JP2022533957A - ＥｐＣＡＭ結合タンパク質および使用方法 - Google Patents

ＥｐＣＡＭ結合タンパク質および使用方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】ＥｐＣＡＭ結合タンパク質、そのようなタンパク質またはそのフラグメントを含む医薬組成物、ならびに、そのようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書で提供される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示されたＥｐＣＡＭ結合タンパク質を使用する方法も開示されている。【選択図】図２１Ｂ

Description

相互参照
本出願は、２０１９年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／８４７，７７８号、２０１９年５月１４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３０７号、２０１９年５月１４日に出願されたＰＣＴ出願第ＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２２２４号、２０１９年５月１４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／ＵＳ０３２３０２号、および、２０１９年５月１４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２３０６号の利益を主張し、上記文献は各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
引用による組み込み
この明細書で言及されるすべての公報、特許、および特許出願は、個々の公報、特許、または特許出願が、それぞれ、明確かつ個々に引用によって組み込まれると示されるのと同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
上皮細胞接着／活性化分子（ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３２６）は、基本的にすべてのヒト腺癌、特定の扁平上皮癌、網膜芽細胞腫、および肝細胞癌で発現していることが研究により示されている。例えば、Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ，Ｇｉｒｅｓ Ｏ．ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６） ｆｉｎｄｉｎｇ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．を参照。ＥｐＣＡＭは、多くの固形腫瘍中の癌増殖細胞、および正常な前駆細胞と幹細胞のシグネチャーの一部である。同文献参照。ＥｐＣＡＭは、例えば、乳癌などの癌において増殖、移動、シグナル伝達に因果関係があるとされてきた。例えば、Ｏｓｔａ ＷＡ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｍｉｋｈｉｔａｒｉａｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ． ＥｐＣＡＭ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：５８１８－２４．を参照。
抗ＥｐＣＡＭ抗体であるエドレコロマブは、第ＩＩＩ相試験で限られた有効性を示した。Ｅｙｖａｚｉ Ｓ，Ｆａｒａｊｎｉａ Ｓ，Ｄａｓｔｍａｌｃｈｉ Ｓ， Ｋａｎｉｐｏｕｒ Ｆ，Ｚａｒｒｅｄａｒ Ｈ，Ｂａｎｄｅｈｐｏｕｒ Ｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂａｓｅｄ ＥｐＣＡＭ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ Ｕｐｄａｔｅ． Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ２０１８；１８（９）：８５７－８６８．を参照。様々な臨床試験で使用されているその他の抗ＥｐＣＡＭ抗体としては、アデカツムマブ（完全ヒト型モノクローナル抗体）、カツマキソマブ（キメラ抗体）、オポルツズマブモナトキス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ Ｍｏｎａｔｏｘ）（シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ）とコンジュゲートしたｓｃＦｖ抗体）、シタツズマブ・ボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ Ｂｏｇａｔｏｘ）（ボウガニン毒素（ｂｏｕｇａｎｉｎ ｔｏｘｉｎ）とのＦａｂフラグメント））、イモノコンジュゲート抗体ツコツズマブ（ＩＬ２とのモノクローナル抗体）が挙げられる。同文献参照。
医師が個々の患者にとって最良の副作用プロファイルを有する治療を選択することを可能にする、治療オプションのより大きな選択肢が必要とされている。本開示は、治療方法、とりわけ、ＥｐＣＡＭの異常発現に関連する状態の治療に有用な新規ポリペプチドおよびタンパク質治療剤を提供する。
一実施形態では、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＥｐＣＡＭ結合ドメインを提供し、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは多特異性タンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質はＣＤ３結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は活性薬フォーマットを含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質はバルク血清タンパク質結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質は血清アルブミンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンタンパク質はヒト血清アルブミンタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質結合ドメインは、配列番号３７８に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３７９に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、配列番号４９２に記載の配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質結合ドメインは、リンカーを含む結合部分と、マスキング部分とを含み、ここで、マスキング部分は、それぞれの標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインまたはＣＤ３結合ドメインの結合をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は切断不可能なプロドラッグフォーマットを含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列、または配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０７、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０７、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質結合ドメインは、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、配列番号４９５、４９８－５０２、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、配列番号４９５および５０２からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、活性薬は、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または条件付きで活性化可能なキメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）の一部であり、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＰｒｏＣＡＲの一部であり、ＰｒｏＣＡＲは、（ａ）非ＣＤＲループと切断可能なリンカーを含む結合部分、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、結合部分は、その標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、結合部分は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲループは、バルク血清タンパク質に特異的な結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質は、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、五量体ＩｇＭのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質は血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、ＰｒｏＣＡＲは共刺激ドメインをさらに含み、ここで、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに、少なくとも１つであるが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されたタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つであるが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはコードされたＴ細胞受容体融合タンパク質に対するリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的フラグメント、ならびに、少なくとも１つであるが２０以下の修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されたタンパク質の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３アルファ、ＣＤ３ベータ、またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインはＰｒｏＣＡＲの一部であり、および、ＰｒｏＣＡＲは、配列番号４８５－４９１からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、またはＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
１つの実施形態は、単一のポリペプチド鎖を含む条件付きで活性なキメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）を提供し、上記キメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）は、（ａ）非ＣＤＲループおよび切断可能なリンカーを含む結合部分、（ｂ）ＥｐＣＡＭ結合ドメインであって、ここで、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、および、ＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、および、（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、結合部分は、その標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。
１つの実施形態は、非ＣＤＲループを含む結合部分（Ｍ）、切断可能なリンカー（Ｌ）、第１の標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）、および第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）を含んでいる条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質を提供し、第１の標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）および第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）の少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含み、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ここで、非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインに結合することができ、および、結合部分は、その標的に対する、ＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの結合をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、結合部分はマスキング部分を含み、ここで、マスキング部分は、配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列、または配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列に対して１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に対して１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）はＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体、または上記キメラ抗原受容体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、または上記ＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは単一のドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、約０．００１ｎＭ～約５００ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）でＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、ヒトＥｐＣＡＭ、マウスＥｐＣＡＭ、カニクイザルＥｐＣＡＭ、またはそれらの組み合わせに結合する。１つの実施形態は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質を提供し、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは本開示によるものである。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態において、請求項１－３および４９－５３のいずれか１つにかかるＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）、ＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）、およびアルブミン結合ドメイン（抗ＡＬＢドメイン）。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ドメインは、配列番号３７９または配列番号４７４に記載のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗ＡＬＢドメインは、配列番号３７５、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４８２、または配列番号４８３に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ配向にある。
１つの実施形態は、配列番号４９５、４９８－５０２、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８のうちのいずれか１つで記載される配列を含む多価タンパク質を提供する。１つの実施形態は、配列番号４９４、５７１、および５７４のうちのいずれか１つで記載される配列を含む活性薬を提供する。１つの実施形態は、配列番号４８５－４９１のうちのいずれか１つで記載される配列を含む多価タンパク質を提供する。
１つの実施形態は、（ｉ）（ａ）本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、（ｉ）（ｂ）本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体、（ｉ）（ｃ）本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、（ｉ）（ｄ）本開示に係る多特異性タンパク質、（ｉ）（ｅ）本開示に係る多価タンパク質、または、（ｉ）（ｆ）本開示に係る活性薬、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメインの生成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインの発現を可能にする条件下で本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。
１つの実施形態は、本開示に係る多特異性タンパク質の生成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、多特異性タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係る多特異性ＥｐＣＡＭ結合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、または上記ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る多特異性タンパク質、本開示に係る多価タンパク質、本開示に係る活性薬、または本開示に係る医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、上記方法は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、本開示に係る多特異性タンパク質、本開示に係る多価タンパク質、本開示に係る活性薬、または本開示に係る医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体、本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、または上記を含む医薬組成物と組み合わせて薬剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つである。
１つの実施形態は、本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体の生成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体の発現を可能にする条件下で本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。１つの実施形態は、本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の生成のプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。１つの実施形態は、本開示に係る多価タンパク質の生成のプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示に係る多価タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係る多価タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。１つの実施形態は、本開示に係る活性薬の生成のプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示に係る活性薬の発現を可能にする条件下で本開示に係る活性薬のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成された薬物を回収および精製する工程とを含む。
１つの実施形態は、本開示に係るＣＡＲを含む細胞を提供する。１つの実施形態は、本開示に係るＰｒｏＣＡＲを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。１つの実施形態は、本開示に係る細胞を、ＣＡＲまたはＰｒｏＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたはＲＮＡを用いて、トランスフェクトする方法を含む。
１つの実施形態は、条件付きで活性なキメラ抗原受容体を提供し、上記条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、（ａ）結合部分を含まないが、それ以外では条件付きで活性なキメラ抗原受容体と同一であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と比較して、より大きな治療指数を有する。いくつかの実施形態では、条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、（ａ）結合部分を含まないが、それ以外では条件付きで活性なキメラ抗原受容体と同一であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の治療指数よりも、少なくとも約５倍～約１００倍大きな治療指数を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号５７６の配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、結合部分（Ｍ）または切断可能なリンカー（Ｌ）を含まないがそれ以外は条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質と同一であるＥｐＣＡＭ結合タンパク質と比較して、より大きな治療指数を有する。いくつかの実施形態では、条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、結合部分（Ｍ）または切断可能なリンカー（Ｌ）を含まないが、それ以外は条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質と同一であるＥｐＣＡＭ結合タンパク質と比較して、少なくとも約５倍～約１００倍大きな治療指数を有する。
１つの実施形態は、（ｉ）（ａ）本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体、または、（ｉ）（ｂ）本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る条件付きで活性なキメラ抗原受容体、または上記条件付きで活性なキメラ抗原受容体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、または上記条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む。
１つの実施形態は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインの治療指数を増加させる方法を提供し、上記方法は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、
－非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに特異的な結合部位を含み、
－ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、結合部分によってその標的との結合からマスキングされ、
－ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、切断可能なリンカーが切断されると、その標的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分にコンジュゲートしたＥｐＣＡＭ結合ドメインは、条件付きで活性な多特異性タンパク質の一部であり、多特異性タンパク質はＣＤ３結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３７９および４７４からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分にコンジュゲートしたＥｐＣＡＭ結合ドメインは、条件付きで活性なキメラ抗原受容体の一部であり、条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、配列番号４８５－４９１からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。
１つの実施形態は、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインとを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質の治療指数を増加させる方法を提供し、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含み、上記方法は、第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、
－非ＣＤＲループは、第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインに特異的な結合部位を含み、
－第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、結合部分によってその標的の結合からマスキングされ、および、
－マスキングされる第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインは、切断可能なリンカーの切断時にその標的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに特異的な結合部位を含む。いくつかの実施形態では、第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む。
１つの実施形態は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインとＣＤ３結合ドメインとを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質の治療指数を増加させる方法を提供し、上記方法は、ＣＤ３結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、非ＣＤＲループは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む。
１つの実施形態は、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン、ＣＤ３結合ドメイン、アルブミン結合ドメインを含む、ＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質を提供し、アルブミン結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む非ＣＤＲループと、切断可能なリンカーとを含み、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む。
１つの実施形態は、本開示のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。１つの実施形態は、本開示のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質の生成のプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質、または請求項１４９または１５０に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む。
１つの実施形態は、配列番号１－３８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含むＥｐＣＡＭ結合ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または、配列番号１１５－１５２から選択された配列に対する１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは単一のドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、約０．００１ｎＭ～約５００ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）でＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトＥｐＣＡＭ、マウスＥｐＣＡＭ、カニクイザルＥｐＣＡＭ、またはそれらの組み合わせに結合する。
１つの実施形態は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質を提供し、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは本開示によるものである。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）、ＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）、およびアルブミン結合ドメイン（抗ＡＬＢドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３ドメインは、配列番号３７９または配列番号４７４に記載のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗ＡＬＢドメインは、配列番号３７５、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４８２、または配列番号４８３に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ配向にある。
１つの実施形態は、配列番号４８５－４９１のうちのいずれか１つで記載される配列を含む多価タンパク質を提供する。１つの実施形態は、（ｉ）（ａ）本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、（ｉ）（ｂ）本開示に係る多特異性タンパク質、または、（ｉ）（ｃ）本開示に係る多価タンパク質、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメインの生成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメインの発現を可能にする条件下で本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。１つの実施形態は、本開示に係る多特異性タンパク質の生成のプロセスを提供し、前記プロセスは、多特異性タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係る多特異性ＥｐＣＡＭ結合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、または本開示に係る医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法を提供し、上記方法は、本開示に係る多特異性タンパク質、本開示に係る多価タンパク質、または本開示に係る医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、上記方法は、本開示に係るＥｐＣＡＭ結合ドメイン、本開示に係る多特異性タンパク質、本開示に係る多価タンパク質、または本開示に係る医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴と利点をより良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と添付図面とを参照されたい。
本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインを含む本開示の例示的な融合タンパク質を用いる、ＮＣＩ－Ｈ５０８細胞による代表的なＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイの結果を提供する。 本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインを含む本開示の例示的な融合タンパク質を用いる、代表的なＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイの結果を提供する。 本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインを含む本開示の例示的な融合タンパク質を用いる、代表的なＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイの結果を提供する。 本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインを含む本開示の例示的な融合タンパク質を用いる、代表的なＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイの結果を提供する。 本明細書に記載されるヒト化抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインを含む本開示の例示的な融合タンパク質を用いる、代表的なＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイの結果を提供する。 例示的なＰｒｏＣＡＲ構築物を例示する。１つの例示的な構築物は、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８５）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８６）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８７）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８８）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、プロテアーゼ切断部位３、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８９）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、プロテアーゼ切断部位３、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４９０）を含む。１つの例示的な構築物は、抗ＧＦＰ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４９１）を含む。 １０：１、５：１、２．５：１、および１．２５：１のＣＡＲ－Ｔ：標的細胞の比における、示した構築物のＨＳＡによる抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０の立体的遮断を実証している。 ＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性の遮断におけるＥｐＣＡＭマスク１の有効性を実証する抗ＦＬＡＧ染色に基づいて、低（Ａ）、中（Ｂ）、または高（Ｃ）のＣＡＲ発現に分類された図６からのＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色のヒストグラムを提供している。番号は配列識別子を指す（例えば、４９１＝配列番号４９１）。 ＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性の遮断におけるＥｐＣＡＭマスク２の有効性を実証する抗ＦＬＡＧ染色に基づいて、低（Ａ）、中（Ｂ）、または高（Ｃ）のＣＡＲ発現に分類された図６からのＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色のヒストグラムを提供している。番号は配列識別子を指す（例えば、４８８＝配列番号４８８）。 １０：１、５：１、２．５：１、および１．２５：１のＣＡＲ－Ｔ：標的細胞の比における、図６の構築物の抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０のマスキングを実証している。 ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＣＡＲマスク２細胞殺傷活性のプロテアーゼ部位依存的活性化を実証している。 抗ＦＬＡＧ染色に基づく低（Ａ）、中（Ｂ）、または高（Ｃ）のＣＡＲ発現におけるＥｐＣＡＭマスク１ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化を例示する。番号は配列識別子を指す（例えば、４８９＝配列番号４８９）。 抗ＦＬＡＧに基づく低（図Ａ）、中（図Ｂ）、または高（図Ｃ）のＣＡＲ発現におけるＥｐＣＡＭマスク２ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化を例示する。番号は配列識別子を指す（例えば、４８５＝配列番号４８５）。 本開示の例示的なＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（図１４ＢのリンカーＬ０４０を含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ；図１４Ｃの切断不可能なリンカーを含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ）、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣ分子（図１４Ａ）の投与後のマウスにおける体重パーセント変化を示している。 本開示の例示的なＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（図１４ＢのリンカーＬ０４０を含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ；図１４Ｃの切断不可能なリンカーを含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ）、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣ分子（図１４Ａ）の投与後のマウスにおける体重パーセント変化を示している。 本開示の例示的なＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（図１４ＢのリンカーＬ０４０を含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ；図１４Ｃの切断不可能なリンカーを含むＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ）、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣ分子（図１４Ａ）の投与後のマウスにおける体重パーセント変化を示している。 様々なＥｐＣＡＭ結合ドメイン；Ｈ１３（図１５Ａ）、Ｈ９０（図１５Ｂ）、およびＨ９０．２（図１５Ｃ）についての結合動態を示す。 様々なＥｐＣＡＭ結合ドメイン；Ｈ１３（図１５Ａ）、Ｈ９０（図１５Ｂ）、およびＨ９０．２（図１５Ｃ）についての結合動態を示す。 様々なＥｐＣＡＭ結合ドメイン；Ｈ１３（図１５Ａ）、Ｈ９０（図１５Ｂ）、およびＨ９０．２（図１５Ｃ）についての結合動態を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１６Ａ）、Ｈ９０．２（図１６Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１６Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＨＣＴ１１６細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１６Ａ）、Ｈ９０．２（図１６Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１６Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＨＣＴ１１６細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１６Ａ）、Ｈ９０．２（図１６Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１６Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＨＣＴ１１６細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１７Ａ）、Ｈ９０．２（図１７Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１７Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１７Ａ）、Ｈ９０．２（図１７Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１７Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図１７Ａ）、Ｈ９０．２（図１７Ｂ）、およびＨ１３８．２（図１７Ｃ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＴｒｉＴＡＣタンパク質、または活性薬（ＣＴ）を用いた、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞上でのＴ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣアッセイ）の結果を示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３およびＨ９０．２を含むＴｒｉＴＡＣを用いた、ＨＣＴ１１６細胞（図１８Ａ）およびＨＣＴ１１６（ＥｐＣＡＭ－ノックアウト；ＫＯ）（図１８Ｂ）に対する、Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣ ａｓｓａｙ）の結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３およびＨ９０．２を含むＴｒｉＴＡＣを用いた、ＨＣＴ１１６細胞（図１８Ａ）およびＨＣＴ１１６（ＥｐＣＡＭ－ノックアウト；ＫＯ）（図１８Ｂ）に対する、Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（ＴＤＣＣ ａｓｓａｙ）の結果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞野生型（ＷＴ）およびＨＣＴ１１６（ＥｐＣＡＭ－ノックアウト；ＫＯ）細胞とＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３およびＨ９０．２との結合を測定するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグまたは活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、ＳＫＢＲ３細胞上でのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図２１Ａ）またはＨ９０．２（図２１Ｂ）を含む切断不可能なプロドラッグバージョンによって達成されたマスキング効果を、同じものを含む活性薬と比較して実証している代表的なプロットを例示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（図２１Ａ）またはＨ９０．２（図２１Ｂ）を含む切断不可能なプロドラッグバージョンによって達成されたマスキング効果を、同じものを含む活性薬と比較して実証している代表的なプロットを例示している。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ａは、ＣＡＰＡＮ２細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｂは、ＤＭＳ５３細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｃは、ＨｅｐＧ２細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｄは、ＫＭＲＣ３細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｅは、ＭＤＡＰＣＡ２ｂ細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｆは、ＯＶＣＡＲ８細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｇは、ＰＥＣＡＰＪ４１細胞についての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を含む切断不可能なプロドラッグ（ＮＣＬＶ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（Ｌ０４０）、または活性薬（ＣＴ）バージョンを用いた、様々な細胞株に関するＴＤＣＣアッセイの結果を示している。図２２Ｈは、ＳＫＢＲ３細胞についての結果を示す。 マウス腫瘍モデルにおける、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（図２３Ｂ）バージョンおよびＴｒｉＴＡＣ（図２３Ａ）バージョンの有効性を示す。 マウス腫瘍モデルにおける、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（図２３Ｂ）バージョンおよびＴｒｉＴＡＣ（図２３Ａ）バージョンの有効性を示す。 カニクイザルにおける、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣおよびＴｒｉＴＡＣのバージョンの投与後のサイトカインプロファイルを示す。Ａは、ＩＦＮ－γレベルを例示する。Ｂは、ＩＬ－２レベルを例示する。Ｃは、ＩＬ－６レベルを例示する。Ｄは、ＩＬ－１０レベルを例示する。 カニクイザルにおける、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（Ａ）またはＨ９０．２（Ｂ）を含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣおよびＴｒｉＴＡＣバージョンの投与後の血漿中濃度を示す。 相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、ならびにβ鎖を接続する非ＣＤＲループ（ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、ＥＦ、およびＤＥ）を含む、免疫グロブリン分子の可変ドメインを例示する。 本開示の標的抗原結合ドメイン（ａＴａｒｇｅｔ １）、切断可能なリンカー、および結合部位（ａＴａｒｇｅｔ ２）の典型的な配置を例示している。 本明細書に記載される条件付きで活性な受容体の一例を例示している。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ａは、対照ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｂは、０．００３ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｃは、０．０１ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｄは、０．０３ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｅは、０．１ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｆは、０．１ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｇは、０．０３ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｈは、０．１ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｉは、０．３ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｊは、１ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 確立されたＬｏＶｏ（結腸癌）腫瘍モデルにおける、対照ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、およびＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質の有効性を示す。図２９Ｋは、３ｍｇ／ｋｇでのＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣについての結果を示す。 ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含むＰｒｏＴｒｉＴＡＣまたはＴｒｉＴＡＣバージョンを投与後の生存率（Ａ－Ｂ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）（Ｃ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）（Ｄ）、および総ビリルビン（Ｅ）レベルを示している。 対照ＧＦＰ ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣ、またはＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣを用いた病理組織学的研究の結果および要約を示す。 ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の概略図を提供する。
ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質、その医薬組成物、同様にそのようなタンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書に記載されている。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示されたＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質を使用する方法も提供される。ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３と同様にＥｐＣＡＭに特異的に結合することができ、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）に結合するドメインなどの半減期延長ドメインを有する。図３２は三重特異性のＥｐＣＡＭ結合タンパク質の１つの非限定的な例を描く。
特定の定義
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「とともに（ｗｉｔｈ）」との用語またはその変形が、詳細な記載および／または請求項のいずれかで使用される程度まで、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に類似した方法で含まれるように意図される。
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」との用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるかに、例えば、測定システムの制約に部分的に依存している。例えば、「約」とは、任意の値での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、特段の定めのない限り、「約」との用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものであると仮定されなければならない。
「個体」、「患者」、または「対象」との用語は互換的に使用される。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医師、正看護師、ナース－プラクティショナー、医師助手、用務係、またはホスピス職員）の監督（例えば、持続的または断続的）によって特徴付けられた状態を要求せず、またはそれに限定されない。
「抗体」とは典型的には、共有的なジスルフィド結合と非共有的な相互作用によって一緒に保持される、２つの重（Ｈ）ポリペプチド鎖および２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字型の四量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）を含み、定常ドメインは、アミノ酸配列と遺伝子座位に基づいてカッパまたはラムダとして容易に分類され得る。鎖間のジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置し、溶媒に利用可能であり、通常比較的容易に還元される。ヒトＩｇＧ１アイソタイプでは、４つの鎖間のジスルフィド結合があり、各重鎖から軽鎖まで１つ、および、重鎖間に２つある。鎖間のジスルフィド結合は鎖の会合には必要ではない。周知のように、重鎖のシステイン豊富なＩｇＧ１ヒンジ領域は一般に、３つの部分：上部ヒンジ、コアヒンジ、および下部ヒンジからなるように保持されている。当業者は、ＩｇＧ１ヒンジ領域が、鎖間のジスルフィド結合（２つの重／重、２つの重／軽）を含む重鎖内にシステインを含有しており、これがＦａｂの移動を促進する構造的な柔軟性をもたらすことを理解するであろう。ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は、カッパまたはラムダの軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上部ヒンジ領域内のＣ２２０との間で形成される。重鎖間の鎖間ジスルフィド結合は、位置Ｃ２２６とＣ２２９にある（すべて、下のＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．に従ってＥＵの指標に基づき番号を付された）。
本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、その突然変異およびその変異体を含む、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体および霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、イントラボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体（例えば、一価ＩｇＧ）、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、免疫特異性抗体フラグメント、例えば、ｈｃＩｇＧ、Ｖ－ＮＡＲ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３フラグメント、単鎖フラグメント（例えば、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖＦｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨとＣＨ１のドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ（ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨＨドメイン）「ｒ ＩｇＧ」（「ハーフ抗体」）などの１つの可変ドメインのみを含むナノボディまたは単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、「ミニボディ」は、いくつかの例では、以下に示す構造によって例証される：（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３）、または（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２、マルチボディ、例えば、トリアボディあるいはテトラボディ；ならびに、Ｆｃ融合と他の修飾を含むその誘導体、および、任意の他の免疫反応性の分子（それがＥｐＣＡＭタンパク質との優先的な会合または結合のための結合部位を有するドメインを含む限り）。さらに、文脈上の制約によって他の方法で指定されない限り、この用語はさらに、すべてのクラスの抗体（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）とすべてのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）を含む。様々なクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは典型的には、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμによってそれぞれ表示される。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てられ得る。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなどの重鎖のみの抗体を含む。場合によっては、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、操作されたヒトＶＨドメインである重鎖のみの抗体を含む。いくつかの例では、操作されたヒトＶＨドメインは、ファージディスプレイライブラリのパニングに生成される。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はＶＨＨを含む。「ＶＨＨ」との用語は、本明細書で使用されるように、軽鎖を欠いた単鎖抗体結合ドメインを指す。場合によっては、ＶＨＨは、軽鎖を生来欠いているラクダ科あるいは軟骨魚類で見られるタイプの抗体に由来し、または、それに応じて構築することができる合成の非免疫ＶＨＨに派生する。各重鎖は、Ｖ、Ｄ、およびＪのエクソンによってコードされた可変領域を含む。ＶＨＨは、場合によっては、天然のＶＨＨ、例えば、ラクダ科由来のＶＨＨ、または、重鎖可変ドメインを含む組換え型タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、グアナコ、および軟骨魚類（限定されないが、サメなど）からなる群から選択された種に由来する。別の実施形態では、ＶＨＨは、アルパカ（限定されないが、ワカヤ（Ｈｕａｃａｙａ Ａｌｐａｃａ）とスーリ（Ｓｕｒｉ ａｌｐａｃａ）など）に由来する。
本明細書で使用されるように、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合と特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、β－シート構造を接続する、場合によってはβ－シート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続された、β－シート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。各ドメイン、フレームワーク領域、およびＣＤＲに対するアミノ酸の割り当ては、いくつかの実施形態では、別段の定めのない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （５ｔｈ Ｅｄ．）、ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＰＨＳ， ＮＩＨ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ． ９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６， ＰＭＩＤ：８８７６６５０；または、Ｄｕｂｅｌ， Ｅｄ． （２００７） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗｉｌｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ ｏｒ ＡｂＭ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供される番号付与方法の１つに従う。本開示のいくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなどの重鎖のみの抗体を含み、および、３つのＣＤＲを含む。そのような重鎖のみの抗体は、いくつかの実施形態では、最適な結合親和性のために、ＶＬ（可変の軽鎖）領域との二量体化に依存しない単量体としてＥｐＣＡＭを結合する。
「Ｋａｂａｔでのような可変ドメイン残基の番号付与」または「Ｋａｂａｔでのようなアミノ酸位置の番号付与」、およびその変更形態は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付与システムを参照する。この番号付与システムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの省略、またはそれらへの挿入に対応する、より少数のまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ式番号付与は、「標準の」Ｋａｂａｔ式番号付与を行った配列との、抗体の配列の相同領域におけるアライメントによって、所定の抗体について決定され得る。本開示のＣＤＲはＫａｂａｔの番号付与の慣習に必ず対応するということを意図するものではない。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基（または領域）との用語は、本明細書で定義されるようなＣＤＲまたは超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。１つの抗原が１つを超えるエピトープを有することもある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる部位に結合し、異なる生物学的効果を有する可能性がある。エピトープは立体構造であっても線状であってもよい。立体構造のエピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントの空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生じるものである。特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖類、リン酸基、またはスルホニル基の部分を含んでいてもよい。
本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」との用語は、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントして、必要に応じてギャップを導入した後に、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＥＭＢＯＳＳ ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長での最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２１－２５（Ａｌｆｒｅｄ Ｇｏｏｄｍａｎ Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ Ａｌｆｒｅｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ ｅｄ．１９８０）に記載されるように、その通常の意味で使用される。簡潔にいえば、この用語は、薬物消失の時間経過の定量的尺度を包含することを意味している。薬物濃度が通常、消失プロセスの飽和に必要な濃度に達しないため、ほとんどの薬剤の消失は指数関数的なものである（すなわち、一次速度論に従う）。急激なプロセスの速度は、時間の単位当たりの分数変化率を表すその速度定数ｋによって、または、プロセスの５０％の完了に必要な時間であるその半減期ｔ１／２によって表され得る。これらの２つの定数の単位は、それぞれ時間－１および時間である。一次反応速度定数および反応の半減期は単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、適宜交換され得る。一次排出速度論は、薬物の一定の割合が時間単位ごとに失われることを規定するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初期分布段階後（すなわち、薬物吸収と分布が完了した後）の全ての時間で直線状である。薬物排出半減期は、そのようなグラフから正確に判定され得る。
本明細書で使用されるように、「結合親和性」との用語は、結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して表現される。２つ以上のタンパク質が、それらの結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に相当する。いくつかの実施形態では、「Ｋｄ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）または表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。ある実施形態では、「オンレート（ｏｎ－ｒａｔｅ）」あるいは「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎまたはａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」あるいは「ｋｏｎ」、および「オフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）」あるいは「解離速度（ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」、あるいは「ｋｏｆｆ」も、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴技術で決定される。さらなる実施形態では、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、および「ｋｏｆｆ」は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムズ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓを使用して、結合親和性を測定するための例示的な方法では、リガンド、例えば、ビオチン化されたヒトまたはカニクイザルのＥｐＣＡＭは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ストレプトアビジンキャピラリーセンサー先端表面に固定され、その後、約２０－５０μｇ／ｍｌのヒトまたはカニクイザルのＥｐＣＡＭタンパク質を使用して、ストレプトアビジンの先端が、メーカーの説明書に従って活性化される。ＰＢＳ／カゼインの溶液も遮断薬として導入される。会合反応速度測定（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）に関して、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質変異体は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、または約２ｎｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で導入される。いくつかの実施形態において、ＥｐＣＡＭ結合単一ドメインタンパク質は、約２ｎｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用される。完全解離は、陰性対照である結合タンパク質を含まないアッセイ緩衝液の場合に観察される。その後、結合反応の速度論的パラメータは、適切なツール、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを使用して決定される。
本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態では、「処置」または「処置すること」または「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、または疾患を遅らせること、あるいは、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、または疾患の程度の減少；疾病、障害、または疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、または疾患の発症を遅らせること、あるいは進行を遅らせること；疾病、障害、または疾患状態の改善；および、検出可能であれ検出不可能であれ、緩解（部分的でも全体でも）、あるいは、疾病、障害、または疾患の亢進であれ改善を含む。処置は過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態では、「処置」または「処置すること」または「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患のための遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせるか、あるいはその重症度を低下させることである。
「ＴｒｉＴＡＣ」、「ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣ」、または「ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質」は、本明細書で使用されるように、条件付きで活性化されない三重特異性結合タンパク質を指し、バルク血清タンパク質、第１の標的抗原結合ドメイン、および第２の標的抗原結合ドメインに特異的な結合部分を含み、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、本明細書に記載されるようにＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含み、および、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ヒトＣＤ３などのＣＤ３に結合するドメインを含む。
「ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ」または「ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性促進（ｐｒｏｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）タンパク質」は、本明細書で使用されるように、条件付きで活性化される三重特異性結合タンパク質を指し、（ｉ）切断可能なリンカー（例えば、配列番号４２５－４７１および配列番号５０３－５０６に記載の配列を含む））、（ｉｉ）バルク血清タンパク質に特異的である結合部分を含み、および第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインのその標的への結合を禁止するマスキング部分（例えば、配列番号３８０－４２４に記載の配列を含む）も含んでおり、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、本明細書に記載されるようにＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む。本開示のＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質は、場合によっては、例えば、腫瘍微小環境などのプロテアーゼリッチな環境において、切断可能なリンカーの切断によってマスキングされた状態から活性状態へと活性化され、活性薬を形成する。活性薬は、本明細書で提供されるように、いくつかの実施態様において、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインと本開示のＣＤ３結合ドメインとを含む。活性薬の例は、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４で提供されるか、または、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４からなる群から選択された配列と少なくとも約７５％～１００％同一であり、例えば、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４からなる群から選択された配列と約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である配列で提供される。
「切断不可能なプロドラッグ」は、本明細書で使用されるように、切断可能なリンカーが、切断不可能なリンカー（例えば、配列番号５０７におけるようなリンカー）と交換されている、上記のようなＰｒｏＴｒｉＴＡＣを指す。活性薬の例は、配列番号４９５および５０２で提供されるか、または、配列番号４９５および５０２からなる群から選択された配列と少なくとも約７５％～１００％同一であり、例えば、配列番号４９５および５０２からなる群から選択された配列と約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一である配列で提供される。
非ベータサンドイッチ足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、アフィボディ）において、「非ＣＤＲループ」は、（１）第２の抗原に対する操作された特異性を可能にするために配列ランダム化を受け入れることができ、かつ、（２）立体的な干渉なく、両方の抗原に対する足場の同時結合を可能にするために足場に通常使用される主要な特異性決定領域の遠位にある、領域を指す。この目的のために、主要な特異性決定領域は、Ｓｋｒｌｅｃ ２０１５ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３：４０８－４１８）において確立されたフレームワークを使用して定義することができる。フレームワークの抜粋を以下に記載する：
Figure 2022533957000002
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、本明細書で使用されるように、細胞（例えば、Ｔ細胞）に抗原特異性を提供する操作された受容体を指す。ＣＡＲは、複数のドメイン、例えば、少なくとも１つの標的抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。各ドメインはリンカーによって接続されることがある。「ＰｒｏＣＡＲ」は、本明細書で使用されるように、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む、条件付きで活性化可能なＣＡＲを指す。
ＥｐＣＡＭ結合タンパク質
ＥｐＣＡＭに結合するタンパク質、その医薬組成物、同様にそのようなタンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書に記載されている。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示されたＥｐＣＡＭ結合タンパク質を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、本明細書に記載されているようなＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性（例えば、三重特異性）タンパク質の一部である。
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、ほとんどの正常なヒト上皮で発現し、ほとんどの癌腫で過剰発現している膜糖タンパク質である。この分子は細胞間の接着に関与し、さらにシグナル伝達、細胞移動、増殖、および分化に関与している。そのため、ＥｐＣＡＭは、いくつかの固形癌の臨床試験において、免疫療法の標的となっている。それは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出と単離に重要な役割を果たすことが分かっている。ＥｐＣＡＭは、様々な研究において、様々な癌腫の診断と治療に有益であることが示されている。さらに、多くの場合、腫瘍細胞は、その親上皮または上記癌の侵襲性の低い形態よりも、はるかに高い程度にＥｐＣＡＭを発現することが観察された。例えば、ＥｐＣＡＭの発現は、正常な前立腺上皮よりも腫瘍組織および腺癌で有意に高いことが示され（ｎ＝７６；ｐ＜０．０００１）、ＥｐＣＡＭの発現の増加は前立腺癌の発生における初期イベントを表していることが示唆された。Ｐｏｃｚａｔｅｋ，Ｊ Ｕｒｏｌ．，１９９９，１６２，１４６２－１６４４を参照。加えて、扁平上皮癌と子宮頸部腺癌の両方の大部分において、強いＥｐＣＡＭの発現は、増殖の増加および末端分化のマーカーの消失と相関することが示されている。Ｌｉｔｖｉｎｏｖ， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １９９６， １４８， ８６５－７５を参照。１つの例は、腫瘍細胞上のＥｐＣＡＭの過剰発現が生存の予測因子である乳癌である。Ｇａｓｔｌ， Ｌａｎｃｅｔ． ２０００， ３５６， １９８１－１９８２を参照。さらに、ＥｐＣＡＭは、頭頸部および肺の扁平上皮癌に罹患した患者において、播種性腫瘍細胞を検出するためのマーカーとして記載されている。Ｃｈａｕｂａｌ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９， １９， ２２３７－２２４２， Ｐｉｙａｔｈｉｌａｋｅ， Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ． ２０００， ３１， ４８２－４８７を参照。表皮、口腔、喉頭蓋、咽頭、喉頭、および食道に見られるような正常な扁平上皮は、ＥｐＣＡＭを有意に発現しなかった。Ｑｕａｋ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １９９０， ９， ３７７－３８７を参照。
ＥｐＣＡＭは、配向した高度に秩序だった方法で上皮細胞を接着させるのに役立つことが企図されている。Ｌｉｔｖｉｎｏｖ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７，１３９，１３３７－１３４８を参照。上皮細胞の悪性形質転換に伴い、急速に成長する腫瘍細胞は、上皮の高い細胞秩序を放棄すると考えられている。その結果、ＥｐＣＡＭの表面分布は制限されなくなり、分子は腫瘍細胞によりよく露出するようになると企図されている。上皮細胞由来であるため、ほとんどの癌の腫瘍細胞は、その表面上にＥｐＣＡＭを発現すると予想される。
ＥｐＣＡＭは、３１４個のアミノ酸の４０ｋＤａの膜結合型糖タンパク質であり、特定の上皮および多くのヒト癌に特異的に発現している。Ｂａｌｚａｒ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．１９９９，７７，６９９－７１２）を参照。ＥｐＣＡＭは、マウスモノクローナル抗体１７－１Ａ／エドレコロマブによる認識によって発見され、その後クローン化された。Ｇｏｅｔｔｌｉｎｇｅｒ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． １９８６；３８， ４７－５３ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９０；８７， ２７５５－２７５９を参照。モノクローナル抗体１７－１Ａは、ヒト結腸癌細胞を用いるマウスの免疫化によって生成された。Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． １９７９， ５， ９５７－９７１を参照。ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様の反復は、同種親和性の細胞接着において、横方向および相互の相互作用を媒介することが示された。例えば、Ｂａｌｚａｒ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２００１， ２１， ２５７０－２５８０）を参照する。その理由のため、上皮細胞間で優勢的に位置している（Ｌｉｔｖｉｎｏｖ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７，１３９，１３３７－１３４８， Ｂａｌｚａｒ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． １９９９， ７７， ６９９－７１２ ａｎｄ Ｔｒｅｂａｋ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１， ２７６， ２２９９－２３０９）。
ＥｐＣＡＭは、以下の別名でも知られている：上皮細胞接着分子、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質、主要消化管腫瘍関連タンパク質ＧＡ７３３－２、腺癌関連抗原、細胞表面糖タンパク質Ｔｒｏｐ－１、上皮糖タンパク質３１４、ＴＡＣＳＴＤ１、ＥＧＰ３１４、ＭＩＣ１８、ＴＲＯＰ１、Ｍ４Ｓ１、ＫＳＡ、膜成分第４染色体表面マーカー（３５ｋＤ糖タンパク質）、モノクローナル抗体によって同定された抗原 ＡＵＡ－１、ヒト上皮糖タンパク質－２、上皮細胞表面抗原、上皮糖タンパク質、ＫＳ １／４抗原、ＣＤ３２６抗原、ＧＡ７２２－２、ＨＥＧＰ３１４、ＨＮＰＣＣ８、ＥｐＣＡＭ、ＤＩＡＲ５、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ４０、ＫＳ１／４、ＭＫ－１、Ｍ１Ｓ２、ＥＳＡ、およびＥＧＰ。ＥｐＣＡＭの例示的なタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔｋＢ ＩＤ Ｎｏｓ．Ｐ１６４２２およびＢ５ＭＣＡ４で提供される。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔｋＢ ＩＤ Ｎｏ．Ｐ１６４２２（配列番号４７８）またはＢ５ＭＣＡ４（配列番号４７５）で提供されるＥｐＣＡＭ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、成熟ＥｐＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインに結合する。ヒト細胞外ドメイン配列は、配列番号４７９で提供され、カニクイザル細胞外ドメイン配列は、配列番号４８０で提供され、および、マウス細胞外ドメイン配列は、配列番号４８１で提供される。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７５と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥＰＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７５の配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７６と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥＰＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７６の配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７７と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７７と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７８と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７８と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７９と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４７９と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４８０と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４８０と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４８１と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号４８１と比較して、切断された配列を含むタンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、完全長ＥｐＣＡＭを認識する。特定の例では、本明細書に開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ内のエピトープを認識し、例えば、場合によっては、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ヒトＥｐＣＡＭのドメイン内に見られる１つ以上のアミノ酸に相互作用する。抗体が結合するエピトープは、ＥｐＣＡＭのドメイン内に位置する３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなることもある。あるいは、エピトープは、ＥｐＣＡＭのドメイン内に位置する複数の非連続的なアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなることもある。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、完全長ＥｐＣＡＭタンパク質、またはそのフラグメント、例えば、上記のように完全長ＥｐＣＡＭタンパク質内のエピトープ含有フラグメントに結合する。場合によっては、エピトープ含有フラグメントは、ＥｐＣＡＭタンパク質の抗原性または免疫原性フラグメントおよびその誘導体を含む。抗原性または免疫原性フラグメントを含むエピトープ含有フラグメントは、いくつかの実施形態では、１２アミノ酸またはそれ以上、例えば、２０アミノ酸またはそれ以上、５０あるいは１００アミノ酸またはそれ以上である。ＥｐＣＡＭフラグメントは、いくつかの実施形態では、完全長タンパク質の９５％以上、完全長タンパク質の９０％以上、７５％または５０％または２５％または１０％以上を含む。いくつかの実施形態では、抗原性または免疫原性フラグメントを含むＥｐＣＡＭのエピトープ含有フラグメントは、患者において関連する免疫応答を誘発することができる。ＥｐＣＡＭの誘導体は、いくつかの実施形態では、配列番号４７５－４８１に提供されるＥｐＣＡＭ配列に１つ以上（例えば、１－２０、例えば、１５のアミノ酸、またはタンパク質の全長に基づくアミノ酸の数だけ最大で２０％、例えば、１０％または５％または１％）の欠失、挿入、または置換がなされた配列上の変異体を含む。
いくつかの実施形態では、置換は保存的置換を含む。その誘導体および変異体は、いくつかの例では、それらが由来するタンパク質と本質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ＥｐＣＡＭの誘導体および変異体は、いくつかの例では、それらが由来するタンパク質と比較可能な抗原性または免疫原性を有し、それらが由来するタンパク質のリガンド－結合活性、または活性受容体－複合体形成能力のいずれか、あるいは好ましくはその両方を有し、ＥｐＣＡＭと同じ組織分布を有している。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、参照ＥｐＣＡＭ結合タンパク質と同等またはそれ以上の親和性でＥｐＣＡＭに特異的に結合し、そのような実施形態におけるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子を含み、ＥｐＣＡＭ結合親分子に由来し、ＥｐＣＡＭ結合親分子に関して１つ以上のアミノ酸変異（例えば、安定化変異、不安定化変異）を含んでいる。いくつかの実施形態では、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、参照のＥｐＣＡＭ結合親分子と比較して、選択された不安定化剤に対して優れた安定性を持っている。いくつかの実施形態では、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質などのＥｐＣＡＭタンパク質に対してファージディスプレイライブラリで発現された１つ以上のＥｐＣＡＭ結合親分子に由来する１つ以上の事前候補ＥｐＣＡＭ結合分子のパニングを含むプロセスで同定される。事前候補ＥｐＣＡＭ結合分子は、いくつかの実施形態では、親分子に対する、可変領域、ＣＤＲ、またはフレームワーク残基におけるアミノ酸置換を含む。
本明細書で使用されるように、「ファージディスプレイ」とは、ファージ、例えば、繊維状ファージ、粒子の表面にあるコートタンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質として、変異型ポリペプチドが表示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大規模なライブラリが、標的分子に高い親和性で結合する配列について迅速かつ効率的に選択可能であるという事実にある。ペプチドやタンパク質のライブラリをファージに表示することは、数百万ものポリペプチドから特定の結合特性を有するものをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに融合することにより、小さなランダムペプチドおよび小さなタンパク質を表示するために使用されている。例えば、Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ， ３：３５５－３６２ （１９９２）、および、その中で引用されている文献を参照。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドライブラリーを遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合させ、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下において低レベルで発現させることにより、ファージ粒子が融合タンパク質の１つのコピーを表示するか、またはいかなる融合タンパク質も表示しない。多価ファージに比べてアビディティ効果が小さく、選択は内因性のリガンドとの親和性に基づいており、ファージミドベクターが使用され、これによりＤＮＡ操作が容易になる。例えば、Ｌｏｗｍａｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３：２０５－０２１６ （１９９１）を参照。
いくつかの実施形態では、パニングは、事前候補のＥｐＣＡＭ結合分子から、オンレートが増加または減少したＥｐＣＡＭ結合分子を特定するために、変動する結合時間と濃度を使用することを含む。いくつかの実施形態では、パニングは、事前候補のＥｐＣＡＭ結合分子から、オンレートが増加または減少したＥｐＣＡＭ結合分子を特定するために、変動する洗浄時間を使用することを含む。いくつかの実施形態では、パニングは、変動する結合時間と変動する洗浄時間を使用することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の安定化変異は、例えば、そのような突然変異体から第２期のコンビナトリアルライブラリーを作製するためにシャッフルすること、および、パニングの第２ラウンドと、その後の結合選択を実施することによって、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子の安定性を高めるために、組み合わされる。
いくつかの実施形態では、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、ＥｐＣＡＭ結合親分子と同等以上のＥｐＣＡＭタンパク質（ヒトＥｐＣＡＭタンパク質など）への親和性を有するが、それは、ＥｐＣＡＭ結合親分子が特異的であるか、または特異的であるように設計されたＥｐＣＡＭエピトープ以外の、リガンド、タンパク質、抗原などの選択された物質との交差反応性を低減させたか、実施形態によっては、その交差反応性を増大させた。後者に関して、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、実施形態によっては、親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子を、ヒトＥｐＣＡＭと、動物モデルの対応する標的、例えば、マウスＥｐＣＡＭまたはカニクイザルＥｐＣＡＭとの両方と反応させる場合に、動物モデルの方でより成功裏に試験される。いくつかの実施形態では、親のＥｐＣＡＭ結合分子は、約５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下の親和性でヒトＥｐＣＡＭに結合し、および、約５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、１回のラウンドのパニング後に特定された親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、１ｎＭ以下などの約５ｎＭ以下の親和性でヒトＥｐＣＡＭに結合し、および、１ｎＭ以下などの約７．５ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、２ラウンドのパニング後に特定された親和性成熟ＥｐＣＡＭ結合分子は、約２．５ｎＭ以下の親和性でヒトＥｐＣＡＭに結合し、および、約３．５ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合する。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、疾患細胞上の標的などの標的、または疾患状態を支持する他の細胞上の標的、例えば、腫瘍の成長を支持する間質細胞上の標的、あるいは疾患を媒介とする免疫抑制を支持する免疫細胞上の標的に特異的に結合する抗原特異的結合ドメインポリペプチドを含む。いくつかの例では、抗原特異的結合ドメインは、抗体、単鎖抗体、Ｆａｂｓ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ、または他のさまざまな抗体模倣体（アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アトリマー、ＣＴＬＡ４ベースの分子、アドネクチン、アンチカリン、クニッツドメインベースのタンパク質、アビマー、ノッチン、フィノマー、ダーピン、アフィボディ、アフィリン、モノボディ、およびアルマジロリピートタンパク質ベースのタンパク質など）を含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいはＥｐＣＡＭ結合ドメインまたはその抗原結合フラグメントの抗体変異体である。本明細書で使用されるように、「抗体変異体」との用語は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントの変異体および誘導体を指す。ある実施形態では、抗ＥｐＣＡＭの抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列変異体は、本明細書に記載されるように、企図されている。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列変異体は、その結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するために企図されている。アミノ酸変異体を調製するための例示的な方法は、限定されないが、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列へ適切な修飾を導入すること、あるいはペプチド合成を含む。そのような修飾は、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または上記残基への挿入および／または上記残基の置換を含む。
最終構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換のあらゆる組み合わせを行うことができるが、ただし、最終構築物は所望の特徴（例えば、抗原－結合）を有する。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象部位は、ＣＤＲとフレームワーク領域を含む。そのような置換の例が以下に記載される。アミノ酸置換は、対象とする抗体またはその抗原結合フラグメントに導入されてもよく、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、減少した免疫原性、変化した抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）、または改善されたＴ細胞媒介性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）についてスクリーニングされてもよい。保存的および非保存的なアミノ酸置換が抗体変異体の調製について企図されている。
変異体抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合フラグメントを作製する置換の別の例では、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換されている。一般的に、変異体は、親抗体またはその抗原結合フラグメントと比較して、所望の特性の改善、例えば、親和性の増加、親和性の減少、免疫原性の減少、ｐＨ依存性の結合の増加に基づいて、選択される。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ラマ由来のｓｄＡｂの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ＥｐＣＡＭに特異的なペプチド、リガンド、または小分子実体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含むＥｐＣＡＭに結合する任意のドメインである。ある実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは小分子である。
一般に、単一ドメイン抗体との用語は、その最も広い意味で本明細書で使用されるように、特定の生体源または特定の調製方法に限定されないことに着目されたい。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例としては、限定されないが、重鎖抗体、軽鎖を生来欠いている抗体、従来の４鎖状抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場が挙げられる。単一ドメイン抗体は、当該技術分野の任意のもの、または、将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、（１）自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインの単離；（２）自然発生のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現；（３）自然発生のＶＨＨドメインの「ヒト化」、またはそのようなヒト化されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現；（４）任意の動物種に由来する、および、とりわけ人間などの哺乳動物種に由来する、自然発生のＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」、または、そのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現；（５）「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、あるいはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現；（６）タンパク質、ポリペプチド、または他のアミノ酸配列を調製するための合成技術または半合成技術の使用；（７）当該技術分野で知られている核酸合成の技術を使用した単一ドメイン抗体をコードする核酸の調製と、その後の上記のように得られた核酸の発現；ならびに／あるいは、（８）前述の１つ以上の任意の組み合わせ、によって得られる。
１つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＥｐＣＡＭに対して向けられた自然発生重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は通常、ＥｐＣＡＭでラマの種を適切に免疫化することによって（つまり、免疫応答、および／または、ＥｐＣＡＭに対して向けられた重鎖抗体を生じさせるため）、上記ラマ由来の適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、またはＢ細胞のサンプルなど）を得ることによって、および、当該技術分野で知られているあらゆる適切な技術を用いて上記サンプルから始まるＥｐＣＡＭに対して向けられたＶＨＨ配列を生成することにより、生成または入手することができる。
別の実施形態では、ＥｐＣＡＭに対するそのような自然発生のＶＨＨドメインは、例えば、当該技術分野で知られている少なくとも１つのスクリーニング技術を用いて、ＥｐＣＡＭ、あるいはその少なくとも１つの部分、フラグメント、抗原決定基、もしくはエピトープを使用して、そのようなライブラリをスクリーニングすることによって、ラクダ科動物のＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得られる。そのようなライブラリおよび技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、およびＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、ナイーブＶＨＨライブラリに由来する改善された合成または半合成のライブラリ、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるような、無作為の突然変異誘発および／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によって、ナイーブＶＨＨライブラリから得られたＶＨＨライブラリなどが使用される。
さらなる実施形態では、ＥｐＣＡＭに対して向けられたＶＨＨ配列を得るためのさらに他の技術には、重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化すること（つまり、ＥｐＣＡＭに対して向けられた免疫応答および／または重鎖抗体を産生するために）と、上記トランスジェニック哺乳動物から適切な生体試料（血液試料、血清試料、またはＢ細胞の試料など）を得ることと、その後、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して、上記試料から始まる、ＥｐＣＡＭに対して向けられたＶＨＨ配列を生成することが含まれる。例えば、この目的のために、重鎖抗体発現ラットまたはマウス、およびＷＯ０２／０８５９４５とＷＯ０４／０４９７９４に記載されるさらなる方法と技術を使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体は、非ヒト抗体および／または自然発生のＶＨＨドメインのアミノ酸配列、例えば、ラマ抗ＥｐＣＡＭ抗体に対応するが、「ヒト化」されている、つまり、上記非ヒト抗ＥｐＣＡＭおよび／または自然発生のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中（および、とりわけ、フレームワーク配列内）の１つ以上のアミノ酸残基を、（例えば、上に示すような）ヒト由来の従来の４－鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上によって置き換えることによって「ヒト化」されている、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。これは、例えば、本明細書のさらなる説明に基づいて、当業者に明らかな当該技術分野で知られている様式で実施可能である。さらに、本開示のそのようなヒト化された抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体がそれ自体で知られている任意の適切な様式（つまり、上記項目（１）～（８）で示されるような）で得られ、したがって、出発物質として自然発生のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されない。いくつかのさらなる実施形態では、単一ドメイン抗ＥｐＣＡＭ抗体は、本明細書に記載されるように、自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、つまり、従来の４－鎖抗体からの自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上によって置き換えることによって「ラクダ化」されている、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。そのような「ラクダ化」置換は、ＶＨ－ＶＬ界面および／または（いわゆるラクダ科ホールマーク残基（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ ｈａｌｌｍａｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）で形成される、および／または存在するアミノ酸位置に挿入されるのが好ましい。例えば、ＷＯ９４／０４６７８およびＤａｖｉｅｓとＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４年と１９９６年）を参照されたい。好ましくは、ラクダ化された単一ドメインを生成または設計するための出発物質あるいは出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかし、ある実施形態では、本開示のそのようなラクダ化された抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体は、当該技術分野で知られている任意の適切な様式（つまり、上記項目（１）～（８）で示されるような様式）で得られ、したがって、出発物質としての非ヒト抗ＥｐＣＡＭ抗体および／または自然発生のＶＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定されないということに留意されたい。例えば、本明細書にさらに記載されるように、「ヒト化」と「ラクダ化」の両方は、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ提供し、その後、新しいヌクレオチド配列が「ヒト化された」または「ラクダ化された」単一ドメイン抗体をそれぞれコードするように、上記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変えることによって、実行される。その後、本開示の所望の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体がもたらされるように、核酸が発現され得る。あるいは、他の実施形態では、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、本開示の所望のヒト化またはラクダ化された抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列がそれぞれ設計され、その後、ペプチド合成の既知の技術を用いてデノボ合成される。いくつかの実施形態では、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列にそれぞれ基づいて、本開示の所望のヒト化またはラクダ化された抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体をそれぞれコードするヌクレオチド配列が設計され、次に、核酸合成の既知の技術を用いてデノボ合成され、その後、本開示の所望の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体がもたらされるように、このように得られた核酸が既知の発現技術を用いて発現され得る。
自然発生のＶＨ配列またはＶＨＨ配列から始まる、本開示の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体および／またはそれをコードする核酸を得るための他の適切な方法および技術は、例えば、本開示の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体あるいはそれをコードするヌクレオチド配列または核酸を提供するために、適切な様式で、１つ以上の自然発生のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）配列および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、１つ以上の自然発生のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列あるいはＣＤＲ配列など）、および／または、１つ以上の合成あるいは半合成の配列を組み合わせることを含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、重鎖可変相補性決定領域ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、重鎖可変ＣＤＲ３、軽鎖可変ＣＤＲ１、軽鎖可変ＣＤＲ２、および軽鎖可変ＣＤＲ３を含む、抗ＥｐＣＡＭ特異的抗体である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、あるいは抗原結合フラグメント、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または重鎖二量体、軽鎖単量体または軽鎖二量体、ならびに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体からのドメインを含む、ＥｐＣＡＭに結合する任意のドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体は、重鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、式：ｆ１－ｒ１－ｆ２－ｒ２－ｆ３－ｒ３－ｆ４によって表されるように、３つの相補性決定領域／配列によって中断された４つのフレームワーク領域／配列（ｆ１－ｆ４）で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、式中、ｒ１、ｒ２、およびｒ３はそれぞれ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質のフレームワーク残基は、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４のアミノ酸残基を含み、および、相補性決定領域は、例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合タンパク質は、配列番号１－３８から選択される配列、そのサブ配列、およびその変異体を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、配列番号１－３８から選択される配列、そのサブ配列、およびその変異体に対して少なくとも７０％～９５％以上の相同性を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択される配列、そのサブ配列、およびその変異体に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択される配列、そのサブ配列、およびその変異体に対して、少なくとも７０％～９５％以上の同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択される配列、そのサブ配列、その変異体に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、配列番号３９－７６からなる群から選択される配列と比べて１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４のいずれか１つに記載の配列、または、配列番号７７－１１４からなる群から選択される配列と比べて１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２のいずれか１つに記載の配列、または、配列番号１１５－１５２からなる群から選択される配列と比べて１つ以上の置換を含む配列を含む。
様々な実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％、約６１％、少なくとも約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
様々な実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインの相補性決定領域は、配列番号３９－７６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
様々な実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインの相補性決定領域は、配列番号７７－１１４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
様々な実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインの相補性決定領域は、配列番号１１５－１５２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一である。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトカニクイザルとマウスＥｐＣＡＭと交差反応性である。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトＥｐＣＡＭに特異的である。ある実施形態では、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）でヒトＥｐＣＡＭに結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ｃｙｎｏ Ｋｄ（ｃＫｄ）でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、マウスＫｄ（ｍＫｄ）でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ｃｙｎｏ Ｋｄ（ｃＫｄ）とヒトＫｄ（ｈＫｄ）で、カニクイザルＥｐＣＡＭとヒトＥｐＣＡＭにそれぞれ結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ｃｙｎｏ Ｋｄ（ｃＫｄ）、マウスＫｄ（ｍＫｄ）およびヒトＫｄ（ｈＫｄ）で、カニクイザルＥｐＣＡＭ、マウスＥｐＣＡＭ、およびヒトＥｐＣＡＭにそれぞれ結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、同等の結合親和性（つまり、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄの値は、±１０％を超えて異ならない）で、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＥｐＣＡＭに結合する。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約５００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約４５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約４００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約３５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約３００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約２５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約２００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約１５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．００１ｎＭ～約１００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．１ｎＭ～約９０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．２ｎＭ～約８０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．３ｎＭ～約７０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．４ｎＭ～約５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．５ｎＭ～約３０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．６ｎＭ～約１０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．７ｎＭ～約８ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．８ｎＭ～約６ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約０．９ｎＭ～約４ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄ、ｍＫｄ、およびｃＫｄは、約１ｎＭ～約２ｎＭの範囲である。
いくつかの実施形態では、前述のＥｐＣＡＭ結合ドメイン（例えば、配列番号１－３８の抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体）のいずれかは、精製しやすくするためにタグ付けされた親和性ペプチドである。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドタグは、６Ｘ－ｈｉｓ（配列番号３７７）とも呼ばれる、６つの連続するヒスチジン残基である。
ある実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインは、可溶性ＥｐＣＡＭよりも膜結合型ＥｐＣＡＭに優先的に結合する。膜結合型ＥｐＣＡＭは、ＥｐＣＡＭを発現する細胞の細胞膜表面中のあるいはその表面上のＥｐＣＡＭの存在を指す。可溶性ＥｐＣＡＭは、ＥｐＣＡＭを発現するか、またはＥｐＣＡＭを発現した細胞の細胞膜表面中またはその表面上にはもはや存在しないＥｐＣＡＭを指す。ある例では、可溶性ＥｐＣＡＭは、対象の血液および／またはリンパ循環中に存在する。一実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、可溶性ＥｐＣＡＭよりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多く膜結合型ＥｐＣＡＭに結合する。一実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、可溶性ＥｐＣＡＭよりも３０倍多く、膜結合型ＥｐＣＡＭに優先的に結合する。抗原結合タンパク質が可溶性ＥｐＣＡＭよりも膜結合型ＥｐＣＡＭに優先的に結合するかどうかの判定は、結合アッセイを使用して容易に判定され得る。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はかなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、または１０ｋＤａ以下であることが企図される。ある例では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ペプチドまたは小分子実体である場合、５ｋＤａ以下である。
他の実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭのための小分子実体（ＳＭＥ）バインダを含む。ＳＭＥバインダは、平均して約５００～２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼライゲーションあるいはコンジュゲーションなどの既知の方法によってＥｐＣＡＭ結合タンパク質に結合される。これらの例では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ソルターゼ認識配列、例えば、ＬＰＥＴＧ（配列番号３７６）を含むドメインを含む。ソルターゼ認識配列を含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質にＳＭＥバインダを結合させるために、タンパク質は、ソルターゼおよびＳＭＥバインダとインキュベートされ、それによって、ソルターゼはＳＭＥバインダを認識配列に結合させる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭへの結合のためのノッチンペプチドを含む。ノッチンは、システインノット足場を備えたジスルフィド安定化ペプチドであり、約３．５ｋＤａの平均サイズを有する。ノッチンは、ＥｐＣＡＭなどの特定の腫瘍分子に結合するように企図されている。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＥＰＣＡＭ結合タンパク質は、天然のＥｐＣＡＭリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、１つを超えるドメインを含み、ドメインの柔軟な結合を有する単一ポリペプチド設計である。このことにより、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、単一のｃＤＮＡ分子によってコードされてベクターに容易に組み入れられ得るためである。さらに、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるいくつかの実施形態では、鎖の対形成の問題も二量体形成の要件も存在しない。そのような実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、凝集する傾向が減少していることが企図される。
１つを超えるドメインを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質では、ドメインは１つ以上の内部リンカーによって連結される。ある実施形態では、内部リンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。ある実施形態では、内部リンカーは「長い」、つまり、１５、２０、または２５のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、内部リンカーは、約３～約１５、例えば、８、９、または１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーのアミノ酸組成物に関して、ペプチドは、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質に柔軟性を与え、結合ドメインに干渉せず、プロテアーゼからの切断に抵抗する特性により選択される。例えば、グリシンとセリンの残基は一般に、プロテアーゼ抵抗性を与える。ＥｐＣＡＭ結合タンパク質においてドメインに連結するのに適切な内部リンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（配列番号．３６５）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号．３６６）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号．３６７）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号．３６８）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号．３６９）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号．３７０）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（配列番号．３７１）、または（ＧＧＧ）ｎ（配列番号．３７２）を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号．３７３）（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号．３７４）、または（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号．３７５）である。
場合によっては、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質が１つを超えるドメインを含む場合、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質内のドメインは、哺乳動物または細菌のトランスグルタミナーゼ酵素の使用を含む酵素学的な部位特異的コンジュゲーション法を使用してコンジュゲートされる。微生物のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、現代の研究やバイオテクノロジーにおいて汎用性の高いツールである。比較的純粋な酵素が大量に入手できること、使いやすいこと、カルシウムやグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）による調節がないことなどにより、ｍＴＧは食品産業とバイオテクノロジーの両方で使用される主要な架橋酵素となっている。現在、ｍＴＧは、タンパク質およびペプチドを低分子、ポリマー、表面、ＤＮＡ、ならびに他のタンパク質に結合させる多くの用途で使用されている。例えば、Ｐａｖｅｌ Ｓｔｒｐ，Ｖｅｒａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２５，５，８５５－８６２を参照されたい。
いくつかの例では、１つを超えるドメインを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質が提供され、ここで、ドメインの１つは、定常領域にアクセプターグルタミンを含み、これは、リジンベースのリンカー（例えば、アルキルアミン、オキソアミンを含む、ＴＧａｓｅの基質である任意の一級アミン鎖）を介して別のドメインにコンジュゲート可能であり、ここで、コンジュゲーションは、抗原結合部位の外側（例えば、可変領域の外側、定常領域内）の標的化部分に存在する１つ以上のアクセプターグルタミン残基上で独占的に起こる。したがって、可変領域内のグルタミン、例えば、少なくとも部分的に表面が露出したグルタミン上では、コンジュゲーションは起こらない。ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、いくつかの例では、ＴＧａｓｅの存在下でドメインの１つをリジンベースのリンカーと反応させることによって形成される。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質内の１つ以上のドメインが直接連結される場合、ハイブリッドベクターが作られ、直接連結されたドメインをコードするＤＮＡそれ自体が互いに直接ライゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーが使用される場合、ハイブリッドベクターが作られ、ハイブリッドベクターでは、あるドメインをコードするＤＮＡが、リンカー部分の一方の末端をコードするＤＮＡに連結され、別のドメインをコードするＤＮＡがリンカー部分の他方の末端に連結される。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ由来の単一ドメイン抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチド、およびモノボディなどの抗体模倣物である。さらなる実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに結合または会合するリガンドまたはペプチドである。さらなる実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はノッチンである。さらなる実施形態では、ＥｐＣＡＭへの結合ドメインは小分子実体である。
ある実施例では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質に組み入れられ得る。いくつかの実施形態では、三重特異性タンパク質は、ＣＤ３結合ドメイン、半減期延長ドメイン、および本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合三重特異性タンパク質は、三重特異性抗体を含む。
多特異性ＥｐＣＡＭ結合を標的とするタンパク質、ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質（本明細書では、ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣタンパク質または分子とも呼ばれる）。
一態様では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質または多価タンパク質が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ヒトのＣＤ３に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３ガンマに特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３デルタに特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＣＤ３イプシロンに特異的に結合するドメインをさらに含む。
さらなる実施形態では、多特異性タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのアルファ鎖に特異的に結合するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質は、ＴＣＲのベータ鎖に特異的に結合するドメインをさらに含む。
ある実施形態では、多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との強力なＣＤ３結合親和性を示すだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。いくつかの例では、多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。ある例では、ＣＤ３結合についてのヒトＫＤ：カニクイザルＫＤ（ｈＫｄ：ｃＫｄ）の比は、２０：１～１：２との間である。
いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、あるいはＣＤ３結合抗体の抗原結合フラグメント、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または重鎖二量体、軽鎖単量体または軽鎖二量体、ならびに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体からのドメインを含む、ＣＤ３に結合する任意のドメインである。いくつかの例では、本明細書に記載される単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質を含む多特異性タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが、ＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む多特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒト残基またはヒト化残基を含めることが有益な場合がある。本開示の多特異性（例えば、三重特異性）ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣタンパク質のＣＤ３結合ドメインのための例示的なアミノ酸配列は、配列番号３７９、あるいは、配列番号３７９と少なくとも約７５％～１００％同一、例えば、配列番号３７９と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一の配列として提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む、多特異性タンパク質の血清アルブミン結合ドメイン（本明細書では、半減期延長ドメインとも呼ばれる）は、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む血清アルブミンに結合する任意のドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、などの単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）、あるいは、ＨＳＡ結合抗体の抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、および１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体、ペプチド、リガンド、または血清アルブミンに特異的な小分子実体である。ある実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、血清アルブミン結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは小分子である。単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の血清アルブミン結合ドメインはかなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある例では、血清アルブミン結合がペプチドまたは小分子実体である場合、血清アルブミン結合は５ｋＤ以下である。本開示の多特異性（例えば、三重特異性）ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣタンパク質の血清アルブミン結合ドメインのための例示的なアミノ酸配列は、配列番号３７８、あるいは、配列番号３７８と少なくとも約７５％～１００％同一、例えば、配列番号３７８と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％同一の配列として提供される。
本明細書に記載されるように、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の半減期延長ドメインは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質自体の変更された薬動力学と薬物動態学をもたらす。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはさらに、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の組織分布、透過、および拡散の変更を含む、薬力学的な特性を変更する。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織分布、組織透過、組織内での拡散、増強した有効性をもたらす。一実施形態では、治療方法は、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質のより少ない量を有効かつ効率的に利用し、これにより、非腫瘍細胞毒性などのオフターゲットの減少など、副作用の減少が結果としてもたらされる。
さらに、半減期延長ドメインの結合親和性は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む特定の多特異性結合タンパク質における、特定の消失半減期を標的とするように選択される。したがって、いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは高い結合親和性を有する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、半減期延長ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、１０ｎＭ以下のＫｄ（高い）、１０ｎＭ～１００ｎＭの間のＫｄ（中程度）、および１００ｎＭを超えるＫｄ（低い）を含む。上記のように、血清アルブミンへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
本開示のＥｐＣＡＭを標的とする多特異性タンパク質は、ある実施形態では、（Ａ）ＣＤ３に結合する第１のドメインと、（Ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメインと、（Ｃ）本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質である第３のドメインと、を含む。ある実施形態では、第１のドメインは、ＣＤ３を特異的に結合するｓｃＦｖを含む。ＣＤ３は、例えば、ヒトＣＤ３タンパク質である。ある実施形態では、第２のドメインは、バルク血清タンパク質を特異的に結合するｓｄＡｂを含む。いくつかの例では、バルク血清タンパク質は、アルブミン、例えば、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンである。
ドメイン（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）は、いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｎ－（Ａ）－Ｌ１－（Ｃ）－Ｌ２－（Ｂ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｂ）－Ｌ１－（Ａ）－Ｌ２－（Ｃ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｃ）－Ｌ１－（Ｂ）－Ｌ２－（Ａ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ｃ）－Ｌ１－（Ａ）－Ｌ２－（Ｂ）－ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ－（Ａ）－Ｌ１－（Ｂ）－（Ｃ）－Ｌ２－ＣＯＯＨ、またはＨ２Ｎ－（Ｂ）－（Ｃ）－（Ａ）－ＣＯＯの配向のいずれか１つにおいて、リンカーＬ１とＬ２によって連結される。
本開示のＥｐＣＡＭを標的とする多特異性タンパク質は、いくつかの実施形態では、配列番号１５３－２０６および２１０－２１２からなる群から選択される配列と少なくとも約７０％～約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭを標的とする多特異性タンパク質は、配列番号１５３－２０６および２１０－２１２からなる群から選択される配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、～約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質などの、条件付きで活性な多特異性ＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質（本明細書では、ＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣまたは三重特異性促進タンパク質あるいは分子と呼ばれる）。
本開示の一実施形態は、本明細書で開示されるＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む、条件付きで活性な多特異性タンパク質を提供する（例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む、ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性促進／ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を提供する）。
いくつかの実施形態では、条件付きで活性な多特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインと、ヒト血清アルブミンなどのバルク血清タンパク質に特異的に結合する結合部分とをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、それらの標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインまたはＣＤ３結合ドメインの相互作用をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、本開示の結合部分は、マスキング部分と、プロテアーゼ切断可能なリンカーなどの切断可能なリンカーとを含む。結合部分内のマスキング部分のための例示的な配列は、配列番号３８０－４２４、または、配列番号３８０－４２４からなる群から選択される配列に対して１つ以上の置換を含む配列において提供される。いくつかの実施形態では、結合部分は、修飾された非ＣＤＲループ配列と、切断可能なリンカーとを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、５０８－５５０、および５８１からなる群から選択される配列、または、配列番号４２５－４２５－４７１、５０３－５０６、５０８－５５０、および５８１からなる群から選択される配列に対して１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、修飾された非ＣＤＲループ配列と、切断不可能なリンカーとを含む。いくつかの実施形態では、切断不可能なリンカーは、配列番号５０７に記載される配列、または、配列番号５０７に対して１つ以上の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択される配列と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％約９９％、または約１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣのＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ３結合ドメイン（例えば、配列番号４７４の配列、またはそれと少なくとも約７５％の同一性を有するＣＤ３結合ドメイン）のための結合部位を有する非ＣＤＲループを含む抗ＡＬＢドメインである結合部分と、切断可能なリンカーと、ＣＤ３結合ドメインと、Ｃ末端上に抗ＥｐＣＡＭ結合ドメインとを含む。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣのＥｐＣＡＭ結合ドメインは、いくつかの実施形態では、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％、約６１％、少なくとも約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、配列番号４９５、４９８、４９９、５００、５０２、５６９、５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択される配列と少なくとも約少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、配列番号５７６に記載されるアミノ酸配列と、上記アミノ酸配列を含む医薬組成物と、本明細書に記載される腫瘍性疾患などの疾患を処置するために上記アミノ酸配列を使用する方法とを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、切断不可能なプロドラッグフォーマットで、配列番号４９５および５０２からなる群から選択される配列と少なくとも約少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるような、活性なＥｐＣＡＭを標的とする薬物（ＣＴ）のための例示的な配列は、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一の配列である。
結合部分は、立体的なマスキングと特異的なマスキングの両方によって、条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性促進タンパク質の治療濃度域を相乗的に拡張することができる。いくつかの実施形態では、結合部分は、立体的なマスキング（例えば、バルク血清アルブミンへの結合を介する）と、特異的なマスキング（例えば、抗ＥｐＣＡＭのドメインまたは抗ＣＤ３ｓｃＦｖドメインのＣＤＲに結合する非ＣＤＲループを介する）の両方を組み合わせる。場合によっては、結合部分内の非ＣＤＲループの修飾は、アルブミン結合に影響を与えない。プロテアーゼ切断可能なリンカーは、場合によっては、単一のタンパク質分解イベントにおけるＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性促進タンパク質の活性化を可能にし、それによって、腫瘍微小環境中の三重特異性促進分子のより効率的な変換を可能にする。さらに、腫瘍関連タンパク質分解の活性化により、場合によっては、活性化後にオフ腫瘍活性を最小限に抑えた活性なＴ細胞エンゲージャーが明らかになる。本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合部分を含む、半減期が延長したＴ細胞エンゲージャーフォーマット（ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ）を提供し、これは、場合によっては、条件付きで活性なＴ細胞エンゲージャーを設計するための新規かつ改善されたアプローチである。
条件付きで活性な三重特異性促進のフォーマットにおけるＥｐＣＡＭ結合ドメインの半減期は、いくつかの実施形態では、多特異性タンパク質がリンカーの切断によって条件付きで活性化され、その標的抗原に結合することができる腫瘍微小環境に、多特異性タンパク質が到達するまで、不活性な状態のプロフォーマット（ｐｒｏ ｆｏｒｍａｔ）で多特異性タンパク質を維持する安全スイッチとして作用する、上述の結合部分を使用することによって体循環で延長される。安全スイッチは、ある例では、いくつかの利点をもたらし、いくつかの例としては、（ｉ）条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質の治療濃度域を拡張すること、（ｉｉ）体循環において、条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質を維持することにより、標的媒介性薬物動態を低減すること、（ｉｉｉ）体循環中の望ましくない活性化されたタンパク質の濃度を低下させ、それによって、化学、製造、および制御に関連する不純物、例えば、あらかじめ活性化された薬物製品、内在性ウイルス、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、溶出物（ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ）、消泡剤、抗生物質、毒素、溶媒、重金属が広がるのを最小限に抑えること、（ｉｖ）体循環中の望ましくない活性化されたタンパク質の濃度を低下させ、それによって、酸化、脱アミド、変性、ＭＡｂｓにおけるＣ－ｔｅｒｍ Ｌｙｓの損失による産物に関連する不純物、凝集体、分解生成物、産物変異体が広がるのを最小限に抑えること、（ｖ）循環中の異常な活性化を防ぐこと、（ｖｉ）異常組織あるいは他の病態生理的状態、例えば、腫瘍、自己免疫疾患、炎症、ウイルス感染、組織リモデリング事象（心筋梗塞、皮膚創傷治癒など）、または外部的傷害（Ｘ線、ＣＴスキャン、紫外線暴露）からの活性種の漏出に関連する毒性を低減すること、および（ｖｉｉ）条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質の非特異的結合を減少させること、が挙げられる。さらに、活性化後、または言いかえれば、安全スイッチの破壊後、条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質は、延長された半減期を提供した安全スイッチから分離され、したがって、循環から除去される。例えば、薬物が腫瘍環境の外部で不注意に活性化される場合、あるいは薬物が活性化後に腫瘍環境から漏れ出る場合、その薬物は迅速に除去され、正常組織に対して損傷を引き起こす可能性は低く、したがって、毒性が低減される。
いくつかの実施形態では、条件付きで活性でないが構成的に活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の治療指数と比較して、本明細書に記載される条件付きで活性な多特異性ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、改善された治療指数を有する。例えば、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣよりも増加した治療指数を有する。治療指数の増加は、いくつかの実施形態では、少なくとも約２倍～約１０００倍、例えば、約４倍～約８００倍、約６倍～約８００倍、約６倍～約６００倍、約１０倍～約４００倍、約２０倍～約２００倍、約３０倍～１５０倍、約５０倍～約１００倍である。治療指数の増加は、いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループおよび切断可能なリンカーを用いた、上に記載される結合部分へのＥｐＣＡＭ結合ドメインのコンジュゲーションに起因する。
「治療指数」（ＴＩ）（「治療濃度域」とも呼ばれる）は、いくつかの実施形態では、治療効果（例えば、上記の治療剤で処置された、ＥｐＣＡＭを発現する癌患者の生存の改善）をもたらす最小量の治療剤（例えば、ＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＣＡＲ）と、最小限の最大耐用量との比較である。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣの治療指数の拡大の一例を表１４に示す。いくつかの例では、治療指数の改善は、癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷において、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣと比較したＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣの改善されたＥＣ５０の点から明示される。
いくつかの実施形態では、条件付きで活性なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質フォーマットは、大幅に長い血清半減期をＥｐＣＡＭ結合ドメインに与え、循環中のその望ましくない活性化の可能性を減少させ、それによって、「バイオベター」バージョンが産生される。
本明細書に記載される結合部分は、少なくとも１つの非ＣＤＲループを含む。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合部分が結合するための結合部位を提供する。場合によっては、結合部分は、例えば、立体的閉鎖（ｓｔｅｒｉｃ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を介して、特異的な分子間相互作用を介して、あるいはその両方の組み合わせを介して、その標的抗原へのＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合部分は、例えば、バルク血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）への結合に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含む。いくつかの例では、本開示の結合部分は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来するドメインである。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）のものであってもよい。Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は、ループによって連結された一連の平行なβストランドへとフォールディングする。可変領域では、ループのうちの３つは、分子の抗原結合特異性を決定する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を構成する。ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨとＶＬの領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域へとさらに細分化することができ、その領域は、配列おいて超可変であり、および／または抗原認識に関与し、および／または構造的に定義されたループを通常形成し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に並べられた、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
いくつかの実施形態では、本開示の結合部分は重鎖のみの抗体である。図２６に示されるように、重鎖のみの抗体の可変ドメインは、２枚のシートに配置された、いくつかのβストランドを有する。重鎖のみの抗体の可変ドメインは、３つの超可変のループ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む。可変ドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、βバレルの一端にクラスター形成する。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのβストランドＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’、およびＦ－Ｇを接続するループであるが、免疫グロブリンフォールドのβストランドＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’－Ｄ、およびＥ－Ｆを接続するボトムループと、免疫グロブリンフォールドのＤ－Ｅストランドを接続するトップループとは、非ＣＤＲループである。
本開示のいくつかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸配列の少なくとも一部、またはすべては、重鎖のみの抗体である結合部分などの、本明細書に記載される結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。本開示のいくつかの実施形態では、定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３の少なくとも一部のアミノ酸残基は、本明細書に記載される結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。非ＣＤＲループは、いくつかの実施形態では、ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ１セットドメインのＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、およびＤＥループ；ＩｇあるいはＩｇ様分子のＣ２セットドメインのＡＢ、ＣＣ’、ＥＦ、ＦＧ、ＢＣ、およびＥＣ’ループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＩ（中間体）セットドメインのＤＥ、ＢＤ、ＧＦ、Ａ（Ａ１Ａ２）Ｂ、およびＥＦループの１つ以上を含む。
可変ドメイン内では、ＣＤＲは抗原認識と結合の原因となると考えられ、ＦＲ残基はＣＤＲのための足場と考えられる。しかし、ある例では、ＦＲ残基の一部が抗原認識と結合に重要な役割を果たす。Ａｇ結合に影響するフレームワーク領域残基は、２つのカテゴリーに分けられる。１つ目は、抗原を接続するＦＲ残基であり、したがって、結合部位の一部であり、これらの残基の一部は順番にＣＤＲに近接している。他の残基は、ＣＤＲから順番に遠いが、分子の３Ｄ構造（例えば、重鎖におけるループ）ではＣＤＲに近接している残基である。
いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは修飾されて、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に特異的な抗原結合性部位を生成する。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは修飾されて、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合ドメインに特異的な抗原結合性部位を生成する。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは修飾されて、本明細書に記載されるＣＤ３結合ドメインに特異的な抗原結合性部位を生成する。
様々な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、非ＣＤＲループのアミノ酸配列に外来性の少なくとも１つのアミノ酸の挿入、アミノ酸置換が、非ＣＤＲループを修飾するために使用され得ることが企図される。いくつかの例において、抗原ペプチドは非ＣＤＲループに挿入される。いくつかの例において、抗原ペプチドが非ＣＤＲループの代わりに用いられる。修飾は、抗原結合部位を生成するために、場合によっては、たった１つの非ＣＤＲループ内にある。他の例では、１つを超える非ＣＤＲループが修飾される。例えば、修飾は、図２６に示される非ＣＤＲループ（つまり、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、ＥＦ、およびＤ－Ｅ）のいずれか１つ内にある。場合によっては、修飾はＤＥループ内にある。その他の場合において、修飾は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、Ｅ－Ｆループの４つすべてにある。
ある例では、本明細書に記載される結合部分は、それらのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合され、および、それらのＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’またはＦ－Ｇループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合される。ある例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、ならびにＥＦループを介してＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合され、および、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、ならびにＦＧループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合される。ある例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、ならびにＥ－Ｆループの１つ以上を介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合され、および、ＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、ならびにＦＧループの１つ以上を介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合される。ある例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合され、および、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、またはＦＧループを介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合される。ある例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、ならびにＥＦループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合され、および、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、ならびにＦＧループを介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合される。ある例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、ならびにＥ－Ｆループの１つ以上を介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合され、および、ＢＣ、Ｃ’Ｃ’’、ならびにＦＧループの１つ以上を介して、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質に結合される。ある例では、本明細書に記載される結合部分は、それらのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、ＣＤ３結合ドメインに結合され、および、それらのＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’、またはＦ－Ｇループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合される。ある例では、本明細書に記載される結合部分は、それらのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、アルブミンなどのバルク血清タンパク質に結合され、および、それらのＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’、またはＦ－Ｇループを介して、ＣＤ３結合ドメインに結合される。ある例では、本明細書に記載される結合部分は、それらのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、ＣＤ３結合ドメインに結合され、および、それらのＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’、またはＦ－Ｇループを介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合される。ある例では、本明細書に記載される結合部分は、それらのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ’’Ｄ、またはＥＦループを介して、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合され、および、それらのＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ’’またはＦ－Ｇループを介して、ＣＤ３結合ドメインに結合される。
バルク血清タンパク質は、例えば、アルブミン、フィブリノゲン、またはグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は操作された足場である。操作された足場は、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場（Ｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １２（７）：５６３－５７１において示唆される）、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡあるいはＲＮＡのアプタマー足場を含む。
場合によっては、結合部分は、バルク血清タンパク質のための結合部位を含む。いくつかの実施形態では、結合部分内のＣＤＲは、バルク血清タンパク質のための結合部位を提供する。バルク血清タンパク質は、いくつかの例では、グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、ＩｇＥ、または五量体ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、結合部分は、免疫グロブリン軽鎖のための結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、免疫グロブリン軽鎖のための結合部位を提供する。免疫グロブリン軽鎖は、いくつかの例では、Ｉｇκの遊離軽鎖またはＩｇλの遊離軽鎖である。
さらなる実施形態では、結合部分は任意の種類のポリペプチドである。例えば、ある例では、結合部分は、天然のペプチド、合成ペプチド、あるいはフィブロネクチン足場、または操作されたバルク血清タンパク質である。いくつかの例では、結合部分は、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、任意のタイプの結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可溶性ＴＣＲフラグメント、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、結合部分は、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノボディである。
本明細書に記載される結合部分は少なくとも１つの切断可能なリンカーを含むことが、本明細書で企図される。一態様では、切断可能なリンカーは、配列特異的な様式で、認識および切断された配列を有するポリペプチドを含む。本明細書に記載される結合部分は、場合によっては、配列特異的な様式で認識および切断されたプロテアーゼ切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ９）（ＭＭＰ）によって配列特異的な様式で認識される。場合によっては、ＭＭＰ９によって認識されるプロテアーゼ切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＰＲ（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｉ）（Ｓ／Ｔ）を有するポリペプチドを含む。場合によっては、ＭＭＰ９によって認識されるプロテアーゼ切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＬＥＡＴＡを有するポリペプチドを含む。場合によっては、プロテアーゼ切断可能なリンカーは、ＭＭＰ１１によって配列特異的な様式で認識される。
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な様式で、タンパク質を切断するタンパク質である。プロテアーゼとしては、限定されないが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、およびストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ－、およびジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられる。
Figure 2022533957000003
Figure 2022533957000004
プロテアーゼは、いくつかの異常細胞および異常組織、例えば、腫瘍または癌細胞によって分泌され、プロテアーゼが豊富な微小環境あるいはプロテアーゼに富んだ微小環境を作ることが知られている。ある例では、対象の血液はプロテアーゼに富んでいる。場合によっては、腫瘍を囲んでいる細胞が、プロテアーゼを腫瘍微小環境へと分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を囲んでいる細胞としては、限定されないが、腫瘍間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞毒性Ｔリンパ球、樹状細胞、間葉系幹細胞、多核白血球、および他の細胞が挙げられる。場合によっては、プロテアーゼは、対象の血液中に存在する（例えば、微生物ペプチド中で見られるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼ）。Ｔ細胞が、標的細胞または標的組織のプロテアーゼに富んだ微小環境を除いて、抗原結合性タンパク質によって結合されないので、この特徴は、抗原結合性タンパク質などの標的とされた治療薬がさらなる特異性を有することを可能にする。
本明細書に記載される構築物中で利用され得るリンカーの他の非限定的な例は、以下の配列表で提供される。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）への組込み
本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ある実施例では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＰｒｏＣＡＲへと組み込むことができる。操作された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば、本明細書に記載される抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体を含有するＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含むＣＡＲを発現するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含むＣＡＲは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに、さらには共刺激ドメイン、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、あるいは４－１ＢＢから得られる機能的シグナル伝達ドメインに結合される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含むＰｒｏＣＡＲのための例示的な配列は、配列番号４８５－４９１、または、配列番号４８５－４９１から選択される配列と少なくとも約７５％～１００％同一、例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは１００％同一の配列において提供される。
本明細書に記載される条件付きで活性な受容体は、非ＣＤＲループを含む少なくとも１つの結合部分を含む。一態様では、結合部分は、活性化まで、ＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングする。切断可能なリンカーは、例えば、プロテアーゼ切断部位またはｐＨ依存性切断部位を含む。切断可能なリンカーは、ある例では、腫瘍微小環境内でのみ切断される。したがって、いくつかの例では、切断可能なリンカーに接続され、ＥｐＣＡＭ結合ドメインへさらに結合される結合部分は、切断可能なリンカーが腫瘍微小環境中で切断されるまで、循環において不活性な状態でＥｐＣＡＭ結合ドメインを維持する。いくつかの実施形態では、上記結合部分は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、上記部分がＥｐＣＡＭ結合ドメインに結合するための結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、結合部分マスクは、例えば、立体的閉鎖（ｓｔｅｒｉｃ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を介して、結合部分を含むポリペプチドの様々なドメイン内の相互作用などの特定の分子内相互作用を介して、その標的抗原へのＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングする。いくつかの実施形態では、結合部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含む。
いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲまたはｐｒｏＣＡＲの結合部分は、本開示の条件付きで活性な多特異性ＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質に対応するセクションにおいて上述されるような、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来するドメインである。
図２７は、本開示の例示的な切断可能な条件付きで活性な受容体の一部の略図を示す。条件付きで活性な受容体は、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン（ａＴａｒｇｅｔ１）、切断可能なリンカー、および結合部分（ａＴａｒｇｅｔ２）を含む。ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、第１の標的（ＥｐＣＡＭ）への特異性を有するが、結合部分は第２の標的への特異性を有する。結合部分は修飾された非ＣＤＲループも有しており、これは、その標的へのＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合を阻害する。一旦、切断可能なリンカーで切断されると、結合部分は放出され、ＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合が可能になる。
図２８は、本開示の例示的な条件付きで活性な受容体の活性化の略図を示す。不活性の受容体（不活性のＰｒｏＣＡＲ）は、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーを介して結合部分（抗標的２ ｓｄＡｂ）に接続されたＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗腫瘍標的ｓｄＡｂあるいはｓｃＦｖ）を含む。結合部分は、結合部分がＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインに結合して阻害するように、１つ以上の非ＣＤＲループに挿入されたマスキングペプチド／部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所でさらに記載されるように、結合部分は、所与の標的への特異性を有する。受容体は、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。受容体はＴ細胞（ＣＡＲＴ）において提供される。腫瘍環境に曝露されると、プロテアーゼ切断部位は腫瘍関連プロテアーゼによって切断され、それによって、受容体が活性化され、結合部分を含まない活性な受容体が生成される。受容体は活性な抗原結合ドメインを含む。受容体が細胞によって内部移行されると、結合部分を含み、不活性である新規な受容体が生成される。
結合部分の切断可能なリンカーは、いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む条件付きで活性な多特異性タンパク質に関して、上述されるものと同様のプロテアーゼ切断部位を含む。例えば、切断可能なリンカーは、いくつかの実施形態では、表１または配列表で提供される他のリンカー配列から選択される配列を含む。
膜貫通ドメイン
本開示の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体融合タンパク質、およびＴ細胞受容体は、真核細胞膜に挿入するための膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインと細胞内ドメインとの間に挿入される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインと共刺激ドメインとの間に挿入される。
真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞の細胞膜にポリペプチドを挿入するための任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインは、使用に適している。１つの非限定的な例として、ＴＭ配列ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号５５１）が使用されてもよい。適切なＴＭ配列のさらなる非限定的な例としては、ａ）ＣＤ８β由来：ＧＬＬＶＡＧＶＬＶＬＬＶＳＬＧＶＡＩＨＬＣＣ（配列番号５５２）；ｂ）ＣＤ４由来：ＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣ（配列番号５５３）；ｃ）ＣＤ３ゼータ由来：ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶ（配列番号５５４）；ｄ）ＣＤ２８由来：ＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５５５）；ｅ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来：ＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬ（配列番号５５６）；および、ｆ）ＣＤ７由来：ＡＬＰＡＡＬＡＶＩＳＦＬＬＧＬＧＬＧＶＡＣＶＬＡ（配列番号５５７）が挙げられる。
ヒンジ領域
場合によっては、本開示の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体融合タンパク質、およびＴ細胞受容体は、ヒンジ領域（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）を含み、ここで、ヒンジ領域は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に挿入される。場合によっては、ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。場合によっては、ヒンジ領域は、受容体に由来したヒンジ領域ポリペプチドである（例えば、ＣＤ８由来のヒンジ領域）。
ヒンジ領域は、約４つのアミノ酸～約５０のアミノ酸（ａａ）、例えば、約４ａａ～約１０ａａ、約１０ａａ～約１５ａａ、約１５ａａ～約２０ａａ、約２０ａａ～約２５ａａ、約２５ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約４０ａａ、または約４０ａａ～約５０ａａの長さを有する場合がある。
適切なスペーサーは、４つのアミノ酸～１０のアミノ酸、５つのアミノ酸～９つのアミノ酸、６つのアミノ酸～８つのアミノ酸、または７つのアミノ酸～８つのアミノ酸を含む、１つのアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０のアミノ酸、２つのアミノ酸～１５のアミノ酸、３つのアミノ酸～１２のアミノ酸などの多くの適切な長さのいずれかから容易に選択されるか、またはその長さのいずれかであってもよく、および、１、２、３、４、５、６、または７のアミノ酸であってもよい。
例示的なスペーサーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＳＧＧＳ）ｎを含み、ここで、ｎは少なくとも１つの整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニンセリンポリマー、および当技術分野において既知の他のフレキシブルリンカーが含まれる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーが使用されてもよく、ＧｌｙとＳｅｒの両方は比較的不定形であり、したがって、構成要素間の中性テザー（ｎｅｕｔｒａｌ ｔｅｔｈｅｒ）として機能することができる。グリシンポリマーが使用されてもよく、グリシンは、アラニンよりも非常に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間（ｐｈｉ－ｐｓｉ ｓｐａｃｅ）にアクセスすることができ、側鎖がより長い残基と比べてはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２ （１９９２）を参照）。例示的なスペーサーは、限定されないが、ＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＳＧ、ＧＳＳＳＧなどを含む、アミノ酸配列を含む。
免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当技術分野において既知である；例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１６２；ａｎｄ Ｈｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：１７７９を参照されたい。非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、ＤＫＴＨＴ；ＣＰＰＣ；ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号５５８）；例えば、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１４９４）を参照；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号５５９）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５６０）；ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号５６１）；ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号５６２）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５６３）；ヒトＩｇＧ１ヒンジ）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号５６４）；ヒトＩｇＧ２ヒンジ）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号５６５）；ヒトＩｇＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号５６６）；ヒトＩｇＧ４ヒンジ）；などのアミノ酸配列のうち１つを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列を含む。ヒンジ領域は、野生型の（自然発生）ヒンジ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換および／または挿入および／または欠失を含むことができる。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９は、Ｔｙｒで置換される場合があり、その結果、ヒンジ領域は、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰ（配列番号５６７）を含む。例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８７：５８９１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８に由来するアミノ酸配列を含む；例えば、ヒンジ領域はアミノ酸配列：ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５６８）、またはその変異体を含む。
条件付きで活性なキメラ抗原受容体
一実施形態では、本開示は、条件付きで活性なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは一般に、標的抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、複数のドメインを含む。本開示の条件付きで活性なＣＡＲは、結合部分、ＥｐＣＡＭに結合する標的抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、複数のドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、限定されないが、ＺＡＰ７０、ＣＤ３ゼータ、および４－１ＢＢを含む、タンパク質のシグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、限定されないが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、および少なくとも１、２、あるいは３以上の修飾から２０、１０、あるいは５以下の修飾までを有するそのアミノ酸配列を含む、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、限定されないが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能的フラグメント、および１以上～２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列を含む、タンパク質の膜貫通ドメインを含む。
一態様では、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。１つの態様では、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルス・ベクターである。いくつかのそのような実施形態では、細胞は安定してＣＡＲを発現することができる。別の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、一時的にＣＡＲを発現することができる。
条件付きで活性なＴ細胞受容体融合タンパク質
一実施例では、本開示は条件付きで活性なＴ細胞受容体融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、典型的に、Ｔ細胞の表面中またはその表面上で同時に配置される時、一般に、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合すること、およびｉｉ）無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用すること、ができるＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを含む。
条件付きで活性なＴＦＰは、結合部分、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン、およびＴ細胞受容体サブユニットを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体サブユニットは、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、限定されないが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、その機能的フラグメント、または１、２、あるいは３以上の修飾から２０、１０、あるいは５以下の修飾までを有するアミノ酸配列を含む、タンパク質の膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメインは刺激ドメインを含む。刺激ドメインは、限定されないが、アルファサブユニット、ベータサブユニット、デルタサブユニット、ガンマサブユニット、イプシロンサブユニット、またはそれらの組み合わせを含む、Ｔ細胞受容体サブユニットからのものであってもよい。いくつかの実施形態では、刺激ドメインは、限定されないが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ １鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤＳ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、その機能的フラグメント、および１、２、あるいは３以上の修飾から２０、１０、あるいは５以下の修飾までを有するアミノ酸配列を含む、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む。
いくつかの実施形態では、条件付きで活性なＴＦＰは共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、限定されないが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、および少なくとも１、２、あるいは３以上の修飾から２０、１０、あるいは５以下の修飾までを有するアミノ酸配列を含む、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、リンカー配列によってＴ細胞受容体の細胞外ドメインに接続される。いくつかの例では、コードされたリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここで、ｎ＝１～４である。いくつかの例では、コードされたリンカー配列は長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。いくつかの例では、コードされた長いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここで、ｎ＝２～４である。いくつかの例では、コードされたリンカー配列は短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。いくつかの例では、コードされた短いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここで、ｎ＝１～３である。
一態様では、本開示は、条件付きで活性なＴ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。一態様では、細胞は条件付きで活性なＴＦＰで形質転換され、条件付きで活性なＴＦＰは細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、条件付きで活性なＴＦＰをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルス・ベクターである。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、条件付きで活性なＴＦＰを安定して発現することができる。別の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、条件付きで活性なＴＦＰをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、条件付きで活性なＴＦＰを一時的に発現することができる。
条件付きで活性なＴ細胞受容体
一実施形態では、本開示は、条件付きで活性なＴ細胞受容体を提供する。Ｔ細胞受容体は一般に、アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ、イプシロン、およびゼータのサブユニットを含む、複数のサブユニットを含む。本開示の条件付きで活性なＴ細胞受容体は結合部分を含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、限定されないが、アルファサブユニット、ベータサブユニット、またはそれらの組み合わせを含む、Ｔ細胞受容体サブユニットに結合される。
いくつかの実施形態では、結合部分は、その標的へのＴ細胞受容体の結合をマスキングすることができる。いくつかの実施形態では、結合部分はＴ細胞受容体に結合する。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、上記部分がＴ細胞受容体に結合するための結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、Ｔ細胞受容体アルファ、Ｔ細胞受容体ベータ、またはそれらの組み合わせに特異的な結合部位を提供する。いくつかの実施形態では、結合部分は、例えば、立体的閉鎖を介して、特定の分子間相互作用を介して、その標的へのＴ細胞受容体の結合をマスキングする。
一態様では、本開示は、条件付きで活性なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。一態様では、細胞は条件付きで活性なＴＣＲで形質転換され、条件付きで活性なＴＣＲは細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、条件付きで活性なＴＣＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス・ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルス・ベクターである。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、条件付きで活性なＴＣＲを安定して発現することができる。別の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、条件付きで活性なＴＣＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのそのような実施形態では、細胞は、条件付きで活性なＴＣＲを一時的に発現することができる。
細胞
一実施形態では、本開示は、本開示のキメラ抗原受容体または条件付きで活性なキメラ抗原受容体、条件付きで活性なＴ細胞受容体融合タンパク質、あるいは条件付きで活性なＴ細胞受容体を含む、細胞を提供する。細胞は哺乳動物細胞であってもよい。
適切な哺乳動物細胞は、初代細胞および不死化細胞株を含む。適切な哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが含まれる。適切な哺乳動物細胞株としては、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３の細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＴ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、およびＹＴＳ）などが挙げられる。
いくつかの例では、細胞は不死化細胞株でないが、代わりに個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、場合によっては、細胞は個体から得られた免疫細胞である。一例として、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。別の例として、細胞は個体から得られた細胞傷害性細胞である。別の例として、細胞は個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
最近の試験では、ＣＡＲ構築物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を対象とするために使用され、これは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ＆Ｋａｕｆｍａｎ（２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：１９５）ａｎｄ Ｃａｒｌｓｔｅｎ＆Ｃｈｉｌｄｓ（２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：２６６）によって概説されている。Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現構築物でトランスフェクトされる場合があり、免疫応答を誘発するために使用することができる。ＮＫ細胞がＨＬＡの一致を必要としないため、それらは同種異系エフェクター細胞として使用することができる（Ｈａｒｍａｎｓｏｎ＆Ｋａｕｆｍａｎ、２０１５年）。さらに、治療に有用な末梢血ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ）は、単純な採血によってドナーから単離され得る。有用なＣＡＲ構築物は、ＣＡＲＴ細胞を作るために使用されるものと同様の要素を含有している場合がある。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のキメラ抗原受容体、条件付きで活性なキメラ抗原受容体、条件付きで活性なＴ細胞受容体融合タンパク質、または条件付きで活性なＴ細胞受容体を含むＮＫ細胞を含む、細胞を提供する。
条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質（例えば、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ）の文脈で上に述べられるように、いくつかの実施形態では、条件付きで活性な変異体と同じＥｐＣＡＭ結合ドメインを含むが、条件付きで活性である代わりに構成的に活性であるキメラ抗原受容体の治療指数と比較して、本明細書に記載される条件付きで活性なキメラ抗原受容体は改善された治療指数を有する。例えば、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＣＡＲは、いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲよりも増加した治療指数を有する。上記増加は、いくつかの実施形態では、少なくとも約２倍～約１０００倍、例えば、約４倍～約８００倍、約６倍～約８００倍、約６倍～約６００倍、約１０倍～約４００倍、約２０倍～約２００倍、約３０倍～約１５０倍、約５０倍～約１００倍である。治療指数の増加は、いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループおよび切断可能なリンカーによる、上に記載される結合部分へのＥｐＣＡＭ結合ドメインのコンジュゲーションに起因する。
条件付きで活性な受容体を含む細胞を生成する方法
本開示は、条件付きで活性なキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体融合タンパク質、またはＴ細胞受容体を含む細胞を生成する方法を提供する。方法は一般に、本開示の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体融合タンパク質、あるいはＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を、発現ベクターまたはＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）を用いて、遺伝子的に改変する工程を含む。遺伝子変化は、インビトロで、エクスビボで、エクスビボで実行することができる。細胞は、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）、幹細胞、あるいは前駆細胞であってもよい。
場合によっては、遺伝子の改変はエクスビボで実施される。例えば、Ｔリンパ球、幹細胞、またはＮＫ細胞は、個体から得られ、個体から得られた細胞は、本開示の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体融合タンパク質、またはＴ細胞受容体を発現するように遺伝子改変されている。
Ｔ細胞源
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞源は対象から得られる。「対象」という用語は、本開示全体にわたり使用されるとき、免疫応答が誘発される場合のある生体（例えば哺乳動物）を含むように意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、同種異系Ｔ細胞（例えば同種異系ドナー由来のＣＡＲ Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞（例えば、ドナー由来のナチュラルキラー細胞）、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むがこれらに限定されない多数の源から得ることができる。本開示のある実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意数のＴ細胞が使用されてもよい。本開示のある実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など当業者に知られる任意数の技法を用いて対象から採取される一単位の血液から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は一般的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を包含している。一実施形態では、アフェレーシスにより採取される細胞は、血漿分画を取り除き、その後の処理工程のために適切な緩衝液または培地に細胞を配するために洗浄される。本開示の一実施形態では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄される。代替的な実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠いており、かつ、マグネシウムを欠く場合があるか、またはすべてではないが多くの二価のカチオンを欠く場合がある。カルシウムがない場合、最初の活性化工程は、活性化の拡大を生じさせる場合がある。当業者が容易に理解するように、洗浄工程は、製造業者の指示に従い、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を用いるなどにより、当業者に知られる方法により達成することができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性の緩衝液、例えばＣａを含まないＰＢＳ、Ｍｇを含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、あるいは緩衝液を含むか含まない他の食塩水中で再懸濁されてもよい。代替的に、望ましくないアフェレーシス試料の構成要素は取り除かれてもよく、細胞は培養培地に直接再懸濁される。
一実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球の溶解および単球の除去により、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配を介する遠心分離、または向流により、末梢血リンパ球から単離される、遠心の溶出。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞などのＴ細胞の特異的な亜集団は、正または負の選択技法によりさらに単離されてもよい。例えば一実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞に対する正の選択に十分な期間にわたり、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば３×２８）をコンジュゲートされたビーズによるインキュベーションにより単離される。一実施形態では、この期間は約３０分である。さらなる実施形態では、期間は、３０分～３６時間以上、およびこれらの間にあるすべての整数値である。さらなる実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。また他の実施形態では、期間は１０～２４時間である。一実施形態では、インキュベーション期間は２４時間である。より長いインキュベーションを使用して、腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するなどに際して、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない任意の状況下でＴ細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率を向上することができる。このため、時間を短くまたは長くするだけで、Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができ、および／あるいは（本明細書でさらに記載されるように）ビーズとＴ細胞との比を増減させることにより、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または処理中のその他の時点で優先的に正または負に（ｆｏｒ ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）選択される場合がある。加えて、ビーズまたは他の表面上で抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増減させることにより、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または他の所望の時点で優先的に正または負に選択される場合がある。本開示の範囲内では複数回の選択も使用される場合がある。ある実施形態では、活性化および拡張プロセスにおいて選択手順を実施し、「未選択の細胞」を使用することが望ましい場合もある。「未選択」の細胞はまた、さらなる選択にさらされる場合がある。
負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーを対象とする抗体の組合せにより達成することができる。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した、細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは一般的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある実施形態では、一般的にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を富化または正に選択することが望ましい場合もある。代替的に、ある実施形態では、制御性Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５をコンジュゲートされたビーズ、または他の同様の選択法により除去される。
一実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、およびパーフォリンのうち１つ以上、または他の適切な分子、例えば他のサイトカイン類を発現するＴ細胞集団が、選択される場合がある。細胞発現に対してスクリーニングを行う方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１３／１２６７１２に記載の方法により決定することができる。
正または負の選択による所望の細胞集団の単離において、細胞および表面（例えばビーズなどの粒子）の濃度は、変動する場合がある。ある実施形態では、細胞およびビーズの最大接触を確実なものとするべくビーズおよび細胞がともに混合される（例えば、細胞濃度を増加する）体積を大幅に低下させることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、２０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億を超える細胞／ｍｌが使用される。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。別の一実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億の細胞／ｍｌが使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、および細胞拡張が増加する可能性がある。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など目的の標的抗原を弱く発現する場合がある細胞を、または多くの腫瘍細胞（例えば白血病血液、腫瘍組織など）が存在する試料からより効率的に捕捉することが可能となる。このような細胞集団には治療値がある可能性があり、取得するのが望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞をより効率的に選択することができる。
別の実施形態では、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合もある。Ｔ細胞および表面（例えばビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これは、粒子に結合される所望の抗原を多量に発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、希釈濃度においてＣＤ８＋ Ｔ細胞よりも高レベルのＣＤ２８を発現し、効率的に捕捉される。一実施形態では、使用する細胞濃度は５×１０ｅ６／ｍｌである。他の実施形態では、使用する濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、およびそれらの間にある任意の整数値であってもよい。
他の実施形態では、細胞は、２～１０℃、または室温で、様々な速度で様々な時間にわたり、回転機上でインキュベートされてもよい。
刺激のためのＴ細胞はさらに、洗浄工程後に冷凍される場合がある。理論に縛られるものではないが、冷凍およびその後の解凍工程は、細胞集団において顆粒球とある程度の単球を取り除くことにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を取り除く洗浄工程の後、細胞は、冷凍溶液中で懸濁される場合がある。多くの冷凍溶液およびパラメータが当該技術分野で知られており、この背景に有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを包含するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロースを包含する培養培地、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯ、あるいは例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを包含するその他適切な細胞冷凍培地の使用を必要とし、その後、細胞は毎分１°の速度で－８０℃に冷凍され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保管される。他の制御された冷凍方法のほか、－２０℃または液体窒素中での制御されない即時冷凍も使用される場合がある。
ある実施形態では、冷凍保存された細胞は解凍され、本明細書に記載されるように洗浄され、室温で１時間静置してから、本開示の方法を用いて活性化を行うことが可能となる。
さらに本開示の背景では、同時に対象から血液試料またはアフェレーシス産物を採取してから、本明細書に記載されるような拡張された細胞が必要となる場合があることも企図される。そのため、拡張される細胞源は、必要な時点で採取されてもよく、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載されるものなどＴ細胞治療から利益を得るであろう任意数の疾患または疾病に対するＴ細胞治療において後に使用するために、単離され、冷凍される。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、全体的に健康な対象から得られる。ある実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を進行させるリスクがあるが依然として進行のない全体的に健康な対象から得られ、目的の細胞は、後の使用のために単離され、冷凍される。ある実施形態では、Ｔ細胞は、拡張され、冷凍され、後に使用されてもよい。ある実施形態では、試料は、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断直後ではあるが処置を受ける前の患者から採取される。さらなる実施形態では、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤などの薬剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線などの他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤を含むがこれらに限定されない任意数の関連処置様式の前に、対象の血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本開示のさらなる実施形態では、Ｔ細胞は、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後に患者から直接得られる。この点では、特定の癌処置、具体的には免疫系に損傷を与える薬物による処置の後、患者が正常に処置から回復する期間中の処置の直後に、得られるＴ細胞の品質は、Ｅｘ ｖｉｖｏでの拡張能という点で最適であるか、改善されている場合がある。同様に、本明細書に記載の方法を用いるＥｘ ｖｉｖｏ操作の後、これら細胞は、移植およびｉｎ ｖｉｖｏ拡張の増強に好ましい状態にあり得る。このため、本開示の背景では、この回復段階中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある実施形態では、動員（例えばＧＭ－ＣＳＦによる動員）および移植前治療（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）が、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡張が、特に治療後の所定の時間枠中に好まれる、対象に対する条件を作成するために使用されてもよい。例示的な細胞型として、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細胞が挙げられる。
Ｔ細胞の活性化および拡張
Ｔ細胞は、一般的に例えば米国特許第６，３５２，６９４号、６，５３４，０５５号、６，９０５，６８０号、６，６９２，９６４号、５，８５８，３５８号、６，８８７，４６６号、６，９０５，６８１号、７，１４４，５７５号、７，０６７，３１８号、７，１７２，８６９号、７，２３２，５６６号、７，１７５，８４３号、５，８８３，２２３号、６，９０５，８７４号、６，７９７，５１４号、６，８６７，０４１号、および米国特許出願公報第２００６０１２１００５号に記載されるような方法を用いて活性化および拡張することができる。
一般的に、本開示のＴ細胞は、それが付着する表面に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上で副刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより、拡張することができる。具体的に、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体、その抗原結合フラグメント、または表面に固定される抗ＣＤ２の抗体との接触、あるいはカルシウムイオノホアと合わせてプロテインキナーゼＣアクチベータ（例えばブリオスタチン）との接触などにより、本明細書に記載されるように刺激される場合がある。Ｔ細胞の表面上での付属分子の共刺激のために、付属分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞いずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を含む抗ＣＤ２８の抗体の例のほか、当該技術分野でよく知られる他の方法（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）も使用することができる。
ある実施形態では、Ｔ細胞の主要な刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供される場合がある。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、表面に結合する場合がある。薬剤は、表面に結合すると、同じ表面（すなわち「ｃｉｓ」形態にある）または別の表面（すなわち「トランス」形態にある）に結合する場合がある。代替的に、１つの薬剤が、表面、および溶液中の他の薬剤に結合する場合がある。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、主要活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、表面に結合する。ある実施形態では、両方の薬剤が溶液中にある場合がある。一実施形態では、薬剤は可溶性形態にあり、後にＦｃ受容体または抗体を発現する細胞、あるいは薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋される場合がある。この点では、例えば本開示中のＴ細胞を活性化および拡張する際の使用を企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照されたい。
一実施形態では、２つの薬剤は、同じビーズ（すなわち「シス」）または別のビーズ（すなわち「トランス」）のいずれかに固定される。例として、主要な活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３の抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８の抗体またはその抗原結合性フラグメントである。両方の薬剤がともに同等の分子量で同じビーズに固定される。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡張およびＴ細胞成長のためにビーズに結合する１：１の比の各抗体が使用される。本開示のある実施形態では、ビーズに結合する抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、Ｔ細胞拡張の増加が、１：１の比を使用して観察される拡張と比較して観察されるように使用される。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡張と比較した約１～約３倍の増加が、観察される。一実施形態では、ビーズに結合するＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００、およびその間にあるすべての整数値に及ぶ。本開示の一実施形態では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。本位開示のある実施形態では、ビーズに結合する抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比は、２：１より大きい。特定の一実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。さらなる実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一実施形態では、ビーズに結合する抗体の１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。一実施形態では、ビーズに結合する抗体の３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比が使用される。
１：５００～５００：１の粒子と細胞との比、およびその間にあるすべての整数値が、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために使用されてもよい。当業者が容易に理解できるように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに左右される場合がある。例えば、小さなサイズのビーズは少数の細胞にしか結合できないが、大きなビーズは多くの細胞に結合することができる。ある実施形態では、細胞と粒子との比は、１：１００～１００：１、およびその間にあるすべての整数値に及び、さらなる実施形態では、比は、１：９～９：１、およびその間にあるすべての整数値を含んでおり、Ｔ細胞を刺激するために使用することができる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子とＴ細胞との比は、上述のように変動する場合があるが、特定の値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含んでおり、１つの好ましい比は少なくとも１：１の粒子対Ｔ細胞である。一実施形態では、１：１以下の粒子と細胞との比が使用される。特定の一実施形態では、粒子と細胞との比は１：５である。さらなる実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激を行った日に応じて変動する場合がある。例えば一実施形態では、粒子と細胞との比は、１日目に１：１～１０：１であり、追加の粒子が、（追加した日の細胞数に基づき）１：１～１：１０の最終比で最大１０日間、毎日、またはその後１日おきに追加される。特定の一実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激の１日目では１：１であり、刺激の３日目と５日目では１：５に調整される。一実施形態では、粒子は、刺激の１日目では１：１、３日目と５日目では１：５の比に基づき、毎日または１日おきに追加される。一実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激の１日目では２：１であり、刺激の３日目と５日目では１：１０に調整される。一実施形態では、粒子は、刺激の１日目では１：１、３日目と５日目では１：１０の比に基づき、毎日または１日おきに追加される。当業者は、他の様々な比が本開示における使用に適している可能性があることを認識するであろう。具体的に、比は、粒子のサイズ、および細胞のサイズと種類に応じて変動する。
本開示のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤をコーティングしたビーズと組み合わせられ、続いてこのビーズと細胞は分離され、細胞は培養される。代替的な一実施形態では、培養前に、薬剤をコーティングしたビーズおよび細胞は分離されないが、ともに培養される。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞は先ず、磁力などの力をかけることにより濃縮され、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それにより細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合している常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）がＴ細胞と接触するのを可能にすることにより、ライゲートされる場合がある。一実施形態では、細胞（例えば１０４～１０９のＴ細胞）およびビーズ（例えば１：１の比でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）は、緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウムやマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で組み合わせられる。再度、当業者は、あらゆる細胞濃度が使用されてもよいことを容易に認識することができる。例えば、標的細胞は、試料中で非常にまれであり、かつ試料のわずか０．０１％しか含まない可能性があり、あるいは試料全体（すなわち１００％）が目的の標的細胞を含む場合がある。したがって、あらゆる細胞数は、本開示の中にある。ある実施形態では、細胞および粒子の最大接触を確実なものとするべく粒子および細胞がともに混合される（すなわち、細胞濃度を増加する）体積を大幅に低下させることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、約２０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１億を超える細胞／ｍｌが使用される。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。別の一実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億の細胞／ｍｌが使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、および細胞拡張が増加する可能性がある。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現する場合がある細胞をより効率的に捕えることができる。このような細胞集団には治療値がある可能性があり、ある実施形態では取得するのが望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞をより効率的に選択することができる。
本開示の一実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、またはその間にあるすべての時間整数値にわたり培養される場合がある。一実施形態では、混合物は２１日間培養されてもよい。本開示の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞は、約８日間ともに培養される。一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞は、２～３日間ともに培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上となり得るように、複数回の刺激も望まれる場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、胎児、ウシ、またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、ＴＮＦ－α、または当業者に知られるその他細胞増殖用の添加剤を含む、増殖および生存率に必要な因子を含有している可能性がある適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭｅｄｉａもしくはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。その他細胞増殖用の添加剤として、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインや２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｒｉｍｉｚｅｒを含む場合があり、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または所定の組のホルモン、および／またはＴ細胞の増殖および拡張に十分な量のサイトカインを補足されている。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入されるべき細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば適切な温度（例えば３７℃）および雰囲気（例えば空気と５％ＣＯ２）で維持される。
様々な刺激時間にさらされているＴ細胞は、異なる特徴を呈する場合がある。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを行った（ａｐｈｅｒｅｓｅｄ）末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きなヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有している。ＣＤ３およびＣＤ２８の受容体の刺激によるＴ細胞のＥｘ ｖｉｖｏ拡張は、約８～９日目より前にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８～９日目以降は、Ｔ細胞集団はＴＣ細胞よりも次第に大きな集団を含む。
ＥｐＣＡＭ結合タンパク質修飾
本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン（例えば本開示のＥｐＣＡＭ結合ｓｄＡｂ）およびＥｐＣＡＭを標的とする多特異性タンパク質（例えば、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性または三重特異性促進タンパク質）を含むものであり、（ｉ）アミノ酸が、遺伝子コードによりコードされたものでないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの他の化合物と融合し、あるいは（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、またはタンパク質精製のための配列などのタンパク質に融合される誘導体またはアナログを包含している。
典型的な修飾として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の添加、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の修飾に有用な、よく用いられる特定のペプチド修飾は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合修飾によるポリペプチド中のアミノ基またはカルボキシル基、あるいはその両方の遮断、およびＡＤＰリボシル化を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質の誘導体は、１つ以上の修飾を含む免疫反応性調節因子誘導体および抗原結合性分子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、単価または多価（二価、三価など）である。本明細書で使用するとき、用語「原子価」は、抗体に関連する起こり得る標的結合部位の数を指す。各標的の結合部位は、１つの標的分子あるいは標的分子上の特定の位置または座位に特異的に結合する。抗体が単価であるとき、分子の各結合部位は、単一の抗原位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が１より多くの標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合する場合がある（例えば、異なるリガンドまたは異なる抗原、あるいは同じ抗原上の異なるエピトープまたは位置に結合する場合がある）。
いくつかの実施形態では、上述のようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、Ｆｃ融合ＥｐＣＡＭ結合タンパク質を生成するために、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４などのヒト免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない任意の種からのＦｃ領域に融合される。いくつかの実施形態では、本開示のＦｃ融合ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の半減期は、その他同一のＥｐＣＡＭ結合タンパク質と比較して長い。いくつかの実施形態では、本開示のＦｃ融合ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、例えばＦｃ領域において、とりわけ１つ以上の追加のアミノ酸残基の置換、突然変異、および／または修飾を含んでいる。これにより、薬物動態の改質や血清半減期の延長を含むがこれらに限定されない好ましい特徴を有する結合タンパク質が得られる。
いくつかの実施形態では、このようなＦｃ融合ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ヒトなどの哺乳動物において、５日超、１０日超、１５日超、２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２か月超、３か月超、４か月超、または５か月超の長い半減期を提供する。場合により、半減期の増加により、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の投与頻度を減少し、および／または投与対象である抗体の濃度を低減する、より高い血清力価が得られる。ｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＦｃＲｎへの結合、およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、いくつかの例では、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスまたは形質移入されたヒト細胞株、あるいは異なるＦｃ領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類を対象にアッセイされる。
場合により、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより、産生中または産生後に差動的に修飾される。多数の化学的修飾のうちいずれかは、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的な切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成を含むがこれらに限定されない技法により行なわれる。
さらに本開示により包含されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質の様々な翻訳後修飾は、例えば、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端の処理、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。さらに、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、場合により、モジュレータの検出と単離を可能にするために、酵素、蛍光、放射性同位体、または親和性ラベルなどの検出可能なラベルにより修飾される。
ＥｐＣＡＭ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
また、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
ポリヌクレオチド分子は、単一ドメインＥｐＣＡＭ結合タンパク質をコードする遺伝子、または１より多くのドメインを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質の様々なドメインをコードする遺伝子を組み合わせることなど既知の方法により構築される。いくつかの実施形態では、ドメインをコードする遺伝子は、適切なプロモータ、および任意選択で適切な転写ターミネータに動作可能に結合される単一の遺伝子構築物へと、ペプチドリンカーにより分離され、または他の実施形態ではペプチド結合により直接結合され、細菌または例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系にてそれを発現する。利用されるベクター系と宿主に依存して、任意数の適切な転写、および構成的で誘導可能なプロモータを含む翻訳要素が使用されてもよい。プロモータは、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆り立てるように選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組換えベクターは、既知の方法に従い構築することができる。具体的な目的のベクターとして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドが挙げられる。
様々な発現ベクター／宿主系は、記載されたＥｐＣＡＭ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、かつそれを発現するように利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１－２７）またはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ゆえに、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、ならびに、タンパク質ドメインが発現し、単離される場合があり、かつ任意選択でさらに精製され得る条件下で前記宿主細胞を培養することにより、生成される。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体により形質転換される宿主細胞を含む医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」は、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与対象である患者に対して毒性ではない任意の担体を含むが、これに限定されるものではない。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、無菌液などを含む。このような担体は、従来の方法により製剤化することができ、適切な用量で対象に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これら組成物は、防腐剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに包含していてもよい。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤を包含することにより確実となり得る。さらなる実施形態は、凍結乾燥形態で包装される、または水性媒体に包装される上述のＥｐＣＡＭ結合タンパク質のうち１つ以上を提供する。
医薬組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ナノ粒子に封入される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はリポソームに結合する。いくつかの例では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はリポソームの表面にコンジュゲートされる。いくつかの例では、ＥｐＣＡＭ結合タンパク質はリポソームのシェル内に封入される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
本明細書に記載されるＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、薬物としての使用を企図されている。投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与により達成される。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類、および医薬組成物が包含する化合物の種類に左右される。投与レジメンは、主治医および他の臨床的因子により決定されることになる。１人の患者に対する用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間、投与経路、治療の種類、健康状態、および併用投与される他の薬物を含む多くの因子に左右される。「有効量」は、疾患の経過と重症度に影響を及ぼし、そのような病状の減少または緩解をもたらすのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定される場合もある。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、週１回の頻度で最大１０ｍｇ／ｋｇの用量を投与される。場合により、用量は、約１ｎｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｎｇ／ｋｇ～約７０ｎｇ／ｋｇに及ぶ。いくつかの実施形態では、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ～約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ～約１５ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ～約２０ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ～約３０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ～約５０ｎｇ／ｋｇ、約３５ｎｇ／ｋｇ～約６０ｎｇ／ｋｇ、約４５ｎｇ／ｋｇ～約７０ｎｇ／ｋｇ、約６５ｎｇ／ｋｇ～約８５ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ～約１μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ～約５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ～約１０μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ～約１５μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ～約２５μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ、約３５μｇ／ｋｇ～約７０μｇ／ｋｇ、約４５μｇ／ｋｇ～約８０μｇ／ｋｇ、約６５μｇ／ｋｇ～約９０μｇ／ｋｇ、約８５μｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０９５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。場合により、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ～約４ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約６ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇ、または約８．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。投与頻度は、いくつかの実施形態では、ほぼ毎日（ａｂｏｕｔ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｄａｉｌｙ）、隔日、１日１回未満、週２回、毎週、７日に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、または月に１回である。場合により、投与頻度は毎週である。場合により、投与頻度は毎週であり、用量は最大１０ｍｇ／ｋｇである。場合により、投与期間は約１日～約４週間以上である。
処置方法および腫瘍増殖低下特性
ある実施形態では、対象におけるＥｐＣＡＭを発現する悪性細胞に関連する疾病を処置する方法も提供され、該方法は、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは該ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質（任意選択で活性な多特異性タンパク質を含む）、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含むＣＡＲまたはＰｒｏＣＡＲ、あるいはこれらを含む医薬組成物を有効量で、必要とする対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記疾病は癌である。
他の態様では、本開示は、ＥｐＣＡＭを発現する悪性細胞を抱える対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法を提供し、該方法は、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは該ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含むＣＡＲ、あるいはこれらを含む医薬組成物を有効量で、必要とする対象に投与する工程を含む。他の態様では、本開示は、対象におけるＥｐＣＡＭを発現する悪性細胞の転移を阻害する方法を提供し、該方法は、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは該ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質、あるいはこれらを含む医薬組成物を有効量で、必要とする対象に投与する工程を含む。他の態様では、本開示は、ＥｐＣＡＭを発現する悪性細胞を抱える対象における腫瘍縮小を誘導する方法を提供し、該方法は、本開示のＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは該ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質、あるいはこれらを含む医薬組成物を有効量で、必要とする対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、第２の治療薬を有効量で投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、生物学的薬物、例えば抗体である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、サイトカイン、ＴＮＦａ（腫瘍壊死因子α）、ＰＡＰ（ホスファチジン酸ホスファターゼ）阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、キナーゼ阻害剤、ＩＤＯ（インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ）阻害剤、グルタミナーゼＧＬＳ１阻害剤、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）－Ｔ細胞またはＴ細胞治療薬、ＴＬＲ（トール様受容体）アゴニスト（例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、あるいは腫瘍ワクチンである。
ある実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞を抱える対象に投与するとｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖を低減させる。腫瘍細胞増殖の低減の測定は、当該技術分野で周知である複数の様々な方法により求めることができる。非限定的な例として、腫瘍寸法の直接測定、切除した腫瘤の測定と対照との比較、解析の向上のために同位体または発光分子（例えばルシフェラーゼ）を使用するか使用しない画像処理技法（例えばＣＴまたはＭＲＩ）を介した測定などが挙げられる。特異的な実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質の投与は、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減し、約１００％の腫瘍増殖の低減は、腫瘍の完全寛解および消失を示す。さらなる実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質の投与は、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を約５０～１００％、約７５～１００％、または約９０％～１００％低減する。さらなる実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質の投与は、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、または約９０％～１００％低減する。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、腫瘍性疾病を処置するために投与される。腫瘍性疾病は、いくつかの実施形態では、良性または悪性、固形腫瘍または他の血液腫瘍形成であり、いくつかの実施形態では、以下を含むがこれらに限定されない群から選択される：副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱癌（有棘細胞癌および移行上皮癌）、割腔障害（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、骨癌（アダマンチノーマ、動脈瘤骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳および脊髄癌、転移性脳腫瘍、三種陰性乳癌を含む乳癌、頸動脈球腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、大腸癌、皮膚良性線維組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨格外粘液様軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ ｏｓｓｉｕｍ）、骨の線維性形成異常、胆嚢および胆管癌、胃癌、胃腸癌（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部癌、視床下部腫瘍（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ）、腸癌、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（腎芽腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、有棘細胞癌、大細胞癌など）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、乳頭状甲状腺癌、上皮小体腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫（ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）、下垂体部腫瘍、前立腺癌、後部ぶどう膜黒色腫、稀な血液障害、転移性腎癌、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部肉腫、扁平上皮癌、胃癌、間質性障害、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、転移性甲状腺癌、および子宮癌（子宮頸癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）。
ある実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、第一選択治療として使用され、癌性疾病の治療歴のない対象に投与される。他の実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、（本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、または他の抗癌剤による）治療歴のある対象、あるいは再発したか以前の処置に対し難治性であると判断された対象を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、腫瘍が再発している対象を処置するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、本明細書に記載されるような多特異性タンパク質、ＣＡＲ、またはＰｒｏＣＡＲを含むものであり、大腸、前立腺、神経内分泌、甲状腺、肺（非小細胞肺癌と小細胞肺癌の両方）、胃、卵巣、子宮内膜、膵臓、胆管、胆嚢癌、食道、乳房、およびすべての腺癌を含むがこれらに限定されない、広範なＥｐＣＡＭの発現および蔓延を伴う癌を処置するために投与される。
いくつかの態様では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、頚部、子宮、食道、大腸、前立腺、膵臓、肺（非小細胞肺と小細胞肺の両方）、甲状腺、癌腫、肉腫、膠芽腫、および様々な頭頸部腫瘤を含むがこれらに限定されない固形腫瘍を含む増殖性障害を処置するために投与される。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、黒色腫の対象に投与される。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、黒色腫を診断、モニタリング、処置、または予防するために使用される。「黒色腫」という用語は、本明細書で使用するとき、原発性黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、真皮外黒色腫、表在拡大型黒色腫、ポリープ状黒色腫、黒色癌、黒色表皮腫、黒色肉腫、黒色腫性インサイツ結節型悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、黒子型黒色腫、黒子型悪性黒色腫、粘膜黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、末端性黒子型黒色腫、軟組織黒色腫、眼黒色腫、侵襲性黒色腫、家族性非定型黒子および黒色腫（ＦＡＭ－Ｍ）症候群、線維硬化性悪性黒色腫、またはブドウ膜黒色腫を含むがこれらに限定されないあらゆる種類の黒色腫を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質またはこれを含む医薬組成物の投与の候補となる適応症は、腫瘍疾患、特に乳癌、結腸癌、前立腺癌、頭頚部癌、皮膚癌、泌尿生殖器の癌、例えば卵巣癌、子宮内膜癌、子宮癌、および腎臓癌、肺癌、胃癌、小腸の癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、唾液腺の癌、ならびに甲状腺の癌などの上皮癌／癌腫である。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質またはこれを含む医薬組成物の投与は、早期固形腫瘍、重度固形腫瘍、または転移性固形腫瘍といった、単細胞の生存により引き起こされる腫瘍の局所的かつ非局所的な再発を特徴とする微小残存病変を適応とする。
選択された態様では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）へと組み込まれ、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲは、乳癌、結腸癌、前立腺癌、頭頚部癌、皮膚癌、泌尿生殖器の癌、例えば卵巣癌、子宮内膜癌、子宮癌、および腎臓癌、肺癌、胃癌、小腸の癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、唾液腺の癌、ならびに甲状腺の癌などの上皮癌／癌腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（例えば扁平細胞非小細胞肺癌または扁平細胞小細胞肺癌）、および大細胞神経内分泌腫瘍（ＬＣＮＥＣ）などの癌の処置に有効なＣＡＲベースの治療薬中で投与される。
キメラ抗原受容体は一般的に、シグナル伝達ドメイン（例えばＴ細胞シグナル伝達またはＴ細胞活性化ドメイン）に結合される抗体の抗原結合ドメインを包含するか含んでいる、人為的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含むＣＡＲは、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合特性を利用することにより、非ＭＨＣ拘束性の形で感作リンパ球（例えばＴ細胞）の特異性および反応性をＥｐＣＡＭ陽性標的細胞へと再配向する能力を有している。非ＭＨＣ拘束性の抗原認識は、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲを発現するＴ細胞に対して、抗原処理と独立して腫瘍形成性ＥｐＣＡＭを認識し、そうすることで主要な腫瘍エスケープ機構を迂回する能力を与える。さらに、Ｔ細胞に発現されると、ＣＡＲは都合の良いことに、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ鎖と二量体を形成しない。
いくつかの実施形態では、開示されたＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、難治性患者（すなわち、一連の初期治療の間、またはこれを完遂した直後に疾患が再発する患者）、感応性患者（すなわち、再発が一次治療後２～３か月より長い患者）、あるいは白金系薬剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）および／またはタキサン（例えばドセタセル、パクリタキセル、ラロタキセル、またはカバジタキセル）に対し忍容性を呈する患者に投与される。別の実施形態では、開示されたＥｐＣＡＭ ＣＡＲ処置は、漿液性卵巣癌腫および乳頭状漿液性卵巣癌腫を含む卵巣癌を処置するのに有効である。
別の実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せが、疾患の初期症状後の腫瘍再発の可能性を低減または排除するための維持療法において使用される。場合により、障害が処置され、初期の腫瘤は、患者が無症状または寛解するように排除、低減、またはその他の方法により改善される。そのときに、対象には、標準の診断手順を用いて疾患の適応がほとんどまたは全くないかどうかに関係なく、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せを薬学的に有効量で１回以上投与される。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せは、毎週、２週ごと、毎月、６週ごと、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごと、または毎年などの一定期間にわたり規則的なスケジュールで投与され、疾患再発の可能性を低下させる。さらに、いくつかの実施形態では、このような処置は、患者応答ならびに臨床および診断パラメータに応じて、数週間、数か月、数年、またはさらに無限の期間にわたり継続される。
また他の実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せは、減量手順後の腫瘍転移を妨げるかその可能性を低下させるために、予防的にまたはアジュバント療法として使用される。本開示で使用するとき、「減量手順」は、腫瘍またはその増殖を排除、低減、処置、または改善する手順、技術、あるいは方法を意味する。典型的な減量手順として、手術、放射線治療（すなわちビーム放射）、化学療法、免疫療法、またはアブレーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、適切な時点で、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せは、腫瘍転移を低減するために臨床、診断、またはセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）手順により示唆されるように投与される。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、その改変を可能にする適切な診断またはモニタリング技法を付随する。
本開示のまた他の実施形態は、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せを、無症状であるが増殖性障害を進行させるリスクのある対象に投与する工程を含む。つまり、いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ、またはＥｐＣＡＭ感作リンパ球、あるいはこれらの任意の組合せは、予防という意味で使用され、診察または試験が行われ１つ以上の注記したリスク因子（例えばゲノム適応症、家族歴、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの試験結果など）があるが新形成を進行させていない患者に投与される。このような場合、当業者は、経験的観察または容認された臨床実践を通じて有効な投与レジメンを決定することができる。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質または組成物は、特定の疾患、障害、または疾病の処置のための薬剤とともに投与される。薬剤として、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、および／または放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、および他の免疫療法に関する治療が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、および／または非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、抗癌剤と組み合わせて投与される。本開示の医薬組成物、投薬形態、およびキットを含む本開示の様々な実施形態に使用可能な抗癌剤の非限定的な例は、以下を含む：アシビシン、アクラルビシン、アコダゾールヒドロクロリド、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテーパ、アズトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレンヒドロクロリド、ジメシル酸ビスナフィド、ビセレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナーナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベティマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシンヒドロクロリド、カルゼルシン、セデフィンガル、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンヒドロクロリド、デシタビン、デクソロマプラチン、デザグアミン、メシル酸デザグアミン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンヒドロクロリド、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドゥアゾマイシン、エダトレキセート、エフロルニチンヒドロクロリド、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、エピルビシンヒドロクロリド、エルブロゾール、エソルビシンヒドロクロリド、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、ファドロゾールヒドロクロリド、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホスストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビンヒドロクロリド、ヒドロキシ尿素、イダルビシンヒドロクロリド、イホスファミド、イルモフォシン、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－ｎ１、インターフェロンα－ｎ３、インターフェロンβ－Ｉａ、インターフェロンγ－Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカンヒドロクロリド、ランレオチドアセテート、レトロゾール、ロイプロリドアセテート、リアロゾールヒドロクロリド、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロンヒドロクロリド、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミンヒドロクロリド、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトジリン、ミトマルシン、ミトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロンヒドロクロリド、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オクシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロクサントロンヒドロクロリド、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、プロカルバジンヒドロクロリド、プロマイシン、ピューロマイシンヒドロクロリド、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴル、サフィンゴルヒドロクロリド、セムスチン、シムトラゼーネ、スパルホスエートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウムヒドロクロリド、スピロマスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェナール、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、トレクサトロンヒドロクロリド、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシビリン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾールヒドロクロリド、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロジン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンゾキジン、硫酸ビンゾキジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンヒドロクロリド。他の抗癌剤の例として、限定されないが以下が挙げられる：２０－ｅｐｉ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５－エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アキルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ－ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバマスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリックス、抗背方化形態形成タンパク質－１（ａｎｔｉ－ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、前立腺癌用の抗アンドロゲン、抗エストロゲン、アンチネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子モジュレータ、細胞死レギュレーター、アプリン酸、ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリマスチン、アクシナスタチン１、アクシナスタチン２、アクシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾチロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータ－アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジンイルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビセレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリポックスＩＬ－２、カペシタビン、カルボキサミド－アミノ－トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ ７００、軟骨由来の阻害剤、カルゼルシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロリン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス－ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン、クラムベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６、クリスナトール、クリプトファイシン８、クリプトファイシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタアントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞傷害性因子、シトスタチン、ダクリズマブ、デシタビン、デヒドロジデミンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ジデミンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ－５－アザシチジン、ジヒドロタキソール，９－、ジオクサマイシン、ジフェニルスピロマスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフール、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチンアナログ、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フラステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）、フルダラビン、フルオロダウノルニシンヒドロクロリド、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテクサピリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ハプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロニック酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）、イルモフォシン、イルモスタット、イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅｓ）、イミキモド、免疫賦活剤ペプチド、インスリン様成長因子Ｉ受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール，４－、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラライドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リュープロレリン、レバミソール、リアロゾール、線形ポリアミンアナログ、親油性二糖類ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメテレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ＨＭＧ－ＣｏＡリダクターゼ阻害剤（限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シンバスタチン、およびアトルバスタチンなど）、ロクソリビン、ラルトテカン、ルテチウムテクサピリン、リソフィリン、細胞溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メタレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、ミトマイシンアナログ、ミトナファイド、ミトトキシン線維芽細胞増殖因子－サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍抑圧遺伝子１ベースの治療薬、マスタード抗癌剤、ミカペロキサイドＢ、ミコバクテリウム細胞壁抽出物、ミラポロン、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスティップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ニーリドロニック酸、中性エンドペプチターゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレータ、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、Ｏ６－ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド
、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘発剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オグサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセルアナログ、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロニック酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリスルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス－アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、タンパク質Ａベースの免疫モジュレータ、プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤、チロシンホスファターゼタンパク質阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビン・ポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ １８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチンアミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ラビジノンＢ１、ラボキシル、サフィンゴル、セイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ １模倣物、セムスチン、セネスセンス由来の阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレータ、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、サルバロル、ソマトメジン結合タンパク質、ソナーミン、スパルホシック酸、スピカマイシンＤ、スピロマスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクワラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分割阻害剤、スティピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノジン、超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、サラディスタ、スラミン、スウェインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロマスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、サリブラスチン、チオコラリン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチン模倣物、チマルファジン、チモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプロプリン、チラパザミン、チタノセン二塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシビリン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、テュロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来の成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクターシステム、赤血球遺伝子治療薬、ベラレゾール、ベラミン、アメリカツリスガラ、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンザルチン、Ｖｉｔａｘｉｎ（登録商標）、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、およびジノスタチンスチマラマー。追加の抗癌剤は、５－フルオロウラシルおよびロイコボリンである。サリドマイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤を利用する方法に使用するとき、これら２つの薬剤は特に有用である。いくつかの実施形態では、本開示のＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ゲムシタビンと併用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、手術前、手術中、または手術後に投与される。
ＥｐＣＡＭ発現の検出方法およびＥｐＣＡＭ関連癌の診断方法
本開示の他の実施形態に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＥｐＣＡＭの発現を検出するためのキットが提供される。このキットは、前述のＥｐＣＡＭ結合タンパク質（例えば、標識された抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメントを含有するＥｐＣＡＭ結合タンパク質）、および標識を検出するための１つ以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、および発色団標識からなる群から選択される。
場合により、ＥｐＣＡＭ発現は生体試料中で検出される。試料は、生検、剖検、および病態標本由来の組織を含むがこれらに限定されない任意の試料であってもよい。生体試料はさらに、組織切片、例えば組織学目的のために採取された凍結切片を含む。生体試料はさらに、血液、血清、血漿、痰、髄液、または尿などの体液を含む。生体試料は一般的に、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物から得られる。
一実施形態では、対象の試料を本明細書に開示されるような抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体と接触させることにより、および試料への単一ドメイン抗体の結合を検出することにより、対象に癌があるかどうかを判定する方法が提供される。試料への抗体の結合が対照試料への抗体の結合と比較して増加している場合、対象に癌があると特定する。
別の実施形態では、癌と診断された対象の試料を本明細書に開示されるような抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体と接触させることにより、および試料への抗体の結合を検出することにより、対象における癌の診断を確認する方法が提供される。試料への抗体の結合が対照試料への抗体の結合と比較して増加している場合、対象における癌の診断を確認する。
開示された方法のいくつかの例では、ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体は直接標識される。いくつかの例では、本方法はさらに、抗ＥｐＣＡＭ単一ドメイン抗体に特異的に結合する第２の抗体を試料と接触させる工程と、第２の抗体の結合を検出する工程とを含む。試料への第２の抗体の結合が対照試料への第２の抗体の結合と比較して増加している場合、対象において癌を検出するか、または対象における癌の診断を確認する。場合により、癌は、神経内分泌癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、有棘細胞癌、膵臓癌、肝内胆管癌、三種陰性乳癌または卵巣癌（上皮卵巣癌腫など）、あるいはＥｐＣＡＭを発現する他の任意の種類の癌である。いくつかの例では、対照試料は、癌がない対象の試料である。特定の例では、試料は血液または組織試料である。
場合により、ＥｐＣＡＭに結合する（例えば特異的に結合する）抗体は、検出可能な標識を用いて直接標識される。別の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する（例えば特異的に結合する）抗体（第１の抗体）は標識されず、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体に結合可能な第２の抗体または他の分子が標識される。第２の抗体は、第１の抗体の特異的な種およびクラスに特異的に結合できるように選択される。例えば、第１の抗体がラマＩｇＧである場合、第２の抗体は抗ラマＩｇＧの場合がある。抗体に結合可能な他の分子は、限定されないがプロテインＡおよびプロテインＧを含み、これらは共に市販で入手可能である。抗体または第２の抗体に適切な標識が上述されており、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性薬剤、および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の非限定的な例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の非限定的な例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の非限定的な例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的で例示的な発光材料はルミノールであり、非限定的で例示的な磁性薬剤はガドリニウムであり、非限定的で例示的な放射性材料には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
代替的な実施形態では、ＥｐＣＡＭは、検出可能な物質で標識されるＥｐＣＡＭ標準、およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する非標識抗体を利用する競合イムノアッセイにより、生体試料中でアッセイすることができる。このアッセイでは、生体試料、標識されたＥｐＣＡＭ標準、およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体が組み合わせられ、非標識抗体に結合される標識されたＥｐＣＡＭ標準の量が求められる。生体試料中のＥｐＣＡＭの量は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体に結合される標識されたＥｐＣＡＭ標準の量とは反比例する。
本明細書に開示されるイムノアッセイと方法は、多数の目的のために使用可能である。一実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体が、細胞培養物中の細胞においてＥｐＣＡＭの産生を検出するために使用されてもよい。別の実施形態では、抗体は、組織試料、血液試料、血清試料などの生体試料中のＥｐＣＡＭの量を検出するために使用することができる。いくつかの例では、ＥｐＣＡＭは細胞表面ＥｐＣＡＭである。他の例では、ＥｐＣＡＭは、可溶性ＥｐＣＡＭ（例えば、細胞培養上清中のＥｐＣＡＭ、あるいは血液試料または血清試料などの体液試料中の可溶性ＥｐＣＡＭ）である。
一実施形態では、血液試料または組織試料などの生体試料中のＥｐＣＡＭを検出するためのキットが提供される。例えば、対象の癌診断を確認するために、生検を行い組織学的検査用の組織試料を取得することができる。代替的に、血液試料を得て、可溶性ＥｐＣＡＭタンパク質またはフラグメントの存在を検出することができる。ポリペプチドを検出するためのキットは一般的に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する、本発明の開示による単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメイン、またはＦａｂなどの抗体フラグメントがキットに含まれる。さらなる実施形態では、抗体は（例えば蛍光標識、放射標識、または酵素標識を用いて）標識される。
一実施形態では、キットは、ＥｐＣＡＭに結合する抗体の使用手段を開示する教材を含む。この教材は、電子形式（コンピューターディスクまたはコンパクトディスクなど）で書き込まれ、視認可能であり（ビデオファイルなど）、あるいはインターネット、ワールドワイドウェブ、イントラネット、または他のネットワーク上で電子ネットワークを通じて提供することができる。キットはまた、キットの設計対象となる特定用途を容易にするための付加的な構成要素を備えてもよい。そのため、例えばキットは、標識を検出する手段（酵素標識用の酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルタセット、第２の抗体などの適切な第２の標識など）を付加的に包含してもよい。キットは、緩衝剤、および特定の方法の実施に慣例的に使用される他の試薬を付加的に備えてもよい。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
一実施形態では、診断キットはイムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、利用される特定のフォーマットに応じて変動する可能性があるが、生体試料中のＥｐＣＡＭを検出する方法は一般的に、免疫学的反応条件下でＥｐＣＡＭポリペプチドに特異的に反応する抗体に生体試料を接触させる工程を含む。抗体は、免疫複合体を形成するために免疫学的反応条件下で特異的に結合することを可能とされ、免疫複合体（結合抗体）の存在が直接または間接的に検出される。
細胞表面マーカーの有無を判定する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含むがこれらに限定されない他の化合物へとコンジュゲートされる場合がある。抗体はまた、限定されないが放射免疫定量法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学アッセイなどのイムノアッセイに利用することができる。抗体はまた、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）に使用可能である。ＦＡＣＳは、細胞を仕分けるまたは選別するために、特により洗練された検出水準で、複数の色チャネル、低角度かつ鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用する。米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい。本明細書に開示されるようなＥＰＣＡＭに結合する単一ドメイン抗体のいずれかは、これらのアッセイに使用可能である。ゆえに抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学的検査、ウエスタンブロット、または免疫沈降法を含むがこれらに限定されない従来のイムノアッセイに使用することができる。
実施例１：ＥｐＣＡＭ結合ドメインの同定のためのファージディスプレイライブラリのスクリーニング
Ｅｘｐｉ２９３細胞中に発現する精製ＥｐＣＡＭタンパク質により、ラマを免疫化した。重可変抗体ドメインの発現に対するファージディスプレイライブラリを、循環Ｂ細胞から構築した。ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，ｄｅ Ｇｅｕｓ，Ｓｔｏｋ，Ｂｏｓ，ｖａｎ Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ｖｅｒｒｉｐｓ，ａｎｄ Ｆｒｅｎｋｅｎ．２０００．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０：１８５－１９５を参照されたい。大腸菌中で抗ＥｐＣＡＭタンパク質を発現させ、ペリプラズム抽出物を調整することにより、ファージクローンをＥｐＣＡＭへの結合に対してスクリーニングし、比色定量ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質をヒトおよびカニクイザルＥｐＣＡＭ結合活性に対してスクリーニングした。（表２に示すように）ヒトおよび／またはカニクイザルＥｐＣＡＭタンパク質を伴う対照に関するＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてシグナルを生成した３８個の固有の重鎖のみの配列を、同定した（配列番号１～３８）。これら重可変ドメインに対するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ配列番号３９～７６、配列番号７７～１１４、および配列番号１１５～１５２である。
Figure 2022533957000005
実施例２：融合タンパク質およびＴ細胞依存性細胞傷害アッセイへのＥｐＣＡＭ結合重鎖の単一ドメイン抗体のみの取込み
実施例１から選択した抗ＥｐＣＡＭ重鎖の単一ドメイン抗体のみを、組換えタンパク質の発現のためにＤＮＡ構築物へとクローニングした。これら発現構築物はすべて、シグナルペプチドをコードした。一組の抗ＥｐＣＡＭ構築物（配列番号１５３～１７９）を、成熟分泌融合タンパク質のＮ末端上でヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメイン、続いてラマ抗ＥｐＣＡＭドメイン、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳにより連結される２つのドメイン、およびＣ末端上でＨＨＨＨＨＨＨを伴う融合タンパク質を発現するようにデザインした。もう一組の抗ＥｐＣＡＭ構築物（配列番号１８０～１２０６）を、成熟分泌融合タンパク質のＮ末端上でラマ抗ＥｐＣＡＭドメイン、続いてヒト化抗ＣＤ３－ｓｃＦｖドメイン、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳにより連結される２つのドメイン、およびＣ末端上でＨＨＨＨＨＨＨを伴う融合タンパク質を発現するようにデザインした。
これら抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３（Ｎ末端からＣ末端まで）または抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭ（Ｎ末端からＣ末端まで）融合タンパク質構築物を、Ｅｘｐｉ２９３細胞へと形質移入した。ストレプトアビジンを用いるＯｃｔｅｔ装置を使用して、形質移入したＥｘｐｉ２９３細胞からの条件培地中の抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質の量を定量し、標準として抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３タンパク質と同等の分子量の抗ＣＤ３融合タンパク質を使用してビオチン化ＣＤ３－Ｆｃ融合タンパク質を充填させた。
上述の条件培地を、Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｎａｚａｒｉａｎ ＡＡ，Ａｒｃｈｉｂｅｑｕｅ ＩＬ，Ｎｇｕｙｅｎ ＹＨ，Ｗａｎｇ Ｐ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ ＡＭ，Ｐｏｗｅｒｓ ＤＡ．２０１５．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９－２７を参照されたい。本アッセイでは、ＥｐＣＡＭを発現するルシフェラーゼ標識ＮＣＩ－Ｈ５０８細胞を精製ヒトＴ細胞と組み合わせて、抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質または抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭの滴定を行った。融合タンパク質がＴ細胞にＮＣＩ－Ｈ５０８細胞を死滅させるよう導く場合には、実験開始後４８時間で実施されるルシフェラーゼアッセイでのシグナルは減少すると仮定した。図１～４では、ＴＤＣＣデータをグラフ形式で提供する。
ＴＤＣＣアッセイからのＥＣ５０値を表３（配列番号１５３～１７９に関するＥＣ５０データを列記するもの）および表４（配列番号１８０～２０６に関するＥＣ５０データを列記するもの）に列記する。最も強力な分子（ＥＰＬ１３）のＥＣ５０値は約１．６ｐＭであった。抗ＥｐＣＡＭ結合タンパク質の一部は、抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭ構成に存在するときのみ活性であった。１つの抗ＥＰＣＡＭ配列であるＥＰＬ３４は、抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３構成においてのみ活性であった。ＴＤＣＣアッセイの陰性対照は抗ＧＦＰ／抗ＣＤ３タンパク質であり、このタンパク質は、Ｔ細胞にＮＣＩ－Ｈ５０８細胞を死滅させるよう導かなかった（データは示さず）。
Figure 2022533957000006
Figure 2022533957000007
既知の濃度の抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭ融合タンパク質を伴う条件培地を用いて、ヒトおよびカニクイザルのＥｐＣＡＭタンパク質に対する融合タンパク質の結合親和性を測定した。ストレプトアビジン先端を備えたＯｃｔｅｔ装置に、ビオチン化ヒトまたはカニクイザルＥｐＣＡＭタンパク質を充填し、ビオチン化ＥｐＣＡＭタンパク質への抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質または抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭ融合タンパク質の結合のオンレートとオフレートを測定することにより、ＫＤ値を算出した。単一の５０ｎＭ濃度の抗ＥＰＣＡＭ／抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／抗ＥｐＣＡＭ融合タンパク質を使用してＫＤ測定を行い、これによりランク付けの効力が可能になった。測定した相対親和性を表５に列記する。すべての融合タンパク質がカニクイザルＥｐＣＡＭに結合し、ＫＤ値は１．６～５６ｎＭであった。融合タンパク質のすべてではないが大半がヒトＥｐＣＡＭに結合したことを測定し、ＫＤ値は０．８～７４ｎＭであった。
Figure 2022533957000008
実施例３：ＥｐＣＡＭ結合重鎖の単一ドメイン抗体のみのヒト化およびＴ細胞依存性細胞傷害アッセイ
そのＣＤＲ配列をヒト生殖系列配列抗体の上にグラフトし、一方で一部のラマフレームワーク配列を保持して抗体が確実に活性を失わないようにすることにより、実施例１で特定したラマ抗ＥｐＣＡＭ抗体配列のうち３つをヒト化した（配列番号２０７～２０９）。
実施例２に記載したように、これらの配列を、Ｅｘｐｉ２９３細胞中の抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質（配列番号２１０～２１２）の発現のために発現構築物へとクローニングした。
条件培地中に存在する抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質の量を、実施例２に記載するように定量した。ヒト、カニクイザル、およびマウスのＥｐＣＡＭに対するこれらヒト化タンパク質の親和性を、実施例２に記載するように測定した。これらの測定から算出した相対的ＫＤ値を表６に列記する。３つすべての配列がヒトおよびカニクイザルＥｐＣＡＭに結合し、相対的ＫＤ値は約０．３～約１８ｎＭであった。これら配列のうち２つはさらにマウスＥｐＣＡＭに結合し、ＫＤ値は約１．４～約１．８ｎＭであった。
Figure 2022533957000009
条件培地中に存在する抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３融合タンパク質のＴ細胞死滅の可能性を、実施例２に記載するように評価した。結果を表７と図５に提供する。
Figure 2022533957000010
実施例４：異種移植片腫瘍モデル
本開示のＥｐＣＡＭを標的とする融合タンパク質（例えば、抗ＥｐＣＡＭ重鎖の単一ドメイン抗体のみ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、および抗アルブミンドメインを含む三重特異性タンパク質である融合タンパク質）を、異種移植片モデルを対象に評価する。ｉｎ ｖｉｖｏで例示的なＥｐＣＡＭを標的とする融合タンパク質の有効性を求めるために、複数の異種移植片腫瘍モデルを使用する。異種移植片腫瘍試験に使用する一般的な腫瘍細胞株の例として、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞、ＤＵ－１４５（前立腺）細胞、ＭＣＦ－７（乳房）細胞、Ｃｏｌｏ２０５（結腸）細胞、３Ｔ３／］ＧＦ－ＩＲ（マウス線維芽細胞）細胞、ＮＣＩ Ｈ４４１細胞、ＨＥＰ Ｇ２（幹細胞）細胞、ＭＤＡ ＭＢ ２３１（乳房）細胞、ＨＴ－２９（結腸）細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５ｓ（乳房）細胞、Ｕ２６６細胞、ＳＨ－ＳＹＳＹ細胞、Ｓｋ－Ｍｅｌ－２細胞、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭ１８２２６、およびＡ４３１細胞が挙げられる。免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し亜致死的に照射し（２Ｇｙ）、１Ｘ１０６腫瘍細胞（例えばＮＣＩ Ｈ４４１細胞）を右背側脇腹に皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したとき、マウスを３つの治療群に割り付ける。群２と３には、１．５ｘ１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。三日後、群３の動物に、続いて例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性抗原結合タンパク質を投与する。群１と２には溶媒のみを投与する。体重と腫瘍体積を、例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の投与後少なくとも５日後から開始して３０日間判定する。
例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質で処置したマウスは、それぞれのビヒクルで処置した対照群と比較して、腫瘍増殖が統計的に有意に遅延することが予想される。
実施例５：卵巣癌患者に対する実施例４のＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性抗原結合タンパク質の投与のための概念実証臨床試験計画書
本試験は、上皮性卵巣癌に対する処置として本開示の例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性抗原結合タンパク質を試験するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
試験アウトカム：
主要アウトカム：例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の最大耐用量。
副次的アウトカム：例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ応答が臨床応答と関連しているかどうかを求める。
第Ｉ相
最大耐用量（ＭＴＤ）は本試験の第Ｉ相項目において求める。
１．１ 最大耐用量（ＭＴＤ）は本試験の第Ｉ相項目において求める。
１．２ 選択基準を満たす患者を、先の実施例のＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質に対する試験に登録する。
１．３ 目標は、参加者に重度または管理不能な副作用を生じさせることなく安全に投与することができる先の実施例のＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の最高用量を特定することである。投与する用量は、以前に試験に登録した参加者の数、およびその用量が忍容される程度に左右される。すべての参加者が同じ用量の投与を受けるわけではない。
第ＩＩ相
２．１ その後の第ＩＩ相項目は、例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の治療薬を用いた治療が少なくとも２０％の奏効率をもたらすかどうかを目標として、ＭＴＤで処置を行う。
第ＩＩ相の主要アウトカム－－－ＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質の治療により、患者の少なくとも２０％が臨床応答（芽細胞応答（ｂｌａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、軽度応答、部分応答、または完全応答）を達成するかどうかを求める。
適格性：
・組織学的または細胞学的に上皮性卵巣癌を確認した患者。過去にわずか１つの白金ベースのレジメン療法による第一線の白金ベースの化学療法が失敗した後、再発上皮性卵巣癌または疾患進行の可能性がある患者。
・骨髄機能、腎機能、肝機能、および心エコー検査の検査値が十分な患者。
第ＩＩＩ相
３．１ 後の第ＩＩＩ相項目は、例示的なＥｐＣＡＭを標的とする三重特異性タンパク質により実施する。ここでは、応答率（ＲＲ）、患者記録アウトカム（ＰＲＯ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、無増悪生存期間、無憎悪期間（ＴＩＰ）、全生存、健康に関連する生活の質の評価、全生存参加者の数、応答期間、応答までの期間、応答参加者の数、および腫瘍増殖までの期間などの副次的評価項目を評価する。
実施例６：例示的な多価標的結合タンパク質の構築および試験
構築物
図６：本明細書で提供するＥｐＣＡＭバインダ配列を使用して、以下のＰｒｏＣＡＲ構築物を作製した。抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８５）を含む例示的な構築物。抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８６）を含む例示的な構築物。抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８７）を含む例示的な構築物。抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８８）を含む例示的な構築物。抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、プロテアーゼ切断部位３、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４８９）を含む例示的な構築物。抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ、プロテアーゼ切断部位３、抗ヒトＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４９０）を含む例示的な構築物。抗ＧＦＰ ｓｄＡｂ、ＦＬＡＧエピトープ、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン（配列番号４９１）を含む例示的な構築物。
ＥｐＣＡＭマスク１はＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性を妨げる
健康なドナーから単離した３００，０００個の一次ヒトＴ細胞に、図６に示した構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。次いでこの細胞を、示した二次抗体とともに抗ＦＬＡＧ抗体およびＥｐＣＡＭ－Ｆｃにより染色した。データをフローサイトメトリーにより解析した。図７は、抗ＦＬＡＧ染色に基づき低（図７Ａ）、中程度（図７Ｂ）、または高（図７Ｃ）ＣＡＲ発現にグループ分けされたＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７染色のヒストグラムを提供する。
このデータは、ＥｐＣＡＭマスク１がＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性を妨げる有効性を実証する。
ＥｐＣＡＭマスク２はＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性を妨げる
健康なドナーから単離した３００，０００個の一次ヒトＴ細胞に、図２１に示した構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。次いでこの細胞を、示した二次抗体とともに抗ＦＬＡＧ抗体およびＥｐＣＡＭ－Ｆｃにより染色した。データをフローサイトメトリーにより解析した。
図８は、ＰｒｏＣＡＲ ＥｐＣＡＭ結合活性を妨げる際のＥｐＣＡＭマスク２の有効性を実証する抗ＦＬＡＧ染色に基づき、低（図８Ａ）、中程度（図８Ｂ）、または高（図８Ｃ）ＣＡＲ発現へとグループ分けされた図６のＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７染色のヒストグラムを提供する。
抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０のマスキング
健康なドナーから単離した３００，０００の一次ヒトＴ細胞に、図１の示された構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。続いてこの細胞を、ルシフェラーゼを安定して発現するＥｐＣＡＭ発現癌細胞との種々の比（ＣＡＲ－Ｔ：標的細胞）で共培養した。７２時間後に癌細胞生存率の代わりとしてルシフェラーゼ活性を読み取り、抗ＧＦＰ対照ＣＡＲ－Ｔ細胞であるＣ１０８１に対して正常化した。
図９で提供するデータは、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０のマスキングを実証する。配列番号４８５が「ネイキッド」ＣＡＲであり、すなわち抗ＡＬＢドメインがない。抗ＡＬＢドメイン（配列番号４８６）の付加は、細胞死滅活性に小さな影響を及ぼす。抗ＡＬＢドメインのＣＣ’ループへのマスクの付加は、ＥｐＣＡＭ結合の特異的遮断に起因する細胞死滅活性に大きな影響を及ぼす。
抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０のＨＳＡによる立体遮断
健康なドナーから単離した３００，０００の一次ヒトＴ細胞に、図６の示された構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。続いてこの細胞を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の有無にかかわらずルシフェラーゼを安定して発現するＥｐＣＡＭ発現癌細胞との種々の比（ＣＡＲ－Ｔ：標的細胞）で共培養した。７２時間後に癌細胞生存率の代わりとしてルシフェラーゼ活性を読み取り、抗ＧＦＰ対照ＣＡＲ－Ｔ細胞であるＣ１０８１に対して正常化した。
図１０で提供するデータは、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ Ｈ９０のＨＳＡによる立体遮断を実証する。
実施例７：ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＣＡＲプロテアーゼ部位依存性細胞死滅
健康なドナーから単離したＣＤ４／ＣＤ８陽性Ｔ細胞を示された構築物を発現するレンチウイルスに感染させることにより、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成した。図６は、使用した構築物を伴う略図を示す。Ｆｃでタグ付けしたＥｐＣＡＭ細胞外ドメイン（ＥＣ Ｄ）により細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、未結合のＦｃでタグ付けしたＥｐＣＡＭ ＥＳＤを取り除いた。ヒトＦｃを認識するＤｙＬｉｇｈｔ６５０にコンジュゲートされる二次抗体により細胞をインキュベートした。細胞への二次抗体の結合をフローサイトメトリーにより測定した。
図１１は、ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＣＡＲマスク２細胞死滅活性のプロテアーゼ部位依存性活性化を実証する。
実施例８：ＥｐＣＡＭマスク１ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化
健康なドナーから単離した３００，０００個の一次ヒトＴ細胞を、図１の示された構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、 抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。続いてこの細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、次いでＰＢＳまたは組換えＵＰＡプロテアーゼ４００ｎＭを含有するＰＢＳを用いて室温で１時間処理し、抗マウスＢＶ４２１および抗ヒトＦｃ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体とともに抗ＦＬＡＧ抗体およびＥｐＣＡＭ－Ｆｃで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
抗ＦＬＡＧ染色に基づき低（図１２Ａ）、中程度（図１２Ｂ）、または高（図１２Ｃ）ＣＡＲ発現にグループ分けされたＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ染色のヒストグラム。これらの結果は、ＥｐＣＡＭマスク１ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化を実証する。
実施例９：ＥｐＣＡＭマスク２ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化
健康なドナーから単離した３００，０００個の一次ヒトＴ細胞を、図１の示された構築物から作製したレンチウイルス上清１ｍＬを感染させ、 抗ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。続いてこの細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、次いでＰＢＳまたは組換えＵＰＡプロテアーゼ４００ｎＭを含有するＰＢＳを用いて室温で１時間処理し、抗マウスＢＶ４２１および抗ヒトＦｃ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体とともに抗ＦＬＡＧ抗体およびＥｐＣＡＭ－Ｆｃで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
抗ＦＬＡＧ染色に基づき低（図１３Ａ）、中程度（図１３Ｂ）、または高（図１３Ｃ）ＣＡＲ発現にグループ分けされたＣＡＲ－Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ－Ｆｃ染色のヒストグラム。これらの結果は、ＥｐＣＡＭマスク２ ＰｒｏＣＡＲ抗原結合活性のプロテアーゼ活性化を実証する。
実施例１０：例示的なＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子により付与される、マウスにおける忍容性改善の実証
本試験では、例示的なＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子の忍容性を評価した。腫瘍のない７週齢でメスのＮＳＧマウスに、試験の開始時、すなわち０日目に２×１０７の拡大ヒトＴ細胞を腹腔内注射した。２日目、マウスを様々な群に分け、リンカー配列Ｌ０４０を含有する例示的なＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（配列番号４９４）、ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子（配列番号４９２）、切断不能リンカーを含有するＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（ＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（ＮＣＬＶ）（配列番号４９５）、および対照としてＧＦＰ ＴｒｉＴＡＣ分子（配列番号４９３）を様々な濃度で投与することにより、処置を開始した。これらの分子は１０日間かけて１日１回、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。２日目からマウスの体重を毎日記録した。図１４Ａ～１４Ｃに示すように、切断不能リンカーを含有するＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子（ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ （ＮＣＬＶ））とＧＰＦ ＴｒｉＴＡＣ（陰性対照として使用）は、１ｍｇ／ｋｇの最高用量であってもマウスにおいて忍容性が十分に優れていた。Ｌ０４０のリンカー配列を含有するＥｐＣＡＭ標的ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子は、１ｍｇ／ｋｇの用量で忍容性が十分に優れていたが、ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣは０．１ｍｇ／ｋｇで忍容性が優れていた。このため、Ｌ０４０リンカー配列を含有するＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣと比較して少なくとも約１０倍の忍容性改善をマウスに与えたことを観察した。
実施例１１：ヒト、カニクイザル、またはマウスＥｐＣＡＭに対するＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質の親和性
ヒト、カニクイザル、またはマウスＥｐＣＡＭに対する種々の例示的なＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質の親和性を、結合アッセイにおいて測定し、試験されたＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質とヒトＥｐＣＡＭとの相互作用に関する結合動力学にも着目した。結合動力学は図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃに示す。
例示的なＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３（配列番号２０７）、Ｈ９０（配列番号２０９）、またはＨ９０．２（配列番号４９７）を包含する、ＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質に関する親和性の概要を、表８に提供する。
Figure 2022533957000011
実施例１２：ＴｒｉＴＡＣフォーマット、切断不能プロドラッグフォーマット、または活性薬物フォーマットでの例示的なＥｐＣＡＭを標的とするタンパク質のＴ細胞係合能および特異性
本明細書に記載されるような例示的なＥｐＣＡＭ結合ドメイン、Ｈ１３（配列番号２０７）、Ｈ９０（配列番号２０９）、またはＨ９０．２（配列番号４９７）を包含する３つの例示的なヒト化ＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、ＥｐＣＡＭを発現する結腸癌細胞ＨＣ１１６を用いて、Ｔ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイ（Ｎａｚａｒｉａｎ ＡＡ，Ａｒｃｈｉｂｅｑｕｅ ＩＬ，Ｎｇｕｙｅｎ ＹＨ，Ｗａｎｇ Ｐ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ ＡＭ，Ｐｏｗｅｒｓ ＤＡ．２０１５．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９－２７を参照）にて試験した。Ｈ９０．２およびＨ１３８．２のＥｐＣＡＭ結合ドメイン配列は、それぞれＥｐＣＡＭ結合ドメイン配列Ｈ９０およびＨ１３８にかなり類似していたが、フレームワーク４の第１のアミノ酸が修飾されていた（配列番号 ５８２を参照）。具体的に、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン配列Ｈ９０およびＨ１３８は、Ａｓｎ脱アミド化を取り除くようにＷＧへと改質したＡｓｎ脱アミド化（ＮＧ）部位を包含しており、タンパク質安定性の面での改善（薬物の製造可能性を改善するのに都合の良い可能性が高い）が企図された。
結果を図１６Ａ（Ｈ１３）、１６Ｂ（Ｈ９０．２）、および１６Ｃ（Ｈ１３８．２）に示す。試験したＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン（Ｈ１３、Ｈ９０．２、またはＨ１３８．２）、アルブミン結合ドメイン（抗ＡＬＢ）、およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３）を包含しており、抗ＡＬＢドメインはさらに、切断不能リンカー（ＮＣＬＶ）（切断不能プロドラッグフォーマット）、または切断不能リンカーとマスキングドメイン（ＡＣＴ）を含んでいた。活性化ＥｐＣＡＭ結合タンパク質（ＣＴ）（活性薬物フォーマット）は、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン（Ｈ１３、Ｈ９０．２、またはＨ１３８．２）およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３）を包含していた。
本アッセイでは、ルシフェラーゼで標識したＨＣＴ１１６細胞を精製ヒトＴ細胞と組み合わせ、上述のような例示的なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の滴定（ＮＣＬＶ、ＣＴ、ＡＣＴ）にさらした。ＥｐＣＡＭ結合タンパク質が、Ｔ細胞にＥｐＣＡＭを発現するＨＣＴ１１６細胞を死滅させるよう導いた場合、これらの細胞の生存率は、実験開始後４８時間でルシフェラーゼアッセイを実行することにより求めると低下すると仮定した。ＥｐＣＡＭ陰性ＮＣＩ－Ｈ９２９骨髄腫細胞を用いて同様のアッセイをさらに実施し、図１７Ａ、１７Ｂ、および１７Ｃに示すように、試験されたどのタンパク質も、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を死滅させる際にＴ細胞に係合できなかった。
図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、ＨＣＴ１１６細胞を用いたアッセイからの代表的なＴＤＣＣデータを示す。ＴＤＣＣアッセイからのＥＣ５０値を表９に列記する。プロットで確認され、かつＥＣ５０値が示すように、３つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン（Ｈ１３、Ｈ９０．２、またはＨ１３８．２）のいずれかを包含する結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭを発現するＨＣＴ１１６大腸癌細胞におけるＴ細胞エンゲージャーとして機能した。さらに、切断可能なリンカーおよびマスキングドメイン（ＡＣＴ）を伴う結合タンパク質では、ＥＣ５０ 値は、切断不能リンカー（ＮＣＬＶ）（切断不能プロドラッグフォーマット）を伴う結合タンパク質と比較して約７～１０倍（Ｈ１３およびＨ１３８．２）低く、一方で活性薬物（ＣＴ）では、ＥＣ５０値は、ＮＣＬＶよりも最大で約３５０倍（Ｈ１３８．２）低かった。Ｈ１３ ＥｐＣＡＭ結合ドメインを包含する活性薬物のＥＣ５０値は約３７ｐＭであり、Ｈ９０．２結合ドメインでは約１１ｐＭであり、Ｈ１３８．２結合ドメインでは約１０７ｐＭであった。
Figure 2022533957000012
試験ＥｐＣＡＭ結合タンパク質のＥｐＣＡＭ特異的細胞死滅能をさらに評価するために、上述のようなＴＤＣＣアッセイを、ＥｐＣＡＭを発現するＨＣＴ１１６結腸癌細胞（野生型）、またはＥｐＣＡＭを発現しないＨＣＴ１１６（ＥｐＣＡＭ－ＫＯ）細胞を用いて行った。ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２を包含するＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣタンパク質を本アッセイにおいて試験し、対照タンパク質はＧＦＰ ＴｒｉＴＡＣタンパク質およびＥＧＦＲ ＴｒｉＴＡＣタンパク質とした。本アッセイの結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示し、ＥＣ５０値を表１０に列記する。
ＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、ＥｐＣＡＭの発現に基づき、細胞の差動的な死滅を示した。図１９に示すように、フローサイトメトリーにより結合の特異性も確認した。フローサイトメトリーアッセイでは、細胞をＣＴフォーマット（活性薬物）で３００ｎＭのＨ１３またはＨ９０．２により染色し、１１Ｄ３－ＡＦ６５０抗体により検出した。
Figure 2022533957000013
さらにＴＤＣＣアッセイでは、他の様々な細胞株を用いて、ＣＴフォーマット（Ｈ１３またはＨ９０．２いずれかのＥｐＣＡＭ結合ドメインと抗ＣＤ３ドメインとを包含する活性薬物）あるいは切断不能プロドラッグフォーマット（Ｈ１３またはＨ９０．２いずれかと抗ＣＤ３と抗切断不能リンカーＮＣＬＶを伴う抗ＨＳＡとを包含）にある２つのＥｐＣＡＭ結合タンパク質の細胞死滅能を比較した。結果を表１１に提供する。図２０のプロットは、ＳＫＢＲ３（ヒト乳癌細胞）を用いたＴＤＣＣアッセイのためのものである。
ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を包含する活性薬物は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＤＣＣアッセイにおいてＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ９０．２を包含する活性薬物より約３倍強力であったことを観察した。これらのタンパク質は、その活性薬物フォーマットと切断不能プロドラッグフォーマット（ＣＴ対ＮＣＬＶ）とを比較したとき、複数のＥｐＣＡＭ発現細胞を用いたＴＤＣＣアッセイにおいて同様の４００～６００倍のマスキングを示した。切断不能プロドラッグフォーマットにより達成されるマスキング効果を実証する代表的なプロットを、図２１Ａおよび２１Ｂに示す。
Figure 2022533957000014
Ｈ１３を包含するＥｐＣＡＭ結合タンパク質ＮＣＬＶ（切断不能プロドラッグ）、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（切断可能なリンカーＬ０４０を伴う）、および活性薬物ＣＴを比較するために、さらなるＴＤＣＣアッセイを、細胞株（ＣＡＰＡＮ２、ＤＭＳ５３、ＨｅｐＧ２、ＫＭＲＣ３、ＭＤＡＰＣＡ２ｂ、およびＳＫＢＥ３を含む）を用いて行った。ＥＣ５０値を表１２に提供する。代表的なプロットは、図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、および２２Ｈに示す。
Figure 2022533957000015
Figure 2022533957000016
実施例１３：ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣと比較した場合のＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣの抗腫瘍有効性と忍容性
ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を包含するＥｐＣＡＭ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、確立されたＨＴ２９大腸腫瘍モデルを対象に評価し、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３を包含するＥｐＣＡＭ ＴｒｉＴＡＣと比較した。
５日目、腫瘍移植後、マウスに対し、試験ＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣを０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ、試験ＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＴｒｉＴＡＣを０．３ｍｇ／ｋｇ、または同等用量で対照ＴｒｉＴＡＣのいずれかを注射し、腫瘍体積を約２０日間測定した。図２３Ａおよび２３Ｂに示すように、ＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣは、マウス腫瘍モデルにおいてＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＴｒｉＴＡＣよりも有効であった。
別の試験では、カニクイザルに対し、同等用量（３０μ ｇ／ｋｇ）のＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣまたはＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＴｒｉＴＡＣを注射し、サイトカインレベルを測定した（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０）。結果を図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、および２４Ｄに示す。これらの図では、ＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＰｒｏＴｒｉＴＡＣが、３０μ ｇ／ｋｇでの単回投与ｃｙｎｏ試験においてＥｐＣＡＭ Ｈ１３ ＴｒｉＴＡＣと比較してサイトカイン産生の著しい低下を示したことを認める。
実施例１４：カニクイザルにおける例示的なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の薬物動態特性
ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ１３またはＨ９０．２（ＴｒｉＴＡＣフォーマット、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ ＮＣＬＶフォーマット、および切断可能なリンカーＬ０４０を伴うＰｒｏＴｒｉＴＡＣフォーマットにある）を包含する結合タンパク質をカニクイザルに投与し、その薬物動態特性を評価した。図２５Ａおよび図２５Ｂは、カニクイザルにおける試験されたタンパク質の経時的な血漿中濃度を示す。加えて、表１３は薬物動態パラメータを要約する。
Figure 2022533957000017
実施例１５：ＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣ／ＴｒｉＴＡＣタンパク質の治療指標（有効性および毒性）の評価
本試験では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインＨ９０を包含する、ＥｐＣＡＭを標的とするＴｒｉＴＡＣタンパク質またはＥｐＣＡＭを標的とするＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質、あるいは対照ＴｒｉＴＡＣタンパク質の様々な用量を、ＬｏＶｏ腫瘍モデル（結腸癌モデル）を抱えるマウスに注射した。結果を図２９Ａ～２９Ｋに示す。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣおよびＴｒｉＴＡＣの安全性と忍容性も試験し、その結果を図３０Ａ～３０Ｅに示す。生存率を図３０Ａ～３０Ｂに示し、臨床化学パラメータ（ＡＬＴ、ＡＳＴ、および総ビリルビン）を図３０Ｃ、３０Ｄ、および３０Ｅに示す。全体的な結果は、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣフォーマットの忍容性は、同じＬｏＶｏ腫瘍を抱えるマウスにおいてＴｒｉＴＡＣフォーマットよりも約３０倍優れていたことを実証している。この観察を病理組織学的試験によりさらに裏付け、その概要を３１と表１４に提供する。
したがって、この試験は、同じ動物における薬物の有効性および安全性に基づき、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣフォーマットでは約１０倍の治療指数の拡大を実証した。
Figure 2022533957000018
本発明の好ましい実施形態を本明細書中で示しかつ記載してきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案は本発明の実施に利用可能であることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法と構造は、それにより包含されることが、意図されている。
Figure 2022533957000019
Figure 2022533957000020
Figure 2022533957000021
Figure 2022533957000022
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Figure 2022533957000047
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Claims (155)

  1. 相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、ＥｐＣＡＭ結合ドメインであって、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  2. ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列を含む、請求項１に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  3. 配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  4. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは多特異性タンパク質の一部である、請求項１－３のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  5. 多特異性タンパク質はＣＤ３結合ドメインをさらに含む、請求項４に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  6. 多特異性タンパク質は活性薬フォーマットを含む、請求項５に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  7. 多特異性タンパク質はバルク血清タンパク質結合ドメインをさらに含む、請求項４または５に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  8. バルク血清タンパク質は血清アルブミンタンパク質を含む、請求項７に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  9. 血清アルブミンタンパク質はヒト血清アルブミンタンパク質を含む、請求項８に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  10. バルク血清タンパク質結合ドメインは、配列番号３７８に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項７－９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  11. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３７９に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項４－９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  12. 多特異性タンパク質は、配列番号４９２に記載の配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項４－９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  13. バルク血清タンパク質結合ドメインは、リンカーを含む結合部分と、マスキング部分とを含み、ここで、マスキング部分は、それぞれの標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインまたはＣＤ３結合ドメインの結合をマスキングすることができる、請求項７－９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  14. 多特異性タンパク質は切断不可能なプロドラッグフォーマットを含む、請求項７－９および１３のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  15. マスキング部分は、配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列、または配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１３または１４に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  16. リンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０７、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０７、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１３－１５のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  17. バルク血清タンパク質結合ドメインは、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１３－１６のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  18. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項５－９および１３－１７のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  19. 多特異性タンパク質は、配列番号４９５、４９８－５０２、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項７－９および１３－１８のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  20. 多特異性タンパク質は、配列番号４９５および５０２からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項７－９および１３－１９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  21. 多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項７－９および１３－２０のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  22. 活性薬は、配列番号１５３－１７９、１８０－２０６、２１０－２１２、４９４、５７１、および５７４からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項６に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  23. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または条件付きで活性化可能なキメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）の一部であり、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１－３のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  24. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＰｒｏＣＡＲの一部であり、ＰｒｏＣＡＲは、（ａ）非ＣＤＲループと切断可能なリンカーを含む結合部分、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、結合部分は、その標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングすることができる、請求項２３に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  25. 結合部分は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含む、請求項２４に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  26. ＣＤＲループは、バルク血清タンパク質に特異的な結合部位を提供する、請求項２５に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  27. バルク血清タンパク質は、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、五量体ＩｇＭのうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  28. バルク血清タンパク質は血清アルブミンを含む、請求項２７に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  29. 血清アルブミンはヒト血清アルブミンである、請求項２８に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  30. ＰｒｏＣＡＲは、共刺激ドメインをさらに含み、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに、少なくとも１つであるが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択されたタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである、請求項２３－２９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  31. 少なくとも１つであるが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはコードされたＴ細胞受容体融合タンパク質に対するリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、請求項３０に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  32. 膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的フラグメント、および少なくとも１つであるが２０以下の修飾を有するそれらのアミノ酸配列から選択されたタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項２３－３１のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  33. 細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３アルファ、ＣＤ３ベータ、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項２３－３２のいずれかに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  34. ＥｐＣＡＭ結合ドメインはＰｒｏＣＡＲの一部であり、および、ＰｒｏＣＡＲは、配列番号４８５－４９１からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項２３－３３のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  35. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項１－３４のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン、または前記ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  36. 対象はヒトである、請求項３５に記載の方法。
  37. 単一のポリペプチド鎖を含む条件付きで活性なキメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）であって、前記キメラ抗原受容体（ＰｒｏＣＡＲ）は、
    （ａ）非ＣＤＲループおよび切断可能なリンカーを含む結合部分、
    （ｂ）ＥｐＣＡＭ結合ドメインであって、ここで、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、および、ＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、ＥｐＣＡＭ結合ドメイン、
    （ｃ）膜貫通ドメイン、および、
    （ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
    結合部分は、その標的に対するＥｐＣＡＭ結合ドメインの結合をマスキングすることができる、条件付きで活性なキメラ抗原受容体。
  38. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項３７に記載の条件付きで活性なキメラ抗原受容体。
  39. 非ＣＤＲループを含む結合部分（Ｍ）、切断可能なリンカー（Ｌ）、第１の標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）、および第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）を含んでいる条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質であって、
    第１の標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）および第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）の少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含み、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ここで、非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインに結合することができ、および、結合部分は、その標的に対する、ＥｐＣＡＭ結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの結合をマスキングすることができる、条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  40. 結合部分はマスキング部分を含み、および、マスキング部分は、配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列、または配列番号３８０－４２４からなる群から選択された配列に対して１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項３９に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  41. リンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に対して１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項３９または４０に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  42. 結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項３９－４１のいずれか１つに記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  43. 第２の標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）はＣＤ３結合ドメインを含む、請求項３９－４２のいずれか１つに記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  44. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に記載の配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項４３に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  45. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項３７または３８の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、または前記条件付きで活性なキメラ抗原受容体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  46. 対象はヒトである、請求項４５に記載の方法。
  47. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項３９－４４のいずれか１つの条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、または前記ＥｐＣＡＭ結合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  48. 対象はヒトである、請求項４７に記載の方法。
  49. 結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１－３のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  50. 結合ドメインは、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体である、請求項１－３および４９のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  51. 結合ドメインは単一ドメイン抗体を含む、請求項５０に記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  52. 結合ドメインは、約０．００１ｎＭ～約５００ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）でＥｐＣＡＭに結合する、請求項１－３および４９－５１のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  53. 結合ドメインは、ヒトＥｐＣＡＭ、マウスＥｐＣＡＭ、カニクイザルＥｐＣＡＭ、またはそれらの組み合わせに結合する、請求項１－３および４９－５２のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭ結合ドメイン。
  54. ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む多特異性タンパク質であって、前記ＥｐＣＡＭ結合ドメインが、請求項１－３および４９－５３のうちのいずれか１つによるものである、多特異性タンパク質。
  55. 請求項１－３および４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）を含む、請求項５４に記載の多特異性タンパク質。
  56. 抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある、請求項５５に記載の多特異性タンパク質。
  57. 抗ＥｐＣＡＭドメインおよび抗ＣＤ３ドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある、請求項５５に記載の多特異性タンパク質。
  58. 請求項１－３および４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン（抗ＥｐＣＡＭドメイン）、ＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３ドメイン）、およびアルブミン結合ドメイン（抗ＡＬＢドメイン）を含む、請求項５４－５６のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  59. 抗ＣＤ３ドメインは、配列番号３７９または配列番号４７４に記載のアミノ酸を含む、請求項５４－５８のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  60. 抗ＡＬＢドメインは、配列番号３７５、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４８２、または配列番号４８３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５８－５９のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  61. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  62. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  63. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  64. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ：抗ＡＬＢ配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  65. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３：抗ＥｐＣＡＭ配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  66. 抗ＥｐＣＡＭドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、および抗ＡＬＢドメインは、抗ＥｐＣＡＭ：抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ配向にある、請求項５８－６０のいずれか１つに記載の多特異性タンパク質。
  67. 配列番号４９５、４９８－５０２、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８のうちのいずれか１つで記載される配列を含む、多価タンパク質。
  68. 配列番号４９４、５７１、および５７４のうちのいずれか１つで記載される配列を含む、活性薬。
  69. 配列番号４８５－４９１のうちのいずれか１つで記載される配列を含む、多価タンパク質。
  70. （ｉ）（ａ）請求項１－３４および４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン、
    （ｉ）（ｂ）請求項３７－３８のいずれか１つの条件付きで活性なキメラ抗原受容体、
    （ｉ）（ｃ）請求項３９－４４のいずれか１つの条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、
    （ｉ）（ｄ）請求項５４－６６のいずれか１つの多特異性タンパク質、
    （ｉ）（ｅ）請求項６７または６９の多価タンパク質、あるいは、
    （ｉ）（ｆ）請求項６８の活性薬、および、
    （ｉｉ）薬学的に許容可能な担体、
    を含む、医薬組成物。
  71. 請求項１－３と４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメインの生成のためのプロセスであって、前記プロセスは、請求項１－３と４９－５３のＥｐＣＡＭ結合ドメインの発現を可能にする条件下で、前記ＥｐＣＡＭ結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  72. 請求項５４－６６のいずれか１つの多特異性タンパク質の生成のためのプロセスであって、前記プロセスは、請求項５４－６６のいずれか１つの多特異性タンパク質の発現を可能にする条件下で、多特異性ＥｐＣＡＭ結合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  73. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項１－３４および４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン、または請求項７０の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  74. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項５４－６６のいずれか１つの多特異性タンパク質、請求項６７または６９の多価タンパク質、請求項６８の活性薬、あるいは請求項７０の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  75. 対象はヒトである、請求項７３または７４に記載の方法。
  76. 前記方法はさらに、請求項１－３４および４９－５３のいずれか１つのＥｐＣＡＭ結合ドメイン、請求項５４－６６のいずれか１つの多特異性タンパク質、請求項６７または６９の多価タンパク質、請求項６８の活性薬、あるいは請求項７０の医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、請求項７３－７６のいずれか１つに記載の方法。
  78. 腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む、請求項７３－７７のいずれか１つに記載の方法。
  79. 固形腫瘍疾患は転移性である、請求項７８に記載の方法。
  80. 腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む、請求項７３－７９のいずれか１つに記載の方法。
  81. 前記方法はさらに、請求項３７または３８の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、あるいは、請求項３９－４４のいずれか１つの条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、あるいはそれを含む医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程を含む、請求項４５－５８のいずれか１つに記載の方法。
  82. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、請求項８１に記載の方法。
  83. 腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 固形腫瘍疾患は転移性である、請求項８３に記載の方法。
  85. 腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つである、請求項８１－８４のいずれか１つに記載の方法。
  86. 請求項３７－３８のいずれか１つの条件付きで活性なキメラ抗原受容体の生成のためのプロセスであって、 前記プロセスは、請求項３７－３８のいずれか１つの条件付きで活性なキメラ抗原受容体の発現を可能にする条件下で、前記条件付きで活性なキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  87. 請求項３９－４４のいずれか１つの条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の生成のためのプロセスであって、であって、前記プロセスは、請求項３９－４４のいずれか１つの条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  88. 請求項６７または６９に記載の多価タンパク質の生成のためのプロセスであって、前記プロセスは、請求項６７または６９の多価タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記多価タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  89. 請求項６８の活性薬の生成のためのプロセスであって、前記プロセスは、請求項６８の活性薬の発現を可能にする条件下で、前記活性薬のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成された薬物を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  90. 請求項２３および３０－３３のいずれか１つのＣＡＲを含む、細胞。
  91. 請求項２３－３３および３７－３８のいずれか１つのＰｒｏＣＡＲを含む、細胞。
  92. 細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項９０または９１に記載の細胞。
  93. 請求項９０－９２のいずれか１つの細胞を、ＣＡＲまたはＰｒｏＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたはＲＮＡを用いてトランスフェクトする工程を含む、方法。
  94. 前記条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、（ａ）結合部分を含まないが、それ以外では条件付きで活性なキメラ抗原受容体と同一であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と比較して、より大きな治療指数を有する、請求項３７または３８に記載の条件付きで活性なキメラ抗原受容体。
  95. 前記条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、（ａ）結合部分を含まないが、それ以外では条件付きで活性なキメラ抗原受容体と同一であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の治療指数よりも、少なくとも約５倍～約１００倍大きな治療指数を有する、請求項９４に記載の条件付きで活性なキメラ抗原受容体。
  96. タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項３９－４４のいずれか１つに記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  97. タンパク質は、配列番号５７６の配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項９６に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  98. タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む、請求項９７に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  99. 条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、結合部分（Ｍ）または切断可能なリンカー（Ｌ）を含まないがそれ以外は条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質と同一であるＥｐＣＡＭ結合タンパク質と比較して、より大きな治療指数を有する、請求項３９－４４および９６－９８のいずれか１つに記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  100. 条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質は、結合部分（Ｍ）または切断可能なリンカー（Ｌ）を含まないが、それ以外は条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質と同一であるＥｐＣＡＭ結合タンパク質と比較して、少なくとも約５倍～約１００倍大きな治療指数を有する、請求項９９に記載の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質。
  101. （ｉ）（ａ）請求項９４または９５の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、あるいは、（ｉ）（ｂ）請求項９９または１００の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物。
  102. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項９４または９５の条件付きで活性なキメラ抗原受容体、あるいは請求項１０１の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  103. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項９９または１００の条件付きで活性なＥｐＣＡＭ結合タンパク質、あるいは請求項１０１の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  104. 対象はヒトである、請求項１０２または１０３に記載の方法。
  105. 腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む、請求項１０２－１０４のいずれか１つに記載の方法。
  106. ＥｐＣＡＭ結合ドメインの治療指数を増加させる方法であって、前記方法は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、
    －非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに特異的な結合部位を含み、
    －ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、結合部分によってその標的との結合からマスキングされ、
    －ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、切断可能なリンカーが切断されると、その標的に結合することができる、
    方法。
  107. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 結合部分にコンジュゲートしたＥｐＣＡＭ結合ドメインは、条件付きで活性な多特異性タンパク質の一部であり、多特異性タンパク質はＣＤ３結合ドメインをさらに含む、請求項１０６または１０７に記載の方法。
  109. 結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１０６－１０８のいずれか１つに記載の方法。
  110. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号３７９および４７４からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１０８または１０９に記載の方法。
  111. 切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０７、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１０６－１１０のいずれか１つに記載の方法。
  112. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１０６－１１１のいずれか１つに記載の方法。
  113. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１０６－１１２のいずれか１つに記載の方法。
  114. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１０６－１１３のいずれか１つに記載の方法。
  115. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む、請求項１０６－１１４のいずれか１つに記載の方法。
  116. 結合部分にコンジュゲートしたＥｐＣＡＭ結合ドメインは、条件付きで活性なキメラ抗原受容体の一部であり、条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインの少なくとも１つをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  117. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１１６または１１７に記載の方法。
  119. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１１６－１１８のいずれか１つに記載の方法。
  120. 条件付きで活性なキメラ抗原受容体は、配列番号４８５－４９１からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１１６－１１９のいずれか１つに記載の方法。
  121. 第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインとを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質の治療指数を増加させる方法であって、第１の標的抗原結合ドメインと第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含み、前記方法は、第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、
    －非ＣＤＲループは、第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインに特異的な結合部位を含み、
    －第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、結合部分によってその標的の結合からマスキングされ、および、
    －マスキングされる第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインは、切断可能なリンカーの切断時にその標的に結合することができる、方法。
  122. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 非ＣＤＲループは、ＥｐＣＡＭ結合ドメインに特異的な結合部位を含む、請求項１２１または１２２に記載の方法。
  124. 第１の標的抗原結合ドメインまたは第２の標的抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＣＤ３結合ドメインを含む、請求項１２１または１２２に記載の方法。
  125. 非ＣＤＲループは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. 結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１２１－１２６のいずれか１つに記載の方法。
  128. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１２１－１２７のいずれか１つに記載の方法。
  129. 切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１２１－１２８のいずれか１つに記載の方法。
  130. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１２１－１２９のいずれか１つに記載の方法。
  131. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１２１－１３０のいずれか１つに記載の方法。
  132. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む、請求項１２１－１３１のいずれか１つに記載の方法。
  133. ＥｐＣＡＭ結合ドメインとＣＤ３結合ドメインとを含むＥｐＣＡＭ結合タンパク質の治療指数を増加させる方法であって、前記方法は、ＣＤ３結合ドメインを、切断可能なリンカーおよび非ＣＤＲループを含む結合部分にコンジュゲートする工程を含み、非ＣＤＲループは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む、方法。
  134. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. ＣＤ３結合ドメインは、配列番号４７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. 結合部分は、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１３３－１３５のいずれか１つに記載の方法。
  137. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１３３－１３６のいずれか１つに記載の方法。
  138. 切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１３３－１３７のいずれか１つに記載の方法。
  139. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１３３－１３８のいずれか１つに記載の方法。
  140. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１３３－１３９のいずれか１つに記載の方法。
  141. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む、請求項１３３－１４０のいずれか１つに記載の方法。
  142. ＥｐＣＡＭ結合ドメイン、ＣＤ３結合ドメイン、アルブミン結合ドメインを含む、ＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質であって、アルブミン結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインに特異的な結合部位を含む非ＣＤＲループと、切断可能なリンカーとを含み、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、配列番号３９－７６からなる群から選択された配列、または配列番号３９－７６からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列、または配列番号７７－１１４からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含み、および、ＣＤＲ３は、配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列、または配列番号１１５－１５２からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、ＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  143. アルブミン結合ドメインは、配列番号４７２－４７３および４８２－４８３からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１４２に記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  144. ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１－３８、２０７－２０９、および４９６－４９７からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１４２または１４３に記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  145. 切断可能なリンカーは、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列、または、配列番号４２５－４７１、５０３－５０６、および５８１からなる群から選択された配列に１つ以上の置換を含む配列を含む、請求項１４２－１４４のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  146. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号４９８－５０１、５６９－５７０、５７２、５７３、５７５、５７６、５７７、および５７８からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１４２－１４５のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  147. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項１４２－１４６のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  148. 条件付きで活性な多特異性タンパク質は、配列番号５７６で記載される配列を含む、請求項１４２－１４７のいずれか１つに記載のＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質。
  149. 請求項１４２－１４８のいずれか１つのＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質を含む医薬組成物。
  150. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１４９に記載の医薬組成物。
  151. 請求項１４２－１４８のいずれか１つのＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質の生成のためのプロセスであって、前記プロセスは、請求項１４２－１４８のいずれか１つのＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記ＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質のドメインをコードする１つ以上の核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
  152. 増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、請求項１４２－１４８のいずれか１つのＥｐＣＡＭを標的とする条件付きで活性な多特異性タンパク質、または請求項１４９または１５０の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
  153. 腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む、請求項１５２に記載の方法。
  154. 固形腫瘍疾患は転移性である、請求項１５３に記載の方法。
  155. 腫瘍性疾患は、大腸癌、前立腺癌、神経内分泌癌、甲状腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、食道癌、乳癌、腺癌の少なくとも１つを含む、請求項１５２－１５４のいずれか１つに記載の方法。
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