CN103665165B - 一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗人CD47和抗人SIRPα的双特异性抗体，包含特异性结合CD47的第一抗原结合域和特异性结合SIRPα的第二抗原结合域，第一和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成；第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与SIRPα特异性结合的抗体可变区结构域。制备方法主要包括：合成编码所述抗体的cDNA序列；将cDNA序列插入工具载体，构建表达载体；将表达载体在宿主细胞中表达和分离纯化表达的双特异性抗体。本发明用于制备治疗人类癌症的药品。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种抗人类整合素相关蛋白(CD47或IAP)和人信号调节蛋白α(SIRPα)的双特异性抗体及其制备方法和用途。
背景技术
CD47，又称整合素相关蛋白(Integrin-associatedprotein，IAP)，最初从人胎盘与整合素aVβ3共纯化及从血小板与β3整合素共免疫沉淀而为人们所认识，其功能与整合素相关(JohansenandBrown.JBiolChem.2007)。它是一种广泛表达于细胞表面的糖基化跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。结构上包括一个氨基端细胞外可变区域，一个有3-5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜区域和一个亲水的羧基端胞质尾区。CD47是细胞表面至关重要的标记物，分子量在47-55kD之间，与GPA(血型糖蛋白A，GlycophorinA)、GPB(血型糖蛋白B，GlycophorinB)、带3蛋白(Band3protein)、RhD(RhantigenD)等相关蛋白紧密相关(BarclayandBrown.NatRevImmunol.2006)。
SIRPα，信号调节蛋白α(Signalregulatoryproteinα)也是一种跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面。其胞外区含有3个免疫球蛋白超家族样区域，其中N末端的区域介导与CD47的结合，而其细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性序列(Immunoreceptortyrosine-basedinhibitionmotif，ITIM)；与CD47结合后，SIRPα的ITIM被磷酸化，产生级联反应，抑制巨噬细胞的吞噬作用(Matozakietal.TrendsCellBiol.2009)。
在人体的固有免疫系统(Innateimmunesystem)中，巨噬细胞(Macrophage)扮演着“清道夫”的角色，它通过吞噬作用清除病原物、受损细胞和衰老细胞维持机体健康；同时，巨噬细胞又能识别正常健康细胞，使其免于被自我攻击。这种识别的机制正是在于正常健康细胞如红细胞(Oldenborgetal.Science.2000)或血小板(Olssonetal.Blood.2005)表面的CD47分子与巨噬细胞上的受体SIRPα相互作用产生抑制性信号，抑制其吞噬活性。所以CD47在红细胞和血小板上是一种“自身细胞的标记物”(Markerofself)。
CD47和SIRPα形成的信号复合体，还可参与神经系统发育、中性粒细胞趋化激活和基质细胞支持的造血细胞生成等多种生理活动，共同调节效应细胞的功能和其所分泌的细胞因子，同时在诱导T细胞免疫耐受、活化、凋亡等方面也发挥着多种调节作用(JohansenandBrown.JBiolChem.2007)。
近年来，CD47和CD47-SIRPα信号系统受到广泛关注。其中，最令人瞩目的是其作为肿瘤治疗的潜在药靶。已有研究证实，CD47在许多恶性肿瘤中，如急性髓细胞性白血病(AML)、B细胞和T细胞急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等，均呈过表达状态，且CD47高表达与临床预后差有关(Willinghametal.ProcNatlAcadSciUSA.2012；Majetietal.Cell.2009)。CD47作为卵巢肿瘤细胞标记物第一个被克隆，这表明它可能在阻止其他肿瘤组织的吞噬作用中同样发挥作用(Majetietal.Cell.2009)。肿瘤细胞表面高表达的CD47被巨噬细胞表面的SIRPα识别，向巨噬细胞传递“别吃我”(“Don’teatme”)的信号，借以逃避免疫监视。
斯坦福大学的Weissman教授团队系统地研究了多种实体瘤中CD47的表达水平，结果表明，所有人类实体瘤细胞中的CD47都呈高表达，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右。而且，他们发现实体瘤病人CD47mRNA的水平与预后指数(Prognosticfactor)呈负相关。进一步针对原位免疫缺陷性小鼠异种移植动物模型(Orthotopicimmunodeficientmousexenotransplantationmodels)的实验发现，抗CD47单克隆抗体的施用能够抑制大型肿瘤的生长和转移，而对于小型肿瘤则可以治愈。抗CD47单克隆抗体的有效性和安全性还在原位小鼠乳腺癌模型(Orthotopicmousebreastcancermodel)实验中得到证实(Willinghametal.ProcNatlAcadSciUSA.2012)。为此Weissman等在美国发表了专利(Jaiswaletal.US12/321,215)。该项研究不仅证实了高表达CD47是肿瘤细胞逃避免疫监视的普遍机制，也为通过阻断CD47-SIRPα信号通路来治疗肿瘤提供了有重要价值的借鉴。
通过抗CD47单克隆抗体进行肿瘤治疗的有效性和安全性在其它案例中也得到证实。根据Majeti等(Majetietal.Cell.2009)的研究结果，抗CD47抗体能够清除小鼠异种移植模型中的急性髓细胞性白血病癌症干细胞。而且他们观察到抗CD47抗体对小鼠没有明显毒性，除了仅有的嗜中性粒细胞减少症。Chao等(Chaoetal.Cell.2010)的研究也表明，人非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞上CD47表达增加，抗CD47抗体使NHL细胞优先被吞噬，其作用与抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)有协同作用；移植人NHL肿瘤细胞的小鼠经抗CD47抗体治疗后肿瘤减少、成活率增加，与利妥昔单抗合用能消除肿瘤，达到治愈。
专利WO2005044857报道了一种人源化抗人CD47单克隆抗体用于血液性肿瘤，尤其是白血病治疗。
中国专利(201010557999.1)“一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47”报道了一种靶向白血病干细胞的可溶性蛋白hCD47，这种蛋白应用于体内后可与巨噬细胞上的SIRPα结合，阻止白血病干细胞上内源性的CD47与SIRPα结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞和白血病干细胞的吞噬作用，起到治疗白血病的作用。
诺华公司于2010年12月在中国申请了一个“四价CD47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗”的专利(CN201080064426.3)，描述了一种可溶性蛋白能选择性地结合SIRPα，其中一种是与抗体恒定区的CD47融合蛋白，能同时结合4个SIRPα分子，可用于预防或治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。
针对CD47-SIRPα信号通路，除了采用抗CD47单克隆抗体和可融性CD47蛋白的肿瘤治疗策略，还可以开发抗SIRPα单克隆抗体(Hoetal.OncoImmuno.2013；Zhaoetal.Proc.NatlAcadSciUSA2011)。专利WO2013056352描述了人源化的抗人SIRPα的全长单克隆抗体及其衍生的抗体片段用于血液性肿瘤，尤其是白血病的治疗。
除抗体以外，有人报道了一种通过人工改造的可溶性SIRPα变体来拮抗CD47进而阻断CD47-SIRPα信号通路的方法(Weiskopfetal.Science.2012)。Weiskopf等通过蛋白质工程获得的这种SIRPα变体，相较于天然的SIRPα分子，与CD47的亲合力提高了约50,000倍。这种SIRPα变体单体能有效拮抗肿瘤细胞上的CD47，但并不能引起巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬；但这种SIRPα变体单体与其它针对肿瘤的特异性单克隆抗体(如靶向HER2/neu的Trastuzumab，或靶向EGFR的Cetuximab)合并施用，能产生显著的协同作用，增加巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性和增加抗肿瘤的效应。所以，这种可溶性SIRPα变体可以作为肿瘤特异性抗体的普适性佐剂(Adjuvant)。或者，这种SIRPα变体与人类IgG4的Fc融合制成二聚体后施用，也能增加巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性。Theocharides等(Theocharidesetal.JExpMed.2012)也在急性髓细胞性白血病(AML)模型上发现SIRPα-Fc融合蛋白通过阻断CD47-SIRPα信号通路，能显著增加小鼠和人巨噬细胞对AML癌细胞的吞噬作用，并抑制肿瘤细胞在小鼠的移植和生长，而不增加巨噬细胞对正常造血细胞的吞噬。
本发明采用一种全新的策略，即通过抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，一方面通过与CD47和SIRPα的结合阻断CD47-SIRPα信号通路，使得肿瘤细胞“别吃我”信号被封闭，巨噬细胞得以将其吞噬杀灭；另一方面，这种双特异性抗体因能同时结合CD47和SIRPα，可以将高表达CD47的肿瘤细胞和巨噬细胞拉近，促进后者对肿瘤细胞的吞噬作用。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是：提供一种抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，并提供其制备方法，以用于制备治疗人类癌症的药品。抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体国内外未见报道。
本发明的技术方案是：本发明的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，包含特异性结合CD47的第一抗原结合域和特异性结合SIRPα的第二抗原结合域，其结构特点是：
上述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域VH和抗体轻链可变结构域VL组成；
上述的第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与SIRPα特异性结合的抗体可变区结构域。
进一步的方案是：上述的第一抗原结合域为以下四对序列组合，即SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中的任意一对序列组合。其中，SEQIDNO：1、SEQIDNO：3、SEQIDNO：5、SEQIDNO：7为重链可变结合域；SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8为轻链可变结合域。
进一步的方案是：上述的第二抗原结合域为以下两对序列组合，即SEQIDNO：9和SEQIDNO：10、SEQIDNO：11和SEQIDNO：10中的任意一对序列组合。其中，SEQIDNO：9、SEQIDNO：11为重链可变结合域；SEQIDNO：10为轻链可变结合域。
进一步的方案是：上述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人CD47特异性结合的抗体的可变区结构域的序列；上述的第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人SIRPα特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
进一步的方案是：上述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
进一步的方案还有：上述的抗体是二价的或多价的。
一种上述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
①合成编码上述抗体的cDNA序列；
②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体；
③将上述的表达载体在宿主细胞中表达；
④分离纯化表达的双特异性抗体。
进一步的方案是：上述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
进一步的方案是：上述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等常见表达宿主。
一种上述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，用于制备治疗人类癌症的药品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各种实体瘤的药品。
本发明有以下优点：本发明中描述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，一方面通过与CD47和SIRPα的结合阻断信号CD47-SIRPα通路，使得肿瘤细胞“别吃我”信号被封闭，巨噬细胞得以将其吞噬杀灭；另一方面，这种双特异性抗体因能同时结合CD47和SIRPα，可以将高表达CD47的肿瘤细胞和巨噬细胞拉近，促进后者对肿瘤细胞的吞噬作用。本发明的抗CD47和SIRPα的双特异性抗体，可用于制备治疗癌症的药品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各种实体瘤的药品。
附图说明
图1为本发明的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的scFv(Single-chainvariablefragment)结构类型示意图，图中抗原1为CD47，相应地抗原2则为SIRPα，其中：
图1-1：连接方式：VL1-接头-VH1-接头-VL2-接头-VH2；
图1-2：连接方式：VH1-接头-VL1-接头-VH2-接头-VL2；
图1-3：连接方式：VL2-接头-VH2-接头-VL1-接头-VH1；
图1-4：连接方式：VH2-接头-VL2-接头-VH1-接头-VL1；
图1-5：连接方式：VL1-接头-VH2-接头-VL2-接头-VH1；
图1-6：连接方式：VH1-接头-VL2-接头-VH2-接头-VL1；
图1-7：连接方式：VL2-接头-VH1-接头-VL1-接头-VH2；
图1-8：连接方式：VH2-接头-VL1-接头-VH1-接头-VL2；
图2为本发明的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的scFab(Single-chainantigen-bindingfragment)结构类型示意图，图中抗原1为CD47，相应地抗原2则为SIRPα，其中：
图2-1：[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原1-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原2；
图2-2：[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原1-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原2；
图2-3：[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原2-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原1；
图2-4：[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原2-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原1。
图3为本发明的抗一种抗原的全长抗体并含有抗另一种抗原的scFv的四价双特异性识别人CD47和人SIRPα抗体的结构示意图，图中抗原1为CD47，相应地抗原2则为SIRPα，其中：
图3-1：结合SIRPα的scFv连接到全长CD47抗体的轻链C端；
图3-2：结合SIRPα的scFv连接到全长CD47抗体的Fc的C端；
图3-3：结合CD47的scFv连接到全长SIRPα抗体的轻链的C端；
图3-4：结合CD47的scFv连接到全长SIRPα抗体的Fc的C端。
图4为本发明的抗一种抗原的全长抗体并含有抗另一种抗原的scFab的四价双特异性识别人CD47和人SIRPα抗体的结构示意图，图中抗原1为CD47，相应地抗原2则为SIRPα，其中：
图4-1：结合SIRPα的scFab连接到全长CD47抗体的轻链的C端；
图4-2：结合SIRPα的scFab连接到全长CD47抗体的Fc的C端；
图4-3：结合CD47的scFab连接到全长SIRPα抗体的轻链的C端；
图4-4：结合CD47的scFab连接到全长SIRPα抗体的Fc的C端。
氨基酸序列描述
SEQIDNO：1针对CD47的抗体重链结合可变区域1；
SEQIDNO：2针对CD47的抗体轻链结合可变区域1；
SEQIDNO：3针对CD47的抗体重链结合可变区域2；
SEQIDNO：4针对CD47的抗体轻链结合可变区域2；
SEQIDNO：5针对CD47的抗体重链结合可变区域3；
SEQIDNO：6针对CD47的抗体轻链结合可变区域3；
SEQIDNO：7针对CD47的抗体重链结合可变区域4；
SEQIDNO：8针对CD47的抗体轻链结合可变区域4；
SEQIDNO：9针对SIRPα的抗体重链结合可变区域1；
SEQIDNO：10针对SIRPα的抗体轻链结合可变区域1；
SEQIDNO：11针对SIRPα的抗体重链结合可变区域2。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。
(实施例1)
见图1至图4，本实施例的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，至少包含结合人CD47的第一抗原结合域和结合人SIRPα的第二抗原结合域，前述每个抗原结合域又包含一对功能性的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
前述针对人CD47和人SIRPα的双特异性抗体分子组成包含但不限于结合CD47的第一抗原结合域和结合SIRPα的第二抗原结合域，还包括有助于前述双特异性抗体维持空间结构以实现正常功能或增强抗体功能的其它肽段或分子。
术语“价”指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。比如：术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，六个结合位点。根据本实施例的双特异性抗体至少是“二价”的，并且可以是“多价”的(例如“三价”，“四价”等)。优选地，本实施例的双特异性抗体是二价的，四价的。对于具有超过两个抗原结合域的抗体，有些结合域可以是相同的，只要前述抗体至少具有对于两种抗原CD47和SIRPα的两个特异性结合域。
优选地，本实施例的双价的双特异性抗体结构类型包括scFv型和scFab型。scFv是由抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)和肽段接头组成的多肽。具体的，前述scFv型双特异性抗体(如附图1所示)具有从N端到C端方向的下列顺序之一：
(1)VLCD47-接头-VHCD47-接头VLSIRPα-接头-VHSIRPα，
(2)VHCD47-接头-VLCD47-接头VHSIRPα-接头-VLSIRPα，
(3)VLSIRPα-接头-VHSIRPα-接头-VLCD47-接头-VHCD47，
(4)VHSIRPα-接头-VLSIRPα-接头VHCD47-接头-VLCD47，
(5)VLCD47-接头-VHSIRPα-接头-VLSIRPα-接头-VHCD47，
(6)VHCD47-接头-VLSIRPα-接头-VHSIRPα-接头-VLCD47，
(7)VLSIRPα-接头-VHCD47-接头-VLCD47-接头-VHSIRPα，
(8)VHSIRPα-接头-VLCD47-接头-VHCD47-接头-VLSIRPα。
scFab是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体重链恒定结构域1(CH1)，抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定区(CL)和肽段接头组成的多肽，前述scFab型双特异性抗体(如附图2所示)具有从N端到C端方向的下列顺序之一：
(1)[VL-CL-接头-VH-CH1]CD47-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]SIRPα，
(2)[VH-CH1-接头-VL-CL]CD47-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]SIRPα，
(3)[VL-CL-接头-VH-CH1]SIRPα-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]CD47，
(4)[VH-CH1-接头-VL-CL]SIRPα-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]CD47，
本实施例的采用scFv结构的双特异性抗体中，第一和第二抗原结合域之间以及每个抗原结合域内部的VH和VL之间的肽段接头为(Gly4Ser)n，n应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现结合抗原的功能，优选地，n在1-6之间。本实施例的采用scFab结构的双特异性抗体中，第一和第二抗原结合域之间以及每个抗原结合域内部的重链和轻链之间均由肽段接头(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)nGm连接，n和m应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现抗原结合的功能，优选地，n在1-6之间，m在1-4之间。
优选地，本实施例的四价的双特异性抗体结构包括在抗人CD47全长抗体的两个轻链C端各自连接一个抗人SIRPα的scFv或scFab结构域(如附图3-1、附图4-1所示)，或者在抗人SIRPα全长抗体的两个轻链C端各自连接一个抗人CD47的scFv或者scFab结构域(如附图3-3、附图4-3所示)；还包括在抗人CD47全长抗体Fc部分的两个C末端各自连接一个抗人SIRPα的scFv或scFab结构域(如附图3-2、附图4-2所示)，或者在抗人SIRPα全长抗体Fc部分的两个C末端各自连接一个抗人CD47的scFv或scFab结构域(如附图3-4、附图4-4所示)。因此前述的四价的双特异性抗体均包含两个CD47特异性结合域和两个SIRPα特异性结合域。
本实施例的四价的双特异性抗体结构中，全长抗体和Fab之间以及Fab内部重链和轻链之间也采用肽段接头(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)nGm连接，n和m应满足最大程度保证抗体分子的正确装配以实现抗原结合的功能，优选地，n在1-6之间，m在1-4之间。
本实施例的四价的双特异性抗体，因具有人类来源的IgG，优选地IgGl亚类的恒定区域，因而除可封闭CD47和SIRPα介导的信号传递之外，还可激发抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。
本实施例的各种结构类型的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的设计与制备如下述。
1、scFv结构类型的识别人CD47和人SIRPα的双特异性抗体(VLCD47-Linker1-VHSIRPα-Linker2-VLSIRPα-linker3-VHCD47)的设计与制备：
①抗CD47和SIRPα的双特异性抗体的核酸序列设计与合成：
获得分别特异性结合CD47和SIRPα的抗体的氨基酸序列，截取VL和VH序列，按照VLCD47-Linkerl-VHSIRPα-Linker2-VLSIRPα-linker3-VHCD47[如图1-5，按N端至C端方向排列，其中linker1和linker3序列都为(Gly4Ser)1，linker2序列为(Gly4Ser)3]方式连接。在编码序列5’和3’端分别引入酶切位点NcoI和XhoI，得到分子A，将分子A的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在大肠杆菌中表达的核酸序列，并合成。
②表达载体的构建、转化及诱导：
将测序正确的序列通过NcoI和XhoI双酶切连接到pET-26(b)载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照MerckpET操作手册的方法转化BL21(DE3)细胞。挑阳性克隆培养至OD600约为0.6，添加0.2mMIPTG诱导过夜。
③双特异性抗体的分离与纯化：
收集菌体，然后按照MerckpET操作手册的方法进行渗透休克。收集上清，按顺序用一次DEAE-SepharoseFF(GE产品)离子交换层析、一次ButylSepharoseFF(GE产品)疏水柱层析和一次Superdex75(GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将上清用溶液I(20mMTri-Cl，pH8.5)稀释6倍，上样至用溶液I预平衡的DEAE离子交换层析柱，以溶液I洗涤5-10个柱体积，然后以溶液II(20MmTris-Cl+500mMNaCl，pH8.5)梯度洗脱，收集目标洗脱峰。目标洗脱峰加NaCl至终浓度1M，然后溶液III(50mMTris-Cl+1MNaCl，pH8.0)稀释5倍后上样至溶液III预处理过的ButylSepharoseFF层析柱，再用溶液IV(50mMTris-Cl，pH8.0)梯度洗脱，收集目的流出峰。然后将目的流出峰按5％柱床体积上样经PBS溶液平衡过的Superdex75层析柱，收集目标峰。目标样品采用BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度＞95％。
2、scFab结构类型的识别人CD47和人SIRPα的双特异性抗体(LCD47-Linkerl-HCD47-Linker2-LSIRPα-linker3-HSIRPα)的设计与制备：
①抗CD47和SIRPα的双特异性抗体的核酸序列设计与合成：
获得分别特异性结合CD47和SIRPα的抗体的氨基酸序列，截取Fab区序列，按照LCD47-Linkerl-HCD47-Linker2-LSIRPα-linker3-HSIRPα[按N端至C端方向排列，其中linker1和linker3序列都为(Gly4Ser)6GG，linker2序列为[(Gly4Ser)4]方式连接，为便于纯化在N端引入6×His标签，并在组氨酸标签和抗体分子之间插入肠激酶切割位点(DDDDK)，得到分子B。然后将分子B融合到人IgGl信号肽羧基端，得到分子C，再在分子C编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI，得到分子D，将分子D的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选：
将测序正确的序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过WesternBlot方法筛选到产量较高的株细胞，产量＞5mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化：
收集培养液上清，按顺序用两次Ni-NTA亲和层析和一次DEAE-SepharoseFF(GE产品)离子交换层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心15min，留上清。然后上样到用溶液A(20mMTris-Cl+150mMNaCl，pH8.5)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱，以溶液A洗涤5-10个柱体积，然后以溶液B(20mMTris-Cl+150mMNaCl+150mM咪唑，pH8.5)洗脱，收集洗脱峰。按肠激酶说明书方法将洗脱液采用肠激酶酶切以去除组氨酸标签，切割后样品以溶液A稀释20倍后上Ni-NTA，肠激酶因和未被切割的抗体分子结合到层析柱上，而被切割的抗体分子直接流穿。然后收集流穿部分，将其以上样至溶液C(50mMTri-Cl，pH8.5)预处理过的DEAE-SepharoseFF层析柱，以溶液C洗涤5-10个柱体积，再用溶液D(600mMNaCl+50mMTris-Cl，pH8.5)梯度洗脱，收集目的流出峰。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度＞95％。
3、四价结构类型的识别SIRPα的全长抗体重链C端连接识别CD47的scFv的双特异性抗体：
①获得分别特异性结合CD47和SIRPα的抗体的氨基酸序列，设计结合CD47的单价scFv分子VLCD47-Linker1-VHCD47[按N端至C端方向排列，其中linker1序列为(Gly4Ser)3]，将其N端通过(Gly4Ser)3连接到抗SIRPα全长抗体的重链的C端，然后将其融合到人IgGl信号肽C端，再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI，将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
另将SIRPα抗体轻链部分融合到人IgGl信号肽3’端，再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI，将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选：
将测序正确的两段序列通过双酶切EcoRI和XbaI双酶切各自连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法，将两个载体按1∶1比例共转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞，产量＞7mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化：
收集培养液上清，按顺序用ProteinA亲和层析和S-200(GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心10min，留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mMNaCl，pH8.0)预平衡的ProteinA亲和层析柱，以平衡溶液洗涤5-10个柱体积，然后以洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8)洗脱，将包含蛋白的收集液用1MTris-Cl，pH8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩，并上样到用平衡液(20mM组氨酸，150mMNaCl，pH6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。按BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度＞95％。
4、四价结构类型的识别SIRPα的全长抗体重链C端连接识别CD47的scFab的双特异性抗体：
①获得分别特异性结合CD47和SIRPα的抗体的氨基酸序列，设计结合CD47的单价scFab分子VLCD47-CL-Linker1-VHCD47-CH1[按N端至C端方向排列，其中linkerl序列为(Gly4Ser)6GG]，将其N端通过(Gly4Ser)3连接到抗SIRPα全长抗体的重链的C端，然后将其融合到人IgG1信号肽C端，再在所得融合蛋白编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI，将所设计分子的序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
另将SIRPα抗体轻链部分融合到人IgG1信号肽3’端，再在5’和3’端分别引入酶切位点EcoRI和XbaI，将设计的分子的编码序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在CHO细胞中表达的核酸序列，并合成。
②表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选：
将测序正确的两段序列通过EcoRI和XbaI双酶切各自连接到pCIneo载体中，经DNA测序分析，与设计完全一致。然后按照Invitrogen操作手册的方法，将两个载体按1∶1比例共转染CHO-DG44贴壁细胞。添加G418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过Western方法筛选到产量较高的株细胞，产量＞6.5mg/L。
③双特异性抗体的分离与纯化：
收集培养液上清，按顺序用ProteinA亲和层析和S-200(GE产品)排阻层析进行分离。具体的说，将培养基上清800g离心10min，留上清。然后上样到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mMNaCl，pH8.0)预平衡的ProteinA亲和层析柱，以平衡溶液洗涤5-10个柱体积，然后以洗脱液(0.1M甘氨酸缓冲液，pH3.0)洗脱，将包含蛋白的收集液用1MTris-Cl，pH8.0中和。用Millipore超滤装置(截留分子量30kD)将其浓缩，并上样到用平衡液(20mM组氨酸，150mMNaCl，pH6.0)平衡的S-200层析柱。将双特异性抗体部分收集。BCA方法进行定量。SDS-PAGE检测纯度＞96％。
本实施例的识别CD47和SIRPα双特异性抗体的初步活性检测：
分别用前述4种方法所获得的4种结构的双特异性抗体与人非霍奇金淋巴瘤和急性髓性白血病细胞系进行相互作用分析，并以抗人CD47抗体和抗人SIRPα抗体作对照，结果表明，相比单一抗体，上述双特异性抗体引起更强的巨噬细胞吞噬活性。
本实施例的各种结构类型的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体通过药学可接受的载体用于人类，合适的药物载体为本领域熟知，包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有此类载体的双特异性抗体或抗体组合物通过众所周知的常规方法制备。
本实施例的各种结构类型的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体可以通过各种给药途径用于人类，给药途径包括但不限于静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、口服、舌下给药、喷雾等。
本实施例的各种结构类型的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体可以应用上述的药物载体，通过上述的给药途径单独使用或者与其它药物合用或者与其它药物偶联后用于人类。所述的药物包括但不限于细胞毒素、放射性同位素、脂质体、抗体等。
综上，本实施例将特异性识别人CD47和人SIRPα的抗体可变区域构建在同一抗体分子中，一方面通过与CD47和SIRPα的结合阻断信号CD47-SIRPα通路，使得肿瘤细胞“别吃我”信号被封闭，巨噬细胞得以将其吞噬杀灭；另一方面，这种双特异性抗体因能同时结合CD47和SIRPα，可以将高表达CD47的肿瘤细胞和巨噬细胞拉近，促进后者对肿瘤细胞的吞噬作用。本发明的抗CD47和SIRPα的双特异性抗体，可用于制备治疗人类癌症的药品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各种实体瘤的药品。
以上实施例是对本发明的具体实施方式的说明，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。
Claims (8)
1.一种抗人CD47和抗人SIRPα的双特异性抗体，包含特异性结合CD47的第一抗原结合域和特异性结合SIRPα的第二抗原结合域，其特征在于：
i)所述结合域每个都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成；
ii)所述的第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域，为以下四对氨基酸序列组合SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中的任意一对序列组合。其中，SEQIDNO：1、SEQIDNO：3、SEQIDNO：5和SEQIDNO：7为重链可变结合域；SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8为轻链可变结合域。
iii)所述第二抗原结合域为可与SIRPα特异性结合的抗体可变区结构域，为以下两对氨基酸序列组合SEQIDNO：9和SEQIDNO：10、SEQIDNO：11和SEQIDNO：10中的任意一对序列组合。其中，SEQIDNO：9和SEQIDNO：11为重链可变结合域；SEQIDNO：10为轻链可变结合域。
2.权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，其特征在于：所述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
3.根据权利要求1～2所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，其特征在于：所述的抗体是二价的。
4.根据权利要求1～2所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，其特征在于：所述的抗体可以是多价的。
5.一种权利要求1～4所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①合成编码所述抗体的cDNA序列；
②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体；
③将所述的表达载体在宿主细胞中表达；
④分离纯化表达的双特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
7.根据权利要求5所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体的制备方法，其特征在于：所述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
8.权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPα的双特异性抗体，其特征在于：用于制备治疗人类癌症的药品。
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