KR20220003567A - Pd-1 및 lag-3에 대한 이중특이적 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티 및 LAG-3에 특이적으로 결합하는 제2 표적화 모이어티를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하고, 제1 표적화 모이어티는 제1 VHH 도메인을 포함하고, 제2 표적화 모이어티는 제2 VHH 도메인을 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체의 아미노산 서열, 클로닝 또는 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체의 발현 또는 단리 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 치료 조성물이 또한 제공된다. 본 발명은 또한 이중특이적 항체에 의해 암 및 다른 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티(targeting moiety) 및 LAG-3에 특이적으로 결합하는 제2 표적화 모이어티를 포함하는 이중특이적 항체(bispecific antibody)에 관한 것으로, 제1 표적화 모이어티는 제1 VHH 도메인을 포함하고, 제2 표적화 모이어티는 제2 VHH 도메인(domain)을 포함한다. 또한, 본 발명은 항체를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 숙주 세포, 항체의 생산 공정 및 이중특이적 항체를 사용한 암, 감염 또는 다른 인간 질병의 치료에서의 면역요법을 제공한다.
지난 몇 년 동안, 면역요법은 일부 유형의 암과 싸우기 위한 매우 유망한 신규한 영역으로 발전하였다. 면역 체크포인트 단백질 중 하나인 PD-1은 활성화된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 및 B 세포에서 발현되는 CD28 패밀리의 억제성 구성원이다. PD-1은 면역계를 하향 조절하는데 중요한 역할을 한다.
PD-1은 I형 막관통 단백질이며, 그 구조는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM) 및 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프 (ITSM)를 포함하는 면역글로불린 가변형 세포외 도메인 및 세포질 도메인으로 구성된다.
PD-1은 B7 패밀리의 세포 표면 발현 구성원인 2개의 공지된 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. 생리학적 리간드와 결찰되면 PD-1은 T-세포 수용체 (TCR) 매개 신호전달의 주요 혼입인자인 Zap70을 탈인산화 및 비활성화하는 SHP-2를 집합시켜 T 세포 활성화를 억제한다. 그 결과, PD-1은 T 세포 증식 및 사이토카인 생산 및 세포독성 활성과 같은 T 세포 기능을 억제한다.
PD-1을 표적화하는 단일클론 항체는 PD-1/PD-L1 결합을 차단하고 암세포에 대한 면역 반응을 높일 수 있다. 이러한 약물은 특정 암을 치료하는데 많은 가능성을 보여주었다. 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab) (Keytruda), 니볼루맙 (Nivolumab) (Opdivo), 세미플리맙 (Cemiplimab) (Libtayo)를 포함하여 PD-1을 표적화하는 다수의 승인된 치료 항체를 다수의 제약 회사에서 개발하였다. 이러한 약물은 피부 흑색종, 비소세포폐암, 신장암, 방광암, 두경부암, 호지킨 림프종을 포함하는 다양한 유형의 암 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 이는 또한 많은 다른 유형의 암에 대한 사용을 위해 연구되고 있다.
LAG-3으로도 공지된 림프구 활성화 유전자 3은 면역 글로불린 슈퍼패밀리 (IgSF)의 구성원인 I형 막관통 단백질이다. LAG-3은 활성화된 T 세포, NK 세포, B 세포 및 형질세포양 수지상 세포에서 발현되지만 휴지기 T 세포에서는 발현되지 않는 세포 표면 분자이다. LAG-3은 CD4와 약 20%의 아미노산 서열 상동성(homology)을 공유하지만 더 높은 친화도로 MHC 클래스 II에 결합하여 T 세포 수용체 신호전달의 음성 조절을 제공한다.
시험관내에서 LAG-3의 차단은 T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 증가시키며, LAG-3 결핍 마우스는 초항원 포도상구균 장독소 B, 펩타이드 또는 센다이 바이러스 감염에 의해 유도된 T 세포 반응의 하향조절에 결함이 있다. LAG-3은 활성화된 천연 Treg (nTreg) 및 유도된 CD4+FoxP3+ Treg (iTreg) 세포 모두에서 발현되며, 발현 수준은 활성화된 효과기 CD4+ T 세포에서 관찰되는 것보다 더 높다. Treg 세포에서 LAG-3의 차단은 Treg 세포 억제인자 기능을 제거하고, 비-Treg CD4+ T 세포에서 LAG-3의 이소성 발현은 억제 활성을 부여한다. 만성 감염 및 암에서 T 세포 기능에 대한 LAG-3의 면역 조절 역할에 기반하여, LAG-3 특이적 단일클론 항체에 대한 예측된 작용 기전은 종양 특이적 효과기 T 세포의 음성 조절을 억제하는 것이다. 또한, PD-1 경로와 LAG-3의 이중 차단은 마우스와 인간에서 두 분자 중 하나만 차단하는 것보다 항종양 면역에 더 효과적인 것으로 나타났다.
LAG-3 및 PD-1의 공동-발현은 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 나타나고, 둘 모두의 공동-차단은 개선된 증식 및 사이토카인 생산으로 이어진다. 항-PD-1 요법과 조합된 항-LAG-3은 다양한 유형의 고형 종양에 대한 임상 시험에 들어갔다.
본 발명은 단리된 항체, 특히 이중특이적 항체를 제공한다.
한가지 측면에서, 본 발명은 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티 및 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 제2 표적화 모이어티ㄹ를 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제1 표적화 모이어티는 제1 VHH 도메인을 포함하고, 제2 표적화 모이어티는 제2 VHH 도메인을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 전술한 항체 또는 항원 결합 단편, 제1 표적화 모이어티는 뮤린 PD-1에 결합하고, 제2 표적화 모이어티는 뮤린 LAG-3에 결합한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제1 VHH 도메인은 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고; H-CDR3은 서열번호 1에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형(conservative modification)을 포함하고; H-CDR2는 서열번호 2에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR1은 서열번호 3에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제2 VHH 도메인은 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3을 포함하고; H-CDR3은 서열번호 4에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR2는 서열번호 5에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR1은 서열번호 6에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제1 VHH 도메인은 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성인 서열을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제2 VHH 도메인은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성(homologous)인 서열을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 제1 VHH 도메인은 서열번호 7의 서열을 포함하고, 제2 VHH 도메인은 서열번호 8의 서열을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 제1 VHH 도메인 및 제2 VHH 도메인은 펩타이드 서열에 의해 연결되고, 상기 펩타이드 서열은
(a) 힌지 영역(hinge region), CH2 및 CH3을 포함하는 IgG Fc 단편, 및/또는
(b) 링커(linker)
를 포함한다.
한가지 실시양태에서, 링커는 서열번호 9의 서열을 포함한다.
한가지 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 항체 또는 항원 결합 단편은
a) 2.92E-09 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고;
b) 3.01E-10 이하의 KD로 인간 LAG-3에 결합한다.
상기 항체의 서열은 표 1 및 서열목록에 제시되어 있다. W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 형태는 VHH (항-PD-1)-힌지-CH2-CH3-링커-VHH(항-LAG-3)이고, 힌지-CH2-CH3은 IgG4의 Fc 단편이다.
| 클론 ID | 서열번호 | 아미노산 서열 | |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 항-PD-1 결합 도메인의 VHH | 7 | QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASDSIDSLVNMGWYRQAPGKQRELVALIATYITHYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYARNIIVDYWGQGTLVTVSS |
| 항-LAG-3 결합 도메인의 VHH |
8 | QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGLTLSQYTMGWFRQAPGKERELVAAIHWTSSVTDYADSVYGRFTISRDDSKNTGYLQMNSLRAEDTAVYYCAATHYYTHRGPFDYWGQGTLVTVSS | |
| 링커 | 9 | GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | |
| 전장 서열 | 10 | QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASDSIDSLVNMGWYRQAPGKQRELVALIATYITHYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYARNIIVDYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGLTLSQYTMGWFRQAPGKERELVAAIHWTSSVTDYADSVYGRFTISRDDSKNTGYLQMNSLRAEDTAVYYCAATHYYTHRGPFDYWGQGTLVTVSS | |
상기 항체의 CDR 서열은 표 2 및 서열목록에 제시되어 있다.
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 서열번호 | 아미노산 서열 | |
| 항-PD-1 결합 도메인 | 항-PD-1: HCDR3 | 1 | RNIIVDY |
| 항-PD-1: HCDR2 | 2 | LIATYITHYADFVKG | |
| 항-PD-1: HCDR1 | 3 | DSIDSLVNMG | |
| 항-LAG-3 결합 도메인 | 항-LAG-3: HCDR3 | 4 | THYYTHRGPFDY |
| 항- LAG-3: HCDR2 | 5 | AIHWTSSVTDYADSVYG | |
| 항- LAG-3: HCDR1 | 6 | GLTLSQYTMG | |
본 발명의 항체는 키메라 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체, 또는 완전한 인간 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 설치류 항체일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝(cloning) 또는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 항체를 단리하는 단계를 포함하는 공정을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 상기 항체의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료제에 연결된 본 발명의 상기 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
여기서, 본 발명은 상기 면역접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체(subject)에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 본 발명의 항체, 또는 상기 항체 중 임의의 하나의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 면역 장애(immune disorder) 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 종양 세포의 성장을 억제하기 위해 치료 유효량의 상기 항체, 또는 상기 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
여기서, 본 발명은 종양 세포는 흑색종(melanoma), 신장암(renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안내 악성 흑색종(cutaneous or intraocular malignant melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 및 직장 암(rectal cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 세포인 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점
PD-1 및 LAG-3 경로 둘 모두에 대한 이중특이적 항체는 암 요법에서 다수의 이점을 제공할 수 있다. 항-PD-1 요법과 비교하여, 이중특이적 항체는 PD-1 및 LAG-3 이중 양성 암에 대한 반응 속도를 증가시킬 수 있다.
도 1은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 PD-1 단백질에 결합함을 도시한다.
도 2는 인간 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 3은 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 4는 마우스 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 5는 세포 표면 사이노몰구스 PD-1에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 6은 사이노몰구스 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 7은 인간 CTLA-4, CD28 및 CD4 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 결합을 도시한다. 도 7a는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CTLA-4 단백질에 결합하지 않음을 도시하고; 도 7b는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CD28 단백질에 결합하지 않는다는 것을 도시하고; 도 7c는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CD4 단백질에 결합하지 않음을 도시한다.
도 8은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 PD-1 및 LAG-3 단백질에 동시에 결합함을 도시한다.
도 9는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 PD-L1 발현 세포에 대한 PD-1의 결합을 차단함을 도시한다.
도 10은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 Raji 세포 상의 MHC-II에 대한 LAG-3의 결합을 차단함을 도시한다.
도 11은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 PD-1 발현 Jurkat에서 NFAT 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 12는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 LAG-3 발현 Jurkat에서 IL-2 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 13은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 LAG-3 및 PD-1 발현 Jurkat에서 NFAT 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 14는 인간 동종이계 혼합 림프구 반응 (MLR)에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과를 도시한다. 도 14a는 MLR 분석에서 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 IL-2 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다. 도 14b는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 MLR 분석에서 IFN-γ 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 15는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 SEB로 자극된 PBMC의 IL-2 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 16은 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP가 최대 14일 동안 신선한 인간 혈청에서 안정했음을 도시한다.
도 17은 마우스의 종양에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과를 도시한다. 도 17a는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 마우스에서 결장 26 종양의 성장을 억제한다는 것을 도시한다. 도 17b는 처리된 마우스의 생존 곡선을 도시한다. 도 17c는 처리된 마우스의 중량 변화를 도시한다.
도 2는 인간 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 3은 마우스 PD-1 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 4는 마우스 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 5는 세포 표면 사이노몰구스 PD-1에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 6은 사이노몰구스 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체를 도시한다.
도 7은 인간 CTLA-4, CD28 및 CD4 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 결합을 도시한다. 도 7a는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CTLA-4 단백질에 결합하지 않음을 도시하고; 도 7b는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CD28 단백질에 결합하지 않는다는 것을 도시하고; 도 7c는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CD4 단백질에 결합하지 않음을 도시한다.
도 8은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 PD-1 및 LAG-3 단백질에 동시에 결합함을 도시한다.
도 9는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 PD-L1 발현 세포에 대한 PD-1의 결합을 차단함을 도시한다.
도 10은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 Raji 세포 상의 MHC-II에 대한 LAG-3의 결합을 차단함을 도시한다.
도 11은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 PD-1 발현 Jurkat에서 NFAT 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 12는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 LAG-3 발현 Jurkat에서 IL-2 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 13은 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 LAG-3 및 PD-1 발현 Jurkat에서 NFAT 경로를 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 14는 인간 동종이계 혼합 림프구 반응 (MLR)에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과를 도시한다. 도 14a는 MLR 분석에서 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 IL-2 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다. 도 14b는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 MLR 분석에서 IFN-γ 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 15는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 SEB로 자극된 PBMC의 IL-2 생산을 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 16은 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP가 최대 14일 동안 신선한 인간 혈청에서 안정했음을 도시한다.
도 17은 마우스의 종양에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과를 도시한다. 도 17a는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 마우스에서 결장 26 종양의 성장을 억제한다는 것을 도시한다. 도 17b는 처리된 마우스의 생존 곡선을 도시한다. 도 17c는 처리된 마우스의 중량 변화를 도시한다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 먼저 특정 용어를 규정한다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 추가 정의가 제시된다.
용어 "계획된 사멸 1", "계획된 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1", "CD279" 및 " hPD-F"는 혼용되며, 인간 PD-1의 변이체, 이소형, 종 상동체, 다른 종의 PD-1, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
본 명세서에 지칭되는 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 중쇄의 CDR은 H-CDR, 예를 들어 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 약칭하고 경쇄의 CDR은 L-CDR, 예를 들어 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3로 약칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 유도체를 지칭하며, 시험관내 또는 생체내에서 생산되는지에 관계없이 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 이 용어는 다음에 제한되는 것은 아니나, 다클론, 단일클론, 단일특이적, 다중특이적, 비특이적, 인간화, 단일 사슬, 키메라, 합성, 재조합, 혼성체, 돌연변이 및 이식된 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 항체 단편, 예컨대 scFv, dAb, 제1 VHH 도메인 및 제2 VHH 도메인을 포함하는 이중특이적 항체, 및 항원 결합 기능, 즉 PD-1 및 LAG-3에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 다른 항체 단편을 포함한다. 통상적으로, 이러한 단편은 항원 결합 단편을 포함할 것이다.
항원 결합 단편은 통상적으로 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하지만, 반드시 둘 모두를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 단편은 VH 도메인과 CH1 도메인으로만 구성되지만 여전히 온전한 항체의 일부 항원 결합 기능을 보유한다.
용어 "교차 반응성"은 본 명세서에 기재된 항원 단편이 인간, 원숭이 및/또는 뮤린 (마우스 또는 랫트)에서 동일한 표적 분자에 결합하는 것을 지칭한다. 따라서, "교차 반응성"은 상이한 종에서 발현되는 동일한 분자 X에 대한 종간 반응성으로 이해되어야 하지만 X 이외의 분자에 대해서는 그렇지 않다. 예를 들어, 인간 PD-1, 원숭이, 및/또는 뮤린 (마우스 또는 랫트) PD-1을 인식하는 단일클론 항체의 교차 종 특이성은 예를 들어 FACS 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 혼용된다.
"치료" 및 "치료 방법"이라는 용어는 치료적 처치 및 방지적/예방적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 자들은 이미 특정 의학적 장애가 있는 개체와 결과적으로 그 장애를 획득할 수 있는 자들을 포함할 수 있다.
용어 "보존적 변형", 즉, 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치거나 이를 변이시키지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 서열 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다.
용어 "LAG-3", "림프구 활성화 유전자 3", "CD223"은 혼용되며, 인간 LAG-3의 변이체, 이소형, 종 상동체, 다른 종의 LAG-3, 및 LAG-3과 함께 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체", "중쇄 항체", "HCAb"는 혼용되며, 2개의 VH 도메인을 포함하고 경쇄는 포함하지 않는 항체를 지칭한다. 중쇄 항체는 낙타과 (낙타, 단봉 낙타 및 라마)로부터 최초로 유래되었다. 경쇄가 없지만 HCAb는 확실한 항원 결합 기전 부분을 가지고 있다. 중쇄 항체의 가변 도메인 (VHH 도메인)은 적응 면역 반응에 의해 생성된 가장 작은 공지된 항원 결합 단위를 나타낸다. 용어 "VHH"는 HCAb의 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동체" 및 "상동성"은 혼용되고, 최적으로 정렬될 때 다른 서열에 대해 적어도 70% (예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 (또는 이의 상보적 가닥) 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
실시예
실시예 1
: 연구 재료 준비
1. 시판 재료
2. 항원 및 다른 단백질 생성
2.1 항원의 생산
인간 PD-1, 마우스 PD-1, 인간 LAG-3, 마우스 LAG-3 및 사이노몰구스 LAG-3 ECD (세포외 도메인)를 인코딩하는 핵산은 Sangon Biotech에 의해 합성하였다. PD-1 또는 LAG-3 유전자 단편을 합성 핵산으로부터 증폭하여 발현 벡터 pcDNA3.3 (ThermoFisher)에 삽입하였다. 삽입된 PD-1 또는 LAG-3 유전자 단편을 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인하였다. 인간 Fc, 마우스 Fc를 포함하는 다양한 태그가 있는 인간 LAG-3 ECD를 포함하는 융합 단백질을 인간 PD-1 또는 LAG-3 유전자를 293F 세포 (ThermoFisher)에 형질감염시켜 획득하였다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 FreeStyle 293 발현 배지에서 배양하였다. 배양 5일 후, 일시적으로 형질감염된 세포의 배양으로부터 수확된 상청액을 단백질 정제에 사용하였다. 융합 단백질을 단백질 A 및/또는 SEC 컬럼으로 정제하였다. 태그가 없는 LAG-3 ECD 단백질을 인자 Xa 프로테아제를 사용하여 절단 부위가 있는 ECD-hFc 융합 단백질의 절단에 의해 생성하였다. 정제된 단백질을 스크리닝 및 특성화에 사용하였다.
마우스 Fc-태그 인간 PD-L1 ECD, 인간 CTLA-4 ECD 및 CD28 ECD를 상기와 같이 생성하였다.
2.2 벤치마크 항체의 생산
항-인간 PD-1 또는 LAG-3 벤치마크 항체 (W339-BMK1 및 W305-BMK1)의 유전자 서열을 각각 특허 출원 US20110150892A1 (W339-BMK1은 "25F7"로 지칭됨) 및 WO2006121168 (W305-BMK1은 "5C4"로 지칭됨)에 개시된 정보에 기반하여 합성하였다.
항-인간 PD-1xLAG-3 벤치마크 항체 W365-BMK1, W365-BMK2 및 W365-BMK3의 서열을 각각 특허 출원 WO2015200119A8 (W365-BMK1은 "서열번호 25 & 서열번호 27"로 지칭됨), WO2017087589A2 (W365-BMK2는 "서열번호 110"으로 지칭됨) 및 WO2015200119A8 (W365-BMK3은 "서열번호 5 및 4"로 지칭됨)에 개시된 정보에 기반하여 합성하였다. 합성된 유전자 서열을 플라스미드 pcDNA3.3에 혼입하였다. 플라스미드로 형질감염된 세포를 5일 동안 배양하고 단백질 A 컬럼을 사용하여 단백질 정제를 위해 상청액을 수집하였다. 획득된 벤치마크 항체를 SDS-PAGE와 SEC로 분석한 후 -80℃에서 저장하였다.
W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-Fc-V2 (3056, 항-PD-1) 및 W3396-P2R2 (L)-1E1-z4-R2-2-Fc (3396, 항-LAG-3)를 Wuxi Biologics의 TAD 부에서 개발하였다.
3. 세포주 생성
사이노몰구스 PD-1 형질감염 세포주를 생성하였다. 간단히 말해서, 293F 세포를 각각 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 형질감염 키트를 사용하여 전장 인간, 사이노몰구스 PD-1을 포함하는 pcDNA3.3 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48 내지 72시간에, 형질감염된 세포를 선택을 위해 블라스티시딘 (blasticidin)을 포함하는 배지에서 배양하고 표적 발현에 대해 시험하였다.
Jurkat 세포주를 Nucleofactor (Lonza)를 사용하여 인간 전장 PD-1/NFAT 리포터 또는 LAG-3/IL-2 리포터를 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에, 형질감염된 세포를 선택을 위해 하이그로마이신 (hygromycin)을 포함하는 배지에서 배양하고 표적 발현에 대해 시험하였다. 안정하게 혼입된 NFAT 또는 IL-2 루시퍼라제 리포터 유전자와 함께 인간 PD-1 또는 LAG-3을 발현하는 Jurkat 세포를 2개월 후에 획득하였다.
실시예 2
: 이중특이적 항체 생성
1. 발현 벡터 작제
제1 VHH 결합 PD-1의 생산 방법은 PCT 출원 PCT/CN2019/078515에 기재되어 있고, 제2 VHH 결합 LAG-3의 생산 방법은 PCT 출원 PCT/CN2019/078315에 기재되어 있다.
항-PD-1 VHH 및 항-LAG-3 VHH를 인코딩하는 DNA 서열을 GENEWIZ (Suzhou, China)에 의해 합성하였다. 그 다음, 항-PD-1 VHH 및 항-LAG-3 VHH를 각각 pYF 발현 벡터의 힌지 영역 및 IgG4 Fc 영역의 N-말단 및 C-말단에 서브클로닝하였다.
2. 소규모 형질감염, 발현 및 정제
이중특이적 항체의 플라스미드를 Expi293 세포에 형질감염시켰다. 세포를 5일 동안 배양하고 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 단백질 정제를 위해 상청액을 수집하였다. 획득된 항체를 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC로 분석한 후 -80℃에서 저장하였다.
항체의 순도를 Agilent 1260 Infinity HPLC를 사용하여 SEC-HPLC에 의해 결정하였다. 항체 용액을 50 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0 완충액을 사용하여 TSKgel SuperSW3000 컬럼에 주입하였다. 구동 시간은 20분이었다. 컬럼의 피크 보유 시간을 280 nm에서 모니터링하였다. 데이터를 ChemStation 소프트웨어 (V2.99.2.0)를 사용하여 분석하였다.
3. 결과
리드 후보의 서열
항체 리드의 서열은 표 2에 나열되어 있고 CDR은 표 1에 나열되어 있다.
실시예 4
: 시험관내 특성화
1. 인간 PD-1 또는 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 결합
플레이트를 4℃에서 밤새 PD-1xLAG-3 항체로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 마우스 Fc-태그 PD-1 단백질 또는 LAG-3 단백질을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, 후속적으로 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 1 및 표 3에 나타낸 바와 같이, PD-1 단백질에 대한 결합에 대한 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 벤치마크와 유사하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.07 |
| W305-BMK1 | 0.09 |
| W365-BMK1 | 0.15 |
| W365-BMK2 | 0.18 |
| W365-BMK3 | 0.09 |
도 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이, LAG-3 단백질에 대한 결합에 대한 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 벤치마크와 유사하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.32 |
| W305-BMK1 | 0.23 |
| W365-BMK1 | 0.35 |
| W365-BMK2 | 0.28 |
| W365-BMK3 | 0.25 |
2. 마우스 PD-1 또는 LAG-3에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 결합
플레이트를 4℃에서 밤새 PD-1xLAG-3 항체로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 His-태그 마우스 PD-1 또는 LAG-3 단백질을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, 후속적으로 HRP-표지된 염소 항-His IgG 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, BMK가 아닌 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP만이 마우스 PD-1 단백질에 결합할 수 있다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.26 |
| W305-BMK1 | 비결합 |
| W365-BMK3 | 비결합 |
도 4 및 표 6에 나타낸 바와 같이, BMK가 아닌 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP만이 마우스 LAG-3 단백질에 결합할 수 있다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.87 |
| W305-BMK1 | 비결합 |
| W365-BMK3 | 비결합 |
3. 사이노몰구스 PD-1 또는 LAG-3에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 결합
사이노몰구스 PD-1의 경우, 사이노몰구스 PD-1을 발현하는 293F 세포를 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체와 각각 인큐베이션하였다. PE-표지된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하여 PD-1xLAG-3 항체가 세포에 결합하는 것을 검출하였다. 세포의 MFI를 유세포 분석기로 측정하고 FlowJo (버전 7.6.1)로 분석하였다.
사이노몰구스 LAG-3의 경우, 플레이트를 4℃에서 밤새 PD-1xLAG-3 항체로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 His-태그 사이노몰구스 LAG-3을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, 후속적으로 HRP-표지된 염소 항-His IgG 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 5 및 표 7에 나타낸 바와 같이, LAG-3 단백질에 대한 결합에 대한 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 BMK와 유사하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.36 |
| W305-BMK1 | 0.28 |
| W365-BMK3 | 0.33 |
도 6 및 표 8에 나타낸 바와 같이, LAG-3 단백질에 대한 결합에 대한 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 W365-BMK3과 유사하고 W339-BMK1보다 더 우수하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 1.21 |
| W339-BMK1 | 4.27 |
| W365-BMK3 | 0.87 |
4. 인간 CD4, CTLA-4 및 CD28에 대한 교차 반응성
인간 CD4, CTLA-4 또는 CD28에 대한 교차 반응성을 ELISA에 의해 측정하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 1 μg/mL의 인간 CD4, CTLA-4 또는 CD28로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 세척한 다음 해당 2차 항체와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다.
도 7a, 도 7b 및 도 7c의 결과는 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체가 인간 CTLA-4, CD28 또는 CD4 단백질에 결합하지 않았음을 나타낸다.
5. SPR에 의한 인간, 마우스, 사이노몰구스 PD-1 및 LAG-3에 대한 친화도 테스트
항원에 대한 이중특이적 항체의 결합 친화도를 Biacore 8K를 사용하는 SPR 분석에 의해 결정하였다. PD-1 x LAG-3 항체를 항-인간 IgG Fc 항체 고정된 CM5 센서 칩 (GE)에 포획하였다. 상이한 농도의 His 태그 인간 PD-1 단백질 (MW: 40KD) 및 사이노몰구스 PD-1 (MW: 40KD)을 30 μL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입하고, 120초 동안의 결합 단계 후 800초 해리를 수행하였다. 다양한 농도의 His 태그 마우스 LAG-3 단백질 (MW: 45KD)을 30 μL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입하고 120초의 결합 단계 후 3600초 해리를 수행하였다. 다양한 농도의 His 태그 마우스 PD-1 단백질 (MW: 45KD)을 30 μL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입하고, 60초의 결합 단계 후 90초 해리를 수행하였다. 칩을 각 결합 주기 후에 10 mM 글리신 (pH 1.5)에 의해 재생하였다.
인간 LAG-3에 대한 친화도의 경우, PD-1xLAG-3 항체를 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 단일 주기 동역학 방법을 사용하여 다양한 농도의 태그가 없는 인간 LAG-3을 30 μL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입하고, 180초의 결합 단계 후 3600초 해리를 수행하였다. 칩을 10 mM 글리신 (pH 1.5)으로 재생하였다.
블랭크 표면 및 완충액 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 제외하였다. 실험 데이터를 Langmiur 분석을 사용하여 1:1 모델로 적용하였다.
| 항원 | Ab | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) |
| 인간 PD-1 | W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 2.52E+05 | 7.36E-04 | 2.92E-09 |
| W305-BMK1 | 4.02E+05 | 1.35E-03 | 3.37E-09 | |
| W365-BMK3 | 3.80E+05 | 1.36E-03 | 3.58E-09 | |
| 사이노몰구스 PD-1 | W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 1.97E+05 | 1.66E-03 | 8.45E-09 |
| W305-BMK1 | 3.51E+05 | 8.39E-04 | 2.39E-09 | |
| W365-BMK3 | 2.93E+05 | 6.74E-04 | 2.30E-09 | |
| 마우스 PD-1 | W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 1.52E+05 | 4.99E-03 | 3.29E-08 |
| 항원 | Ab | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) |
| 인간 LAG-3 | W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 3.00E+05 | 9.03E-05 | 3.01E-10 |
| W339-BMK1 | 4.87E+05 | 3.34E-04 | 6.85E-10 | |
| W365-BMK3 | 1.02E+07 | 8.70E-04 | 8.51E-11 | |
| 마우스 LAG-3 | W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 1.96E+06 | <1.00E-05 | <5.10E-12 |
6. 인간 PD-1 및 LAG-3 단백질에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 이중 결합
플레이트를 4℃에서 밤새 1 μg/mL의 마우스 Fc-태그 인간 PD-1로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체를 플레이트에 첨가하고 세척 후 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음 플레이트를 세척하고 후속적으로 His-태그 LAG-3 단백질과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, HRP 항-His 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 8 및 표 11에 나타낸 바와 같이, LAG-3 단백질에 대한 결합에 대한 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 W365-BMK3와 유사하고 W365-BMK1 및 BMK2보다 더 우수하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.03 |
| W365-BMK1 | 2.41 |
| W365-BMK2 | 0.2 |
| W365-BMK3 | 0.03 |
7. PD-1 발현 세포에 결합하는 PD-L1 단백질의 차단
항체를 1% BSA-PBS에서 연속적으로 희석하고 4℃에서 mFc-태그 PD-L1 단백질과 혼합하였다. 혼합물을 CHO-S 세포를 발현하는 PD-1이 시딩된 96-웰 플레이트로 옮겼다. 염소 항-마우스 IgG Fc-PE 항체를 사용하여 PD-1 발현 세포에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 검출하였다. MFI를 유세포 분석에 의해 평가하고 소프트웨어 FlowJo에 의해 분석하였다.
도 9 및 표 12에 나타낸 바와 같이, PD-L1 발현 세포에 대한 PD-1의 결합의 차단의 경우 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 BMK와 유사하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.58 |
| W305-BMK1 | 0.59 |
| W365-BMK1 | 0.72 |
| W365-BMK2 | 1.36 |
| W365-BMK3 | 0.64 |
8. Raji 세포 상에 발현된 MHC-II에 결합하는 LAG-3 단백질의 차단
항체를 1% BSA-PBS에서 연속적으로 희석하고 4℃에서 마우스 Fc-태그 LAG-3 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 표면에 MHC-II를 발현하는 Raji 세포가 시딩된 96-웰 플레이트로 옮겼다. 염소 항-마우스 IgG Fc-PE 항체를 사용하여 Raji 세포에 대한 LAG-3 단백질의 결합을 검출하였다. MFI를 유세포 분석에 의해 평가하고 소프트웨어 FlowJo에 의해 분석하였다.
도 10 및 표 13에 나타낸 바와 같이, Raji 세포에 발현된 MHC-II에 대한 LAG-3의 결합의 차단의 경우 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 W339-BMK1, W365-BMK3과 유사하고, W365-BMK1 및 W365-BMK2보다 더 우수하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 1.39 |
| W339-BMK1 | 1.68 |
| W365-BMK1 | 30.0 |
| W365-BMK2 | 4.90 |
| W365-BMK3 | 1.88 |
9. NFAT 리포터 유전자를 갖는 PD-1 발현 Jurkat에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과
안정하게 혼입된 NFAT 루시퍼라제 리포터 유전자와 함께 인간 PD-1을 발현하는 Jurkat 세포 및 인간 PD-L1 발현 인공 APC (항원 제시 세포) 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 테스트 항체를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 재작제된 루시페라제 기질 One-Glo를 첨가하고 마이크로플레이트 분광광도계로 루시페라제 강도를 측정하였다.
도 11에서 입증된 바와 같이, 항체는 리포터 유전자 분석에서 Jurkat의 NFAT 경로를 향상시켰다. 또한, 표 14에 나타낸 바와 같이, 이 분석에서 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 EC50은 W365-BMK1보다 더 우수하고 다른 벤치마크 항체와 유사하다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.12 |
| W305-BMK1 | 0.18 |
| W365-BMK1 | 1.94 |
| W365-BMK2 | 0.31 |
| W365-BMK3 | 0.23 |
10. IL-2 리포터 유전자를 갖는 LAG-3 발현 Jurkat에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과
안정하게 혼입된 IL-2 루시퍼라제 리포터 유전자와 함께 인간 LAG-3을 발현하는 Jurkat 세포 및 Raji 세포를 SEE (포도상구균 장독소 E)의 존재 하에 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 테스트 항체를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 재작제된 루시퍼라제 기질 One-Glo를 첨가하고 마이크로플레이트 분광광도계로 루시페라제 강도를 측정하였다.
도 12 및 표 15에서 입증된 바와 같이, 항체는 리포터 유전자 분석에서 Jurkat의 IL-2 경로를 향상시켰다.
| 항체 | EC 50 (nM) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 0.84 |
| W339-BMK1 | 0.65 |
| W365-BMK1 | 14.9 |
| W365-BMK2 | 29.9 |
| W365-BMK3 | 0.14 |
11. NFAT 리포터 유전자를 갖는 PD-1 및 LAG-3을 발현하는 Jurkat에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과
전체 인간 LAG-3 플라스미드를 안정하게 혼입된 NFAT 루시퍼라제 리포터 유전자와 함께 인간 PD-1을 발현하는 Jurkat 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 SEE (포도상구균 장독소 E)의 존재 하에 PD-L1-발현 Raji 세포와 함께 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 테스트 항체를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 재작제된 루시페라제 기질 One-Glo를 첨가하고 마이크로플레이트 분광광도계로 루시페라제 강도를 측정하였다.
도 13에서 입증된 바와 같이, 항체는 리포터 유전자 분석에서 PD-1 및 LAG-3을 발현하는 Jurkat의 NFAT 경로를 향상시켰다. 배수는 W305-BMK1 및 W339-BMK1 및 기타 벤치마크 항체의 조합보다 더 크다.
12. 인간 동종이계 혼합 림프구 반응 (MLR)에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS 구배 원심분리를 사용하여 건강한 공여체로부터 새로 단리하였다. 제조업체의 지침에 따라 인간 단핵구 농축 키트를 사용하여 단핵구를 단리하였다. 세포를 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 수지상 세포 (DC)를 생성하였다. 인간 CD4+ T 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 CD4+ T 세포 농축 키트를 사용하여 단리하였다. 정제된 CD4+ T 세포를 96웰 플레이트에서 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체의 존재 하에 동종이계 미성숙 DC (iDC)와 공동 배양하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 3일 및 5일째에 각각 IL-2 및 IFN-γ 테스트를 위해 상청액을 수확하였다. 인간 IL-2 및 IFN-γ 방출을 해당하는 항체 쌍을 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 재조합 인간 IL-2 및 IFN-γ를 각각 표준으로 사용하였다. 플레이트를 각각 인간 IL-2 또는 IFN-γ에 특이적인 포획 항체로 미리 코팅하였다. 차단 후, 50 μL의 표준 또는 샘플을 각 웰에 피펫팅하고 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 기질을 제거한 후, 해당 사이토카인에 특이적인 비오틴 결합 검출 항체를 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 HRP-스트렙타비딘을 웰에 첨가하고 주위 온도에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 TMB 기질을 분배하여 발색시킨 다음 50 μL의 2N HCl로 정지하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450nM에서 판독하였다.
도 14a 및 도 14b에서 입증된 바와 같이, W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP는 혼합 림프구 반응에서 IL-2 및 IFN-γ 분비를 향상시켰다.
13. 인간 PBMC 활성화에 대한 PD-1xLAG-3 이중특이적 항체의 효과
PBMC 및 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체를 SEB의 존재 하에 96-웰 플레이트에서 공동-배양하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하고 IL-2 테스트를 위해 상청액을 수확하였다. 인간 IL-2 방출은 섹션 12에 기재된 대로 ELISA에 의해 측정하였다.
도 15에서 입증된 바와 같이, W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP는 SEB로 자극된 PBMC에서 IL-2 분비를 향상시켰다.
14. 시차 주사 형광 측정법 (DSF)에 의한 열 안정성 테스트
항체의 Tm을 QuantStudioTM 7 Flex 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 조사하였다. 19 μL의 항체 용액을 1 μL의 62.5x SYPRO 오렌지 용액 (Invitrogen)과 혼합하고 96 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 0.9℃/분의 속도로 26℃에서 95℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음의 도출 값을 계산하고, 최대값을 용융 온도 Tm으로 규정하였다. 단백질에 다중 비접힘 전이가 있는 경우 처음 2개의 Tm을 기록하였으며 Tm1 및 Tm2로 명명하였다. 데이터 수집 및 Tm 계산을 운영 소프트웨어에 의해 자동으로 수행하였다.
| 항체 | pI | 완충액 | T m 1 (℃) | T m 2 (℃) |
| W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP | 6.12 | PBS | 61.0 | ND |
| 20 mM 히스티딘 +7% 수크로스 pH 6.5 | 64.3 | ND | ||
| 50 mM NaAC +7% 수크로스 pH 5.6 | 63.6 | 69.0 |
15. 혈청 안정성
리드 항체를 37℃에서 새로 단리된 인간 혈청 (혈청 함량 > 95%)에서 인큐베이션하였다. 표시된 시점에서, 혈청 처리된 샘플의 분취량을 인큐베이터에서 제거하고 액체 N2에서 급속 동결한 다음 테스트 준비가 될 때까지 80℃에서 저장하였다. 샘플을 안정성 테스트 직전에 급속 해동하였다.
플레이트를 4℃에서 밤새 1 μg/mL의 마우스 Fc-태그 인간 PD-1로 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 다양한 농도의 PD-1xLAG-3 항체를 플레이트에 첨가하고 세척 후 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음 플레이트를 세척하고 후속적으로 His-태그 LAG-3 단백질과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, HRP 표지된 마우스 항-His 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후 TMB 기질을 첨가하고 2M HCl로 발색 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP가 신선한 인간 혈청에서 최대 14일 동안 안정했음이 도 16에 나타나있다.
실시예 5
: 생체내 특성화
1. PD-1 x LAG-3 항체의 생체내 항종양 활성
Balb/c 마우스 (Shanghai Lingchang Biotech) 및 Colon26 종양 모델을 사용하여 생체내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 PD-1xLAG-3 항체의 능력을 평가하였다. BALB/C 마우스에 0일째에 5 x 105개의 마우스 결장 암종 Colon26 세포로 피하 이식하고, 종양이 60 내지 70 mm3에 도달했을 때 마우스를 그룹화 (n=8)하였다.
0일, 3일, 7일, 10일 및 14일에, 마우스를 PD-1 mAb (3056) 단독 (10 mg/kg), LAG-3 mAb (3396) 단독 (10 mg/kg), PD-1ХLAG-3 항체 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP (13.9 mg/kg) 또는 3056 mAb (10 mg/kg) 및 3396 mAb (10 mg/kg)의 조합으로 복강내 처리하였다. 인간 IgG4 이소형 대조군 항체 (10 mg/kg)를 음성 대조군으로 제공하였다.
종양 부피 및 동물 중량을 주사 후 3주 이상 동안 측정하였다. 종양 부피는 다음 식을 사용하여 mm3로 표시된다: V = 0.5ab2, a 및 b는 각각 종양의 장경 및 단경이다.
처리된 마우스의 종양 부피 및 생존 곡선을 도 17a 및 도 17b에 나타내었다. 결과는 W3396 및 PD-1xLAG-3 항체 W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP를 사용한 처리가 Colon26 종양 성장 억제에 효과적이고, 항체 W3056 단독 처리는 효과가 거의 없음을 보여준다. W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP는 모 PD-1 항체 (W3056) 단독 또는 모 LAG-3 항체 (W3396) 단독보다 더 큰 종양 성장 억제를 초래하였다. W3659-U14T4.G1-1.uIgG4.SP의 효능은 PD-1 및 LAG-3 항체의 조합과 유사하였다. 한편, 도 17c에서, 각 그룹의 중량 증가는 명백한 독성 없이 양호한 안전성을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING
<110> WuXi Biologics (Shanghai) CO., LTD
WuXi Biologics Ireland Limited
<120> Bispecific antibodies against PD-1 and LAG-3
<130> AJ3297PCT2001
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of Anti-PD-1
<400> 1
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of Anti-PD-1
<400> 2
Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 of Anti-PD-1
<400> 3
Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val Asn Met Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of Anti-LAG-3
<400> 4
Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of Anti-LAG-3
<400> 5
Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 of Anti-LAG-3
<400> 6
Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH of anti-PD-1 binding domain
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH of anti-LAG-3 binding domain
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile His Trp Thr Ser Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 10
<211> 498
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length sequence
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Ile Asp Ser Leu Val
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ala Thr Tyr Ile Thr His Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala
85 90 95
Arg Asn Ile Ile Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
210 215 220
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Ala Ser Gly Leu Thr Leu Ser Gln Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln
405 410 415
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile His Trp Thr Ser
420 425 430
Ser Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Ser
435 440 445
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
450 455 460
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr His Tyr Tyr Thr
465 470 475 480
His Arg Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
485 490 495
Ser Ser
Claims (21)
- PD-1에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티(targeting moiety) 및 LAG-3에 특이적으로 결합하는 제2 표적화 모이어티를 포함하는 이중특이적 항체(bispecific antibody) 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
제1 표적화 모이어티는 제1 VHH 도메인(domain)을 포함하고, 제2 표적화 모이어티는 제2 VHH 도메인을 포함하고;
제1 VHH 도메인은 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고; H-CDR3은 서열번호 1에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형(conservative modification)을 포함하고; H-CDR2는 서열번호 2에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR1은 서열번호 3에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고;
제2 VHH 도메인은 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3을 포함하고; H-CDR3은 서열번호 4에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR2는 서열번호 5에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하고; H-CDR1은 서열번호 6에 도시된 바와 같은 서열 및 이의 보존적 변형을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서, 제1 VHH 도메인은 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성(homologous)인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 VHH 도메인은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성인 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VHH 도메인은 서열번호 7의 서열을 포함하고, 제2 VHH 도메인은 서열번호 8의 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제4항에 있어서, 제1 VHH 도메인 및 제2 VHH 도메인은 펩타이드 서열에 의해 연결되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제5항에 있어서, 상기 펩타이드 서열은
(a) 힌지 영역(hinge region), CH2 및 CH3을 포함하는 IgG Fc 단편, 및/또는
(b) 링커(linker)
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제6항에 있어서, 링커는 서열번호 9의 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10의 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은
a) 2.92E-09 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고;
b) 3.01E-10 이하의 KD로 인간 LAG-3에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩(encoding)하는 핵산 분자.
- 제11항의 핵산 분자를 포함하는 클로닝(cloning) 또는 발현 벡터.
- 제12항의 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 공정으로서, 제13항의 숙주 세포를 배양하고, 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 공정.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및, 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및 담체 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물.
- 치료제에 연결된, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
- 제16항의 면역접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및 담체 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물.
- 대상체(subject)에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 면역 장애(immune disorder) 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
- 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법으로서, 종양 세포의 성장을 억제하기 위해, 치료 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제20항에 있어서, 종양 세포는 흑색종(melanoma), 신장암(renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안내 악성 흑색종(cutaneous or intraocular malignant melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 및 직장 암(rectal cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 세포인, 방법.
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