JP2022523781A - Dll3標的化キメラ抗原受容体および結合剤 - Google Patents
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- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Abstract
DLL3結合剤およびDLL3に特異的に結合するDLL3結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)、ならびにこれらのDLL3特異的CARを含む免疫細胞、例えば、CAR-T細胞が本明細書で提供される。また、DLL3特異的CARを作製および使用する方法、ならびにDLL3特異的CARを含む免疫細胞も提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2019年3月1日に出願された米国仮特許出願第62/812,585号、および2020年2月4日に出願された米国仮特許出願第62/969,976号に対する優先権の利益を主張し、そのすべての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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本開示は、DLL3結合剤およびDLL3に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)、それをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを使用して患者における癌を治療する方法に関する。
配列表
本出願は、EFS-Webを介して電子出願されており、.txtフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。.txtファイルは、2020年2月4日に作成され、約1,026,798バイトのサイズを有する「AT-019_03US_SL」と題された配列表を含有する。本.txtファイルに含まれる配列表は、本明細書の部分であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS-Webを介して電子出願されており、.txtフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。.txtファイルは、2020年2月4日に作成され、約1,026,798バイトのサイズを有する「AT-019_03US_SL」と題された配列表を含有する。本.txtファイルに含まれる配列表は、本明細書の部分であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
小細胞肺癌(SCLC)は、予後不良および限定された治療選択肢を有する侵襲的な形態の肺癌である。SCLCは、すべての新たに診断された肺癌の約10~15%を表す。アメリカ癌協会は、2018年には約234,000の新しい肺癌の症例が診断されるであろうと推定する。SCLCの推定5年相対生存率は、31%(ステージIの場合)、19%(ステージIIの場合)、8%(ステージIIIの場合)、および2%(ステージIVの場合)である。SCLCの生存率は、この形態の肺癌と闘うための新しい療法がないことが主な理由で、数十年間低いままであった。癌のための従来の治療的処置には、化学療法および放射線療法が含まれる。患者は、典型的には、エトポシドおよびシスプラチンを含む、現在の第一選択療法によく応答するが、化学療法抵抗性疾患で常にすぐに再発する。再発した難治性の状況での予後は非常に悪く、急速な疾患進行および6か月未満の短い生存期間の中央値を有する。したがって、増殖性障害のためのより標的化された強力な療法を開発する大きな必要性が残っている。
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子修飾された免疫細胞の養子移入は、癌を治療するための新しいアプローチとして有望であることを示している(例えば、Brenner et al.,Current Opinion in Immunology,22(2):251-257(2010)、Rosenberg et al.,Nature Reviews Cancer,8(4):299-308(2008)を参照されたい)。免疫細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)、DLL3抗原認識部分で構成される融合タンパク質、およびT細胞活性化ドメインを発現するように遺伝子修飾することができる(例えば、Eshhar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(2):720-724(1993)、およびSadelain et al.,Curr.Opin.Immunol,21(2):215-223(2009)を参照されたい)。CARを含有する免疫細胞、例えば、CAR-T細胞(CAR-T)は、標的細胞を認識し、殺滅するそれらの能力を保持または強化しながら、それらに抗原特異性を付与するように操作される。
DLL3は、非カノニカルNotchリガンドであり、細胞自律的に機能してNotchシグナル伝達を阻害し、よって細胞間の相互作用および標的細胞におけるNotchの内在化を遮断する。デルタ様リガンド3(DLL3)は、SCLC腫瘍マーカーであり、癌幹細胞に関連していることがわかっている。DLL3に関係する他の適応症には、黒色腫、低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺髄様癌、カルチノイド、膵臓、膀胱、および前立腺における分散性神経内分泌腫瘍、精巣癌、ならびに神経内分泌特徴を伴う肺腺癌が含まれる。癌、特にDLL3の異常な発現を伴う悪性腫瘍の治療の必要性がある。この必要性に対処する方法および組成物が本明細書で提供される。
DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)、およびこれらのDLL3特異的CARを含む免疫細胞、例えば、CAR-T細胞が本明細書で提供される。これらのDLL3特異的CARを作製および使用する方法、ならびにDLL3特異的CARを含む免疫細胞も提供される。本明細書に記載されるDLL-3標的化CAR T細胞は、良好な形質導入効率、インビトロ表現型、ならびに強力なインビトロおよびインビボ抗腫瘍活性を示す。
一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、(a)配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451、および460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1、(b)配列番号2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461、および695からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2、(c)配列番号3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453、および462からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3、(d)配列番号4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463、および696からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1、(e)配列番号5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455、および464からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2、ならびに(f)配列番号6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456、および465からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3のうちの少なくとも1つを含む。
別の態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、(a)配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451、および460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1、(b)配列番号2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、および695461からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2、ならびに(c)配列番号3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453、および462からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3を含む。
一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、(a)配列番号4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463、および696からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1、(b)配列番号5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455、および464からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2、ならびに(c)配列番号6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456、および465からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3を含む。
別の態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、(a)配列番号7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに(b)配列番号8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458、および467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含み、可変重鎖および可変軽鎖は、少なくとも1つのリンカーによって連結される。
さらなる態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、(a)配列番号7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、および466からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに(b)配列番号8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458、および467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、可変重鎖および可変軽鎖は、少なくとも1つのリンカーによって連結される。
一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、表1dに提示されるscFvからなる群から選択される配列を含む。
別の態様では、本開示は、DLL3に特異的に結合するキメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は、配列番号482~533および配列番号632~683のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号482~533および632~683のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、DLL3に特異的に結合するキメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号482~533および配列番号632~683のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号482~533および632~683のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の共刺激ドメインは、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である。
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、CD28のシグナル伝達領域を含む。
いくつかの実施形態では、CD28共刺激ドメインは、配列番号550を含む。
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BB/CD137のシグナル伝達領域を含む。
いくつかの実施形態では、4-1BB/CD137共刺激ドメインは、配列番号480を含む。
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、少なくとも1つの活性化ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、CD3を含む。
いくつかの実施形態では、CD3は、CD3ゼータを含む。
いくつかの実施形態では、CD3ゼータは、配列番号481を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号571~621および631のいずれか1つのポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、安全スイッチをさらに含む。
いくつかの実施形態では、安全スイッチは、CD20ミモトープまたはQBEND-10エピトープを含む。
いくつかの実施形態では、安全スイッチは、1つ以上のCD20ミモトープもしくは1つ以上のQBEND-10エピトープ、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、QR3、SR2、RSR、またはR2Sのフォーマットの1つ以上の安全スイッチを含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号622~628、474~476、565、および684~694のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号622~628、474~476、565、および684~694のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか1つをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レンチウイルスベクター、またはそれらの任意の組み合わせである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを発現する操作された免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞、またはNK-T細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、自家T細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、同種T細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ノックアウトされたTCR(例えば、TCRα、TCRβ)である。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、操作された免疫細胞または本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌である。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、小細胞肺癌である。
いくつかの態様では、本開示は、操作された免疫細胞または本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を含む、製品を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される抗DLL3結合剤を提供する。
いくつかの実施形態では、抗DLL3結合剤は、抗体、抗体コンジュゲート、またはそれらの抗原結合断片、任意に、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fab断片、Fv断片、scFv断片、dsFv断片、またはdAb断片である。
いくつかの実施形態では、結合剤は、IgG定常領域を含むモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、抗DLL3結合剤は、表1bに提供されるVH配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である可変重(VH)鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗DLL3結合剤は、表1cに提供されるVL配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である可変軽(VL)鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗DLL3結合剤は、表1dに提示されるscFv配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗DLL3結合剤は、Fc定常領域に融合したscFv断片を含む融合タンパク質である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される抗DLL3結合剤および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるように、抗DLL3結合剤、または抗DLL3結合剤を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌である。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、小細胞肺癌である。
DLL3特異的抗体およびキメラ抗原受容体(CAR)が本明細書で提供される。本明細書に記載されるDLL-3特異的CARは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメイン、およびこれらのCARをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのDLL3特異的CARを含む免疫細胞、例えば、CAR-T細胞、およびこれらの免疫細胞を含む薬学的組成物も提供される。例えば、癌の治療のために、これらのDLL3特異的CARおよびこれらのDLL3特異的CARを含む免疫細胞を作製および使用する方法も開示される。
I.DLL-3結合剤
本開示は、DLL-3に特異的に結合するDLL-3結合剤(例えば、DLL3抗原結合ドメイン、DLL-3抗体、またはそれらの断片を含む分子)を提供する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原(例えば、DLL-3)への特異的結合を与えるのに十分なカノニカル免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で知られているように、自然界で産生されるインタクトな抗体は、一般に「Y字型」構造と呼ばれるものに互いに会合する2つの同一の重鎖ポリペプチド(各々約50kD)および2つの同一の軽鎖ポリペプチド(各々約25kD)で構成される約150kDの四量体剤である。各重鎖は、少なくとも4つのドメイン(各々約110アミノ酸長)-アミノ末端可変(VH)ドメイン(Y構造の先端に位置する)と、続いて3つの定常ドメイン:CHI、CH2、およびカルボキシ末端CH3(Yのステムの基部に位置する)とで構成される。「スイッチ」として知られる、短い領域は、重鎖可変領域および定常領域を接続する。「ヒンジ」は、CH2およびCH3ドメインを抗体の残部に接続する。このヒンジ領域における2つのジスルフィド結合は、2つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体において互いに接続する。各軽鎖は、2つのドメイン、別の「スイッチ」によって互いに分離された、アミノ末端可変(VL)ドメインと、続いてカルボキシ末端定常(CL)ドメインと、で構成される。当業者は、抗体構造および配列要素に精通しており、提供された配列における「可変」および「定常」領域を認識し、そのようなドメイン間の「境界」の定義におけるいくらかの柔軟性があり得、同じ抗体鎖配列の異なる提示が、例えば、同じ抗体鎖配列の異なる提示に対して1残基または数残基シフトした位置でそのような境界を示し得ることを理解する。
本開示は、DLL-3に特異的に結合するDLL-3結合剤(例えば、DLL3抗原結合ドメイン、DLL-3抗体、またはそれらの断片を含む分子)を提供する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原(例えば、DLL-3)への特異的結合を与えるのに十分なカノニカル免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で知られているように、自然界で産生されるインタクトな抗体は、一般に「Y字型」構造と呼ばれるものに互いに会合する2つの同一の重鎖ポリペプチド(各々約50kD)および2つの同一の軽鎖ポリペプチド(各々約25kD)で構成される約150kDの四量体剤である。各重鎖は、少なくとも4つのドメイン(各々約110アミノ酸長)-アミノ末端可変(VH)ドメイン(Y構造の先端に位置する)と、続いて3つの定常ドメイン:CHI、CH2、およびカルボキシ末端CH3(Yのステムの基部に位置する)とで構成される。「スイッチ」として知られる、短い領域は、重鎖可変領域および定常領域を接続する。「ヒンジ」は、CH2およびCH3ドメインを抗体の残部に接続する。このヒンジ領域における2つのジスルフィド結合は、2つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体において互いに接続する。各軽鎖は、2つのドメイン、別の「スイッチ」によって互いに分離された、アミノ末端可変(VL)ドメインと、続いてカルボキシ末端定常(CL)ドメインと、で構成される。当業者は、抗体構造および配列要素に精通しており、提供された配列における「可変」および「定常」領域を認識し、そのようなドメイン間の「境界」の定義におけるいくらかの柔軟性があり得、同じ抗体鎖配列の異なる提示が、例えば、同じ抗体鎖配列の異なる提示に対して1残基または数残基シフトした位置でそのような境界を示し得ることを理解する。
フレームワーク、CDR、および可変ドメインの各々へのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Kabat番号付け(例えば、Kabat et al.in Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md.1991を参照にされたい)、Chothia番号付け(例えば、Chothia & Lesk,(1987),J Mol Biol 196:901-917、Al-Lazikani et al.,(1997)J Mol Biol 273:927-948、Chothia et al.,(1992)J Mol Biol 227:799-817、Tramontano et al.,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82、および米国特許第7,709,226号を参照されたい)、接触番号付け、またはAbMスキーム(Antibody Modelingプログラム、Oxford Molecular)の番号付けスキームに従う。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提示されるDLL3結合剤のCDRは、Kabat番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるDLL3結合剤のCDRは、Chothia番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるDLL3結合剤のCDRは、接触番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるDLL3結合剤のCDRは、AbM番号付けスキームに従って番号付けされる。
インタクトな抗体四量体は、重鎖および軽鎖が単一ジスルフィド結合によって互いに連結している2つの重鎖-軽鎖二量体で構成され、2つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに接続し、その結果、二量体が互いに接続され、四量体が形成される。自然に産生された抗体はまた、典型的にはCH2ドメイン上で、グリコシル化される。天然抗体における各ドメインは、圧縮された逆平行ベータバレルにおいて互いに詰め込まれた2つのベータシート(例えば、3、4、または5本鎖シート)から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」(CDR1、CDR2、およびCDR3)として知られる3つの超可変ループ、および4つのやや不変の「フレームワーク」領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)を含有する。天然抗体が折り畳まれる場合、FR領域は、ドメインの構造フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖および軽鎖の両方からのCDRループ領域は、それらがY構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位が作成されるように、3次元空間に一緒にされる。天然発生抗体のFc領域は、補体系の要素に結合し、また、例えば、細胞毒性を媒介するエフェクター細胞を含む、エフェクター細胞上の受容体に結合する。当該技術分野で知られているように、Fc受容体に対するFc領域の親和性および/または他の結合属性は、グリコシル化または他の修飾によって調節することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って産生および/または利用される抗体は、修飾または操作されたそのようなグリコシル化を有するFcドメインを含む、グリコシル化されたFcドメインを含む。
本発明の目的のために、特定の実施形態では、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に産生される(例えば、抗原に反応する生物によって生成される)か、あるいは組換え操作、化学合成、または他の人工システムもしくは方法論によって産生されるかにかかわらず、「抗体」として言及および/または使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり、いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである。
さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態では(別段に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り)、代替の提示において抗体の構造的および機能的特徴を利用するための当該技術分野で知られているか、または開発された構築物もしくはフォーマットのいずれかを指すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、インタクトなIgA、IgG、IgE、またはIgM抗体;二重または多重特異的抗体(例えば、Zybodies(登録商標)など);Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd’断片、Fd断片、および単離されたCDRまたはそれらのセットなどの抗体断片;単鎖Fv;ポリペプチド-Fc融合体;単一ドメイン抗体(例えば、IgNARまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体);ラクダ抗体;マスクされた抗体(例えば、Probodies(登録商標))、小モジュラー免疫薬(「SMIP(商標));単鎖またはタンデムダイアボディー(例えば、TandAb(登録商標));VHH;Anticalins(登録商標);Nanobodies(登録商標)ミニボディ;BiTE(登録商標);アンキリン反復タンパク質またはDARPINs(登録商標);Avimers(登録商標);DART;TCR様抗体;Adnectins(登録商標);Affilins(登録商標);Trans-bodies(登録商標);Affibodies(登録商標);TrimerX(登録商標);MicroProteins;Fynomers(登録商標)、Centyrins(登録商標);およびKALBITOR(登録商標)から選択されるが、これらに限定されないフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体は、それが自然に産生される場合に有するであろう共有結合修飾(例えば、グリカンの付着)を欠き得る。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾(例えば、グリカンの付着、ペイロード(例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など)、または他のペンダント基(例えば、ポリエチレングリコールなど)を含有し得る。
抗体は、抗体断片を含む。抗体は、ポリクローナルモノクローナル、キメラdAb(ドメイン抗体)、単鎖、Fab、Fa、F(ab)2断片、scFv、およびFab発現ライブラリーも含むが、これらに限定されない。抗体は、全抗体、または免疫グロブリン、または抗体断片であり得る。
上で詳述されるように、全抗体は、「軽鎖」(LC)および「重鎖」(HC)の2つの対からなる(そのような軽鎖(LC)/重鎖対は、本明細書ではLC/HCと略される)。そのような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。全抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと略される)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインCHI、CH2、およびCH3(抗体クラスIgA、IgD、およびIgG)、ならびに任意に重鎖定常ドメインCH4(抗体クラスIgEおよびIgM)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインVLおよび軽鎖定常ドメインCLを含む。可変ドメインVHおよびVLは、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域が点在した、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分化することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された、3つのCDRおよび4つのFRで構成される(Janeway,C.A.,Jr,et al,(2001)Immunobiology.,5th ed.,Garland Publishing、およびWoof,J.,Burton,D.,Nat Rev Immunol 4(2004)89-99)。重鎖および軽鎖の2つの対(HC/LC)は、同じ抗原に特異的に結合することができる。よって、当該全抗体は、二価単一特異性抗体である。そのような「抗体」は、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびそれらの特徴的な特性が保持される限り、遺伝子操作された抗体(バリアントまたは変異体抗体)を含む。いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、特に組換えヒトまたはヒト化抗体としてのヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「対称的」であり得る。「対称的」とは、抗体または結合剤が同じ種類のFv領域を有することを意味する(例えば、抗体は、2つのFab領域を有する)。いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「非対称的」であり得る。「非対称的」とは、抗体または結合剤が少なくとも2つの異なる種類のFv領域を有することを意味する(例えば、抗体は、FabおよびscFv領域、FabおよびscFv2領域、またはFab-VHH領域を有する)。様々な非対称抗体または結合剤構造が当該技術分野で知られている(Brinkman and Kontermann et al.2017 Mabs(9)(2):182-212)。
本明細書で使用される場合、「抗体剤」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、用語は、特異的結合を与えるのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体剤には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な1つ以上の定常領域配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当該技術分野で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである1つ以上の配列要素を含み得る。多くの実施形態では、「抗体剤」という用語は、代替の提示において抗体の構造的および機能的特徴を利用するための当該技術分野で知られているか、または開発された構築物もしくはフォーマットのうちの1つ以上を指すために使用される。例えば、本発明に従って利用される抗体剤は、インタクトなIgA、IgG、IgE、またはIgM抗体;二重または多重特異的抗体(例えば、Zybodies(登録商標)など);Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd’断片、Fd断片、および単離されたCDRまたはそれらのセットなどの抗体断片;単鎖Fv;ポリペプチド-Fc融合体;単一ドメイン抗体(例えば、IgNARまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体);ラクダ抗体;マスクされた抗体(例えば、Probodies(登録商標))、小モジュラー免疫薬(「SMIP(商標));単鎖またはタンデムダイアボディー(例えば、TandAb(登録商標));VHH;Anticalins(登録商標);Nanobodies(登録商標)ミニボディ;BiTE(登録商標);アンキリン反復タンパク質またはDARPINs(登録商標);Avimers(登録商標);DART;TCR様抗体;Adnectins(登録商標);Affilins(登録商標);Trans-bodies(登録商標);Affibodies(登録商標);TrimerX(登録商標);MicroProteins;Fynomers(登録商標)、Centyrins(登録商標);およびKALBITOR(登録商標)から選択されるが、これらに限定されないフォーマットである。
いくつかの実施形態では、抗体は、それが自然に産生される場合に有するであろう共有結合修飾(例えば、グリカンの付着)を欠き得る。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾(例えば、グリカンの付着、ペイロード[例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など]、または他のペンダント基[例えば、ポリエチレングリコールなど]を含有し得る。多くの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、相補性決定領域(CDR)として当業者によって認識される1つ以上の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含み、いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、参照抗体に見られるものと実質的に同一である少なくとも1つのCDR(例えば、少なくとも1つの重鎖CDRおよび/または少なくとも1つの軽鎖CDR)を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。
本発明のコードされる抗体または抗原結合分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子は、一本鎖である。特定の実施形態では、抗原結合分子は、scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2、dAb、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗DLL-3抗体剤は、単離される。いくつかの実施形態では、抗体剤は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換または逆相HPLC)によって決定されるように、95%または99%を超える純度に精製することができる(例えば、Flatman et al.,J.Chromatogr.,B 848:79-87(2007)を参照されたい)。いくつかの態様では、本開示は、DLL-3結合剤(例えば、DLL3特異的抗体)および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、抗DLL-3抗体剤は、Fcを含む。Fcドメインは、細胞表面受容体と相互作用することができ、これは抗体が免疫系を活性化することを可能にすることができる。IgG、IgA、およびIgD抗体アイソタイプでは、Fc領域は、抗体の2つの重鎖の第2および第3の定常ドメインに由来する、2つの同一のタンパク質断片で構成され、IgMおよびIgE Fc領域は、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2~4)を含有する。IgGのFc領域は、高度に保存されたN-グリコシル化部位(N297)を担持し得る。Fc断片のグリコシル化は、Fc受容体媒介性活性に不可欠であり得る。この部位に付着したN-グリカンは、主に複合体タイプのコア-フコシル化二分岐構造であり得る。
軽鎖および重鎖の定常領域は抗体の抗原への結合に直接関与しない場合がある一方で、定常領域は、可変領域の配向に影響を与え得る。定常領域はまた、エフェクター分子および細胞との相互作用を介した抗体依存性補体媒介性溶解または抗体依存性細胞毒性への関与などの、様々なエフェクター機能を示し得る。
開示される抗DLL-3抗体剤は、アイソタイプIgA、アイソタイプIgD、アイソタイプIgE、アイソタイプIgG、またはアイソタイプIgMを含む、任意のアイソタイプの抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗DLL-3抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常ドメインを含有する。
DLL3標的の様々な領域またはドメインに結合することができるDLL3結合剤(例えば、抗体)が本明細書で提供される。エピトープは、例えば、DLL3標的の隣接アミノ酸(線状または隣接エピトープ)であるか、またはDLL3標的の2つ以上の非隣接領域(立体配座、非線状、不連続、または非隣接エピトープ)から一緒になり得る。DLL3抗原結合ドメインが結合するエピトープは、様々なアッセイ、例えば、NMR分光法、X線回折結晶学研究、ELISAアッセイ、質量分析と組み合わせた水素/重水素交換(例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析)、アレイベースのオリゴ-ペプチド走査アッセイ、フローサイトメトリー、および/または変異誘発マッピング(例えば、部位特異的変異誘発マッピング)によって決定することができる。
いくつかの実施形態では、DLL3結合剤は、可変重鎖(VH)を含み、VHのアミノ酸配列は、表1bに提示されるVH配列から選択される。いくつかの実施形態では、抗DLL-3結合剤は、表1bに提示されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、DLL3結合剤は、可変軽鎖(VL)を含み、VLのアミノ酸配列は、表1cに提示されるVL配列から選択される。いくつかの実施形態では、抗DLL-3結合剤は、表1cに提示されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖を含む。
DLL3抗原結合ドメインが可変重鎖(VH)および可変軽鎖を含み、VHのアミノ酸配列が表1bに提示されるVH配列から選択され、VLのアミノ酸配列が表1cに提示されるVL配列から選択される、DLL3結合剤(例えば、抗体)が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、DLL-3結合剤は、重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの実施形態では、重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、表1eに提示される重鎖CDRから選択される。
いくつかの実施形態では、DLL-3結合剤は、軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、表1fに提示される軽鎖CDRから選択される。
本開示は、表1b~1eに示される配列を含むDLL3抗体剤への修飾を包含し、それらの特性に有意に影響を及ぼさない修飾を有する機能的に同等のDLL3抗体剤ならびに増強または減少した活性および/または親和性を有するバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列は、DLL3への所望の結合親和性を有するDLL3抗原結合剤を得るために変異され得る。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野における日常的な慣行であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換を有する、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟(増強)させるアミノ酸の1つ以上の欠失もしくは付加を有する、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドを含む。
アミノ酸配列挿入は、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入と同様に、長さが1残基から100以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合を含む。末端挿入の例は、N末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合された抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、血液循環における抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗体のNまたはC末端への融合を含む。
置換バリアントは、除去された抗原結合ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。いくつかの実施形態では、置換変異誘発のための目的の部位は、超可変領域/CDRを含むが、FR変更も企図される。保存的置換を、「保存的置換」の見出しの下で表2に示す。かかる置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表2において「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスへの参照において以下でさらに記載される、より実質的な変化は、導入され得、産物はスクリーニングされ得る。
i.抗体断片
一態様では、上記実施形態のいずれかによる抗DLL-3抗体剤は、抗体断片であり得る。抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片には、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、ダイアボディ、線状抗体、抗体断片抗体およびscFv断片から形成される多重特異性、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなIgG1抗体、または本明細書に記載されるような他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。(例えば、Hudson et al.,Nat.Med.,9:129-134(2003)、Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,pp.269-315(1994)、Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)、WO93/01161、ならびに米国特許第5,571,894号、同第5,869,046号、同第6,248,516号、および同第5,587,458号を参照されたい)。全長抗体、インタクトな抗体、または全抗体は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書で定義されるようなFc領域を含有する重鎖を有する抗体である。抗体断片は、当該技術分野で知られているように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞(例えば、E.coliまたはファージ)による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができる。
一態様では、上記実施形態のいずれかによる抗DLL-3抗体剤は、抗体断片であり得る。抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片には、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、ダイアボディ、線状抗体、抗体断片抗体およびscFv断片から形成される多重特異性、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなIgG1抗体、または本明細書に記載されるような他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。(例えば、Hudson et al.,Nat.Med.,9:129-134(2003)、Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,pp.269-315(1994)、Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)、WO93/01161、ならびに米国特許第5,571,894号、同第5,869,046号、同第6,248,516号、および同第5,587,458号を参照されたい)。全長抗体、インタクトな抗体、または全抗体は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書で定義されるようなFc領域を含有する重鎖を有する抗体である。抗体断片は、当該技術分野で知られているように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞(例えば、E.coliまたはファージ)による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができる。
Fv抗体断片は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む。この断片は、緊密な非共有会合における1つの重鎖および1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体を含み得る。これらの2つのドメインの折り畳みから、抗原結合のアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を与える6つの超可変ループ(各々H鎖およびL鎖からの3つのループ)が発生する。しかしながら、単一可変領域(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
ダイアボディは、VHドメインとVLドメインとの間の短いリンカー(例えば、約5~10残基)でsFv断片を構築することによって調製される小さな抗体断片であり、Vドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成され、二価断片をもたらす。二重特異性ダイアボディは、2つのクロスオーバーsFv断片のヘテロ二量体であり、2つの抗体のVHドメインおよびVLドメインは、異なるポリペプチド鎖上に存在する(例えば、EP404,097、WO93/11161、およびHollinger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)を参照されたい)。
完全なヒト形態で産生することができる、ドメイン抗体(dAb)は、抗体の最小の既知の抗原結合断片であり、約11kDa~約15kDaの範囲である。DAbは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の堅牢な可変領域(それぞれ、VHおよびVL)である。それらは、微生物細胞培養において高度に発現され、例えば、溶解性および温度安定性を含むが、これらに限定されない、好ましい生物物理学的特性を示し、例えば、ファージディスプレイなどのインビトロ選択システムによる選択および親和性成熟によく適している。dAbは、単量体として生物活性があり、それらの小さなサイズおよび固有の安定性のため、より大きな分子にフォーマットして、延長した血清半減期または他の薬理活性を有する薬剤を作製することができる。(例えば、W09425591およびUS2003/0130496を参照されたい)。
FvおよびscFvは、定常領域を含まないインタクトな結合部位を有する種である。よって、それらは、インビボ使用中の低減した非特異的結合に適し得る。単鎖Fv(sFvまたはscFv)は、単一ポリペプチド鎖に接続されたVHおよびVL抗体ドメインを含む抗体断片である。sFvポリペプチドは、sFvが抗原結合の所望の構造を形成することを可能にするVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含むことができる(例えば、Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)、Borrebaeck 1995、下記を参照されたい)。scFv融合タンパク質は、sFvのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築することができる。抗体断片はまた、「線状抗体」であり得る(例えば、米国特許第5,641,870号を参照されたい)。そのような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。例示的なDLL3特異的scFvを表1dに提供する。
いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されたDLL3特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変(VL)領域および重鎖可変(VH)領域を含むscFvを含む。単鎖可変領域断片は、結合ペプチド(linking peptide)を使用することによって軽鎖および/または重鎖可変領域を結合することによって作製され得る。結合ペプチドの例は、アミノ酸配列(GGGGS)xを有するGSリンカーであり、ここで、xは1、2、3、4、または5である(配列番号470)。いくつかの実施形態では、xは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または約20未満の任意の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、(GGGGS)4(配列番号478)である。一般に、リンカーは、短い、柔軟なポリペプチドであり得、いくつかの実施形態では、約20以下のアミノ酸残基で構成される。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持物への付着のような、追加的機能のために修飾され得る。一本鎖バリアントは、組換えまたは合成的のいずれかで生み出され得る。scFvの合成産生のために、自動合成装置が使用され得る。ScFvの組換え産生のために、scFvをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物、またはE.coliのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞中に導入され得る。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作製され得る。生じたscFvは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離され得る。
例示的な実施形態では、表1bに示されるVH配列のVH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3を含むVH領域、ならびに/または表1cに示されるVL配列のVL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3を含むVL領域を含む、DLL3抗原結合ドメインが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、VHおよびVLは、リンカーによって一緒に連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号478)を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCC(配列番号564)を含むDNA配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ggcggcggcggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctct(配列番号630)を含むDNA配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号534)を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号535)を含み得る、scFv Whitlowリンカーである。scFv Whitlowリンカーは、GGGTCTACATCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGTGGCGAAGGTAGTACAAAGGGG(配列番号566)を含むDNA配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、開示されるscFvのVHおよびVL配列は、ScFvのN末端に位置しているVH配列、続いてリンカー、次いでVL配列で配向することができ、他の実施形態では、scFvは、N末端におけるVL配列、続いてリンカー、次いでVH配列で配向することができる。
ii.キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗DLL-3抗体剤は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、抗DLL-3抗体剤は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗DLL-3抗体剤は、キメラ抗体であり得る(例えば、米国特許第4,816,567号、およびMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)を参照されたい)。キメラ抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体であり得る。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)およびヒト定常領域を含むことができる。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体であり得る(例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.,13:1619-1633(2008)、Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)、Queen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)、米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号、Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)、Padlan,Mol.Immunol,28:489-498(1991)、Dall’Acqua et al.,Methods,36:43-60(2005)、Osbourn et al.,Methods,36:61-68(2005)、ならびにKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)を参照されたい)。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域からのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変領域(例えば、CDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。
非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化することができる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する、1つ以上のCDR、またはその部分を含む1つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体配列に由来する、1つ以上のFR、またはその部分を含む1つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体における1つ以上のFR残基は、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体からの対応する残基(例えば、CDR残基が由来する抗体)で置換される。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」方法を使用して選択されるフレームワーク領域、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域、ヒト成熟(体細胞変異)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域、およびFRライブラリーをスクリーニングすることから誘導されるフレームワーク領域が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Sims et al.,J.Immunol,151:2296(1993)、Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)、Presta et al.,J.Immunol,151:2623(1993)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272:10678-10684(1997)、およびRosok et al.,J.Biol.Chem.,271:22611-22618(1996)を参照されたい)。
iii.ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗DLL-3抗体剤は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる(例えば、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)、およびLonberg,Curr.Opin.Immunol,20:450-459(2008)を参照されたい)。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり得る。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、インタクトなヒト抗体または抗原チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原(例えば、DLL-3タンパク質)を投与することによって調製され得る(例えば、Lonberg,Nat.Biotech.,23:1117-1125(2005)、米国特許第6,075,181号、同第6,150,584号、同第5,770,429号、および同第7,041,870号、ならびに米国特許出願公開第US2007/0061900号を参照されたい)。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗DLL-3抗体剤は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる(例えば、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)、およびLonberg,Curr.Opin.Immunol,20:450-459(2008)を参照されたい)。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり得る。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、インタクトなヒト抗体または抗原チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原(例えば、DLL-3タンパク質)を投与することによって調製され得る(例えば、Lonberg,Nat.Biotech.,23:1117-1125(2005)、米国特許第6,075,181号、同第6,150,584号、同第5,770,429号、および同第7,041,870号、ならびに米国特許出願公開第US2007/0061900号を参照されたい)。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。例えば、ヒト抗体は、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、および他の方法を使用して、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株から産生することができる(例えば、Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984)、Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(1987)、Boerner et al.,J.Immunol,147:86(1991)、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)、米国特許第7,189,826号、Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)、Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)、およびVollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)を参照されたい)。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常領域と組み合わされ得る。
抗体中のオリゴ糖の修飾は、例えば、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために行うことができる。例えば、抗体グリコシル化バリアントは、改善されたCDC機能を有することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能(補体など)が不要または有害である用途の望ましい候補となる、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図することができる。CDC活性の低減/枯渇を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞毒性アッセイを実施することができる。
iv.抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体剤は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれ得るが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造する際に利点を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体剤は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれ得るが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造する際に利点を有し得る。
ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐または非分岐であり得る。抗体に付着したポリマーの数は変動し得、2つ以上のポリマーが付着している場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。
いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブであり得る(例えば、Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:11600-11605(2005)を参照されたい)。放射線は、任意の波長であり得、普通の細胞に害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を抗体-非タンパク質性部分の近位の細胞が殺滅される温度に加熱する波長を含み得るが、これらに限定されない。
DLL3結合剤(例えば、抗原結合ドメインを含む分子)は、解離定数(Kd)が約1nMである場合、その標的抗原(例えば、ヒト、カニクイザル、またはマウスDLL3)に「特異的に結合」すると言われる。抗原結合ドメインは、Kdが1~5nMである場合は「高親和性」で、Kdが0.1~0.5nMである場合は「非常に高親和性」で、抗原に特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、約1nMのKdを有する。一実施形態では、オフレートは、<1×10-5である。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトDLL3に、約1×10-7M~1×10-12MのKdで結合し、さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインは、約1x10-5M~1x10-12MのKdで結合するであろう。
本明細書で提供されるように、本開示の抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3、またはマウスDLL3)に特異的に結合する。特定の実施形態では、本開示のDLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3に、1×10-6M未満、1×10-7M未満、1×10-8M未満、または1×10-9M未満のKdで結合する。1つの特定の実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3、またはマウスDLL3)に、1×10-7M未満のKdで結合する。別の実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3、またはマウスDLL3)に、1×10-8M未満のKdで結合する。いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3)に、約1×10-7M、約2×10-7M、約3×10-7M、約4×10-7M、約5×10-7M、約6×10-7M、約7×10-7M、約8×10-7M、約9×10-7M、約1x10-8M、約2×10-8M、約3×10-8M、約4×10-8M、約5×10-8M、約6×10-8M、約7×10-8M、約8×10-8M、約9×10-8M、約1×10-9M、約2×10-9M、約3×10-9M、約4×10-9M、約5×10-9M、約6×10-9M、約7×10-9M、約8×10-9M、約9×10-9M、約1×10-10M、または約5×10-10MのKdで結合する。特定の実施形態では、Kdは、Koff/Konの商として計算され、KonおよびKoffは、例えば、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定される、Fab断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、Kdは、Koff/Konの商として計算され、KonおよびKoffは、例えば、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定される、Fab断片などの二価抗体を使用して決定される。
いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3、またはマウスDLL3)に、1×10-4M-1s-1未満、2×10-4M-1s-1未満、3×10-4M-1s-1未満、4×10-4M-1s-1未満、5×10-4M-1s-1未満、7×10-4M-1s-1未満、8×10-4M-1s-1未満、9×10-4M-1s-1未満、1×10-5M-1s-1未満、2×10-5M-1s-1未満、3×10-5M-1s-1未満、4×10-5M-1s-1未満、5×10-5M-1s-1未満、6×10-5M-1s-1未満、7×10-5M-1s-1未満、8×10-5M-1s-1未満、9×10-5M-1s-1未満、1×10-6M-1s-1未満、2×10-6M-1s-1未満、3×10-6M-1s-1未満、4×10-6M-1s-1未満、5×10-6M-1s-1未満、6×10-6M-1s-1未満、7×10-6M-1s-1未満、8×10-6M-1s-1未満、9×10-6M-1s-1未満、または1×10-7M-1s-1未満の会合速度(kon)で結合する。特定の実施形態では、konは、例えば、BlAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定されるように、Fab断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、konは、例えば、BlAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定されるような二価抗体を使用して決定される。
いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、哺乳動物DLL3(例えば、ヒトDLL3、カニクイザルDLL3、またはマウスDLL3)に、1×10-2s-1未満、2×10-2s-1未満、3×10-2s-1未満、4×10-2s-1未満、5×10-2s-1未満、6×10-2s-1未満、7×10-2s-1未満、8×10-2s-1未満、9×10-2s-1未満、1×10-3s-1未満、2×10-3s-1未満、3×10-3s-1未満、4×10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、6×10-3s-1未満、7×10-3s-1未満、8×10-3s-1未満、9×10-3s-1未満、1×10-4s-1未満、2×10-4s-1未満、3×10-4s-1未満、4×10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、6×10-4s-1未満、7×10-4s-1未満、8×10-4s-1未満、9×10-4s-1未満、1×10-5s-1未満、または5×10-4s-1未満の解離速度(koff)で結合する。特定の実施形態では、koffは、例えば、BlAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定されるように、Fab断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、koffは、例えば、BlAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴技術によって測定されるような二価抗体を使用して決定される。
II.キメラ抗原受容体
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体(CAR)は、標的抗原(例えば、癌細胞上の標的抗原)を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合される場合、CARは、免疫細胞を活性化して、その抗原を担持する細胞(例えば、癌細胞)を攻撃および破壊し得る。CARはまた、それらの効力を高めるために共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み得る。Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626)、Finney et al.,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797,Song et al.,Blood 119:696-706(2012)、Kalos et al.,Sci.Transl.Med.3:95(2011)、Porter et al.,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)、およびGross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)、米国特許第7,741,465号、および同第6,319,494号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体(CAR)は、標的抗原(例えば、癌細胞上の標的抗原)を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合される場合、CARは、免疫細胞を活性化して、その抗原を担持する細胞(例えば、癌細胞)を攻撃および破壊し得る。CARはまた、それらの効力を高めるために共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み得る。Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626)、Finney et al.,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797,Song et al.,Blood 119:696-706(2012)、Kalos et al.,Sci.Transl.Med.3:95(2011)、Porter et al.,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)、およびGross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)、米国特許第7,741,465号、および同第6,319,494号を参照されたい。
本明細書に記載されるキメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、5’から3’までの以下の要素:シグナル配列、DLL3抗原結合ドメイン(例えば、抗DLL3 scFv)、ヒンジおよび膜貫通領域、ならびに1つ以上の連続するシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、DLL-3特異的CARは、5’から3’までの以下の要素:CD8αシグナル配列、本明細書に記載されるDLL3可変重鎖および/または可変軽鎖を含むDLL3 scFv、CD8αヒンジおよび膜貫通領域、41BB細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。(図4、表7)。
いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、安全スイッチおよび/またはモノクローナル抗体特異的エピトープをさらに含む。
a.抗原結合ドメイン
以上で議論されるように、本明細書に記載されるDLL3 CARは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、特定の標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味し、例えば、特定の標的抗原は、DLL3(DLL-3)タンパク質またはその断片であり得る(本明細書では「DLL3抗原」、「DLL3標的抗原」、または「DLL3標的」と交換可能に呼ばれる)。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上のDLL3抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、過剰増殖性疾患に関与する細胞上のDLL3抗原に結合する。
以上で議論されるように、本明細書に記載されるDLL3 CARは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、特定の標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味し、例えば、特定の標的抗原は、DLL3(DLL-3)タンパク質またはその断片であり得る(本明細書では「DLL3抗原」、「DLL3標的抗原」、または「DLL3標的」と交換可能に呼ばれる)。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上のDLL3抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、過剰増殖性疾患に関与する細胞上のDLL3抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、可変重鎖、可変軽鎖、および/または本明細書に記載される1つ以上のCDRを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、軽鎖CDR、CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに重鎖CDR、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、単鎖可変断片(scFv)である。
いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、表1bに示されるVHを含む。いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、表1cに示されるVLを含む。いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、表1eに示される重鎖CDR1、CDR2、CDR3を含む。いくつかの実施形態では、DLL-3特異的CARは、表1fに示される軽鎖CDR1、CDR2、CDR3を含む。
抗原結合ドメインのバリアント(例えば、CDR、VH、および/またはVLのバリアント)もまた、本開示の範囲内であり、例えば、各々が本明細書に記載される抗原結合ドメイン配列のアミノ酸配列と少なくとも70~80%、80~85%、85~90%、90~95%、95~97%、97~99%、または99%超の同一性を有する可変軽鎖および/または可変重鎖である。いくつかの例では、そのような分子は、少なくとも1つの重鎖および1つの軽鎖を含むが、他の例では、バリアント形態は、2つの可変軽鎖および2つの可変重鎖(またはそのサブパート)を含有する。当業者は、周知の技法を使用して、本明細書に記載される抗原結合ドメインの好適なバリアントを決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性にとって重要であるとは考えられない領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変更され得る分子の好適な領域を特定することができる。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインのポリペプチド構造は、それぞれ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある)、およびそれらの断片を含む、抗体に基づく。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、アビマーを含むか、またはそれからなる。
DLL3抗原結合ドメインは、第2の標的に結合するよりも1つの標的に密接に結合する場合、「選択的」であると言われる。
いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメインは、scFvである。いくつかの実施形態では、DLL3特異的CARは、表1dに提供されるscFvを含む。
いくつかの実施形態では、DLL3特異的CARは、リーダーまたはシグナルペプチドを含み、いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、アミノ酸配列MALPVTALLLPLALLLHAARP(配列番号477)と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、配列番号477のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCG(配列番号555)を含む核酸配列によってコードされる。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるDLL3抗原結合ドメインのいずれか1つをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、表10に記載されるDLL3 CARをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドを含むベクター、およびそれを作製する方法も本明細書で提供される。
b.安全スイッチおよびモノクローナル抗体特異的エピトープ
安全スイッチ
免疫細胞(1つ以上のCARを含有する)に自殺遺伝子を形質導入することによって、有害事象が最小限に抑えられ得ることが理解されるであろう。誘導性の「オン」または「促進因子」スイッチを免疫細胞に組み込むことが望ましい場合もあり得る。好適な技法には、細胞が本開示のCAR構築物で形質導入される前、後、またはそれと同時に、誘導性カスパーゼ-9(米国特許出願第2011/0286980号)またはチミジンキナーゼの使用が含まれる。自殺遺伝子および/または「オン」スイッチを導入するための追加の方法には、TALENS、ジンクフィンガー、RNAi、siRNA、shRNA、アンチセンス技術、および当該技術分野で知られている他の技法が含まれる。
安全スイッチ
免疫細胞(1つ以上のCARを含有する)に自殺遺伝子を形質導入することによって、有害事象が最小限に抑えられ得ることが理解されるであろう。誘導性の「オン」または「促進因子」スイッチを免疫細胞に組み込むことが望ましい場合もあり得る。好適な技法には、細胞が本開示のCAR構築物で形質導入される前、後、またはそれと同時に、誘導性カスパーゼ-9(米国特許出願第2011/0286980号)またはチミジンキナーゼの使用が含まれる。自殺遺伝子および/または「オン」スイッチを導入するための追加の方法には、TALENS、ジンクフィンガー、RNAi、siRNA、shRNA、アンチセンス技術、および当該技術分野で知られている他の技法が含まれる。
本開示によれば、追加のオンオフまたは他のタイプの制御スイッチ技法が本明細書に組み込まれ得る。これらの技法は、二量体化ドメインおよびそのようなドメイン二量体化の任意の活性化因子の使用を採用し得る。これらの技法には、例えば、特定の細胞においてFKBP/ラパログ二量体化システムを利用するWu et al.,Science 2014 350(6258)によって記載されるものが含まれ、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化技術は、例えば、Fegan et al.Chem.Rev.2010,110,3315-3336ならびに米国特許第5,830,462号、同第5,834,266号、同第5,869,337号、および同第6,165,787号に記載され、これらの内容も参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化対は、シクロスポリン-A/シクロフィリン、受容体、エストロゲン/エストロゲン受容体(任意にタモキシフェンを使用)、グルココルチコイド/グルココルチコイド受容体、テトラサイクリン/テトラサイクリン受容体、ビタミンD/ビタミンD受容体が含み得る。二量体化技術のさらなる例は、例えば、WO2014/127261、WO2015/090229、US2014/0286987、US2015/0266973、US2016/0046700、米国特許第8,486,693号、US2014/0171649、およびUS2012/0130076に見出すことができ、その内容は、参照によってその全体が本明細書にさらに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のCAR免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)は、例えば、RQR8のような自殺ポリペプチド(suicide polypeptide)をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2013/153391Aを参照されたい。ポリヌクレオチドを含むCAR免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)細胞において、自殺ポリペプチドは、CAR免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)の表面で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号552:
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(配列番号552)に示されるアミノ酸配列を含む。
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(配列番号552)に示されるアミノ酸配列を含む。
自殺ポリペプチドはまた、アミノ末端におけるシグナルペプチド、例えば、MGTSLLCWMALCLLGADHADA(配列番号553)を含み得る。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号554に示されるアミノ酸配列を含み、これは、配列番号553:
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(配列番号554)のシグナル配列を含む。
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(配列番号554)のシグナル配列を含む。
自殺ポリペプチドがCAR免疫細胞(CAR-T細胞)の表面で発現される場合、リツキシマブがポリペプチドのRエピトープに結合することは、細胞の溶解を引き起こす。リツキシマブの2つ以上の分子は、細胞表面で発現されるポリペプチドごとに結合する可能性がある。ポリペプチドの各Rエピトープは、リツキシマブの別々の分子に結合する可能性がある。DLL3特異的CAR免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)の欠失は、例えば、患者にリツキシマブを投与することによって、インビボで起こり得る。移入された細胞を欠失する決定は、例えば、許容されないレベルの毒性が検出される場合など、移入された細胞に起因する患者において検出されている望ましくない影響から生じ得る。
いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、CAR構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、DLL3 CAR構築物の一部ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるDLL3特異的CARのうちのいずれか1つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な(すなわち、これによって特異的に認識される)1つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではmAb特異的エピトープとも称される。例示的なmAb特異的エピトープは、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第WO2016/120216号に開示される。これらの実施形態では、CARの細胞外ドメインは、DLL3に特異的に結合する抗原結合ドメイン、および1つ以上のモノクローナル抗体(mAb)に結合する1つ以上のエピトープを含む。mAb特異的エピトープを含むCARは、単鎖または多鎖であり得る。
本明細書に記載されるCARの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に対して特異的なエピトープの包含は、CARを発現する操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、この特徴はまた、CARを発現する操作された免疫細胞の投与によって枯渇した内因性DLL3発現細胞の回復を促進する。いくつかの実施形態では、枯渇を可能にすることは、例えば対象への投与時の有害な影響の場合に、安全スイッチを提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、mAb特異的エピトープを含むCARを付与された操作された免疫細胞を選別および/または枯渇させるための方法、ならびに内因性DLL3発現細胞の回復を促進するための方法に関する。
いくつかのエピトープ-モノクローナル抗体カップルを使用して、モノクローナル抗体特異的エピトープ、特に、非限定的な例としてのCD20エピトープ/リツキシマブなどの、すでに医療用途で承認されているものを含むCARを生成することができる。
本開示はまた、mAb特異的エピトープを発現するDLL3特異的CARを付与された操作された免疫細胞を選別するための方法、およびこれらのCARを付与された操作された免疫細胞の活性化が、当該CARの外部リガンド結合ドメインを標的とする抗体を使用して細胞を枯渇させることによって調節される治療方法を包含する。表4は、本開示のCARのうちのいずれか1つの細胞外ドメインに挿入することができる例示的なミモトープ配列を提供する。
いくつかの実施形態では、CARの細胞外結合ドメインは、以下の配列:
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-、
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-、
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2、
-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-V1-L1-V2、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x-、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V2、または
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V2-(L)x-エピトープ3-(L)xを含み、
-式中、
-V1は、VLであり、V2は、VHであるか、またはV1は、VHであり、V2は、VLであり、
-L1は、VH鎖をVL鎖に連結するために適したリンカーであり、
-エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3、およびエピトープ4は、mAb特異的エピトープであり、同一であり、または
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-、
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-、
-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2、
-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-V1-L1-V2、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ3-(L)x-、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x-、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x、
-V1-(L)x-エピトープ1-(L)x-V2-(L)x-エピトープ2-(L)x-エピトープ3-(L)x-エピトープ4-(L)x、
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V2、または
-(L)x-エピトープ1-(L)x-V1-(L)x-エピトープ2-(L)x-V2-(L)x-エピトープ3-(L)xを含み、
-式中、
-V1は、VLであり、V2は、VHであるか、またはV1は、VHであり、V2は、VLであり、
-L1は、VH鎖をVL鎖に連結するために適したリンカーであり、
-エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3、およびエピトープ4は、mAb特異的エピトープであり、同一であり、または
c.ヒンジドメイン
本開示のCARの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン(またはヒンジ領域)を含み得る。用語は、一般に、CARにおける膜貫通ドメインをCARにおける細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドを指す。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインにより多くの柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。
本開示のCARの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン(またはヒンジ領域)を含み得る。用語は、一般に、CARにおける膜貫通ドメインをCARにおける細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドを指す。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインにより多くの柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。
ヒンジドメインは、最大300個のアミノ酸、いくつかの実施形態では10~100個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では25~50個のアミノ酸を含み得る。ヒンジドメインは、CD8、CD4、CD28、4-1BB、またはIgGの細胞外領域の全部もしくは一部(特に、IgGのヒンジ領域、ヒンジ領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、もしくはその断片などの免疫グロブリンファミリーのメンバーの一部もしくは全部を含有し得ることが理解されるであろう)、または抗体重鎖定常領域の全部もしくは一部などの、天然発生分子の全部または一部に由来し得る。代替的には、Aドメインは、天然に発生するA配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のA配列であり得る。いくつかの実施形態では、当該Aドメインは、ヒトCD8α鎖(例えば、NP_001139345.1)の一部である。別の特定の実施形態では、当該ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCARのヒンジドメインは、CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1、またはFcγRIIIαのサブ配列、特に、CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1、またはFcγRIIIαのうちのいずれかのヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトCD8αヒンジ、ヒトIgG1ヒンジ、ヒトIgG4、ヒトPD-1、またはヒトFcγRIIIαヒンジを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるCARは、scFv、CD8αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、ならびに4-1BBシグナル伝達ドメインを含む。表5は、本明細書で提供される例示的なヒンジのアミノ酸配列を提供する。
特定の実施形態では、ヒンジ領域は、本明細書において表5に記載される細胞外ドメインアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。
d.膜貫通ドメイン
本開示のCARは、CARの細胞外ドメインに融合している膜貫通ドメインで設計されている。同様に、CARの細胞内ドメインに融合させることができる。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するために、アミノ酸置換によって選択または修飾することができる。いくつかの実施形態では、短いリンカーは、CARの細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのいずれかまたはいくつかの間の結合を形成し得る。
本開示のCARは、CARの細胞外ドメインに融合している膜貫通ドメインで設計されている。同様に、CARの細胞内ドメインに融合させることができる。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するために、アミノ酸置換によって選択または修飾することができる。いくつかの実施形態では、短いリンカーは、CARの細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのいずれかまたはいくつかの間の結合を形成し得る。
本明細書に開示されるCARに適した膜貫通ドメインは、(a)例えば、限定なく、Tヘルパー(Th)細胞、細胞毒性T(Tc)細胞、T調節性(Treg)細胞、もしくはナチュラルキラー(NK)細胞などのリンパ球細胞などの免疫細胞を表面で発現する能力、ならびに/または(b)標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を誘導するために細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。
膜貫通ドメインは、天然または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
本開示における特定の使用の膜貫通領域は、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来(これを含むか、またはこれに対応)し得る。
非限定的な例として、膜貫通領域は、T細胞受容体、例えば、CD3複合体を構成するα、β、γ、もしくはδポリペプチド、IL-2受容体p55(鎖)、p75(β鎖)もしくはγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖、特にFcγ受容体IIIもしくはCDタンパク質に由来するか、またはその一部分であり得る。代替的には、膜貫通ドメインは、合成的であり得、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、当該膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖(例えば、NP_001139345.1)に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示のCARにおける膜貫通ドメインは、CD8α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のCARにおける膜貫通ドメインは、アミノ酸配列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(配列番号549)を含むCD8α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、CD8α膜貫通ドメインは、配列番号549の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のCARにおけるヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号479のアミノ酸配列を含むCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のCARにおける膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のCARにおける膜貫通ドメインは、FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号550)のアミノ酸配列を含むCD28膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、CD28膜貫通ドメインは、配列番号550の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
e.細胞内ドメイン
本開示のCARの細胞内(細胞質)ドメインは、CARを含む免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化、例えば、シグナル1/活性化および/またはシグナル2/共刺激を提供することができる。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性を指し得る。
いくつかの実施形態では、CARにおける使用のための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定なく、抗原受容体の連結後にシグナル形質導入を開始するように協調して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。
本開示のCARの細胞内(細胞質)ドメインは、CARを含む免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化、例えば、シグナル1/活性化および/またはシグナル2/共刺激を提供することができる。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性を指し得る。
いくつかの実施形態では、CARにおける使用のための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定なく、抗原受容体の連結後にシグナル形質導入を開始するように協調して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。
好適な(例えば、活性化)細胞内ドメインは、これらに限定されないが、CD3ゼータ、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来する(または対応する)シグナル伝達ドメインを含むことが理解されるであろう。
本開示のCARの細胞内ドメインは、以上に記載される活性化ドメインに加えて、それらの効力を高めるために、共刺激シグナル伝達ドメイン(本明細書では共刺激分子と交換可能に呼ばれる)を組み込み得る。共刺激ドメインは、本明細書に記載される活性化分子によって提供される一次シグナルに加えてシグナルを提供することができる。
本開示の範囲内の好適な共刺激ドメインは、例えば、CD28、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14、TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNFR、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83リガンド、またはそれらの断片もしくは組み合わせに由来(または対応)することができる。以上に列挙されていない、追加の共刺激分子、またはその断片は、本開示の範囲内にあることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、CARの細胞内/細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のCARの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、41BB/CD137ドメインを含むように設計することができる。41BB/CD137の完全天然アミノ酸配列は、NCBI参照配列:NP_001552.2に記載される。完全天然41BB/CD137核酸配列は、NCBI参照配列:NM_001561.5に記載される。
いくつかの実施形態では、CARの細胞内/細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のCARの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、CD28ドメインを含むように設計することができる。CD28の完全天然アミノ酸配列は、NCBI参照配列:NP_006130.1に記載される。完全天然CD28核酸配列は、NCBI参照配列:NM_006139.1に記載される。
いくつかの実施形態では、CARの細胞内/細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のCARの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、CD3ゼータドメインを含むように設計することができる。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、表7における配列番号481で示されるアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも80%、少なくとも90%、95%、97%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、CARの細胞内ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達分子の一部分を含むことができる。本開示のCARの細胞内シグナル伝達部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結され得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ゼータの活性化ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ゼータの活性化ドメインおよび4-1BBの共刺激/シグナル伝達ドメインを含むように設計される。
いくつかの実施形態では、4-1BB(細胞内ドメイン)は、アミノ酸配列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号480)を含む。いくつかの実施形態では、4-1BB(細胞内ドメイン)は、核酸配列:AAGCGCGGCAGGAAGAAGCTCCTCTACATTTTTAAGCAGCCTTTTATGAGGCCCGTACAGACAACACAGGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCAGATTTCCCGAGGAGGAGGAAGGTGGGTGCGAGCTG(配列番号568)によってコードされる。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号480)を含む。いくつかの実施形態では、4-1BB(細胞内ドメイン)は、核酸配列:AAGCGCGGCAGGAAGAAGCTCCTCTACATTTTTAAGCAGCCTTTTATGAGGCCCGTACAGACAACACAGGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCAGATTTCCCGAGGAGGAGGAAGGTGGGTGCGAGCTG(配列番号568)によってコードされる。
いくつかの実施形態では、CARにおける細胞内ドメインは、CD28およびCD3ゼータの一部分を含むように設計され、細胞内CD28は、配列番号567に示される核酸配列を含む。
AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCC ACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC(配列番号567)。
AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCC ACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC(配列番号567)。
いくつかの実施形態では、CARにおける細胞内ドメインは、アミノ酸配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号551)を含むように設計される。CD3ゼータアミノ酸配列は、配列番号481または469を含み得、核酸配列は、配列番号569:
AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG(配列番号569)を含み得る。
AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG(配列番号569)を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BB(GenBank:AAA53133)およびCD28(NP_006130.1)の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。いくつかの実施形態では、本開示のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号480および配列番号551で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号480に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、95%、97%、もしくは99%の配列同一性、および/または配列番号551に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、95%、97%、もしくは99%の配列同一性を含む、アミノ酸配列を含む。
例示的な実施形態では、本開示のCARは、N末端からC末端まで、(切断可能な)CD8αシグナル配列、DLL3 scFv、CD8αヒンジおよび膜貫通領域、4-1BB細胞質(共刺激)シグナル伝達ドメイン、ならびにCD3ζ細胞質(刺激)シグナル伝達ドメインを含む。
III.CARを含む免疫細胞
a.免疫細胞
本開示のCARを発現する操作された免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)が本明細書で提供される。
a.免疫細胞
本開示のCARを発現する操作された免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、CARの集団を含み、各CARは、異なる細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、CARの集団を含み、各CARは、同じ細胞外抗原結合ドメインを含む。
操作された免疫細胞は、同種または自家であり得る。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、T細胞(例えば、炎症性Tリンパ球、細胞毒性Tリンパ球、調節性Tリンパ球(Treg)、ヘルパーTリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球(TIL))、ナチュラルキラーT細胞(NKT)、TCR発現細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、またはB細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、T細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、ガンマデルタT細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、マクロファージである。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、例えば、限定なく、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、臍帯血から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃(例えば、遺伝子銃)、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、ウイルストランスフェクション(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、AAV)、またはポリプレックスからなる群から選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される。
いくつかの実施形態では、それらの細胞表面膜で本開示のDLL3特異的CARを発現する操作された免疫細胞は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%を超える幹細胞メモリーおよびセントラルメモリー細胞のパーセンテージを含む。いくつかの実施形態では、それらの細胞表面膜で本開示のDLL3特異的CARを発現する操作された免疫細胞は、約10%~約100%、約10%~約90%、約10%~約80%、約10%~約70%、約10%~約60%、約10%~約50%、約10%~約40%、約10%~約30%、約10%~約20%、約15%~約100%、約15%~約90%、約15%~約80%、約15%~約70%、約15%~約60%、約15%~約50%、約15%~約40%、約15%~約30%、約20%~約100%、約20%~約90%、約20%~約80%、約20%~約70%、約20%~約60%、約20%~約50%、約20%~約40%、約20%~約30%、約30%~約100%、約30%~約90%、約30%~約80%、約30%~約70%、約30%~約60%、約30%~約50%、約30%~約40%、約40%~約100%、約40%~約90%、約40%~約80%、約40%~約70%、約40%~約60%、約40%~約50%、約50%~約100%、約50%~約90%、約50%~約80%、約50%~約70%、約50%~約60%、約60%~約100%、約60%~約90%、約60%~約80%、約60%~約70%、約70%~約90%、約70%~約80%、約80%~約100%、約80%~約90%、約90%~約100%、約25%~約50%、約75%~約100%、または約50%~約75%の幹細胞メモリーおよびセントラルメモリー細胞のパーセンテージを含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるCARのうちのいずれか1つを発現する炎症性Tリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるCARのうちのいずれか1つを発現する細胞毒性Tリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるCARのうちのいずれか1つを発現する調節性Tリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるCARのうちのいずれか1つを発現するヘルパーTリンパ球である。
増殖および遺伝学的修飾の前に、細胞の供給源は、さまざまな非限定的な方法を通じて対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつもの非限定的な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、当業者に利用可能であり、既知である任意の数のT細胞株を使用し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健常ドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の部分であり得る。
上記の方法のうちのいずれかに従って形質転換された免疫細胞(例えば、T細胞)から得られる細胞株も本明細書で提供される。免疫抑制治療に耐性のある修飾細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示による単離された細胞は、CARをコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示の免疫細胞は、一般に知られている方法を使用して、免疫細胞の遺伝子修飾の前または後のいずれかで、活性化および増殖することができる。一般に、本開示の操作された免疫細胞は、例えば、T細胞に対する活性化シグナルを作成するために、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激する薬剤と接触することにより、増殖し得る。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)、またはフィトヘマグルチニン(PHA)のような分裂促進性レクチンのような化学物質を、T細胞に対する活性化シグナルを作成するために使用し得る。
いくつかの実施形態では、T細胞集団は、例えば、OKT3抗体などの抗CD3抗体、もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上に固定された抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わされたプロテインキナーゼC活性化因子(例えば、ブリオスタチン)との接触によって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子を結合するリガンドを、使用する。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗CD3抗体(例えば、OKT3抗体)および抗CD28抗体と接触され得る。抗CD3抗体および抗CD28抗体は、プラスチックもしくは磁気ビーズなどのビーズ、またはプレートもしくは他の基板上に配置することができる。T細胞培養に適した条件は、血清(例えば、ウシ胎児もしくはヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFベータ、およびTNF、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地(例えば、Minimal Essential MediaもしくはRPMI Media 1640、またはX-vivo 15(Lonza))を含む。細胞の成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート(plasmanate)、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清(もしくは血漿)もしくは定義されたセットのホルモン、ならびに/またはT細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカイン(例えば、IL-7および/またはIL-15)が補充されているかのいずれかである、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象中に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するために必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気および5%CO2)下で維持される。さまざまな刺激時間に曝露されているT細胞は、異なる特徴を呈することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖され得る。細胞はまた、例えば、細胞を対象中に投与した後、対象の血液においてインビボで増殖され得る。
いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、1つ以上の破壊または不活化された遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、CD52、DLL3、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα、およびTCRβからなる群から選択される1つの破壊もしくは不活化された遺伝子を含み、かつ/またはCAR、多重鎖CAR、および/もしくはpTα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、多重鎖CARを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示による単離された細胞は、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、DLL3およびCD52、DLL3およびTCRα、DLL3およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβ、PD-1およびTCRα、PD-1およびTCRβ、CTLA-4およびTCRα、CTLA-4およびTCRβ、LAG3およびTCRα、LAG3およびTCRβ、TIM3およびTCRα、Tim3およびTCRβ、BTLAおよびTCRα、BTLAおよびTCRβ、BY55およびTCRα、BY55およびTCRβ、TIGITおよびTCRα、TIGITおよびTCRβ、B7H5およびTCRα、B7H5およびTCRβ、LAIR1およびTCRα、LAIR1およびTCRβ、SIGLEC10およびTCRα、SIGLEC10およびTCRβ、2B4およびTCRα、2B4およびTCRβからなる群から選択される2つの破壊もしくは不活化された遺伝子を含み、かつ/またはCAR、多重鎖CAR、およびpTα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、方法は、選択的DNA切断によって遺伝子を選択的に不活化することができるエンドヌクレアーゼを細胞中に導入することによって1つ以上の遺伝子を破壊または不活化することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、メガTALヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALE-ヌクレアーゼ/TALEN)、またはCRISPR(例えば、Cas9)エンドヌクレアーゼであり得る。
いくつかの実施形態では、TCRは、TCRα遺伝子および/またはTCRβ遺伝子を破壊または不活化することにより、本開示に従って、細胞において機能的ではなくなる。いくつかの実施形態では、個体に由来する修飾細胞を得る方法が提供され、細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)シグナル伝達経路とは独立して増殖することができる。MHCシグナル伝達経路とは独立して増殖することができ、この方法によって得られやすい修飾細胞は、本開示の範囲に含まれる。本明細書に開示される修飾細胞は、宿主対移植片(HvG)拒絶および移植片対宿主病(GvHD)に対して治療を必要とする患者を治療するために使用することができ、したがって、宿主対移植片(HvG)拒絶および移植片対宿主病(GvHD)に対して治療を必要とする患者を治療する方法であって、当該患者に破壊または不活化されたTCRαおよび/またはTCRβ遺伝子を含む有効量の修飾細胞を投与することによって当該患者を治療することを含む方法は、本開示の範囲内である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、1つ以上の化学療法薬に耐性があるように操作される。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体(PNA)であり得、したがって、免疫細胞を、養子免疫療法と化学療法を組み合わせた癌治療に適したものにする。例示的なPNAは、例えば、クロファラビン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびシタラビンを、単独でまたは組み合わせて含む。PNAは、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)によって一リン酸、二リン酸、および三リン酸のPNAに代謝される。それらの三リン酸型は、DNA合成についてATPと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)の強力な阻害剤である。破壊または不活化されたdCK遺伝子を含むDLL3特異的CAR-T細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、dCKノックアウト細胞は、例えば、mRNAのエレクトロポレーションによる、dCK遺伝子に指向した特定のTALヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用するT細胞のトランスフェクションによって作製される。dCKノックアウトDLL3特異的CAR-T細胞は、例えば、クロロファラビンおよび/またはフルダラビンを含むPNAに耐性があり、DLL3発現細胞に対するT細胞の細胞毒性活性を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の単離された細胞または細胞株は、pTαまたはその機能的バリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞または細胞株は、TCRα遺伝子を破壊または不活化することによってさらに遺伝子修飾され得る。
本開示はまた、本明細書に記載されるCARポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、CARは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受けた細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーを含むことができる。
CARポリペプチドは、CARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞中への導入後に、細胞においてインサイチュで合成され得る。代替的には、CARポリペプチドは、細胞の外側で産生され、次いで細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞中に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、(例えば、レンチウイルスベクターを使用する)安定な形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム中に組み込むことができる。他の実施形態では、一過性形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノム中に組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過的に発現することができる。他の実施形態では、ウイルス媒介性方法が、使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどのような任意の好適な手段によって細胞中に導入され得る。一過性形質転換方法は、例えば、限定なく、微量注射、電気穿孔または粒子衝撃を含む。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、DLL3抗原結合ドメイン、少なくとも1つの共刺激分子、および活性化ドメインをコードする第1のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクター内に含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、SFGベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミド内に含まれる。
b.作製の方法
本開示のCARおよびCAR含有免疫細胞を作製する方法が本明細書で提供される。
本開示のCARおよびCAR含有免疫細胞を作製する方法が本明細書で提供される。
本開示による、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合ドメイン、免疫細胞、組成物などを作製する際に、様々な既知の技法を利用することができる。
本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作または遺伝子修飾の前に、細胞を対象から得ることができる。DLL3 CARを発現する細胞は、同種または自家プロセスに由来し得る。
i.供給源材料
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞を含む。T細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から得られることができる。特定の実施形態では、T細胞は、FICOLL(商標)分離などの、当業者に知られている任意の数の技法を使用して、対象から収集される血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞を含む。T細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から得られることができる。特定の実施形態では、T細胞は、FICOLL(商標)分離などの、当業者に知られている任意の数の技法を使用して、対象から収集される血液の単位から得ることができる。
細胞は、アフェレーシスによって個体の循環血液から得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む、リンパ球を含有する。特定の実施形態では、アフェレーシスによって収集される細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され得、その後の処理のために適切なバッファーまたは培地に入れられ得る。
特定の実施形態では、T細胞は、例えば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離を使用して、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、PBMCから単離される。T細胞の特定の亜集団(例えば、CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-、CD45RO+、CDS+、CD62-、CD95-、CD95+、IL2Rβ+、IL2Rβ-、CCR7+、CCR7-、CDL-、CD62L+、およびそれらの組み合わせ)は、当該技術分野で知られている正または負の選択技法によってさらに単離することができる。一例では、T細胞の亜集団は、CD45RA+、CD95-、IL-2Rβ-、CCR7+、CD62L+である。一例では、T細胞の亜集団は、CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+である。一例では、T細胞の亜集団は、CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+である。一例では、T細胞の亜集団は、CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-である。一例では、T細胞の亜集団は、CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-である。例えば、負の選択によるT細胞集団の富化は、負の選択をされた細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成することができる。本明細書における使用のための1つの方法は、負の選択をされた細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、負の選択によってCD4+細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞選別もまた、本開示における使用のために目的の細胞集団を単離するために使用され得る。
PBMCは、本明細書に記載される方法を使用して、免疫細胞(CARまたはTCRなど)による遺伝子修飾に直接使用され得る。特定の実施形態では、PBMCを単離した後、Tリンパ球は、さらに単離することができ、細胞毒性およびヘルパーTリンパ球の両方は、遺伝子修飾および/または増殖の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターT細胞亜集団に選別することができる。
いくつかの実施形態では、CD8+細胞は、これらのタイプのCD8+細胞の各々に関連する特徴的な細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、幹細胞メモリー、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞にさらに選別される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT細胞の表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、およびCD127を含み、グランザイムBに対して陰性である。いくつかの実施形態では、幹細胞メモリーT細胞は、CD45RO-、CD62L+、CD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT細胞は、CD45RO+、CD62L+、CD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターT細胞は、CD62L、CCR7、CD28、およびCD127に対して陰性であり、グランザイムBおよびパーフォリンに対して陽性である。
特定の実施形態では、CD4+T細胞は、亜集団にさらに選別される。例えば、CD4+Tヘルパー細胞は、特徴的な細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に選別することができる。
iii.幹細胞由来の免疫細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導性多能性幹細胞、iPSC、造血幹細胞、および間葉系幹細胞などの、幹細胞に由来し得る。iPS細胞および他のタイプの幹細胞は、培養された不死細胞株であるか、または患者から直接単離され得る。幹細胞を単離、発達、および/または培養するための様々な方法が当該技術分野で知られており、本発明を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導性多能性幹細胞、iPSC、造血幹細胞、および間葉系幹細胞などの、幹細胞に由来し得る。iPS細胞および他のタイプの幹細胞は、培養された不死細胞株であるか、または患者から直接単離され得る。幹細胞を単離、発達、および/または培養するための様々な方法が当該技術分野で知られており、本発明を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、再プログラム化T細胞に由来する人工多能性幹細胞(iPSC)である。いくつかの実施形態では、供給源材料は、T細胞または非T細胞に由来する人工多能性幹細胞(iPSC)であり得る。あるいは、供給源材料は、B細胞、または末梢血単核細胞分離株からの任意の他の細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、または任意の他の体細胞型であり得る。
ii.単離された細胞の遺伝子修飾
T細胞などの免疫細胞は、既知の方法を使用して単離後に遺伝子修飾することができるか、または免疫細胞は、遺伝子修飾される前にインビトロで活性化および増殖(または前駆細胞の場合は分化)することができる。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性TCRαおよび/またはCD52の発現を低減または排除するように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術(例えば、CRISPR/Cas9、CRISPR/CAS12、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、MegaTAL、メガヌクレアーゼ)を使用して遺伝子修飾されて、内因性タンパク質の発現を低減または排除する(例えば、TCRαおよび/またはCD52)。別の実施形態では、T細胞などの免疫細胞は、任意に、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体でさらに遺伝子修飾され(例えば、CARをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入され)、次いで活性化および/またはインビトロで増殖される。
T細胞などの免疫細胞は、既知の方法を使用して単離後に遺伝子修飾することができるか、または免疫細胞は、遺伝子修飾される前にインビトロで活性化および増殖(または前駆細胞の場合は分化)することができる。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性TCRαおよび/またはCD52の発現を低減または排除するように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術(例えば、CRISPR/Cas9、CRISPR/CAS12、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、MegaTAL、メガヌクレアーゼ)を使用して遺伝子修飾されて、内因性タンパク質の発現を低減または排除する(例えば、TCRαおよび/またはCD52)。別の実施形態では、T細胞などの免疫細胞は、任意に、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体でさらに遺伝子修飾され(例えば、CARをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入され)、次いで活性化および/またはインビトロで増殖される。
T細胞を活性化および増殖するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第6,905,874号、米国特許第6,867,041号、米国特許第6,797,514号、およびPCT WO2012/079000に記載され、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。一般に、そのような方法は、IL-2などの適切なサイトカインを含む培養培地において、PBMCまたは単離されたT細胞を刺激分子および共刺激分子、例えば、一般にプラスチックもしくは磁気ビーズまたは他の表面に付着した、抗CD3および抗CD28抗体と接触させることを含む。同じビーズに付着した抗CD3および抗CD28抗体は、「サロゲート」抗原提示細胞(APC)として機能する。一例は、ヒトT細胞の生理学的活性化のためのCD3/CD28活性化因子/刺激因子システムである、Dynabeads(登録商標)システムである。他の実施形態では、T細胞は、それらの内容が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,040,177号、米国特許第5,827,642号、およびWO2012/129514に記載されるものなどの方法を使用して、フィーダー細胞ならびに適切な抗体およびサイトカインで増殖するように活性化および刺激され得る。
本開示の構築物および操作された免疫細胞を作製するための特定の方法は、PCT出願PCT/US15/14520に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
PBMCは、NK細胞またはNKT細胞などの他の細胞毒性リンパ球をさらに含むことができることが理解されるであろう。本明細書に開示されるようなキメラ受容体のコード配列を保有する発現ベクターは、ヒトドナーT細胞、NK細胞、またはNKT細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを保有する成功裏に形質導入されたT細胞を、フローサイトメトリーを使用して選別して、CD3陽性T細胞を単離し、次いでさらに増殖させて、抗CD3抗体およびIL-2または本明細書の他の場所に記載される当該技術分野で知られる他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのCAR発現T細胞の数を増加することができる。標準的な手順は、ヒト対象における使用のための保存および/または調製のためにCARを発現するT細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、T細胞のインビトロ形質導入、培養、および/または増殖は、ウシ胎児血清(fetal calf serumおよびfetal bovine serum)などの非ヒト動物由来産物の不在下で行われる。一実施形態では、凍結保存は、CryoStor(登録商標)CS10、CryoStor(登録商標)CS2、またはCryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions)などの好適な培地において凍結することを含むことができる。
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターは、宿主細胞(単離された宿主細胞)に導入され、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、その中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅し得る。クローニングベクターは、一般に、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択可能なマーカーを含むが、これらに限定されない、配列成分を含有し得る。これらの要素は、当業者によって適切に選択され得る。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進するように選択され得る。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現またはクローニングに有用であり得る。好適な宿主細胞には、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞、より具体的にはヒト細胞が含まれ得る。
ベクターは、DEAE-デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル衝撃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサン、およびペプチドによって媒介される送達を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して宿主細胞に導入することができる。目的のベクターの発現のための細胞のウイルストランスフェクションおよび形質転換のための標準的な方法は、当該技術分野でよく知られている。さらなる実施形態では、異なる発現ベクターの混合物は、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子修飾する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書に開示されるように異なるCARをコードする。結果として生じる形質導入された免疫エフェクター細胞は、操作された細胞の混合集団を形成し、ある割合の操作された細胞が2つ以上の異なるCARを発現する。
一実施形態では、本開示は、DLL3タンパク質を標的とするCARを発現する遺伝子操作された細胞を保存する方法を提供する。一実施形態では、これは、細胞が解凍時に生存し続けるように免疫細胞を凍結保存することを含む。一実施形態では、凍結保存は、CryoStor(登録商標)CS10、CryoStor(登録商標)CS2、またはCryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions)などの好適な培地において凍結することを含むことができる。CARを発現する免疫細胞の画分は、悪性腫瘍に罹患した患者の将来の治療のためにそのような細胞の恒久的な供給源を提供するために、当該技術分野で知られている方法によって凍結保存することができる。必要に応じて、凍結保存された形質転換免疫細胞は、解凍し、成長させ、より多くのそのような細胞のために増殖させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、まずそれらの培養培地からそれらを採取し、次いで治療有効量での投与に適した培地および容器システム(「薬学的に許容される」担体)において細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には正常生理食塩水、Normosol(商標)R(Abbott)、またはPlasma-Lyte(商標)A(Baxter)であり得るが、水中の5%デキストロースまたはリンゲルの乳酸も利用することができる。注入培地には、ヒト血清アルブミンを補充することができる。
iv.同種CAR T細胞
簡潔には、同種CAR T療法、またはAlloCAR(商標)を製造するためのプロセスには、健康なドナーから健康な、選択され、スクリーニングされ、試験されたT細胞を採取することが含まれる。同種T細胞は、移植片対宿主病(GvHD)のリスクを低減し、同種拒絶を防止するための遺伝子編集である。選択されたT細胞受容体遺伝子(例えば、TCRα、TCRβ)は、GvHDを回避するためにノックアウトされる。CD52遺伝子をノックアウトして、CAR T産物を抗CD52抗体治療に対して耐性にすることもできる。したがって、抗CD52抗体治療を使用して、宿主免疫系をリンパ球枯渇させ、CAR T細胞を生着したままにさせて、完全な治療効果を達成することができる。次に、T細胞は、血液腫瘍または固形腫瘍で発現する特定の細胞表面タンパク質(例えば、DLL-3)を認識する、CARを発現するように操作される。次いで、操作されたT細胞は、精製ステップを経て、最終的には患者への送達のためにバイアルにおいて凍結保存される。
簡潔には、同種CAR T療法、またはAlloCAR(商標)を製造するためのプロセスには、健康なドナーから健康な、選択され、スクリーニングされ、試験されたT細胞を採取することが含まれる。同種T細胞は、移植片対宿主病(GvHD)のリスクを低減し、同種拒絶を防止するための遺伝子編集である。選択されたT細胞受容体遺伝子(例えば、TCRα、TCRβ)は、GvHDを回避するためにノックアウトされる。CD52遺伝子をノックアウトして、CAR T産物を抗CD52抗体治療に対して耐性にすることもできる。したがって、抗CD52抗体治療を使用して、宿主免疫系をリンパ球枯渇させ、CAR T細胞を生着したままにさせて、完全な治療効果を達成することができる。次に、T細胞は、血液腫瘍または固形腫瘍で発現する特定の細胞表面タンパク質(例えば、DLL-3)を認識する、CARを発現するように操作される。次いで、操作されたT細胞は、精製ステップを経て、最終的には患者への送達のためにバイアルにおいて凍結保存される。
v.自家CAR T細胞
自家キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、患者自身の細胞(例えば、T細胞を含む白血球)を収集し、T細胞を遺伝子操作して、1つ以上の特異的癌細胞の細胞表面に発現した標的抗原を認識し、癌細胞を殺滅するCARを発現させることを含む。次いで、操作された細胞は凍結保存され、その後、操作のために細胞が取り出された患者に投与される。
自家キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、患者自身の細胞(例えば、T細胞を含む白血球)を収集し、T細胞を遺伝子操作して、1つ以上の特異的癌細胞の細胞表面に発現した標的抗原を認識し、癌細胞を殺滅するCARを発現させることを含む。次いで、操作された細胞は凍結保存され、その後、操作のために細胞が取り出された患者に投与される。
IV.治療の方法
本開示は、患者における望ましくないおよび/または上昇したDLL3レベルに関連する状態を治療または予防するための方法を含み、それを必要とする患者に有効量の少なくとも1つのCAR、または本明細書に開示されるCARを含む免疫細胞を投与することを含む。
本開示は、患者における望ましくないおよび/または上昇したDLL3レベルに関連する状態を治療または予防するための方法を含み、それを必要とする患者に有効量の少なくとも1つのCAR、または本明細書に開示されるCARを含む免疫細胞を投与することを含む。
癌を含む、疾患または障害を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、有効量の本出願の操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象におけるT細胞媒介性免疫応答を形成することに関する。いくつかの実施形態では、T細胞媒介性免疫応答は、標的細胞に対して向けられる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、当該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載される少なくとも1つの単離された抗原結合ドメインを投与することを含む。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、当該方法は、それを必要とする対象に、有効量の少なくとも1つの免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、少なくとも1つのキメラ抗原受容体、および/または本明細書に記載される単離された抗原結合ドメインを含む。本開示の免疫細胞を含有するCARは、DLL3の異常発現を伴う悪性腫瘍を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞を含有するCARを使用して、小細胞肺癌、黒色腫、低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺髄様癌、カルチノイド、膵臓、膀胱、および前立腺における分散性神経内分泌腫瘍、精巣癌、ならびに神経内分泌特徴を有する肺腺癌などの悪性腫瘍を治療することができる。例示的な実施形態では、CAR含有免疫細胞、例えば、本開示の抗DLL3 CAR-T細胞は、小細胞肺癌を治療するために使用される。
本開示の操作された細胞を対象に投与することを含む、対象における腫瘍のサイズを低減するための方法も提供され、細胞は、DLL3抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を含み、腫瘍上のDLL3抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍、またはリンパ腫もしくは白血病などの血液悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、小細胞肺癌に見られる腫瘍床などの腫瘍床に送達される。いくつかの実施形態では、癌は、対象の骨髄に存在する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、自家免疫細胞、例えば、自家T細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種免疫細胞、例えば、同種T細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、異種免疫細胞、例えば、異種T細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、エクスビボでトランスフェクトまたは形質導入される。本明細書で使用される場合、「インビトロ細胞」という用語は、エクスビボで培養される任意の細胞を指す。
治療剤、例えば、操作されたCAR T細胞の「治療有効量」、「有効用量」、「有効量」、または「治療有効投与量」は、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用される場合、疾患の発症に対して対象を保護するか、または疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、もしくは疾患の苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防によって証明される疾患の退行を促進する任意の量である。疾患の退行を促進する治療剤の能力は、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデルシステムにおいてなど、熟練した従事者(例えば、医師もしくは臨床医)に知られている様々な方法を使用して、またはインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによって評価することができる。
「患者」および「対象」という用語は、交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物対象、ならびに正式に診断された障害を有する対象、正式に認識された障害を有しない対象、医療処置を受けている対象、障害を発症するリスクのある対象などを含む。
「治療する」および「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置、および対象が障害または他のリスク因子を発症するリスクを低減する用途を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または潜在的リスク因子を低減する実施形態を包含する。「予防する」という用語は、事象の可能性の100%排除を必要としない。むしろ、それは、化合物または方法の存在下で事象の発生の可能性が低減したことを示す。
組成物中の細胞の所望の治療総量は、少なくとも2つの細胞(例えば、少なくとも1つのCD8+T細胞および少なくとも1つのCD4+T細胞、もしくは2つのCD8+T細胞、もしくは2つのCD4+T細胞)を含むか、またはより典型的には102個超の細胞、および最大106個、最大108または109個の細胞であり、1010または1012個以上の細胞であり得る。細胞の数は、組成物が意図される所望の用途、およびそこに含まれる細胞のタイプに依存するであろう。所望の細胞の密度は、典型的には106細胞/ml超であり、一般的には107細胞/ml超であり、一般的には108細胞/ml以上である。臨床的に関連する数の免疫細胞を、105、106、107、108、109、1010、1011、または1012個の細胞に累積的に等しいか、またはこれを超える複数の注入に分配することができる。本開示のいくつかの態様では、特に、すべての注入された細胞が特定の標的抗原(例えば、DLL3)に向け直されるので、106/キログラム(患者あたり106~1011)の範囲の、より低い数の細胞が投与され得る。CAR治療は、これらの範囲内の投与量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受けている患者に対して自家、同種、または異種であり得る。
いくつかの実施形態では、CAR T細胞の治療有効量は、約1X105細胞/kg、約2X105細胞/kg、約3X105細胞/kg、約4X105細胞/kg、約5X105細胞/kg、約6X105細胞/kg、約7X105細胞/kg、約8X105細胞/kg、約9X105細胞/kg、2X106細胞/kg、約3X106細胞/kg、約4X106細胞/kg、約5X106細胞/kg、約6X106細胞/kg、約7X106細胞/kg、約8X106細胞/kg、約9X106細胞/kg、約1X107細胞/kg、約2X107細胞/kg、約3X107細胞/kg、約4X107細胞/kg、約5X107細胞/kg、約6X107細胞/kg、約7X107細胞/kg、約8X107細胞/kg、または約9X107細胞/kgである。
いくつかの実施形態では、CAR+/CAR-T+細胞の標的用量は、約1×106~約1×1010細胞/kgの範囲、例えば、約1×106細胞/kg、約1×107細胞/kg、約1×108細胞/kg、約1×109細胞/kg、または約1×1010細胞/kgである。この範囲の上下の用量は、特定の対象に適切であり得、適切な用量レベルは、必要に応じて医療提供者によって決定され得ることが理解されるであろう。加えて、本開示に従って、細胞の複数用量を提供することができる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される少なくとも1つの抗原結合ドメインおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、追加の活性剤をさらに含む。
本開示のCAR発現細胞集団は、単独で、または希釈剤および/またはIL-2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わされた薬学的組成物として投与され得る。本開示の薬学的組成物は、1つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるT細胞などのCAR発現細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファー、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
薬学的組成物(溶液、懸濁液など)は、以下:無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸;バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張性の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースのうちの1つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。治療用途について、注射可能な薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
いくつかの実施形態では、患者への投与時に、それらの細胞表面で本明細書に記載されるDLL3特異的CARのうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞は、患者の内因性DLL3発現細胞を低減、殺滅、または溶解し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるDLL3特異的CARのうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞によるDLL3発現内因性細胞またはDLL3を発現する細胞株の細胞のパーセンテージ低減または溶解は、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%以上である。一実施形態では、本明細書に記載されるDLL3特異的CARのうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞によるDLL3発現内因性細胞またはDLL3を発現する細胞株の細胞のパーセンテージ低減または溶解は、約5%~約95%、約10%~約95%、約10%~約90%、約10%~約80%、約10%~約70%、約10%~約60%、約10%~約50%、約10%~約40%、約20%~約90%、約20%~約80%、約20%~約70%、約20%~約60%、約20%~約50%、約25%~約75%、または約25%~約60%である。一実施形態では、内因性DLL3発現細胞は、内因性DLL3発現骨髄細胞である。
一実施形態では、本開示のDLL3特異的CARをそれらの細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞による、標的細胞、例えば、DLL3を発現する細胞株のパーセント低減または溶解を、本明細書に開示されるアッセイを使用して測定することができる。
方法は、本明細書で提供される操作された細胞を投与する前に、1つ以上の化学療法剤を患者に投与することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇(プレコンディショニング)化学療法剤である。例えば、T細胞療法を必要とする患者をコンディショニングする方法は、患者に特定の有益な用量のシクロホスファミド(200mg/m2/日~2000mg/m2/日、約100mg/m2/日~約2000mg/m2/日、例えば、約100mg/m2/日、約200mg/m2/日、約300mg/m2/日、約400mg/m2/日、約500mg/m2/日、約600mg/m2/日、約700mg/m2/日、約800mg/m2/日、約900mg/m2/日、約1000mg/m2/日、約1500mg/m2/日、または約2000mg/m2/日)、および特定の用量のフルダラビン(20mg/m2/日~900mg/m2/日、約10mg/m2/日~約900mg/m2/日、例えば、約10mg/m2/日、約20mg/m2/日、約30mg/m2/日、約40mg/m2/日、約40mg/m2/日、約50mg/m2/日、約60mg/m2/日、約70mg/m2/日、約80mg/m2/日、約90mg/m2/日、約100mg/m2/日、約500mg/m2/日、または約900mg/m2/日)を投与することを含む。例示的な投与レジメンは、治療有効量の操作されたT細胞の患者への投与前3日間に、約30mg/m2/日のフルダラビンを投与することと組み合わせて、またはその前もしくはその後に、約300mg/m2/日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、対象を治療することを伴う。
いくつかの実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞がCD52の表面発現を除去または最小化するように遺伝子編集されている場合に、リンパ枯渇は、アレムツズマブのような抗CD52抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、CD52抗体は、約1~20mg/日のIV、例えば、約13mg/日のIVの用量で、1、2、3日以上投与される。抗体は、リンパ枯渇レジメンの他の要素(例えば、シクロホスファミドおよび/またはフルダラビン)の投与と組み合わせて、その前に、またはその後に、投与され得る。
他の実施形態では、抗原結合ドメイン、形質導入された(またはそうでなければ操作された)細胞、および化学療法剤は、各々対象における疾患または状態を治療するために有効な量で投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるCAR発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と組み合わされて投与され得る。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(商標))などのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート;ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド、およびトリメチルオロメラミンレスメを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスウレア;アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質;メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU)などの代謝拮抗剤;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FUなどのピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤;フロリン酸などの葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルフォルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシッド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル(TAXOL(商標)、Bristol-Myers Squibb)、およびドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer);クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RF S2000;ジフルオロメチルオミチン(DMFO);Targretin(商標)(ベキサロテン)、Panretin(商標)、(アリトレチノイン)などのレチノイン酸誘導体;ONTAK(商標)(デニロイキンジフチトクス);エスペラミシン;カペシタビン;ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(ファレストン)を含む抗エストロゲン;ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤;および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。必要に応じて、CHOP、すなわち、シクロホスファミド(Cytoxan(登録商標))、ドキソルビシン(ヒドロキシドキソルビシン)、ビンクリスチン(Oncovin(登録商標))、およびプレドニゾンを含むが、これらに限定されない、化学療法剤の組み合わせも投与される。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与と同時に、またはその後1週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後約1~7日、約1~約4週間、または約1週間~約1ヶ月、約1週間~約2ヶ月、約1週間~約3ヶ月、約1週間~約6ヶ月、約1週間~約9ヶ月、または約1週間~約12ヶ月にわたって投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、細胞、ポリペプチド、または核酸を投与する少なくとも1ヶ月前に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、2つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む。
様々な追加の治療剤は、本明細書に記載される組成物と組み合わせて使用され得る。例えば、潜在的に有用な追加の治療剤には、ニボルマブ(Opdivo(登録商標))、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブなどのPD-1阻害剤が含まれる。
本開示との組み合わせでの使用に適した追加の治療剤には、イブルチニブ(Imbruvica(登録商標))、オファツムマブ(Arzerra(登録商標)、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))、トラスツズマブエムタンシン(KADCYLA(登録商標)、イマチニブ(Gleevec(登録商標))、セツキシマブ(Erbitux(登録商標)、パニツムマブ)(Vectibix(登録商標))、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セディラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンジフチトクス、エベロリムスおよびテムシロリムスなどのmTOR阻害剤、ソニデギブおよびビスモデギブなどのヘッジホッグ阻害剤、CDK阻害剤(パルボシクリブ)などのCDK阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、CAR含有免疫細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群(CRS)または神経毒性を予防または低減するための治療レジメンとともに投与され得る。サイトカイン放出症候群(CRS)または神経毒性を予防するための治療レジメンには、レンジルマブ、トシリズマブ、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、アナキンラ、iNOS阻害剤(例えば、L-NILまたは1400W)が含まれ得る。追加の実施形態では、CAR含有免疫細胞を含む組成物は、抗炎症剤とともに投与することができる。抗炎症剤または抗炎症薬には、ステロイドおよびグルココルチコイド(ベータメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む)、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗TNF医薬品、シクロホスファミド、およびマイコフェノラートを含む非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)が含まれるが、これらに限定されない。例示的なNSAIDには、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Cox-2阻害剤、およびシアル酸塩が含まれる。例示的な鎮痛剤には、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン塩酸塩のトラマドールが含まれる。例示的なグルココルチコイドには、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンが含まれる。例示的な生物学的応答修飾因子には、細胞表面マーカーに向けられた分子(例えば、CD4、CD5など)、サイトカイン阻害剤、例えば、TNFアンタゴニスト(例えば、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、およびインフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、ケモカイン阻害剤、および接着分子阻害剤が含まれる。生物学的応答修飾因子には、モノクローナル抗体および組換え型の分子が含まれる。例示的なDMARDには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金(経口(オーラノフィン)および筋肉内)、およびミノサイクリンが含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)などの糖タンパク質ホルモン;肝細胞成長因子(HGF);線維芽細胞成長因子(FGF);プロラクチン;胎盤性ラクトゲン;ミュラー管抑制物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF-ベータなどの神経成長因子(NGF);血小板成長因子;TGF-アルファおよびTGF-ベータなどの形質転換成長因子(TGF);インスリン様成長因子-Iおよび-II;エリスロポエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン-アルファ、ベータ、およびガンマなどのインターフェロン;マクロファージ-CSF(M-CSF)などのコロニー刺激因子(CSF);顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF);ならびに顆粒球-CSF(G-CSF);IL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21などのインターロイキン(IL);TNF-アルファまたはTNF-ベータなどの腫瘍壊死因子;ならびにLIFおよびキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源から、または組換え細胞培養からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物を含む。
V.選別および枯渇の方法
いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団のインビトロ選別のための方法が提供され、免疫細胞の集団のサブセットは、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ(例えば、例示的ミモトープ配列)を含むDLL3特異的CARのうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞を含む。方法は、免疫細胞の集団をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、DLL3特異的CARを発現する操作された免疫細胞に富む細胞の集団を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団のインビトロ選別のための方法が提供され、免疫細胞の集団のサブセットは、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ(例えば、例示的ミモトープ配列)を含むDLL3特異的CARのうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞を含む。方法は、免疫細胞の集団をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、DLL3特異的CARを発現する操作された免疫細胞に富む細胞の集団を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は、任意にフルオロフォアにコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は、任意に磁気粒子にコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、磁気活性化細胞選別(MACS)によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、CARを発現する免疫細胞を選別するための方法で使用されるmAbは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、および/またはウステキヌマブから選択される。いくつかの実施形態では、当該mAbは、リツキシマブである。別の実施形態では、当該mAbは、QBEND-10である。
いくつかの実施形態では、以上で記載されるCAR発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるCAR発現免疫細胞の集団は、CAR発現免疫細胞の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%を含む。いくつかの実施形態では、CAR発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるCAR発現免疫細胞の集団は、CAR発現免疫細胞の少なくとも85%を含む。
いくつかの実施形態では、以上で記載されるCAR発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるCAR発現免疫細胞の集団は、初期(選別されていない)細胞集団と比較して、インビトロで増加した細胞毒性活性を示す。いくつかの実施形態では、インビトロでの当該細胞毒性活性は、10%、20%、30%、または50%増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞である。
いくつかの実施形態では、mAbは、支持体または表面に予め結合される。固体支持体の非限定的な例には、ビーズ、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、磁気ビーズ、プラスチックウェルプレート、ガラスウェルプレート、セラミックウェルプレート、カラム、または細胞培養バッグが含まれ得る。
レシピエントに投与されるCAR発現免疫細胞は、供給源集団からインビトロで富化され得る。供給源集団を拡大する方法は、密度遠心分離、免疫磁気ビーズ精製、親和性クロマトグラフィー、および蛍光活性化細胞選別の組み合わせを使用して、CD34抗原などの抗原を発現する細胞を選択することを含み得る。
フローサイトメトリーは、細胞集団内の特定の細胞型を定量化するために使用され得る。一般に、フローサイトメトリーは、主に光学的手段によって細胞の成分または構造的特徴を定量化するための方法である。構造的特徴を定量化することによって異なる細胞型を区別することができるため、フローサイトメトリーおよび細胞選別を使用して、混合物中の異なる表現型の細胞をカウントおよび選別することができる。
フローサイトメトリー分析には、2つの主要なステップ:1)選択された細胞型を1つ以上の標識マーカーで標識することと、T)集団中の細胞の総数に対する標識細胞の数を決定することと、が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞型を標識する方法は、標識された抗体を特定の細胞型によって発現されるマーカーに結合することを含む。抗体は、蛍光化合物で直接標識されるか、または、例えば、第1の抗体を認識する蛍光標識された第2の抗体を使用して間接的に標識されるかのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、CARを発現するT細胞を選別するために使用される方法は、磁気活性化細胞選別(MACS)である。磁気活性化細胞選別(MACS)は、超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用することによる、それらの表面抗原(CD分子)に応じた様々な細胞集団の分離のための方法である。MACSは、純粋な細胞集団を得るために使用され得る。単一細胞懸濁液中の細胞は、マイクロビーズで磁気標識され得る。試料は、細胞のすばやく穏やかな分離を可能にする細胞に優しいコーティングで覆われている、強磁性球で構成されるカラムに適用される。磁気標識された細胞がカラム内に保持される間、標識されていない細胞は通過する。フロースルーは、非標識細胞画分として収集することができる。洗浄ステップ後、カラムはセパレーターから取り外され、磁気標識された細胞はカラムから溶出される。
T細胞などの特定の細胞集団の精製のための詳細なプロトコルは、Basu S et al.(2010)に見出すことができる。(Basu S,Campbell HM,Dittel BN,Ray A.Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting(FACS).J Vis Exp.(41):1546)。
いくつかの態様では、本開示は、インビボ枯渇によってDLL3特異的CAR発現免疫細胞を枯渇させるための方法を提供する。インビボ枯渇は、阻害または排除によってCAR発現免疫細胞の増殖を停止することを目的とした哺乳動物生物への処置(例えば、CAR上のエピトープに結合する分子)の投与を含み得る。
本発明の一態様は、mAb特異的エピトープを含むDLL3 CARを発現する操作された免疫細胞をインビボで枯渇させるための方法に関し、当該操作された免疫細胞または当該CAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させることを含む。本発明の別の態様は、当該操作された免疫細胞をエピトープ特異的抗体と接触させることによって、キメラscFv(例えば、mAb特異的エピトープの挿入によって形成される)を含む、CAR発現免疫細胞をインビボで枯渇させるための方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞であり、かつ/または抗体は、モノクローナルである。
一実施形態によれば、免疫操作された細胞のインビボ枯渇は、本発明のインビトロ方法を使用して以前に選別された操作された免疫細胞に対して行われる。この場合、同じ注入されたmAbが使用され得る。いくつかの実施形態では、mAb特異的抗原は、CD20抗原であり、エピトープ特異的mAbは、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、本発明は、当該CAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させることを含む、mAb特異的エピトープを含むCARを発現する操作された免疫細胞(CAR発現免疫細胞)をインビボで枯渇させる方法に関する。
いくつかの実施形態では、当該操作された免疫細胞または当該CAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させるステップは、患者にエピトープ特異的mAb(例えば、リツキシマブ)を注入することを含む。いくつかの実施形態では、患者に投与されるエピトープ特異的mAbの量は、患者におけるCAR発現免疫細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を排除するために十分である。
いくつかの実施形態では、当該操作された免疫細胞または当該CAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させるステップは、患者に約375mg/m2のリツキシマブを1回または数回注入することを含む。いくつかの実施形態では、mAb(例えば、リツキシマブ)は、週に1回投与される。
いくつかの実施形態では、mAb特異的エピトープを含むCARを発現する免疫細胞(CAR発現免疫細胞)がエピトープ特異的mAbを使用する補体依存性細胞毒性(CDC)アッセイにおいて枯渇される場合、生存CAR発現免疫細胞の量は減少する。いくつかの実施形態では、生存CAR発現免疫細胞の量は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少する。いくつかの実施形態では、当該mAb特異的エピトープは、CD20エピトープもしくはミモトープであり、かつ/またはエピトープ特異的mAbは、リツキシマブである。
特定の実施形態では、CAR操作された免疫細胞のインビボ枯渇は、二重特異性抗体を注入することによって行われる。定義によって、二重特異性モノクローナル抗体(BsAb)は、2つの異なるモノクローナル抗体の断片で構成され、結果として2つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質である。これらのBsAbおよび免疫療法におけるそれらの使用は、Muller D and Kontermann R.E.(2010)Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy,BioDrugs 24(2):89-98において概説される。
別の特定の実施形態によれば、注入された二重特異性mAbは、キメラscFvを発現する操作された免疫細胞上にあるmAb特異的エピトープと、エフェクターおよび細胞毒性細胞(例えば、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、細胞毒性Tリンパ球(CTL)などの免疫細胞)上の表面抗原の両方に結合することができる。そうすることによって、BsAbによって引き起こされる操作された免疫細胞の枯渇は、抗体依存性細胞毒性(ADCC)を通して発生し得る。(Deo Y M,Sundarapandiyan K,Keler T,Wallace PK,and Graziano RF,(2000),Journal of Immunology,165(10):5954-5961])。
いくつかの実施形態では、細胞毒性薬物は、CAR発現免疫細胞を枯渇させるために使用され得るエピトープ特異的mAbに結合される。モノクローナル抗体の標的化能力を細胞毒性薬物の殺癌能力と組み合わせることによって、抗体薬物複合体(ADC)は、薬物単独の使用と比較される場合、健康な組織と病気の組織との間の敏感な区別を可能にする。いくつかのADCについて市場の承認を受け、それらを、特にリンカー上で作製するための技術は、(Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212、Trail et al(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337、Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614、Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26:151-172、米国特許第4,975,278号)。
いくつかの実施形態では、注入されるエピトープ特異的mAbは、補体依存性細胞毒性(CDC)を促進することができる分子と予めコンジュゲートされる。したがって、補体系は、生物から病原体を取り除く抗体の能力を支援または補完する。刺激される場合、活性化カスケードは、細胞殺滅膜侵襲複合体の応答および活性化の大規模な増幅として引き起こされる。グリカンなどの異なる分子を使用してmAbをコンジュゲートし得る(Courtois,A,Gac-Breton,S.,Berthou,C,Guezennec,J.,Bordron,A.and Boisset,C.(2012),Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments may be acquired by immunogenic glycan coupling,Electronic Journal of Biotechnology ISSN:0717-3458、http://www.ejbiotechnology.info DOI:10.2225/voll5-issue5)。
VI.キットおよび製品
本出願は、本明細書に記載されるDLL3含有CARまたはDLL3 CAR含有免疫細胞のうちのいずれか1つを含むキット、およびその薬学的組成物を提供する。キットの一実施形態では、操作されたCAR細胞は、CryoStor(登録商標)CS10、CryoStor(登録商標)CS2、またはCryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions)などの好適な培地で凍結される。
本出願は、本明細書に記載されるDLL3含有CARまたはDLL3 CAR含有免疫細胞のうちのいずれか1つを含むキット、およびその薬学的組成物を提供する。キットの一実施形態では、操作されたCAR細胞は、CryoStor(登録商標)CS10、CryoStor(登録商標)CS2、またはCryoStor(登録商標)CS5(BioLife Solutions)などの好適な培地で凍結される。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示のキットは、同種DLL3 CAR含有T細胞、ならびに対象にリンパ球枯渇レジメンおよびCAR-Tレジメンを投与するためのCD52抗体を含む。
本出願はまた、本明細書に記載される治療組成物またはキットのうちのいずれか1つを含む製品を提供する。製品の例には、バイアル(例えば、密封されたバイアル)が含まれる。
実施例1:DLL3標的化抗体の生成および試験
本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein,Nature 256:495,1975によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または米国特許第4,816,567号に記載されるものなどの組換えDNA法によって作製され得る。抗DLL3抗体をまずFlag-DLL3(アジポゲン)ELISAでスクリーニングし、次いでFACSでスクリーニングして、ヒトDLL3発現ありまたはなしのHEK-293T細胞への結合を決定した。
本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein,Nature 256:495,1975によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または米国特許第4,816,567号に記載されるものなどの組換えDNA法によって作製され得る。抗DLL3抗体をまずFlag-DLL3(アジポゲン)ELISAでスクリーニングし、次いでFACSでスクリーニングして、ヒトDLL3発現ありまたはなしのHEK-293T細胞への結合を決定した。
DLL3特異的抗体が内因性DLL3を発現する細胞を認識することができるかを試験するために、DMS 273(Sigma、カタログ番号95062830)、DMS 454(Sigma、カタログ番号95062832)、およびSHP-77(ATCC、カタログ番号CRL-2195)細胞を、1%BSAで補充されたPBS中のマウスIgG2Aバックボーン(mIgG2a)を含む2ug/mlの精製DLL3抗体または対照mIgG2a抗体で染色した。結合したDLL3抗体を、PE標識抗マウスIgG抗体(Biolegend、カタログ番号405307)で検出した。試料をフローサイトメトリーによって分析した。DLL3抗体のDMS 273、DMS 454、およびSHP-77細胞への結合を示す代表的な画像を図1に含める。
実施例2:DLL3に対する抗DLL3抗体の速度および親和性の決定
この実施例は、全長モノクローナル抗体(IgG)、ならびにヒト、カニクイザル(cyno)、およびマウスDLL3に対するscFvの両方として、37℃での様々な抗DLL3抗体の結合速度および親和性を決定する。scFvについて、それらのそれぞれのハイブリドーマに由来する抗DLL3抗体の可変領域を、(GGGGS)3(配列番号472)または(GGGGS)4(配列番号478)リンカー、続いてヒトIgG2配列からのヒンジおよびFcの一部に隣接してクローニングし、scFv-Fc融合体をもたらし、Expi293を使用して発現させた。ヒト、カニクイザル、およびマウスDLL3からの細胞外ドメイン(ECD)を、C末端8xHisエピトープタグ(配列番号473)およびAviタグと融合させ、Expi293を使用して発現させ、次いで固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)、続いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。
この実施例は、全長モノクローナル抗体(IgG)、ならびにヒト、カニクイザル(cyno)、およびマウスDLL3に対するscFvの両方として、37℃での様々な抗DLL3抗体の結合速度および親和性を決定する。scFvについて、それらのそれぞれのハイブリドーマに由来する抗DLL3抗体の可変領域を、(GGGGS)3(配列番号472)または(GGGGS)4(配列番号478)リンカー、続いてヒトIgG2配列からのヒンジおよびFcの一部に隣接してクローニングし、scFv-Fc融合体をもたらし、Expi293を使用して発現させた。ヒト、カニクイザル、およびマウスDLL3からの細胞外ドメイン(ECD)を、C末端8xHisエピトープタグ(配列番号473)およびAviタグと融合させ、Expi293を使用して発現させ、次いで固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)、続いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。
抗体結合速度は、表面プラズモン共鳴(BiacoreTM表面プラズモン共鳴(SPR)システム、GE Healthcare Bio-Sciences、Pittsburg PA)によって決定した。HBS-T+ランニングバッファー(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.05%体積/体積 Tween20、1mg/mL BSA)で希釈された抗体を、抗DLL3抗体定常ドメインに特異的な抗体で固定化したCM4チップ上で捕捉した。精製されたDLL3をHBS-T+で段階希釈し、30uL/分で2分間注射し、10分の解離時間後、注射間に10mMのグリシン-HCl pH1.7またはリン酸のいずれかで表面を再生した。速度論的会合速度(kon)および解離速度(koff)は、BIA評価プログラムを使用してデータを全体的に1:1Langmuir結合モデル(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)に当てはめることによって同時に得られる。平衡解離定数(Kd)値は、koff/konとして計算される。
試験された抗DLL3抗体の速度および親和性パラメータを表8に示す。具体的には、表8は、ヒト、カニクイザル、およびマウスDLL3に対する抗DLL3抗体(IgGまたはscFv-Fc融合体のいずれか)の親和性を示す。最後の列は、抗DLL3抗体の各々がヒトDLL3のどの細胞外ドメインを認識するかを示す。
実施例3:全長および短縮型DLL3を発現するCHO細胞の生成
全長および様々な短縮型ヒトDLL3を発現するCHO細胞のパネルを使用して、各DLL3標的化抗体がどのドメインを認識するかを決定した。ヒトDLL3の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸位置:シグナルペプチド:1~26、N末端(N-ter):27~175、DSL:176~215、EGF1:215~249、EGF2:274~310、EGF3:312~351、EGF4:353~389、EGF5:391~427、およびEGF6:429~465によって定義される異なるサブドメインに細分化することができる。
全長および様々な短縮型ヒトDLL3を発現するCHO細胞のパネルを使用して、各DLL3標的化抗体がどのドメインを認識するかを決定した。ヒトDLL3の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸位置:シグナルペプチド:1~26、N末端(N-ter):27~175、DSL:176~215、EGF1:215~249、EGF2:274~310、EGF3:312~351、EGF4:353~389、EGF5:391~427、およびEGF6:429~465によって定義される異なるサブドメインに細分化することができる。
エピトープマッピングに使用される短縮型DLL3タンパク質を生成するために、ヒトDLL3のそれぞれの8つの細胞外ドメイン(シグナルペプチドとN末端、DSL、EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、およびEGF6)の配列を、N末端から開始して、抗原から1つずつ欠失した。表6は、生成された短縮型DLL3タンパク質を示す(図2A~2Dも参照されたい)。
N末端HAタグを有する全長および短縮型ヒトDLL3を発現するCHO細胞を確立するために、全長ヒトDLL3(配列番号556、GeneBankレコードNM_016941)および7 HAタグ付き短縮型ヒトDLL3(配列番号557~563)をpLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3Gベクター(Clontech)にクローニングした。全長または短縮型ヒトDLL3のいずれかをコードするレンチウイルスは、293T細胞をpLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3Gベクターと、psPAX2およびpMD2Gベクターと、でコトランスフェクトすることによって生成した。トランスフェクションの2日後、ウイルス粒子を含有する上清を収集し、5ug/mlのポリブレンと一緒にCHO細胞を形質導入するために使用した。
全長および短縮型DLL3の発現は、PEコンジュゲート抗HA抗体(Biolegend、カタログ番号901518)を使用したFACSアッセイで検証した。陰性対照として、細胞を、抗HA抗体の代わりに、アイソタイプが一致し、PE標識された抗体(Biolegend、カタログ番号400111)とインキュベートした。図2Aの下のパネルは、CHO細胞上の全長および短縮型DLL3の発現を示す。
実施例4:DLL3標的化抗体のエピトープマッピング
全長および短縮型DLL3を発現するCHO細胞を、PBS+1%BSA中のハイブリドーマ上清または精製DLL3抗体で染色した。結合したDLL3抗体を、PE標識抗マウスIgG抗体(Biolegend、カタログ番号405307)で検出した。試料をフローサイトメトリーによって分析した。各クローンの結合ドメインは、実施例2に記載される全長または短縮型DLL3を発現するCHOのパネルを使用して決定した。フローサイトメトリー分析は、例えば、クローンがEGF3を含むすべての短縮型タンパク質に結合するが、EGF3を含まないいずれの短縮型タンパク質にも結合しない場合、そのようなクローンはEGF3を認識することを示した。図2Dにおける代表的な画像に示されるように、抗DLL3抗体は、それぞれ、DSL、EGF1、およびEGF3ドメインを認識する。PEチャネルからのシグナルを、x軸上に示し、カウントをy軸上に示す。
全長および短縮型DLL3を発現するCHO細胞を、PBS+1%BSA中のハイブリドーマ上清または精製DLL3抗体で染色した。結合したDLL3抗体を、PE標識抗マウスIgG抗体(Biolegend、カタログ番号405307)で検出した。試料をフローサイトメトリーによって分析した。各クローンの結合ドメインは、実施例2に記載される全長または短縮型DLL3を発現するCHOのパネルを使用して決定した。フローサイトメトリー分析は、例えば、クローンがEGF3を含むすべての短縮型タンパク質に結合するが、EGF3を含まないいずれの短縮型タンパク質にも結合しない場合、そのようなクローンはEGF3を認識することを示した。図2Dにおける代表的な画像に示されるように、抗DLL3抗体は、それぞれ、DSL、EGF1、およびEGF3ドメインを認識する。PEチャネルからのシグナルを、x軸上に示し、カウントをy軸上に示す。
実施例5:DLL3特異的CAR-T細胞の生成
この実施例は、抗DLL3キメラ抗原受容体(CAR)の構築を説明する。
この実施例は、抗DLL3キメラ抗原受容体(CAR)の構築を説明する。
表1aに列挙される抗DLL3抗体をCARに再フォーマットした。これらの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列(表1bおよび表1c)を使用して、以下の一般的な構造:重鎖可変領域--リンカー--軽鎖可変領域を有する単鎖可変断片(scFv)(表1d)を設計した。リンカーは、以下のアミノ酸配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号478)を有した。
キメラ抗原受容体をコードするタンパク質配列は、5’から3’までの以下の要素:CD8αシグナル配列(配列番号477)、抗DLL3 scFv、ヒトCD8α分子のヒンジおよび膜貫通領域(配列番号479)、41BB分子の細胞質部分(配列番号291)、ならびにCD3ζ分子の細胞質部分(配列番号292)を含有するように設計した(図3A、表7)。
CAR構造の概略図を図3Aに示す。抗DLL3クローンから再フォーマットされた代表的なCAR配列は、配列番号482~533に含まれる。コドン最適化DLL3 CAR配列を合成し、XmaI(5’)およびMluI(3’)制限部位を使用して以下のレンチウイルスベクターpLVX-EF1a-DLL3 CAR(Clontech)にサブクローニングした。
DLL3 CAR-T細胞を生成するために、PBMCを、まずFicoll勾配密度培地(Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences)を使用してバフィーコート試料から精製した。T細胞を、市販のT細胞単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-535)を使用してPBMCから精製した。あるいは、初代ヒトT細胞をLeukoPak(StemCell Technologies)から直接精製することができる。
DLL3 CARをコードするレンチウイルスを作製するために、HEK-293T細胞を、0日目に、6ウェルプレートのウェルあたり10%FBS(HycloneまたはJR Scientific)で補充された2mLのDMEM(Gibco)中に1mLあたり40万細胞で播種した。1日目に、レンチウイルスを、6ウェルプレートのウェルあたり250uLのOpti-MEM(Gibco)において、レンチウイルスパッケージングベクター1.5ugのpsPAX2、0.5ugのpMD2G、および0.5ugの適切なトランスファーCARベクターを一緒に混合することによって調製した(「DNAミックス」)。250uLのOpti-MEM中の10uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いでDNAミックスに添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、500uLの総体積をHEK-293Tを含有するウェルの側面にゆっくりと添加した。精製されたT細胞を、100IU/mLのヒトIL-2(Miltenyi Biotec)、10%FBS(Hyclone)、およびヒトT TransAct(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-111-160、1:100希釈)で補充されたX-Vivo-15培地(Lonza)において活性化した。2日目に、6ウェルプレートの各ウェルからの培地を、ウェルあたり2mLのT細胞形質導入培地、すなわち、10%FBSで補充されたX-Vivo-15で置き換えた。3日目に、T細胞を、Grex-24プレート(Wilson Wolf、カタログ番号80192M)のウェルあたり1mLのT細胞形質導入培地において、1mLあたり50万細胞で再懸濁させた。HEK293T細胞からのレンチウイルス上清を、回収し、0.45ミクロンフィルター(EMD Millipore)に通して細胞片を除去し、次いで100IU/mLのヒトIL-2とともにT細胞に添加した。5日目に、4.5mLのT細胞増殖培地、すなわち、5%ヒトAB血清(Gemini Bio)で補充されたX-Vivo-15を、Grex-24プレートの各ウェルに添加した。9日目および13日目に、フローサイトメトリーを使用して組換えDLL3(Adipogen)を認識するT細胞のパーセンテージを検出することによって、形質導入効率を決定した。細胞を、T細胞増殖培地を使用して、必要に応じてより大きなフラスコまたはG-Rex容器(Wilson Wolf)中に増殖させた。14日目に、DLL3 CAR-T細胞を凍結保存した。組換えDLL3で染色された細胞のパーセンテージは、凍結保存の直前にクローンにわたって正規化した。
DLL3 CARで成功裏に形質導入されたT細胞のパーセンテージを決定するために、T細胞をまずPBS+1%BSA中の1ug/mlのFlagタグ付き組換えDLL3(Adipogen)と4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS+1%BSAで洗浄し、PE標識抗Flag抗体(Biolegend、カタログ番号637310)で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
DLL3 CAR-T細胞の例を図3Bに示す。図3Bは、実験データを示し、抗DLL3 CARが初代T細胞の表面上に発現し、組換えDLL3を認識することができることを示す。プロットを、生きているCD3+細胞でゲーティングする。プロット上の数字は、各抗DLL3 CARを発現する細胞のパーセンテージである。
実施例6:インビトロ特徴分析
この実施例は、DLL3についてのCARの特異性およびインビトロ活性を決定するために使用される実験を説明する。
この実施例は、DLL3についてのCARの特異性およびインビトロ活性を決定するために使用される実験を説明する。
SHP-77、WM266.4、DMS 454、およびDMS 273は、ATCCまたはSigmaから購入されたDLL3+細胞株である。HEK-293Tは、DLL3陰性細胞株である。HEK-293TにおいてヒトDLL3を発現させるために、全長ヒトDLL3をコードするレンチウイルスを使用してHEK-293T細胞を形質導入した。
DLL3特異的殺滅を試験するために、ヒトDLL3発現ありまたはなしのHEK-293T細胞を発現するホタルルシフェラーゼを次いで、96ウェルアッセイプレート(Costar)にウェルあたり5,000細胞の播種密度で播種した。DLL3 CAR-T細胞を解凍し、T細胞増殖培地、すなわち、5%ヒトAB血清(Gemini Bio)で補充されたX-Vivo-15において1:9~9:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で、ヒトDLL3発現ありまたはなしの播種されたHEK-293Tに添加した。細胞生存は、one-gloアッセイキット(Promega)を使用して72時間後に測定した。代表的なDLL3 CAR-T細胞は、HEK-293T-DLL3細胞に対する強力な殺滅を示したが、HEK-293T親細胞では検出可能な活性を示さなかった(図4A)。
内因性DLL3を発現する細胞株に対するDLL3 CAR-T細胞の細胞毒性活性を試験するために、DLL3 CAR-T細胞を、ホタルルシフェラーゼ標識DLL3+SHP-77、WM266.4、DMS 454、またはDMS 273細胞と、T細胞増殖培地、すなわち、5%ヒトAB血清(Gemini Bio)で補充されたX-Vivo-15において1:9~9:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比でインキュベートした。細胞生存は、one-gloアッセイキット(Promega)を使用して72時間後に測定した。各条件を3つの複製でアッセイした。生細胞の平均パーセンテージおよび標準偏差を播種した(図4Bおよび図4C)。
図4Aは、抗DLL3 CAR-T細胞が、示されたエフェクター:標的比での3日の細胞毒性アッセイにおいて、ヒトDLL3を発現するHEK-293T細胞を特異的に殺滅したが、親HEK-293T細胞を殺滅しなかったことを示す実験データを示す。抗DLL3 CARを発現しなかったT細胞(標識された空ベクター)を陰性対照として使用した。
図4Bは、抗DLL3 CAR-T細胞が、示されたエフェクター:標的比での3日の細胞毒性アッセイにおいて内因性DLL3を発現するSHP-77およびWM266.4細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。
図4Cは、抗DLL3 CAR-T細胞が、示されたエフェクター:標的比での3日の細胞毒性アッセイにおいて内因性DLL3を発現するDMS 454およびDMS 273小細胞肺癌細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。図4Cにおけるすべてのプロットについて、One-gloアッセイシステムを使用して、標的細胞生存率を評価した(n=3)。
DLL3 CAR-T細胞から分泌されるサイトカインを測定するために、DLL3 CAR-T細胞を、DLL3+SHP-77細胞と、T細胞増殖培地、すなわち、5%ヒトAB血清(Gemini Bio)で補充されたX-Vivo-15において1:1または1:9のエフェクター:標的(E:T)比でインキュベートした。24時間後、組織培養上清を収集し、上清中の3つのサイトカイン[インターフェロンガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、およびIL-2]のレベルを、ヒト炎症誘発性組織培養9プレックスアッセイ(MSD)を製造業者のプロトコルに従って使用して測定した。図5は、抗DLL3 CAR-T細胞がDLL3発現SHP-77細胞株との共インキュベーション後にサイトカインを放出したことを示す。CAR-T細胞およびSHP-77細胞を1:1または1:9のエフェクター:標的比で24時間インキュベートした(n=3)。
実施例7:連続殺滅アッセイ
連続殺滅アッセイは、CAR-T細胞を増殖させ、特定の場合では、分化および枯渇を引き起こすCAR-T細胞のそれらの標的への繰り返し曝露を含む。このアッセイを使用して、標的細胞への数ラウンドの曝露後に、高い標的細胞溶解および増殖能力を有する最適なクローンを選択した。
連続殺滅アッセイは、CAR-T細胞を増殖させ、特定の場合では、分化および枯渇を引き起こすCAR-T細胞のそれらの標的への繰り返し曝露を含む。このアッセイを使用して、標的細胞への数ラウンドの曝露後に、高い標的細胞溶解および増殖能力を有する最適なクローンを選択した。
アッセイの初日、DLL3を発現することが知られている5,000個のホタルルシフェラーゼ標識WM266.4、DMS 454、またはDMS 273細胞を、5%のヒト血清を有する100ulのX-Vivo-15培地において白い壁および平らな透明底を備えた96ウェルプレートに播種した。標的細胞をプレートの底に付着させた後、DLL3 CAR-T細胞を解凍し、5%のヒト血清を含むX-VIVO培地において1:1のエフェクター:標的(E:T)比で播種された標的細胞に添加した。その後2日毎に、DLL3 CAR-T細胞を含有する100μlの培地を、新たに播種された標的細胞に移し、one-gloアッセイシステムまたはCellTiter-gloシステム(Promega)を使用して、予め播種された標的細胞の溶解パーセンテージを測定した。各条件を3~6つの複製でアッセイした。溶解の平均パーセンテージおよび標準偏差を播種した(図6A~6C)。最適なクローンは、12日目のアッセイ全体中で最も高い標的細胞溶解を有するものであった。これらのデータは、連続殺滅アッセイの実験データを示して、抗DLL3 CAR-T細胞のDLL3+WM266.4細胞への繰り返し曝露後、クローンのうちのいくつかが活性のままであったことを示す。One-gloアッセイシステムまたはCellTiter-gloを、示された各時点で使用して、標的細胞生存を評価した(n=3~6)。
実施例8:インビボ活性
DLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、SHP-77腫瘍担持NSGマウスを使用した。SHP-77細胞は、凍結ストックバイアルから入手し、解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を完全成長培地(RPMI+10%FBS)において50×106個の生存細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植した直後に、細胞をBD Matrigel Matrix(カタログ番号354234)と1:1に混合し、マウスあたり5x106個のSHP-77細胞を含有する200μLの細胞/マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後5日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後約2週間で腫瘍体積に基づいてマウスを5匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、314mm3以下であった。マウスをランダム化した1日後に、非形質導入T細胞およびDLL3 CAR-T細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞をRPMI+10%FBSに再懸濁し、マウスあたり200万または500万個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって注射した。腫瘍を、研究の終わりまで3~4日毎に監視し続けた。26C8および10G1-K DLL3 CAR-T細胞は、用量依存的に腫瘍阻害を誘導した(図7A~7B)。図7A~7Bは、抗DLL3 CAR-T細胞が確立された小細胞肺癌腫瘍を排除することができることを示す実験データを示す。
DLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、SHP-77腫瘍担持NSGマウスを使用した。SHP-77細胞は、凍結ストックバイアルから入手し、解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を完全成長培地(RPMI+10%FBS)において50×106個の生存細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植した直後に、細胞をBD Matrigel Matrix(カタログ番号354234)と1:1に混合し、マウスあたり5x106個のSHP-77細胞を含有する200μLの細胞/マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後5日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後約2週間で腫瘍体積に基づいてマウスを5匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、314mm3以下であった。マウスをランダム化した1日後に、非形質導入T細胞およびDLL3 CAR-T細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞をRPMI+10%FBSに再懸濁し、マウスあたり200万または500万個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって注射した。腫瘍を、研究の終わりまで3~4日毎に監視し続けた。26C8および10G1-K DLL3 CAR-T細胞は、用量依存的に腫瘍阻害を誘導した(図7A~7B)。図7A~7Bは、抗DLL3 CAR-T細胞が確立された小細胞肺癌腫瘍を排除することができることを示す実験データを示す。
ヒト疾患と類似の転移を示すモデルにおいてDLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、SHP-77腫瘍を尾静脈注射で確立した。腫瘍を、肺、肝臓、脳、腎臓、および脾臓において観察した。具体的には、SHP-77細胞を解凍し、完全成長培地(RPMI+10%FBS)において40x106個の生存細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持し、マウスあたり200μLの細胞懸濁液を尾静脈IVによって注射した。移植後7日目に、200uLのルシフェリン(15mg/mL)を注射し、腫瘍成長をIVISイメージングによって監視した。移植後11日目に全光束に基づいてマウスを5匹の群にランダム化した。移植後12日目に、CAR-Tを解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞をRPMI+10%FBSに再懸濁し、マウスあたり200万または700万個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって注射した。腫瘍を、研究の終わりまで3~4日毎に監視し続けた。図8に示されるように、10G1-K抗DLL3 CAR-T細胞は、用量依存的に、マウスにおいて確立された小細胞肺癌腫瘍を阻害することができる。
実施例9:安全スイッチを有する抗DLL3 CAR構築物
この実施例は、安全スイッチを有する抗DLL3 CARの構築、発現、および細胞毒性活性を説明する。表6における抗DLL3 CARは、以下に列挙される異なる安全スイッチ構造を含むように再フォーマットした(表8)。
この実施例は、安全スイッチを有する抗DLL3 CARの構築、発現、および細胞毒性活性を説明する。表6における抗DLL3 CARは、以下に列挙される異なる安全スイッチ構造を含むように再フォーマットした(表8)。
安全スイッチを含む抗DLL3 CAR構築物をコードするタンパク質配列を表9に示す。例示的な安全スイッチ構築物は、CD8αシグナル配列(配列番号477)、本明細書に記載される抗DLL3 scFv、CD20ミモトープ(配列番号536)、QBEND-10エピトープ(配列番号544)、ヒトCD8α分子のヒンジおよび膜貫通領域(配列番号479)、4-1BB分子の細胞質部分(配列番号291)、ならびにCD3ζ分子の細胞質部分(配列番号292)を含み得る。
CAR-Tを、実施例5に記載される方法を使用して生成し、それらの細胞毒性活性は、実施例7に記載される方法を使用して調査した。図9Aは、4つの異なる安全スイッチの構造を示すプロットである。図9Bは、安全スイッチを有する抗DLL3 CAR 2G1、4H8、および10G1-Kが初代T細胞の表面に発現し、組換えDLL3を認識することができることを示す実験的フローサイトメトリーデータを示す。プロットを、生きているCD3+細胞でゲーティングし、プロット上の数字は、各抗DLL3 CARを発現する細胞のパーセンテージである。図9Cは、安全スイッチを有する抗DLL3 CARが、DLL3+ WM266.4細胞株の連続殺滅アッセイにおいて活性であることを示す実験データを示す。
実施例10:小細胞肺癌PDXモデルに対する細胞毒性
小細胞肺癌PDXモデルは、Crown Bioscienceから購入した。細胞表面のDLL3発現を調査するために、PDXモデルの凍結バイアルを解凍し、各染色試料に200,000個の細胞を使用した。DLL3の発現は、PEコンジュゲート抗DLL3抗体を使用したFACSアッセイで検証した。Brilliant violet 421コンジュゲート抗ヒトCD45および抗マウスCD45抗体を同じ染色試料に添加して、ヒトおよびマウスのリンパ球を除外した。
小細胞肺癌PDXモデルは、Crown Bioscienceから購入した。細胞表面のDLL3発現を調査するために、PDXモデルの凍結バイアルを解凍し、各染色試料に200,000個の細胞を使用した。DLL3の発現は、PEコンジュゲート抗DLL3抗体を使用したFACSアッセイで検証した。Brilliant violet 421コンジュゲート抗ヒトCD45および抗マウスCD45抗体を同じ染色試料に添加して、ヒトおよびマウスのリンパ球を除外した。
図10Aは、DLL3が2つの小細胞肺癌PDXモデルの表面に発現されることを示す実験データを示す。図10Bは、抗DLL3 CAR-T細胞が、示されたエフェクター:標的比での3日の細胞毒性アッセイにおいて同じ2つの小細胞肺PDXモデルを殺滅したことを示す実験データを示す。抗DLL3 CARを発現しなかったT細胞(標識された空ベクター)を陰性対照として使用した。
実施例11:リツキシマブベースの安全スイッチを使用したDLL3 CAR-T細胞のインビトロ検出および枯渇
望ましくない活性の事象においてCAR T細胞を枯渇させるか、またはオフにするために、実施例9に記載されるCARの細胞外領域の様々な位置でのリツキシマブミモトープの挿入によってリツキシマブオフスイッチを開発した。補体依存性細胞毒性アッセイを使用して、DLL3 CAR-T細胞のリツキシマブ依存性インビトロ枯渇を評価した。このアッセイでは、凍結されたCAR-T細胞を解凍し、1x105個の細胞を96ウェルプレートにおける10%FBSで補充されたRPMI1640培地でインキュベートした。細胞を、25%子ウサギ補体(Cedarlane、CL3441-S)およびリツキシマブ抗体(インハウスで製造、100mg/mL)の不在または存在下で3時間インキュベートした。細胞を組換えDLL3(Adipogen)で染色し、細胞毒性をフローサイトメトリーによって分析した。図11Aは、抗DLL3 CAR-T細胞を組換えDLL3およびリツキシマブ染色の両方によって検出することができることを示す実験データを示す。図11Bは、DLL3 CAR-T細胞をリツキシマブ依存性および補体依存性の方法でインビトロで枯渇させたことを示す実験データを示す。
望ましくない活性の事象においてCAR T細胞を枯渇させるか、またはオフにするために、実施例9に記載されるCARの細胞外領域の様々な位置でのリツキシマブミモトープの挿入によってリツキシマブオフスイッチを開発した。補体依存性細胞毒性アッセイを使用して、DLL3 CAR-T細胞のリツキシマブ依存性インビトロ枯渇を評価した。このアッセイでは、凍結されたCAR-T細胞を解凍し、1x105個の細胞を96ウェルプレートにおける10%FBSで補充されたRPMI1640培地でインキュベートした。細胞を、25%子ウサギ補体(Cedarlane、CL3441-S)およびリツキシマブ抗体(インハウスで製造、100mg/mL)の不在または存在下で3時間インキュベートした。細胞を組換えDLL3(Adipogen)で染色し、細胞毒性をフローサイトメトリーによって分析した。図11Aは、抗DLL3 CAR-T細胞を組換えDLL3およびリツキシマブ染色の両方によって検出することができることを示す実験データを示す。図11Bは、DLL3 CAR-T細胞をリツキシマブ依存性および補体依存性の方法でインビトロで枯渇させたことを示す実験データを示す。
実施例12:安全スイッチを有する抗DLL3 CAR-T細胞のインビボ活性
安全スイッチを有するDLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、SHP-77腫瘍担持NSGマウスを使用した。SHP-77細胞を凍結バイアルから解凍し、カウントし、希釈した。マウスあたりRPMI培地/マトリゲル懸濁液における50×106個の生存細胞/mLを皮下に注射した。腫瘍成長を、移植後5日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後約14日で腫瘍体積に基づいてマウスを8匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、178mm3であった。マウスをランダム化した同じ日に、非形質導入T細胞およびDLL3 CAR-T細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を、マウスあたり5×106個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって、RPMIに再懸濁した。腫瘍を、研究の終わりまで3~4日毎に監視し続けた。安全スイッチを有するDLL3 CAR-T細胞のすべての群は、50日目までに有意な腫瘍阻害および検出可能な腫瘍の完全またはほぼ完全な排除を誘導した(図12A)。
安全スイッチを有するDLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、SHP-77腫瘍担持NSGマウスを使用した。SHP-77細胞を凍結バイアルから解凍し、カウントし、希釈した。マウスあたりRPMI培地/マトリゲル懸濁液における50×106個の生存細胞/mLを皮下に注射した。腫瘍成長を、移植後5日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後約14日で腫瘍体積に基づいてマウスを8匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、178mm3であった。マウスをランダム化した同じ日に、非形質導入T細胞およびDLL3 CAR-T細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を、マウスあたり5×106個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって、RPMIに再懸濁した。腫瘍を、研究の終わりまで3~4日毎に監視し続けた。安全スイッチを有するDLL3 CAR-T細胞のすべての群は、50日目までに有意な腫瘍阻害および検出可能な腫瘍の完全またはほぼ完全な排除を誘導した(図12A)。
ヒト疾患のように転移を示すモデルにおけるDLL3 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を試験するために、外因性DLL3を発現するDMS 273小細胞肺腫瘍(DMS 273-DLL3)を尾静脈注射で確立した。具体的には、DMS 273-DLL3細胞を解凍し、RPMI培地中で1mLあたり5×105生存細胞まで希釈した。マウスあたり200μLの細胞懸濁液を尾静脈IVによって注射した。移植後3日目に、マウスを9匹の群にランダム化した。同じ日に、DLL3 CAR-Tを解凍し、カウントし、マウスあたり5x106個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって、RPMI培地に再懸濁した。腫瘍を、研究の終わりまで、IVISイメージングシステムを使用して3~4日毎に監視し続けた。図12Bに示されるように、異なるリツキシマブベースの安全スイッチを有する複数の異なるDLL3 CARは、転移性腫瘍に対して有効であった。
実施例13:非腫瘍担持動物を使用したマウス安全性研究
DLL3 RNAは、ヒト脳および下垂体において報告されている(GTex)。同様に、マウスDLL3 RNAはまた、下垂体において報告されている(Bio-GPS)。マウス脳におけるDLL3 RNA発現を理解するために、3匹のNSGマウスからの脳を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で固定し、包埋し、4~6ミクロンで連続的に切片化し、RNAscope(登録商標)LS Red ISHアッセイ(ACDBio)で分析した。DLL3 RNAをNSGマウスの脳試料において低レベルで検出した。図13Aは、このアッセイで観察されたマウスDLL3 RNA染色の代表的な画像を示す。
DLL3 RNAは、ヒト脳および下垂体において報告されている(GTex)。同様に、マウスDLL3 RNAはまた、下垂体において報告されている(Bio-GPS)。マウス脳におけるDLL3 RNA発現を理解するために、3匹のNSGマウスからの脳を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で固定し、包埋し、4~6ミクロンで連続的に切片化し、RNAscope(登録商標)LS Red ISHアッセイ(ACDBio)で分析した。DLL3 RNAをNSGマウスの脳試料において低レベルで検出した。図13Aは、このアッセイで観察されたマウスDLL3 RNA染色の代表的な画像を示す。
脳および下垂体の非形質導入T細胞におけるDLL3 RNA発現の潜在的な毒性の責任を理解するために、8x106個の10G1-K DLL3 CAR-T細胞、または8x106個の2G1 DLL3 CAR-T細胞をNSGマウスにIV注射した。注射の7日後、脾臓、脳、および下垂体を採取し、10%NBFで固定し、包埋し、4~6ミクロンで連続的に切片化し、抗ヒトCD3抗体(Abcam、ab52959、1:500希釈)で染色して、免疫組織化学によってヒトT細胞を検出した。T細胞はすべての動物からの脾臓において検出されたが、それらは、脳または下垂体試料では検出されなかった(図13B)。よって、DLL3 RNAは、非腫瘍担持NSGマウスでは低レベルで検出されたが、DLL3 CAR-T細胞は、マウスの脳または下垂体試料では検出されなかった。
実施例14:皮下腫瘍を担持する動物を使用したマウス安全性研究
潜在的な脳および下垂体の毒性の責任をさらに評価するため、DLL3 CAR-T細胞を、外因性マウスDLL3(LN229-mDLL3)を発現する皮下LN229腫瘍を有するNSGマウスに注射した。このモデルでは、腫瘍細胞によるCAR-Tの活性化は、潜在的にDLL3を発現する正常組織に対する増加された感度および活性をもたらし得る。実験設計を図14Aに示す。腫瘍移植の3日前(-3日目)に、IL-7およびIL-15をコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)(Vigene Biosciences)を、尾静脈を通して注射して、CAR-T細胞の増殖および持続を支持した。LN229-mDLL3細胞を、次いで凍結バイアルから解凍し、完全成長培地(RPMI+10%FBS)において4.25×107個の細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植する直前に、細胞をBDマトリゲルマトリックス(カタログ番号354234)と1:1に混合し、マウスあたり4.25x106個のLN229-mDLL3細胞を含有する200μLの細胞/マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後8日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後22日目に、腫瘍体積ならびにIL-7およびIL-15の血清濃度に基づいて、マウスを5匹の群にランダム化した。同日(22日目)に、非形質導入T細胞およびマウス交差反応性10G1-K DLL3 CAR-T細胞を解凍し、RPMI+10%FBSに再懸濁し、マウスあたり1x107個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって注射した。腫瘍を研究の終わりまで3~4日毎に監視し続け、DLL3 CAR T治療によるロバストな抗腫瘍活性を観察した(図14B)。
潜在的な脳および下垂体の毒性の責任をさらに評価するため、DLL3 CAR-T細胞を、外因性マウスDLL3(LN229-mDLL3)を発現する皮下LN229腫瘍を有するNSGマウスに注射した。このモデルでは、腫瘍細胞によるCAR-Tの活性化は、潜在的にDLL3を発現する正常組織に対する増加された感度および活性をもたらし得る。実験設計を図14Aに示す。腫瘍移植の3日前(-3日目)に、IL-7およびIL-15をコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)(Vigene Biosciences)を、尾静脈を通して注射して、CAR-T細胞の増殖および持続を支持した。LN229-mDLL3細胞を、次いで凍結バイアルから解凍し、完全成長培地(RPMI+10%FBS)において4.25×107個の細胞/mLに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植する直前に、細胞をBDマトリゲルマトリックス(カタログ番号354234)と1:1に混合し、マウスあたり4.25x106個のLN229-mDLL3細胞を含有する200μLの細胞/マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後8日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積=(幅^2×長さ/2)という式を使用して計算した。移植後22日目に、腫瘍体積ならびにIL-7およびIL-15の血清濃度に基づいて、マウスを5匹の群にランダム化した。同日(22日目)に、非形質導入T細胞およびマウス交差反応性10G1-K DLL3 CAR-T細胞を解凍し、RPMI+10%FBSに再懸濁し、マウスあたり1x107個のCAR+細胞で、マウスあたり200uLの体積の尾静脈IV注射によって注射した。腫瘍を研究の終わりまで3~4日毎に監視し続け、DLL3 CAR T治療によるロバストな抗腫瘍活性を観察した(図14B)。
49日目に、DLL3 CAR-T細胞を受けた動物が腫瘍を有しなかった場合、動物からの脳組織を10%NBFに固定し、包埋して、第3および第4の側脳室を含む、脳室系を明らかにし、3つの切片を単一ブロックに配置し、それを4~6ミクロンで連続的に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色するか、または免疫組織化学によってヒト特異的CD3(hCD3)を検出するために染色した。下垂体を10%NBFで固定し、処理し、H&Eで染色するか、または免疫組織化学的に染色して、hCD3を示した。H&Eスライドが顕微鏡で検査され、組織病理学的所見が病理学者によって標準システムを使用してスコア付けられた。DLL3 CAR-T細胞の投与は、下垂体中葉および神経葉における豊富なhCD3染色T細胞、前葉における比較的少ないT細胞をもたらした(図14Cおよびデータは示されていない)。T細胞のまばら~中程度に低いまたは中程度~中程度に高いhCD3染色が、脳の神経網および血管系(循環T細胞として)に存在した(図14Cおよびデータは示されていない)。他の下垂体または脳の所見は存在しなかった(図14C~D)。T細胞浸潤の機能的結果を理解するために、神経葉において放出された2つのホルモン、バソプレシンおよびオキシトシンを、免疫組織化学を使用して染色した。バソプレシン検出のために、試料を室温で1時間1/7,000希釈で抗バソプレシン抗体(ImmunoStar、20069)で、次いで室温で30分間Rabbit-on-Rodent HRP-Polymer(Biocare Medical)で染色した。オキシトシン検出のために、試料を室温で15分間1/10,000希釈で抗オキシトシン抗体(ImmunoStar、20068)で、次いで室温で30分間Rabbit-on-Rodent HRP-Polymer(Biocare Medical)で染色した。両方のホルモンは、非形質導入T細胞またはDLL3 CAR-T細胞を受けた動物の下垂体神経葉において検出することができ、この領域におけるホルモン産生ニューロンが機能的なままであったことを示す(図14E~F)。よって、病理学的評価およびホルモン染色に基づいて、組織損傷は試料には見られなかった。
実施例15:頭蓋内腫瘍を担持する動物を使用したマウス安全性研究
脳へのT細胞浸潤を促進し、潜在的な脳毒性をさらに理解するために、外因性マウスDLL3およびヒトEGFRvIII(LN229-mDLL3-vIII)を発現する頭蓋内LN229腫瘍を有するNSGマウスを使用した。実験設計を図15Aに示す。LN229-mDLL3細胞を、凍結バイアルから解凍し、RPMIにおいて1×107個の生存細胞/mLに希釈した。次いで、マウスあたり3μLの3×104個のLN229-mDLL3細胞を含有する細胞懸濁液を、頭蓋内に注射した。腫瘍成長は、IVISイメージングシステムによって監視した。移植後17日目に、腫瘍体積に基づいてマウスを10匹の群にランダム化した。同日(17日目)に、TCRノックアウトされた非形質導入T細胞、10G1-K DLL3 CAR-T細胞、およびEGFRvIII CAR-T細胞を解凍し、RPMIに再懸濁し、1x107個のCAR+細胞/マウスで、200uL/マウスの体積の尾静脈IV注射によって注射した。EGFRvIII CAR-T細胞を、脳における腫瘍崩壊によって引き起こされる潜在的な炎症を評価するための対照として含んだ。CAR-T細胞の増殖および持続を支持するために、0.5ugのIL-15(Peprotech AF-200-15)および3ugのIL-15Ra Fc融合タンパク質(R&D Systems 7194-IR)を、17日目に開始して研究の終わりまで週2回各動物に投与した。腫瘍を研究の終わりまで3~4日毎に監視し続け、明確な抗腫瘍活性を観察した(図15B)。22日目および38日目に、すべての動物からの脳組織をトリミングし、処理し、包埋し、第3および第4の側脳室を含む、脳室系を明らかにし、3つの切片を単一ブロックに配置し、それを4~6ミクロンで連続的に切片化し、H&Eで染色するか、免疫組織化学によってヒト特異的CD45(hCD45)を検出するために染色した。下垂体組織は、神経葉、中葉、および前葉を含むように処理し、H&Eで染色するか、または免疫組織化学的に染色して、ヒトT細胞のマーカーとしてhCD45を検出した。
脳へのT細胞浸潤を促進し、潜在的な脳毒性をさらに理解するために、外因性マウスDLL3およびヒトEGFRvIII(LN229-mDLL3-vIII)を発現する頭蓋内LN229腫瘍を有するNSGマウスを使用した。実験設計を図15Aに示す。LN229-mDLL3細胞を、凍結バイアルから解凍し、RPMIにおいて1×107個の生存細胞/mLに希釈した。次いで、マウスあたり3μLの3×104個のLN229-mDLL3細胞を含有する細胞懸濁液を、頭蓋内に注射した。腫瘍成長は、IVISイメージングシステムによって監視した。移植後17日目に、腫瘍体積に基づいてマウスを10匹の群にランダム化した。同日(17日目)に、TCRノックアウトされた非形質導入T細胞、10G1-K DLL3 CAR-T細胞、およびEGFRvIII CAR-T細胞を解凍し、RPMIに再懸濁し、1x107個のCAR+細胞/マウスで、200uL/マウスの体積の尾静脈IV注射によって注射した。EGFRvIII CAR-T細胞を、脳における腫瘍崩壊によって引き起こされる潜在的な炎症を評価するための対照として含んだ。CAR-T細胞の増殖および持続を支持するために、0.5ugのIL-15(Peprotech AF-200-15)および3ugのIL-15Ra Fc融合タンパク質(R&D Systems 7194-IR)を、17日目に開始して研究の終わりまで週2回各動物に投与した。腫瘍を研究の終わりまで3~4日毎に監視し続け、明確な抗腫瘍活性を観察した(図15B)。22日目および38日目に、すべての動物からの脳組織をトリミングし、処理し、包埋し、第3および第4の側脳室を含む、脳室系を明らかにし、3つの切片を単一ブロックに配置し、それを4~6ミクロンで連続的に切片化し、H&Eで染色するか、免疫組織化学によってヒト特異的CD45(hCD45)を検出するために染色した。下垂体組織は、神経葉、中葉、および前葉を含むように処理し、H&Eで染色するか、または免疫組織化学的に染色して、ヒトT細胞のマーカーとしてhCD45を検出した。
22日目に、非形質導入T細胞または10G1-K DLL3 CAR-T細胞を受けた動物は、脳または下垂体にまれな/まばらなhCD45染色T細胞を有した(データ記載せず)。一方、EGFRvIII CAR-T細胞で処理された動物について、hCD45+染色は、浸潤/神経膠症または神経膠腫の領域においてまれ/まばらから中程度に低いか、または中程度から中程度に高い範囲であり、この群の抗腫瘍活性と一致した(データ記載せず)。38日目に、非形質導入T細胞またはEGFRvIII CAR-T細胞を受けた動物は、脳および下垂体にまれな/まばらなhCD45+染色を有した。10G1-K DLL3 CAR-T細胞を受けた動物は、下垂体、主に中葉および神経葉において最小限または軽度の単核細胞浸潤を有した(図15C-D)。また、これらの動物は、脳の他の領域(脳の血管系、脈絡叢、および髄膜)におけるまれな/まばらな染色と比較して、神経膠腫の小さな病巣に関連するわずかに多い(中程度に低い)hCD45+染色を有し、図15Bに示されるこの群の抗腫瘍活性と一致した。
実施例16:解離されたマウス下垂体細胞のインビトロ細胞毒性
DLL3 CARTが下垂体に対して活性であるかを直接試験するために、NSGマウスからのマウス下垂体をインビトロ分析のために無菌条件下で採取した。組織は、1mLの解離ミックス[5mLのDMEM、高グルコース、GlutaMax(Gibco、カタログ番号10564)、50uLの酵素H、5uLの酵素R、6.25uLの酵素A(Miltenyi腫瘍解離キット番号130-095-929)]において37℃で3ラウンドのインキュベーションによって解離し、続いて粉砕を使用した機械的解離を行った。単一細胞を完全培地(DMEM、高グルコース、GlutaMax、20%、1Xインスリン-トランスフェリン-セレン溶液、1X MEM非必須アミノ酸、1Xペニシリン-ストレプトマイシン)に移し、各ラウンド後にプールした。細胞をペレット化し、ACK溶解バッファーでRTで3分間処理し、続いて完全培地において中和した。細胞懸濁液を70uフィルターに通して濾過し、遠心分離してバッファーを除去した。細胞をカウントし、96ウェルプレートに完全培地においてウェルあたり5x104細胞で播種し、CAR-T細胞が添加される前に3日間回復させた。CAR-T細胞が添加される時点で、予想される標的密度は、ウェルあたり1×104細胞である。対照について、DLL3+細胞(DMS-273)およびDLL3-細胞(293T)を同じ密度で播種した。10G1-Kおよび2G1 DLL3 CAR-T細胞をE:T=9:1、3:1、および1:1で添加し、標的と3日間共培養した。3日の共培養の終わりに、培地をウェルから分離し、遠心分離してT細胞をペレット化した。標的細胞を、50uL/ウェルのCell Titer Glo(Promega、G7570)で10分間処理し、SpectraMaxプレートリーダーで細胞毒性読み取りについて分析した。
DLL3 CARTが下垂体に対して活性であるかを直接試験するために、NSGマウスからのマウス下垂体をインビトロ分析のために無菌条件下で採取した。組織は、1mLの解離ミックス[5mLのDMEM、高グルコース、GlutaMax(Gibco、カタログ番号10564)、50uLの酵素H、5uLの酵素R、6.25uLの酵素A(Miltenyi腫瘍解離キット番号130-095-929)]において37℃で3ラウンドのインキュベーションによって解離し、続いて粉砕を使用した機械的解離を行った。単一細胞を完全培地(DMEM、高グルコース、GlutaMax、20%、1Xインスリン-トランスフェリン-セレン溶液、1X MEM非必須アミノ酸、1Xペニシリン-ストレプトマイシン)に移し、各ラウンド後にプールした。細胞をペレット化し、ACK溶解バッファーでRTで3分間処理し、続いて完全培地において中和した。細胞懸濁液を70uフィルターに通して濾過し、遠心分離してバッファーを除去した。細胞をカウントし、96ウェルプレートに完全培地においてウェルあたり5x104細胞で播種し、CAR-T細胞が添加される前に3日間回復させた。CAR-T細胞が添加される時点で、予想される標的密度は、ウェルあたり1×104細胞である。対照について、DLL3+細胞(DMS-273)およびDLL3-細胞(293T)を同じ密度で播種した。10G1-Kおよび2G1 DLL3 CAR-T細胞をE:T=9:1、3:1、および1:1で添加し、標的と3日間共培養した。3日の共培養の終わりに、培地をウェルから分離し、遠心分離してT細胞をペレット化した。標的細胞を、50uL/ウェルのCell Titer Glo(Promega、G7570)で10分間処理し、SpectraMaxプレートリーダーで細胞毒性読み取りについて分析した。
図16Aは、DLL3 CAR-T細胞がDLL3+DMS 273細胞株に対して活性であるが、それらがインビトロでマウス下垂体細胞に対して細胞毒性ではないことを示す実験データを示す。T細胞をプールし、フローサイトメトリーによる分析のために活性化マーカー(41BBおよびCD25)について染色した。図16Bは、マウス下垂体細胞がインビトロでDLL3 CAR-T細胞を活性化しないことを示す。上清を-80℃で凍結し、次いでHuman TH1/TH2 10-Plex Tissue Culture Kit(Meso Scale Discovery、K15010B)を使用してサイトカイン分析のために解凍した。図16Cは、10G1-Kおよび2G1 DLL3 CAR-T細胞の両方が、DLL3+DMS 273細胞株と共培養される場合、インターフェロン-ガンマ(IFNγ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、およびIL-2を分泌するが、DLL3 CAR-T細胞をマウス下垂体細胞と共培養した後、サイトカイン分泌がないことを示す。よって、DLL3 CAR-T細胞は、インビトロで下垂体細胞に対して細胞毒性ではなかった。
Claims (45)
- 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451、および460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1、
(b)配列番号2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461、および695からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2、
(c)配列番号3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453、および462からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3、
(d)配列番号4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463、および696からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1、
(e)配列番号5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455、および464からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2、ならびに
(f)配列番号6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456、および465からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3のうちの少なくとも1つを含む、キメラ抗原受容体。 - 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451、および460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1、
(b)配列番号2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461、および695からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2、ならびに
(c)配列番号3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453、および462からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3を含む、キメラ抗原受容体。 - 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463、および696からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1、
(b)配列番号5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455、および464からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2、ならびに
(c)配列番号6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456、および465からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3を含む、キメラ抗原受容体。 - 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに
(b)配列番号8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458、および467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含み、
前記可変重鎖および前記可変軽鎖が、少なくとも1つのリンカーによって連結される、キメラ抗原受容体。 - 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
(a)配列番号7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、および466からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに
(b)配列番号8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458、および467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、
前記可変重鎖および前記可変軽鎖が、少なくとも1つのリンカーによって連結される、キメラ抗原受容体。 - 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、DLL3に特異的に結合するDLL3抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、表1dに提示されるscFvからなる群から選択される配列を含む、キメラ抗原受容体。
- DLL3に特異的に結合するキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体が、配列番号482~533および配列番号632~683のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
- 前記細胞内ドメインが、少なくとも1つの共刺激ドメインを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記共刺激ドメインが、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である、請求項8に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記共刺激ドメインが、4-1BB/CD137のシグナル伝達領域を含む、請求項9に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記4-1BB/CD137共刺激ドメインが、配列番号480またはその断片を含む、請求項10に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞内ドメインが、少なくとも1つの活性化ドメインを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記活性化ドメインが、CD3を含む、請求項12に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記CD3が、CD3ゼータを含む、請求項13に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記CD3ゼータが、配列番号481またはその断片を含む、請求項14に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号570~621および631のうちのいずれか1つのポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1~15のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 安全スイッチをさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記安全スイッチが、CD20ミモトープまたはQBEND-10エピトープを含む、請求項17に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記安全スイッチが、1つ以上のCD20ミモトープもしくは1つ以上のQBEND-10エピトープ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項18に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記キメラ抗原受容体が、QR3、SR2、RSR、またはR2Sのフォーマットの1つ以上の安全スイッチを含む、請求項17~19のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号622~628、474~476、565、および684~694のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項17~20のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項1~21に記載のキメラ抗原受容体のうちのいずれか1つをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レンチウイルスベクター、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項23に記載のベクター。
- 請求項1~21に記載のキメラ抗原受容体のうちのいずれか1つを発現する操作された免疫細胞。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドまたは請求項23もしくは24に記載のベクターを発現する操作された免疫細胞。
- 前記免疫細胞が、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞、またはNK-T細胞である、請求項25または26に記載の操作された免疫細胞。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項27に記載の操作された免疫細胞。
- 前記細胞が、同種T細胞である、請求項27に記載の操作された免疫細胞。
- 請求項25~29のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を含む、薬学的組成物。
- 疾患または障害の治療を必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、請求項25~29のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項30に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記疾患または障害が、癌である、請求項31に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、小細胞肺癌である、請求項31または32に記載の方法。
- 請求項26~325~29のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項30に記載の薬学的組成物を含む、製品。
- (a)配列番号1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451、および460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1、
(b)配列番号2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461、および695からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2、
(c)配列番号3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453、および462からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3、
(d)配列番号4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463、および696からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1、
(e)配列番号5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455、および464からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2、ならびに
(f)配列番号6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456、および465からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3を含む、抗DLL3結合剤。 - 前記結合剤が、抗体、抗体コンジュゲート、またはそれらの抗原結合断片、任意に、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fab断片、Fv断片、scFv断片、dsFv断片、またはdAb断片である、請求項35に記載のDLL3結合剤。
- 前記結合剤が、IgG定常領域を含むモノクローナル抗体である、請求項36に記載の抗DLL3結合剤。
- 表1bに提供されるVH配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である可変重(VH)鎖配列を含む、請求項35~37のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤。
- 表1cに提供されるVL配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である可変軽(VL)鎖配列を含む、請求項35~38のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤。
- 前記結合剤が、表1dに提示されるscFv配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%、または100%同一である配列を含む、請求項35~39のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤。
- 前記結合剤が、Fc定常領域に融合されたscFv断片を含む融合タンパク質である、請求項35~40のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤。
- 請求項35~41のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 請求項35~41のいずれか一項に記載の抗DLL3結合剤、または請求項42に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法。
- 前記疾患または障害が、癌である、請求項43に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、小細胞肺癌である、請求項43または44に記載の方法。
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