CN104904661B - 一种人源化小鼠 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种人源化小鼠。该人源化小鼠其人源细胞上表达小鼠‑人融合CD47基因如SEQ ID NO.1所示，该基因的胞外部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。本发明转入该小鼠‑人融合CD47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种人源化小鼠，尤其是一种在人源细胞表达人鼠融合CD47基因进而促进人源细胞在小鼠体内正常生长发育并发挥功能的人源化小鼠。
背景技术
人类免疫学、免疫病理学等的研究发现转化为临床疗法时常受到不能直接在人体进行体内实验研究的限制。人类疾病的小鼠模型虽然能提供很多有用信息，但是由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而非人类的灵长类动物研究能够填平物种亲缘关系太远而存在的差别沟壑，但是其使用受限于其高昂的费用、缺乏近交系和伦理问题。在转化医学时代，复杂的生物学机制需要体内实验分析，因此，这就需要一种新的动物模型，该模型要能支持体内人体组织和细胞的研究。人源化小鼠刚好符合这个要求，该模型的使用能获得对很多人类感染和炎症疾病的深入研究。
1988年世上第一个成功地用重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠建立了异基因移植小鼠模型【Mosier DE,et al.Nature 1988；335:256–9.】。目前制作免疫系统人源化小鼠是通过在免疫缺陷小鼠移植人体造血干细胞。常见的受体鼠有NOD-scid IL2rγ-/-小鼠、BALB/c背景的Rag2-/-IL2rγ-/-小鼠和C57BL/6背景的Rag2-/-IL2rγ-/-CD47-/-小鼠【Lavender KJ,et al.Blood.2013,122(25):4013-4020】。通过敲除IL2rγ、Rag2基因或Prkdc基因自然突变能导致免疫功能障碍，使B、T和NK细胞缺失，从而能进行异种移植【Shultz LD,et al.Nat Rev Immunol.2007；7:118–130；Ito M,et al.Blood 2002；100:3175–3182；Shultz LD,et al.J Immunol.2005；174:6477–6489】。
NOD遗传背景的小鼠相对缺乏吞噬细胞活性【Legrand N,et al.J Immunol 2006；176:2053–2058；Shultz LD,et al.J Immunol 1995；154:180–191】，而BALB/c和C57BL/6小鼠吞噬细胞活性较强，阻碍了人源化T、NK细胞的发育。吞噬细胞的活性能通过CD47和SIRPα分子间的相互识别并结合而被抑制【Barclay AN.2009；Curr Opin Immunol 21:47–52】。SIRPα表达在巨噬细胞和树突状细胞上，该分子能识别并结合CD47分子，而CD47分子广泛表达于几乎所有的细胞上【Kharitonenkov A,et al.Nature 1997；386:181–186；SeiffertM,et al.Blood 1999；94:3633–3643；Lindberg FP,et al.J Cell Biol 1993；123:485–496】。不表达CD47的造血细胞会很快被血液中的巨噬细胞和树突状细胞所清除【OldenborgPA,et al.Science 2000；288:2051–2054；Blazar BR,et al.J Exp Med 2001；194:541–550】，因此CD47是一个识别自身细胞的必要标记物。由于人源细胞表达的CD47不同于小鼠CD47，小鼠SIRPα分子不能识别人CD47分子，因此人源细胞容易被小鼠吞噬细胞吞噬，从而使建立人源化小鼠难于成功。基于此，近来针对SIRPα和CD47分子进行了基因修饰来阻止小鼠细胞吞噬人源细胞，比如在人源造血干细胞转入小鼠CD47分子【Legrand N,et al.ProcNatl Acad Sci USA.2011；108(32):13224–13229】，在小鼠转入人SIRPα基因【StrowigT,etal.Proc Natl Acad Sci USA.2011；108(32):13218–13223】，敲除小鼠CD47基因【LavenderKJ,et al.Blood.2013,122(25):4013-4020】等，取得了较好的效果。
尽管在人源细胞表达小鼠CD47能阻止吞噬细胞吞噬人源细胞，但是由于CD47分子本身也是一个信号分子，它不仅能与SIRPα反应，还能与多种其他分子进行反应(如thrombospondin,integrins,其他的SIRP家族成员SIRPγ等)【van Beek EM,et al.JImmunol 2005；175:7781–7787；Sarfati M.et al.Current Drug Targets,2008；9:842-850】，因此，CD47除了作为SIRPα配体而起到识别自我组织的作用外，它还通过与其他配体结合而介导其他许多生理活动，比如影响T细胞功能等(CD47与thrombospondin-1(TSP-1)或可溶性CD47单克隆抗体结合能抑制T细胞功能【Avice MN,et al.J.Immunol.2000；165(8):4624-31；Avice MN,et al.J.Immunol.2001；167(5):2459-68；Li Z,etal.J.Immunol.2001；166(4):2427-36；Waclavicek M,et al.J.Immunol.1997；159(11):5345-54】)、影响细胞自我更新(CD47与配体TSP-1结合后通过抑制c-myc等的表达而影响细胞自我更新等【Kaur S,et al.Sci Rep.2013；3:1673】)、以及影响炎性反应(CD47与CD47单克隆抗体或L-SIRP-alpha结合抑制IL-12R的表达并下调活化的T细胞对IL-12的反应【Latour S,et al.J Immunol.2001；167(5):2547-54.】)。因此CD47不仅仅作为一个与它反应的受体的配体而存在，它本身也是一个信号分子或受体，起到传递胞外信号进细胞的作用。
在现有的制作人源化小鼠技术中，为了不使小鼠巨噬细胞和DC细胞吞噬人源细胞，只是把小鼠CD47基因表达于人源细胞上，该表达于人源细胞上的小鼠CD47分子只是起到让小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不吞噬人源细胞的作用，但是由于小鼠CD47分子与人CD47分子存在差异，很多胞外信号并不能通过小鼠CD47分子被人源细胞感知并触发应有的生理反应，而本身就表达在人源细胞上的人CD47分子对小鼠CD47的配体或受体又不能识别，从而使得人源细胞在小鼠体内缺乏很多需要通过CD47传递的胞外信号的刺激，细胞外的信息不能畅达至细胞内，从而影响到人源细胞在小鼠体内生长发育的正常进行与功能的正常发挥。这一点已经被我们实验所证实，比如在表达了小鼠CD47的人源T细胞，小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体不能抑制该人源T细胞的功能，而对于小鼠T细胞则其功能能被小鼠TSP-1或可溶性CD47单克隆抗体抑制，说明在人源细胞表达的小鼠CD47不能把胞外信息顺利传递到人源细胞内部。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有制备人源化小鼠技术的在人源细胞表达的小鼠CD47不能顺畅地把胞外信号进传递入胞内的缺点，本发明通过基因改建提供一种人源化小鼠，该小鼠不仅能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞噬人源细胞，而且能使人源细胞在小鼠体内获得正常的胞外信息，促进其在小鼠体内进行正常的生长发育并发挥功能，从而提高人源化小鼠的应用价值。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明的人源化小鼠，其人源细胞上表达小鼠-人融合CD47基因，该基因的胞外部分为小鼠CD47序列，而穿膜部分和胞内部分为人CD47序列；或者胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列。
本发明的人源化小鼠，人源细胞上表达的融合CD47分子，其胞外部分能被小鼠SIRPα、TSP-1及其他小鼠CD47的配体或受体所识别，胞内部分能很好地把胞外所受到的信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞噬，又能使人源细胞在小鼠体内环境下获得正常的胞外信息的目的。
本发明的有益效果是转入该小鼠-人融合CD47基因的人源细胞，在不被小鼠吞噬细胞吞噬的同时，能使小鼠体内环境下胞外信息传递到人源细胞并被人源细胞所感知并作出应有反应，使人源化小鼠中的人源细胞正常生长发育并发挥功能。
附图说明
图1是本发明融合CD47的载体质粒图，其中各元件如下：
| 元件 | 功能 |
| Pcmv/5’LTR | 启动转录整个病毒RNA |
| CAG | 启动转录下游基因 |
| Fused CD47 | 小鼠-人融合基因 |
| IRES | 内部核糖体进入位点，启动下游GFP基因翻译 |
| copGFP | 绿色荧光蛋白基因，筛选基因 |
| WPRE | 提高病毒转录本的稳定性 |
| 3’ΔLTR | 终止转录 |
| Ori | Col E1中复制起始点 |
| AMPr | 氨苄青霉素抗性基因 |
图2是经免疫接种灭活的白色念珠菌3天后，对照人源化小鼠(人源细胞表达小鼠CD47)和融合CD47人源化小鼠(人源细胞表达小鼠-人融合CD47)中人源CD4和白介素4双阳性细胞白介素表达强度的比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明(下面序列ID 1是本发明融合CD47序列)。
1、人-鼠CD47融合基因的构建
首先，小鼠CD47(如GENBANK accession number:AB012693)的第1至第142氨基酸残基与人CD47(如GENBANK accession number:BT006907)的第145至305氨基酸残基融合在一起，相对应的核苷酸序列为序列ID 1。根据该设计好的序列，在5’端ATG前加上三个保护核苷酸和XbaI限制性内切酶识别序列以及Kozak序列GCCACC，在终止密码子后加上BglII限制性内切酶识别序列和三个保护核苷酸。该序列DNA委托生物技术公司合成。
以上合成好的DNA经BglII和XbaI酶切，分离片段后克隆入慢病毒表达载体多克隆位点相应的酶切点间。图1为融合CD47载体质粒图。
2、慢病毒的制备
将293T细胞培养在6孔细胞培养板中的改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium，DMEM)完全培养基(在DMEM完全培养基中添加10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺等)中(37℃,5﹪CO2)，待细胞90﹪汇合时，用含5﹪FBS、不含抗生素的DMEM新鲜培养基替换掉老培养基，每孔加1.5ml培养基，放入37℃,5﹪CO培养箱备用。取两个1.5ml离心管，每管加入预先37℃加热的OPTI-MEM培养基250μl，然后在其中一管中加入经纯化的2.5μg上述构建好的慢病毒CD47融合蛋白表达载体质粒(或作为对照的慢病毒小鼠CD47表达载体质粒)以及VSV-G质粒和包装质粒，混匀，常温5分钟；同时在另一管中加入Lipofectamine 2000脂质体5μl，混匀，常温5分钟。把两管内容物加在一起混匀，常温放置20分钟，然后加到细胞培养孔中，轻轻摇晃均匀，然后置于37℃,5﹪CO2培养，6小时后用新鲜完全DMEM培养基(在DMEM培养基中添加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺等)置换掉老培养基，再培养约30个小时后收集上清液，500g离心5分钟，取上清，-80度保存备用。
3、人CD34造血干细胞分离、病毒感染及移植
从产妇获取新鲜脐带血，按照CD34磁珠分离试剂盒(STEM CELL公司)产品使用说明进行CD34阳性细胞分离。分离后的CD34阳性细胞培养于添加有100纳克/毫升人干细胞因子(rhSCF)、100纳克/毫升Flt3配体(Flt3-L)、50纳克/毫升促血小板生成素(Tpo)的完全培养基【含有15％胎牛血清、2毫摩尔/升谷氨酰胺、0.1毫摩尔/升非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素(100x,Gibco)的高糖改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)】，48小时后用制备好的慢病毒上清液进行病毒感染，感染方法为离心感染法，即在细胞中加好含有6微克每毫升polybrene的病毒上清液，然后在离心机上900g离心45分钟，连续两天进行两次离心感染。第二次感染后换上新鲜含有细胞因子的完全培养基，培养24小时后进行GFP阳性细胞流式细胞仪筛选，筛选出的GFP阳性细胞进行移植。移植前免疫缺陷的受体小鼠(BALB/c Rag2-/-IL2rγ-/-小鼠)经不同剂量137Cs源放射线照射或不照射，从尾静脉注入感染好的CD34阳性骨髓细胞。
4、移植后免疫应答
移植后6周测定小鼠外周血人源细胞比例，人源细胞表达小鼠CD47的人源化小鼠(对照人源化小鼠)和人源细胞表达小鼠-人融合CD47的人源化小鼠(融合CD47人源化小鼠)中人源细胞比例分别为62.9±23.6％和67.4±20.2％，两者无显著差别。
挑选人源细胞达到80％以上的人源化小鼠，接种5×105灭活的白色念珠菌来免疫小鼠。接种后3天，从小鼠取出脾脏细胞，用红细胞裂解液去除红细胞，用1％胎牛血清的PBS洗两遍，然后用FITC标记的抗CD4抗体和APC标记的抗人CD45抗体对脾脏白细胞冰上孵育30分钟，然后用含1％胎牛血清的PBS洗两遍，然后在固定-透膜剂(Cytofix/Cytoperm)中固定和透膜15分钟，用透膜冲洗液冲洗两遍，然后用PE标记的抗白介素4(anti-IL-4)抗体在冰上标记30分钟，细胞用含1％胎牛血清的PBS洗两遍，重悬于400μl的PBS中，上流式细胞仪进行检测。结果见图2，对照人源化小鼠的人源CD4和白介素4双阳性细胞表达的白介素4显著小于融合CD47人源化小鼠的人源CD4和白介素4双阳性细胞，提示后者有更好的体液免疫应答。
本发明上述融合CD47DNA序列，如SEQ ID NO.1所示，具体是：
ATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCTGCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGTAACGTCAACTCCATAGAGTTCACTTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAGGCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCGTATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCACTACTACAGATCAAAACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGCCTCTTTGAAAATGGATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGCGAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAAAACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAAGATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTTGCTATACTCCTGTTCTGGGGACAGTTTGGTATTAAAACACTTAAATATAGATCCGGTGGTATGGATGAGAAAACAATTGCTTTACTTGTTGCTGGACTAGTGATCACTGTCATTGTCATTGTTGGAGCCATTCTTTTCGTCCCAGGTGAATATTCATTAAAGAATGCTACTGGCCTTGGTTTAATTGTGACTTCTACAGGGATATTAATATTACTTCACTACTATGTGTTTAGTACAGCGATTGGATTAACCTCCTTCGTCATTGCCATATTGGTTATTCAGGTGATAGCCTATATCCTCGCTGTGGTTGGACTGAGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCAATGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTTTGAGTATCTTAGCTCTAGCACAATTACTTGGACTAGTTTATATGAAATTTGTGGAATAACTGAAGTGAAGTGATGGACTCCGATTTGGAGAGTAG
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 王彦刈
<120> 一种人源化小鼠
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgtggccct tggcggcggc gctgttgctg ggctcctgct gctgcggttc agctcaacta 60
ctgtttagta acgtcaactc catagagttc acttcatgca atgaaactgt ggtcatccct 120
tgcatcgtcc gtaatgtgga ggcgcaaagc accgaagaaa tgtttgtgaa gtggaagttg 180
aacaaatcgt atattttcat ctatgatgga aataaaaata gcactactac agatcaaaac 240
tttaccagtg caaaaatctc agtctcagac ttaatcaatg gcattgcctc tttgaaaatg 300
gataagcgcg atgccatggt gggaaactac acttgcgaag tgacagagtt atccagagaa 360
ggcaaaacag ttatagagct gaaaaaccgc acggtttcgt ggttttctcc aaatgaaaag 420
atcctcattg ttattttccc aatttttgct atactcctgt tctggggaca gtttggtatt 480
aaaacactta aatatagatc cggtggtatg gatgagaaaa caattgcttt acttgttgct 540
ggactagtga tcactgtcat tgtcattgtt ggagccattc ttttcgtccc aggtgaatat 600
tcattaaaga atgctactgg ccttggttta attgtgactt ctacagggat attaatatta 660
cttcactact atgtgtttag tacagcgatt ggattaacct ccttcgtcat tgccatattg 720
gttattcagg tgatagccta tatcctcgct gtggttggac tgagtctctg tattgcggcg 780
tgtataccaa tgcatggccc tcttctgatt tcaggtttga gtatcttagc tctagcacaa 840
ttacttggac tagtttatat gaaatttgtg gaataactga agtgaagtga tggactccga 900
tttggagagt ag 912
Claims (3)
1.一种生成人源化小鼠的方法，其特征在于该方法包含生成人源细胞上表达小鼠-人融合CD47基因的人源化小鼠；其人源细胞上表达的小鼠-人融合CD47基因，胞外部分为小鼠CD47氨基酸序列，穿膜部分和胞内部分为人CD47氨基酸序列；其人源细胞上表达的小鼠-人融合CD47基因如SEQ ID NO.1所示，为小鼠CD47的第1至第142氨基酸残基与人CD47的第145至305氨基酸残基融合在一起。
2.一种生成人源化小鼠的方法，其特征在于该方法包含生成人源细胞上表达小鼠-人融合CD47基因的人源化小鼠；其人源细胞上表达的小鼠-人融合CD47基因，胞外部分和穿膜部分为小鼠CD47氨基酸序列，胞内部分为人CD47氨基酸序列；其人源细胞上表达的小鼠-人融合CD47基因如SEQ ID NO.1所示，为小鼠CD47的第1至第142氨基酸残基与人CD47的第145至305氨基酸残基融合在一起。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于人源化小鼠，人源细胞上表达的融合CD47基因，其胞外部分能被小鼠SIRPα、TSP-1及其他小鼠CD47的配体或受体所识别，胞内部分能很好地把胞外所受到的信号让人源细胞感知并作出应有的反应，达到既能使小鼠吞噬细胞识别人源细胞为自身细胞而不再吞噬，又能使人源细胞在小鼠体内环境下获得正常的胞外信息的目的。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20180222 Address after: Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 310000 West No. 1500 Building No. 2 room 716 Applicant after: Hangzhou positive Biotechnology Co., Ltd. Address before: Room 704, unit 704, No. 13, Changning street, Xiacheng City, Zhejiang, Zhejiang Applicant before: Wang Yanyi |
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| GR01 | Patent grant | ||
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