JP6794348B2 - ヒト化抗ox40抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
[式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9(WIRX39HPGKGLEX47X48G;式中、X39はQ又はKであり、X47はW又はYであり、及びX48はI又はMである)であり、HCDR2は、配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17(RITINX71DTSKNQX78SLQLNSVTPEDTAVYX91CAR;式中、X71はP又はRであり、X78はF又はYであり、及びX91はY又はFである)であり、HCDR3は、配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である]を有するアミノ酸配列を含み、VLはアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み;及び抗体又はその断片はヒトOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号1であり、特定の態様において、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
この発明はまた、以下に関する。
[1]
ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記VHが、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である)を有するアミノ酸配列を含み、
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み、及び
ヒトOX40に特異的に結合することができる抗体又はその断片。
[2]
前記HFW2のアミノ酸配列が、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である、[1]に記載の抗体又はその断片。
[3]
前記HFW3のアミノ酸配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である、[1]又は[2]に記載の抗体又はその断片。
[4]
前記VHがアミノ酸配列、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[5]
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、且つ前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含む、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[6]
前記VLのC末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[7]
前記軽鎖定常領域がヒトκ定常領域である、[6]に記載の抗体又はその断片。
[8]
前記VHのC末端に融合した重鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[9]
前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG4P定常領域、ヒトIgG1TM定常領域又はマウスIgG1定常領域である、[8]に記載の抗体又はその断片。
[10]
前記重鎖定常領域がヒトIgG1定常領域である、[9]に記載の抗体又はその断片。
[11]
重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[12]
前記抗原結合断片が、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、又はsc(Fv)2断片、又はこれらの任意の組み合わせである、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
[13]
カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合することができる、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[14]
ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化CD4 + 又はCD8 + T細胞上に発現するとおりのOX40に特異的に結合することができる、[13]に記載の抗体又はその断片。
[15]
マウス又はラットOX40に結合しない、[1]〜[14]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[16]
関連する腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(TNFRSF)タンパク質と交差反応しない、[1]〜[15]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[17]
初代活性化ヒトCD4 + T細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約370pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[18]
前記結合親和性が約312pMである、[17]に記載の抗体又はその断片。
[19]
フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトCD4 + T細胞に対する20%レセプター占有率(EC 20 )を約63〜約93pMで、初代活性化ヒトCD4 + T細胞に対する50%レセプター占有率(EC 50 )を約250〜約370pMで、及び初代活性化ヒトCD4 + T細胞に対する90%レセプター占有率(EC 90 )を約2290〜約3330pMで実現することができる、[17]又は[18]に記載の抗体又はその断片。
[20]
EC 20 が約78pMであり、EC 50 が約312pMであり、及びEC 90 が約2810pMである、[19]に記載の抗体又はその断片。
[21]
OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[22]
前記結合親和性が約424pMである、[21]に記載の抗体又はその断片。
[23]
フローサイトメトリーによって計測するとき、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC 20 を約60〜約150pMで、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC 50 を約250〜約600pMで、及びOX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC 90 を約2260〜約4380pMで実現することができる、[21]又は[22]に記載の抗体又はその断片。
[24]
EC 20 が約106pMであり、EC 50 が約424pMであり、及びEC 90 が約3820pMである、[23]に記載の抗体又はその断片。
[25]
初代活性化カニクイザルCD4 + T細胞上に発現するカニクイザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約340pM〜約820pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[26]
前記結合親和性が約580pMである、[25]に記載の抗体又はその断片。
[27]
初代活性化アカゲザルCD4 + T細胞上に発現するアカゲザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約130pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[28]
前記結合親和性が約370pMである、[27]に記載の抗体又はその断片。
[29]
プレートベースのアッセイにおいて活性化CD4 + T細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ヒトCD4 + T細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[30]
全てフローサイトメトリーによって計測するとき、20%最大増殖応答(EC 20 )を初代活性化ヒトCD4 + T細胞において約14pM〜約28pMの抗体濃度で実現することができ、50%最大増殖応答(EC 50 )を初代活性化ヒトCD4 + T細胞において約0.3pM〜約130pMの抗体濃度で実現することができ、及び90%最大増殖応答(EC 90 )を初代活性化ヒトCD4 + T細胞において約50pM〜約90pMの抗体濃度で実現することができる、[29]に記載の抗体又はその断片。
[31]
EC 20 が約21pMであり、EC 50 が約28pMであり、及びEC 90 が約72pMである、[30]に記載の抗体又はその断片。
[32]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[29]〜[31]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[33]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[32]に記載の抗体又はその断片。
[34]
初代活性化カニクイザルCD4 + T細胞及び初代活性化アカゲザルCD4 + T細胞においてCD4 + T細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[35]
FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化させることができる、[1]〜[34]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[36]
前記OX40発現T細胞が、NFκBシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するOX40発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼレポーター細胞である、[35]に記載の抗体又はその断片。
[37]
OX40発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[1]〜[36]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[38]
C1qに結合して、前記OX40発現細胞に対するNK媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[37]に記載の抗体又はその断片。
[39]
癌治療を必要としている対象に有効用量を投与すると、前記対象の腫瘍成長を阻害することができる、[1]〜[38]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[40]
前記腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[39]に記載の抗体又はその断片。
[41]
アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して、腫瘍成長が少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%阻害される、[39]又は[40]に記載の抗体又はその断片。
[42]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片と担体とを含む組成物。
[43]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片、又は[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
[44]
配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、[43]に記載のポリヌクレオチド。
[45]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[46]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチド又は[45]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[47]
抗体又はその断片の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体又はその断片が発現する条件下で[46]に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む方法。
[48]
活性化T細胞の生存又は増殖を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[49]
活性化T細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[50]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[49]に記載の方法。
[51]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[50]に記載の方法。
[52]
前記活性化T細胞が、活性化CD4 + T細胞、活性化CD8 + T細胞、又はこれらの組み合わせである、[48]〜[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53]
前記活性化CD4 + T細胞が、ヒトCD4 + T細胞、カニクイザルCD4 + T細胞、アカゲザルCD4 + T細胞、又はこれらの組み合わせである、[52]に記載の方法。
[54]
T細胞活性化を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をT細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[55]
NFκBシグナル伝達経路の刺激によってT細胞活性化を計測することができる、[54]に記載の方法。
[56]
前記T細胞が、活性化CD4 + T細胞、活性化CD8 + T細胞、又はこれらの組み合わせである、[54]又は[55]に記載の方法。
[57]
前記活性化CD4 + T細胞が、ヒトCD4 + T細胞、カニクイザルCD4 + T細胞、アカゲザルCD4 + T細胞、又はこれらの組み合わせである、[56]に記載の方法。
[58]
前記接触させるステップが、対象に前記抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む、[54]〜[57]のいずれか一項に記載の方法。
[59]
対象の癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は[42]に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
[60]
前記癌が固形腫瘍である、[59]に記載の方法。
[61]
前記抗体若しくはその断片又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、[59]又は[60]に記載の方法。
[62]
腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[61]に記載の方法。
[63]
対象の免疫応答を増強する方法であって、それを必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片、又は[42]に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
[64]
前記対象がヒト対象である、[59]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[65]
配列番号91のアミノ酸108〜146の範囲内にあるヒトOX40のエピトープに結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[66]
前記エピトープが少なくとも配列番号91のアミノ酸ロイシン116及びアラニン126を含む、[65]に記載の抗体又はその断片。
[67]
Q113L突然変異及びV124A突然変異を除いて配列番号92を含むマウスOX40変異体に結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体。
[68]
100アミノ酸以下からなる単離ペプチドであって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片が特異的に結合することのできるペプチド。
[69]
配列番号91のアミノ酸116〜126を含む、[68]に記載のペプチド。
[70]
L116及びA126を除く任意の位置における1、2、3、4、5、又は6個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号91のアミノ酸108〜146を含む、[68]又は[69]に記載のペプチド。
用語「一つの(a)」又は「一つの(an)」実体とは、当該の実体の1つ以上を指し;例えば、「一つの結合分子(a binding molecule)」は、1つ以上の結合分子を表すものと理解されることに留意すべきである。従って、用語「一つの(a)」(又は「一つの(an)」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体例えばヒト化抗体に関する。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は単離可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は天然に存在しえない。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、
を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
本開示は、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、ヒト化抗OX40抗体若しくはヒト化抗OX40抗体のサブユニットをコードするか又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含む1種のポリヌクレオチド又は2種以上のポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNA形又はDNA形であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA例えば修飾ゲノムDNA、及び合成DNAを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であり得るとともに、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であり得る。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、
を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、
(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である)
を有するアミノ酸配列、又は(c)参照アミノ酸配列の配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列、を含むVHと、を一体的に含み得る。VH(b)では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、若しくは配列番号13であり得るとともに、且つ/又はHFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、若しくは配列番号24であり得る。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を調製する方法及び必要とされる被験体に、例えば、癌患者で免疫反応を増強するために、例えば、腫瘍成長を阻害又は低減するために投与する方法は、周知であるか又は当業者であれば容易に決定可能である。ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、又は局所であり得る。本明細書で用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸、又は経膣の投与を含む。これらの投与形態はすべて好適な形態として明確に企図されるが、投与形態の別の例は、とくに静脈内又は動脈内の注射又は点滴に供される注射用の溶液であろう。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、緩衝液(例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)、安定化剤(例えば、ヒトアルブミン)などを含む。本明細書に記載の教示に適合可能な他の方法では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を有害な細胞集団部位に直接送達することにより治療剤への疾患組織の暴露を増加させることが可能である。
本開示は、本明細書に記載のヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含み且つ本明細書に記載の方法を行うために使用可能なキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、1つ以上の容器内に少なくとも1種の精製されたヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含む。当該技術分野で周知の確立されたキット方式の1つに開示されたヒト化抗OX40抗体を容易に組込み可能であることは、当業者であれば容易に分かるであろう。
ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の任意の方法により特異的及び/又は選択的結合に関してアッセイ可能である。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、いくつかの例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、蛍光フォーカスアッセイ(FFA)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイなどの技術を用いた競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイはルーチンで行われており、当該技術分野で周知である(例えば、Ausubel et al.,eds,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)Vol.1(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞上のOX40のエンゲージによる被験体(例えば、ヒト被験体などの哺乳動物被験体)における抗原特異的免疫反応の増強は、抗原の活性化時又は活性化後に多種多様な方法を用いて達成可能である。最適な方法は、免疫反応の増強が望まれる抗原のタイプに主に依存するであろう。また、利用可能な種々の方法は、以下で考察される。どんな方法を選択するにせよ、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、抗原によるT細胞のプライミング時又はその直後に被験体のT細胞に提示されるように被験体例えばヒト患者に投与可能である。
抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的分子例えばOX40ポリペプチドの部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的分子例えばポリペプチドは、単一のエピトープであり得るが、典型的には少なくとも2つのエピトープを含み、標的分子のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存して任意の数のエピトープを含み得る。
ネズミmAb9B12のCDRを選択されたヒト生殖系列フレームワーク上にグラフトすることによりヒト化した。ネズミmAb9B12の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の配列を公共NCBIデータベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列と比較した。最も高い配列相同性に基づいてヒトアクセプターフレームワーク(FR)を特定した。最適アクセプターフレームワークを選択する際、結合に影響を及ぼす可能性があるマッチ残基(バーニアゾーン残基、カノニカルクラス残基、及びVH/VLインターフェース残基)や免疫原性の可能性(低い生殖系列頻度)などのいくつかの基準を考慮した。それぞれ個別のフレームワーク領域に対して最も相同なヒト免疫グロブリン生殖系列セグメントを選択することにより、VH及びVLの最適ハイブリッドヒトアクセプターFR配列を独立して設計した。3つの異なる生殖系列アクセプター配列を組み合わせてヒト化VHフレームワークバックボーンを形成し、一方、VLについては2つの異なる生殖系列アクセプター配列を選択した。VH鎖(9B12VH−hu)に対して選択された完全ヒト生殖系列アクセプターテンプレートは、IGVH4−34*09(FR1)とVH4−39(FR2)とVH6−1(FR3)とJH4(FR4)との組合せであった。VL(9B12VL−hu1)は、O18(FR1)とO18(FR2)とL23(FR3)とJK1(FR4)との組合せであった。ネズミ配列とヒトテンプレートアクセプター配列との間のフレームワーク相同性は、VHでは77%及びVLでは約72%であった。
2.1 材料
この実施例で使用した材料を表2−1に列挙する。
2.2.1 一次ヒトCD4+T細胞及びOX40発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合
ヒトOX40に結合するOX40mAb24の見掛けの平衡結合定数(Kd)及び平衡時に細胞表面ヒトOX40レセプターの20%、50%、又は90%に結合するのに必要な濃度を、OX40発現活性化一次ヒトCD4+T細胞又はヒトOX40過剰発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合曲線から計算した。OX40mAb24値との比較のために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるマウスOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24と比較するために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。以下のプロトコルに従って、採取された正常Balb/Cマウス脾臓からマウスCD4+T細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるラットOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。製造業者の取扱い説明書に従ってR&D Systems Magellectキット(Minneapolis,MN)を用いてラットCD4+T細胞の単離を行ったこと以外は、マウス脾細胞の単離に関連して以上に説明したプロトコルに従って、新たに採取した正常スプラーグドーリーラット脾臓からラットCD4+細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるカニクイザル(cyno)OX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常カニクイザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からカニクイザルCD4+T細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるアカゲザルOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常アカゲザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からアカゲザルCD4+T細胞を単離した。
第2.1節に記載のアッセイのフローサイトメトリーは、LSRIIフローサイトメーター(Becton−Dickinson,San Jose,CA)を用いて行った。Flow Joサイトメトリー解析ソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR)を用いて細胞へのOX40mAb24、9B12、及び対照タンパク質の結合を決定した。OX40発現細胞(非染色でPIも二次抗体も無し)、AlexaFluor(登録商標)488標識二次抗体試薬若しくはAlexaFluor(登録商標)647標識二次抗体試薬のみに結合される細胞、又は0.1%のサポニンで透過化されて10μg/mLのPIで処理された細胞を含有するウェルを単一染色補償対照として準備した。蛍光補償後、生存(PI陰性)細胞をゲート処理して二次抗体の平均蛍光強度(MFI)を決定した。
2.4.1 見掛けの平衡解離定数(Kd)の決定
Windows用GraphPad Prismバージョン5.01(GraphPad Software,San Diego California USA,www.graphpad.com)を用いてタンパク質濃度(M)に対してOX40mAb24結合のMFIをプロットすることにより結合曲線を作成し、この曲線から見掛けのKdが決定した。ヒト、マウス、ラット、カニクイザル、又はアカゲザルのOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合に対する見掛けのKdを決定するために、一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を利用した。
レセプターに結合されるモノクローナル抗体(mAb)の量は、以下の結合関係式:
式1: レセプター(A)+mAb(B)←→レセプター−mAb複合体(AB)
から推定可能である。
式6:
[B]=F*Kd/(1−F)
が得られる。式中、[B]は、mAbこの場合はOX40mAb24の濃度に等しい。この式(式6)を用いて20、50、及び90%レセプター占有率(F=0.20、0.50、又は0.90)に必要とされるOX40mAb24の濃度を細胞結合実験から計算し、この濃度から以上に記載の一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を用いてKd値を計算した。
Graphpad Prismソフトウェアで95%の信頼水準の対応のないスチューデントの両側t検定及び異なる標準偏差を含むデータセットを補正するウェルチ補正を利用し、OX40発現ジャーカットT細胞と対比して活性化一次ヒトCD4T細胞上のOX40へのOX40mAb24結合で決定された見掛けのKd値間又は見掛けのレセプター占有率値間の統計学的有意差を決定した。記述統計量(すなわち、平均値及び平均値の標準誤差)は、まとめた図及び表に示される。
2.6.1 一次ヒトCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
6つの独立したT細胞ドナーを用いたn=6の結合アッセイにおいて、OX40mAb24は活性化ヒトCD4+T細胞に結合し、見掛けのKdの平均は312pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、78.1、312、及び2810pMであった(図2A及び2B並びに表2−2)。
OX40mAb24はOX40発現ジャーカットT細胞に結合し、平均Kdは424pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、106、424、及び3820pMであった。図3A〜C及び表2−3。活性化一次ヒトCD4+T細胞及びOX40過剰発現ジャーカットT細胞により発現されるOX40へのOX40mAb24の見掛けの結合親和性又はレセプター占有率には統計学的有意差はなかった(p=0.59)。
OX40mAb24及び9B12はいずれも、活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。市販の抗マウスOX40抗体及び抗ラットOX40抗体、それぞれ、クローンOX86及びOX40では、活性化マウスCD4+T細胞及び活性化ラットCD4+T細胞の陽性染色が観察された。9B12は活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。
OX40mAb24は、581pMの平均Kdで活性化カニクイザル細胞に結合した。カニクイザルKdは、ヒトKdの1.9倍であった(表2−4)。
この実施例では、NGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、及びHVEM(TNFRSF14)を含む関連アミノ酸配列を有する他のヒトTNFRSFメンバーと対比してヒトOX40へのOX40mAb24の特異性を決定するために、フローサイトメトリーベースの細胞結合アッセイを行った。そのほかに、組換えヒトTNFRSFメンバーへのOX40mAb24の結合特異性をELISA方式で試験した。このメンバーには、以上に挙げたもののほか、DR6(TNFRSF21)、オステオプロテゲリン(OPG、TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、及びCD40(TNFRSF5)が含まれる。
この試験で使用した材料を表3−1に列挙する。
3.2.1 ヒトOX40に近い配列相同性を有するタンパク質の検索
ヒトOX40とのアミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質を同定するために、OX40のタンパク質配列(CCDS11/UniProt P43489)を用いて、タンパク質配列相同性のBasic Local Alignment Search Tool(BLASTP)検索を行った。19種のTNFRSFファミリーメンバー/アイソフォームを同定した。CCDS及びUniProtデータベース(www.uniprot.org)の両方を用いて、これらのタンパク質の全長配列を検証した。Clone Managerバージョン9ソフトウェアでblosum62スコア行列を用いてヒトOX40参照に対する集合アライメントを行うことにより、ヒトOX40とBLASTP検索で同定されたタンパク質との間のアミノ酸同一性のパーセントを決定した(表3−2)。
哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときに個別のTNFRSFメンバーの発現を誘導可能なcDNA構築物をOrigene Technologies,Rockville,MDから入手した。一過性トランスフェクションに使用するために、Protein Sciences group,MedImmune,Gaithersburg,MDによりこれらのcDNA構築物の増幅及び精製を行った。TNFRSFメンバーをそれぞれ個別に発現させるために、Lipofectamine 2000に対する製造業者の推奨プロトコルに従って、TNFRSFメンバーの1つをコードする発現ベクターの0.5μgのDNAと組み合わせてLipofectamine 2000(Life Technologies,Carlsbad,CA)を用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、トリプシン処理により組織培養プレートから細胞を取り出した。血清含有完全培地RPMI−1640+10%FBSの添加、それに続くに細胞のペレット化、及び完全培地による洗浄を行って、トリプシンを中和した。次いで、細胞を冷FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に懸濁させ、96ウェル非組織培養物処理プレートにプレーティングし、TNFRSFメンバー特異的mAb(表3−3)及びOX40mAb24を用いた結合試験に供した。
FlowJoソフトウェア(Ashland,OR)を用いてフローサイトメトリー標準(FCS)データを検査した。mAb結合を解析するために、最初に、細胞を生存(PI陰性)細胞に関してゲート処理し、次いで、イベントの全数に対してイベントの平均蛍光強度(MFI)をプロットして結合ヒストグラムを作成した。バックグラウンド(アイソタイプ対照又は二次抗体単独)に対するMFI倍率を決定できるように、各サンプルについてすべての生存細胞の幾何MFIを決定した。
ストックタンパク質をPBSで5μg/mLに希釈した後、8点で各組換えヒトTNFRSFタンパク質の二倍希釈系列を調製した。続いて、50μLの各抗原希釈液をデュープリケートでNunc96ウェルMaxiSorp平底プレートのウェルに導入し、4℃で一晩インキュベートしてタンパク質をプレートに吸着させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーによりプレートをPBSで3回洗浄して未結合タンパク質を除去した。抗OX40mAb29、9B12、及び対照抗体をPBSで10μg/mLの最終濃度に希釈して50μLのmAbを各ウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートしてmAbをプレート結合タンパク質に結合させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーを用いてウェルをPBS/0.1%Tween−20(体積/体積)で洗浄した。HRPコンジュゲートのヤギ抗ヒト二次抗体又はヤギ抗マウス二次抗体を10μg/mLで各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1%Tween−20で3回洗浄した後、各ウェルに50μLのTMB基質を添加し、そして室温で5分間インキュベートして比色生成物を形成した。50μLの0.5モルH2SO4をウェルに添加することにより反応を停止させ、その直後、比色生成物を検出するためにEnvision Cプレートリーダーを用いて450nmでプレートを読み取った。Windows用ソフトウェアGraphPad Prismバージョン5.01で結果をグラフで示し、単一部位結合に対する非線形回帰分析を用いて結合曲線を作成した。
ヒトOX40に関するタンパク質配列相同性BLASTP検索により、全長OX40配列に対して15〜27%のアミノ酸配列同一性を共有する19種のヒトTNFRSFタンパク質又はアイソフォームを同定した。タンパク質及びその配列同一性パーセントを表3−2に列挙する。
ヒトOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合は特異的であり、関連性の高いTNFRSFタンパク質と交差反応しない。
この実施例では、プレートベースのヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出アッセイを用いて、CD3/T細胞レセプター(TCR)複合体を介する活性化と組み合わせてT細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を評価した。CD3/TCRシグナル伝達の不在下で可溶性OX40mAb24及びプレート結合OX40mAb24の活性を調べたのと同様に、可溶性OX40mAb24の活性も調べた。
この試験で使用した材料を表4−1に列挙する。
4.2.1 OX40mAb24のプレート固定化バイオ活性
プレートベースの薬剤捕捉アッセイでヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン産生を測定することによりOX40mAb24のバイオ活性を決定した(図6)。
4つのドナーのそれぞれからの増殖データ及び1つのドナーからのサイトカイン放出データを図7A〜C及び図8A〜Eに示し、ヒト一次CD4+T細胞増殖のEC20、EC50、及びEC90の効力値を表4−2に示し、ヒト一次CD4+T細胞サイトカイン放出アッセイの効力値を表4−3〜表4−7に示し、OX40mAb24及び9B12の平均増殖値及びサイトカイン放出値を表4−8及び表4−9に示す。
OX40mAb24は、ヒト化に用いられた抗体9B12と同じように濃度依存的に一次ヒトCD4+T細胞の増殖及びサイトカイン放出を誘導した(図8A〜E及び図9A〜E)。OX40mAb24は、プレート結合タンパク質として活性を示したが、可溶性タンパク質として活性を示さなかった。さらに、OX40mAb24活性は、CD3/TCRシグナル伝達と同時に生じた。
この実施例では、ヒトOX40を介してシグナル伝達するOX40mAb24及び9B12の能力を一セットの2細胞レポーターバイオ活性アッセイにより評価した。OX40共刺激を介するT細胞活性化の測定は、NFκBシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを生成するOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を用いて達成された(図10)。NFκBシグナル伝達は、OX40エンゲージメントの下流に行われることが報告されており、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関し得る(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。細胞溶解物にルシフェラーゼ基質を添加して反応生成物により発せられる光をルミノメーターにより測定することにより、ルシフェラーゼの量つまりT細胞活性化を測定した。様々なFcγレセプター補体を発現するように工学操作された細胞を用いて架橋されたOX40mAb24、さらには可溶性非FcγR架橋OX40mAb24のバイオ活性を測定した。
この試験で使用した材料を表5−1に列挙する。
5.2.1 一次ヒトCD45+細胞の単離
一次ヒトCD45+細胞をヒト腫瘍から単離した。腫瘍サンプルを輸送媒体から取り出し、無菌ペトリ皿に配置した。ハンク緩衝塩溶液を添加し、目視可能な壊死組織又はなんらかの正常組織を腫瘍サンプルから切除した。組織を小片(約1mm)にミンスし、50mLコニカルチューブに配置し、コラゲナーゼIII酵素ミックス(250IU/mLコラゲナーゼIII、3mM CaCl2、315μg/mL DNAアーゼ1)を添加し、混合し、そしてインキュベートした。消化サンプルを70ミクロンフィルターに通して濾過し、MACS緩衝液で洗浄した。解離細胞をペレット化し、ViCellカウンターを用いて細胞数及び生存能は決定した。細胞をCD45マイクロビーズと共にMACS緩衝液中に懸濁させ、そして氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、MACS緩衝液中に再懸濁させ、LSカラムを用いたCD45+細胞のポジティブ選択に供した。マグネットからカラムを取り出してMACS緩衝液をカラムに添加することにより、ビーズ結合CD45+細胞を溶出させた。細胞をペレット化し、完全RPMI培地中に再懸濁させ、そして以上に記載のバイオ活性アッセイで使用した。
2細胞バイオ活性アッセイを用いてOX40mAb24及び9B12のバイオ活性を試験した。ヒトOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポータークローン64(OX40ジャーカットレポーター)を用いてOX40アゴニズム(NFκB活性)を測定した。第2のFcγR発現細胞系を用いてOX40mAb24架橋を媒介した。この架橋は、OX40ジャーカットレポーター細胞上のOX40をクラスター化及び活性化する(図10)。架橋に使用したFcγR発現細胞系は、RajiヒトB細胞リンパ腫系、CD32A発現HEK293、CD32B発現HEK293、又は一次ヒト腫瘍から単離されたCD45+免疫細胞を含んでいた。
OX40mAb24及び対照抗体のバイオ活性の結果を図11A〜D、図12A〜D、及び表5−2に示す。
OX40mAb24及び9B12は、OX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系でFκB経路の刺激により測定したときにヒトT細胞の活性化を媒介する。OX40mAb24のFcドメインを介して架橋可能なFcγRsを発現する細胞の不在下では、最小のレポーター細胞系活性が測定された。しかしながら、mAbを架橋可能なFcγRを発現する細胞と、T細胞活性化のリードアウトのためのジャーカット過剰発現NFκBルシフェラーゼレポーター系と、を含む2細胞システムでは、OX40mAb24及び9B12は、それぞれ、751pM及び2530pMの平均EC50値で強力なOX40活性化を媒介した。従って、2細胞アッセイシステムでのOX40mAb24のバイオ活性は、9B12に類似していた。
この実施例では、Fcエフェクター機能を惹起するOX40mAb24の能力、すなわち、高レベルのOX40を発現する一次ヒトCD4+T細胞に対してヒトナチュラルキラー(NK)細胞媒介抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を惹起するOX40mAb24の能力、又は補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件としてC1qに結合するOX40mAb24の能力に関して、評価した。ヒトIgG4P Fcドメインを含有するOX40mAb24の形態(mAb28)又はIgG1 FcドメインにFcγRIIIa結合を低減する三重突然変異を含有するOX40mAb24の形態(mAb29)を利用して、ADCC活性を媒介するOX40mAb24 IgG1 Fcドメインの寄与を評価した。また、OX40mAb24のエフェクター機能と、OX40mAb24を形成するためにヒト化されたマウス抗ヒトOX40 IgG1モノクローナル抗体9B12と、を比較した。抗CD20抗体リツキシマブは、CD20を発現するB細胞に結合するので、陽性対照としてADCC実験に使用した。一次活性化ヒトCD4+T細胞はCD20を発現しないので、ADCCアッセイシステムで使用されるNK細胞の活性を検証するために、CD20を発現するToledo B細胞系を用いた独立したアッセイを行った。
この試験で使用した材料を表7−1に列挙する。
6.2.1 抗体依存性細胞傷害性
エフェクターとして富化一次ヒトNK細胞及び標的としてOX40発現一次ヒトCD4+T細胞を用いて、9B12と対比して及びIgG4P Fcドメイン又は三重突然変異体(TM)ヒトIgG1 Fcドメインのいずれかと共にOX40mAb24のFabアームを含有するモノクローナル抗体と対比して、OX40mAb24のADCC活性を試験した。陽性対照として、Toledo B細胞系のリツキシマブ指向性死滅を用いて各NK細胞調製物の活性を試験した。
ProteOn XPR36装置を用いて表面プラズモン共鳴により、OX40mAb24又は9B12に対してプールヒト血清から精製されたヒト補体タンパク質C1qへのOX40mAb24又は9B12の結合を決定した。標準的なアミンカップリングを用いてGLCバイオセンサーチップの表面にOX40mAb24又は9B12を固定した。ヒトC1qを26nM〜1.6nMの範囲内の5つの濃度でPBS/0.005%Tween20、pH7.4中に懸濁させた。サンプルを30μL/minで200秒間注入し、続いて600秒間の解離段階を設けた。1:1フィッティングを用いてProteOn Manager 2.1ソフトウェア(Bio−Rad)によりセンサーグラムデータを処理した。
NK細胞及びOX40発現標的細胞の同種異系及び自己由来の両方の混合物を用いて、OX40結合の飽和しレベル(10μg/mL[67nM])(実施例2参照)で、ADCCを媒介するOX40mAb24、9B12、並びにOX40mAb24のヒトIgG4P型(mAb28)及びIgG1−TM型(mAb29)の能力を試験した(図13A及び図14A)。OX40mAb24は、活性化ヒトCD4+T細胞に対する測定可能なADCC活性を示した。これとは対照的に、9B12、mAb28、及びmAb29は、陰性対照のADCC活性を超える活性を示さなかった。ヒトCD20に対する陽性対照抗体(リツキシマブ)は、同一のNK細胞を用いてADCC活性を示したことから、NK細胞はすべて、ロバストなADCC活性が可能であることが示される(図13B及び図14B)。
OX40mAb24は、C1qに結合し、活性化CD4+T細胞に対するNK媒介ADCCを惹起する。
この実施例では、カニクイザル(cyno)/アカゲザルOX40を発現するジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を含む2細胞レポーターバイオ活性アッセイを用いて、T細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を調べた。Fcγレセプター媒介薬剤架橋は、アカゲザルB細胞系又は赤血球溶解後全血サンプル中のアカゲザルFcγレセプター発現細胞により媒介された。OX40活性化は、一次ヒトT細胞活性化の下流のNFκBシグナル伝達経路の刺激に反応して増加するルシフェラーゼ活性として測定した。NFκBシグナル伝達は、十分に研究されているOX40シグナル伝達の下流イベントであり、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関がある(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。そのほかに、CD4+T細胞増殖が評価されるプレートベースのバイオ活性アッセイを用いて、アカゲザルT細胞のT細胞レセプター媒介活性化(共刺激)を増強するOX40mAb24の能力を試験した。アイソタイプ対照(NIP228 IgG1)を用いて特異的OX40エンゲージメントを示した。
この試験で使用した材料を表7.1に列挙する。
7.2.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
2細胞レポーターアッセイを用いてOX40mAb24をバイオ活性に関して試験した。カニクイザル及びアカゲザルは同一のOX40アミノ酸配列を共有するので、OX40アゴニズム(NFκB活性)のリードアウト用としてカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系(クローンB2)を使用した。ジャーカットレポーター細胞上のOX40mAb24架橋つまりOX40クラスタリングを媒介するために、FcγR発現細胞を含有する正常アカゲザルの全血に由来するFcγレセプター発現アカゲザルB細胞系、LCL8664、又は白血球を使用した。OX40mAb24を添加しない場合さらにはFcγR発現細胞の不在下の場合の両方でバックグラウンドバイオ活性を評価した。レポーター細胞上のOX40エンゲージメントの役割を示すために、OX40mAb24の代わりにアイソタイプ対照を使用した。
次のプロトコルに従って、活性化一次アカゲザルCD4+T細胞及びプレート捕捉薬剤を用いて、CD4+T細胞増殖アッセイでOX40mAb24のバイオ活性を決定した。世界的霊長動物の健常アカゲザル(n=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から単離されたアカゲザルCD4+T細胞を反応細胞源として使用した。
7.3.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイの結果を表7−2、図19A〜B、図20A〜B及び図21A〜Bに示す。OX40mAb24は、1450pMの平均EC50(n=2実験)を有して、アカゲザルB細胞系LCL8664の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞でNFκBシグナル伝達により測定されるようにOX40シグナル伝達経路を活性化した。表7−2に示されるように、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイでのOX40mAb24活性のEC50値は、Raji B細胞系を用いたヒト2細胞アッセイでの値の1.3倍であり、一方、9B12は、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイで限られた活性を有し、EC50値を決定できなかった。
アカゲザル一次T細胞増殖アッセイの結果を表7−3、表7−4、及び図22A〜Dに示す。OX40mAb24は、436pMの平均EC50を有して一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した(表7−3、n=2実験)。表7−5に示されるように、9B12のEC50値は110pMであった(表7−4、n=2実験)。OX40mAb24は、類似のアッセイ方式で28pMの平均EC50を有して活性化一次ヒトCD4+T細胞の増殖を誘導した((表7−5、実施例4のデータ)。
OX40mAb24は、アカゲザルB細胞又はRBC溶解アカゲザル全血内に含有されるFcγレセプター発現細胞の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞NFκBレポーター細胞系でOX40シグナル伝達経路を活性化した。そのほかに、OX40mAb24は一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した。
この実施例は、OX40mAb24が癌を治療するための単一作用剤療法として有効であるかを決定するために設計された。この試験は、免疫無防備非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスにおいてアロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌の異種移植モデルで行われた。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表8−1に列挙する。
8.2.1 試験動物
5〜9週齢の雌NOD/SCIDマウスをHarlan Laboratories,Inc.から入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Iristithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して毎週モニターした。
ヒト黒色腫細胞系に由来するヒト癌性A375細胞はATCCから入手した。細胞は、5%CO2下37℃の加湿インキュベーター内で10%FCSを有するDMEM中に成長させた。次いで、それを採取し、PBSで1回洗浄し、次いで、PBS中に再懸濁させた。
細胞のSC注射前に6匹の動物を各実験群にランダムに帰属した。動物の入替えはしなかった。各実験に対する群指定及び用量レベルを表8−2、表8−3及び表8−4に列挙する。試験抗体及び対照抗体はPBSで適切な濃度に希釈し、200μLの全体積で腹腔内(IP)投与した。試験抗体及び対照抗体の初回用量は、癌/エフェクターT細胞の移植後3日目又は4日目に投与した。動物は、図に示される通り及び対応する図の説明に示される通りさらに3回まで試験抗体及び対照抗体の投与を受けた。各動物で腫瘍の形成が週1回又は2回観察された。この試験の主要エンドポイントは、2000mm3の腫瘍体積又は全体的腫瘍壊死のいずれかであった。
各実験に対する図及び表に示される間隔でカリパスにより腫瘍を測定し、次式:
V(mm3)=(長さ[mm]×幅[mm]×[幅mm])/2
により腫瘍体積(V)を計算した。
各群に対して結果を算術平均で報告する。抗腫瘍効果は、腫瘍成長阻害パーセント(%TGI)で表した。これは次のように計算した。
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V])×100
OX40mAb24治療動物又は9B12治療動物とアイソタイプ対照治療動物との間で比較を行って、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性で群間差を解析した。
この試験ではヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍の成長に対するOX40mAb24の活性を調べた。ヒト癌細胞系をアロ反応性ヒトCD4+及びCD8+T細胞系と混合して免疫不全NOD/SCID雌動物に移植した。CD4+及びCD8+T細胞は、健常ヒトドナーから単離されたPBMCに由来するものであった。異種移植の3日後又は4日後に動物に試験抗体及び対照抗体の最初の投与を行い、適応があれば試験抗体及び対照抗体の追加投与を行った。
OX40mAb24は、アロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。OX40mAb24の抗腫瘍活性は、9B12の抗腫瘍活性に類似していた。これらの結果は、OX40mAb24がT細胞浸潤物を有する癌の患者の治療に単一作用剤療法として有効であり得ることを示す証拠となる。
OX40mAb24は、マウス(m)OX40に交差反応しない(実施例2参照)。従って、免疫能のあるマウスモデルにおいてその活性を試験することはできない。OX86は、mOX40に特異的に結合してそのシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al.,Eur.J.Immunol.26:1695−1699(1996))、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg AD,et al.,J.Immunol.164:2160−2169(2000))。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、ラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体(OX86mIgG2a、ラット抗OX40軽鎖及び重鎖の可変領域とマウスIgG2a定常領域とを有する)をOX86から作製した。この実施例では、癌の3つのマウスモデルにおいてOX86mIgG2aの単一作用剤抗腫瘍活性を評価する。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表9−1に列挙する。
9.2.1 試験動物
6〜8週齢のBALB/c及びC57BL/6マウスをMedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN)で入手し、試験開始前の3日間にわたり気候順化を行った。その後、マウスの腫瘍移植部位を剃毛し、同定のためにマイクロチップトランスポンダーと共に移植した。
CT26及び4T1は、Manassas,VAのATCCから入手した。MCA205細胞は、Providence Cancer Center,Portland,ORから入手した。細胞はすべて、10%FBSが追加されたRPMI1640細胞培養培地で培養し、37℃、5%CO2の加湿組織培養チャンバー内で成長させ、次いで採取し、FBSで1回洗浄し、次いでPBS中に再懸濁させた。
この試験ではBALB/c(合計216匹)及びC57BL/6(合計70匹)雌マウスを使用した。CT26腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3/コホートに成長した後(移植の9日後)又は200mm3/コホートに成長した後(移植の13日後)はランダムに帰属した。4T1腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3に成長した後(移植の13日後)にランダムに帰属した。C57BL/6マウスは、腫瘍が平均体積95mm3/コホートに成長した後(移植の11日後)にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表9−2、表9−3、表9−4及び表9−5に示す。試験抗体及び対照抗体はすべて、腹腔内(IP)注射により投与した。動物の入替えはしなかった。
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
%TGI=(1−[治療群の平均V]÷[対照群の平均V]×100)
測定可能な腫瘍がなかった場合、腫瘍成長反応は完全反応(CR)として分類した。
一元配置ANOVAを用いて平均腫瘍体積差を決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮して腫瘍体積にlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。
OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又は陰性又はアイソタイプの対照抗体で治療されたマウス対照と比較してCT26及びMCA205の腫瘍細胞の成長の有意な低減をもたらす(表9−6、表9−7、及び表9−8;図26A、図27A及び図28A)。OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又はアイソタイプの対照抗体と比較して4T1腫瘍細胞の成長の遅延又は低減をもたらす(表9−9及び図29A)。
腫瘍を有するマウスにOX86mIgG2aにより単一作用剤治療を施すと、未治療、陰性、及び/又はアイソタイプの対照治療群と比較して、多発性腫瘍の成長を有意に低減する抗腫瘍活性がもたらされる。
この実施例では、一連のヒト/マウスOX40キメラ変異体を用いてOX40mAb24のエピトープを調べる。
OX40mAb24は、ヒトOX40(配列番号91)に特異的に結合し、アミノ酸(aa)配列が60%の同一性を共有するにもかかわらずマウスOX40(配列番号92)を認識しない(図30)。ヒトOX40とマウスOX40との間で細胞外ドメインの一部を交換するように工学操作してヒト/マウスキメラOX40変異体を作製した。オーバーラップ伸長PCRでヒト及びマウスOX40のcDNA構築物を鋳型として用いて、組換えタンパク質の細胞表面発現のために膜貫通ドメインを有するキメラ変異体を構築した。OX40は、3つの完全システインリッチドメイン(CRD)及び1つのトランケートシステインリッチドメインを有する約45kDaのタンパク質である。構造はTNFRスーパーファミリーに特有である。
・ ・CRD1(ヒトOX40 aa29〜65をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD2(ヒトOX40 aa66〜107をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD4の+リンカー(ヒトOX40 aa147〜214をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3+4(ヒトOX40 aa108〜167をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・A111(ヒトOX40 aaアラニン111をマウスのカウンターパートのプロリンで置き換えた)、
・ ・L116(ヒトOX40 aaロイシン116をマウスのカウンターパートのグルタミンで置き換えた)、
・ ・P121(ヒトOX40 aaプロリン121をマウスのカウンターパートのロイシンで置き換えた)、
・ ・A126(ヒトOX40 aaアラニン126をマウスのカウンターパートのバリンで置き換えた)、
・ ・D137(ヒトOX40 aaアスパラギン酸137をマウスのカウンターパートのアスパラギンで置き換えた)、
・ ・A111P121D137(ヒトOX40 aa Ala111、Pro121、及びAsp137をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・L116A126(ヒトOX40 aa Leu116及びAla126をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
並びに
・ ・D117S118(ヒトOX40の aa Asp117及びSer118をAla突然変異で置き換えた)。
・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146を対応するマウス領域にグラフトした)、
・A111(ヒトOX40 aaアラニン111を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116(ヒトOX40 aaロイシン116を対応するマウス位置にグラフトした)、
・A126(ヒトOX40 aaアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116A126(ヒトOX40 aaロイシン116及びアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)。
トランスフェクションの48時間後、1μg/mLのOX40mAb24を含むPBS中、氷上でHEK293F細胞を1時間インキュベートした。結合されたOX40mAb24をフローサイトメトリーにより検出するために、細胞を冷PBSで3回洗浄し、1μg/mLのAlexa480コンジュゲート抗ヒトIgG抗体と共に氷上で1時間インキュベートし、次いでLSRIIフローサイトメーターを用いて解析した。
キメラヒト/マウス変異体を用いてOX40mAb24のエピトープの特徴付けを行った。ヒトOX40及びマウスOX40は、aa配列が60%の同一性を共有する(図30)。とはいえ、OX40mAb24は、ヒトOX40に特異的に結合するがマウスOX40を認識しない。この特異性を利用してOX40mAb24のエピトープを同定した。マウスOX40の細胞外ドメインの様々なドメインをヒトOX40中に(KO/機能喪失変異体)又はヒトOX40の様々なドメインをマウスOX40中に(KI/機能獲得変異体)スワップイン又はスワップアウトすることにより18種のキメラ変異体を構築した(図31)。変異体はすべて、キメラタンパク質の細胞表面発現用の膜貫通ドメインをコードしていた。これらの変異体へのOX40mAb24の結合特性をフローサイトメトリーにより解析した。
きわめて重要な残基Leu116及びAla126を含めてヒト/マウスキメラ変異体を用いてエピトープOX40mAb24をヒトOX40のCRD3ドメインにマッピングした。OX40mAb24及びその親9B12との間ですべての変異体への結合プロファイルが同一であることから、それらはヒトOX40上の同一のエピトープを認識することが示唆される。
OX86は、MOX40に特異的に結合してMOX40のシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al,1996)、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg et al,2000)。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、この実施例では実施例9に記載のラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体OX86を利用する。しかしながら、種間でいくつかの類似点を導くことは可能である。例えば、mIgG2a及びヒトIgG1は、多くの場合、機能的に等価であるとみなされる。なぜなら、両方のアイソタイプが複数のFcγレセプターに結合可能であり、高親和性Fcγレセプター結合が可能であり、ADCCを惹起することが可能であり、しかも補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件であるヒトC1qへの結合を行うからである(Stewart et al.2014、Dall’Acqua et al,2006))。OX86mIGg2aはマウスOX40に結合するので(実施例9参照)、サロゲートマウスOX40アゴニスト抗体としてOX40mAb24に使用した。
11.1.1 動物の受領及び同定
6〜8週齢の野生型Fcgr2b−/−又はFcer1g−/−BALB/c、及びFcgr2b−/−又はFcer1g−/−C57BL/6マウスは、MedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN又はCharles River Laboratories(UK))で受領し、試験開始前に15日間以下で気候順化させた。その後、個別のマウスを同定するためにマウスにマイクロチップトランスポンダーを移植した。
動物は、Laboratory Animal Resources facility(USA)and Biological Sciences Unit(UK)at MedImmune,an Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Institutional Animal Care and Use Committee(USA)and Home Office(UK)により認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水(USA)又は上水(UK)を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃(USA)又は21℃±1℃(UK)、相対湿度:50%±10%(USA)又は55±10%(UK)、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、20%体重損失、又は2000mm3超の腫瘍体積が認められた場合、動物は頸椎脱臼又はCO2窒息により人道的にただちに屠殺した。
CT26細胞系(マウス結腸癌)はATCC,Manassas,VAから入手し、細胞系MCA205(化学誘導マウス軟組織肉腫)はProvidence Cancer Center,Portland,ORから入手した。両方の細胞系を37℃、5%CO2でRPMI1640培地+10%FBS中に維持した。
この試験では野生型(n=70)、Fcgr2b−/−(n=36)、又はFcer1g−/−(n=36)BALB/c、及びFcgr2b−/−(n=36)又はFcer1g−/−C57BL/6雌マウス(n=36)を使用した。マウスはすべて、治療群にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表11−1、表11−2及び表11−3に示す。試験品及び対照品はすべて、腹腔内に投与した(IP)。動物の入替えはしなかった。
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V]×100)
11.1.6.1 フローサイトメトリー解析のためのマウス血液細胞の調製
赤血球溶解(RBCL)緩衝液(2mL)を血液(50μL)に添加し、5分間インキュベートした。インライフ採血から得られた体積は、20μL〜50μLの範囲内であった。最終採血は50μLであった。RPMI+10%ウシ胎仔血清(FBS)(8mL)を各サンプルに添加した。各サンプルの細胞をペレット化し(300×g、5min)次いで0.3mLのフロー緩衝液中で再懸濁させた。細胞懸濁液(200μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加して蛍光抗体による染色に供した。非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ染色対照、及び蛍光マイナスオン(FMO)抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
脾臓を10mLのRPMI+1Pen/Strep溶液中に配置し、40μm細胞ストレーナーに通した。サンプルをペレット化し(300×g、5min)、次いで1mLのRBCL緩衝液中に3分間再懸濁させた。RPMI+FBS10%(9mL)を各サンプルに添加した。細胞懸濁液をペレット化し、1mLのフロー緩衝液中に再懸濁させた(300×g、5min)。細胞懸濁液(100μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加し、蛍光抗体による染色に供した。プール基サンプルは使用された、非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ対照、及びFMO抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
結合組織又は皮膚を採取しないように注意して安楽死マウスから無菌状態で腫瘍を摘出し、6ウェルディッシュ中のハンクス平衡塩溶液で希釈されたコラゲナーゼ中に配置した。酵素消化プロセスの効率を向上させるために、各腫瘍は、スカルペル又は小さな鋭いハサミを用いてより小さな小片にミンスした。ミンスされた腫瘍を15mLコニカルチューブ中に導入し、振盪プラットフォーム上に配置して37℃で20〜30分間インキュベートした。コラゲナーゼを脱活性化させて免疫細胞の生存能を維持するために5mLのRPMI+10%FBSを各サンプルに添加した。サンプルを70μM細胞ストレーナーに通して、50mLコニカルチューブ中に配置した。各サンプルのアリコートをカウントのために取り出した。残りのサンプルを330×gの遠心分離機でペレット化し、1×107細胞/mLの濃度でFACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に再懸濁させた。
11.1.7.1 腫瘍のないマウス由来の組織の解析
血液又は脾臓細胞の単細胞浮遊液をペレット化し(300×g、5min)、50μLのFcブロック溶液(1:50)中に再懸濁させ、eBiosciences Flow Bufferで希釈し、氷上で10分間インキュベートした。50マイクロリットルの蛍光標識抗体(2×ストック溶液)を各サンプルに添加した(最終体積100μL)。単一抗体染色溶液(細胞外)を1μL/ウェルで添加し、細胞/抗体混合物を氷上で30分間インキュベートした。細胞をペレット化し(300×g、5min)、2回洗浄し(200μLフロー緩衝液/ウェル、300×g、5min)、50μLのFix/Penn緩衝液(3部の希釈液に対して1部の濃縮物)、次いで、4℃の暗所で一晩インキュベートした。
11.1.7.2.1 細胞表面染色
ペレット化細胞の各サンプルをFACS緩衝液中に再懸濁させた。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA)で解析した。
ペレット化細胞の各サンプルを、生存/非生存細胞の識別のための蛍光固定青色染料の50μLの1:500希釈液中に再懸濁させ、4℃の暗所で15分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、Fcブロックを含有する30μLのPBS+4%正常マウス血清中に再懸濁させ、室温で15分間インキュベートした。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、新たに調製された150μLのFoxP3 Fix/Penn作用液中に再懸濁させ、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で2回洗浄し、抗体を含有する100μLの1×透過化緩衝液中に再懸濁させて細胞内抗原を染色し、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で1回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターで解析した。
一元配置ANOVAを用いてKi67+又はICOS+細胞の平均腫瘍体積差及び平均パーセントを決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮してlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。線形回帰分析にGraphPad Prism 6.0を利用することにより、XからYの最良予測が行われた最良当てはめ線、線の統計的有意水準、及び決定された最良当てはめ線の適合度(r2)を得た。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表11−4及び表11−5に列挙する。
抗OX40抗体OX86マウスIgG2a(OX86 mIgG2a)でナイーブマウスの腹腔内治療を行ったところ、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のKi67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な用量依存性且つ一過性の増加が経時的に得られた(図33A及びC)。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞の最大パーセントは10日目に検出された。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な増加は、対照品で治療されたマウスと比較して、OX86mIgG2aの投与後の10日目のマウスの脾臓中で測定した(図33B及びD)。Ki67+CD4+T細胞のパーセントとICOS+CD4+T細胞のパーセントとの間の統計的に有意な強い相関は、10日目の血液及び脾臓は同定された(図34A及び34B)。
ナイーブマウスにおける単回用量のOX86mIgG2aは、ICOS及びKi67の発現の増加により測定したとき、それぞれT細胞活性化及び増殖の一過性の増加を誘導した。CD4+及びCD8+T細胞上のICOS及びKi67のパーセントの有意な直線相関が見いだされた。CT26及びMCA205の腫瘍の成長の阻害として測定されるOX86mIgG2aの抗腫瘍活性は、阻害FcγレセプターIIBではなく活性化FcγレセプターI、III、及びIVの発現に依存した。活性化Fcγレセプターを発現する腫瘍を有するマウスにおける並行薬力学的実験では、末梢血、流入領域リンパ節、及び/又は脾臓のT細胞増殖の増加(Ki67)が観測され、阻害Fcγレセプターのみを発現するマウスにおいて、いくつかのT細胞増殖が観察された。理論により拘束されることを望むものではないが、ナイーブマウスからの薬力学的結果と合わせると、OX86mIgG2a抗腫瘍活性の可能性のある機構は、末梢及び腫瘍内のT細胞増殖(Ki67)である。さらに、OX86mIgG2aのin vivo抗腫瘍活性はFcγレセプターの活性化の発現時に生じる。
この実施例では、再構成ヒト免疫系を有する免疫無防備マウスにおいてOX40mAb24がヒトCD4+及びCD8+記憶T細胞を活性化し増大し得るか又はヒトTregを低減し得るかを調べる。薬剤がヒトT細胞に対して免疫調節作用を有するか決定するために、ヒト免疫細胞で再構成されたin vivoマウスモデルシステムにおいてOX40mAb24を試験した。
12.1.1 試験動物
Nod.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウス(n=14、23〜26週齢)をJackson Laboratoryから入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及びUnited States Department of Agricultureの許可を得た施設で、Instithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、試験期間中、有害な臨床徴候に関して毎日モニターした。
12.1.2.1 ヒトHSC移植マウスの確立
ヒトCD34+HSC移植マウスをJackson Laboratoryから入手した。次のようにマウスを作製した。複数の臍帯血ドナー由来のプールヒトCD34+細胞を単離し、Nod.Cg−Prkdcscid112rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウスのテール静脈に静脈内注射した。移植の12週間後、マウス末梢血をサンプリングし、Pharm Lyse赤血球溶解緩衝液で溶解し、次いで、ヒトCD45、CD19、及びCD3陽性細胞に関してフローサイトメトリーにより解析し、マウスにおけるヒト免疫細胞移植の程度を決定した。続いて、全生存可能血液細胞のうち25%以上のCD45+ヒト免疫細胞がうまく移植されたマウスをMedImmuneに輸送した。
ヒトCD34細胞の注射の22週間後にフローサイトメトリーによりNSGマウスへのヒト免疫細胞の持続的移植を確認し、23週間後に未治療状態又は治療された状態の3群のマウスに分けた(表12−1)。実験開始の22週前に最終的治療群間のヒトCD45+細胞移植の平均パーセントに統計学的有意差はなかった。群1は4匹のマウスからなり、皮下(SC)キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)免疫化も抗体投与も受けなかった。群2は5匹のマウスからなり、2つの独立した注射SC部位で300μg/50μLのKLH及び50μLの完全フロイントアジュバント(CFA)の投与を受けた。この群のマウスはまた、KLH免疫化の1日後、腹腔内(IP)に2mg/kgのhIgG1アイソタイプ対照抗体の投与を受けた。群3は5匹のマウスからなり、以上に記載のKLH/CFA SC免疫化を受けた。そのほかに、マウスはまた、1日後に単回IP用量の2mg/kgのOX40mAb24の投与を受けた。KLH/CFA SC免疫化の当日、免疫化前(治療前)、及び7日後(治療後)、眼窩後方採血により全血を取得し、細胞の免疫表現型を調べ、フローサイトメトリーによりカウントした。
全血抗体結合プロトコルを用いてフローサイトメトリーにより細胞の免疫表現型を調べた。簡潔に述べると、一定体積のEDTA抗凝固処理全血をディープウェルプレートのウェルに添加し、T細胞染色マスターミックスを細胞に添加して細胞表面抗原に結合させた。FACS緩衝液(PBS、pH7.2+2%熱不活性化新生仔ウシ血清)で洗浄した後、1×RBC溶解緩衝液を用いて赤血球(RBC)を溶解し、EBiosciences Fix及びPerm kitを用いて製造業者のプロトコルに従って細胞の固定及び透過化を行った。続いて、抗FoxP3mAb及び抗Ki67mAbを細胞に結合させた。1×固定及び透過化緩衝液を用いて細胞を洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターを用いてイベントを解析した。生のフローサイトメトリー標準(FCS)データはFlowJoソフトウェアを用いて解析され、且つ細胞集団が、生存/死亡細胞の識別、及び二重線と細胞デブリの除去後に同定された。CD4+及びCD8+T細胞集団をゲート処理した後、CD45RA及びCCR7発現プロファイルにより記憶T細胞を決定した。ナイーブT細胞はCD45RA+/CCR7+として、エフェクターT細胞(Teff)はCD45RA+/CCR7−として、エフェクター記憶T細胞(Tem)はCD4SRA−/CCR7−として、及び中枢記憶T細胞(Tcm)はCD45RA−/CCR7+として定義した。TregはCD4+/FoxP3+細胞として定義した。
データのグラフ化及び統計解析のためにWindows用GraphPad Prismソフトウェア(バージョン6.03)を使用した。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表12−2に列挙する。
KLHによる免疫化の1日後にOX40mAb24又はhuIgG1対照抗体を投与した。OX40mAb24は、huIgG1アイソタイプ対照抗体が投与された群と比較して6日間後の末梢血中のTregのパーセントの統計的に有意な低減にもたらした(p=0.019、一元配置ANOVA、図43A及び43B)。治療群間のTregのパーセントの差は免疫化及び抗体投与の前に観察されなかった。
ヒト免疫細胞が移植されたマウスでは、抗原免疫化後のOX40mAb24による治療は、ヒトIgG1対照抗体の投与を受けたマウスと比較して末梢Treg細胞の減少をもたらした。同様に、Treg細胞に対する全エフェクター・記憶CD4+T細胞の比及びエフェクターCD8+T細胞の比もまた、huIgG1対照抗体の投与を受けたものと比較して、OX40mAb24の投与を受けたマウスの末梢血で増加した。最後に、細胞表面上にCD25を発現するCD8+T細胞のパーセントがOX40mAb24治療後に増加したことから、末梢CD8+T細胞活性化のOX40誘発が示唆される。
Claims (15)
- ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体であって、前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含み、前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、且つ前記抗体がヒトOX40に特異的に結合することができる、抗体。
- 重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体と担体とを含む組成物。
- 請求項1に記載の抗体をコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 抗体の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体が発現する条件下で請求項7に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体を回収するステップとを含む方法。
- 請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体を含む、対象の癌を治療するための組成物であって、
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含む、前記組成物。 - 前記癌が固形腫瘍である、請求項10に記載の組成物。
- 前記抗体又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、請求項10に記載の組成物。
- 腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、請求項12に記載の組成物。
- 前記抗体が、重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、請求項10に記載の組成物。
- 担体をさらに含む、請求項10に記載の組成物。
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