CN103804495A - 抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 - Google Patents
抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103804495A CN103804495A CN201210440978.0A CN201210440978A CN103804495A CN 103804495 A CN103804495 A CN 103804495A CN 201210440978 A CN201210440978 A CN 201210440978A CN 103804495 A CN103804495 A CN 103804495A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- constant region
- gene
- genetic engineering
- divalence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物,该抗肿瘤基因工程二价类抗体包括恒定区以及与恒定区连接的SIRPα和B7。该抗肿瘤基因工程抗体的制备方法包括:获取恒定区基因、SIRPα基因和B7基因;构建包括上述三种基因的表达质粒;将表达质粒转染至表达细胞株中进行培养;分离纯化后得到二价类抗体。本发明的二价类抗体同时具有可分别与肿瘤细胞上的CD47位点和淋巴细胞上的CD28位点特异性结合的SIRPα和B7,特异性结合作用显著增强,可以实现双重抑制机体肿瘤细胞的能力;本发明的制备方法工艺简单、切实可行;具有二价类抗体的抗肿瘤基因工程药物可有效作用于肿瘤细胞,并有效预防和治疗肿瘤疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,涉及抗肿瘤基因工程抗体,更具体地,涉及抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物。
背景技术
CD47又称整联蛋白相关蛋白(integrinassociated protein,IAP),其配体为信号调节蛋白α链(signal regulatory protein alpha,SIRPα)。CD47通过与SIRPα结合可产生抑制性信号来降低吞噬细胞(单核细胞及巨噬细胞)的吞噬活性,进而对免疫系统产生抑制作用。在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性疾病的研究中,发现肿瘤细胞存在CD47的升高,且CD47高表达提示临床预后不良,一些类型的肿瘤干细胞中亦存在CD47的过表达。肿瘤细胞借CD47-SIRPα通道,产生“别吃我”信号,从而逃避免疫系统的自我监测。使用抗CD47抗体,通过阻断CD47-SIRPα通道抑制细胞吞噬的作用,能够显著增强了机体免疫系统能力,达到抗肿瘤的目的。有文献表明使用抗CD47单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌等肿瘤也获得了一定的疗效。
共刺激分子B7/CD28在T淋巴细胞的激活方面有着重要的作用,他们可提供激活T淋巴细胞的正性信号来刺激T淋巴细胞分泌细胞因子、促进T淋巴细胞分化,同时也已证实CD28广泛表达于T淋巴细胞。CD28与APC上的B7结合后,为T淋巴细胞提供共刺激信号。它们的结合对初次免疫应答的诱导是必需的,主要涉及树突状细胞与T淋巴细胞相互作用的起始阶段,该信号修饰和补充TCR信号,并将多种信号整合后,起着信号传递、增强或放大免疫应答的作用,因此可以利用B7/CD28的这一性质来促进免疫反应,达到治疗肿瘤的目的。有文献表明B7-FC融合蛋白同样可以有效激活、增强T淋巴细胞的免疫功能。
目前已经出现的一些抗肿瘤抗体主要是通过单独与CD47结合,或者单独与CD28结合,通过增强机体免疫系统能力,达到抗肿瘤的目的。但是单一结合位点与肿瘤细胞的特异性结合作用有限,对肿瘤的防治效果不明显。SIRPα分子具有高度的亲嗜性,可选择性地与肿瘤细胞CD47分子结合,共刺激分子B7可选择性地与T淋巴细胞CD28分子结合,本发明的二价类抗体同时具有上述可分别与肿瘤细胞上的CD47位点和T淋巴细胞上的CD28位点特异性结合的SIRPα和B7,特异性结合作用显著增强,可以实现双重增强机体清除肿瘤细胞的能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,针对现有技术中的抗肿瘤抗体与肿瘤细胞的特异性结合作用有限、对肿瘤的防治效果不明显的缺陷,提供一种可同时与肿瘤细胞和T淋巴细胞特异性结合、有效预防和治疗肿瘤感染的抗肿瘤基因工程二价类抗体及抗肿瘤基因工程药物。
本发明的另一目的在于,提供一种工艺简单、便于实施的上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法。
本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现:提供一种抗肿瘤基因工程二价类抗体,所述二价类抗体包括两个可变区和将所述两个可变区连接在一起的恒定区,所述两个可变区分别为SIRPα和B7;所述恒定区为柔性连接肽、或者所述恒定区为人抗体的恒定区。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中,所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No:16所示的氨基酸序列,所述人抗体的恒定区为具有激活人体免疫功能的抗体Fc片段。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中,所述人抗体的恒定区为IgG抗体的恒定区、IgA抗体的恒定区或IgM抗体的恒定区。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体中,所述SIRPα和所述B7分别通过柔性连接肽与所述人抗体的恒定区柔性连接,所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面,提供一种上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法,其中,所述方法包括以下步骤:
A:分别获取恒定区基因、SIRPα基因和B7基因;
B:当所述恒定区基因为人抗体的恒定区基因时,采用真核表达载体构建包括人抗体的恒定区基因、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;
或者,当所述恒定区基因为柔性连接序列时,采用原核表达载体或所述真核表达载体构建包含柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;
C:将步骤B中形成的表达质粒转染至表达细胞株中进行培养,稳定表达二价类抗体;
D:离心收集上清或细胞进行纯化后得到所述二价类抗体。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法中,在步骤B中,所述人抗体的恒定区基因为IgG抗体的恒定区基因、IgA抗体的恒定区基因或IgM抗体的恒定区基因;所述柔性连接序列具有以下核苷酸序列:GAA TGT TCC。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法中,在步骤B中,所述真核表达载体为pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1;所述原核表达载体为pET28a、pGEX-4T-1或pTrxA。
在上述抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法中,在步骤C中,所述表达细胞株为293细胞、293T细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
根据本发明的另一方面,提供一种抗肿瘤基因工程药物,其中,所述抗肿瘤基因工程药物含有上述抗肿瘤基因工程二价类抗体。
实施本发明的技术方案,可以获得以下技术效果:本发明的二价类抗体同时具有可与肿瘤细胞上的CD47位点和T淋巴细胞上的CD28位点特异性结合的SIRPα和B7,不仅特异性结合作用显著增强,而且可以通过抑制吞噬细胞的吞噬活性和激活淋巴细胞两种途径实现双重阻止肿瘤细胞感染宿主细胞的作用;本发明的制备方法工艺简单、切实可行;具有本发明的二价类抗体的抗肿瘤基因工程药物可有效作用于肿瘤细胞,从而有效预防和治疗肿瘤细胞感染。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明的抗肿瘤基因工程二价类抗体(以下简称二价类抗体)为恒定区分别同时与SIRPα和B7连接形成的类抗体,这样构建的二价类抗体具有阻止肿瘤细胞感染宿主细胞的双重作用,可有效治疗和预防肿瘤细胞感染。当恒定区采用柔性连接肽时,所构建的二价类抗体生物活性高、治疗和预防肿瘤细胞感染的效果显著。当恒定区采用人抗体的恒定区时,SIRPα和B7主要是替换了人抗体的可变区,并通过柔性连接肽与人抗体的恒定区连接,这样构建的二价类抗体的主要部分仍为人抗体的恒定区,因此减少了异源性抗体的免疫原性,同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。不仅如此,人抗体的恒定区为具有激活人体免疫功能的抗体Fc片段,其可执行病毒清除功能,进一步完善该二价类抗体对肿瘤细胞造成的感染的预防和治疗功效。
本发明的抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法包括以下步骤:A:分别获取恒定区基因、SIRPα基因和B7基因;B:当所述恒定区基因为人抗体的恒定区基因时,采用真核表达载体构建包括人抗体的恒定区基因、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;或者,当所述恒定区基因为柔性连接序列时,采用原核表达载体或所述真核表达载体构建包含柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;C、将步骤B中形成的表达质粒转染至表达细胞株中进行培养,稳定表达二价类抗体;D、离心收集上清或细胞进行纯化后得到二价类抗体。通过细胞株表达可获得同时具有SIRPα和B7的二价类抗体,该方法操作简便、便于实现上述二价类抗体的扩大化生产。
进一步地,上述步骤A具体包括以下步骤:
A1:人抗体的恒定区基因的钓取:
设计合适的引物,从人血细胞cDNA中钓取人抗体的恒定区基因。由于恒定区基因非常保守,人抗体的恒定区基因的钓取比较容易。在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(IMGT)等数据库中,很容易找到人抗体的恒定区基因序列以及引物。在选择人抗体的恒定区基因时,本发明优选使用IgG抗体的恒定区基因、IgA抗体的恒定区基因或IgM抗体的恒定区基因(这样最后制备得到的二价类抗体分别优选具有IgG抗体的恒定区、IgA抗体的恒定区和IgM抗体的恒定区)。以下则通过IgG抗体的恒定区基因展开详细叙述。优选采用IgG1抗体,特别优选地,使用IgG1抗体的亚类κ型,以有效发挥其生物学功能并延长其在人体内的半衰期。
IgG1抗体的恒定区基因的钓取:在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(IMGT)等数据库中查找人IgG1恒定区基因序列,设计含有酶切位点的上游和下游引物,分别为:
上游引物的引物序列1:5’-AAT CTC GAG GTC TCC TCA GCC TCC ACCAAG-3’,
下游引物的引物序列2:5’-ATC TCT GAG TTTACC CGG AGA CAG GGAGAG-3’,
分别引入了Xho I和Xba I酶切位点。
A2:SIRPα基因的钓取:
在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(IMGT)等数据库中查找SIRPα基因序列(人SIRPα基因序列),截取其表达在胞外的部分功能序列,并设计含有酶切位点的上下游引物,其中下游引物中引入柔性连接序列(GAA TGT TCC),所述上游和下游引物具体为:
上游引物的引物序列3:5’-GTG GAA TTC ATG GAG CCC GCC GGC CCGGCC-3’,
下游引物的引物序列4:5’-ATC CTC GAG GGA ACA TTC CTT CCT CGGGAC CTG GAC GCT-3’,
分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点。
A3:B7基因的钓取:
在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(IMGT)等数据库中查找B7基因序列(人B7基因序列),选择其表达在胞外的最后一个环状区域及后面部分的功能蛋白序列,并设计含有酶切位点的上游和下游引物,其中下游引物中引入柔性连接序列(GAA TGT TCC),所述上游和下游引物分别为:
上游引物的引物序列5:5’-GTG GAA TTC ATG GGC CAC ACA CGGAGG CAG-3’,
下游引物的引物序列6:5’-ATC CTC GAG GGA ACA TTC TAC AGG GCGTAC ACT TTC CCT-3’,
分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点。
A4:柔性连接序列的构建:
为了使重组抗体形成类似天然的抗体结构,引入柔性连接序列,将IgG1抗体的恒定区基因与SIRPα基因和B7基因连接,可以促进重组抗体以二硫键的形式形成天然结构的抗体分子。柔性连接序列在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(IMGT)等数据库中,以人IgG1轻链分子与IgG1重链分子相结合的部位,设计引物如下:
上游引物的引物序列7:5’-GAA GTC ACC CAT CAG GGC-3’;
下游引物的引物序列8:5’-ACA CTC TCC CCT GTT GAA-3’
A5:IgG1抗体的恒定区基因、柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因的PCR扩增:
从人新鲜血样中提取总RNA,反转录成人cDNA,以人cDNA为模板,以IgG1抗体的恒定区基因、柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因各自的上游和下游引物分别扩增,各自得到约1000bp、60bp、1500bp和800bp大小的基因片段。随后,将扩增得到的基因片段分别装入T载体,经基因测序分析证实各基因片段为所需要的目的基因。
成功获取所需的各基因片段后,构建符合要求的表达质粒并转染至表达细胞株中培养。为便于多方面考察本发明的二价类抗体的可行性和实际应用方面的可靠性,本发明采用以下真核表达载体pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TOTOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1,以及以下原核表达载体:pET28a、pGEX-4T-1或pTrxA。另外,由于基因工程抗体的表达水平主要取决于表达载体的宿主细胞(表达细胞株),因此,适用于本发明的表达细胞株的选取也比较重要。对于本研究的二价类抗体,哺乳动物细胞表达系统是最佳的选择。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确空间结构所必需的分子伴侣和折叠酶,其内质网为抗体分子正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化还原环境。此外,哺乳动物细胞表达系统还拥有完整的转录和转录后、翻译和翻译后修饰、信号肽的剪切以及糖基化等优势,使表达的抗体空间结构近似于天然,有利于发挥其生物学功能,并延长其在体内的半衰期。本发明可选用293细胞、293T细胞(又称为人肾上皮细胞系Flp-In T-Rex 293)或中国仓鼠卵巢细胞,并优选使用293细胞作为表达载体的宿主细胞,来建立起SIRPα-B7-二价类抗体稳定表达的293细胞。考虑到表达的稳定,染色体整合式表达系统将被采用。
以下实施例将详细说明如何采用获得的基因片段制备本发明的二价类抗体。其中,实施例1-4为采用人抗体的恒定区作为恒定区的具体示例,实施例5-8为采用柔性连接肽作为恒定区的具体示例。
实施例1:
将IgG1抗体的恒定区基因的PCR产物经Xho I和Xba I酶切后装入同样酶切的真核表达载体pCDNA3.1/His C中,构建成含有IgG1抗体的恒定区基因的重组质粒pCDNA3.1/His C-IgG;将经PCR扩增的SIRPα基因和B7基因克隆至含有IgG1抗体的恒定区基因的重组质粒pCDNA3.1/His C-IgG中,构建成含有IgG1抗体的恒定区基因与SIRPα基因和B7基因柔性连接的真核表达质粒pCDNA3.1/His C-SIRPα-IgG和pCDNA3.1/His C-B7-IgG。具体地,通过柔性连接序列(GAA TGT TCC)实现上述柔性连接。
采用293细胞作为表达细胞株,提取高质量高浓度的真核表达质粒pCDNA3.1/His C-SIRPα-IgG和pCDNA3.1/His C-B7-IgG,利用脂质体转染法,将上述质粒分别转染到293细胞中,48小时后用四环素诱导,收集细胞并裂解。采用HIS binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST后再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μlTBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用人FC抗体进行检测,反应2小时后,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
实施例2:
设计引物,引物序列9为:5’-CTT AAG CTT ACC ATG GGG GGT TCT-3’,从实施例1的真核表达质粒pCDNA3.1/His C-SIRPα-IgG和pCDNA3.1/HisC-B7-IgG中扩增出真核表达载体pCDNA3.1/His C带有选择标签(6×His标签和Xpress Epitop标签)的SIRPα-IgG和B7-IgG基因,将这两个基因装入pCDNA5/FRT/TO TOPO TA的真核载体中,得到真核表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-SIRPα-IgG和pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-B7-IgG。
采用人肾上皮细胞系Flp-In T-Rex 293作为表达细胞株,建立稳定高表达的细胞株,提取高质量高浓度的真核表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPOTA-SIRPα-IgG和pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-B7-IgG,利用脂质体转染法,将质粒分别转染到Flp-In T-Rex 293细胞中,24小时后采用抗生素Blasticidin B进行抗性筛选,10天后,用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株,并进行大量细胞培养,用四环素诱导,收集细胞并裂解,采用HIS binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μlTBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用人FC抗体进行检测,反应2小时后,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
实施例3:
设计引物,引物序列10为:5’-AAT GTC GAC AGA TCT GC GGT CCGGCG CGG AAC CAG TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3’,将实施例2中的SIRPα-IgG和B7-IgG基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,其中引物序列中引入凝血酶蛋白切割位点,以便将目的抗体与荧光蛋白切开。利用引物序列9和引物序列10以质粒pCDNA3.1/His C-SIRPα-IgG和pCDNA3.1/HisC-B7-IgG为模板,扩增出带有选择标签(6×His标签和Xpress Epitop标签)的SIRPα-IgG和B7-IgG基因,将这两个基因装入载体pEGFP-N1中,得到真核表达质粒pEGFP-N1-SIRPα-IgG和pEGFP-N1-B7-IgG。
采用293细胞作为表达细胞株,提取高质量高浓度的真核表达质粒pEGFP-N1-SIRPα-IgG和pEGFP-N1-B7-IgG,利用脂质体转染法,将上述质粒分别转染到293细胞中,24小时后采用抗生素G418进行抗性筛选,10天后,用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株,并进行大量细胞培养,收集细胞并裂解,采用HIS binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用His单抗做为一抗,反应2小时后,TBST洗涤,加上兔抗鼠二抗反应一小时,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。。
实施例4:
设计引物,引物序列11为:5’-CTT AA GCTT C ATG GGG GGT TCT CATCAT-3’,引入Hind III和Xba I酶切位点,将实施例2的SIRPα-IgG基因克隆至真核表达载体pBudce4.1中的CMV启动子。设计引物序列12:5’-GCTGCGGCCGC ATG GGG GGT TCT CAT CAT-3’,设计引物序列13:5’-TCGAGA GAT TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG-3’,引入Not I和Bgl II酶切位点,将实施例2的B7-IgG基因克隆至真核表达载体pBudce4.1中的EF-1α启动子。然后利用PCR的方法将含有SIRPα-IgG的CMV启动子区域及含有B7-IgG的EF-1α启动子区域拼接起来,装入pCDNA5/FRT/TO TOPO TA的真核载体中,得到表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-SIRPα-IgG-B7-IgG。
采用中国仓鼠卵巢细胞作为表达细胞株,建立稳定高表达的细胞株,提取高质量高浓度的真核表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPOTA-SIRPα-IgG-B7-IgG,利用脂质体转染法,将质粒分别转染到中国仓鼠卵巢细胞中,24小时后采用抗生素Blasticidin B进行抗性筛选,10天后,用96孔板稀释法筛选得到稳定表达的细胞株,并进行大量细胞培养,用四环素诱导,收集细胞并裂解,采用HIS binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用人FC抗体进行检测,反应2小时后,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
实施例5:
设计引物,引物序列14为:5’-GTG CTC GAG ATG GGC CAC ACA CGGAGG CAG-3’,下游引物的引物序列15:5’-ATC TCT GAG GGA ACA TTC TACAGG GCG TAC ACT TTC CCT-3’,引入Xho I和Xba I酶切位点,将SIRPα基因和B7基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His C中,得到pCDNA3.1/HisC-SIRPα-B7表达质粒,SIRPα基因和B7基因以柔性连接序列(GAA TGTTCC)连接。
采用293细胞作为表达细胞株,建立稳定高表达的细胞株,提取高质量高浓度的真核表达质粒pCDNA3.1/His C-SIRPα-B7;利用脂质体转染法,将上述表达质粒分别转染到293细胞中,48小时后收集细胞,裂解细胞,采用HISbinds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用His单抗做为一抗,反应2小时后,TBST洗涤,加上兔抗鼠二抗反应一小时,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
除了采用实施例5的pCDNA3.1/His C表达载体外,也可采用上述实施例2-3中的真核表达质粒pCDNA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-N1和pBudce4.1中,具体真核表达质粒的构建和转染过程与实施例5相同。
实施例6:
利用原核表达系统,使用分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的SIR Pα基因、分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的B7基因、以及分别引入了EcoRI和Xba I酶切位点的SIRPα-B7基因;以EcoR I和Xho I双酶切SIRPα基因和B7基因,同时以EcoR I和Xho I双酶切pET28a载体,构建pET28a-SIRPα原核表达质粒和pET28a-B7原核表达质粒;以EcoR I和Xba I双酶切SIRPα-B7基因,同时以EcoR I和Xba I双酶切pET28a载体,构建pET28a-SIRPα-B7原核表达质粒。将上述原核表达质粒pET28a-SIRPα、pET28a-B7和pET28a-SIRPα-B7转化于表达菌株Rosstta中,培养细菌OD值达0.6时,采用IPTG诱导表达,收集细胞并裂解,采用HIS binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μl TBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用His单抗做为一抗,反应2小时后,TBST洗涤,加上兔抗鼠二抗反应一小时,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
实施例7:
利用原核表达系统,使用分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的SIR Pα基因、分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的B7基因、以及分别引入了EcoRI和Xba I酶切位点的SIRPα-B7基因;以EcoR I和Xho I双酶切SIRPα基因和B7基因,同时以EcoR I和Xho I双酶切pGEX-4T-1载体,构建pGEX-4T-1-SIRPα原核表达质粒和pGEX-4T-1-B7原核表达质粒;以EcoR I和Xba I双酶切SIRPα-B7基因,同时以EcoR I和Xba I双酶切pGEX-4T-1载体,构建pGEX-4T-1-SIRPα-B7原核表达质粒。将上述原核表达质粒pGEX-4T-1-SIRPα、pGEX-4T-1-B7和pGEX-4T-1-SIRPα-B7转化于表达菌株Rosstta中,培养细菌OD值达0.6时,采用IPTG诱导表达,收集细胞并裂解,采用GCT binds进行抗体提纯,取30μl HIS binds,加入TBST洗涤三次,去尽TBST,再加入300μlTBST溶液,加入细胞裂解液50μl,4℃轻轻摇动2-3小时,去尽上清,加入1000μl TBST溶液洗涤三次,去尽上清,加入20μl TBST和20μl蛋白上样loading buffer于95℃温度上变性5分钟后,进行SDS-PAGE电泳,转膜后进行Western Blot检测,采用GST单抗做为一抗,反应2小时后,TBST洗涤,加上兔抗鼠二抗反应一小时,ECL显色,可以清楚检测到目的蛋白的表达。
实施例8:
利用原核表达系统,使用分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的SIR Pα基因、分别引入了EcoR I和Xho I酶切位点的B7基因、以及分别引入了EcoRI和Xba I酶切位点的SIRPα-B7基因;以EcoR I和Xho I双酶切SIRPα基因和B7基因,同时以EcoR I和Xho I双酶切pTrxA载体,构建pTrxA-SIRPα原核表达质粒和pTrxA-B7原核表达质粒;以EcoR I和Xba I双酶切SIRPα-B7基因,同时以EcoR I和Xba I双酶切pTrxA载体,构建pTrxA-SIRPα-B7原核表达质粒。将上述原核表达质粒pTrxA-SIRPα、pTrxA-B7和pTrxA-SIRPα-B7转化于表达菌株Rosstta中,培养细菌OD值达0.6时,采用IPTG诱导表达,以SDS-PAGE电泳检测蛋白表达,后续提取蛋白进行Western Blot检测。
上述步骤D中,对实施例1-8的二价类抗体进行纯化包括通过离心收集上清或细胞,然后通过G蛋白柱层析分离出IgG1抗体,最后通过SIRPα或B7的亲和层析分离出SIRPα-B7-二价类抗体。
本发明所制备得到的抗肿瘤基因工程二价类抗体可制成抗肿瘤基因工程药物,然后用于人对肿瘤感染的预防和治疗。或者也可以通过特定载体将本发明所制备得到的抗肿瘤基因工程二价类抗体导入人体中,在人体内表达,从而产生预防和治疗肿瘤感染的效果。另外,由于所述二价类抗体内还包含有抗体Fc片段。因此,除了上述对肿瘤感染的预防和治疗外,还具有肿瘤感染的诊断功能。
综上所述,本发明的抗肿瘤基因工程二价类抗体由于同时具有可与肿瘤细胞上的CD47位点和T淋巴细胞上的CD28位点特异性结合的SIRPα和B7,特异性结合作用显著增强,并因此可以实现双重阻止肿瘤细胞感染宿主细胞的作用;本发明的制备方法工艺简单、切实可行;具有本发明的二价类抗体的抗肿瘤基因工程药物可有效作用于肿瘤细胞,从而有效预防和治疗肿瘤细胞感染。
Claims (9)
1. 一种抗肿瘤基因工程二价类抗体,包括两个可变区和将所述两个可变区连接在一起的恒定区,其特征在于,所述两个可变区分别为SIRPα和B7;所述恒定区为柔性连接肽、或者所述恒定区为人抗体的恒定区。
2. 根据权利要求1所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体,其特征在于,所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No:16所示的氨基酸序列,所述人抗体的恒定区为具有激活人体免疫功能的抗体Fc片段。
3. 根据权利要求1或2所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体,其特征在于,所述人抗体的恒定区为IgG抗体的恒定区、IgA抗体的恒定区或IgM抗体的恒定区。
4. 根据权利要求1或2所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体,其特征在于,所述SIRPα和所述B7分别通过所述柔性连接肽与所述人抗体的恒定区柔性连接,所述柔性连接肽具有序列表中的SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
5. 一种权利要求1或2中抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
A:分别获取恒定区基因、SIRPα基因和B7基因;
B:当所述恒定区基因为人抗体的恒定区基因时,采用真核表达载体构建包括人抗体的恒定区基因、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;
或者,当所述恒定区基因为柔性连接序列时,采用原核表达载体或所述真核表达载体构建包含柔性连接序列、SIRPα基因和B7基因的表达质粒;
C:将步骤B中形成的表达质粒转染至表达细胞株中进行培养,稳定表达二价类抗体;以及
D:离心收集上清或细胞进行纯化后得到所述二价类抗体。
6. 根据权利要求5所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法,其特征在于,在步骤B中,所述人抗体的恒定区基因为IgG抗体的恒定区基因、IgA抗体的恒定区基因或IgM抗体的恒定区基因;所述柔性连接序列具有以下核苷酸序列:GAA TGT TCC。
7. 根据权利要求5所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法,其特征在于,在步骤B中,所述真核表达载体为pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/TO TOPO TA、pEGFP-N1或pBudce4.1;所述原核表达载体为pET28a、pGEX-4T-1或pTrxA。
8. 根据权利要求5所述的抗肿瘤基因工程二价类抗体的制备方法,其特征在于,在步骤C中,所述表达细胞株为293细胞、293T细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
9.一种抗肿瘤基因工程药物,其特征在于,所述抗肿瘤基因工程药物含有权利要求1或2中的抗肿瘤基因工程二价类抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210440978.0A CN103804495A (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210440978.0A CN103804495A (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103804495A true CN103804495A (zh) | 2014-05-21 |
Family
ID=50701923
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210440978.0A Pending CN103804495A (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103804495A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104904661A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-09-16 | 王彦刈 | 一种人源化小鼠 |
JP2017510249A (ja) * | 2014-03-24 | 2017-04-13 | イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ (シャンハイ) カンパニー リミテッド | 新規組換え二機能性融合タンパク質、それらの調製および使用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002099119A2 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | Bristol-Myers Squibb Company | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
CN101896504A (zh) * | 2007-12-21 | 2010-11-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 二价双特异性抗体 |
CN102190729A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-21 | 苏州大学 | 抗人cd80双价抗体及其应用 |
CN102596233A (zh) * | 2009-05-15 | 2012-07-18 | 大学健康网络 | 用于以SIRPα-CD47的相互作用为靶标治疗血液癌症的组合物和方法 |
-
2012
- 2012-11-07 CN CN201210440978.0A patent/CN103804495A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002099119A2 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | Bristol-Myers Squibb Company | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
CN101896504A (zh) * | 2007-12-21 | 2010-11-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 二价双特异性抗体 |
CN102596233A (zh) * | 2009-05-15 | 2012-07-18 | 大学健康网络 | 用于以SIRPα-CD47的相互作用为靶标治疗血液癌症的组合物和方法 |
CN102190729A (zh) * | 2011-03-09 | 2011-09-21 | 苏州大学 | 抗人cd80双价抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
唐亮等: "人信号调节蛋白α单克隆抗体的制备及初步应用", 《第二军医大学学报》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017510249A (ja) * | 2014-03-24 | 2017-04-13 | イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ (シャンハイ) カンパニー リミテッド | 新規組換え二機能性融合タンパク質、それらの調製および使用 |
CN104904661A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-09-16 | 王彦刈 | 一种人源化小鼠 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107217042B (zh) | 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法 | |
CN110818802B (zh) | 一种嵌合t细胞受体star及其应用 | |
US11345726B2 (en) | Chikungunya virus (CHIKV) or Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) virus-like particles comprising heterologous antigens inserted into the envelope protein | |
CN106536563B (zh) | 嵌合抗原受体 | |
US11155626B2 (en) | Anti-human PD-L1 humanized monoclonal antibody and application thereof | |
JP7262597B2 (ja) | 二重特異性抗体及びその作製方法と使用 | |
JP2018522564A (ja) | 抗グリピカン3抗体およびその使用 | |
CN108059680B (zh) | 一种针对cd20和cd3的双特异性抗体 | |
CN112794909B (zh) | 一种抗tigit单克隆抗体及其应用 | |
TW201831516A (zh) | 抗gpc3抗體 | |
CN107814845A (zh) | 新的抗pd‑1纳米抗体及其应用 | |
CN106574246A (zh) | 用于细胞免疫治疗的方法和组合物 | |
CN107840891A (zh) | 高亲和力的抗msln抗体及其应用 | |
CN110831963A (zh) | Pd-l1变体免疫调节蛋白及其用途 | |
CN111944062B (zh) | 一种识别Fc片段的嵌合抗原受体及其应用 | |
JP7264383B2 (ja) | 血中半減期の向上のための抗体Fc変異体 | |
CN109776678A (zh) | 一种人源化pd-l1单克隆抗体、其制备方法和应用 | |
CN103965363A (zh) | 与pd-1和vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 | |
CN105622753A (zh) | 一种pd-1单克隆抗体及其应用 | |
CN107840889A (zh) | 高亲和力的抗cd123抗体及其应用 | |
CN113004415B (zh) | 靶向her2和4-1bb的双特异性抗体及其应用 | |
CN103804495A (zh) | 抗肿瘤基因工程二价类抗体及其制备方法及抗肿瘤基因工程药物 | |
US10995142B2 (en) | Monoclonal antibody FnAb8 and application thereof | |
Phumyen et al. | Improved binding activity of antibodies against major histocompatibility complex class I chain-related gene A by phage display technology for cancer-targeted therapy | |
CN103183735A (zh) | 抗hiv基因工程二价类抗体及其制备方法及抗hiv基因工程药物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140521 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |