CN116144599A - 一种逃逸异体nk细胞杀伤的免疫细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞及其应用，所述免疫细胞的CD58基因的功能被抑制。本发明针对CD58基因进行了一系列的研究，通过对CD58的敲除改造实现通用CAR‑T逃逸宿主NK和T细胞的攻击和杀伤。本发明设计的通用型CAR‑T细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，提供了一种全新的通用型CAR‑T细胞逃逸宿主NK细胞杀伤的策略。

Description

一种逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞及其应用。
背景技术
相比自体CAR-T，通用型CAR-T具备多方面的优势，(1)通过获得稳定批次的冻存细胞制品，通用CAR-T产品能够极大地缩短患者治疗等待期，为患者提供及时的治疗；(2)为CAR-T细胞产品提供标准化的制备流程；(3)有足够的时间对细胞进行多种改造；(4)能够实现反复给药；(5)能够和不同靶点的CAR-T产品进行联用；(6)通过工业化的生产流程降低CAR-T制备成本等。因此，通用型CAR-T产品将是未来CAR-T疗法的主要趋势。
然而，通用CAR-T的研发也面临着极大的挑战，最需要解决以下两大问题：(1)由于异体细胞输注而导致的移植物抗宿主病GvHD；(2)通用CAR-T在宿主体内被宿主免疫系统快速清除，而无法有效扩增。
目前，第一个难题已基本得到解决。研究人员通过基因编辑技术，敲除αβ-T细胞上编码T细胞表面受体(TCR)的TRAC基因，有效抑制CAR-T细胞通过激活TCR对宿主细胞进行无差别的攻击，从而避免GvHD的发生。
相比之下，第二个问题更难解决。近年来研究者一直在探究如何使通用CAR-T细胞在宿主体内进行有效扩增。目前，主流的解决方案有三种：
(1)通过CD52单抗药物和通用CAR-T联合使用。再应用CD52蛋白的单克隆抗体药Alemtuzumab和化疗药物清淋后，给患者输注TRAC/CD52双敲除的CAR-T细胞进行治疗。该方案中敲除TRAC预防移植物抗宿主病，敲除CD52预防清淋药物对通用CAR-T的清除。目前，全球披露的通用CAR-T临床数据均是采用TRAC/CD52敲除和CD52单抗药物联合的治疗策略。
(2)第二种为了降低宿主排斥移植物反应的策略，是在通用CAR-T上敲除MHC一类和/或二类分子，来逃逸宿主的T细胞识别到MHC分子错配而造成对通用CAR-T的识别和杀伤。
其中，MHC-I类分子主要是向CD8阳性的细胞毒T细胞呈递抗原，敲除编码β2-微球蛋白的B2M基因，可阻止功能性HLA-I类分子在CAR-T细胞表面表达。该方案通过破坏HLA-I类分子，避免了通用CAR-T激活宿主体内的细胞毒T细胞，从而使其获得长期增殖。然而，由于HLA是NK细胞的抑制性配体，它的缺失会激活患者NK细胞对CAR-T细胞进行清除，使其在体内的扩增受限，影响其有效性。
MHC-II类分子主要是向CD4阳性的辅助性T细胞呈递抗原，敲除二类分子能够避免宿主CD4阳性T细胞的激活。由于二类分子的种类繁多，敲除的手段主要是通过敲除二类分子共同的转录起始复合物中的基因，来抑制所有二类分子的转录，其中包括CIITA和RXF5等基因。虽然研究者们对MHC分子进行了上述多种基因的改造，但目前并没有完全解决异体细胞被宿主免疫体统排异的难题，对何种基因进行改造能够使得通用CAR-T细胞逃逸宿主免疫也是研究者们关注的重点方向。
(3)第三种策略是使用选择肿瘤细胞和宿主免疫系统共同的靶点，如CD7，其既在T细胞肿瘤上表达，也在宿主的NK细胞和T细胞上表达。因此，以CD7为靶点的通用CAR-T能够在杀伤患者肿瘤细胞的同时，有效杀伤宿主的T和NK细胞，避免宿主T和NK对通用CAR-T的清除。但这种方案相对局限，只能治疗T/NK细胞相关的恶性肿瘤，且过度清除宿主的免疫系统也会带来由于机体免疫缺陷造成的严重感染等安全性问题。
因此，开发一种全新的CAR-T逃逸宿主NK细胞杀伤的策略，实现通用CAR-T逃逸宿主NK细胞的攻击和杀伤，对CAR-T疗法的应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞及其应用。为了解决通用型CAR-T难以逃逸宿主免疫监察的问题，本发明针对CD58基因进行了一系列的研究，通过对CD58的改造实现通用型CAR-T逃逸宿主NK细胞的攻击和杀伤，本发明设计的通用型CAR-T细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，提供了一种全新的通用型CAR-T细胞逃逸宿主NK细胞杀伤的策略。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种免疫细胞，所述免疫细胞的CD58基因的功能被抑制。
优选地，所述免疫细胞的TRAC基因和/或B2M基因的功能也被抑制。
优选地，所述免疫细胞的CD58基因、TRAC基因和/或B2M基因被敲除或敲低。
优选地，所述免疫细胞同时敲除了CD58基因、TRAC基因和B2M基因。
优选地，所述免疫细胞为工程化免疫细胞。
优选地，所述免疫细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、TCR-T细胞或TCR-NK细胞。
优选地，所述免疫细胞为通用型CAR-T细胞。
优选地，所述免疫细胞为逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞。
优选地，所述免疫细胞细胞是一种逃逸异体NK细胞杀伤的通用型CAR-T细胞，所述通用型CAR-T细胞中同时敲除了CD58基因、TRAC基因和B2M基因。
本发明为了解决通用CAR-T难以逃逸宿主免疫监察的问题，针对CD58基因进行了一系列的研究，希望通过对CD58的改造来实现通用CAR-T逃逸宿主NK细胞的攻击和杀伤。
CD58，也被称为淋巴细胞功能抗原3，即LFA-3，是一种高度糖基化的细胞表面蛋白，其作为供刺激受体广泛分布于人体各组织细胞上。CD58的天然配体是CD2，其表达于T和NK细胞的表面。CD2-CD58的相互作用是免疫突触(Immunological Synapse，IS)形成的重要组成部分，诱导T细胞和NK细胞的激活和增殖，并且除了促进细胞黏附和靶细胞识别外，CD2-CD58相互作用还刺激了T和NK细胞一系列的胞内信号转导。同时，可溶性的CD58的积累也会导致肿瘤微环境中T和NK细胞的免疫抑制。最后，CD2-CD58的相互作用还参与了抗病毒反应的调控、自身免疫疾病中的炎症反应、移植相关的免疫排斥以及肿瘤细胞逃逸免疫监察等等。因此，对CD2-CD58相关通过进行基因编辑，为异体细胞治疗中面临的免疫排斥问题提供新思路。
优选地，敲除CD58基因、TRAC基因和B2M基因的方法包括TALEN、锌指方法或CRISPR/Cas9系统。
优选地，通过CRISPR/Cas9系统进行CD58基因、TRAC基因和B2M基因的敲除获得通用型CAR-T细胞。
优选地，敲除所述CD58基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:3所示；
敲除所述TRAC基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
敲除所述B2M基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:3：AGGACTTATAATGTACTCAT。
SEQ ID NO:7：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA。
SEQ ID NO:8：CAGTAAGTCAACTTCAATGT。
本发明通过CRISPR/Cas9技术对CAR-T细胞的CD58基因、TRAC基因和B2M基因进行了敲除，得到了一种通用型CAR-T细胞，敲除CD58基因后能干扰宿主NK细胞与通用型CAR-T细胞的IS稳定性，同时阻止CD2-CD58相互作用对宿主NK细胞的激活信号，从而抑制宿主NK细胞对通用型CAR-T细胞的清除。
本发明中，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向选自下组的分子：CD19、CD20、CD22、ROR1、BCMA、MUC-1、CLDN18.2、GPC3、CD174、HER2、GD2、CD33、CD38、CD138、CD123、CD30、EGFR、EGFRvIII、PSMA、Mesothelin、FAP、CEA、CD171、Glypican 3、IL-13R、PSCA、CD123、CD133、CA125、EphA2、C-met、L1CAM、VEGFR、CS1、ROR1、EC、NY-ESO-1、MUC16、LewisY、EPG、DLL3、CD99、5T4、CAIX或其组合。
优选地，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向选自下组的分子：CD19、CD20、BCMA、CD5、CD7或CLDN18.2中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向CD19。
优选地，所述CAR从N端到C端依次包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
优选地，所述CAR在N末端还包括信号肽。
优选地，所述CAR在所述胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间还包括铰链区。
优选地，所述胞外抗原结合结构域靶向CD19，且氨基酸序列为SEQ ID NO:9，如下所示：
QAVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSYSWSSWYWDFWGQGTLVTVSS。
优选地，所述胞内信号传导结构域包括(i)CD28胞内结构域和/或4-1BB胞内结构域；和(ii)CD3ζ胞内结构域。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的免疫细胞。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的免疫细胞的制备方法，包括步骤：抑制所述免疫细胞的CD58基因的功能。
优选地，所述制备方法包括：敲低或敲除所述免疫细胞的CD58基因。
优选地，所述制备方法包括：敲低或敲除所述免疫细胞的CD58基因、TRAC基因和B2M基因。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(a)构建含有编码嵌合抗原受体CAR的核酸分子的慢病毒表达载体；
(b)将步骤(a)中所述的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
(c)通过TALEN、锌指方法或CRISPR/Cas9系统对分离和激活的T细胞进行CD58基因、TRAC基因和B2M基因的敲除，获得基因敲除的T细胞；
(d)将步骤(b)中所述重组慢病毒导入所述基因敲除的T细胞中，获得免疫细胞。
第四方面，本发明提供第一方面所述免疫细胞在制备异体治疗药物中的应用。
第五方面，本发明提供第一方面所述免疫细胞在制备治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤可选自浆细胞恶性肿瘤疾病，例如多发性骨髓瘤，所述肿瘤还可选自B细胞恶性疾病，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
优选地，所述自身免疫性疾病包括视神经脊髓炎谱系疾病。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明设计的通用型CAR-T细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，通过CRISPR/Cas9技术对CAR-T细胞的CD58基因、TRAC基因和B2M基因进行了敲除，得到了一种通用型CAR-T细胞，敲除CD58基因后能干扰宿主NK细胞与通用型CAR-T细胞的IS稳定性，同时阻止CD2-CD58相互作用对宿主NK细胞的激活信号，从而抑制宿主NK细胞对通用型CAR-T细胞的清除，提供了一种全新的通用型CAR-T逃逸宿主NK细胞杀伤的策略。
附图说明
图1A为CD58候选sgRNA序列；
图1B为CD58候选sgRNA敲除效率测试的FACS结果图；
图2A为TRAC基因和/或B2M基因敲除效率测试的FACS结果图；
图2B为CD58基因敲除效率测试的FACS结果图；
图3A为流式检测共孵育体系中不同时间点的4种靶细胞在整体细胞中的占比结果图；
图3B为共孵育体系中不同时间点的4种靶细胞细胞数变化示意图；
图4A为流式细胞分析阴选前CD19-UCART与CD58 KO CD19-UCART敲除效率与CAR+测试的FACS结果图；
图4B为流式细胞分析TCR/B2M/CD58和TCR/B2M阴选后CD19-UCART与CD58 KOCD19-UCART敲除效率与CAR+测试的FACS结果图；
图5A为流式检测共孵育体系中不同时间点的靶细胞在整体细胞中的占比结果图；
图5B为共孵育体系中不同时间点的靶细胞细胞数变化示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1方法与材料
1.方法：
(1)CD3+T细胞的分选和激活
复苏冻存的健康供体PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8mL预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以300g离心(升8降8)10min。离心结束后，弃上清，加入20μL/107的CD3微珠，混匀后放入4℃冰箱孵育20min，期间每10min轻弹管壁数次避免细胞沉淀。孵育结束后，加入Rinsing buffer润洗1遍后离心(400g 10min升8降8)，再用500μL Rinsing buffer重悬细胞。同时将LS分选柱放置在美天旎磁力分选架上，用2mL Rinsing buffer润洗润洗1遍后，加入500μL的细胞悬液，待细胞悬液滴尽后，反复2次加入2mL Rinsing buffer于LS柱上。用5mL Rinsing buffer将目的细胞从LS柱上冲出并收集，做适当稀释后对目的细胞进行计数，取约1×105个细胞以流式细胞术确定分选的T细胞的纯度。随后将细胞悬液以300g离心10min，用新鲜T细胞培养基将细胞密度调整至1×106个细胞/mL，以106个细胞/10μL加入抗-CD3/-CD28抗体磁珠激活，按每孔4mL，种入到12孔板中，放入37℃，CO2培养箱中进行培养。
(2)T细胞的激活电转
对于CD3/CD28 Dynabeads(免疫磁珠)激活的细胞，激活24h后即可进行电转。细胞收集于离心管中，置于磁力架上去除Dynabeads，反复过3遍，然后将细胞离心(300g离心15min升8降8)；结束后，弃上清，用适量的复方电解质将细胞重悬到一起，取细胞计数；根据细胞计数结果配制相应量的RNP(Cas9蛋白和sgRNA的复合物)，37℃孵育10min以上；同时将细胞再次离心，结束后用相应量的电转buffer重悬细胞，加入孵育好的RNP，轻轻混匀后加入Lonza电转仪配套的电转杯中，选择电转激活T细胞的程序EH-115，电转，然后立即加入少量的经温热后的T细胞培养基，放入培养箱中恢复15min以上，再将细胞悬液从电转杯中转出至合适的培养瓶中，加入T细胞培养基使培养密度为2M/mL。
(3)T细胞的静息电转
分选出的T细胞静息培养4h后，收集细胞于离心管中，取细胞计数，根据细胞计数结果，配制相应量的RNP(Cas9蛋白和sgRNA的复合物)，37℃孵育10min以上；同时将细胞离心，结束后用相应量的电转buffer重悬细胞，加入孵育好的RNP，轻轻混匀后加入Celletrix电转仪配套的电转杯中，设置电转静息T细胞的相应参数(100μL体系，1380V，3ms)，电转，然后立即将细胞吸出至培养瓶中(培养瓶中的培养基提前加好CD2/CD3/CD28激活剂并温热)，此时勿吹打细胞，然后将细胞放入培养箱中培养，培养密度为2M/mL。
(4)CAR的慢病毒转导
细胞激活48h后，进行CAR的慢病毒转导。对细胞悬液进行活率检测和细胞计数，根据细胞计数结果加入相应量的慢病毒，MOI为3，再加入100×的lentiboost助转试剂，轻轻混匀后，37℃培养箱中继续培养。24h后换液去除病毒，换新鲜的培养基继续培养T培养细胞，密度为1M/mL。
(5)FACS(流式细胞术)检测
取约2×105个细胞悬液于1.5mL离心管中，300g离心5min，用PBS+2％胎牛血清缓冲液洗1遍，完全弃去上清，用100μL缓冲液重悬细胞后加入相应抗体1μL，混匀后4℃避光孵育30min，加入100μL缓冲液洗一遍后，用100μL含DAPI或者7AAD的缓冲液重悬后上机检测。
(6)NK细胞的分选和激活
复苏冻存的健康供体PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8mL预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以300g离心(升8降8)10min。离心结束后，弃上清，加入80μL/107的Rinsing buffer，加入20μL/107的CD56微珠，混匀后放入4℃冰箱孵育15min。孵育结束后，加入Rinsing buffer润洗1遍后离心(300g离心10min升8降8)，再用500μLRinsing buffer重悬细胞。同时将LS分选柱放置在美天旎磁力分选架上，用2mL Rinsing buffer润洗润洗1遍后，加入500μL的细胞悬液，待细胞悬液滴尽后反复2次加入2mL Rinsing buffer于LS柱上。用5mL Rinsing buffer将目的细胞从LS柱上冲出并收集，做适当稀释后对目的细胞进行计数，取约1×105个细胞以流式细胞术确定分选的NK细胞的纯度。
(7)NK细胞CFSE标记
NK细胞计数，收集需要量细胞重悬于PBS中，加入1μL/106细胞/mL的CFSE。室温避光孵育20min。孵育结束后加入原体积5倍体积的培养基孵育5min。室温离心，结束后弃上清，用T细胞培基重悬细胞。
(8)TRAC/B2M/CD58阴选
在细胞培养的第六天左右，TRAC/B2M/CD58成功敲除的细胞已不表达相应的蛋白，因此可对细胞进行阴选，将TRAC/B2M/CD58成功敲除的细胞给分离出来继续培养。
具体步骤如下：收集细胞室温离心(400g离心15min，升8降8)，结束后弃上清，用Rinsing Buffer重悬细胞(80μL/107细胞)，加入FITC-B2M抗体(1μL/106细胞)，加入PE-CD58抗体(1μL/106细胞)，四度避光孵育20min；孵育完毕后，加10mL的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心(300g离心10min升8降8)，结束后弃上清，用Rinsing Buffer重悬细胞(80μL/107细胞)，加anti-FITC-beads(1μL/106细胞)，anti-PE-beads(1μL/106细胞)，加CD3-beads(按1μL/106细胞)，四度避光孵育20min；孵育完毕后，加10mL的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心(300g离心10min升8降8)，同时用3mL的buffer润洗LD柱子；离心结束后弃上清，用Rinsing Buffer(1×108/mL)重悬细胞，过柱子2遍(2mL/柱子)，然后用3mL的RinsingBuffer洗柱子2遍，收集流下的阴性细胞，计数，取少量细胞用于FACS检测敲除效率、CAR阳性率和分选的纯度等，将阴性细胞离心后用适量的T细胞完全培养基培养于培养瓶中。
2.材料：
实验中的主要试剂如表1所示
表1
Figure BDA0003988277120000081
Figure BDA0003988277120000091
实验中的主要耗材如表2所示
表2
名称 厂商 货号
LS Columns Miltenyi 130-042-401
LD Columns Miltenyi 130-042-901
T25培养瓶 Corning 430639
T75培养瓶 Corning 430641
15mL离心管 Corning 430791
50mL离心管 Corning 430829
50mL注射器 康德莱 /
10mL移液管 Corning 4488
25mL移液管 Corning 4489
电转杯 lonza V4XP-3024
EP管 eppendorf 30108051
250mL离心瓶 Corning 430776
储液瓶-500mL Corning 430282
实施例2人原代T细胞上高效敲除CD58基因的sgRNA筛选
本实施例通过CRISPick、CRISPOR、IDT、CHOPCHPOP和GUIDES几个网站预测后，然后综合考虑在靶和脱靶等信息后选出6条候选sgRNA，CD58候选sgRNA序列如图1A所示。将6条候选sgRNA的靶向序列告知技术服务公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)让其合成全长的sgRNA(靶向序列+骨架序列)。
sgRNA合成好后，用nuclease-free的水将其溶解为100-500pmol/μL，然后与Cas9蛋白混合后37℃孵育10min以上，再通过lonza电转仪电转，将Cas9与sgRNA的复合物导入T细胞中，细胞培养4天后，用FACS检测电转后细胞CD58的表达情况，从而反应出不同sgRNA对CD58的敲除效率。
图1B为CD58候选sgRNA敲除效率测试的FACS结果图，横坐标代表细胞CD58表达情况，图1B中，Isotype是CD58抗体的同型对照，Mock T是CD58未敲除对照；从图1B可以看出，sgRNA3的敲除效率最高，为45.7％；其它几条sgRNA的敲除效率均低于sgRNA3。根据敲除效率，选择sgRNA3作为后续实验所用。
sgRNA1(SEQ ID NO:1)：GAGCATTACAACAGCCATCG
sgRNA2(SEQ ID NO:2)：AATGCTCTGGTATCATGCAT
sgRNA3(SEQ ID NO:3)：AGGACTTATAATGTACTCAT
sgRNA4(SEQ ID NO:4)：AGCGACGCGGGGCGGGCCCT
sgRNA5(SEQ ID NO:5)：GCAGCAGGCAGACCACGCTG
sgRNA6(SEQ ID NO:6)：AAGCAATGTGCCTTTAAAAG
实施例3敲除CD58的B2M/TCR KO T细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤
UCAR-T(通用型CAR-T)细胞成功的重要因素之一为避免发生免疫排斥反应，UCAR-T细胞通常情况下必须不表达TCR和HLA-I复合物，否则会发生严重的GvHD或HvGD。常用的策略为敲除UCAR-T细胞的TCR和B2M。但B2M缺失的细胞为NK天然的靶细胞。
为模拟CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞是否能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，本实施例使用CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞与异体NK细胞共孵育实验来评估CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞逃逸异体NK细胞杀伤的能力。
所述方法包括以下步骤：
(1)CD3+T细胞的分选和激活。
(2)CRISPR-Cas9与sgRNA介导的TRAC、B2M、CD58基因敲除，其中利用SEQ ID NO:3所示的sgRNA3敲除CD58，利用SEQ ID NO:7所示的sgRNA敲除TRAC，利用SEQ ID NO:8所示的sgRNA敲除B2M。
(3)TRAC，B2M，CD58基因敲除效率检测：TRAC，B2M基因敲除效率如图2A所示。
图2A为TRAC基因和/或B2M基因敲除效率测试的FACS结果图；图2A中，TCR KO T表示TRAC基因敲除的T细胞，TCR/CD58 KO T表示TRAC联合CD58基因敲除的T细胞，TCR/B2M KOT表示TRAC联合B2M基因敲除的T细胞，TCR/B2M/CD58 KO T表示TRAC联合B2M联合CD58基因敲除的T细胞。从图2A可知，TCR KO T组TRAC基因的敲除效率为100％；TCR/CD58KO T组TRAC基因的敲除效率为100％；TCR/B2M KO T组TRAC基因的敲除效率为100％，B2M的敲除效率为99.3％；TCR/B2M/CD58 KO T组TRAC基因的敲除效率为100％，B2M的敲除效率为98.6％。成功制备了TRAC基因和/或B2M基因敲除的T细胞。
图2B为CD58基因敲除效率测试的FACS结果图；从图2B可知，根据流式细胞分析CD58敲除效率，TCR/CD58 KOT组CD58基因敲除效率为79.3％，TCR/B2M/CD58 KOT组CD58基因敲除效率为84.6％。
(4)异体NK细胞的获得：为了测试CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞是否能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，另需获得与CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞供体的HLA-ABC蛋白相异的供体来源的NK细胞作为异体NK细胞并用CFSE进行标记。
(5)利用敲除CD58的B2M/TCR KO T细胞与异体NK细胞共孵育实验，检测CD58敲除的B2M/TCR KO T细胞是否能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤。将异体NK细胞视作理论上的效应细胞，敲除或者不敲除CD58的B2M/TCR KO T细胞、敲除或者不敲除CD58的TCR KO T细胞作为靶细胞。
此次共孵育实验中靶细胞分为4组：
1)TCR KO T细胞组为TCR/CD58 KO T细胞对照组；
2)TCR/B2M KO T细胞组为TCR/B2M/CD58 KO T细胞对照组；
3)TCR/CD58 KO T细胞组为TCR/B2M/CD58 KO T细胞对照组；
4)TCR/B2M/CD58 KO T细胞组为实验组。
此次共孵育反应中的靶细胞仅使用同一供体来源的同种异体T细胞。
本实施例以1：1效靶比开展。将4组靶细胞按1.5×106个细胞数分别铺于12孔板中，效应细胞按1.5×106个细胞数与靶细胞混合，每孔总体积2mL，均以T细胞完全培养基培养。将孔板置于37℃培养箱培养。
此次测试，预测TCR/B2M/CD58 KO T组生长优势优于TCR/B2M KO T组，TCR KO T组与TCR/CD58 KO T组无差异。因而需要在共孵育实验过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞与靶细胞的比例与绝对数量。
为了获得上述数据，分别于共培养的第3天，第5天(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞、靶细胞的比例。
将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标，图3A为流式检测共孵育体系中不同时间点的4种靶细胞在整体细胞中的占比结果，图3A展示了不同时间(共孵育第三天、共孵育第五天)4组靶细胞在共孵育体系中所占百分比。共孵育体系中，NK细胞对TCR KO T组与TCR/CD58 KO T组无杀伤，因为这两组靶细胞为B2M+细胞，不会成为NK细胞的杀伤靶细胞；而TCR/B2M/CD58 KO T较TCR/B2M KO T细胞存活时间更久。在共孵育第3天时，与NK共孵育体系中TCR/B2M KO T细胞占体系总细胞比为43.8％，远低于与TCR/B2M/CD58 KO T的78.1％；在共孵育第5天时，NK共孵育体系中TCR/B2M KO T细胞已无存活，而TCR/B2M/CD58 KO T细胞仍有25.9％的细胞存在。图3B为共孵育体系中不同时间点的4种靶细胞细胞数变化示意图，图3B展示了共孵育体系中4组靶细胞绝对数的变化。TCR KO T组与TCR/CD58 KO T组细胞在共孵育体系中正常扩增，TCR/B2M KO T组细胞数明显下降，在共孵育第5天时已经检测不到细胞；而TCR/B2M/CD58 KO T组在在共孵育第3天时能维持初始的细胞量，无明显降低；在共孵育第5天时仍有细胞存活。
因此，实验结果证实敲除CD58的B2M/TCR KO T细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤。
实施例4敲除CD58的CD19-UCART细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤
为模拟CD58敲除的UCART细胞是否能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，本实施例示例性地使用CD58敲除的CD19-UCART细胞与异体NK细胞共孵育实验来评估CD58敲除的CD19-UCART逃逸异体NK细胞杀伤的能力。
其中，CD19 CAR为公司内部自行构建，从N端到C端依次包括CD8a信号肽，靶向CD19的胞外抗原结合结构域、CD8铰链区和CD8跨膜结构域和CD28胞内结构域和CD3ζ胞内结构域。
所述方法包括以下步骤：
(1)CD3+T细胞的分选。
(2)CRISPR-Cas9与sgRNA介导的TRAC、B2M、CD58基因敲除及T细胞激活。
(3)慢病毒感染TRAC/B2M和TRAC/B2M/CD58敲除的T细胞。
(4)TRAC、B2M、CD58基因敲除效率检测：结果如图4A所示，图4A为流式细胞分析阴选前CD19-UCART与CD58 KO CD19-UCART敲除效率与CAR+测试的FACS结果图，从图4A可知CD58 KO CD19-UCART组TRAC基因联合B2M基因的敲除效率为82.3％，CD58基因的敲除效率为55.3％；CD19-UCART组TRAC基因联合B2M基因的敲除效率为95.6％。
(5)TRAC、B2M、CD58阴选：由于CD19-UCART与CD58 KO CD19-UCART存在部分TCR、B2M、CD58基因未敲除细胞，为得到较均一的细胞，发明人对CD19-UCART细胞进行了TRAC、B2M阴选，对CD58 KO CD19-UCART细胞进行了TRAC、B2M、CD58阴选；阴选后CD19-UCART细胞与CD58 KO CD19-UCART细胞TRAC/B2M双阴性细胞比例超过99％，CD58KO CD19-UCART细胞CD58阴性细胞比例为96％。
(6)CAR阳性率检测：T细胞感染慢病毒后3天，以流式细胞术检测CAR阳性率，结果如图4A、4B所示，图4B为流式细胞分析TCR/B2M/CD58和TCR/B2M阴选后CD19-UCART与CD58KO CD19-UCART敲除效率与CAR+测试的FACS结果图。从图4B可知，阴选后CD58 KO CD19-UCART细胞表达CAR的T细胞的比例约为32.6％，KO CD19-UCART细胞表达CAR的T细胞的比例约为35.0％。届时，认为已获得了可用于体外测试的CD58 KO CD19-UCART细胞与CD19-UCART细胞。
(7)异体NK细胞的获得：为了测试CD58敲除的CD19-UCART能否逃逸异体NK细胞杀伤，另需获得与CD58 KO CD19-UCART细胞供体的HLA-ABC蛋白相异的供体来源的NK细胞作为异体NK细胞并用CFSE进行标记。
(8)利用CD58 KO CD19-UCART与异体NK细胞共孵育实验检测CD58敲除的CD19-UCART细胞是否能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤。将异体NK细胞视作理论上的效应细胞，CD58 KO CD19-UCART细胞与CD19-UCART细胞作为靶细胞。
此次共孵育实验中靶细胞分为2组：
1)CD19-UCART细胞(TCR/B2M KO的靶向CD19的CAR-T细胞)为对照组；
2)CD58 KO CD19-UCART细胞(TCR/B2M/CD58 KO的靶向CD19的CAR-T细胞)为实验组。
此次共孵育反应中的靶细胞仅使用同一供体来源的同种异体T细胞。
本实施例以1：1效靶比开展。将2组靶细胞按1.5×106个细胞数分别铺于12孔板中，效应细胞按1.5×106个细胞数与靶细胞混合，每孔总体积2mL，均以T细胞完全培养基培养。将孔板置于37℃培养箱培养。
此次测试，预测CD58 KO CD19-UCART组存活细胞数优于CD19-UCART组。因而需要在共孵育实验过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞与靶细胞的比例与绝对数量。
为了获得上述数据，分别于共培养的第3天，第6天，第9天(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞、靶细胞的比例。
将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标，结果如图5A和图5B所示，图5A为流式检测共孵育体系中不同时间点的靶细胞在整体细胞中的占比结果图，图5A展示了不同时间(共孵育第三天、共孵育第六天、共孵育第九天)2组靶细胞在共孵育体系中所占百分比，从图5A可知CD58 KO CD19-UCART较CD19-UCART在异体NK存在的环境中存续更佳：在共孵育第六天时，与NK共孵育体系中CD19-UCART细胞占体系总细胞比为45.5％，低于CD58 KO CD19-UCART的67.9％；在共孵育第9天时，NK共孵育体系中CD19-UCART仅占总细胞的5.5％，而CD58 KO CD19-UCART细胞仍有43.1％的细胞存在。图5B为共孵育体系中不同时间点的靶细胞细胞数变化示意图，图5B展示了共孵育体系中2组靶细胞绝对数的变化，从图5B可知，随着与NK共孵育时间的延长CD19-UCART组细胞数明显下降；而CD58 KO CD19-UCART组细胞数明显高于对照组。
因此，实验结果证实敲除CD58的CD19-UCART细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤。
综上，本发明针对CD58基因进行了一系列的研究，通过对CD58的改造实现通用CAR-T逃逸宿主NK细胞的攻击和杀伤，本发明设计的免疫细胞能够有效逃逸异体NK细胞的杀伤，提供了一种全新的UCAR-T逃逸宿主NK细胞杀伤的策略。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的CD58基因的功能被抑制。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的TRAC基因和/或B2M基因的功能也被抑制；
优选地，所述免疫细胞的CD58基因、TRAC基因和/或B2M基因被敲除或敲低；
优选地，所述免疫细胞同时敲除了CD58基因、TRAC基因和B2M基因。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为工程化免疫细胞；
优选地，所述免疫细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、TCR-T细胞或TCR-NK细胞；
优选地，所述免疫细胞为通用型CAR-T细胞；
优选地，所述免疫细胞为逃逸异体NK细胞杀伤的免疫细胞。
4.根据权利要求2所述的免疫细胞，其特征在于，敲除CD58基因、TRAC基因和B2M基因的方法包括TALEN、锌指方法或CRISPR/Cas9系统；
优选地，通过CRISPR/Cas9系统进行CD58基因、TRAC基因和B2M基因的敲除；
优选地，敲除所述CD58基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:3所示；
敲除所述TRAC基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
敲除所述B2M基因的sgRNA的编码序列如SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向选自下组的分子：CD19、CD20、BCMA、CD5、CD7或CLDN18.2中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体CAR靶向CD19。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-5中任一项所述的免疫细胞；
所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
7.一种权利要求1-5中任一项所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：抑制所述免疫细胞的CD58基因的功能；
优选地，所述制备方法包括：敲低或敲除所述免疫细胞的CD58基因；
优选地，所述制备方法包括：敲低或敲除所述免疫细胞的CD58基因、TRAC基因和B2M基因；
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(a)构建含有编码嵌合抗原受体CAR的核酸分子的慢病毒表达载体；
(b)将步骤(a)中所述的慢病毒表达载体与包装质粒共转染病毒包装细胞，制备重组慢病毒；
(c)通过TALEN、锌指方法或CRISPR/Cas9系统对分离和激活的T细胞进行CD58基因、TRAC基因和B2M基因的敲除，获得基因敲除的T细胞；
(d)将步骤(b)中所述重组慢病毒导入所述基因敲除的T细胞中，获得免疫细胞。
8.权利要求1-5中任一项免疫细胞在制备异体治疗药物中的应用。
9.权利要求1-5中任一项免疫细胞在制备治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤和自身免疫性疾病包括淋巴瘤或视神经脊髓炎谱系疾病。
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