但不结合至CHO亲本细胞。使用流式细胞术测量单价单结构域抗体与原代T细胞的结合。如本文所述的VH与预刺激的CD8+细胞结合。在FMAT配体抑制测定法中,还测量了纯化的Humabody VH抑制CD137配体与CHO人CD137细胞结合的能力。VH抑制人CD137配体与人CD137的结合。还使用表达CD137和NF-kB荧光素酶报告基因的Jurkat细胞在报告基因测定中进行了功能测定,以评估与CD137结合的单价VH充当CD137激动剂的能力。将它们的活性与具有增加的亲合相互作用潜力的二价和三价分子以及与由连接至结合肿瘤抗原PSMA的VH的CD137 VH组成的双特异性分子进行了比较。在双特异性分子中,CD137和细胞表达的PSMA共同接合导致CD137激动。
实施例2双特异性构建体的生成和稳定性测试
使用编码甘氨酸/丝氨酸富集序列(G4S)x的接头通过连接分离的VH核酸序列来生成多价构建体,其中x是G4S重复的数目,范围为2至12个重复单元。通过PCR扩增编码每个的DNA序列。将产物与VH单结构域抗体序列组装成较大的片段,所述VH单结构域抗体序列的侧翼为(G4S)x接头,并通过基于限制酶的方法连接到表达载体中。按照标准分子生物学技术将质粒转化到微生物表达系统中。通过标准克隆PCR技术验证插入物的存在,并使用载体特异性和内部的引物通过Sanger测序确认序列,以确保完整的序列覆盖。为了生成双特异性分子,第一序列和第二序列与对应于对CD137特异性的VH的一个序列和对应于结合肿瘤相关抗原PSMA的的另一个序列不同。在另一个实例中,单价和双特异性结合剂任选地与半衰期延长核酸序列(MSA粘合剂)连接。双特异性和三特异性构建体通过微生物细胞系统表达。为了进行稳定性测试,对纯化的双特异性和三特异性VH进行了尺寸排阻色谱分析。表9列出了代表性的构建体的示例数据。
表9
三特异性融合蛋白和编码此类融合蛋白的核酸的实例如下所示。二价分子的实例也显示在下面(表10)。
实施例3:与CD137和PSMA的结合
3.1细胞结合
使用荧光微体积测定技术(FMAT)评估His标记的分子与CHO人CD137、CHO亲本,CHO人PSMA、DU145 PSMA和DU145亲本细胞的结合。所有试剂均在含PBS,0.1%牛血清白蛋白,0.05%叠氮化钠的FMAT测定缓冲液(pH 7.4)中制备。将经连续稀释的样品转移到384孔黑色透明底测定板(Costar cat.no.3655)中,并在室温下与1.5nM Anti-His(Milliporecat.no.05-949)、3nM山羊抗小鼠Alexa Fluor-488(Jackson ImmunoResearchcat.no.115-545-071)以及用DRAQ5(Thermo Scientific cat.no.62251)预染的2000个细胞/孔温育至少2小时。在488nm和640nm激发后,在TTP Mirrorball读板仪上在FL2(502nm-537nm)和FL5(677-800nm)通道中测量荧光发射。数据在FL5周界和峰强度上被门控,使用门控数据的FL2中值平均荧光强度来确定VH结合。表11中显示了结合的示例性的EC50值。单价CD137特异性的VH,具有CD137结合臂的双特异性和三特异性的分子结合至CHO CD137表达细胞。单价PSMA特异性的VH,具有PSMA结合臂的双特异性和三特异性分子结合至PSMA表达细胞。
表11
使用流式细胞术测量单价单结构域抗体与原代T细胞的结合。通过密度梯度离心从人血中分离出外周血单核细胞(PBMC),然后根据制造商的规程(Miltenyi Biotech catno 130-042-401)使用阴性选择分离试剂盒纯化CD8+T细胞。在补充了10%FBS,2mM谷氨酰胺,1X Pen/Strep的RPMI培养基中,将CD8+T细胞用PMA/离子霉素刺激48-72小时。将细胞转移到96孔板中,用染色缓冲液(PBS/1%BSA/0.05%叠氮化钠)封闭10分钟,然后与在染色缓冲液(PBS/1%BSA)中与连续稀释的VH在4℃温育30分钟-1小时。通过离心洗涤细胞,然后使用抗His抗体(Millipore 05-949)和山羊抗小鼠Alexa Fluor-488(JacksonImmunoResearch cat no.115-545-071)检测VH结合。用A Live Dead near IR stain(Molecular Probes cat no.L10119)区分活细胞。进一步洗涤后,将细胞固定并通过流式细胞仪测量荧光。表9显示了结合的平均EC50值(2-3个供体)。单价CD137特异性VH和带有CD137结合臂的双特异性分子结合至预刺激的CD8+细胞。
3.2亲和动力学
在ForteBio Octet RED 384仪器上测定纯化的单价VH和PSMA-CD137靶向双特异性分子的结合动力学。为了研究与抗原的相互作用,将CD137-Fc标签蛋白(AcroBiosystems cat no.41B-H5258)或PSMA-his(R&D Systems cat no.4234-ZN)通过胺偶联固定在AR2G生物传感器(ForteBio cat no.18-5082)。在动力学缓冲液(0.1%BSA,0.02%Tween,1x PBS)中连续稀释单价VH和双特异性分子(通常在最高浓度在12-25nM之间开始以1:2稀释系列),且与固定的蛋白质的结合是在缔合和解离阶段进行研究的。使用180秒缔合和600秒解离阶段测量PSMA结合。在180秒缔合和600秒解离阶段测量CD137结合。使用ForteBio Octet数据分析软件,将减去参考的数据拟合为1:1结合模型。表12中显示获得的示例动力学和结合亲和力数据。
表12
Biacore T200仪器用于通过表面等离振子共振(SPR)研究VH与人和恒河猴CD137-人IgG1Fc标记的蛋白之间的相互作用。单循环动力学测定法用于评价相互作用的动力学和亲和力。实验是在25℃在HBS-EP+测定缓冲液中进行的,流速为30μl/分钟。蛋白G芯片用于在7秒钟内将稀释至2μg/ml的Fc标记的重组CD137捕获到其中一个流通池中。没有任何捕获的CD137的第二流通池用作参考池。制备了最高浓度为60nM的五点的三倍稀释系列的VH。结合动力学之后,使它们流过芯片表面。对于恒河猴和人CD137,每个结合步骤的接触时间为180秒,解离步骤分别为1800和3600秒。每次运行后,用甘氨酸pH 1.5以除去捕获的CD137来再生传感器。在使用Biacore T200评价软件进行双重参考扣除后,将数据拟合为1:1结合模型。1.113与人CD137Fc结合的平均动力学常数(±标准偏差)为ka 3.6E+06±1.6E+06(1/Ms),Kd是3.0E-04±1.1E-04(1/s)和KD 8.5E-11±7.8E-12(M),与恒河猴CD137Fc结合的的平均动力学常数为ka 1.1E+06±2.2E+05(1/Ms),Kdis 2.8E-04±6.8E-06(1/s)和KD 2.7E-10±5.2E-11。结合HSA-4GS的构建体4.1-6GS-1.113-6GS-VH与人CD137Fc结合的平均动力学常数(±标准偏差)为ka 5.6E+05(1/Ms),Kdis 1.7E-05(1/s)和KD 3.1E-11(M),且与恒河猴CD137Fc结合的平均动力学常数为ka 4.4E+05(1/Ms),Kdis5.2E-05(1/s)和KD 1.2E-10(M)。与其他分子相比,1.113显示出与cyno更好的结合,并且与其他分子相比,其还显示出更好的可开发性特征(稳定性和表达)。
3.3共同接合
还使用ForteBio Octet仪器证明了3个靶标的接合。缔合1—三特异性分子与蛋白质G生物传感器上捕获的CD137Fc的结合。缔合2—人血清白蛋白的结合,缔合3—在人血清白蛋白存在下的PSMA的结合,以最小化HSA解离。这表明三特异性分子能够同时结合靶标。
用T细胞使用ELISA格式和流式细胞术评估了双特异性分子对CD137和PSMA的双重靶标接合。对于ELISA,将CHO-PSMA细胞(20000/孔)接种到补充有L-谷氨酰胺+杀稻瘟菌素+四环素的Hams F12中的96孔板(Greiner cat no.353872)中,并与5%CO2在37℃下温育过夜。所有后续步骤均在室温下进行,并且在每个步骤之间包括用PBS洗涤。将板用PBS/0.1%BSA封闭1小时,然后加入连续稀释的VH并使其结合1小时。除去未结合的VH后,将1nM CD137huFc(Acro Biosystems cat no.41B-H5258)添加至孔中并温育1小时。随后添加1:3000稀释的抗huFc-HRP(Jackson ImmunoResearch cat no.109-035-098)1小时,并通过添加TMB使平板显色。加入0.5M硫酸终止反应,并在BMG PheraStar上于450nm的吸光度处读板。图1显示了代表性数据,表明双特异性分子能够同时结合人CD137和人PSMA。用FACS缓冲液(补充有10%人血清和0.05%叠氮化钠的PBS)洗涤用PMA/离子霉素预刺激48小时的人CD8+T细胞。在冰上将连续稀释的双特异性和三特异性Humabody VH构建体添加到细胞中1小时。用FACS缓冲液洗涤板,然后加入含有5nM生物素化的PSMA,20nM链霉亲和素AlexaFluor488和Live/Dead NearIR细胞染色稀释液的检测混合物。将板在4℃温育1小时,然后通过离心用FACS缓冲液洗涤两次。通过添加1X BD Cell固定液固定细胞,然后通过离心用PBS洗涤两次,并将细胞沉淀重悬于PBS中。在iQue Plus筛选器(IntelliCyt)上的RL2-H通道(Live/Dead染色)和BL1-H通道(AlexaFluor488染色)中测量荧光。双特异性和三特异性分子能够同时结合人CD8+T细胞和PSMA蛋白。
还使用荧光微体积测定技术按照3.1节测量与细胞系的结合。CD137huFc/抗人Fc-Alexa Fluor-488用于检测与表达PSMA的细胞的结合。
ELISA数据是n=3测定的平均EC50(±SD)。显示的流式细胞术数据是至少6个不同的人T细胞供体的平均EC50(±SD)(表13)。在FMAT测定中,构建体4.1-6GS-1.113-6GS-VHHSA-4GS结合CHO食蟹猴PSMA细胞(平均EC50±SD(M)5.7E-10±4.6E-11,0.57nM n=3)。
表13
实施例4 CD137L结合的抑制
以FMAT形式测试VHs抑制人CD137配体蛋白与CHO人CD137细胞的相互作用的能力。将在FMAT测定缓冲液中连续稀释的VH在室温下与0.2nM–0.4nM CD137L-huFc(Sino Biologicals cat no.15693-101H),3nM488山羊抗人IgG,Fcγ片段特异性山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch cat no.109-545-098)以及用DRAQ5预染的2000个细胞温育至少2小时。在每个板上设置含有FMAT测定缓冲液的总结合对照和含有过量的非Fc标记的竞争物的非特异性结合对照,以进行数据归一化。使用TTPMirrorball测量荧光信号,并将门控的FL2中值平均荧光强度用于数据归一化。减去从非特异性结合对照孔中测定的背景信号后,数据表示为总结合对照的%(%对照)。单价和双特异性形式的VH抑制CD137与CD137配体的结合(表14)。
表14
实施例5功能活性
5.1共培养功能活性测定
使用表达CD137和NF-kB荧光素酶报告基因的Jurkat细胞和表达人PSMA的细胞,在共培养报告基因测定中评估了双特异性分子充当CD137激动剂的能力。使用高PSMA表达细胞(CHO PSMA)和低PSMA表达细胞(DU145 PSMA)进行测定。将PSMA表达细胞或亲本细胞(5000/孔)过夜接种到384孔白色透明底的组织培养物处理的板中。对于CHO细胞,第二天除去培养基,并用测定培养基(补充有10%FBS,2mM L-谷氨酰胺,1X Pen/Strep的RPMI 1640)代替。在测定培养基(补充有10%FBS,2mM L-谷氨酰胺,1X Pen/Strep的RPMI 1640)中制备连续稀释的单体VH,双特异性和Jurkat报告细胞,并添加到孔中。在CO2培养箱中于37℃温育5-6小时后,通过添加BioGlo试剂(Promega G7940)并在BMG Pherastar上测量发光信号来确定荧光素酶报告基因的表达水平。图2举例说明了CD137-PSMA VH双特异性分子对NF-kB途径的浓度和PSMA依赖性刺激。PSMA表达水平决定了最大应答,与低表达DU145 PSMA细胞相比,CHO PSMA高PSMA表达细胞系获得的最大水平更高(图2b)。抗CD137抗体以PSMA非依赖性的方式刺激NF-kB驱动的报告基因活性(图2c)。实验表明,在双特异性分子中,CD137和细胞表达的PSMA的共同接合导致CD137激动。
5.2IL-2释放
在共培养测定中,测试双特异性分子诱导IL-2从T细胞释放的能力。将DU145 PSMA或亲本DU145细胞重悬于培养基(补充有10%FBS,2mM L-谷氨酰胺,1X Pen/Strep的RPMI1640)中,并以每孔20000的密度接种到已用5ug/ml抗CD3抗体(e-Bioscience cat no.14-0037-82)预包被的96孔平底板上。使细胞在37℃,5%CO2下粘附过夜。通过密度梯度离心从人血中分离出外周血单核细胞(PBMC),然后根据制造商的规程(Miltenyi Biotech cat no130-042-401)使用阴性选择分离试剂盒纯化CD8+T细胞。在培养基中制备VH,双特异性抗体和基准抗体,并将其与T细胞(100000细胞/孔)一起添加至测定板。在37℃下,5%CO2温育48小时后收获上清液,并根据制造商的说明(Cisbio Cat no.64IL2PEB)使用人IL-2测定试剂盒对IL-2水平进行定量。CD8+T细胞对IL-2产生的刺激不依赖于针对抗CD137基准抗体的PSMA,但是PSMA依赖性的(图3a)和浓度依赖性的(图3b,3d)。最大应答水平针对于抗体和双特异性分子均是T细胞供体依赖性的(图3c)。干扰素γ也被诱导(图3e)。
5.3.超抗原激活的细胞的刺激
在治疗前,用10ng/ml SEB(葡萄球菌肠毒素B)刺激来自健康供体的PBMC 16小时。将CHO细胞或表达PSMA的CHO细胞以每孔10,000接种到96孔板中。加入构建体至终浓度为50nM和4倍稀释系列。将SEB刺激的PBMC以每孔75,000添加到含1ng/ml SEB的培养基中。将板在37℃ 5%CO2温育3天。收获上清液用于细胞因子测量。根据制造商的说明,使用Cisbio HTRF试剂盒(62HTNFAPEG)测量TNF-α。在表达PSMA的细胞存在下,TNF-α以双特异性依赖性剂量应答方式增加。在不存在PSMA的情况下无诱导(图5)。
将雄性NCG小鼠(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl,Charles River)在右胁腹皮下注射50%基质胶中的1x 107DU145 PSMA细胞。在第8天,通过尾静脉移植hPBMC(HemaCare BioResearch Products)。未移植的小鼠用作对照组。然后用经腹膜内施用的或对照CD137激动剂抗体处理小鼠,并记录体重,临床观察结果和肿瘤体积。该研究是在Charles River Discovery Services North Carolina(CR DiscoveryServices)进行的,该研究在约束,饲养,手术程序,饲料和体液调节以及兽医护理方面具体符合《实验动物的护理和使用指南》的建议,并获得AAALAC的认可。与对照组相比,半衰期延长的双特异性处理组显示减小的肿瘤体积(图6)。
实施例7在双转基因人源化FcRn/HSA小鼠中半衰期延长分子的单次静脉内给药的药代动力学分析
使用的人类新生儿Fc受体/白蛋白小鼠模型进行实验。这种双重人源化的新生儿Fc受体(FcRn)/白蛋白小鼠模型维持了自体受体-配体的相互作用并模拟了人体中的生理药物清除,因此代表了一种独特而可靠的工具,用于测量和优化与白蛋白连接的小分子和常规药物药代动力学,以及研究和预测循环生物制剂和生物仿制药的半衰期(Viuff D,Antunes F,Evans L,Cameron J,Dyrnesli H,Thue Ravn B,Stougaard M,ThiamK,Andersen B, S,Howard KA.2016.Generation of a double transgenichumanized neonatal Fc receptor(FcRn)/albumin mouse to study thepharmacokinetics of albumin-linked drugs.J Control Release)。
与WT小鼠相比,hFcRn/HSA人源化小鼠提供更可预测的“类人”药代动力学结果。该模型非常适合HSA结合药物的药代动力学、分布和毒性的体内评估。
在这些实验中,使用三特异性分子(4.1-6GS-1.113-6GS-VH HSA-4GS)测试药代动力学。
简而言之,经由尾静脉以2mg/kg的三特异性单次静脉注射(n=3)给药雄性人HSA/FcRn Tg小鼠。在给药前和通过隐静脉施用后的0.083h、1h、8h、24h、48h、72h和96h采集血样。给药后168小时,对所有动物实施安乐死并收集血液。分离血浆并储存在-80℃直到进行测定。在Gyrolab免疫测定平台上分析血浆样品,使用生物素化的人PSMA作为捕获物,并使用人CD137Dylight650作为检测物。使用Gyros(陀螺仪)分析数据以获得血浆中的浓度。数据的药代动力学分析是使用PK Solver 2.0完成的。
研究结果表明,在人HSA/FcRn Tg小鼠中以2mg/kg静脉内给药时,该分子的半衰期为18.13±0.412小时(n=3)。
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Claims (38)
1.分离的结合分子,其包含
a)结合至CD137的单可变重链结构域抗体和
b)结合至PSMA的部分。
2.根据权利要求1所述的分离的结合分子,其中所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含含有SEQ ID NO.1或与其具有至少40%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.2或与其具有至少40%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.3或与其具有至少40%同源性的序列的CDR3,或含有SEQ ID NO.425或与其具有至少40%同源性的序列的CDR1、含有SEQ IDNO.426或与其具有40%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.427或与其具有至少40%同源性的序列或与其具有至少40%同源性的序列的CDR3或含有SEQ ID NO.427或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3。
3.根据权利要求2所述的分离的结合分子,其中所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含人构架区。
4.根据前述权利要求所述的分离的结合分子,其中所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含如表2或3中列出的全长序列或与其具有至少75%同源性的序列。
5.根据前述权利要求所述的分离的结合分子,其中所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO.4、312、852、856、860、864、868、872、876、880或428或与其具有至少75%同源性的序列。
6.根据前述权利要求所述的分离的结合分子,其中所述结合至PSMA的部分选自抗体、抗体片段、抗体模拟物或其他多肽。
7.根据权利要求6所述的分离的结合分子,其中所述抗体片段选自Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)、单结构域抗体或其片段。
8.根据权利要求7所述的分离的结合分子,其中所述单结构域抗体是VH单结构域抗体。
9.根据权利要求8所述的分离的结合分子,其中所述VH单结构域抗体包含含有SEQ IDNO.812或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.813或与其具有至少75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ ID NO.814或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3,或其中所述VH单结构域抗体包含含有SEQ ID NO.837或与其具有至少75%同源性的序列的CDR1、含有SEQ ID NO.838或与其具有75%同源性的序列的CDR2和含有SEQ IDNO.839或与其具有至少75%同源性的序列的CDR3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中所述结合至PSMA的单可变重链结构域抗体包含表6或7中列出的全长序列或与其具有至少75%同源性的序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中所述结合至PSMA的单可变重链结构域抗体包含SEQ ID NO.815、816、817、818、819、820、821、822、823,824、825或840或与其具有至少75%同源性的序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中具有SEQ ID No.4或428的单结构域抗体1.1或2.1,或具有SEQ ID No 312、852、856、860、864、868、872或876或与其具有至少75%序列同源性的单结构域抗体,分别连接至具有SEQ ID No.815、822或840的单结构域抗体3.1、3.8或4.1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其能够以至少约10-6M至约10-12M的Kd的亲和力结合CD137。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其能够以约10-6M至约10-12M的Kd的亲和力结合PSMA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中所述结合至CD137的单可变重链结构域抗体通过肽接头与所述结合至PSMA的部分连接。
16.根据权利要求15所述的结合分子,其中所述接头选自(G4S)n接头,其中n是选自1至10的整数。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其缀合至选自毒素、酶、放射性同位素、半衰期延长部分、标记物、治疗分子和其他化学部分中的一种或更多种的部分。
18.根据权利要求17所述的结合分子,其中所述半衰期延长部分选自由以下各项组成的组:白蛋白结合部分、转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段,和结合人血清白蛋白的白蛋白结合肽和单结构域抗体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中当作为单特异性实体结合至CD137时,结合至人CD137的单可变重链结构域抗体不引起CD137信号传导。
20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的结合分子,其中结合至人CD137的单可变重链结构域抗体是从表达包含人V、D和J区的转基因的转基因啮齿动物获得或可获得的。
21.根据权利要求20所述的单可变重链结构域抗体,其中所述啮齿动物不产生功能性内源性轻链和重链。
22.药物组合物,其包含根据前述权利要求所述的结合分子和药物载体。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求23所述的药物组合物,用于治疗疾病。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物,其中所述疾病是癌症。
25.治疗前列腺癌或前列腺病症的方法,其包括施用治疗有效量的根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
26.根据权利要求24所述的结合分子或根据权利要求25所述的方法,其中所述癌症是前列腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、神经内分泌癌、结肠癌和乳腺癌。
27.核酸分子,其包含编码根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子的核酸序列。
28.包含根据权利要求27所述的核酸分子的载体。
29.宿主细胞,其包含根据权利要求27所述的核酸分子或根据权利要求28所述的载体。
30.根据权利要求29所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是细菌、酵母、病毒或哺乳动物细胞。
31.产生根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子的方法,其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸,并从所述宿主细胞中分离所述结合分子。
32.用于促进CD8+T细胞扩增、诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活和/或细胞因子释放的方法,所述方法包括施用根据权利要求1至21中任一项的所述结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
33.用于降低人PSMA活性的体内或体外方法,其包括使人PSMA与根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子接触。
34.试剂盒,其包含根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
35.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物在同时激活CD137和PSMA的下游信号传导途径中的用途。
36.共刺激CD137和PSMA的下游信号传导途径的方法,其包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
37.根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物在PSMA阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部T细胞应答中的用途。
38.在PSMA阳性肿瘤细胞或组织附近诱导局部T细胞应答的方法,包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的结合分子或根据权利要求22所述的药物组合物。
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