JP2021520800A - ヒトt細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に特異性を有する最適化された操作されたヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、EFS−WEBを介してASCII形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2019年4月11日に作成された当該ASCIIコピーは、P109070028WO00−SEQという名称であり、サイズは2700バイトである。
より最近では、I−Crelおよび他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計し、哺乳動物、酵母、植物、細菌、およびウイルスのゲノム中の部位を含む、幅広く多岐にわたるDNA部位を標的とすることができる、モノ−LAGLIDADG(配列番号2)ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている(特許文献1)。
本発明は、ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子(配列番号3)の第1エクソン内に存在する認識配列を認識かつ切断する、操作されたメガヌクレアーゼを提供する。かかるメガヌクレアーゼは、TCRアルファ定常領域遺伝子を破壊し、結果的に細胞表面TCRの発現および/または機能を破壊するのに有用である。メガヌクレアーゼ切断は、非相同末端結合の変異原性活性によって、または相同組換えによる遺伝子中への外因性ポリヌクレオチドの導入を促進することのいずれかによって、遺伝子機能を破壊することができる。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは内因性TCRを欠く同種異系CAR T細胞を生成するのに有用であるため、導入された外因性ポリヌクレオチドはキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、第1世代のメガヌクレアーゼであるTRC1−2x.87EEと比較して、少なくとも1つの最適化された特徴を示す。かかる最適化された特徴には、オフターゲット切断を低下させ、細胞中の維持時間(例えばmRNA由来の発現後)を低下させ、TCRアルファ定常領域遺伝子の改変の効率を増強(すなわち増加)させる原因となる、向上(すなわち増加)した特異性が挙げられる。更に、本開示の操作されたメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞は、向上した特徴を示す。この特徴は、オフターゲット切断およびその効果を低下させ、細胞中のメガヌクレアーゼの維持時間を減少させ、CAR Tの増殖を増強(すなわち増加)させることを含む。更に、該細胞は、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞と比較した場合、分化程度が低い。加えて、本開示のメガヌクレアーゼ(またはこれをコードする核酸)が中に導入された細胞集団は、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼ(またはこれをコードする核酸)が中に導入された細胞集団と比較した場合、より多い比率にて、改変された細胞、およびより大きい比率にて分化程度の低い細胞を有する。
配列番号1は、クラミドモナス・レインハルディ(Chlamydomonas reinhardtii)由来の野生型I−Crelメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定している。
本明細書で参照される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。Genbankデータベース配列、公開遺伝子データベースおよびタンパク質データベースアクセッション番号またはコード(ならびにそれに関連する核酸および/またはアミノ酸配列)を含み、本明細書に引用されている、発行された米国および米国以外の特許、許可された出願、公開された米国出願、公開された非米国出願、およびPCT出願、共有および共同係属中の未公開の米国特許出願、公開された外国出願、ならびに科学、技術、および医学的な参照文献は、それぞれが参照により組み入れられるため、具体的かつ個別に示されている場合と同程度で参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、向上(すなわち増加)された特異性およびオフターゲット切断の減少、mRNAからの発現後の、細胞中の維持時間の減少、ヒトT細胞とインビトロで使用した場合の細胞特性の向上、および実物大のCAR T細胞製造プロセスにて使用される場合の細胞特性の向上など、親である第1世代のメガヌクレアーゼと比較して向上した特徴を有する最適化された第2世代のメガヌクレアーゼの発見に、部分的には基づいている。
生存している細胞のゲノムにてDNA切断を行うため、部位特異的ヌクレアーゼを使用することが可能であり、かかるDNA切断が、ゲノム内にて同一のまたは高度な相同DNA配列を有する切断ターゲット部位の相同組換えを用いてゲノムの永続的な変更を生じることができるという点は、当技術分野で公知である。したがって、一部の実施形態では、本発明は操作された組換えメガヌクレアーゼを用いて実行され得る。
本発明は、ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子(配列番号3)内で見られる認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼを用いた、遺伝子改変されたT細胞およびその集団を製造するための方法を提供する。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺細胞、感染部位由来の細胞、腹水、胸腔浸出液、脾臓組織、および腫瘍を含む、大量の供給源から得られ得る。本開示のある特定の実施形態では、当技術分野にて利用可能な任意の数のT細胞株が使用され得る。本開示の一部の実施形態では、T細胞は当業者に公知である、任意の数の技術を用いて対象から収集した血液のユニットから得られる。一実施形態では、アフェレーシスによって固体の循環血から細胞が得られる。
一部の実施形態では、本発明は本発明の遺伝子改変された真核細胞、本発明の遺伝子改変された真核細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。かかる薬学的組成物は、公知の技術に従って調製され得る。例えば、Remington,The Science And Practice of Pharmacy(21st ed.,Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)を参照されたい。本発明に従った薬学的製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物は対象へと投与される。もちろん、担体は製剤中の任意の他の成分と適合しているという意味で許容されなければならず、対象に対して有害であってはならない。一部の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、対象の疾患治療において有用である、1つまたは複数の追加の薬剤を更に含み得る。追加の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、サイトカイン(例えばIL−2、IL−7、IL−15および/またはIL−21)などの生物学的分子を更に含む。これは、インビボでの細胞増殖および遺伝子改変されたT細胞の移植を促進させる。本発明の遺伝子改変された真核細胞を含む薬学的組成物は、追加の薬剤もしくは生物学的分子として同じ組成物をもって投与され得る。代替的には、別々の組成物をもって同時投与され得る。
本明細書に記載の別の態様は、治療の必要がある対象への、有効量の本開示の遺伝子改変された真核細胞またはその集団の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は治療の必要がある対象へと投与される。例えば、治療有効量の細胞の集団は、疾患を有する対象へと投与され得る。特定の実施形態では、該疾患は癌であり得、本発明の遺伝子改変された真核細胞の投与は免疫療法となる。投与された細胞は、増殖の減少、数の減少、またはレシピエント中のターゲット細胞を殺すことができる。抗体治療とは異なり、本開示の遺伝子改変された真核細胞は、インビボにて複製および増えることができ、持続的な疾患の制御をもたらし得るよう長期で持続する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するためのウイルスベクター(例えば組換えAAVベクター)を提供する。組換えAAVベクターは、HEK−293などの哺乳動物の細胞株において典型的に産生される。ウイルスcapおよびrep遺伝子は、輸送される1つ以上の治療遺伝子(例えばメガヌクレアーゼ遺伝子)に対する空間を作製するよう、自己複製を防ぐためにベクターから除去されるので、パッケージング細胞株においてはトランス状態のこうした遺伝子を提供することが必要である。加えて、複製を支援するのに必要な「ヘルパー」(例えばアデノウイルス)成分を提供することが必要である(Cots et al.(2013),Curr.Gene Ther.13(5):370−81)。多くの場合、組換えAAVベクターは「ヘルパー」成分をコードしている第1のプラスミド、capおよびrep遺伝子を含む第2のプラスミド、ならびにウイルスへとパッケージされる介在DNA配列を含有するウイルス性ITRを含む第3のプラスミドで細胞株が遺伝子導入される、トリプルトランスフェクションを用いて作製されている。カプシド中に包まれているゲノム(目的のITRおよび1つ以上の介在遺伝子)を含むウイルス粒子は、その後に凍結融解サイクル、超音波処理、洗浄剤、または当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで粒子は、塩化セシウムによる密度グラジエント遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィを用いて精製され、その後に細胞、組織またはヒト患者などの生物に対する目的の1つ以上の遺伝子へと輸送される。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、およびそのバリアントを包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドのバリアントを包含する。
TRC1−2認識配列に対する特異性を有するメガヌクレアーゼの特徴
1.1.TRC1−2認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ
これまでに報告されたTRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼは、GUIDE−seq(Tsai et al.(2015),Nat Biotechnology 33:187−197)と非常に類似しているが、メガヌクレアーゼに対して潜在的なオフターゲット部位を見いだすように調製された方法を用いて、認識部位特異性に関して評価された。一般的には、潜在的なオフターゲット部位は、二本鎖DNA切断中でプローブであるオリゴヌクレオチドを捕獲することによって特定される。TRC1−2メガヌクレアーゼは、4塩基対の3’オーバーハングを生成する。そのため、プローブであるオリゴはまた、ヌクレアーゼ切断によってよりふさわしく作成された部位にてライゲーション効率を向上させる、無作為化された4塩基対のオーバーハングを含有する。
どのTRC1−2メガヌクレアーゼがTRC1−2認識配列(配列番号5)を認識かつ切断可能かを決定するため、各TRC1−2メガヌクレアーゼは、既に記載されたCHO細胞レポータアッセイ(国際公開第2012/167192号、図3を参照されたい)を用いて評価された。アッセイを実施するため、細胞のゲノムへと組み込まれた非機能的な緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子の発現カセットを運搬した、一対のCHO細胞レポータ株が産生された。各細胞株中のGFP遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能的GFP遺伝子を生じる相同組換え現象を刺激するように、一対の認識配列によって中断された。両方の細胞株において、認識配列のうち1つはTRC1−2遺伝子から誘導され、更に第2の認識配列は「CHO23/24」と呼ばれる制御メガヌクレアーゼによって特異的に認識された。TRC1−2認識配列(配列番号5)を含むCHOレポータ細胞およびCHO23/24認識配列は、「TRC1−2細胞」と本明細書にて呼ばれている。
これらの調査において、オリゴ捕獲アッセイを用いてTRC1−2メガヌクレアーゼによって誘発されたオフターゲット切断を識別した。GUIDE−seqと類似する、オリゴ捕獲アッセイは細胞のゲノムDNA内の切断部位にてオリゴヌクレオチドを捕獲することでTRC1−2メガヌクレアーゼにより作製された潜在的なオフターゲット部位を認識する。GUIDE−seqは、DNA切断を生成するCRISPR−Cas9のために開発された。この技術を本発明のヌクレアーゼに適用するために、化学および解析に対する重要な改変はほとんど行われない。CRISPR−cas9とは異なり、本明細書の操作されたメガヌクレアーゼは4塩基対の3’オーバーハングを生成する。この違いに適応させるため、オリゴ捕獲に使用されたオリゴヌクレオチドは、TRC1−2メガヌクレアーゼで生成されたオーバーハングと適合し得る4塩基対オーバーハングを無作為化する。平滑末端よりも結合している付着末端の効率が大きいことを要因として、高頻度の挿入が観察される。細胞は、ヌクレアーゼおよび二本鎖DNAオリゴヌクレオチドをコードしているmRNAで遺伝子導入された。2日後、これらの細胞由来のゲノムDNAを単離および超音波処理し、DNAを小さいサイズへとせん断した。オリゴヌクレオチドアダプタをせん断されたDNAへとつなぎ、PCRを用いて、特定の末端ではアダプタを含有し、他方の末端では捕獲したオリゴヌクレオチドを含有する任意のDNA断片を増幅させた。増幅されたDNAを精製し、更に標準的な市販のキットを用いてシーケンシングライブラリーを調製した。
最適化されたTRC1−2メガヌクレアーゼのインビトロ解析
遺伝子編集効率、編集後の増殖、および分化の評価
オリゴ捕獲は、実施例1に既に記載の方法を用いて、3人のドナーのそれぞれから得られたT細胞の3つの複写物に対して実施された。オリゴ捕獲の結果は図12に示している。ドットは、各推定オフターゲット部位および目的のターゲット部位にて回収されたシーケンシングリードの数を表す。従来の研究では、8箇所以上のミスマッチを有する部位がTRC1−2L.1592により切断されることが示されなかったため、目的とするターゲットに対して8箇所以上のミスマッチを有する推定部位を除外した。各サンプルにとっての目的ターゲット部位は、円で強調されている。目的ターゲットと比較したミスマッチの数は各円の暗さによって示されており、ミスマッチがほとんどない場合にはより暗くなっている。プロットは、取り除かれた偽バックグラウンドを有さず、サンプルごとの固有リードの数に標準化されたリードカウントを有するオリゴ捕獲データを表し、回収されたリードの総数についての差異を説明している。示されるように、TRC1−2L.1592は、CAR T細胞集団で編集および標的挿入のために使用される場合、高いリードカウントの数が少なく、更に目的部位とより類似する数が少ないことを示す。
第2の一連のインビトロ調査では、T細胞を編集するという点、編集後増殖する編集T細胞の能力、および抗原関連ターゲット細胞と遭遇するよう応答するヌクレアーゼバリアントを用いて生成されたCAR T細胞の能力という点で、その効率について第2世代の最適化されたTRC1〜2メガヌクレアーゼを評価した。
調査は、仮に最適化された第2世代のTRC1−2メガヌクレアーゼが、第1世代のTRC1−2x.87EEよりもインビトロで短い維持時間を有するかどうかを決定するために更に実施された。より短い維持時間は、遺伝子の編集およびオフターゲット切断における低下といった可能性という文脈において有利であり得る。
CAR T産生における最適化されたTRC1−2メガヌクレアーゼの評価
Claims (97)
- ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子内の配列番号5を含む認識配列を認識かつ切断する、操作されたメガヌクレアーゼであって、
前記操作されたメガヌクレアーゼが、第1のサブユニットと第2のサブユニットを含み、前記第1のサブユニットは、前記認識配列の第1の認識ハーフサイトと結合し、かつ第1の超可変(HVR1)領域を含み、前記第2のサブユニットは、前記認識配列の第2の認識ハーフサイトと結合し、かつ第2の超可変(HVR2)領域を含み、
更に前記HVR2は、
(a)配列番号7の残基24〜79に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも81%の配列相同性、または、
(b)配列番号8の残基24〜79に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも86%の配列相同性、を有する、操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号7または配列番号8の残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75、および77に対応する残基を含む、請求項1に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR2領域が、配列番号7の残基48、50、71、72、および73に対応する残基を含む、請求項1または2に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR2領域が、配列番号8の残基48および50に対応する残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR2領域が、配列番号7または配列番号8の残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、48、50、68、70、71、72、73、75、および77に対応する残基を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR2領域が、配列番号7または配列番号8の残基66に対応する残基にて、Y、R、K、またはDを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR2領域が、配列番号7または配列番号8の残基24〜79を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基7〜153に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基19に対応する残基にて、G、S、またはAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基80に対応する残基にて、E、Q、またはKを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基7〜153に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基198〜344に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基7〜153に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基19に対応する残基にて、G、S、またはAを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基80に対応する残基にて、E、Q、またはKを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基80に対応する残基を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基139に対応する残基を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基7〜153を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR1領域が、配列番号7または配列番号8の残基215〜270に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR1領域が、配列番号7または配列番号8の残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266および268に対応する残基を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR1領域が、配列番号7または配列番号8の残基257に対応する残基にて、Y、R、K、またはDを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記HVR1領域が、配列番号7または配列番号8の残基215〜270を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基198〜344に対し、少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基210に対応する残基にて、G、S、またはAを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基271に対応する残基にて、E、Q、またはKを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基271に対応する残基を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7または配列番号8の残基198〜344を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 操作された前記メガヌクレアーゼがリンカーを含み、前記リンカーが、前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットを共有結合的につなぐ、請求項1〜26のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 操作された前記メガヌクレアーゼが、配列番号7または配列番号8の前記アミノ酸配列を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 配列番号9として規定されているTRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼが、向上した特異性、細胞中の維持時間の減少、および前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の改変の効率の増強といった、最適化された特徴のうち少なくとも1つを示す、請求項1〜28のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
- 請求項1〜29のいずれか一項に記載の操作された前記メガヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、請求項1〜29のいずれか一項に記載の操作された前記メガヌクレアーゼおよび少なくとも1つの追加のポリペプチドまたは核酸をコードしているポリシストロニックmRNAである、請求項31に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項30に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。
- 前記組換えDNA構築物がウイルスベクターをコードする、請求項33に記載の組換えDNA構築物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
- 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項34または請求項35に記載の組換えDNA構築物。
- 請求項30に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはAAVベクターである、請求項37に記載のウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項37または請求項38に記載のウイルスベクター。
- 遺伝子改変された真核細胞の染色体中へと挿入される関心対象の外因性配列を含む、前記遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、
(a)請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードしており、前記操作されたメガヌクレアーゼが、前記真核細胞にて発現されている第1の核酸と、
(b)関心対象の前記配列を含む、第2の核酸と、
を含む、1つまたは複数の核酸を、真核細胞中へと挿入することを含み、前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号5を含む認識配列にて、前記染色体中に切断部位を作製し、
関心対象の前記配列は、前記切断部位にて前記染色体中へと挿入されている、方法。 - 前記第2の核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、関心対象の前記配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入されている、請求項40に記載の方法。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された前記細胞では低下している、請求項40または請求項41に記載の方法。
- 前記真核細胞がヒトT細胞、またはヒトT細胞から誘導された細胞、またはヒトNK細胞、またはヒトNK細胞から誘導された細胞である、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 関心対象の前記配列が、キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項44に記載の方法。
- 少なくとも前記第1の核酸が、mRNAによって前記真核細胞中へと導入される、請求項40〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも前記第2の核酸が、ウイルスベクターによって前記真核細胞中へと導入される、請求項40〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはAAVベクターである、請求項47に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項47または請求項48に記載の方法。
- 遺伝子改変された真核細胞の染色体中へと挿入される関心対象の外因性配列を含む、遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
(a)請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼを、真核細胞に導入することと、
(b)前記真核細胞へと関心対象の前記配列を含む核酸を導入することと、を含み、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号5を含む認識配列にて、前記染色体中に切断部位を作製し、
関心対象の前記配列は、前記切断部位にて前記染色体中へと挿入されている、方法。 - 前記核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、関心対象の前記配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入されている、請求項50に記載の方法。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項50または請求項51に記載の方法。
- 前記真核細胞がヒトT細胞、またはヒトT細胞から誘導された細胞、またはヒトNK細胞、またはヒトNK細胞から誘導された細胞である、請求項50〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項50〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記の核酸が、ウイルスベクターによって前記真核細胞中へと導入される、請求項50〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはAAVベクターである、請求項56に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、組換えAAVベクターである、請求項55または請求項56に記載の方法。
- 遺伝子改変された真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することによって遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードしている核酸配列を、真核細胞に導入することを含み、前記操作されたメガヌクレアーゼは前記真核細胞で発現されており、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号5を含む認識配列にて前記染色体中に切断部位を作製し、前記ターゲット配列は、前記切断部位にて非相同末端結合することで破壊されている、方法。 - 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項59に記載の方法。
- 前記真核細胞が、ヒトT細胞、またはヒトT細胞から誘導された細胞、またはヒトNK細胞、またはヒトNK細胞から誘導された細胞である、請求項59または請求項60に記載の方法。
- 前記核酸が、mRNAによって前記真核細胞中へと導入される、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子改変された真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することによって遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
請求項1〜29のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号5を含む認識配列にて前記染色体中に切断部位を作製し、前記ターゲット配列は、前記切断部位にて非相同末端結合することで破壊されている、方法。 - 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項63に記載の方法。
- 前記真核細胞が、ヒトT細胞、またはヒトT細胞から誘導された細胞、またはヒトNK細胞、またはヒトNK細胞から誘導された細胞である、請求項63または請求項64に記載の方法。
- 請求項40〜58のいずれか一項に記載の前記方法によって調製されている、遺伝子改変された真核細胞。
- 前記細胞が、配列番号9として規定されているTRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼによるオフターゲット効果の低下、前記真核細胞中の操作された前記メガヌクレアーゼの維持時間の減少、またはその両方を含む、請求項66に記載の遺伝子改変された真核細胞。
- 請求項59〜65のいずれか一項に記載の前記方法によって調製された、遺伝子改変された真核細胞。
- 前記細胞が、配列番号9として規定されているTRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼによるオフターゲット効果の低下、前記真核細胞中の操作された前記メガヌクレアーゼの維持時間の減少、またはその両方を含む、請求項68に記載の遺伝子改変された真核細胞。
- 請求項66または請求項67に記載の、複数の遺伝子改変された前記真核細胞を含む、遺伝子改変された真核細胞の集団。
- 少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または最大100%の前記集団中の細胞が、請求項66または請求項67に記載の前記遺伝子改変された真核細胞である、請求項70に記載の集団。
- 前記遺伝子改変された真核細胞が、遺伝子改変されたヒトT細胞、または遺伝子改変されたヒトT細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたNK細胞、または遺伝子改変されたNK細胞から誘導された細胞である、請求項70または請求項71に記載の集団。
- 前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項70〜72のいずれか一項に記載の集団。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項73に記載の集団。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項70〜74のいずれか一項に記載の集団。
- 請求項68または請求項69に記載の、複数の前記遺伝子改変された真核細胞を含む、遺伝子改変された真核細胞の集団。
- 少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または最大100%の前記集団中の細胞が、請求項68または請求項69に記載の前記遺伝子改変された真核細胞である、請求項76に記載の集団。
- 前記遺伝子改変された真核細胞が、遺伝子改変されたヒトT細胞、または遺伝子改変されたヒトT細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたNK細胞、または遺伝子改変されたNK細胞から誘導された細胞である、請求項76または請求項77に記載の集団。
- 前記遺伝子改変された真核細胞が、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体を含む、請求項76〜78のいずれか一項に記載の集団。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項79に記載の集団。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項76〜80のいずれか一項に記載の集団。
- 治療の必要がある対象において、疾患の治療に有用である薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および治療有効量の請求項66もしくは請求項67に記載の前記遺伝子改変された真核細胞、または請求項70〜75のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変された真核細胞の集団を含む、薬学的組成物。
- 遺伝子改変された前記真核細胞または前記集団が、遺伝子改変されたヒトT細胞、または遺伝子改変されたヒトT細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたNK細胞、または遺伝子改変されたNK細胞から誘導された細胞から成る、請求項82に記載の薬学的組成物。
- 前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項82または請求項83に記載の薬学的組成物。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項84に記載の薬学的組成物。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項82〜85のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 治療の必要がある対象において、疾患の治療に有用である薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および治療有効量の請求項68もしくは請求項69に記載の前記遺伝子改変された真核細胞、または請求項76〜81のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核細胞の前記集団を含む、薬学的組成物。
- 遺伝子改変された前記真核細胞または前記集団が、遺伝子改変されたヒトT細胞、または遺伝子改変されたヒトT細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたNK細胞、または遺伝子改変されたNK細胞から誘導された細胞から成る、請求項87に記載の薬学的組成物。
- 前記遺伝子改変された真核細胞が、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体を含む、請求項87または請求項88に記載の薬学的組成物。
- 前記キメラ抗原受容体または前記外因性T細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項89に記載の薬学的組成物。
- 内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項87〜90のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 治療の必要がある対象において疾患を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の請求項66〜69のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変された真核細胞または請求項70〜81のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核細胞の前記集団を投与することを含む、方法。
- 前記方法が、前記対象に、請求項82〜91のいずれか一項に記載の前記薬学的組成物を投与することを含む、請求項80に記載の方法。
- 前記方法が、治療の必要がある対象において癌を治療するための免疫療法であり、前記遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトT細胞、または遺伝子改変されたヒトT細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたNK細胞、または遺伝子改変されたNK細胞から誘導された細胞であり、前記遺伝子改変された真核細胞が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性T細胞受容体を含み、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、内因性T細胞受容体の細胞表面発現が、前記遺伝子改変された真核細胞で低下している、請求項92または請求項93に記載の方法。
- 前記癌が、細胞腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、および白血病といった癌から成る群から選択される、請求項94に記載の方法。
- 前記癌が、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫から成る群から選択される、請求項94または請求項95に記載の方法。
- 前記B細胞起源の癌が、B細胞系急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ性白血病、B細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から成る群から選択される、請求項96に記載の方法。
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