TW202142568A - 用於調節免疫細胞銜接效應的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種包含多價抗體之組成物，該多價抗體包含結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域、結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域及結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域；且其中該組成物進一步包含結合TA1或TA2之第二結合分子。本發明亦關於一種包含該多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組，且關於用於治療癌症之手段及方法，該等手段及方法包含向有需要之個體投與該多價抗體及第二結合分子。

Description

用於調節免疫細胞銜接效應的手段和方法

本發明係有關於用於調節免疫細胞銜接效應的手段和方法。

發明背景

本發明係關於活化個體中之免疫細胞之手段及方法且關於用免疫細胞銜接結合分子治療個體之癌症之方法。在一個態樣中，本發明係關於包含二個或更多個結合分子之組成物，其中第一結合分子為具有結合免疫細胞活化分子之可變域及結合二個腫瘤抗原(TA1及TA2)之二個可變域的多價抗體。該等結合分子中之第二結合分子為結合TA1或TA2之結合分子。本發明亦關於包含該等抗體之分裝部分之套組且關於用該等結合分子治療癌症之方法。

癌症仍為主要死亡原因中之一。各個方面之治療進步已引起某些適應症及患者群體中之治療及存活改善。有前景之趨勢為研發靶向腫瘤之療法。針對腫瘤之抗體可以多種方式干擾腫瘤之生長及持續存在。一些抗體靶向腫瘤且對其進行標記以使得宿主之免疫系統能夠破壞腫瘤細胞。一些抗體靶向與癌狀態相關之信號傳導路徑。其他抗體干擾腫瘤細胞避開或下調針對腫瘤細胞或容納腫瘤細胞之環境之宿主免疫系統的能力。已描述各種其他作用模式。

抗體為在功效方面及在副作用種類減少及嚴重程度降低方面均超過經典癌症治療方法之重大進步。相對較新之處在於多特異性抗體之研發。該等抗體通常經設計以結合至多個目標。多特異性抗體可具有與具有多特異性抗體之各別結合特性之二個或更多個單特異性抗體之簡單組合不同的活性譜。亦即，不同作用機制及結果可自靶向二個或更多個抗原之多特異性抗體的使用、靶向彼等抗原中之各者之單特異性抗體之組合的使用獲得。其一個實例為T細胞銜接多特異性抗體。舉例而言，該等抗體具有結合T細胞膜上之CD3或另一T細胞活化抗原之可變域及結合腫瘤抗原之可變域。在不受理論束縛之情況下，咸信T細胞銜接抗體將T細胞帶到/保持在(腫瘤)目標細胞附近且經由T細胞活化來誘導/刺激針對腫瘤之免疫反應。

此等治療中之許多治療仍可經受改善。舉例而言，可經改善之態樣為減少多特異性抗體對正常細胞之作用，該等作用可能會導致包括較高毒性或經降低之患者對抗體之耐受性的不合需要之副作用。許多腫瘤抗原不絕對地於腫瘤細胞上經表現。實際上，該等腫瘤抗原中之許多腫瘤抗原亦於在本文中亦稱為「正常」細胞之非腫瘤細胞上經表現。舉例而言，ErbB蛋白質家族在各種癌症中經過度表現及/或經突變，但亦通常於個體之各種正常細胞上經表現。用剝蝕抗體靶向該等腫瘤抗原將通常影響正常非腫瘤細胞，且藉此至少潛在地造成與抗體之腫瘤攻擊態樣不相關之效應。在嚴重情況下，該等目標特異性副作用可能會導致致衰弱之毒性，甚至死亡，且更通常導致經降低之生活品質以及特定治療之減少、中斷或中止。舉例而言，使抗體靶向EGFR可引起在其中EGFR通常經表現以調節生理功能之組織中，諸如在皮膚中最顯而易見之反應。據報導，經EGFR抑制劑治療之患者可能會罹患膿包性丘疹樣疹、乾性皮膚、搔癢以及毛髮及甲周(指(趾)甲周圍區域)變質(Lacouture 2006, nature reviews: cancer 第6卷, 第803-812頁: doi:10.1038/nrc1970)。

本發明提供用於改善多價抗體治療，詳言之多特異性抗體治療之功效及/或毒性窗之手段及方法。當相較於在不存在本發明之手段及方法之情況下類似劑量之多價抗體而言時，治療功效可經增強，毒性可經降低，且耐受性可經提高，或此等結果中之各者。

發明概要

本發明提供包含多價抗體之組成物，該多價抗體包含結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域、結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域及結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域；且其中組成物進一步包含結合TA1或TA2之第二結合分子。

如本文所描述之多價抗體與第二結合分子之組合提供較大治療窗，其中相對於投與單獨多價抗體而言，當與第二結合分子組合投與時，多價抗體之偏離目標效應經減弱。

本發明之多價抗體可具有此項技術中已知之任何抗體格式。此項技術中已知之抗體格式之實例包括但不限於圖12中所示及例如WO 2019/190327中所揭露之抗體格式。本發明之多價抗體為多特異性抗體。

本發明之多價抗體之實例包含有包含結合免疫細胞銜接抗原(IEA)、較佳CD3、TCR-α鏈或TCR-β鏈之可變域及結合TA2之可變域的基礎抗體。結合TA1之多價抗體可變域可為連接至結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之可變域或連接至結合TA2之可變域的額外可變域。本發明之多價抗體之另一實例包含有包含結合免疫細胞銜接抗原(IEA)、較佳CD3、TCR-α鏈或TCR-β鏈之可變域及結合TA1之可變域的基礎抗體。結合TA2之多價抗體可變域可為連接至結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之可變域或連接至結合TA1之可變域的額外可變域。本發明之多價抗體之另一實例包含有包含結合至TA1之可變域及結合至TA2之可變域的基礎抗體。結合免疫細胞銜接抗原(IEA)、較佳CD3、TCR-α鏈或TCR-β鏈之多價抗體可變域可為連接至結合TA1之可變域或連接至結合TA2之可變域的額外可變域。

可變域包含重鏈可變區或輕鏈可變區中之至少一者，較佳地至少重鏈可變區，更佳地重鏈可變區及輕鏈可變區二者。

為了易於參考，多價或多特異性抗體上之可變域可稱為域1、域2及域3。不同重鏈可變區可藉由不同編號稱為諸如VH1、VH2及VH3。因此，本發明提供包含多價抗體之組成物或分裝部分之套組，其中基礎抗體可變域及額外可變域包含重鏈可變區VH1、VH2及VH3。在某些實施例中，上文所描述之結合至免疫細胞銜接抗原(IEA)之基礎抗體可變域包含重鏈可變區VH2。在某些實施例中，結合至TA2之基礎抗體可變域包含重鏈可變區VH3。在某些實施例中，結合至TA1之額外可變域包含重鏈可變區VH1。在某些實施例中，具有VH1之可變域適宜藉助於連接子連接至具有VH2之可變域。在某些實施例中，結合至免疫細胞銜接抗原(IEA)之基礎抗體可變域包含重鏈可變區VH2，結合至TA2之基礎抗體可變域包含重鏈可變區VH3，結合至TA1之額外可變域包含重鏈可變區VH1，且具有VH1之可變域適宜藉助於連接子連接至具有VH2之可變域。合適多價抗體格式之一個實例係作為示意性圖示提供於圖1中。其他格式闡述於本文中，包括圖12中，且提供於以引用之方式併入之WO 2019/190327中。不同輕鏈可變區亦可藉由不同編號稱為諸如VL1、VL2及VL3。用於本發明中之多價或多特異性抗體可包含具有三個不同重鏈可變區之共同輕鏈、具有三個不同輕鏈可變區之共同重鏈或三個不同可變域，該三個不同可變域諸如為各自包含彼此不同之重鏈及輕鏈可變區之域。

本發明之第二結合分子為結合TA1或TA2之單特異性結合分子。第二結合分子可為對TA1或TA2具有特異性之任何結合分子，該任何結合分子包括但不限於維持該抗體之結合特異性之抗體或其片段或變異體或包含該片段之結構。第二結合分子較佳為全長抗體、Fab、經修飾Fab或scFv。

第二結合分子結合TA1或TA2，藉此防止多價抗體結合TA1或TA2或與多價抗體競爭結合TA1或TA2。此舉在細胞表現TA1、但不表現TA2時或在細胞表現TA2、但不表現TA1時防止或減少細胞殺滅。當細胞表現TA1及TA2二者時，多價抗體結合至TA2且藉此對與TA1之結合具有超過第二結合分子之經增強競爭優勢，或多價抗體結合至TA1且藉此對與TA2之結合具有超過第二結合分子之經增強競爭優勢。因此，咸信相較於表現單獨TA1或TA2之細胞而言，多價抗體對表現TA1及TA2二者之細胞展現經增強效應。

本發明進一步提供包含本發明之多價抗體及本發明之第二結合分子的分裝部分之套組。

本發明進一步提供包含本發明之多價抗體及本發明之第二結合分子的治療性組成物。

本發明進一步提供包含本發明之多價抗體、本發明之第二結合分子及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑的醫藥組成物。本發明之多價抗體及第二結合分子可一起或分開經調配且/或投與。

本發明進一步提供用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的本發明之多價抗體及第二結合分子之組合。本發明進一步提供用作藥劑之本發明之多價抗體及第二結合分子之組合。本發明進一步提供用於治療有需要之個體，特別地用於治療癌症之本發明之多價抗體及第二結合分子之組合。多價抗體及第二結合分子可同時投與，或在投與多價抗體之前或之後與第二結合分子依序投與。

本發明進一步提供用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的包含本發明之多價抗體及第二結合分子之組成物。本發明進一步提供用作藥劑之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之組成物。本發明進一步提供用於治療有需要之個體，特別地用於治療癌症之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之組成物。

如本發明之呈任何形式或組合之手段、方法、用途中所描述，包含多價抗體之組成物較佳為治療性組成物，該多價抗體包含結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域、結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域及結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域；且其中組成物進一步包含結合TA1或TA2之第二結合分子。

本發明進一步提供用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的包含本發明之多價抗體及第二結合分子之治療性組成物。本發明進一步提供用作藥劑之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之治療性組成物。本發明進一步提供用於治療有需要之個體，特別地用於治療癌症之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之治療性組成物。

本發明進一步提供用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的包含本發明之多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組。本發明進一步提供用作藥劑之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組。本發明進一步提供用於治療有需要之個體，特別地用於治療癌症之包含本發明之多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組。多價抗體及第二結合分子可同時投與，或在投與多價抗體之前或之後與第二結合分子依序投與。

本發明進一步提供用於減少或降低本發明之多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的方法，其中該方法包含使用如本文所描述之第二結合分子以及多價抗體。

本發明進一步提供治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與本發明之多價抗體且另外向個體投與本發明之第二結合分子。

較佳實施例之詳細說明

為了可更易於理解本說明書，首先定義某些術語。額外定義闡述於整個實施方式中。除非另外說明，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習此項技術者通常所理解之含義相同之含義，且採用免疫學、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。

冠詞「一(a/an)」在本文中用於指一種或超過一種(亦即指一種或至少一種)該冠詞之文法對象。

在整個本說明書及隨附申請專利範圍以及態樣中，字語「包含(comprise)」、「包括(include)」及「具有(having)」以及諸如「包含(comprises/comprising)」、「包括(includes/including)」之變化形式應解釋為包容性的。亦即，在上下文允許之情況下，此等字語意欲傳達可能包括未具體敍述之其他要素或整數。

如本文所使用之術語「結合域」意謂包含可變域之蛋白質分子或可包含可變域或與該可變域共用序列同源性之可變域。包含可變域之結合域之非限制性實例為Fv域、Fab域及經修飾Fab域。典型可變性係在作為互補決定區或CDR之VH及VL域中之三個淺表環形成區中找到。如本文所使用之術語「抗體」意謂含有結合抗原上之抗原決定基之一或多個域之屬於免疫球蛋白類別之蛋白質的蛋白質分子，其中該等域為或來源於抗體之可變域或與其共用序列同源性。抗體通常由基礎結構單元製成—各基礎結構單元具有二個重鏈及二個輕鏈。用於治療用途之抗體較佳儘可能地近似要被治療之個體之天然抗體(例如人類個體之人類抗體)。本發明之抗體不限於任何特定格式或其產生方法。

「基礎抗體」或「基礎抗體部分」包含二個結合域。其較佳由經接合以形成「Y」形分子之四個多肽—二個重鏈及二個輕鏈組成。Y之基底含有配對重鏈之多聚化域，該等多聚化域通常為CH3及CH2域。Y之二個分支含有連接至二個可變域之二個CH1域。CH3序列中之一者具有可相容異二聚化域之一個部分且另一CH3序列具有異二聚化域之互補部分。

在一個實施例中，基礎抗體包含二個結合域，各結合域包含重鏈可變區、CH1、輕鏈可變區及CL；各結合域與其CH1區締合至鉸鏈及Fc區。

抗體結合具有包括特異性、親和力及親合力之不同品質。特異性決定何種抗原或其抗原決定基由結合域特異性結合。親和力為與特定抗原或抗原決定基結合之強度之量度。此處宜注意，抗體之『特異性』係指抗體對特定抗原之選擇性，而『親和力』係指抗體之抗原結合位點與其所結合之抗原決定基之間的相互作用的強度。

因此，如本文所使用之「結合特異性」係指個別抗體結合位點與抗原決定子反應之能力。通常，本發明抗體之結合位點位於Fab域之可變域中且由重鏈及/或輕鏈之高變區構築。

「親和力」為單個抗原結合位點與其抗原之間的相互作用的強度。用於抗原之本發明抗體之單個抗原結合位點可就解離常數(k_d )而言加以表示。

「親合力」係指二價或多價結合分子與其一或多個抗原之間的相互作用的累積強度。親合力係藉由多個抗原結合位點之合併親和力來測定，且視目標細胞上之各抗原之表現位準而定。二價或多價結合分子展示親合力結合之能力係視同時稱為交叉結合能力之二價或多價結合分子結合其抗原之能力而定。

「抗原決定基」或「抗原決定子」為抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合之位點。抗原決定基可由藉由蛋白質三級摺疊而相鄰之相連胺基酸或非相連胺基酸形成(分別為所謂之線性及構形抗原決定基)。由相連線性胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級摺疊形成之構形抗原決定基通常在用變性溶劑處理時損失。抗原決定基通常可包括呈獨特空間構形之3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。

術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」包括來自任何生物體之免疫球蛋白重鏈恆定區序列，且除非另外規定，否則包括重鏈可變域。除非另外規定，否則術語重鏈可變域包括三個重鏈CDR及四個FR區。重鏈之片段包括CDR、CDR與FR及其組合。典型重鏈在可變域之後(自N端至C端)具有CH1域、鉸鏈、CH2域及CH3域。重鏈之功能片段包括能夠特異性辨識抗原且包含至少一個CDR之片段。

術語「輕鏈」包括免疫球蛋白輕鏈可變域或VL (或其功能片段)；以及來自任何生物體之免疫球蛋白恆定域或CL (或其功能片段)序列。除非另外規定，否則術語輕鏈可包括選自人類κ、λ及其組合之輕鏈。除非另外規定，否則輕鏈可變(VL)域通常包括三個輕鏈CDR及四個構架(FR)區。一般而言，全長輕鏈自N端至C端包括有包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之VL域及輕鏈恆定域。可用於本發明之輕鏈包括例如不選擇性結合重鏈所選擇性結合之抗原決定基的輕鏈。

適用於多價抗體發明中之輕鏈包括共同輕鏈，諸如可藉由篩檢現有抗體庫(濕式文庫或電腦模擬)中最常採用之輕鏈識別之輕鏈，其中輕鏈實質上不干擾重鏈之抗原決定基結合域的親和力及/或選擇性，但亦適合與重鏈陣列配對。舉例而言，合適輕鏈包括來自諸如基因轉殖嚙齒動物之基因轉殖動物之輕鏈，該基因轉殖動物包含整合至其基因組中之共同輕鏈且可用於生成多組在暴露於抗原時在重鏈處具有多樣性之共同輕鏈抗體(WO2009/157771)。作為多價抗體之一部分之共同輕鏈亦可用作第二抗體之輕鏈。

本發明之術語「共同輕鏈」係指可相同或具有一些胺基酸序列差異、同時本發明抗體之結合特異性不受影響，亦即差異不顯著地影響功能結合區之形成的輕鏈。

舉例而言，在如本文所使用之共同鏈定義之範疇內，有可能例如藉由引入且測試守恆胺基酸變化、當與同源鏈配對時不促成或僅部分地促成結合特異性之區中之胺基酸變化及其類似變化來製備或發現不相同但仍在功能上等效的可變鏈。因此，該等變異體亦能夠結合不同之同源鏈且形成功能抗原結合域。因此，如本文所使用之術語『共同輕鏈』係指可相同或具有一些胺基酸序列差異、同時在與重鏈配對之後保留所得抗體之結合特異性的輕鏈。特定共同輕鏈及該等功能等效變異體之組合涵蓋在術語「共同輕鏈」內。

較佳共同輕鏈指示為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。IgVκ1-39為免疫球蛋白可變κ1-39基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變1-39；IGKV139；IGKV1-39。基因外部Id為HGNC：5740；Entrez基因：28930；Ensembl：ENSG00000242371。IgVκ1-39之較佳胺基酸序列在圖4中給出。此圖列舉V區之序列。V區可與五個J區中之一者組合。圖4描述IgVκ1-39以及J區之二個較佳序列。接合序列指示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據imgt.org處之IMGT資料庫全球網命名)。

熟習此項技術者應認識到，「共同」亦指胺基酸序列不相同之輕鏈之功能等效物。該輕鏈存在許多變異體，其中存在不會顯著地影響功能結合區之形成的突變(刪除、取代、添加)。

「Fv域」意謂包含具有重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之可變域之結合域。

「Fab域」意謂包含可變區之結合域，通常為包含經配對重鏈可變區及輕鏈可變區之結合域。Fab域可包含恆定區域，包括CH1及與恆定輕鏈域(CL)及VL域配對之VH域。該配對可例如經由雙硫橋鍵以共價鍵聯形式在CH1及CL域處發生。

「經修飾Fab域」意謂包含CH1及VH域之結合域，其中VH與VL域配對且CL域不存在。可替代地，經修飾Fab域為包含CL及VL域之結合域，其中VL與VH域配對且CH1域不存在。為了使CH1或CL區可以不配對形式存在，可能有必要移除疏水性區或減小疏水性區之長度。可使用來自天然地表現單鏈抗體之動物物種，例如來自諸如駱馬或駱駝之駱駝科動物，或來自鯊魚之CH1區。經修飾Fab域之其他實例包括包含不與其同源區配對之恆定區CH1或CL及/或不與其同源區配對之可變區VH或VL (存在)的Fab；及其中VH經VL調換之Fab，其中一對之一個多肽包含VL-CH1且另一多肽包含VH-CL。

如本文所使用之術語「免疫效應細胞」或「效應細胞」係指在哺乳動物免疫系統中之天然細胞組庫內可經活化以影響目標細胞活力之細胞。免疫效應細胞包括諸如自然殺手(NK)細胞、包括細胞毒性T細胞之T細胞或B細胞之淋巴譜系細胞，但骨髓譜系細胞亦可視為諸如單核球或巨噬細胞、樹突狀細胞及嗜中性顆粒球之免疫效應細胞。該效應細胞較佳為NK細胞、T細胞、B細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞或嗜中性顆粒球。

如本文所使用之術語「免疫細胞銜接抗原」係指在該免疫效應細胞之細胞膜上經表現且當結合至其配位體或本發明之活化抗體時引起免疫細胞之活化、刺激或共刺激的分子或部分，要被靶向之該等抗原之非限制性實例包括CD2、CD3、CD137、CD28、OX40、CD5、CD16、CD16A。

當在本文中提及核酸或胺基酸序列時「一致性百分比(%)」定義為在出於最佳比較目的而比對序列之後與經選擇序列中之殘基具有一致性之候選序列中之殘基百分比。為了使比對最佳化，可在二個序列之間在經比較之二個序列中之任一個中引入空隙。該比對可在所比較之全長序列上方進行。可替代地，比對可在較短長度上方，例如在約20個、約50個、約100個或更多個核酸/為主或胺基酸上方進行。序列一致性為經報導之經比對區上方之二個序列之間的一致匹配百分比。

序列比較及二個序列之間的序列一致性百分比測定可使用數學演算法來實現。技術人員將瞭解以下事實：數個不同電腦程式可用於比對二個序列且測定二個序列之間的一致性(Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (編), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, 第1 -44頁Addison Wesley)。二個胺基酸序列或核酸序列之間的序列一致性百分比可使用用於二個序列比對之尼-翁演算法(Needleman and Wunsch algorithm)來測定。(Needleman, S. B.及Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). 尼-翁演算法已實施於電腦程式NEEDLE中。出於本發明之目的，使用來自EMBOSS套裝之NEEDLE程式以測定胺基酸及核酸序列之一致性百分比(2.8.0版或更高級版本, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. LongdenJ.及Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) 第276- 277頁, http://emboss.bioinformatics.nl/)。對於蛋白質序列，使用EBLOSUM62以用於取代矩陣。對於DNA序列，使用DNAFULL。所用參數為10之空隙開放罰分及0.5之空隙擴展罰分。

在比對之後，藉由如上文所描述之程式NEEDLE如下計算查詢序列與本發明序列之間的序列一致性百分比：在二個序列中顯示相同胺基酸或相同核苷酸之比對中之對應位置數目除以減除比對中之空隙總數目之後的比對總長度。

本文中之術語「連接(connected/linked)」係指在一級胺基酸序列處藉助於肽鍵使域彼此接合。舉例而言，包含VH-CH1-CH2-CH3之基礎抗體部分之重鏈可經由連接子(連接CH1處之額外結合域之重鏈與基礎抗體部分之VH區)連接至額外結合域VH-CH1 (或額外結合域與額外結合域)的重鏈，其一起構成一個多肽鏈。類似地，CH1域可連接至可變重鏈區且CL域可連接至可變輕鏈區。抗體域亦可藉由不需要連接子之手段，諸如作為單一多肽之一部分「連接」。

「配對」係指構成本發明之多價抗體之多肽之間的相互作用，該等相互作用使得多肽可多聚化。舉例而言，額外結合域可包含與輕鏈區(VL-CL)配對之重鏈區(VH-CH1)，其中CH1及CL配對以形成該結合域。如本文所描述，抗體域(例如重鏈及輕鏈)之配對係因非共價相互作用且亦經由雙硫鍵發生，且可經由本文所揭露之技術且藉由此項技術中已知之方法經工程改造。該等非共價相互作用通常在除CH1與CL之外之VH與VL之間的抗體中發生。

「雙特異性抗體」為如本文所描述之抗體，其中抗體之一個可變域結合至第一抗原，而抗體之第二可變域結合至第二抗原，其中該第一及第二抗原不相同。術語「雙特異性抗體」亦涵蓋雙互補位抗體，其中抗體之一個可變域結合至抗原上之第一抗原決定基，而抗體之第二可變域結合抗原上之第二抗原決定基。該術語進一步包括其中至少一個VH能夠特異性辨識第一抗原且與免疫球蛋白可變域中之至少一個VH配對之VL能夠特異性辨識第二抗原的抗體。在例如WO 2008/027236、WO 2010/108127及Schaefer等人(Cancer Cell 20, 472-486, 2011年10月)中所描述，所得VH/VL對將結合抗原1或抗原2，且稱為「二合一抗體」。本發明之雙特異性抗體不限於任何特定雙特異性格式或其產生方法。

諸如如本文所描述之三特異性抗體之多特異性抗體為其中抗體之一個可變域結合至第一抗原、抗體之第二可變域結合至第二抗原且在三特異性抗體之情況下抗體之第三可變域結合至第三抗原的抗體，其中該第一、第二及第三抗原不相同或其所結合之抗原決定基不相同。亦即，三特異性抗體可為三互補位的，此係因為其結合相同抗原上之三個不同抗原決定基或一個抗原上之二個抗原決定基及第二抗原上之一個抗原決定基。

諸如雙特異性或三特異性抗體之多價抗體具有二個或更多個結合域。結合域可包含可變域及CH1/CL區。結合域中之一些或全部可針對相同抗原，然而，通常如本發明中之情況，至少二個且較佳地至少三個結合域結合不同抗原。在三特異性抗體之情況下，三個結合域通常全部結合不同抗原。因此，結合域較佳全部結合不同抗原。在該情況下，結合域亦全部具有不同序列。

多價抗體可使用包括細胞融合、化學結合或重組DNA技術之各種技術生成。多價抗體格式為此項技術中已知的。實例為具有二個不同結合域之抗體，諸如在雙特異性抗體中，可結合二個不同抗原或相同抗原內之二個不同抗原決定基的抗體。此類格式可允許使用經校準結合，此舉將允許多價抗體選擇性靶向表現二個抗原或抗原決定基之細胞或目標(諸如腫瘤細胞)、同時不靶向表現一個抗原之健康細胞，或靶向以較低表現位準表現一個抗原之該等健康細胞。類似地，在諸如雙特異性抗體之多價抗體上具有二個不同結合域可准許結合不同抗原，以使得可使用該多價抗體以靶向單個細胞上或二個相互作用細胞上的抑制分子及刺激分子二者，從而引起多價抗體之效力增強。亦可使用多價抗體以再針對可再針對腫瘤之例如免疫調節細胞之細胞。多價抗體之非限制性實例描述於此項技術中。多價抗體亦描述於以引用之方式併入本文中之WO 2019/190327中。

在一個態樣中，本發明提供包含多價抗體之組成物，該多價抗體包含結合第一腫瘤抗原(TA1)之具有VH1之第一可變域、結合第二腫瘤抗原(TA2)之具有VH3之第二可變域及結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之具有VH2之第三可變域；且其中組成物進一步包含結合TA1或TA2之第二結合分子。

結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之具有VH2之多價抗體可變域可結合至在免疫效應細胞表面上經表現之任何分子，例如CD3、TCR-α鏈或TCR-β鏈。其他合適免疫細胞銜接抗原為例如但不限於CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD137、CD28、CD16、CD16A、CD64、OX40、CD27、CD40、ICOS、GITR、NKG2D、NKp46、NKp44及NKp30。較佳地，此可變域結合至CD3、TCR-α鏈、TCR-β鏈、CD2或CD5。此可變域較佳結合至CD3。結合較佳與免疫細胞銜接抗原(IEA)之胞外部分進行。較佳地，多價抗體與IEA之結合活化免疫效應細胞或提供共刺激信號。較佳地，多價抗體與IEA之結合活化免疫效應細胞。

術語「CD3」(分化叢集3)係指由CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、CD3ε鏈(SwissProt P07766)及CD3ζ鏈同二聚體(SwissProt P20963)構成之蛋白複合物。CD3ε係以各種別名為人所知，該等別名中之一些為：「CD3e分子ε (CD3-TCR複合物)」；「CD3e抗原ε多肽(TiT3複合物)」；T細胞表面抗原T3/Leu-4ε鏈；T3E；T細胞抗原受體複合物T3 ε次單元；CD3e抗原；CD3-ε3；IMD18；TCRE。CD3E基因Id為HGNC：1674；Entrez基因：916；Ensembl：ENSG00000198851；OMIM：186830及UniProtKB：P07766。此等鏈與T細胞受體(TCR)及ζ鏈締合以形成在促分裂信號傳導時可在T淋巴球中生成活化信號之TCR複合物。CD3係在T細胞及NK T細胞上經表現。除非另外具體說明，否則在本文提及CD3之情況下，係提及人類CD3。

CD3結合域可在親和力、抗原決定基及其他特徵範圍內。可結合CD3之胞外部分之特定可變域為包含選自由以下組成之群之至少一個重鏈互補決定區(CDR)的可變域：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25。

CD3抗原結合域可包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 23之重鏈CDR1；SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 24之重鏈CDR2；及SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 25之重鏈CDR3。

CD3抗原結合域可包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈CDR1、CDR2及/或CDR3序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25。

CD3抗原結合域可包含與選自以下之群之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈可變區序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22。

CD3結合域可包含具有0-10個、較佳0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合的具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。

CD3抗原結合域可包含具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在某些實施例中，具有VH1之多價抗體可變域結合至TA1。

TA1可為在腫瘤細胞上經表現之任何抗原。TA1較佳為PD-L1、PD-L2、HVEM、CD47、B7-H3、B7-H4、B7-H7或Siglec-15。

TA1較佳為諸如PD-L1或PD-L2之免疫檢查點受體/配位體對之成員。可變域抑制該對之信號傳導路徑且藉此刺激將另外經抑制達到至少一定程度之免疫反應。

PD-L1為起在諸如妊娠、組織同種異體移植、自體免疫疾病及其他疾病狀態(諸如肝炎)之特定事件期間抑制免疫反應作用的1型跨膜蛋白。PD-L1與PD-1或B7.1 (CD80)之結合發射減少表現PD-1之T細胞增殖之抑制信號。認為PD-1能夠控制經由細胞凋亡進行之外來抗原特異性T細胞積聚。PD-L1係由各種癌細胞表現且認為其表現至少部分地引起針對癌細胞之免疫反應之阻尼。PD-L1為B7蛋白質家族之成員且以各種其他名稱為人所知，該等其他名稱諸如為CD274分子；CD274抗原；B7同源物1；PDCD1配位體1；PDCD1LG1；PDCD1L1；B7H1；PDL1；計劃性細胞死亡1配位體1；計劃性死亡配位體1；B7-H1；及B7-H。CD274外部Id為HGNC：17635；Entrez基因：29126；Ensembl：ENSG00000120217；OMIM：605402；UniProtKB：Q9NZQ7。

PD-L2為PD-1之第二配位體。PD-L2銜接PD-1抑制T細胞受體(TCR)介導之增殖及藉由CD4+ T細胞進行之細胞介素產生。在低抗原濃度下，PD-L2/PD-1結合抑制B7-CD28信號。在高抗原濃度下，PD-L2/PD-1結合減少細胞介素產生。PD-L表現係在抗原呈現細胞上藉由干擾素γ處理來加以上調。其在一些正常組織及各種腫瘤中經表現。認為PD-L1及PD-L2具有重疊功能且調節T細胞反應。蛋白質係以多個其他名稱為人所知，該多個其他名稱諸如為計劃性細胞死亡1配位體2；B7樹突狀細胞分子；計劃性死亡配位體2；嗜乳脂蛋白B7-DC；PDCD1配位體2；PD-1配位體2；PDCD1L2；B7-DC；CD273；B7DC；PDL2；PD-1配位體2；CD273抗原；BA574F11.2；及Btdc。PD-L2外部Id為HGNC：18731；Entrez基因：80380；Ensembl：ENSG00000197646；OMIM：605723；及UniProtKB：Q9BQ51。

HVEM亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員14 (TNFRSF14)及CD270，其為TNF受體(腫瘤壞死因子)超家族之人類細胞表面受體。在人類中，蛋白質係由TNFRSF14基因編碼。HVEM可銜接至少四個相異配位體，亦即TNFSF成員LIGHT (TNFSF14)及TNFβ/LTα (腫瘤壞死因子β/淋巴毒素α)及免疫球蛋白超家族成員B及T淋巴球衰減因子(BTLA)及CD160。對於人類HVEM之參考序列，吾等係指Swiss-Prot編號Q92956.3；aa1-283。僅參考識別HVEM基因/蛋白質。不意欲將如本文所描述之HVEM限於資料庫條目之特定序列。可結合BTLA、CD160、LIGHT及TNFβ且可由如本文所描述之抗體結合之HVEM天然變異體係在本發明之範疇內。

CD47為人類中由CD47基因編碼之跨膜蛋白。蛋白質係以多個其他名稱為人所知，該多個其他名稱諸如為整合素相關蛋白(IAP)、MER6、OA3及CD47分子。CD47屬於免疫球蛋白超家族且可結合配位體血小板反應蛋白-1 (TSP-1)及信號調節蛋白α (SIRPα)。CD47在人類細胞中經廣泛地表現且已發現其在許多不同腫瘤細胞中經過度表現。存在四個CD47之可替代地剪接之同功異型物。CD47外部ID為HGNC：1682、OMIM：601028、Entrez基因：961、Ensembl：ENSG00000196776及UniProtKB：Q08722。

免疫檢查點分子B7-H3為經由諸如CD28、CTLA-4及ICOS之CD28家族分子傳導信號之共刺激B7分子。蛋白質係以多個其他名稱為人所知，該多個其他名稱諸如為分化叢集276 (CD276)、4Ig-B7-H3、B7H3、B7RP-2及CD276分子。已發現B7-H3由實體腫瘤過度表現。B7-H3外部ID為HGNC：19137、OMIM：605717、Entrez基因：80381、Ensembl：ENSG00000103855及UniProtKB：Q5ZPR3。

B7-H4為免疫檢查點分子且屬於B7共刺激性分子家族。在人類中，蛋白質係由VTCN1基因編碼。蛋白質係以多個其他名稱為人所知，該多個其他名稱諸如為含V組域之T細胞活化抑制因子1 (VTCN1)、B7H4、B7S1、B7X、B7h.5、PRO1291、VCTN1。B7-H4外部ID為HGNC：28873、OMIM：608162、Entrez基因：79679、Ensembl：ENSG00000134258及UniProtKB：Q7Z7D3。

先前稱為人類內源性逆轉錄病毒-H長端重複序列相關2 (HHLA2)之B7-H7屬於B7共刺激性分子家族。B7-H7已識別為人類CD28H之特定配位體，其一起促進CD4+ T細胞增殖及細胞介素產生。B7-H7外部ID為HGNC：4905、Entrez基因：11148、Ensembl：ENSG00000114455、OMIM：604371及UniProtKB：Q9UM44。

唾液酸結合免疫球蛋白型凝集素Siglec-15為結合唾液酸且主要在免疫細胞表面上找到之細胞表面蛋白。蛋白質係以多個其他名稱為人所知，該多個其他名稱諸如為CD33抗原樣3、CD33分子樣3、CD33L3及唾液酸結合Ig樣凝集素15。Siglec-15外部ID為HGNC：27596、OMIM：618105、Entrez基因：284266、Ensembl：ENSG00000197046及UniProtKB：Q6ZMC9。

在某些實施例中，多價抗體之TA1結合域特異性結合人類PD-L1。多價抗體之PD-L1結合域或可變域可在親和力、抗原決定基及其他特徵範圍內。可結合PD-L1之胞外部分之特定可變域為包含選自由以下組成之群之至少一個重鏈CDR之可變域：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45。

PD-L1抗原結合域可包含SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 43之重鏈CDR1；SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 44之重鏈CDR2；及SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 45之重鏈CDR3。

PD-L1抗原結合域可包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈CDR1、CDR2及/或CDR3序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45。

PD-L1抗原結合域可包含與選自以下之群之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈可變區序列：SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 42。

PD-L1抗原結合域可包含具有0-10個、較佳0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合的具有SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之重鏈可變區。

PD-L1抗原結合域可包含具有SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 42之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在某些實施例中，PD-L1抗原結合域包含有包含具有SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 51之胺基酸序列或針對以下揭露之胺基酸序列之重鏈的PD-L1抗體的重鏈及/或輕鏈可變區，詳言之重鏈可變區：MSB-0010718C，參見WO 2013/079174；STI-1014，參見WO2013/181634; CX-072，參見WO2016/149201；KN035，參見Zhang等人, Cell Discov. 7:3 (2017年3月)；LY3300054，參見例如WO 2017/034916；及CK-301，參見Gorelik等人, AACR:Abstract 4606 (2016年4月))；以及12A4或MDX-1105，參見例如WO 2013/173223。

在某些實施例中，PD-L1抗原結合域結合與包含具有SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 51或具有以下之重鏈之PD-L1抗體之重鏈及輕鏈可變區相同的抗原決定基：MSB-0010718C，參見WO 2013/079174；STI-1014，參見WO2013/181634；CX-072，參見WO2016/149201；KN035，參見Zhang等人, Cell Discov. 7:3 (2017年3月)；LY3300054，參見例如WO 2017/034916；及CK-301，參見Gorelik等人, AACR:Abstract 4606 (2016年4月))；以及12A4或MDX-1105，參見例如WO 2013/173223。

在某些實施例中，PD-L1抗原結合域與以下PD-L1抗體之重鏈及輕鏈可變區競爭結合至PD-L1：MPDL3280A、RG7446，參見US 2010/0203056 A1；MEDI-4736，參見WO 2011/066389；MSB-0010718C，參見WO 2013/079174；STI-1014，參見WO2013/181634；CX-072，參見WO2016/149201；KN035，參見Zhang等人, Cell Discov. 7:3 (2017年3月)；LY3300054，參見例如WO 2017/034916；及CK-301，參見Gorelik等人, AACR:Abstract 4606 (2016年4月))；以及12A4或MDX-1105，參見例如WO 2013/173223。

在某些實施例中，具有VH3之多價抗體可變域結合至TA2。

TA2可為任何腫瘤相關抗原，但較佳為CLEC12A或ErbB蛋白質家族成員，較佳EGFR。

CLEC12A亦稱為C型凝集素域家族12成員A；C型凝集素蛋白CLL-1；MICL；樹突狀細胞相關凝集素2；C型凝集素超家族；骨髓抑制性C型凝集素樣受體；C型凝集素樣分子-1；CLL-1；DCAL2；CLL1；C型凝集素樣分子1；DCAL-2；殺手細胞凝集素樣受體亞家族L成員1 (KLRL1)；CD371 (Bakker A.等人Cancer Res. 2004, 64, p8843 50；GenBankTM寄存編號：AY547296；Zhang W.等人GenBankTM寄存編號：AF247788；A.S. Marshall,等人J Biol Chem 2004, 279, p14792-802；GenBankTM寄存編號：AY498550；Y.Han等人Blood 2004, 104, p2858 66；H.Floyd,等人GenBankTM寄存編號：AY426759；C.H.Chen,等人Blood 2006, 107, p1459 67)。Id：HGNC：31713；Entrez基因：160364；Ensembl：ENSG00000172322；OMIM：612088；UniProtKB：Q5QGZ9。CLEC12A為在白血病母細胞上及在急性骨髓性白血病(AML)中之白血病幹細胞(包括CD34陰性或CD34低表現白血病幹細胞(側群))上經表現之抗原(A.B. Bakker等人Cancer Res 2004, 64, p8443 50；Van Rhenen等人2007 Blood 110:2659；Moshaver等人2008 Stem Cells 26:3059)。另外認為CLEC12A表現限於造血性譜系，特別地限於周邊血液及骨髓中之骨髓細胞，亦即顆粒球、單核球及樹突狀細胞前驅體。更重要地，CLEC12A不存在於造血幹細胞上。此表現圖譜(expression profile)使CLEC12A成為AML中之特別地有利之目標。全長形式之CLEC12A包含275個胺基酸殘基，包括不存在於大部分其他同功異型物中之具有10個胺基酸之額外胞內延伸段，且顯示嚴格骨髓表現圖譜(表面表現及mRNA位準)。如Bakker等人Cancer Res 2004, 64, p8443-50及Marshall 2004 - J Biol Chem 279(15), p14792-802中所描述，術語『CLEC12A或其功能等效物』意謂保留嚴格骨髓表現圖譜之上文提及之全部(諸如剪接及突變)變異體及其同功異型物(二者處於表面表現位準及mRNA位準下)。本發明之CLEC12A結合抗體結合人類CLEC12A。除非另外具體說明，否則在本文提及CLEC12A之情況下，係提及人類CLEC12A。

『ErbB1』或『EGFR』為命名為Her-1、Her-2、Her-3及Her-4或cErbB-1、cErbB-2、cErbB-3及cErbB-4之四個受體酪胺酸激酶(RTK)家族之成員。EGFR具有由四個亞域構成之胞外域(ECD)，該四個亞域中之二個參與配位體結合且該四個亞域中之一個參與同二聚化及異二聚化。此部分中使用之參考號碼係指以「本說明書中引用之參考文獻」為表頭之清單中的參考文獻編號。EGFR整合來自各種配位體之胞外信號以產生多樣胞內反應。由EGFR活化之主信號轉導路徑係由Ras-促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)促分裂信號級聯構成。此路徑之活化係藉由將Grb2募集至酪胺酸磷酸化EGFR來引發。此舉引起經由Grb2結合Ras-鳥嘌呤核苷酸交換因子無七之子(Son of Sevenless，SOS)進行之Ras活化。另外，PI3-激酶-Akt信號轉導路徑亦由EGFR活化，但此活化在存在Her3共表現之情況下強得多。EGFR牽涉到數種人類上皮惡性疾病，尤其乳癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌及腦癌。已在基因中發現活化突變以及受體及其配位體之過度表現，此等情況產生自分泌活化環。因此，此RTK已廣泛地用作癌症療法之目標。靶向RTK之小分子抑制劑及針對胞外配位體結合域之單株抗體(mAb)二者均已得到研發且迄今已顯示數項臨床成功，即使大部分係精選患者組之臨床成功。人類EGFR蛋白及其編碼基因之資料庫寄存編號為(GenBank NM_005228.3)。寄存編號主要為了提供識別作為目標之EGFR蛋白之另一方法而給出，抗體所結合之EGFR蛋白之實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因突變，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之編碼基因突變。除非另外說明，否則在本文提及EGFR之情況下，提及係指人類EGFR。結合EGFR之抗原結合位點結合EGFR及其各種變異體，諸如在一些EGFR陽性腫瘤上經表現之EGFR及其各種變異體。

如本文所使用之『ErbB-2』或『HER2』係指人類中由ERBB-2基因編碼之蛋白質。基因或蛋白質之替代名稱包括CD340；HER-2；HER-2/neu；MLN 19；NEU；NGL；TKR1。ERBB-2基因通常稱為HER2 (來自人類表皮生長因子受體2)。在本文提及ErbB-2之情況下，提及係指人類ErbB-2。包含結合ErbB-2之抗原結合位點之抗體結合人類ErbB-2。ErbB-2抗原結合位點亦可由於人類與其他哺乳動物異種同源物之間的序列及三級結構類似性而結合此類異種同源物，但並非必須如此。人類ErbB-2蛋白及其編碼基因之資料庫寄存編號為(NP_001005862.1,  NP_004439.2  NC_000017.10  NT_010783.15  NC_018928.2)。寄存編號主要為了提供識別作為目標之ErbB-2之另一方法而給出，抗體所結合之ErbB-2蛋白之實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因突變，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之編碼基因突變。ErbB-2抗原結合位點結合ErbB-2及其各種變異體，諸如由一些ErbB-2陽性腫瘤細胞表現之ErbB-2及其各種變異體。

如本文所使用之『ErbB-3』或『HER3』係指人類中由ERBB-3基因編碼之蛋白質。基因或蛋白質之替代名稱為HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-erbb-3；erbb-3-S；p180-Erbb-3；p45-sErbb-3；及p85-sErbb-3。在本文提及ErbB-3之情況下，提及係指人類ErbB-3。包含結合ErbB-3之抗原結合位點之抗體結合人類ErbB-3。ErbB-3抗原結合位點亦可由於人類與其他哺乳動物異種同源物之間的序列及三級結構類似性而結合此類異種同源物，但並非必須如此。人類ErbB-3蛋白及其編碼基因之資料庫寄存編號為(NP_001005915.1  NP_001973.2, NC_000012.11  NC_018923.2  NT_029419.12  )。寄存編號主要為了提供識別作為目標之ErbB-3之另一方法而給出，抗體所結合之ErbB-3蛋白之實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因突變，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之編碼基因突變。ErbB-3抗原結合位點結合ErbB-3及其各種變異體，諸如由一些ErbB-2陽性腫瘤細胞表現之ErbB-3及其各種變異體。

在某些實施例中，目標細胞抗原結合特異性結合人類表皮生長因子受體(EGFR)。EGFR結合域可在親和力、抗原決定基及其他特徵範圍內。可結合EGFR之胞外部分之特定可變域為包含選自由以下組成之群之至少一個重鏈CDR之可變域：SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61及SEQ ID NO: 63。

EGFR抗原結合域可包含具有SEQ ID NO: 53之重鏈CDR1、具有SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2及具有SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 63之重鏈CDR3。

EGFR抗原結合域可包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈CDR1、CDR2及/或CDR3序列：SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61及SEQ ID NO: 63。

EGFR抗原結合域可包含與選自以下之群之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈可變區序列：SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60及SEQ ID NO: 62。

EGFR結合域可包含具有0-10個、較佳0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合的具有SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60及SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之重鏈可變區。

EGFR抗原結合域可包含具有SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 62之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在某些實施例中，EGFR抗原結合域包含EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)之重鏈及/或輕鏈可變區。

在某些實施例中，EGFR抗原結合域結合與EGFR抗體西妥昔單抗或帕尼單抗之重鏈及輕鏈可變區相同的抗原決定基。

在某些實施例中，EGFR抗原結合域與EGFR抗體西妥昔單抗或帕尼單抗之重鏈及輕鏈可變區競爭結合至EGFR。

在某些實施例中，目標細胞抗原結合特異性結合人類CLEC12A。CLEC12A結合域可在親和力、抗原決定基及其他特徵範圍內。可結合CLEC12A之胞外部分之特定可變域為包含選自由以下組成之群之至少一個重鏈CDR之可變域：SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO: 67。

CLEC12A抗原結合域可包含分別具有SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66及SEQ ID NO: 67之重鏈CDR1、CDR2及CDR3。

CLEC12A抗原結合域可包含與SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 67之胺基酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈CDR1、CDR2及/或CDR3序列。

CLEC12A抗原結合域可包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之重鏈可變區序列。

CLEC12A結合域可包含具有0-10個、較佳0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合的具有SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之重鏈可變區。

CLEC12A抗原結合域可包含具有SEQ ID NO: 64之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 93或SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在一個實施例中，本發明之多價抗體包含結合PD-L1之具有VH1之第一可變域、結合CD3之具有VH2之第二可變域及結合EGFR之具有VH3之第三可變域，其中可變域係如本文所定義。第二結合分子可為對TA1或TA2、較佳TA1具有特異性之任何結合分子。TA1較佳為PD-L1。該結合分子包括但不限於維持該抗體之結合特異性之抗體或其片段或變異體或包含該片段之結構。

組合多價抗體與第二結合分子准許多價抗體僅或主要誘導表現抗原TA1及TA2 (例如PD-L1及EGFR)二者之細胞，諸如腫瘤細胞的細胞殺滅。多價抗體不應誘導僅表現TA1或TA2 (例如PD-L1而非EGFR；或EGFR而非PD-L1)之細胞，諸如非腫瘤細胞的細胞殺滅，或誘導程度至少低於不存在第二結合分子情況下之誘導程度。

多價抗體與第二結合分子之組合特別適用於以下情形：存在表現TA1而非TA2之非腫瘤細胞及表現TA2而非TA1之非腫瘤細胞，且多價抗體之親合力不足以僅或主要誘導表現TA1及TA2二者之細胞的細胞殺滅。若多價抗體仍結合至表現TA1而非TA2之非腫瘤細胞且/或誘導其之細胞殺滅，則如本文所描述之第二結合分子結合至TA1。此舉防止或減少如本文所描述之多價抗體與表現TA1而非TA2之非腫瘤細胞的結合，且/或減少多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅。同樣，若多價抗體仍結合至表現TA2而非TA1之非腫瘤細胞且/或誘導其之細胞殺滅，則如本文所描述之第二結合分子結合至TA2。此舉防止或減少如本文所描述之多價抗體與表現TA2而非TA1之非腫瘤細胞的結合，且/或減少多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅。

結合至TA1或TA2之本發明之第二結合分子與多價抗體競爭結合至TA1或TA2。針對雙重陽性表現TA1、TA2之細胞之選擇性活性可由歸因於以下之多價抗體與此等細胞的優良結合引起：多價抗體及第二結合分子之TA1或TA2結合域之親和力、第二結合分子之化合價、多價抗體及第二結合分子之抗原決定基特異性、因第二結合分子所致之目標抗原內化或排出、或此等態樣之組合。因此，第二結合分子減少多價抗體與TA1或TA2之結合，或引起多價抗體與缺乏或具有經減少TA2表現之TA1細胞或缺乏或具有經減少TA1表現之TA2細胞的結合減少。

多價抗體之TA1及TA2結合域之親和力可基於TA1及TA2在腫瘤細胞及非腫瘤細胞上之表現位準加以選擇。舉例而言，若TA2在腫瘤細胞上之表現位準高於TA1在腫瘤細胞上之表現位準，則多價抗體之TA2結合域之親和力可為低或低-中等親和力，諸如雙數位或三數位nM，且多價抗體之TA1結合域之親和力可為中等或中等-高親和力，諸如單數位或雙數位nM。同樣，若TA1在腫瘤細胞上之表現位準高於TA2在腫瘤細胞上之表現位準，則多價抗體之TA1結合域之親和力可為低或低-中等親和力，諸如雙數位或三數位nM，且多價抗體之TA2結合域之親和力可為中等或中等-高親和力，諸如單數位或雙數位nM。若TA2在腫瘤細胞上之表現位準與TA1在腫瘤細胞上之表現位準相當，則多價抗體之TA2結合域之親和力及TA1結合域之親和力較佳在相同範圍內，諸如在高、中等-高、中等、低-中等或低親和力範圍內。若TA2在腫瘤細胞上之表現位準低於TA1在腫瘤細胞上之表現位準，則多價抗體之TA2結合域之親和力可為中等-高或高親和力，且多價抗體之TA1結合域之親和力可為低、低-中等或中等親和力。同樣，若TA1在腫瘤細胞上之表現位準低於TA2在腫瘤細胞上之表現位準。則多價抗體之TA1結合域之親和力可為中等-高或高親和力，且多價抗體之TA2結合域之親和力可為低、低-中等或中等親和力。

第二結合分子較佳為全長抗體、Fab、經修飾Fab或scFv。第二結合分子較佳不包含TA2結合可變域。其較佳不包含結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之結合域。多價抗體之TA1或TA2結合可變域可與第二結合分子之TA1或TA2結合可變域相同。第二結合分子包含至少一個TA1或TA2結合可變域，但亦可包含多個TA1或TA2結合可變域。第二結合分子較佳包含二個TA1或TA2結合可變域。第二結合分子之TA1或TA2結合可變域宜相同，但並非必須相同。第二結合分子較佳為包含二個相同TA1或TA2結合可變域之二價單特異性抗體。在某些實施例中，如在同一分析中所量測，第二結合分子之親合力低於多價抗體之親合力。合適分析之實例為FACS結合分析。

第二結合分子可為諸如阿特珠單抗(atezolizumab)或德瓦魯單抗(durvalumab)之市售抗體或其類似物或變異體。另一可使用之抗PD-L1抗體為包含具有SEQ ID NO: 47之重鏈之抗PD-L1抗體或其功能等效物。另外實例包括但不限於MSB-0010718C，參見WO 2013/079174；STI-1014，參見WO2013/181634；CX-072，參見WO2016/149201；KN035，參見Zhang等人, Cell Discov. 7:3 (2017年3月)；LY3300054，參見例如WO 2017/034916；及CK-301，參見Gorelik等人, AACR:Abstract 4606 (2016年4月))；以及12A4 (亦稱為MDX-1105)，參見例如WO 2013/173223。

在一個實施例中，第二結合分子包含二個具有SEQ ID NO: 46、47或51之重鏈。

多價抗體應與第二結合分子競爭結合至TA1或TA2。多價抗體應能夠勝過第二結合分子結合至表現TA1及TA2二者之細胞，且第二結合分子能夠勝過多價分子結合第二結合分子所靶向之僅表現抗原(TA1或TA2)中之一者的細胞。

獲得正確靶向—例如，第二結合分子以較大比率結合表現單一抗原之細胞且多價抗體以較大比率結合雙抗原細胞可藉由本文所闡述之本發明來達成。

此可藉由調節多價抗體之TA1或TA2結合域及/或第二結合分子之TA1或TA2結合域之親和力來達成。多價抗體之TA1或TA2結合域及/或第二結合分子之TA1或TA2結合域之親和力調節可基於TA1及TA2在腫瘤細胞及非腫瘤細胞上的表現位準。較佳地，結合TA1或TA2之第二結合分子之k_d 與多價抗體之TA1或TA2結合域之k_d 相比相當、相等或較低。k_d 係由k_on 率及k_off 率確定。可較佳地，結合TA1或TA2之第二結合分子之k_on 率與多價抗體之TA1或TA2結合域之k_on 率相比相當、相等或較高。亦可較佳地，結合TA1之第二結合分子之k_off 率與多價抗體之TA1或TA2結合域之k_off 率相比相當、相等或較低。亦可較佳地，結合TA1或TA2之第二結合分子之k_on 率與多價抗體之TA1或TA2結合域之k_on 率相比相當、相等或較高，且結合TA1之第二結合分子之k_off 率與多價抗體之TA1或TA2結合域之k_off 率相比相當、相等或較低。此種情況允許第二結合分子比多價抗體更強地結合至TA1或TA2且/或佔據更多TA1或TA2，藉此防止多價抗體結合至TA1或TA2。當細胞表現TA1及TA2二者時，多價抗體將結合不由第二結合分子結合之腫瘤相關抗原(TA1或TA2)且由於較大親合力勝過第二結合分子結合至第二結合分子所結合之腫瘤相關抗原。

此可藉由以使得不由第二結合分子結合之腫瘤相關抗原過量存在於第二結合分子所靶向之腫瘤相關抗原上方的方式選擇TA1及TA2、及/或藉由選擇對不由第二結合分子靶向之腫瘤相關抗原具有高親和力之多價抗體的結合臂、或二者之組合得到增強。本文例示但不限於其等之此等作用模式減少多價抗體與僅表現TA1或TA2之非腫瘤細胞的結合，或執行此舉達到低於表現TA1及TA2二者之目標腫瘤細胞的程度。

除驅動表現雙抗原之細胞之多價靶向選擇性的親和力及親合力之外，亦可採用其他機械手段。可較佳地，第二結合分子引起經靶向抗原(TA1或TA2)之內化或排出。具有在結合時進行內化或排出能力之腫瘤相關抗原陣列為此項技術中已知的。第二結合分子之此特點移除用於單一表現細胞之多價分子之抗原目標，而對於雙重表現細胞，多價將對接於不由結合分子靶向之第二抗原上，且隨後鎖定至隨時間推移再現之由第二結合分子靶向之抗原上。

類似地，多價分子可經設計以具有靶向域，該靶向域在結合時更改抗原，使得第二結合分子不能靶向抗原。在任何情況下，一個分子(多價分子或第二結合分子)之靶向應破壞第二分子靶向已由第一分子結合之同一抗原的潛能。

在一個態樣中，第二結合分子之TA1或TA2結合可變域之親和力與多價抗體之TA1或TA2結合可變域之親和力相當。此種情況允許多價抗體勝過第二結合分子或在表現TA1及TA2二者之細胞上與TA1或TA2具有經增強結合。為了增強僅表現TA1及TA2中之一者之細胞上第二結合分子與TA1或TA2之結合，可提高第二結合分子之化合價及/或親和力。

在一個態樣中，第二結合分子之TA1或TA2結合可變域之親和力與多價抗體之TA1或TA2結合可變域之親和力相等。此種情況允許多價抗體勝過第二結合分子或在表現TA1及TA2二者之細胞上與TA1或TA2具有經增強結合。為了增強僅表現TA1及TA2中之一者之細胞上第二結合分子與TA1或TA2之結合，可提高第二結合分子之化合價及/或親和力。

在一個態樣中，第二結合分子之TA1或TA2結合可變域之親和力高於多價抗體之TA1或TA2結合可變域之親和力。此種情況允許第二結合分子勝過多價抗體結合至TA1或TA2。為了增強表現TA1及TA2二者之細胞上多價抗體與TA1之結合且因此勝過第二結合分子結合至TA1，可提高多價抗體之TA2結合可變域之親和力。

如本文所描述之可變域之k_d 或k_on 或k_off 較佳在biacore中且較佳在雙特異性單價格式中，亦即使用具有一個k_d 或k_on 或k_off 要被測定之可變域及一個結合無關目標之可變域的雙特異性抗體加以量測。在本申請案中，此無關目標適宜為較佳具有相同共同輕鏈及具有SEQ ID NO: 68之VH鏈的破傷風類毒素結合域。

結合TA1之多價抗體之額外可變域較佳作為scFv域、Fab域或經修飾Fab域之一部分存在。較佳地，額外可變與CH1區在其C端處締合且其較佳藉助於連接子連接至結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之可變域的N端。較佳地，額外結合域為包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之Fab域，該Fab域之該重鏈可變區包含CH1區(VH-CH1)且該Fab之該輕鏈可變區包含CL區(VL-CL)。額外結合域亦可為由VH-CH1及VL組成之經修飾Fab域。可替代地，額外結合域為由VL-CL及VH組成之經修飾Fab域。在該等經修飾Fab域中，存在恆定區CH1或CL，該恆定區不與其同源區配對，且/或存在可變區VH或VL，該可變區不與其同源區配對。

結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之多價抗體之可變域及/或結合TA2之多價抗體之可變域亦較佳與CH1區締合。較佳地，結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之結合域及/或結合TA2之結合域為包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之Fab域，該Fab域之該重鏈可變區包含CH1區(VH-CH1)且該Fab之該輕鏈可變區包含CL區(VL-CL)。結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之結合域及/或結合TA2之結合域亦可為由VH-CH1及VL組成之經修飾Fab域。可替代地，額外結合域為由VL-CL及VH組成之經修飾Fab域。在該等經修飾Fab域中，存在恆定區CH1或CL，該恆定區不與其同源區配對，且/或存在可變區VH或VL，該可變區不與其同源區配對。

連接子可用於連接額外結合域與基礎抗體。連接子可為此項技術中已知之任何合適連接子，且較佳包含例如一或多個鉸鏈區及/或一或多個來源於鉸鏈區之區的肽區。連接子及其所連接之恆定區(例如CH1)之組合可決定多價抗體之特性。連接子可允許校正抗體之功能性及/或一或多個額外結合域向基礎抗體之定向。結合域中之CH1區之組合可改善抗體之功能性及/或結合域向基礎抗體之定向。基於給出亞型之鉸鏈之連接子序列較佳與額外結合域中相同亞型之恆定區組合。

較佳地，連接子為天然存在之序列或基於天然存在之序列。更具體言之，該連接子較佳為鉸鏈序列或包含基於鉸鏈序列之序列。更具體言之，該連接子可包含基於IgG1鉸鏈區、IgG2鉸鏈區、IgG3鉸鏈區或IgG4鉸鏈區之鉸鏈區。連接子較佳為具有7-30個胺基酸殘基之肽。連接子較佳包含如本文所描述之抗體之鉸鏈序列。

可替代地，該連接子包含具有7-30個胺基酸殘基之肽，該肽包含以下序列中之一或多者： 1：ESKYGPP (SEQ ID NO: 69)； 2：EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 70)； 3：GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71)； 4：ERKSSVESPPSP (SEQ ID NO: 72)； 5：ERKCSVESPPSP (SEQ ID NO: 73)； 6：ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 74)； 7：ESKYGPPSPSSP (SEQ ID NO: 75)； 8：ERKSSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 76)； 9：ERKCSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 77)； 10：ESKYGPPAPEFLGG (SEQ ID NO: 78)； 11：EPKSCDKTHTSPPSP (SEQ ID NO: 79)； 12：EPKSCDGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 80)； 13：GGGGSGGGGSAPPVAG (SEQ ID NO: 81)； 14：EPKSCDKTHTAPELLGG (SEQ ID NO: 82)； 15：ERKSSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 83)； 16：ERKCSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 84)； 17：ELKTPLGDTTHTAPEFLGG (SEQ ID NO: 85)； 18：ESKYGPPSPSSPAPEFLGG (SEQ ID NO: 86)； 19：EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG (SEQ ID NO: 87)； 20：ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 88)； 21：ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 89)； 22：ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 90)； 23：EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG (SEQ ID NO: 91)； 24：ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 92)； 或與其任一者具有至少約85%序列一致性之序列。

連接基礎抗體與一或多個額外結合域之連接子較佳為包含肽序列1至24中之任一者之胺基酸序列的肽或包含與肽序列1至24具有至少約85%序列一致性之胺基酸序列的多肽。

多價抗體之結合域可具有任何合適輕鏈。其可各自具有不同輕鏈，或二個或更多個結合域可具有相同或類似輕鏈。該輕鏈在本文中稱為共同輕鏈，該共同輕鏈為包含共同輕鏈可變區之輕鏈。該共同輕鏈中之輕鏈恆定區(CL)不必相同或類似。較佳地，多價抗體之全部結合域皆包含共同輕鏈。第二結合分子亦可包含共同輕鏈。通常，此共同輕鏈為與多價抗體中所使用之共同輕鏈相同的共同輕鏈。

具有共同輕鏈或輕鏈可變區促進多價抗體之產生，此係因為其限制可在免疫球蛋白鏈締合時形成之不同分子之數目。產生細胞現僅需要產生二個重鏈及一個輕鏈或一個輕鏈可變區。在該輕鏈係在包括編碼具有三個或更多個重鏈可變區之二個重鏈之DNA的宿主細胞內經表現的情況下，該輕鏈能夠與各可用重鏈可變區或CH1-VH1區配對，藉此形成至少三個功能抗原結合域。

共同輕鏈或共同輕鏈可變區能夠與諸如具有VH1、VH2及/或VH3之重鏈的不同重鏈或重鏈可變區配對。該共同輕鏈或共同輕鏈可變區之實例描述於WO2004/009618及WO2009/157771中。共同輕鏈或共同輕鏈可變區較佳具有生殖系序列。較佳生殖系序列為常用於人類組庫中之輕鏈可變區且具有良好熱力學穩定性、產量及溶解度。較佳生殖系輕鏈包含IgVκ1-39可變區V區段。共同輕鏈較佳包含經重排生殖系人類κ輕鏈可變區IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (圖3B)。其可包含0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合。共同輕鏈較佳進一步包含輕鏈恆定區。此輕鏈恆定區可為κ或λ輕鏈恆定區，較佳κ輕鏈恆定區(圖3C)。

較佳地，本發明之多價抗體包含κ輕鏈可變區IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。較佳地，多價抗體中之共同輕鏈可變區為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (SEQ ID NO: 93)。

較佳地，本發明之第二結合分子亦包含κ輕鏈可變區IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。較佳地，第二結合分子中之共同輕鏈可變區為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (SEQ ID NO: 93)。

包括例如IgVκ3-20/IgJκ1、IgVκ3-15/IgJκ1及IgVλ3-21/IgJλ3之其他共同輕鏈可變區為此項技術中已知的且可用。

IgVκ1-39為免疫球蛋白可變κ1-39基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變1-39；IGKV139；IGKV1-39。基因外部Id為HGNC：5740；Entrez基因：28930；Ensembl：ENSG00000242371。IgVκ1-39之較佳胺基酸序列係作為SEQ ID NO: 107給出。此序列為V區之序列。V區可與五個J區中之一者組合。二個較佳接合序列指示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據imgt.org處之IMGT資料庫全球網命名)。此等名稱為例示性的且涵蓋基因區段之對偶基因變異體。

IgVκ3-20為免疫球蛋白可變κ3-20基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變3-20；IGKV320；IGKV3-20。基因外部Id為HGNC：5817；Entrez基因：28912；Ensembl：ENSG00000239951。IgVκ3-20之較佳胺基酸序列係如SEQ ID NO: 108。此序列為V區之序列。V區可與五個J區中之一者組合。較佳接合序列指示為IGKV3-20/jk1；替代名稱為IgVκ3-20*01/IGJκ1*01 (根據imgt.org處之IMGT資料庫全球網命名)。此名稱為例示性的且涵蓋基因區段之對偶基因變異體。

IgVκ3-15為免疫球蛋白可變κ3-15基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變3-15；IGKV315；IGKV3-15。基因外部Id為HGNC：5816；Entrez基因：28913；Ensembl：ENSG00000244437。IgVκ3-15之較佳胺基酸序列係作為SEQ ID NO: 109給出。此序列為V區之序列。V區可與五個J區中之一者組合。較佳接合序列指示為IGKV3-15/jk1；替代名稱為IgVκ3-15*01/IGJκ1*01 (根據imgt.org處之IMGT資料庫全球網命名)。此名稱為例示性的且涵蓋基因區段之對偶基因變異體。

IgVλ3-21為免疫球蛋白可變λ3-21基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白λ可變3-21；IGLV320；IGLV3-21。基因外部Id為HGNC：5905；Entrez基因：28796；Ensembl：ENSG00000211662.2。IgVλ3-21之較佳胺基酸序列係作為SEQ ID NO: 110給出。此序列為V區之序列。V區可與五個J區中之一者組合。較佳接合序列指示為IGλV3-21/jk3；替代名稱為IgVλ3-21/IGJκ3 (根據imgt.org處之IMGT資料庫全球網命名)。此名稱為例示性的且涵蓋基因區段之對偶基因變異體。

多價抗體較佳為包含恆定區之全長抗體。較佳地，多價抗體為包含經重鏈異二聚化最佳化之恆定區之全長抗體。用於最佳化重鏈異二聚化之技術為此項技術中已知的且包括但不限於杵-臼突變之使用及DEKK突變之使用(WO2013/157954及De Nardis等人, J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706-14717，其等以引用之方式併入本文中)。

多價抗體可為誘導效應功能之抗體。多價抗體亦可為不誘導效應功能或誘導經減弱之效應功能之抗體。多價抗體較佳不可經由Fc受體誘導效應功能。第二結合分子較佳不誘導效應功能或誘導經減弱之效應功能。

此項技術中已知之一種類型之效應功能常常稱為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，且亦稱為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。ADCC為細胞介導之免疫防禦機制，由此免疫系統之效應細胞主動溶解膜表面抗原已由特異性抗體結合之目標細胞。ADCC效應功能通常由Fc受體(FcR)介導。受體為使抗體介導之(體液)免疫反應與細胞效應功能相聯之關鍵免疫調節受體。已識別用於全部類別之免疫球蛋白之受體，包括FcγR (IgG)、FcεRI (IgE)、FcαRI (IgA)、FcμR (IgM)及FcδR (IgD)。在白血球上發現三類用於人類IgG之受體：CD64 (FcγRI)、CD32 (FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIc)及CD16 (FcγRIIIa及FcγRIIIb)。FcγRI分類為高親和力受體(奈莫耳濃度範圍KD)，而FcγRII及FcγRIII為低至中度親和力(微莫耳濃度範圍KD)。在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中，效應細胞(自然殺手細胞、巨噬細胞、單核球及嗜酸性球)之表面上之FcγR結合至自身與目標細胞結合之IgG的Fc區。在結合時，觸發信號傳導路徑，此舉引起諸如溶解酶、穿孔蛋白、顆粒酶及腫瘤壞死因子之各種物質之分泌，該等物質介導目標細胞破壞。人類IgG亞型之ADCC效應功能位準變化。儘管此位準係視同種異型及特定FcγR而定，但簡言之，人類IgG1及IgG3之ADCC效應功能高，且IgG2及IgG4之ADCC效應功能低。瞭解抗體上之FcγR之結合位點已產生不具有ADCC效應功能之經工程改造之抗體。

另一類型之效應功能不依賴效應細胞且常常稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)。此效應功能為IgG及IgM抗體之效應功能。其為可使治療性抗體或抗體片段達成抗腫瘤效應之另一作用機制。當作為經典補體路徑之引發組分之C1q固定至目標結合抗體之Fc部分時，CDC經引發。此為可最終引起抗體標記細胞溶解之複合物補體活化級聯之第一步。

第二結合分子較佳為包含經工程改造以降低抗體之ADCC及/或CDC活性之恆定區的單特異性抗體。用於降低抗體之ADCC及/或CDC活性之技術為此項技術中已知的且可適宜用於本發明中。在第二結合分子為IgG1抗體之情況下，較佳地，其包含經修飾CH2區，修飾較佳使得抗體之ADCC及/或CDC活性經減弱或喪失。CH2/低級鉸鏈區中之一些抗體經修飾以例如減弱Fc受體相互作用或減少C1q結合。本發明之第二結合分子可為具有突變CH2及/或低級鉸鏈域以使得第二結合分子與Fc受體，較佳Fc-γ受體之相互作用經減弱的IgG抗體。

多價抗體可具有經工程改造以降低抗體之ADCC及/或CDC活性之恆定區。在多價抗體為IgG1抗體之情況下，較佳地，其包含經修飾CH2區，修飾較佳使得抗體之ADCC及/或CDC活性經減弱或喪失。CH2/低級鉸鏈區中之一些抗體經修飾以例如減弱Fc受體相互作用或減少C1q結合。本發明之多價抗體可為具有突變CH2及/或低級鉸鏈域以使得多價抗體與Fc受體，較佳Fc-γ受體之相互作用經減弱的IgG抗體。展現經減弱之效應功能之多價抗體將經由其與免疫細胞銜接抗原之結合保持能夠結合效應細胞且當經由TA1及/或TA2結合可變域結合時在諸如癌細胞之異常細胞附近活化該等效應細胞。

因此，本發明提供如本文所定義之包含多價抗體及第二結合分子之組成物。組成物較佳為包含多價抗體及第二結合分子之治療性組成物或包含多價抗體、第二結合分子及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑之醫藥組成物。要被投與至患者之本發明組成物中之多價抗體及第二結合分子之量通常處於治療窗中，此意謂使用足夠數量以獲得治療作用，同時該量不超過導致不可接受程度之副作用的臨限值。

亦提供如本文所定義之本發明之包含多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組。分裝部分之套組可包含本發明之多價抗體及第二結合分子作為單一組成物或作為獨立組成物，亦即一種包含多價抗體之組成物及另一種包含第二結合分子之組成物。在某些實施例中，套組包含用於向有需要之個體同時或連續投與多價抗體及第二結合分子之說明書。在某些實施例中，套組包含用於在投與多價抗體之前投與第二結合分子之說明書。

如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合、組成物或分裝部分之套組可用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅。

特定言之，在本發明之上下文中，諸如表現TA1而非TA2之細胞及表現TA2而非TA1之細胞之非腫瘤細胞僅表現與多價抗體結合之腫瘤相關抗原中的一者。表現TA1而非TA2之非腫瘤細胞及表現TA2而非TA1之非腫瘤細胞可同時存在。經減少之結合及經減少之細胞殺滅係指當與在不存在第二結合分子之情況下多價抗體之結合或細胞殺滅活性相比較時經降低的結合及細胞殺滅活性。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低如本文所描述之多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低如本文所描述之多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的方法，該方法包含使用結合至TA1或TA2之如本文所描述之第二結合分子以及多價抗體。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低如本文所描述之多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低如本文所描述之多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之第二結合分子的用途。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合的用途。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之包含多價抗體及第二結合分子之組成物的用途。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之治療性組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之醫藥組成物。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之第二結合分子。在某些實施例中，多價抗體為如本文所描述之多價抗體。

在某些實施例中，本發明係關於用於減少或降低多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅的如本文所描述之包含多價抗體及第二結合分子之組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之治療性組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之醫藥組成物。

除其臨床用途之外，如本文所描述之包含多價抗體及第二結合分子之組成物、如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合、如本文所描述之方法及如本文所描述之用途亦可用於研究且研發治療性抗體及包含該等抗體的組成物。此用途包括但不限於包括臨床前表徵中之活體外分析及活體內實驗之活體外分析、活體內實驗中的用途。

如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合、組成物或分裝部分之套組可用於用以治療患有醫學適應症，詳言之癌症之人類或動物的方法中，該方法包含向有需要之人類或動物投與治療有效量之如本文所定義之本發明之多價抗體及第二結合分子之組合。

提供治療癌症之方法，其中該方法包含： - 向有需要之個體投與如本文所描述之多價抗體且另外向個體投與如本文所描述之第二結合分子； - 向有需要之個體投與如本文所描述之組成物； - 向有需要之個體投與如本文所描述之治療性組成物；或 - 向有需要之個體投與如本文所描述之醫藥組成物。

進一步提供用於治療癌症之如本文所定義之包含多價抗體及第二結合分子之組成物或如本文所定義之包含多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組。

在某些實施例中，本發明係關於如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合用於治療癌症的用途。

在某些實施例中，本發明係關於如本文所描述之包含多價抗體及第二結合分子之組成物用於治療癌症的用途。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之治療性組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之醫藥組成物。

在某些實施例中，本發明係關於用於治療癌症的如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合。

在某些實施例中，本發明係關於用於治療癌症的如本文所描述之包含多價抗體及第二結合分子之組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之治療性組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之醫藥組成物。

進一步提供如本文所定義之本發明之多價抗體及第二結合分子之組合、如本文所定義之本發明之包含多價抗體及第二結合分子之組成物或如本文所定義之包含多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組用於製造用以治療患有癌症之個體的藥劑的用途。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之治療性組成物。在某些實施例中，組成物為如本文所描述之醫藥組成物。

進一步提供治療癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與如本文所定義之本發明之多價抗體且另外向個體投與如本文所定義之本發明之第二結合分子。

本發明之多價抗體及第二結合分子可作為一種組成物或作為獨立組成物同時投與。本發明之多價抗體及第二結合分子亦可依序投與，其中首先投與第二結合分子，接著為多價抗體，或反之亦然。較佳地，第二結合分子係在多價抗體之前投與。

癌症可為任何實體癌或血液癌。實體癌之實例包括上皮起源之實體癌；諸如卵巢癌及子宮內膜癌之婦科癌症；乳癌；前列腺癌；及腦癌。

血液癌可為較佳骨髓起源之白血病或白血病前期疾病，但亦可為B細胞淋巴瘤。可根據本發明治療之疾病包括諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)及慢性骨髓性白血病(CML)之骨髓性白血病或白血病前期疾病；及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。此外，B-ALL、T-ALL、套細胞淋巴瘤亦為用本發明之組成物或分裝部分之套組進行之治療的較佳目標。

因此，本發明提供在骨髓發育不良症候群(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、多發性骨髓瘤(MM)或較佳急性骨髓性白血病(AML)治療中用作醫藥之所附申請專利範圍之組成物或分裝部分之套組。亦提供申請專利範圍之組成物或分裝部分之套組用於製備用以治療或預防MDS、CML、MM或較佳AML之藥劑的用途。較佳地，腫瘤抗原為CLEC12A。

本發明進一步提供包含編碼如本文所描述之多價抗體之重鏈及輕鏈之核酸的表現載體以及包含編碼如本文所描述之第二結合分子之重鏈及輕鏈之核酸的表現載體。亦設想用於多價抗體及第二結合分子二者之單一表現載體的用途。

因此，本發明亦關於包含編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸的表現載體，其中載體進一步包含編碼如本文所定義之第二結合分子之重鏈可變區之核酸。編碼第二結合分子之重鏈可變區之核酸為與編碼多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸不同的核酸。舉例而言，例示性多價抗體包含有包含結合至免疫細胞銜接抗原(IEA)之結合域及結合至TA1之結合域的多肽及包含結合至TA2之結合域的多肽。因此，編碼第二結合分子之重鏈可變區之核酸不編碼對TA2具有特異性之重鏈可變區，但編碼對TA1具有特異性之重鏈可變區。

因此，在其中在多價抗體中結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域與Fc區締合且結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域連接至結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域的實施例中，編碼第二結合分子之重鏈可變區之核酸編碼對TA1具有特異性之重鏈可變區。在其中在多價抗體中其中結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域與Fc區締合且結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域連接至結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域的實施例中，編碼第二結合分子之重鏈可變區之核酸編碼對TA2具有特異性之重鏈可變區。

編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸及編碼如本文所定義之第二結合分子之重鏈可變區之核酸可進一步編碼較佳包含CH1、CH2及CH3的重鏈恆定區。

表現載體可進一步包含編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之輕鏈可變區之核酸及編碼如本文所定義之第二結合分子之輕鏈可變區之核酸。該等核酸可進一步編碼輕鏈恆定區(CL)。

本發明進一步關於包含編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸的宿主細胞，其中宿主細胞進一步包含編碼如本文所定義之第二結合分子之重鏈可變區之核酸。如上文針對表現載體所解釋，編碼第二結合分子之重鏈可變區之核酸為與編碼多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸不同的核酸。

編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之重鏈可變區之核酸及編碼如本文所定義之第二結合分子之重鏈可變區之核酸可進一步編碼較佳包含CH1、CH2及CH3的重鏈恆定區。

宿主細胞可進一步包含編碼如本文所定義之多價抗體之第一、第二及第三可變域之輕鏈可變區之核酸及編碼如本文所定義之第二結合分子之輕鏈可變區之核酸。該等核酸可進一步編碼輕鏈恆定區(CL)。

宿主細胞允許由單個細胞表現多價抗體及第二結合分子二者。

合適載體之實例包括能夠在例如哺乳動物細胞之原核或真核宿主細胞中複製之質體、噬質體、黏質體、病毒及噬菌體核酸或其他核酸分子。載體可為其中編碼重鏈及輕鏈之核酸可操作地連接至表現控制元件之表現載體。典型表現載體含有可用於調節多核苷酸表現之轉錄及轉譯終止子、起始序列及啟動子。

較佳地，編碼多價抗體之重鏈之核酸包含一或多個促進重鏈異二聚化之修飾。該等修飾為此項技術中已知的且包括但不限於如本文所提供之修飾之實例。編碼第二結合分子之一或多個重鏈之核酸較佳不具有促進異二聚化之修飾。替代地，其可包含一或多個促進同二聚化之修飾。

此項技術中存在用以產生抗體及其他類型之結合分子之各種方法。抗體及結合分子通常由表現編碼抗體或結合分子之核酸之細胞產生。因此，本發明亦提供產生且/或包含本發明之抗體及/或第二結合分子之經分離細胞或於組織培養物中之細胞。通常，此細胞為活體外、經分離或重組細胞。該細胞包含編碼本發明之抗體及/或第二結合分子之核酸。細胞較佳為動物細胞，更佳哺乳動物細胞，更佳靈長類動物細胞，最佳人類細胞。出於本發明之目的，合適細胞為能夠包含且較佳能夠產生本發明之抗體且/或包含本發明之核酸的任何細胞。較佳地，細胞為融合瘤細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞或PER.C6細胞。特別較佳地，細胞為CHO細胞。

進一步提供包含本發明之細胞之細胞培養物或細胞株。經研發以用於蛋白質及抗體之工業規模生產之細胞株在本文中進一步稱為工業細胞株。

本發明進一步提供用於產生本發明之多價抗體及/或第二結合分子之方法，該方法包含培養本發明之細胞且自該培養物收取多價抗體及/或第二結合分子。該細胞可在無血清培養基中培養。較佳地，該細胞適於懸浮生長。多價抗體及/或第二結合分子可自培養基純化。較佳地，該多價抗體及/或第二結合分子經親和力純化。

本發明進一步提供包含如本文所描述之多價抗體及第二結合分子及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組成物。

當本發明之多價抗體及/或第二結合分子經調配以用作用於點滴之注射或輸注溶液時，注射或輸注溶液可呈水溶液、懸浮液或乳液之任何形式，或可與醫藥學上可接受之載劑一起調配為固體藥劑以使得彼藥劑將在使用時溶解、懸浮或乳化於溶劑中。在用於點滴之注射或輸注溶液中使用之溶劑之實例包括注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖溶液及等張溶液(例如於其中氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇或其類似物可溶)。

醫藥學上可接受之載劑之實例包括穩定劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩解劑、緩衝劑、防腐劑、消毒劑、pH調節劑及抗氧化劑。可使用各種胺基酸、白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、聚葡萄糖、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、依地酸鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯或其類似物作為穩定劑。可使用醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇及聚乙二醇)、非離子界面活性劑(例如聚山梨醇酯20 (註冊商標)、聚山梨醇酯80 (註冊商標)及HCO-50)或其類似物作為增溶劑。可使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉或其類似物作為懸浮劑。可使用阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍或其類似物作為乳化劑。可使用苯甲醇、氯丁醇、山梨醇或其類似物作為緩解劑。可使用磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、硼酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、麩胺酸緩衝液、ε胺基己酸緩衝液或其類似物作為緩衝劑。可使用對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、氯化苄烷銨、去水醋酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、硼酸、硼砂或其類似物作為防腐劑。可使用氯化苄烷銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇或其類似物作為消毒劑。可使用鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸或其類似物作為pH調節劑。可使用(1)諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉及亞硫酸鈉之水性抗氧化劑、(2)諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、卵磷脂、五倍子酸丙酯及α-生育酚之油溶性抗氧化劑或(3)諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸、山梨醇、酒石酸及磷酸之金屬螯合劑作為抗氧化劑。

用於點滴之注射或輸注溶液可藉由執行最終過程中之滅菌或無菌操縱，例如藉由用過濾器過濾進行之滅菌，且隨後填充無菌容器來產生。用於點滴之注射或輸注溶液可藉由在使用時將經真空乾燥或凍乾之無菌粉末(其可包括醫藥學上可接受之載劑粉末)溶解於適當溶劑中來使用。

本發明進一步提供治療個體之癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之如本文所描述之多價抗體及第二結合分子或醫藥組成物。因此，本發明提供用於治療個體之癌症的如本文所描述之多價抗體及第二結合分子之組合。本發明進一步提供用於預防癌症、抑制癌症症狀發展或復發及/或治療癌症之醫藥劑，其中醫藥劑包含作為活性成分之如本文所描述之多價抗體及第二結合分子。

本文引用專利文獻或作為背景給出之其他主題不視為承認彼文件或主題為人所知或其所含資訊為申請專利範圍中之任一者之優先權日的公共常識之一部分。

本文所闡述之各參考文獻之揭露內容係以全文引用之方式併入本文中。

出於清楚且簡潔描述之目的，特點在本文中描述為相同或獨立實施例之一部分，然而，應瞭解，本發明之範疇可包括具有所描述特點中之全部或一些之組合的實施例。 實例 實例1 細胞及細胞株

HCT116 (ECACC 91091005)為人類結腸癌細胞株。BxPC3 (BxPC-3 ATCC ® CRL-1687)為人類胰臟癌細胞。BxPC3細胞表現相對高含量之EGFR及PD-L1，而HCT116表現較低含量之EGFR及PD-L1。 抗體

本文所製備之多價抗體為具有二個具備如圖1中所描繪之一般結構之重鏈的三特異性抗體。

產生包含不同VH1及VH2區及相同VH3區之不同三特異性抗體。單個VH3區係選自對EGFR具有特異性之Fab (SEQ ID NO: 56)；二個VH2區係選自對CD3具有特異性之Fab (SEQ ID No: 8及22)，且二個VH1區係選自對PD-L1具有特異性之Fab (SEQ ID No: 38及42)。二個經選擇PD-L1 Fab具有高於用於單特異性PD-L1抗體(包含SEQ ID NO: 47)中之一者之PD-L1 Fab且低於用於包含具有SEQ ID NO: 46之重鏈之單特異性PD-L1抗體之PD-L1 Fab的相對親和力。

重鏈具有如WO2013/157954及WO2013/157953中所描述之異二聚化域。具有VH3之重鏈具備具有DE殘基351D及368E之CH3域。根據EU編號，具有VH2及VH1之重鏈在CH3區中具備具有KK殘基(351K、366K)之互補CH3域。可經由使用不同技術或在VH3側上具有KK殘基且在VH2及VH1側上具有DE殘基來應用異二聚化CH3區之替代性包括。在細胞中產生二個重鏈引起具有二個重鏈之IgG重鏈異二聚體之生成(WO2013/157954及WO2013/157953)。

KK重鏈具有以下N端至C端結構VH1-CH1-連接子-VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。用於在細胞中表現重鏈及輕鏈之表現載體係基於MV3032製成(圖10)。此處所用之輕鏈為包含IGKV1-39/jk1可變區(圖3中所示之序列)之共同輕鏈。

DE重鏈具有以下N端至C端結構VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3。用於在細胞中表現重鏈及輕鏈之表現載體係基於MV1625製成(圖11)。由此載體編碼之輕鏈為包含IGKV1-39/jk1可變區(圖3中所示之序列)之共同輕鏈。

產生三種二價單特異性PD-L1抗體：1)包含二個具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸之重鏈及一包含如SEQ ID NO: 105中所闡述之胺基酸序列之輕鏈的抗體；2)包含二個具有如SEQ ID NO: 47中所闡述之胺基酸之重鏈及一包含如SEQ ID NO: 98中所闡述之胺基酸序列之輕鏈的抗體；及3)包含二個具有如SEQ ID NO: 51中所闡述之胺基酸之重鏈及一包含如SEQ ID NO: 106中所闡述之胺基酸序列之輕鏈的抗體。 抗體產生

Hek293細胞係用於表現包含具有SEQ ID NO: 47之重鏈及具有SEQ ID NO: 98之輕鏈的三特異性抗體及單特異性PD-L1抗體。在轉染前二天，使Hek293細胞存料在293培養基中以1:1比率裂解且在37℃及8% CO₂ 下以155 rpm回轉振盪速度培育隔夜。在轉染前一天將細胞稀釋至5 × 10e5個細胞/毫升之密度。將懸浮細胞接種至盤中，用可透氣密封件覆蓋且在37℃及8% CO₂ 下以285 rpm回轉振盪速度培育隔夜。在轉染日，使293-F培養基與線性聚乙烯亞胺(PEI) (MW 25,000)混合。對於要被產生之各IgG，將293F培養基-PEI混合物添加至各別表現載體DNA (用於編碼各重鏈之IgG異二聚體DNA)中。將混合物在室溫下培育20分鐘，之後輕輕地添加至細胞中。在轉染後之日，將稀釋於293-F培養基中之青黴素-鏈黴素(Pen Strep)添加至各培養物中。在轉染後七天，將培養物在37℃及8% CO₂ 下以285 rpm回轉振盪速度培育直至收取為止。將培養物以500 g離心5 min，將含有IgG之上清液使用10-12 μm熔噴聚丙烯過濾盤過濾且儲存於-20℃下，之後進行純化。

將上清液與1 M Trizma pH 8及Protein A Sepharose CL-4B珠粒(50% v/v，G.E Healthcare Life Sciences)混合且在25℃下以600 rpm回轉振盪培育2 h。將珠粒真空過濾且用PBS pH 7.4洗滌2次。抗體溶離係藉由添加0.1 M檸檬酸鹽緩衝液pH 3，接著用1 M Trizma pH 8中和來執行。將經純化IgG溶離份立即緩衝交換至PBS pH 7.4中。將IgG樣品轉移至30 kDa過濾器聚醚碸膜中且以1500 g在4℃下離心，將PBS添加至保留物中，將樣品以500 rpm混合3 min，之後在4℃下收集IgG進行儲存。IgG濃度係藉由Octet及Protein A生物感測器(Pall ForteBio)來測定。在七次2倍稀釋中使用人類IgG作為標準品。IgG樣品濃度經二次重複測定。

在CHO細胞中產生包含二個具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸之重鏈及一包含如SEQ ID NO: 105中所闡述之胺基酸序列之輕鏈的單特異性PD-L1抗體及包含二個具有如SEQ ID NO: 51中所闡述之胺基酸之重鏈及一包含如SEQ ID NO: 106中所闡述之胺基酸序列之輕鏈的單特異性PD-L1抗體。 細胞毒性分析

使用BxPC3及HCT116細胞株以量測T細胞介導之細胞殺滅活性。

根據標準技術使用Ficoll及EasySep人類T細胞分離套組自來自健康供體之全血分離休眠T細胞，使用流動式細胞量測分析藉由抗CD3抗體檢查＞ 95% T細胞純度且隨後冷凍保存。將經冷凍保存之T細胞解凍，且若在解凍時，藉由標準錐蟲藍染色所測定，其活力為＞ 90%，則使用其。

簡而言之，細胞毒性分析，將經解凍休眠T細胞及BxPC3或HCT116目標細胞以5:1之E:T比共培養48小時。目標細胞溶解係藉由利用量測由CellTiter-Glo (Promega)評估之ATP含量量測活細胞分數來測定。藉由於Envision微定量盤式讀取器上之發光量測之ATP含量產生相對光單位(RLU)值，該等RLU值係使用GraphPad Prism來加以分析。

各樣品之目標細胞溶解如下計算： 殺滅% = (100- (樣品RLU /無IgG RLU) × 100)。

在第一實驗中，使用BxPC3細胞毒性分析以展現單特異性抗PD-L1抗體添加對三特異性抗體誘導目標細胞殺滅之能力的影響。對於三特異性抗體及對照，使用以20.5 nM濃度開始之20倍4步稀釋數列。

將人類T細胞與BxPC3目標細胞一起共培養且與二種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體一起培育。第一種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 38之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 8之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。第二種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 42之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 22之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。細胞殺滅百分比相對於陰性對照破傷風毒素(TT) = CD3 × TT三特異性抗體而言突出，TT結合臂包含具有SEQ ID NO 68之重鏈可變區且CD3結合域包含具有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 22之重鏈可變區。將第一及第二種三特異性抗體之細胞殺滅活性與三特異性PD-L1 = CD3 × mock抗體之細胞殺滅活性進行比較，其中mock臂對TT具有特異性。

圖6顯示在不存在單特異性PD-L1抗體之情況下第一種三特異性抗體及三特異性PD-L1 = CD3 × mock抗體二者均以類似位準誘導T細胞介導之細胞殺滅(圖6A；右欄)。上述情況亦適用於第二種三特異性抗體(圖6B；右欄)。因此，在不存在單特異性PD-L1抗體之情況下包含PD-L1結合域及EGFR結合域之三特異性抗體及包含PD-L1結合域、但缺乏EGFR結合域之三特異性抗體二者均誘導T細胞介導之細胞殺滅。此種情況表明，抗體之T細胞介導之細胞殺滅活性獨立於與EGFR之結合存在，此意謂表現PD-L1、但不表現EGFR或表現低含量EGFR之細胞(其應包括非腫瘤細胞)將經此等抗體殺滅，此等抗體包括包含PD-L1及EGFR結合域之三特異性抗體。

增加單特異性PD-L1抗體之量影響三特異性PD-L1 = CD3 × mock抗體而非包含PD-L1及EGFR結合域之三特異性抗體的活性。在存在單特異性PD-L1抗體之情況下包含PD-L1結合域及EGFR結合域之三特異性抗體仍誘導T細胞介導之細胞殺滅，但包含PD-L1結合域、但缺乏EGFR結合域之三特異性抗體不誘導或不太有效地誘導T細胞介導之細胞殺滅。此種情況表明，在存在單特異性PD-L1抗體之情況下抗體之細胞殺滅活性係視與EGFR之結合而定。此意謂當存在單特異性PD-L1抗體時，表現PD-L1、但不表現EGFR或表現低量EGFR之細胞(例如非腫瘤細胞)將不經包含PD-L1及EGFR結合域之三特異性抗體殺滅或經其不太有效地殺滅。

結果顯示，在此分析中，當EGFR不由三特異性抗體結合或由三特異性抗體結合達到較低程度時，二價單特異性PD-L1抗體能夠防止由三特異性抗體進行之T細胞介導之目標細胞殺滅。換言之，二價單特異性PD-L1抗體能夠降低表現PD-L1、但不表現EGFR或僅表現低量EGFR之細胞的T細胞介導之細胞殺滅。藉由組合三特異性抗體與二價單特異性抗體使三特異性抗體更高特異性靶向所需TA1、TA2陽性目標細胞。

在第二實驗中，使用細胞毒性分析以測定單特異性抗體對三特異性抗體誘導T細胞介導之HCT116細胞及BxPC3細胞殺滅之能力的影響。對於三特異性抗體及對照，使用以20.5 nM濃度開始之8倍8步稀釋。

在存在三種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體之情況下將人類T細胞與BxPC3或HCT116目標細胞一起共培養。第一種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 38之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 8之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。第二種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 38[5359]之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 22之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。第三種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 42之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 22之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。除PD-L1 = CD3 × TT陰性對照之外，亦包括TT = CD3 × EGFR對照。細胞殺滅百分比再次相對於陰性對照TT = CD3 × TT三特異性抗體而言突出，TT結合臂包含SEQ ID NO: 68且CD3結合域包含SEQ ID NO: 8或22。

圖7顯示在不存在單特異性PD-L1抗體之情況下三特異性PD-L1 = CD3 × mock抗體誘導T細胞介導之細胞殺滅。此T細胞介導之目標細胞殺滅僅歸因於可在表現PD-L1、但不表現EGFR或表現低量EGFR之正常非腫瘤細胞上以及在表現PD-L1及EGFR二者之腫瘤細胞上之抗體與PD-L1的結合。在存在單特異性PD-L1抗體之情況下此T細胞介導之目標細胞殺滅很大程度上經降低或減少。咸信此種情況係歸因於較少PD-L1可用於三特異性PD-L1 = CD3 × mock抗體，因為該抗體必須與單特異性PD-L1抗體競爭。

在不存在單特異性PD-L1抗體之情況下PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體亦誘導T細胞介導之細胞殺滅。在存在單特異性PD-L1抗體之情況下，與三特異性PDL1 = CD3 × mock抗體相比，此T細胞介導之細胞殺滅不經降低或經較低程度地降低。此外，在此處，較少PD-L1將可用於三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體之結合，此係歸因於單特異性PD-L1抗體。然而，因為PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體亦結合EGFR，故PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體可展現其對表現EGFR及PD-L1二者之細胞、而非或較低程度地對不表現EGFR或僅表現低量EGFR之細胞的細胞殺滅影響。

將三特異性抗體與包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之序列之重鏈之二價單特異性抗PD-L1抗體的組合僅與三特異性抗體的用途進行比較。以固定1:10之三特異性抗體與單特異性抗體比添加二價單特異性抗PD-L1抗體以使得單特異性抗體相對於三特異性抗體而言始終大大過剩存在。缺乏功能PD-L1可變域之TT = CD3 × EGFR對照抗體誘導T細胞介導之目標細胞殺滅達到一定程度，但與具有功能PD-L1可變域之三特異性抗體相比有效程度低得多(參見圖7；PD-L1 = CD3 × EGFR；或PD-L1 = CD3 × TT)。在存在二價單特異性PD-L1抗體之情況下PD-L1 = CD3 × EGFR抗體仍誘導T細胞介導之目標細胞殺滅，即使其不結合至或較低程度地結合至EGFR陰性PD-L1陽性細胞。此種情況與在存在二價單特異性抗體之情況下之損失大部分其T細胞介導之目標細胞殺滅活性的PD-L1 = CD3 × mock抗體相反。其損失活性之事實顯示，二價單特異性PD-L1抗體對三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體作用增添大量特異性。單特異性PD-L1抗體改進三特異性抗體之治療窗。

在平均HCT116細胞上具有含量低於BxPC3細胞之EGFR及PD-L1。此種情況不改變單特異性PD-L1抗體對三特異性抗體之更高特異性細胞靶向的影響，即使在存在單特異性PD-L1抗體之情況下三特異性抗體之T細胞介導之細胞殺滅活性的量在某種程度上較低(圖7下圖)。

在第三實驗中，使用BxPC3細胞毒性分析以測定不同比率之三特異性抗體與單特異性抗體對其殺滅BxPC3細胞之能力的影響。對於三特異性抗體及對照，使用以20.5 nM濃度開始之3倍8步稀釋。

在存在二種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體之情況下將人類T細胞與BxPC3目標細胞一起共培養。第一種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 38之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 8之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。第二種三特異性抗體包含有包含具有SEQ ID NO: 42[5426]之重鏈可變區之PD-L1結合域；包含具有SEQ ID NO: 22之重鏈可變區之CD3結合域；及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域。測試二種不同二價單特異性PD-L1抗體：一種抗體包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸序列之重鏈(圖8A)且一種抗體包含具有如SEQ ID NO: 51中所闡述之胺基酸序列之重鏈(圖8B)。

圖8顯示二價單特異性抗體之存在降低缺乏EGFR結合臂之三特異性抗體而非包含EGFR結合臂之三特異性抗體的T細胞介導之目標細胞殺滅。此種情況表明，在存在二價單特異性PD-L1抗體之情況下，與當三特異性抗體僅結合至PD-L1時相比，當三特異性抗體在表現PD-L1及EGFR二者之細胞上結合至PD-L1及EGFR時T細胞介導之細胞殺滅較高。自此可得出結論：單特異性PD-L1抗體確保T細胞介導之目標細胞殺滅主要或較高程度地由抗體與PD-L1及EGFR陽性細胞之結合誘導且不由抗體與PD-L1陽性及EGFR陰性細胞之結合誘導。所測試之二種不同二價單特異性抗體之結果類似。

第四實驗為重複第三實驗，但隨後包括包含有包含具有SEQ ID NO: 38之重鏈可變區之PD-L1結合域、包含具有SEQ ID NO: 22之重鏈可變區之CD3結合域及包含具有SEQ ID NO: 56之重鏈可變區之EGFR結合域的另一種三特異性抗體；且僅使用包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸序列之重鏈之二價單特異性抗體。對於三特異性抗體及對照，使用以20.5 nM濃度開始之8倍8步稀釋。

圖9顯示此三特異性抗體產生與其他二種三特異性抗體類似之結果。因此，可得出結論：具有不同PD-L1及/或CD3結合域之三特異性抗體達成相同結果。 本發明之態樣

1. 一種組成物，其包含多價抗體，該多價抗體包含結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域、結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域及結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域；且其中該組成物進一步包含結合TA1或TA2之第二結合分子。

2. 如態樣1之組成物，其中該結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及該結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域與Fc區締合，且該結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域連接至該結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域。

3.    如態樣1之組成物，其中該結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及該結合第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域與Fc區締合，且該結合第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域連接至該結合免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域。

4. 如態樣1至3中任一項之組成物，其中該第一、第二及/或第三可變域包含共同輕鏈可變區。

5. 如態樣1至4中任一項之組成物，其中該結合免疫細胞銜接抗原之可變域結合至CD3、TCR-α鏈、TCR-β鏈、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD137、CD28、CD16、CD16A、CD64、OX40、CD27、CD40、ICOS、GITR、NKG2D、NKp46、NKp44或NKp30；較佳結合至CD3、TCR-α鏈、TCR-β鏈、CD2或CD5；更佳結合至CD3。

6.    如態樣1至5中任一項之組成物，其中該結合第一腫瘤相關抗原(TA1)之可變域結合至PD-L1、PD-L2、HVEM、CD47、B7-H3、B7-H4、B7-H7或Siglec-15；較佳PD-L1或PD-L2；更佳PD-L1。

7.    如態樣1至6中任一項之組成物，其中該結合第二腫瘤相關抗原(TA2)之可變域結合至CLEC12A或EGFR，較佳EGFR。

8. 如態樣1至7中任一項之組成物，其中該第二結合分子結合至TA1。

9. 如態樣1至8中任一項之組成物，其中該第二結合分子為二價單特異性抗體。

10. 如態樣9之組成物，其中該第二結合分子具有經減弱之效應功能。

11.  一種分裝部分之套組，其包含如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子。

12.  一種醫藥組成物，其包含如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子。

13. 一種如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組合、如態樣1至10中任一項中定義之組成物、如態樣11中定義之分裝部分之套組或如態樣12中定義之醫藥組成物，其用於治療有需要之個體，詳言之患有癌症之個體。

14.  一種治療癌症之方法，其包含： - 向有需要之個體投與如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體且另外向該個體投與如態樣1至10中任一項中定義之第二結合分子；或 - 向有需要之個體投與如態樣1至10中任一項中定義之組成物；或 - 向有需要之個體投與如態樣12中定義之醫藥組成物。

15.  一種包含如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物或包含如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之分裝部分之套組的用途，其用於製造用以治療患有癌症之個體之藥劑。

16.  如態樣13中定義之用於治療之組合、如態樣14中定義之治療方法或如態樣15中定義之用途，其中該多價抗體及第二結合分子係作為單一組成物或作為二種獨立組成物同時投與。

17.  如態樣13中定義之用於治療之組合、如態樣14中定義之治療方法或如態樣15中定義之用途，其中該多價抗體係在該第二結合分子之前投與。

18.  如態樣13中定義之用於治療之組合、如態樣14中定義之治療方法或如態樣15中定義之用途，其中該第二結合分子係在該多價抗體之前投與。

19. 一種載體，其包含編碼如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體之該第一、第二及第三可變域之重鏈可變區的核酸，其中該載體進一步包含不同的編碼如態樣1至10中任一項中定義之第二結合分子之重鏈可變區的核酸。

20. 一種宿主細胞，其包含編碼如態樣1至10中任一項中定義之多價抗體之該第一、第二及第三可變域之重鏈可變區的核酸，其中該宿主細胞進一步包含不同的編碼如態樣1至10中任一項中定義之第二結合分子之重鏈可變區的核酸。 序列 SEQ ID NO: 1：重鏈可變區 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFGISWVRQAPGQGLEWMGGFIPVLGTANYAQKFQGRVTIIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 2：根據Kabat之HCDR1 SFGIS SEQ ID NO: 3：根據Kabat之HCDR2 GFIPVLGTANYAQKFQG SEQ ID NO: 4：根據Kabat之HCDR3 RGNWNPFDP SEQ ID NO: 5：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDAFKSKTFTISWVRQAPGQGLEWLGGIIPLFGTITYAQKFQGRVTITADKSTNTAFMELSSLRSEDTAMYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 6：根據Kabat之HCDR1 SKTFTIS SEQ ID NO: 7：根據Kabat之HCDR2 GIIPLFGTITYAQKFQG SEQ ID NO: 8：重鏈可變區EVQLVQSGSELKKPGSSVKVSCKASGVTFNSRTFTISWVRQAPGQGLEWLGSIIPIFGTITYAQKFQGRVTITADKSTSTAFMELTSLRSEDTAIYYCTRRGNWNPFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 9：根據Kabat之HCDR1 SRTFTIS SEQ ID NO: 10：根據Kabat之HCDR2 SIIPIFGTITYAQKFQG SEQ ID NO: 11：重鏈可變區QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFKFSSYALSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGRTTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSYGPYWYFDLWGRGTLVTVSS SEQ ID NO: 12：根據Kabat之HCDR1 SYALS SEQ ID NO: 13：根據Kabat之HCDR2 GISGSGRTTWYADSVKG SEQ ID NO: 14：根據Kabat之HCDR3 DGGYSYGPYWYFDL SEQ ID NO: 15：重鏈可變區EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRFWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSTSTAYLQWSSLKASDTGMYYCVRHIRYFDWSEDYHYYLDVWGKGTTVTVSS SEQ ID NO: 16：根據Kabat之HCDR1 RFWIG SEQ ID NO: 17：根據Kabat之HCDR2 IIYPGDSDTRYSPSFQG SEQ ID NO: 18：根據Kabat之HCDR3 HIRYFDWSEDYHYYLDV SEQ ID NO: 19：重鏈可變區EVQLVESGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTRYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCVRNIRYFVWSEDYHYYMDVWGKGTTVTVSS SEQ ID NO: 20：根據Kabat之HCDR1 RYWIG SEQ ID NO: 21：根據Kabat之HCDR3 NIRYFVWSEDYHYYMDV SEQ ID NO: 22：重鏈可變區EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGFNFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSDISWSSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLWLQMNSLRTEDTALYFCAKDHRGYGDYEGGGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 23：根據Kabat之HCDR1 DYTMH SEQ ID NO: 24：根據Kabat之HCDR2 DISWSSGSIGYADSVKG SEQ ID NO: 25：根據Kabat之HCDR3 DHRGYGDYEGGGFDY SEQ ID NO: 26：重鏈可變區EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTPNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCAKNVRGYSAYDLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 27：根據Kabat之HCDR1 TYAIS SEQ ID NO: 28：根據Kabat之HCDR2 GIIPIFDTPNYAQKFQG SEQ ID NO: 29：根據Kabat之HCDR3 NVRGYSAYDLDY SEQ ID NO: 30：重鏈可變區QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYSMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDHDFRTGRAFDIWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 31：根據Kabat之HCDR1 SYSMN SEQ ID NO: 32：根據Kabat之HCDR2 WINTNTGNPTYAQGFTG SEQ ID NO: 33：根據Kabat之HCDR3 DHDFRTGRAFDI SEQ ID NO: 34：重鏈可變區EVQLVESGGDVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKSTLFLQMNSLRAEDTAVYFCVRGLPITMVRGAYSFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 35：根據Kabat之HCDR1 SYGMH SEQ ID NO: 36：根據Kabat之HCDR2 VISYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 37：根據Kabat之HCDR3 GLPITMVRGAYSFDY SEQ ID NO: 38：重鏈可變區EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYSITWVRQAPGQGLEWMGSIVPIFGTINNAQKFQGRVTITADKSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDNTMVRGVDYYYMDVWGKGTMVTVSS SEQ ID NO: 39：根據Kabat之HCDR1 TYSIT SEQ ID NO: 40：根據Kabat之HCDR2 SIVPIFGTINNAQKFQG SEQ ID NO: 41：根據Kabat之HCDR3 DNTMVRGVDYYYMDV SEQ ID NO: 42：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFRSYGITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRRGYSNPHWLDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 43：根據Kabat之HCDR1 SYGIT SEQ ID NO: 44：根據Kabat之HCDR2 GIIPIFGTTNYAQKFQG SEQ ID NO: 45：根據Kabat之HCDR3 RRGYSNPHWLDP SEQ ID NO: 46：重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELGRGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN SEQ ID NO: 47：重鏈QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFNTYAINWVRQAPGQGLEWVGRIIPIFGTANYAQKFQGRVTISADKSTTTAYMELSSLRSEDTAVFYCAKDETGYSSSNFQHWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELGRGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN SEQ ID NO: 48：根據Kabat之HCDR1 TYAIN SEQ ID NO: 49：根據Kabat之HCDR2 RIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO: 50：根據Kabat之HCDR3 DETGYSSSNFQH SEQ ID NO: 51：重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 52：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDRHWHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 53：根據Kabat之HCDR1 SYGIS SEQ ID NO: 54：根據Kabat之HCDR2 WISAYNANTNYAQKLQG SEQ ID NO: 55：根據Kabat之HCDR3 DRHWHWWLDAFDY SEQ ID NO: 56：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDLYGHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 57：根據Kabat之HCDR3 DLYGHWWLDAFDY SEQ ID NO: 58：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKGPGSHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 59：根據Kabat之HCDR3 GPGSHWWLDAFDY SEQ ID NO: 60：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDRGWHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 61：根據Kabat之HCDR3 DRGWHWWLDAFDY SEQ ID NO: 62：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDRHWHWWLDGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 63：根據Kabat之HCDR3 DRHWHWWLDGFDY SEQ ID NO: 64：重鏈可變區QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 65：根據Kabat之HCDR1 SYYMH SEQ ID NO: 66：根據Kabat之HCDR2 IINPSGGSTSYAQKFQG SEQ ID NO: 67：根據Kabat之HCDR3 GTTGDWFDY SEQ ID NO: 68：重鏈可變區EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 69：連接子1 ESKYGPP SEQ ID NO: 70：連接子2 EPKSCDKTHT SEQ ID NO: 71：連接子3 GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 72：連接子4 ERKSSVESPPSP SEQ ID NO: 73：連接子5 ERKCSVESPPSP SEQ ID NO: 74：連接子6 ELKTPLGDTTHT SEQ ID NO: 75：連接子7 ESKYGPPSPSSP SEQ ID NO: 76：連接子8 ERKSSVEAPPVAG SEQ ID NO: 77：連接子9 ERKCSVEAPPVAG SEQ ID NO: 78：連接子10 ESKYGPPAPEFLGG SEQ ID NO: 79：連接子11 EPKSCDKTHTSPPSP SEQ ID NO: 80：連接子12 EPKSCDGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 81：連接子13 GGGGSGGGGSAPPVAG SEQ ID NO: 82：連接子14 EPKSCDKTHTAPELLGG SEQ ID NO: 83：連接子15 ERKSSVESPPSPAPPVAG SEQ ID NO: 84：連接子16 ERKCSVESPPSPAPPVAG SEQ ID NO: 85：連接子17 ELKTPLGDTTHTAPEFLGG SEQ ID NO: 86：連接子18 ESKYGPPSPSSPAPEFLGG SEQ ID NO: 87：連接子19 EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG SEQ ID NO: 88：連接子20 ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG SEQ ID NO: 89：連接子21 ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG SEQ ID NO: 90：連接子22 ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG SEQ ID NO: 91：連接子23 EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG SEQ ID NO: 92：連接子24 ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG SEQ ID NO: 93：輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 94：根據IMGT之LCDR1 QSISSY SEQ ID NO: 95：根據IMGT之LCDR2 AAS SEQ ID NO: 96：根據IMGT之LCDR3 QQSYSTPPT SEQ ID NO: 97：輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 98：輕鏈序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 99：IGKV1-39/jk5輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 100：CH1序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV SEQ ID NO: 101：鉸鏈 EPKSCDKTHTCPPCP SEQ ID NO: 102：CH2序列 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK SEQ ID NO: 103：經修飾CH3序列 GQPREPQVYTKPPSREEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 104：經修飾CH3序列 GQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 105：輕鏈序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:  106：輕鏈序列 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ  ID NO: 107：IgVk1-39 V區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP SEQ ID NO: 108：IgVk 3-20 V區 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP SEQ ID NO: 109：IgVk3-15 V區 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP SEQ ID NO: 110：IgVL3-21 V區 SYVLTQPPSVSVAPGETARITCGGDNIGRKSVYWYQQKSGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDGSSDH

(無)

應注意，除下文所例示之特點及態樣以外之本發明之特點及態樣自實施方式以及隨附圖式顯而易知，該等隨附圖式繪示例如根據本發明之實施例的特點。所提供之圖式中之各者為例示性的且不意欲限制所提供之本發明之範疇，該範疇係由描述且致能本文所闡述之本發明之申請專利範圍、態樣及全範圍揭露內容界定。

為了易於參考，當在本文中描述本發明之多價抗體時，使用以下格式：TA1=IEA×TA2，其表示腫瘤相關抗原1結合域(TA1)、連接子(=)、與腫瘤相關抗原2結合域(TA2)二聚(×)之免疫細胞銜接抗原結合域(IEA)，以使得TA1=IEA構成「長臂」，而×指代二聚化，接著TA2指示多價抗體之「短臂」。在多價抗體包含共同輕鏈之情況下，對應VH區如下：TA1(VH1)=IEA(VH2)×TA2(VH3)。

圖1. 多價抗體之實例之示意性圖示。VH為重鏈可變區，CH為重鏈恆定區，CL為輕鏈恆定區，VL為輕鏈可變區。在此特定實施例中，共同輕鏈用於結合域中之各者中。輕鏈或VL亦可對於結合域中之一或多者而言為共同的且對於另一結合域或其他結合域而言為不同的。在此特定實施例中，結合至TA1之具有VH1之額外結合域包含CH1及CL域。多價抗體亦可例如缺乏此等域中之一或二者，或CH1及CL域可經調換。在此特定實施例中，多價抗體在結合至TA1之具有VH1之額外結合域之CH1域與具有VH2之IEA結合域之VH域之間包含連接子。連接子亦可作為額外連接子或作為單一連接子存在於結合至TA1之具有VH1之額外結合域之CL域與具有VH2之IEA結合域之VL之間。

圖2. 具有用於PD-L1、EGFR及CD3之結合域之多價抗體之實例的示意性圖示。VH為重鏈可變區，CH為重鏈恆定區，CL為輕鏈恆定區，VL為輕鏈可變區。在此特定實施例中，共同輕鏈用於結合域中之各者中。輕鏈或VL亦可對於結合域中之一或多者而言為共同的且對於另一結合域或其他結合域而言為不同的。在此特定實施例中，結合至PD-L1之額外結合域包含CH1及CL域。多價抗體亦可例如缺乏此等域中之一或二者，或CH1及CL域可經調換。在此特定實施例中，多價抗體在結合至PD-L1之額外結合域之CH1域與CD3結合域之VH域之間包含連接子。連接子亦可作為額外連接子或作為單一連接子存在於結合至PD-L1之額外結合域之CL域與CD3結合域之VL之間。

圖3A 至3F. 以下之胺基酸序列：A)共同輕鏈胺基酸序列；B)共同輕鏈可變區DNA序列及轉譯(IGKV1-39/jk1)；C)共同輕鏈恆定區DNA序列及轉譯；D) IGKV1-39/jk5共同輕鏈可變區胺基酸序列；E) V區IGKV1-39胺基酸序列；F)共同輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。

圖4A 至4E. 適用於生成雙特異性分子之例示性IgG重鏈核酸及胺基酸序列。A) CH1區。B)鉸鏈區。C) CH2區。D)包含變體L351K及T366K (KK)之CH3域。E)包含變體L351D及L368E (DE)之CH3域。

圖5. 圖A描繪呈PD-L1陽性及EGFR陰性或EGFR陽性及PD-L1陰性之正常非腫瘤細胞。在存在單特異性PD-L1結合分子之情況下，該等細胞不為三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體有效地溶解。經由箭頭交叉(×)意謂不溶解或弱溶解。

在PD-L1陽性及EGFR陰性細胞上單特異性PD-L1結合分子勝過三特異性抗體，此例如歸因於PD-L1結合分子之二價及/或相較於三特異性抗體針對PD-L1之親和力而言較高之PD-L1結合分子親和力。三特異性抗體結合EGFR陽性及PD-L1陰性細胞，不誘導活性或誘導相對弱之活性，此例如歸因於結合之單價特徵。

然而，在表現EGFR及PD-L1二者之細胞，諸如腫瘤細胞之情況下，三特異性抗體經由EGFR對接至細胞，且PD-L1靶向臂相對於單特異性抗PD-L1結合分子而言具有經增強競爭優勢(圖B)。相較於單特異性PD-L1結合分子而言，三特異性抗體與該等PD-L1陽性及EGFR陽性細胞具有更佳結合，該更佳結合係經由親合力達成，該親合力係經由結合至EGFR及PD-L1二者獲得。此種情況可藉由使用EGFR靶向臂之高親和力得到進一步增強。

圖6A 及6B. 圖6A及6B顯示使用與人類T細胞共培養之BxPC3細胞執行之細胞毒性研究之結果。測試二種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體：一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 8之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域；且另一種抗體具有包含SEQ ID NO: 42之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域。在存在具有包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸序列之重鏈之PD-L1結合域的單特異性二價PD-L1抗體(圖6A)或具有包含具有SEQ ID NO: 47中所闡述之胺基酸序列之重鏈之PD-L1結合域的單特異性二價PD-L1抗體(圖6B)情況下測試三特異性抗體之細胞殺滅活性。使用以下不同濃度之單特異性PD-L1抗體：20 nM、2.05 nM、0.205 nM、0.0205 nM、0.00205 nM及0 nM (左欄至右欄)。各曲線圖之y軸指示相較於不包含抗體之對照樣品而言之目標細胞殺滅%。各曲線圖之x軸指示樣品中之各別三特異性抗體之以奈莫耳濃度(nM)為單位之量。該等圖比較PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體與三特異性PD-L1 = CD3 × Mock對照抗體之活性。mock可變域具有與共同輕鏈一起形成破傷風類毒素結合可變域(TT)之具有SEQ ID NO: 68之重鏈可變區。TT可變域在各種培育中不具有結合配偶體且因此充當mock域。

圖7. 圖7顯示使用與人類T細胞共培養之BxPC3細胞(頂圖)或HTC116細胞(下圖)執行之細胞毒性研究之結果。測試三種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體：一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 8之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(左欄)；一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(中間欄)，且一種抗體具有包含SEQ ID NO: 42之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(右欄)。在存在具有包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸序列之重鏈之PD-L1結合域的單特異性二價PD-L1抗體或具有包含具有如SEQ ID NO: 47中所闡述之胺基酸序列之重鏈之PD-L1結合域的單特異性二價PD-L1抗體情況下測試三特異性抗體之細胞殺滅活性。單特異性PD-L1抗體之使用濃度為三特異性抗體之10倍。各曲線圖之y軸指示相較於不包含三特異性抗體之對照樣品而言之目標細胞殺滅%。各曲線圖之x軸指示樣品中之各別三特異性抗體之以ng/ml為單位之量。該等圖比較PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體與三特異性PD-L1 = CD3 × Mock對照抗體及三特異性Mock = CD3 × EGFR對照抗體之活性。mock可變域具有與共同輕鏈一起形成破傷風類毒素結合可變域(TT)之具有SEQ ID NO: 68之重鏈可變區。TT可變域在各種培育中不具有結合配偶體且因此充當mock域。

圖8A 及8B. 用於使用人類T細胞及BxPC3細胞測定T細胞介導之目標細胞殺滅之細胞毒性分析中的PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體以及單特異性二價PD-L1抗體。測試二種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體：一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 8之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(左欄)；且一種抗體具有包含SEQ ID NO: 42之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(右欄)。

x軸指示三特異性抗體之以nM為單位之量。y軸指示相對於不添加抗體時而言之細胞殺滅%。頂列顯示當不存在二價單特異性抗體(媒劑)時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性。中間列顯示當添加等量二價單特異性抗體時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性(三特異性:單特異性比率為1:1)。下列顯示當添加十倍過量二價單特異性抗體時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性(三特異性:單特異性比率為1:10)。圖8A顯示添加包含具有SEQ ID NO: 46之重鏈之二價單特異性抗體時之結果，且圖8B顯示添加包含具有SEQ ID NO: 51之重鏈之二價單特異性抗體時之結果。

圖9. 用於使用人類T細胞及BxPC3細胞測定T細胞介導之目標細胞殺滅之細胞毒性分析中的PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體以及單特異性二價PD-L1抗體。測試三種不同PD-L1 = CD3 × EGFR三特異性抗體：一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 8之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(左欄)；一種抗體具有包含SEQ ID NO: 38之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(中間欄)；且一種抗體具有包含SEQ ID NO: 42之PD-L1結合域、包含SEQ ID NO: 22之CD3結合域及包含SEQ ID NO: 56之EGFR結合域(右欄)。所用二價單特異性PD-L1抗體包含具有如SEQ ID NO: 46中所闡述之胺基酸序列之重鏈。

x軸指示三特異性抗體之以nM為單位之量。y軸指示相對於不添加抗體時而言之細胞殺滅%。頂列顯示當不存在二價單特異性抗體(媒劑)時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性。中間列顯示當添加等量二價單特異性抗體時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性(三特異性:單特異性比率為1:1)。下列顯示當添加十倍過量二價單特異性抗體時三特異性PD-L1 = CD3 × EGFR抗體或mock對照之細胞殺滅活性(三特異性:單特異性比率為1:10)。

圖 10 .載體MV3032之圖譜。

圖 11 ：載體MV1625之圖譜。

圖12A 及12B ：合適多價抗體格式之實例之示意性圖示。此等多價抗體格式可包含另外結合域。

圖12A顯示包含Fc區之多價抗體格式之實例。BD1、BD2及BD3為結合域1、2及3。此等實例中之某些結合域指示為Fab域；然而，亦可使用其他類型之域，諸如單域抗體、VHH、Fv、VHH2、scFv、雙功能抗體、CODV等以及其組合。此等實例中之某些結合域指示為scFv域；然而，亦可使用其他類型之域，諸如單域抗體、VHH、Fv、VHH2、Fab、雙功能抗體、CODV等以及其組合。結合域中之一或多者亦可連接至CH2或在CH1、CH2及/或CH3區中經工程改造。多價抗體格式可包含任何類型之重鏈及輕鏈，該任何類型之重鏈及輕鏈包括共同重鏈、共同輕鏈、正交重鏈及正交HC:LC。根據此項技術中已知之內容，多價抗體格式中之連接子之位置及/或性質可變化。

圖12B顯示包括以下之多價抗體格式之額外實例：V域、以Fv及Fab為主之多特異性抗體(VHH3、三功能抗體、串聯Fab3)、以Fv為主之IgG多特異性抗體(CODV-Fab TsAb、scFv-IgG TsAb)、以Fab為主之IgG多特異性抗體(orthoTsAb)及CrossMab 2:1 TCB。

Claims (32)

1. 一種治療性組成物，其包含一多價抗體，該多價抗體包含結合一第一腫瘤抗原(TA1)之一第一可變域、結合一第二腫瘤抗原(TA2)之一第二可變域及結合一免疫細胞銜接抗原(IEA)之一第三可變域；且其中該組成物進一步包含結合TA1或TA2之一第二結合分子。
2. 如請求項1之治療性組成物，其中該多價抗體包含一Fc區。
3. 如請求項1或2之治療性組成物，其中該結合一免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及該結合一第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域與一Fc區締合，且該結合一第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域連接至該結合一免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域。
4. 如請求項1或2之治療性組成物，其中該結合一免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域及該結合一第一腫瘤抗原(TA1)之第一可變域與一Fc區締合，且該結合一第二腫瘤抗原(TA2)之第二可變域連接至該結合一免疫細胞銜接抗原(IEA)之第三可變域。
5. 如請求項1至4中任一項之治療性組成物，其中該第一、第二及/或第三可變域包含一共同輕鏈可變區。
6. 如請求項1至5中任一項之治療性組成物，其中該結合一免疫細胞銜接抗原之可變域結合至CD3、TCR-α鏈、TCR-β鏈、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD137、CD28、CD16、CD16A、CD64、OX40、CD27、CD40、ICOS、GITR、NKG2D、NKp46、NKp44或NKp30；較佳結合至CD3、TCR-α鏈、TCR-β鏈、CD2或CD5；更佳結合至CD3。
7. 如請求項1至6中任一項之治療性組成物，其中該結合一第一腫瘤相關抗原(TA1)之可變域結合至PD-L1、PD-L2、HVEM、CD47、B7-H3、B7-H4、B7-H7或Siglec-15；較佳PD-L1或PD-L2；更佳PD-L1。
8. 如請求項1至7中任一項之治療性組成物，其中該結合一第二腫瘤相關抗原(TA2)之可變域結合至CLEC12A或EGFR，較佳EGFR。
9. 如請求項1至8中任一項之治療性組成物，其中該第一腫瘤相關抗原(TA1)係表現於非腫瘤細胞上。
10. 如請求項1至9中任一項之治療性組成物，其中該第二結合分子結合至TA1。
11. 如請求項1至10中任一項之治療性組成物，其中該第二結合分子為一種二價單特異性抗體。
12. 如請求項1至11中任一項之治療性組成物，其中該第二結合分子具有與該多價抗體之該第一可變域或第二可變域之針對TA1或TA2之結合親和力相比相當、相等或較低的針對TA1或TA2之結合親和力。
13. 如請求項1至12中任一項之治療性組成物，其中該第二結合分子具有經減弱之效應功能。
14. 一種分裝部分之套組，其包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子。
15. 一種分裝部分之套組，其包含如請求項1至13中任一項之治療性組成物及用於向一有需要之個體投與該組成物之說明書。
16. 如請求項14或15之分裝部分之套組，其中該套組包含用於向一有需要之個體同時或連續投與該多價抗體及第二結合分子之說明書。
17. 如請求項14至16中任一項之分裝部分之套組，其中該套組包含用以在投與該多價抗體之前投與該第二結合分子之說明書。
18. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子以及一醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
19. 一種如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組合、包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物、如請求項1至13中任一項之治療性組成物、如請求項14至17中任一項之分裝部分之套組或如請求項18之醫藥組成物，其用於減少或降低該多價抗體與非腫瘤細胞之結合且/或用於減少或降低該多價抗體誘導之非腫瘤細胞之細胞殺滅。
20. 一種如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組合、包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物、如請求項1至13中任一項之治療性組成物、如請求項14至17中任一項之分裝部分之套組或如請求項18之醫藥組成物，其用作一藥劑。
21. 一種如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組合、包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物、如請求項1至13中任一項之治療性組成物、如請求項14至17中任一項之分裝部分之套組或如請求項18之醫藥組成物，其用於治療一有需要之個體，詳言之一患有癌症之個體。
22. 一種如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組合、包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物、如請求項1至13中任一項之治療性組成物、如請求項14至17中任一項之分裝部分之套組或如請求項18之醫藥組成物的用途，其用於製造一用以治療癌症之藥劑。
23. 一種用於減少或降低如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體與表現TA1或TA2之非腫瘤細胞之結合的方法，其中該方法包含使用如請求項1至13中任一項中定義之結合至TA1或TA2之第二結合分子以及該多價抗體。
24. 如請求項23之方法，其中該等非腫瘤細胞表現TA1且該第二結合分子結合至TA1。
25. 如請求項23或24之方法，其中該多價抗體與表現TA1或TA2之非腫瘤細胞之結合相較於不使用該第二結合分子之一方法中該多價抗體與表現TA1或TA2之非腫瘤細胞之結合而言經降低。
26. 一種治療癌症之方法，其中該方法包含： - 向一有需要之個體投與如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體且另外向該個體投與如請求項1至13中任一項中定義之第二結合分子； - 向一有需要之個體投與包含如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體及第二結合分子之組成物；或 - 向一有需要之個體投與如請求項1至13中任一項之治療性組成物；或 - 向一有需要之個體投與如請求項18之醫藥組成物。
27. 如請求項19至21中任一項之組合、組成物、治療性組成物或分裝部分之套組或如請求項23至26中任一項之方法，其中該多價抗體及第二結合分子係作為一單一組成物或作為二種獨立組成物同時投與。
28. 如請求項19至21中任一項之組合、組成物、治療性組成物或分裝部分之套組或如請求項23至26中任一項之方法，其中該多價抗體係在該第二結合分子之前投與。
29. 如請求項19至21中任一項之組合、組成物、治療性組成物或分裝部分之套組或如請求項23至26中任一項之方法，其中該第二結合分子係在該多價抗體之前投與。
30. 一種載體，其包含一編碼如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體之該第一、第二及第三可變域之重鏈可變區的核酸，其中該載體進一步包含一不同的編碼如請求項1至13中任一項中定義之第二結合分子之重鏈可變區的核酸。
31. 一種宿主細胞，其包含一編碼如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體之該第一、第二及第三可變域之重鏈可變區的核酸，其中該宿主細胞進一步包含一不同的編碼如請求項1至13中任一項中定義之第二結合分子之重鏈可變區的核酸。
32. 如請求項31之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步包含一編碼如請求項1至13中任一項中定義之多價抗體之該第一、第二及第三可變域之輕鏈可變區及第二結合分子之輕鏈可變區的核酸。

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