JP7058223B2 - トランスジェニックｔ細胞及びキメラ抗原受容体ｔ細胞組成物及び関連方法 - Google Patents

トランスジェニックｔ細胞及びキメラ抗原受容体ｔ細胞組成物及び関連方法 Download PDF

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Description

(1.関連出願の相互参照)
本出願は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2016年4月15日に出願された米国仮出願第62/323,623号、2016年4月16日に出願された米国仮出願第62/323,675号、2017年2月21日に出願された米国仮出願第62/461,677号、及び2017年2月22日に出願された米国仮出願第62/462,243号の恩典を主張する。
(2.電子的に提出された配列表の参照)
本出願は、2017年4月7日に作成された、76,426バイトのサイズを有する、「13542-043-228_SL.txt」と題するASCIIテキストファイルとして、配列表を本出願とともに引用により組み込む。
(3.分野)
本発明は、全体として、免疫療法、より具体的には、改変された免疫細胞、例えば、T細胞を用いた免疫療法に関する。
(4.背景)
標的化免疫療法は、癌、感染性障害、及び自己免疫障害を含む、種々の疾患を治療するために、免疫細胞又は免疫細胞と結合する分子の使用に頼っている(Miller及びSadelainの文献、Cancer Cell. 27(4):439-49(2015); Sabatos-Peytonらの文献、Curr. Opin. Immunol. 22(5):609-615(2010); McLeod及びAndertonの文献、Curr. Opin. Pharmacol. 23:1-108(2015))。最近、腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)を発現させるT細胞の遺伝子修飾は、ヒトにおける白血病細胞の根絶の成功を可能にした(Brentjensらの文献、Sci. Transl. Med. 5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930(2013))。後者の手法において、CARをコードする相補的DNA(cDNA)は、組込み可能なγ-レトロウイルス又はレンチウイルスを介してT細胞に送達される。これらの組換えウイルスベクターは、半ランダムな様式でのヒトゲノムへのウイルスDNAの組込みを触媒する、ウイルスインテグラーゼ酵素を必要とする(Schroderらの文献、Cell 110(4):521-529(2002); Wuらの文献、Science 300(5626):1749-1751(2003))。第三の手法は、その成分を、ウイルス粒子を必要とせずに細胞内に送達することができる、DNA転位機構を利用している。この場合、DNAトランスポザーゼは、これも半ランダムな様式で、ヒトゲノムへのDNAトランスポゾン(対象となる遺伝子を含む)の組込みを行う(Yantらの文献、Mol. Cell. Biol. 25(6):2085-2094(2005))。上述の遺伝子送達方法は全て、組み込まれるベクターのゲノム位置が異なるために、不均一なCAR発現を示すT細胞集団を産生する。この「斑入り発現」は、標的細胞との相互作用に及びT細胞活性化の長さに最適なCAR発現を有する細胞の数を制限する。さらに、この制御されないDNA組込みは挿入による突然変異生成を潜在的に生じる可能性があり、これにより、癌原遺伝子が活性化されるか又は腫瘍抑制遺伝子が不活性化されることがある。これらの遺伝子修飾手法の別の制限は、T細胞がTCRとして知られるその抗原受容体を依然として発現し、該受容体が抗原認識に依然として関与し、そのため、CAR T細胞を活性化することができるということである。この潜在的な副作用は、自己免疫障害を有する患者における自己CAR T細胞の使用、又は任意のレシピエントにおける同種異系CAR T細胞の使用を制限するものであり、これらは、T細胞がレシピエントの組織を攻撃し得る(最初の例では自己免疫、後者の例では、移植片対宿主病(GvHD)を引き起こす)、2つの状況である。
相同組換えによる細胞の遺伝子修飾は、選択されたゲノム部位での外因性DNAの正確な組込みを可能にする(Cappechiらの文献、Nat. Rev. Genet. 6(6):507-512(2005))。プロモーター含有CARコンストラクトがヒト初代T細胞のCCR5遺伝子座に標的化され、それにより、修飾されたT細胞が腫瘍細胞をインビトロで死滅させることが可能になった標的化送達が最近記載された(Satherらの文献、Sci. Transl. Med. 7(307):307ra156. doi: 10.1126/scitranslmed.aac5530(2015))。興味深いものの、著者らは、MNDプロモーターによって駆動されるCAR発現がCCR5遺伝子座で一定に保たれることができるかどうかを示さず、より重要なことに、著者らは、CAR発現のレベルが腫瘍細胞をインビボで根絶するのに最適であることを示さなかった。さらに、CCR5破壊は、西ナイルウイルス感染に対する感受性の増大と関連付けられている(Limらの文献、Trends Immunol. 27(7):308-312(2006))。
キメラ抗原受容体(CAR)を用いる養子免疫療法は白血病の治療において顕著な臨床結果を示しており、癌を治療するための最も有望な新しい戦略の一つである。現行の臨床プロトコルは、アフェレーシスによって回収され、かつ細胞外腫瘍分子の認識及び改変されたT細胞の活性化に関与するCARを安定発現するようにレトロウイルスベクターで改変される自己T細胞を利用している。この手法は、患者特異的な細胞製造を必要とし、これにより、最終的な細胞産物における患者間のばらつきが不可避的に生じる。この手法の広範な実施は、CAR T細胞に対する需要を満たすために細胞製造の自動化及び操作の進歩をさらに必要とする。さらに、現行の手法は、全て半ランダムな組込みとトランスジーンの斑入りによるCARの発現のばらつきとをもたらす、γ-レトロウイルス、レンチウイルス、及びトランスポゾンを含む、ランダムに組み込むベクターを利用している。位置効果は、不均一なT細胞機能、トランスジーンのサイレンシング、及び潜在的に、挿入による発癌をもたらし得る。したがって、自己細胞調達とランダムなベクター組込みが同時に行われると、効力にばらつきがある細胞産物を作製しやすい。
CRISPR/Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はTALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、様々なオーダーメイドのヌクレアーゼが、これまでに、初代T細胞を含む広範囲のヒト細胞における遺伝子破壊に使用されている。場合により、これらのヌクレアーゼは、T細胞受容体(TCR)又はHLAクラスI発現を妨害することにより、同種異系投与用の、いわゆる、「汎用T細胞」を作製するために使用されているが、その全てが半ランダムなトランスジーン組込み及びその下流の結果をもたらすウイルスベクター又はスリーピングビューティートランスポゾンがCAR cDNAを送達するために使用された。
TCR発現がCAR T細胞の同種抗原反応性に対して有し得る負の影響に対処するために、いくつかの研究室が、TCRα又はβ鎖の定常領域の5'末端を特異的に標的化及び切断するオーダーメイドのヌクレアーゼ(ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、及びCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ)を設計した(Provasiらの文献、Nat. Med. 18(5):807-815(2012); Poirotらの文献、Cancer Res. 75(18):3853-3864(2015); Osbornらの文献、Mol. Ther. 24(3):570-581(2016))。どちらの部位での切断も、非相同末端結合(NHEJ)と呼ばれるDNA修復機構を介して組み込まれるDNA修飾を生じさせる。突然変異した領域は、そのそれぞれの定常領域を有する再編成されたV(D)J遺伝子間の正確なスプライシングを妨げ、それにより、細胞表面におけるTCR複合体の適切な会合を妨げる。次に、GVHDを引き起こすことができない、これらのTCR陰性細胞が、トランスポゾン又はレンチウイルスにより送達されるCARを発現させるために使用された(Torikaiらの文献、Blood 119(24):5697-5705(2012); Poirotらの文献、Cancer Res. 75(18):3853-3864(2015))。これらのCAR T細胞はGVHDを引き起こし得るTCRを発現しないという利点を有するが、該細胞は、CAR遺伝子の半ランダムな組込みによる上述の潜在的な危険(斑入り発現、挿入による突然変異生成)を依然として示す。
T細胞などの細胞を遺伝子改変するためのこれまでに記載されている手法は、ウイルスベクター内の誘導性プロモーターの使用(例えば、レトロウイルスベクター、もしくはsynNotchコンストラクト中のNFATプロモーター)、又は転写もしくはタンパク質凝集を制御する小分子の使用を含む(Ponomarevらの文献、Neoplasia 3(6):480-488(2001); Zhangらの文献、Mol. Ther. 19(4): 751-759(2011); Roybalらの文献、Cell 167(2):419-432, e16(2016): Wuらの文献、Science 16;350(6258):aab4077(2015); Juilleratらの文献、Sci. report 18950(2016))。これらの手法は、ランダムに組み込まれるトランスジーンの斑入り発現、静脈内薬物注入の必要性及びこれらの薬物の薬力学的制限、並びにこれらの手法のいくつかにおいて使用される一部のタンパク質成分(例えば、キメラ転写因子、免疫原性タンパク質ドメイン)の免疫原性を含む、いくつかの複雑な事態及び障害の影響を受けやすい。
キメラ抗原受容体(CAR)は、腫瘍拒絶を媒介するようにT細胞を方向転換及び再プログラミングする合成受容体である(Jensenらの文献、Curr. Opin. Immunol. 33:9-15(2015))。今まで使用された最も良好なCARはCD19を標的とするものであり(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9:279-286(2003))、これは、化学療法抵抗性/再発性B細胞悪性腫瘍を有する患者における完全寛解の展望を与えるものである(Sadelainの文献、J. Clin. Invest. 125:3392-3400(2015))。CARは、典型的には、γ-レトロウイルス(Sadelainらの文献、Ninth International Immunology Congress, Budapest, 88:34(1992))又は他のランダムに組み込むベクター(Wangらの文献、Mol. Ther. Oncolytics 3:16015(2016))を用いて患者のT細胞に形質導入され、これにより、クローン性増殖、発癌性形質転換、斑入りトランスジーン発現、及び転写サイレンシングがもたらされ得る(Ellisの文献、Hum. Gene. Ther. 16:1241-1246(2005); Riviereらの文献、Blood 119:1107-1116(2012); von Kalleらの文献、Hum. Gene Ther. 25:475-481(2014))。ゲノム編集における最近の進歩により、ヒト細胞への効率的な配列特異的介入が可能になり(Wrightらの文献、Cell 164:29-44(2016); Tsaiらの文献、Nat. Rev. Genet. 17:300-312(2016))、これには、CCR5及びAAVS1遺伝子座への標的化遺伝子送達が含まれる(Lombardoらの文献、Nat. Methods 8:861-869(2011); Satherらの文献、Sci. Transl. Med. 7:307ra156(2015))。
したがって、癌又は他の疾患の治療などの免疫療法を用いて、改善された治療を提供する療法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たすものである。
(5.発明の概要)
本発明は、本明細書において、下記のように提示される特許請求の範囲によって反映される。本発明は、トランスジーンの発現が内在性プロモーターの制御下にあるように、トランスジーンがT細胞のゲノム内に組み込まれるT細胞、及びそのような細胞の使用方法に関する。
一態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞であって、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、T細胞である。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的核酸をコードする。特定の実施態様において、トランスジーンは、ゲノム内の単一の部位で組み込まれる。特定の実施態様において、トランスジーンは、細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる。特定の実施態様において、該第一の部位は、内在性プロモーターの制御下にある内在性遺伝子のエクソンである。特定の実施態様において、該第一の部位は、内在性遺伝子の第一のエクソン内にある。
トランスジーンが上記のT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、内在性プロモーターは構成的である。特定の実施態様において、構成的である内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される。
トランスジーンが上記のT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。特定の実施態様において、T細胞のサブセットで活性がある内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される。
トランスジーンが上記のT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、内在性プロモーターは誘導性である。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導されるプロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、T細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される特定の実施態様において、該抑制性受容体は、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、細胞と核酸との接触によって誘導される。プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される特定の実施態様において、該核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。プロモーターがウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される核酸との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、細胞と代謝物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導されるプロモーターは、PKM2プロモーターである。
特定の実施態様において、誘導性である内在性プロモーターは、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される。特定の実施態様において、該イオンは、カリウム又はカルシウムである。特定の実施態様において、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導されるプロモーターは、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される。
トランスジーンが上記のT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該トランスジーンは、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする。
特定の実施態様において、トランスジーンは、サイトカインをコードする。一実施態様において、任意に、サイトカインは免疫刺激性である。特定の実施態様において、免疫刺激性であるサイトカインは、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される。別の実施態様において、任意に、サイトカインは免疫抑制性である。特定の実施態様において、免疫抑制性であるサイトカインは、TGFβ及びIL10からなる群から選択される。
特定の実施態様において、トランスジーンは、抗体をコードする。特定の実施態様において、任意に、抗体は、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される。
特定の実施態様において、トランスジーンは、CARをコードする。特定の実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
上記のように、トランスジーンがT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、標的抗原に対して感作される。
上記のように、トランスジーンがT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)は、レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム内に組み込まれる。
上記のように、トランスジーンがT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞はヒトに由来する。ヒトに由来するT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
上記のように、トランスジーンがT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該トランスジーンは、標的化相同組換えによって該第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される。
上記のように、トランスジーンがT細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該トランスジーンは、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位でのトランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞であって、第一のトランスジーンの発現が該T細胞の第一の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第一のトランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンの発現が第二の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第二のトランスジーンが該T細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、ここで、該第一及び第二の内在性プロモーターが異なるプロモーターであり、該第一のトランスジーンが第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸をコードし、該第二のトランスジーンが第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸をコードし、好ましくは、ここで、該第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸が、それぞれ、該第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸と異なっている、T細胞である。特定の実施態様において、第一のトランスジーンは、第一の治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、第一のトランスジーンは、第一の治療的核酸をコードする。特定の実施態様において、第二のトランスジーンは、第二の治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、第二のトランスジーンは、第二の治療的核酸をコードする。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、第一の内在性プロモーターは構成的であり、第二の内在性プロモーターは誘導性である。特定の実施態様において、構成的プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、該第一の内在性プロモーター及び/又は該第二の内在性プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。特定の実施態様において、第一の内在性プロモーター及び/又は第二の内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から独立に選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、及び4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。誘導性プロモーターがT細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される特定の実施態様において、該誘導性プロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該抑制性受容体は、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される。特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。特定の実施態様において、サイトカインは、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される。特定の実施態様において、サイトカインは、インターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される。特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、該細胞と核酸との接触によって誘導される。特定の実施態様において、核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。誘導性プロモーターが細胞とウイルスDNA、ウイルスRNA、又は細胞内マイクロRNAとの接触によって誘導される特定の実施態様において、該誘導性プロモーターは、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、該細胞と代謝物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、そのような誘導性プロモーターは、PKM2プロモーターである。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される。特定の実施態様において、該イオンは、カリウム又はカルシウムである。誘導性プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される特定の実施態様において、誘導性プロモーターは、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーン及び/又は該第二のトランスジーンは、各々、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から独立に選択される分子をコードする。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーン及び/又は該第二のトランスジーンは、サイトカインをコードする。第一及び/又は第二のトランスジーンがサイトカインをコードする特定の実施態様において、該サイトカインは、好ましくは、免疫刺激性である。サイトカインが免疫刺激性である特定の実施態様において、該サイトカインは、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンがサイトカインをコードする特定の実施態様において、該サイトカインは、好ましくは、免疫抑制性である。サイトカインが免疫抑制性である特定の実施態様において、該サイトカインは、TGFβ及びIL10からなる群から選択される。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーン及び/又は該第二のトランスジーンは、抗体をコードする。特定の実施態様において、抗体は、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディである。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーン及び/又は該第二のトランスジーンは、CARをコードする。特定の実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、標的抗原に対して感作される。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)は、レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム内に組み込まれる。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞はヒトに由来する。ヒトに由来するT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーン及び/又は該第二のトランスジーンは、標的化相同組換えによって該第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される。
上記のように、第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸は、それぞれ、該第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸と異なっている。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、第二の内在性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。
第一のトランスジーンがゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、かつ第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性であるT細胞の特定の実施態様において、該第一のトランスジーンは、CARをコードする。第一のトランスジーンがCARをコードする特定の実施態様において、第一の内在性プロモーターは、T細胞受容体プロモーターである。特定の実施態様において、T細胞受容体プロモーターは、T細胞受容体α鎖プロモーター、T細胞受容体β鎖プロモーター、CD3γ鎖プロモーター、CD3δ鎖プロモーター、CD3ε鎖プロモーター、及びCD3ζ鎖プロモーターからなる群から選択される。特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞受容体α鎖プロモーターである。
前述の実施態様が、免疫抑制性であるサイトカイン、例えば、TGFβ又はIL10をコードするトランスジーンに関するものである場合を除き、上記のT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、免疫刺激性T細胞である。T細胞が免疫抑制性T細胞である特定の実施態様において、該T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、及びTfh(濾胞性ヘルパー)細胞からなる群から選択される。具体的な実施態様において、T細胞はCD4+である。具体的な実施態様において、T細胞はCD8+である。
前述の実施態様が、免疫刺激性であるサイトカインをコードするトランスジーンに関するものである場合を除き、上記のT細胞の特定の実施態様において、例えば、該サイトカインは、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択され、該T細胞は、免疫抑制性T細胞である。具体的な実施態様において、T細胞は、制御性T細胞である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、複数の上記の実施態様のT細胞を含む、単離されたT細胞集団である。特定の実施態様において、単離されたT細胞集団は、上記の免疫刺激性T細胞を含む。特定の実施態様において、単離されたT細胞集団は、上記の免疫抑制性T細胞を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様のT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞集団(この集団は、複数の上記の実施態様のT細胞を含む)の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様のT細胞(ここで、該T細胞は、上記の免疫刺激性T細胞である)の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞集団(この集団は、複数の上記の実施態様のT細胞を含み、ここで、該T細胞は、上記の免疫刺激性T細胞である)の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、上記の実施態様のT細胞(ここで、該T細胞は、上記の免疫抑制性細胞である)の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞集団(この集団は、複数の上記の実施態様のT細胞を含み、ここで、該T細胞は、上記の免疫抑制性T細胞である)の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、上記の実施態様のT細胞の治療的有効量を投与することを含む、方法である。別の態様において、また本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、上記の実施態様のT細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、方法である。さらに別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、上記の実施態様の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
上記の本発明の方法の特定の実施態様において、対象はヒトであり、T細胞はヒトに由来する。上記の本発明の方法の特定の実施態様において、T細胞は、対象にとって自己である。上記の本発明の方法の特定の実施態様において、T細胞は、対象にとって非自己である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、該対象に、細胞又は細胞集団の治療的有効量を投与することを含み、ここで、該細胞がT細胞であり、ここで、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、方法である。特定の実施態様において、該細胞又は細胞集団は、医薬組成物として対象に投与される。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的核酸をコードする。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、ゲノム内の単一の部位で組み込まれる。特定の実施態様において、ここで、トランスジーンは、細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる。特定の実施態様において、ここで、第一の部位は、内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子のエクソンである。具体的な実施態様において、第一の部位は、内在性遺伝子の第一のエクソン内にある。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは構成的である。特定の実施態様において、構成的プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある特定の実施態様において、内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは誘導性である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該抑制性受容体は、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞と核酸との接触によって誘導される。特定の実施態様において、核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。プロモーターが、該細胞とウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される核酸との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞と代謝物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される具体的な実施態様において、該プロモーターは、PKM2プロモーターである。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される。特定の実施態様において、該イオンは、カリウム又はカルシウムである。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、サイトカインをコードする。特定の実施態様において、任意に、サイトカインは免疫刺激性である。サイトカインが免疫刺激性である特定の実施態様において、該サイトカインは、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、抗体をコードする。特定の実施態様において、任意に、抗体は、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、CARをコードする。具体的な実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、標的抗原に対して感作される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)は、該レポータートランスジーンの発現がプロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム内に組み込まれる。好ましくは、そのようなプロモーターは、T細胞の内在性プロモーターである。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞はヒトに由来する。特定の実施態様において、T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位でのトランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、免疫刺激性T細胞である。特定の実施態様において、T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、及びTfh(濾胞性ヘルパー)細胞からなる群から選択される。具体的な実施態様において、T細胞はCD4+である。別の具体的な実施態様において、T細胞はCD8+である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、該対象は癌を有する。具体的な実施態様において、癌は白血病である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、該対象は腫瘍を有する。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、該対象はヒトであり、T細胞はヒトに由来する。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、対象にとって自己である。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の刺激を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、対象にとって非自己である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、該対象に、細胞又は細胞集団の治療的有効量を投与することを含み、ここで、該細胞がT細胞であり、ここで、トランスジーンの発現がT細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、方法である。特定の実施態様において、該細胞又は細胞集団は、医薬組成物として投与される。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的核酸をコードする。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、ゲノム内の単一の部位で組み込まれる。特定の実施態様において、トランスジーンは、細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる。特定の実施態様において、第一の部位は、内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子のエクソンである。特定の実施態様において、第一の部位は、内在性遺伝子の第一のエクソン内にある。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは構成的である。特定の実施態様において、構成的プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。特定の実施態様において、T細胞のサブセットで活性がある内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは誘導性である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該抑制性受容体は、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、該細胞と核酸との接触によって誘導される。特定の実施態様において、核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。プロモーターが、該細胞とウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される核酸との接触によって誘導される特定の実施態様において、プロモーターは、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞と代謝物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、PKM2プロモーターである。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、かつ内在性プロモーターが誘導性である方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される。特定の実施態様において、該イオンは、カリウム又はカルシウムである。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、サイトカインをコードする。特定の実施態様において、任意に、サイトカインは免疫抑制性である。特定の実施態様において、免疫抑制性であるサイトカインは、TGFβ及びIL10からなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、抗体をコードする。特定の実施態様において、任意に、抗体は、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、CARをコードする。具体的な実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、標的抗原に対して感作される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)は、該レポータートランスジーンの発現がプロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム内に組み込まれる。好ましくは、レポーターは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にある。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞はヒトに由来する。特定の実施態様において、T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、トランスジーンは、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、T細胞は、免疫抑制性T細胞である。具体的な実施態様において、免疫抑制性T細胞は、制御性T細胞である。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、該対象はヒトであり、T細胞はヒトに由来する。
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、細胞は、対象にとって自己である。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、上記のように、該対象が免疫応答の抑制を必要としている方法の特定の実施態様において、細胞は、対象にとって非自己である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法であって: T細胞に:(i)トランスジーン、及び(ii)該細胞のゲノム内の部位における該トランスジーンの標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該トランスジーンを該細胞のゲノム内の該部位で組み込み、ここで、該トランスジーンの発現が内在性プロモーターの制御下にあり、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、相同組換えシステムを導入することを含む、方法である。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的タンパク質をコードする。特定の実施態様において、トランスジーンは、治療的核酸をコードする。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは構成的である。特定の実施態様において、内在性の構成的プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある特定の実施態様において、内在性プロモーターは、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、内在性プロモーターは誘導性である。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該内在性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、及び4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。特定の実施態様において、該抑制性受容体は、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該サイトカインは、インターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、該細胞と核酸との接触によって誘導される。特定の実施態様において、核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。プロモーターが該細胞とウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される核酸との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、該細胞と代謝物質との接触によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、PKM2プロモーターである。
上記のように、治療的トランスジーンを発現し、かつ内在性プロモーターが誘導性であるT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該プロモーターは、細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される。特定の実施態様において、該イオンは、カリウム又はカルシウムである。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される特定の実施態様において、該プロモーターは、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、サイトカインをコードする。特定の実施態様において、任意に、サイトカインは免疫刺激性である。特定の実施態様において、免疫刺激性サイトカインは、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される。特定の実施態様において、任意に、サイトカインは免疫抑制性である。特定の実施態様において、免疫抑制性サイトカインは、TGFβ及びIL10からなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、抗体をコードする。特定の実施態様において、任意に、抗体は、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、CARをコードする。具体的な実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、T細胞は、標的抗原に対して感作される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)は、レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム内に組み込まれる。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該T細胞はヒトに由来する。特定の実施態様において、T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該トランスジーンは、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該細胞に導入されるトランスジーンは、標的化コンストラクトに含まれる。特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、ウイルス核酸配列を含む。特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、天然又は組換えアデノ随伴ウイルス(AVV)ウイルス粒子にパッケージングされる。具体的な実施態様において、AAV粒子は、AAV6配列を含む。特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、非組込み型γ-レトロウイルスにパッケージングされる。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、標的化コンストラクト中のトランスジーンは、プロモーターに機能的に連結されていない。
上記のように、治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該方法は、第二のトランスジーンを該T細胞に導入することをさらに含む。特定の実施態様において、第一のトランスジーンは、内在性の構成的プロモーターの制御下にあり、第二のトランスジーンは、内在性の誘導性プロモーターの制御下にある。特定の実施態様において、第一のトランスジーンはCARである。トランスジーンがCARである特定の実施態様において、内在性の構成的プロモーターは、T細胞受容体プロモーターである。プロモーターがT細胞受容体プロモーターである特定の実施態様において、該プロモーターは、T細胞受容体α鎖プロモーター、T細胞受容体β鎖プロモーター、CD3γ鎖プロモーター、CD3δ鎖プロモーター、CD3ε鎖プロモーター、及びCD3ζ鎖プロモーターからなる群から選択される。具体的な実施態様において、該プロモーターは、T細胞受容体α鎖プロモーターである。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、非組込み型γ-レトロウイルスを含むベクターである。ある実施様において、非組込み型γ-レトロウイルスは、突然変異があるインテグラーゼを含む。特定の実施態様において、突然変異があるインテグラーゼは、DDEモチーフに突然変異がある。特定の実施態様において、突然変異があるインテグラーゼは、D124A、D124E、D124N、D124V、D183A、D183N、D124AとD183A、D124AとD183N、D124EとD183A、D124EとD183N、D124NとD183A、D124NとD183N、D124VとD183A、及びD124VとD183Nからなる群から選択される突然変異を有する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、T細胞である。特定の実施態様において、CARをコードする核酸配列は、ゲノム内の単一の部位で組み込まれる。特定の実施態様において、CARをコードする核酸配列は、細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる。特定の実施態様において、第一の部位は、TCR複合体のタンパク質をコードする遺伝子のエクソンである。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該CARをコードする核酸配列の該第一の部位での組込みは、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、及びCD3ζ鎖からなる群から選択されるタンパク質の発現を低下させ又は妨げる。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞における組み込まれた核酸配列の発現は、内在性プロモーターの制御下にある。特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞受容体複合体プロモーターである。特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、Tfh(濾胞性ヘルパー)細胞、及びT制御性細胞からなる群から選択される。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該T細胞はヒトに由来する。特定の実施態様において、T細胞は、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該CARをコードする核酸配列は、標的化相同組換えによって該第一の部位に組み込まれる。特定の実施態様において、標的化相同組換えは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを用いて実施される。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、該CARをコードする核酸配列は、該細胞のゲノム内の複数の部位に、及び該複数の部位での該CARをコードする核酸配列の発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、CARをコードする核酸配列は、CARが該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該細胞のゲノム内の第二の部位でも組み込まれる。特定の実施態様において、CARをコードする核酸の第二の部位での組込みも、細胞の表面での機能的TCR複合体の発現を低下させ又は妨げ、ここで、該第一の部位及び該第二の部位は、異なる遺伝子中にある。
上記のように、CARをコードする組換え核酸配列が細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれるT細胞の特定の実施態様において、第二のCARをコードする第二の核酸配列は、第二のCARが該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、及び第二の核酸配列の発現が第二の部位で内在性プロモーターの制御下にあるように、該細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、ここで、該第一の部位及び該第二の部位は、異なる遺伝子中にある。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトT細胞であって、CARが内在性TCRα鎖プロモーターの制御下で発現されて、該細胞の表面で該CARを産生するように、該CARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が、TCRα鎖の第一のエクソンである該細胞のゲノム内の部位で組み込まれ、かつ該CARの該部位での組込みが機能的TCRα鎖の発現を低下させ又は妨げる、ヒトT細胞である。特定の実施態様において、CARは、CD19に結合する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたT細胞集団であって、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる複数の上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である複数の上記の細胞を含む、単離されたT細胞集団である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である上記の細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、T細胞集団であって、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる複数の上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である上記の細胞を含む、T細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である上記の細胞の治療的有効量を投与することを含む、方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である上記の細胞の治療的有効量を含む上記の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる複数の上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である複数の上記の細胞を含む上記の細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、T細胞集団(この集団は、CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれる複数の上記の細胞、又はCARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の部位で組み込まれるヒトT細胞である上記の細胞を含む)の治療的有効量を含む上記の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
それを必要としている対象をCAR療法で治療するための上記の方法の特定の実施態様において、該対象は癌を有し、CARは該癌の癌抗原に結合する。具体的な実施態様において、癌は白血病である。
それを必要としている対象をCAR療法で治療するための上記の方法の特定の実施態様において、該対象は腫瘍を有する。
それを必要としている対象をCAR療法で治療するための上記の方法の特定の実施態様において、該対象はヒトであり、細胞はヒトに由来する。
それを必要としている対象をCAR療法で治療するための上記の方法の特定の実施態様において、細胞は、対象にとって自己である。それを必要としている対象をCAR療法で治療するための上記の方法の特定の実施態様において、細胞は、対象にとって非自己である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、キメラ抗原受容体(CAR)を発現し、かつ機能的T細胞受容体(TCR)複合体を欠くT細胞を作製する方法であって: T細胞に:(i)CARをコードする核酸配列、及び(ii)該細胞のゲノム内の部位における該核酸配列の標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該CARの該部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を低下させ又は妨げるように、該CARをコードする核酸配列を該細胞のゲノム内の該部位で組み込む、相同組換えシステムを導入することを含み、それにより、該CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する、方法である。
上記のように、CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、CARの発現は、内在性プロモーターの制御下にある。特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである。
上記のように、CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、相同組換えシステムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、もしくはクラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを含む。
上記のように、CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、該細胞に導入される該CARをコードする核酸配列は、標的化コンストラクトに含まれる。特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、アデノ随伴ウイルス2(AAV2)配列を含む。特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、天然又は組換えアデノ随伴ウイルス(AVV)ウイルス粒子にパッケージングされる。特定の実施態様において、AAV粒子は、AAV6配列を含む。
上記のように、CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、標的化コンストラクト中のCARをコードする核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されていない。
上記のように、CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する方法の特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、5'から3'の順に:第一のウイルス配列、左相同性アーム、自己切断型ブタテッショウウイルス2Aをコードする核酸配列、CARをコードする核酸配列、ポリアデニル化配列、右相同性アーム、及び第二のウイルス配列を含む。特定の実施態様において、第一又は第二のウイルス配列は、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来のものである。特定の実施態様において、AAVは、AAV2、AAV5、又はAAV6である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、誘導多能性幹細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、誘導多能性幹細胞である。
(6.図面の簡単な説明)
図1A～1Eは、TCRα定常(TRAC)遺伝子座へのCARの標的化組込みの解析を示している。図1Aは、オーダーメイドのヌクレアーゼ(TALEN又はCRISPR/Cas9)によって誘導されるTCRα定常(TRAC)遺伝子座への標的化組込みの模式図を示している。標的化コンストラクト(AAV6)は、相同性配列(LHA及びRHA)が両側に隣接しているCAR遺伝子を含有する。ひとたび組み込まれると、CARの発現が内在性TCRaプロモーターによって駆動される一方で、TRAC遺伝子座は破壊される。TRAV: TCRα可変領域。TRAJ: TCRα接続領域。2A:自己切断型ブタテッショウウイルス2A。pA:ウシ成長ホルモンポリA配列。図1Bは、TRAC TALEN mRNAによるT細胞のトランスフェクション及び表記されたMOI(感染多重度)でのAAV6の添加から5日後の代表的なTCR/CARフロープロットを示している。図1Cは、AAV6 MOIに応じたTCR破壊(KO:ノックアウト)及び標的化組込み(KI:ノックイン)のパーセンテージの棒グラフを示している。パーセンテージは、FACS解析により評価した。図1Dは、T細胞へのCARベクター化(CARの発現、細胞内へのCARコーディングの組込みのための適合したベクターの選択)から5日後の平均CAR発現平均蛍光強度(MFI)を示している(n＝6～8回の独立した実験)。図1Eは、CAR発現の分散(平均に対する標準偏差の比)を測るCAR+ T細胞の変動係数を示している。TRAC-P2A-1928z: TRACへの標的化組込み。SFG-1928z: SFGレトロウイルスを用いた半ランダムな組込み。****P＜0.0001(対応のないT-検定)。
図2A～2Eは、TCRα定常(TRAC)遺伝子座へのCARの標的化組込みの解析を示している。図2Aは、CAR及びTCR発現を示すフローサイトメトリー解析を示している。TRAC-P2A-1928zを図1と同様に作製した; TALENによって作製されたTCR細胞にSFG-1928zレトロウイルスを形質導入し; TCR+細胞にSFG-1928zレトロウイルス又はSGF-P28zレトロウイルスのいずれかを形質導入した。図2Bは、CD19+標的細胞で週1回刺激したときの表示されたCAR T細胞の累積細胞数を示している。矢印は、刺激時点を示している。図2Cは、ホタルルシフェラーゼ(FFL)発現NALM6を標的細胞として使用する18時間の生体発光アッセイを用いた細胞傷害活性を示している。データは、平均±SDである。図2D及び2Eは、2×105個のCAR T細胞で処置したFFL-NALM6担持マウスを示している。腫瘍負荷は、40日間にわたって毎週定量された動物1匹当たりの生体発光シグナルとして示されている。定量は、全て所与の時点における動物1匹当たりの腹部及び背部獲得物の平均光子数であり、これは放射輝度として表される。各々の線は、1匹のマウスを表している。群当たりn＝7匹のマウス。右下の図は、図2D及び2Eにおけるマウスの生存のカプラン・マイヤー解析である。
図3A～3Jは、TRAC-CAR T細胞が、インビボでの疲弊を防ぐことにより、従来のCAR T細胞よりも優れていることを示している。図3Aは、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座へのCAR遺伝子組込みを示している。上、TRAC遺伝子座;中、相同性アームが両側に隣接しているCARカセットを含有するrAAV6;下、編集されたTRAC遺伝子座。図3Bは、TRAC標的化から4日後の代表的なTCR/CARフロープロットを示している。図3C及び3Dは、CAR+ T細胞のCAR平均蛍光強度(MFI)(図3C)及びCAR MFI変動係数(図3D)を示している(n＝12回の独立した実験、6匹のドナー)。図3Eは、マウスの生存のカプラン・マイヤー解析を示している。図3F～3Jは、1×105個のCAR T細胞で処置し(群当たりn＝7;ドット＝1匹のマウス)、注入後10日及び17日目に安楽死させたNALM-6担持マウス; FACSによって解析及び計数した骨髄CAR T細胞及びNALM-6細胞を示している(TRAC-1928z、丸; RV-1928z-TCR-、四角; RV-1928z、三角)。図3Fは、CAR T細胞を示している。図3Gは、腫瘍(GFP+CD19+)細胞を示している。図3Hは、CAR T細胞と腫瘍の比を示している。図3Iは、17日目のCAR T細胞におけるエフェクター記憶(CD62L-CD45RA-)及びエフェクター(CD62L-CD45RA+)のパーセンテージを示している。図3Jは、17日目にFACSによって定量される;疲弊マーカーを発現するCAR T細胞のパーセンテージ(それぞれ、内側から外側の環TIM3、LAG3、及びPD1に示された抑制性受容体発現)を示している。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001(ウェルチの2標本t-検定(図3C及び3D);ログランクマンテル・コックス検定(図3E);マン・ホイットニー(図3F-3I))。データは全て、平均±s.d.である。図7～10も参照されたい。
図4A～4Eは、TRAC-CAR T細胞が構成的シグナル伝達及び抗原誘導性分化の低下を示すことを示している。図4Aは、T細胞における活性化、記憶、及び疲弊マーカーのFACS解析を示している(注入後5日目; 3匹のドナーを表す; CD62L/D45RA発現の円グラフ(n＝3、3匹のドナー)。図4Bは、CAR発現及びCD3ζ ITAMリン酸化を示している(3匹のドナーを表す)。RV-19Del、レトロウイルスによって発現される、シグナル伝達ドメインを欠くCD19特異的CAR。図4Cは、CAR+集団におけるホスホ-CD3ζ MFIを示している(n＝3、3匹のドナー; **P＜0.05、マン・ホイットニー検定)。図4Dは、1、2、又は4回刺激されたCAR T細胞におけるCD62L/CD45RA発現を示している。円グラフは、CAR+ T細胞の表現型を示している(異なるドナーに対して、n＝3～5匹)(A、CD45RA+ CD62L+; B、CD45RA- CD62L+; C、CD45RA- CD62L-; D、CD45RA+ CD62L-)。図4Eは、図4Dと同様に回収されたCAR T細胞におけるT-bet、EOMES、及びGATA3発現のヒートマップを示している; 1の増加倍率値は、TRAC-1928zで1回の刺激を表す(n＝2、2匹のドナー)。データは全て、平均±s.d.である。図12も参照されたい。
図5A～5Gは、内在性TRACプロモーターがインビボで他の遺伝子座/プロモーター組合せよりも優れていることを示している。図5Aは、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座へのプロモーター-CAR組込みの模式図を示している。上: TRAC遺伝子座;下:相同性アームが両側に隣接しているプロモーター-CAR-ポリAカセットを含有するrAAV6。図5Bは、CRISPR/Cas9によって標的化されるB2M遺伝子座へのプロモーターレスCAR組込みの模式図を示している。上: B2M遺伝子座;下:相同性アームが両側に隣接しているプロモーターレスCARカセットを含有するrAAV6。図5Cは、T細胞のベクター化から4日後の代表的なB2M/CAR又はTCR/CARフロープロットを示している。図5Dは、4日目のCAR平均蛍光強度(MFI)を示している(n＝4～7回の独立した実験; 4匹のドナー)(左から右に、それぞれ、TRAC-LTR-1928z、B2M-1928z、TRAC-1928z、及びTRAC-EF1α-1928z)。図5Eは、CAR発現を示している。左パネル:4日目のCAR発現(代表的なヒストグラム)。右: 5日目のCAR T細胞の活性化、記憶、及び疲弊マーカーのFACS解析(3匹のドナーを表す)。図5Fは、CD19+標的細胞に対して、0、1、2、又は4回刺激されたCAR T細胞を示している。円グラフは、CAR+ T細胞のCD62L/CD45RA表現型を示している(異なるドナーに対して、n＝3～5回の独立した実験)(A、CD45RA+ CD62L+; B、CD45RA- CD62L+; C、CD45RA- CD62L-; D、CD45RA+ CD62L-)。図5Gは、1×105個のCAR T細胞で処置されたNALM-6担持マウスの腫瘍負荷(平均放射輝度)を示している(n＝6;線＝1匹のマウス)。腫瘍負荷は、生体発光イメージング(BLI)を用いて、50日間にわたって週1回定量した。定量は、全て所与の時点における動物1匹当たりの腹部及び背部獲得物の平均光子数である。各々の線は1匹のマウスを表している。図5Hは、マウス生存のカプラン・マイヤー解析を示している。(A): TRAC-EF1a-1928z CAR T細胞、(B): B2M-1928z CAR T細胞、(C): TRAC-LTR-1928z CAR T細胞、(D): TRAC-1928z CAR T細胞、表示されている通りに標識されたTRAC-1928z。**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001(図5Dについては、ウェルチの2標本t-検定);図5Gについては、ログランクマンテル・コックス検定;図5Hについては、マン・ホイットニー検定)。データは全て、平均±SDである。図14及び15も参照されたい。
図6A～6Fは、TRAC遺伝子座が細胞表面CAR発現の最適な調節をもたらすことを示している。図6Aは、CD19+標的細胞との共培養の前後のCAR発現の代表的なヒストグラムを示している。図6Bは、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座へのCAR-GFP融合遺伝子の組込みを示している。図6C:上、CD19+標的細胞との共培養の前後の2シストロン性CAR-P2A-LNGFR CAR T細胞のLNGFR/CAR発現。下、TRAC遺伝子座に標的化された又はRVベクターでランダムに組み込まれたCAR-GFP融合体のGFP/CAR発現(3匹のドナーに対する3回の独立した実験を表す)。図6Dは、CAR発現を示している。左パネル:ベクター化から5日後のCAR発現の代表的なヒストグラム。右パネル: 1、2、又は4回の刺激後のCAR T細胞の相対CAR MFI(1＝MFI、0時間)(矢印で表示;異なるドナーに対するn＝3～7回の独立した実験)。図6Eは、ベクター化から5日後の相対CAR RNAレベル(1＝TRAC RNAレベル)を示している。図6Fは、CD19+標的細胞に対して1回刺激されたCAR T細胞におけるCAR RNAレベル(1＝RNAレベル、0時間)のタイムコース解析を示している(3匹のドナーに対するn＝3回の独立した実験;上から下、図6Dと同様のCAR T細胞)。データは全て、平均±SDである。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001(ボンフェローニ補正を伴うANOVA F-検定(図6D)、及びマン・ホイットニー検定(図6E))。図16も参照されたい。下の線は、TRAC-1928z CAR T細胞におけるCAR表面レベル(図6D)又はCAR RNAレベル(図6F)を表している。
図7A～7Gは、CRISPR/Cas9によって媒介されるTRAC遺伝子座へのCAR遺伝子標的化を示している。図7A、上、TRACの第一のエクソンの5'末端(グレー)、TRAC gRNA(TGT...GAC、下の鎖)、及び対応するPAM配列(TGT...GACのすぐ左側のGGG)を伴う、TRAC遺伝子座(配列番号41)。2つの矢印は、予測されるCas9二本鎖切断を示している。下、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座への組込み。標的化コンストラクト(AAV)は、TRAC遺伝子座と相同な配列(LHA及びRHA、左及び右相同性アーム)が両側に隣接している、スプライスアクセプター(SA)と、その後ろに、P2Aコード配列、1928z CAR遺伝子、及びポリA配列を含有する。ひとたび組み込まれると、内在性TCRαプロモーターがCAR発現を駆動する一方、TRAC遺伝子座は破壊される。TRAV、TCRα可変領域; TRAJ、TCRα接続領域; 2A、自己切断型ブタテッショウウイルス2A配列。pA:ウシ成長ホルモンポリA配列。図7Bは、初代T細胞へのCAR標的化のタイムラインを示している。図7Cは、Cas9 mRNA及びTRAC gRNAによるT細胞のトランスフェクション及び表示された感染多重度でのAAV6の添加から4日後の代表的なTCR/CARフロープロットを示している。図7Dは、TCR発現のFACS解析によって測定された、Cas9 mRNA及びTRAC gRNAのトランスフェクションから4日後のTCR破壊のパーセンテージを示している(n＝5)。図7Eは、CAR発現のFACS解析によって測定された、AAV6感染多重度に応じたノックインのパーセンテージを示している(n＝4)。図7Fは、TCR陰性集団におけるCAR+細胞のパーセンテージを示している(n＝4)。図7Gは、FACSによって解析されたCAR+集団におけるTCR陽性(下の棒)及びTCR陰性(上の棒)のパーセンテージを示している(n＝4)。
図8A～8Eは、TLA技術を用いたAAV6 TRAC-1928z組込みの全ゲノムマッピングを示している。図8Aは、TLA技術の概略図を示している(de Vreeらの文献、Nat. Biotechnol. 32:1019-1025(2014))。本検討では、CAR及び左相同性アームを標的とする2組のプライマーが使用される。図8Bは、TLA解析に使用されるTRAC-1928z CAR T細胞のTCR/CAR FACSプロットを示している。CAR T細胞は、図7Bと同様に処理し、2週間増殖させた。図8Cは、1928z CAR特異的プライマー(CD28特異的フォワード:
Figure 0007058223000001
 及びscFV特異的リバース:
Figure 0007058223000002
 )を用いたヒトゲノムにわたるTLA配列カバレッジを示している。染色体はy軸に、染色体位置はx軸に示されている。TRACがコードされたCAR T細胞を図3と同様に産生し、10日間増殖させた後、解析用に処理した。プライマーセットを個々のTLA増幅において使用した。PCR産物を精製し、Illumina NexteraXT(商標)プロトコルを用いてライブラリーを調製し、Illumina Miseq(商標)シーケンサーでシークエンシングした。Smith-WatermanアラインメントツールであるBWA-SWを用いて、リードをマッピングした。これにより、切断をまたぐリードを同定するのに最も適している部分的マッピングが可能になる。ヒトゲノムバージョンhg19をマッピングに使用した。図8Dは、AAV-TRAC-1928z配列(ITRが両側に隣接している標的化配列)上で整列させたTLA配列カバレッジを示している。上のグレーの縦棒は、示された位置でのカバレッジを表している。カバレッジは、AAV ITRの組込みを読取りの割合で示した。TRAC相同性アーム遺伝子座の5'末端及び3'末端におけるITR組込みとCAR組込みのカバレッジ比較により、図8Eに示される忠実な相同組換え及び忠実でない相同組換えの測定が可能になる。図8Eは、TLA解析の最終結果を示している。
図9A～9Cは、TRAC-CAR T細胞のインビトロ細胞傷害活性及び増殖応答を示している。図9Aは、CAR及びTCR発現を示す代表的なフローサイトメトリー解析を示している。TRAC-1928z CAR T細胞を図3Bと同様に作製し; CRISPR/Cas9によって作製されたTCR-T細胞にRV-1928zレトロウイルスベクターを形質導入し; TCR+細胞にRV-1928z又はRV-P28z(PSMA特異的CAR)のいずれかを形質導入した。磁気ビーズをカラム上で用いて、TCR陰性T細胞の純化を行った。図9Bは、ホタルルシフェラーゼ(FFL)発現NALM-6を標的細胞として使用する18時間の生体発光アッセイを用いた細胞傷害活性を示している(3匹の健常ドナーに対するn＝3回の独立した実験)。図9Cは、CD19+標的細胞で週1回刺激したときのCAR T細胞の代表的な累積細胞数を示している。矢印は刺激時点を示している(3匹の健常ドナーに対するn＝3回の独立した実験)。
図10A～10Iは、TRAC-CAR T細胞がインビボで従来のCAR T細胞よりも優れていることを示している。図10Aは、2×105個(左)、1×105個(中)、又は5×104個(右)のCAR T細胞で処置されたNALM-6担持マウスを示している。BLIを用いて、腫瘍負荷を100日間にわたって週1回定量した。定量は、全て所与の時点における動物1匹当たりの腹部及び背部獲得物の平均光子数である。各々の線は1匹のマウスを表している。いくつかの群を、群当たりn＝6～20匹のマウスに相当する異なる健常ドナーの2～3回の独立した実験からプールする。下、マウスの生存のカプラン・マイヤー解析。図10B～10Fは、1×105個の表示されたCAR T細胞で処置されたNALM-6担持マウスを示している。CAR T細胞注入から10及び17日後、群当たり7匹のマウスを安楽死させ、骨髄細胞を回収した。CAR T細胞及びNALM-6細胞を解析し、フローサイトメトリーで計数した。図10Bは、17日目の骨髄における腫瘍細胞(CD19+GFP+)の代表的なFACS解析を示している。図10Cは、17日目の骨髄CAR T細胞における疲弊マーカーPD1及びTIM3の代表的なFACS解析を示している。図10Dは、17日目の骨髄CAR T細胞における疲弊マーカーPD1及びLAG3の代表的なFACS解析を示している。図10Eは、骨髄におけるCAR+細胞のCAR MFIを示している(各ドットは1匹のマウスを表している)。図10Fは、CAR +集団のCAR発現における分散を測る変動係数を示している(平均に対する標準偏差の比;各ドットは1匹のマウスを表している)。図10Gは、RV-1928z CAR設計が、自己切断型P2A配列を使用することにより、同じLTRプロモーターからのCARとLNGFRの共発現を可能にすることを示している。LTR、長い末端反復、SD、スプライスドナー部位; SA、スプライスアクセプター部位; 2A、ブタテッショウウイルス自己切断型2A配列。図10Hは、インビトロ又はインビボで培養され(骨髄から抽出され)、かつCAR及びLNGFR発現を検出するために標識された、RV-1928zによって形質導入されたT細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示している。図10Iは、RV-1928z T細胞におけるCAR MFIと骨髄における腫瘍負荷(NALM-6数)の比較を示している。
図11A～11Jは、TRAC-19BBz CAR T細胞が、インビボでの疲弊を防ぐことにより、従来の19BBz CAR T細胞よりも優れていることを示している。図11A及び11Bは、3回の独立したトランスフェクション又は形質導入から得られたCAR+ T細胞の平均CAR MFI(図11A)及び変動係数(図11B)からまとめた結果を示している。これら3回の実験に使用されたT細胞は、3匹の異なる健常ドナーの血液から単離されたものである。図11C:左、遺伝子移入から5日後のフローサイトメトリーによって解析されたCAR T細胞の活性化、記憶、及び疲弊マーカー。右、プロットは、CARベクター化から5日後のCD62L及びCD45RA発現のフローサイトメトリー解析によって測定されたCAR+ T細胞の表現型を示している; A: CD45RA+ CD62L+; B: CD45RA- CD62L+; C: CD45RA- CD62L-; D: CD45RA+ CD62L-。図11Dは、CAR T細胞が48時間にわたってCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回活性化された後の相対CAR MFI(1＝MFI、0時間)を示している(n＝3回の独立した実験、矢印は刺激時点を示している)(下の線、TRAC-19bbz、上の線、RV-19bbz)。図11Eは、フローサイトメトリーによって解析された、48時間のうちにCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回刺激されたCAR T細胞を示している。プロットは、CD62L及びCD45RA発現のフローサイトメトリー解析によって測定されたCAR+ T細胞の表現型を示している(3回の独立した実験の平均割合)。図11Fは、1×105個のCAR T細胞で処置されたFFL-NALM-6担持マウスを示している。腫瘍負荷は、21日間にわたって毎週定量された動物1当たりの生体発光シグナルとして示されている。群当たりn＝6匹のマウス。図11G～11Jは、1×105個のCAR T細胞で処置されたNALM-6担持マウスを示している。CAR T細胞注入から10及び17日後、群当たり7匹のマウスを安楽死させ、骨髄細胞を回収した。CAR T細胞及びNALM-6細胞を解析し、フローサイトメトリーで計数した。各ドットは1匹のマウスを表している。図11Gは、骨髄中のCAR T細胞数を示している(n＝7)。図11Hは、骨髄中の腫瘍(CD19+GFP+ NALM-6)細胞数を示している(n＝7)。図11Iは、骨髄におけるエフェクター/腫瘍比を示している(n＝7)。図11Jは、17日目に回収され、フローサイトメトリーによって解析された骨髄T細胞の疲弊マーカー解析(それぞれ、内側から外側の環TIM3、LAG3、及びPD1に示された抑制性受容体発現)を示している。表示されたマーカーを発現する細胞の平均パーセンテージとして表されている(n＝7)。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001(マン・ホイットニー検定(図11A及び11B)、ANOVA F検定(図11D)。
図12A～12Dは、TRAC-CAR T細胞がインビトロでの持続的(tonic)シグナル伝達及び抗原誘導性分化の低下を示すことを示している。図12Aは、CAR遺伝子移入から5日後のT細胞分化マーカーの代表的なFACS解析を示している。図12Bは、CD19+標的細胞に対する1、2、又は4回の刺激後のCAR T細胞分化マーカーの代表的なFACS解析を示している。図12Cは、48時間にわたってCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回刺激したときのCAR T細胞増殖を示している。3つの1928z CAR T細胞条件間で、顕著な増殖の違いは見られなかった。図12Dは、図4Dのプロトコルの最後の細胞内染色後にIFNγ、TNFα、又はIL-2の発現が陽性であるCAR T細胞のパーセンテージを示している(2匹のドナーに対するn＝2回の独立した実験)(棒の群は、左から右に、それぞれ、TRAC-1928z、RV1928z、及びRV-P28z)。
図13A～13Fは、TRAC-CAR T細胞が、少なく又は多く形質導入されたRV-CAR T細胞と比較して、インビトロでの抗原誘導性分化の遅延を示すことを示している。図13Aは、様々な容量(単位はμl)のレトロウイルス上清の形質導入から5日後のCAR発現の代表的なヒストグラムを示している(3回の独立した実験を表す;合計の形質導入容量は2ml)。図13Bは、CAR+ T細胞のパーセンテージを、形質導入から5日後のFACSによって解析されたレトロウイルス上清の容量の関数として示している(n＝3匹のドナー)。図13Cは、形質導入から5日後のFACSによって解析されたレトロウイルス上清の容量の関数としてのT細胞のCAR平均蛍光強度(MFI)を示している(n＝3匹のドナー)。図13Dは、形質導入から5日後のFACSによって解析されたレトロウイルス上清の容量の関数としてのCAR変動係数を示している(n＝3匹のドナー)。図13Eは、形質導入から5日後のCAR T細胞の平均CAR MFIを示している(n＝3匹のドナー)。大量＝1,000μl、少量＝30μl。図13Fは、48時間のうちにCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回刺激され、フローサイトメトリーによって解析された、CAR T細胞を示している。プロットは、CD62L及びCD45RA発現のフローサイトメトリー解析によって測定されたCAR陽性T細胞の表現型を示している(3回の独立した実験の平均割合)(A、CD45RA+ CD62L+; B、CD45RA- CD62L+; C、CD45RA- CD62L-; D、CD45RA+ CD62L-)。
図14A～14F。異なる遺伝子座で異なるプロモーターを用いるCAR遺伝子発現は、インビトロでの持続的シグナル伝達レベルに影響を及ぼす。図14Aは、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座への組込みの図解を示している。標的化コンストラクト(AAV)は、TRAC遺伝子座と相同な配列(LHA及びRHA:左及び右相同性アーム)が両側に隣接している、スプライスアクセプター(SA)と、その後ろに、P2Aコード配列、1928z CAR遺伝子、及びポリA配列を含有する。ひとたび組み込まれると、内在性TCRαプロモーターがCAR発現を駆動する一方、TRAC遺伝子座は破壊される。TRAV: TCRα可変領域。TRAJ: TCRα接続領域。2A:自己切断型ブタテッショウウイルス2A配列。図14Bは、CRISPR/Cas9によって標的化されるTRAC遺伝子座へのプロモーター組込みの図解を示している。標的化コンストラクト(AAV)は、TRAC遺伝子座と相同な配列(LHA及びRHA:左及び右相同性アーム)が両側に隣接している、外因性プロモーター、長いバージョンのヒト伸長因子1αプロモーター(EF1α)、図3及び4で使用されたγレトロウイルス由来のエンハンサー配列(Mo-MLV LTR、ここでは、LTRと呼ぶ)、又はホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターの制御下にある、逆向きの1928z CARコード配列、及びポリA配列を含有する。TRAV: TCRα可変領域。TRAJ: TCRα接続領域。図14Cは、オーダーメイドのCRISPR/Cas9によって誘導されるB2M遺伝子座への標的化組込みの模式図を示している。標的化コンストラクト(AAV)は、相同性配列(LHA及びRHA)が両側に隣接しているCAR遺伝子を含有する。ひとたび組み込まれると、内在性B2MプロモーターはCAR発現を駆動する。図14Dは、CRISPR/Cas9によって標的化されるB2M遺伝子座へのプロモーター組込みの模式図を示している。標的化コンストラクト(AAV)は、B2M遺伝子座に相同な配列(LHA及びRHA:左及び右相同性アーム)が両側に隣接している、外因性プロモーター、ヒト伸長因子1αプロモーター(EF1α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、又は切断バージョンのPGK(PGK100)の制御下にある、逆向きの1928z CAR遺伝子、及びポリA配列を含有する。図14Eは、形質導入から4日後のFACSによって解析された平均CAR平均蛍光強度(MFI)を示している(n＝3～7回の独立した実験及び4匹の異なるドナー)。pA:全ての標的化コンストラクトのウシ成長ホルモンポリA配列。図14Fは、ベクター化から5日後のCAR T細胞の解析を示している。左パネル: T細胞へのそのベクター化から5日後のCAR発現の代表的なヒストグラム。真ん中のパネル: CARのベクター化から5日後のフローサイトメトリーによって解析されたCAR T細胞の活性化、記憶、及び疲弊マーカー。右パネル:プロットは、CARのベクター化から5日後のCD62L及びCD45RA発現のフローサイトメトリー解析によって測定されたCAR陽性T細胞の表現型を示している(A、CD45RA+ CD62L+; B、CD45RA- CD62L+; C、CD45RA- CD62L-; D、CD45RA+ CD62L-)。
図15A～15Gは、異なる遺伝子座で異なるプロモーターを用いるCAR遺伝子発現がインビボでの抗原誘導性分化及び疲弊に影響を及ぼすことを示している。図15Aは、CD19+標的細胞に対する1、2、又は4回の刺激後のCAR T細胞分化マーカーの代表的なFACS解析を示している。図15Bは、48時間にわたってCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回刺激したときのCAR T細胞増殖を示している(ドットの群は、左から右に、それぞれ、TRAC-LTR-1928z、B2M-1928z、TRAC-1928z、及びTRAC-EF1a-1928z)。4つの1928z CAR T細胞条件間で明白な違いは見られなかった。図15C～15Eは、1×105個のCAR T細胞で処置されたNALM-6担持マウスを示している。CAR T細胞注入から10及び17日後、群当たり7匹のマウスを安楽死させ、骨髄細胞を回収した。CAR T細胞及びNALM-6細胞を解析し、フローサイトメトリーで計数した。各ドットは1匹のマウスを表している。図15Fは、17日目の骨髄CAR T細胞におけるエフェクター記憶(：Eff mem」、CD62L-CD45RA-)及びエフェクター(「Eff」、CD62L-CD45RA+)のパーセンテージを示している(n＝7匹のマウス)。図15Gは、17日目に回収され、フローサイトメトリーによって解析された骨髄T細胞の疲弊マーカー解析を示している。表示されたマーカーを発現する細胞の平均パーセンテージとして表されている(n＝7匹のマウス)(抑制性受容体発現は、それぞれ、内側から外側の環TIM3、LAG3、及びPD1に示されている)。
図16A～16Bは、遺伝子座-プロモーター配置がCAR T細胞活性化時のCARタンパク質発現及び転写応答を制御することを示している。図16A:左パネル: T細胞へのそのベクター化から5日後のCAR発現の代表的なヒストグラム。右パネル: CAR T細胞が48時間にわたってCD19+標的細胞に対して1、2、又は4回活性化された後の相対CAR MFI(1＝MFI、0時間)。図16Bは、刺激前のCAR MFIとCAR RNA相対レベルの比較を示している(3匹のドナーに対して、n＝3回の独立した実験)。下の線は、TRAC-1928z CAR T細胞におけるCAR表面レベルを表している。
図17は、CD8+ T細胞の活性化及び記憶形成と関連する遺伝子発現プロファイルを示している。未感作のOT-I細胞におけるその発現と比べて、感染に曝露されたOT-I細胞で上方調節(Up)又は下方調節(Down)される遺伝子を感染期間中の様々な時点で定量した。発現の変化が1.4倍を超える、K-平均クラスタリング解析で最も動的な発現を有する10個のクラスターが示されている。各々の線は単一のプローブを表し;右下角の数はプローブの数を示し;プロットの上は、各クラスター中の対象となる遺伝子である(Bestらの文献、Nature Immunol. 14:404-413(2013)から抜粋)。
図18は、インテグラーゼ野生型(配列番号1)並びに突然変異体D124A(配列番号2)、D124E(配列番号3)、D124N(配列番号4)、D124V(配列番号5)、D183A(配列番号6)、D183N(配列番号7)、D124AとD183A(配列番号8)、D124AとD183N(配列番号9)、D124EとD183A(配列番号10)、D124EとD183N(配列番号11)、D124NとD183A(配列番号12)、D124NとD183N(配列番号13)、D124VとD183A(配列番号14)、及びD124VとD183N(配列番号15)のモロニーマウス白血病ウイルス(MLV)アミノ酸配列を示している。
図面の説明において色に対する言及がなされている場合、図面は、グレースケールに変換されている。
(7.発明の詳細な説明)
本発明は、免疫療法、及び具体的には、所望の条件下で治療的トランスジーンを発現するようにT細胞を遺伝子改変することに基づく標的化細胞療法に関する。本明細書に記載されるのは、治療的トランスジーンが内在性プロモーターの制御下に置かれるように、T細胞のゲノムへの該トランスジーンの組込みを標的化することにより、免疫療法用のT細胞を作製する方法である。文脈からそうでないことが示されない限り、本明細書に記載されるトランスジーン(単数形)への言及は1以上のトランスジーン(複数形)にも適用されることが理解されるであろう。本発明は、ゲノム編集を用いて、1つ又はいくつかの治療的トランスジーンを1以上の内在性プロモーターの制御下に置き、治療的T細胞における空間的・時間的発現の制御をもたらすT細胞療法の戦略を提供する。本発明は、治療的トランスジーン又は種々の治療的トランスジーンを発現するように改変されることになるT細胞を提供し、その場合、該トランスジーンの発現は、相応に発現をもたらす内在性プロモーターを用いて、T細胞の位置(例えば、腫瘍に近接しているときのみのトランスジーンの発現)、又は規定の時点(例えば、腫瘍細胞と結合する前又は結合した後)に依存するようにすることができる。したがって、本発明の細胞及び方法を用いて、治療的T細胞の有効性及び安全性を高めることができる。
本発明は、治療的トランスジーンを内在性プロモーターの制御下に置いて、T細胞における所望のトランスジーン発現プロファイルを達成することに関する。内在性プロモーターは、トランスジーンの発現特徴、例えば、トランスジーン発現のタイミング及び/又はトランスジーン発現のレベルを調節するように選択される。トランスジーンを内在性プロモーターの制御下に置くことによって、その発現を調節することにより、トランスジーン、免疫原性成分、並びに内部プロモーター及びトランスジーンをコードするウイルスベクターの発現を誘導するための低分子薬物を投与する必要性がなくなる。内在性プロモーターを利用することにより、T細胞は、トランスジーン発現、例えば、いつどこでトランスジーン発現が活性化されるかということが、好ましくは、環境信号(例えば、標的抗原、サイトカイン、及び/又は共刺激性リガンドへの近接性)に対するT細胞の協調的な内在性応答に依存する規定のプログラムで生じるように、トランスジーンの発現を自律的に調節するように改変される。したがって、具体的な実施態様において、T細胞は、微小環境信号に応答する内在性プロモーターが使用され、該内在性プロモーターによって制御される空間的及び時間的に予測可能なトランスジーン発現がもたらされるように改変される。
具体的な実施態様において、治療的トランスジーンは、治療的タンパク質をコードする。別の具体的な実施態様において、治療的トランスジーンは、治療的RNAをコードする。
好ましい実施態様において、本発明は、免疫療法、及び具体的には、T細胞受容体(TCR)複合体の成分とT細胞の特異性及び機能を再プログラミングするCARをコードする配列との遺伝子置換に基づく標的化細胞療法に関する。本明細書に例として開示されるように、遺伝子編集を用いて、安定かつ均一なCAR発現を有する組織適合性T細胞産物を作製した。さらに、遺伝子編集手法は、標的とされる、TCR複合体の成分をコードする遺伝子の破壊をもたらし、このことは、TCR複合体によって媒介されたであろう移植片対宿主反応性を軽減することにより、CAR-T細胞の機能を増強する。この手法は、患者の自己免疫疾患に使用することもできるが、臨床試験には通常含まれない。そのTCRの不活化を用いて、これらの患者の安全性を改善することができる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、T細胞受容体(TCR)複合体の機能的発現に必要とされるポリペプチドをコードする遺伝子への、好ましくは、プロモーターレスの、CAR遺伝子カセットの組込みを標的化することによる汎用CAR T細胞の1ステップ作製方法である。「汎用」という用語は、T細胞が自己使用に限定されるのではなく、非自己でも使用されることができることを意味する。一実施態様において、この手法は、TCR複合体の成分の調節発現を利用して、該細胞におけるCARの発現を駆動することができる。さらに、CARカセットの組込みは、例えば、細胞表面でのTCR複合体の適切な会合を妨げることにより、機能的TCR複合体に必要とされるポリペプチドの発現を妨害し又は低下させ、TCR陰性細胞を生じさせる。本方法は、一般に使用されるゲノム編集プラットフォーム、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びクラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ又はMega-Talで好適であり、細胞のゲノム内の標的部位での相同組換えを生じさせる。本明細書に開示されるように、標的遺伝子破壊とCAR標的化挿入を1ステップで組み合わせて、最大50％の汎用CAR T細胞を生じさせる条件を確立した。本明細書に開示される結果は、内在性TCRプロモーターを利用する方法が単一の組込み及び一貫性がありかつ予測可能な発現という利点をもたらしたことを示している。さらに、本方法は、改善されたT細胞の機能及び持続性という予想外の利点をもたらした。最も重要なことに、TCR遺伝子座からCARを発現するT細胞は、レトロウイルスによって形質導入されたCAR T細胞よりも大きいインビトロ及びインビボ腫瘍溶解活性、増大した増殖及び持続性を示す一方、その移植片対宿主病の可能性を取り除いた。さらに、この新しい方法は、自己免疫障害に罹患している患者用の自己CAR T細胞を作製する可能性を開いている。汎用T細胞製造の拡張性を標的化CAR遺伝子組込みの均一性及び安全性と組み合わせている本明細書に記載される方法は、CAR療法に及び市販のCAR療法の開発に有用である。
(7.1 T細胞)
一実施態様において、本発明は、T細胞であって、治療的トランスジーンの発現がT細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該細胞のゲノム内の部位で組み込まれる、T細胞を提供する。好ましい実施態様において、本発明は、T細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする組換え核酸配列が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARが該細胞のゲノム内の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、T細胞を提供する。好ましい実施態様において、該組換え細胞を用いて、所望の標的に対する免疫応答を増強又は提供することができる。別の実施態様において、該組換え細胞を用いて、望ましくない免疫応答を抑制することができる。好ましくは、該細胞はヒトに由来する(組換え体にされる前はヒト起源である)(ヒト由来細胞は、本発明の治療方法におけるヒトへの投与に特に好ましい)。
具体的な実施態様において、本発明は、内在性プロモーターを利用して、トランスジーン発現を最適化し、改変されたT細胞の機能を増強するための、T細胞、好ましくは、ヒトT細胞の染色体転写ユニットへのプロモーターレス発現カセットの標的化組込みに関するものであり、ここで、該トランスジーンは、CAR又は他の治療的トランスジーンである。好ましい実施態様において、このようにT細胞を改変することにより、安定かつ均一なCAR発現を得て、以前のCAR療法の方法と比べて、T細胞の機能及び持続性を増強した。カセット設計に応じて、本方法を用いて、内在性遺伝子の発現を妨害することもしないこともできる。内在性遺伝子発現が妨害される場合、該内在性遺伝子は、非必須遺伝子、すなわち、細胞の生存又は細胞の増殖に必要でない遺伝子である。特定の実施態様において、治療的トランスジーンはCARである。好ましい実施態様において、CARをコードする核酸配列の組込みは、機能的T細胞受容体複合体に必要なタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現を妨害する。この手法は、安定な発現、空間的に調節される発現、及び/又は時間的に調節される発現のいずれかを有する、任意の遺伝子に適用することができる。具体的な実施態様において、一方のアレルのみから発現される遺伝子、例えば、TCRα、TCRβ、Y又はX染色体特異的遺伝子の標的化を利用して、1細胞当たり1コピーのトランスジーンしか発現されないことを保証することができる。各々のT細胞は、1つの組換えTCRαと1つの組換えTCRβ鎖の会合によって生じる特有のT細胞受容体を発現する。TCR多様性を生むプロセスは、胸腺でのリンパ球生成時に生じ、そこでは、TCRα遺伝子とTCRβ遺伝子の両方が組み換わり(それぞれ、VJ組換え及びVDJ組換え)、アレル排除と呼ばれるプロセスを通じて、各々の遺伝子の一方のアレルのみが発現される(Honeyの文献、Nat. Rev. Immunol. 5, 95 doi:10.1038/nri1560(2005))。組換えTCRα又はβ鎖を標的とする場合、このプロセスは、1コピーの組み込まれたCARのみが発現されることをもたらす。もう一方のアレルは標的とされ得るが、CAR発現をもたらさない。
本発明のT細胞は、リンパ系の免疫細胞である。T細胞は、T細胞受容体(TCR)を発現し、ほとんどの細胞はα鎖及びβ鎖を発現し、より少ない集団がγ鎖及びδ鎖を発現する。本発明の免疫細胞として有用なT細胞は、CD4+又はCD8+であることができ、これには、Tヘルパー細胞(CD4+)、細胞傷害性T細胞(細胞傷害性Tリンパ球、CTL; CD8+ T細胞とも呼ばれる)、並びに中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、幹細胞様記憶T細胞(又はステム様記憶T細胞)、及びエフェクター記憶T細胞、例えば、TEM細胞及びTEMRA(CD45RA+)細胞を含む、記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、Tfh(濾胞性ヘルパー)細胞、T制御性細胞、ナチュラルキラーT細胞、粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT)、並びにγδ T細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。主なT細胞サブタイプとしては、TN(ナイーブ)、TSCM(幹細胞記憶)、TCM(中心記憶)、TTM(移行記憶)、TEM(エフェクター記憶)、及びTTE(終末エフェクター)が挙げられる。一実施態様において、本発明のT細胞は、免疫刺激性細胞、すなわち、免疫応答を媒介する細胞である。免疫刺激性である例示的なT細胞としては、Tヘルパー細胞(CD4+)、細胞傷害性T細胞(細胞傷害性Tリンパ球、CTL; CD8+ T細胞とも呼ばれる)、並びに中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、幹細胞様記憶T細胞(又はステム様記憶T細胞)、及びエフェクター記憶T細胞、例えば、TEM細胞及びTEMRA(CD45RA+)細胞を含む、記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、Tfh(濾胞性ヘルパー)細胞、ナチュラルキラーT細胞、粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT)、並びにγδ T細胞が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、本発明のT細胞は、免疫抑制性細胞、すなわち、免疫応答を抑制する細胞である。免疫抑制性である例示的なT細胞としては、制御性T細胞(T制御性細胞、Treg)及び濾胞性制御性T細胞(Tfh)細胞が挙げられる。T細胞は、任意に、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞(iPSC)から作製することができる(例えば、Themeliらの文献、Nat. Biotechnol. 31(10):928-933(2013)を参照)。任意に、トランスジーン、好ましくは、CARを組換え発現する使用可能なT細胞の前駆細胞は、例として、造血幹細胞及び/又は前駆細胞である。造血幹細胞及び/又は前駆細胞は、当技術分野で公知の方法によって、サイトカイン動員後の骨髄、臍帯血、成人末梢血などから得ることができ、その後、トランスジーン、好ましくは、CARを組換え発現するように遺伝子改変される。特に有用な前駆細胞は、リンパ系に分化することができる前駆細胞、例えば、T細胞に分化することができるリンパ系の造血幹細胞又は前駆細胞である。別の実施態様において、iPSCをトランスジーンの発現のための細胞として利用することができる。好ましい実施態様において、iPSCをCARの発現のための細胞として利用することができ、その場合、CARをコードする組換え核酸は、CARが該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該細胞のゲノム内の部位に組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該部位での組込みは、該細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を低下させ又は妨げる。別の実施態様において、本明細書に開示される、T細胞、好ましくは、CAR T細胞を用いて、iPSCを産生することができる。文脈上許される場合、T細胞に関する本明細書に開示される実施態様がiPSC又は幹細胞に適用可能であるとみなされることが理解される。iPSCを用いて、本発明のT細胞を産生することができ、iPSCをそれから誘導することもできる。
トランスジーンを発現させるために選択されるT細胞のタイプは、免疫応答を刺激することが望ましいか、又は免疫応答を抑制することが望ましいかを考慮に入れる。例えば、制御性T細胞(CD4+ CD25high FoxpP3+)は、免疫応答の抑制を必要としている対象、例えば、自己免疫疾患を有する人を治療するために使用され、例として、該T細胞は、免疫抑制性サイトカインをコードするトランスジーンを発現し、その一方で、CD4+(Tregを除く)/CD8+ T細胞は、免疫応答の刺激を必要としている対象、例えば、癌を有する対象を治療するために使用され、例として、該T細胞は、免疫刺激性サイトカインを発現する。
T細胞は、市販の単離方法を含む、当技術分野で周知の方法によって単離することができる(例えば、Rowland-Jonesらの文献、リンパ球:実践的手法(Lymphocytes: A Practical Approach)、Oxford University Press, New York(1999)を参照)。T細胞の供給源としては、末梢血、臍帯血、骨髄、又は造血細胞の他の供給源が挙げられるが、これらに限定されない。様々な技法を利用して、細胞を分離し、所望の免疫細胞、例えば、T細胞を単離又は濃縮することができる。例えば、陰性選択法を用いて、所望の免疫細胞でない細胞を除去することができる。さらに、陽性選択法を用いて、所望のT細胞を単離もしくは濃縮することができか、又は陽性選択法と陰性選択法の組合せを利用することができる。モノクローナル抗体(MAb)は、陽性選択と陰性選択の両方のための特定の細胞系譜及び/又は分化段階と関連するマーカーを同定するのに特に有用である。当技術分野で周知であるように、特定のタイプのT細胞を単離することになっている場合、限定されないが、CD3、CD4、CD8、CD34(造血幹細胞及び前駆細胞の場合)などを含む、様々な細胞表面マーカー又はマーカーの組合せを用いて、細胞を分離することができる(Kearseの文献、T細胞プロトコル:発生及び活性化(T Cell Protocols: Development and Activation)、Humana Press, Totowa NJ(2000); De Liberoの文献、T細胞プロトコル(T Cell Protocols)、分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)の第514巻、Humana Press, Totowa NJ(2009)を参照)。
制御性T細胞を単離し及び増殖させる方法は、当技術分野で周知である(例えば、Suらの文献、Methods Mol. Biol. 806:287-299(2012); Bluestoneらの文献、Sci. Transl. Med. 7(315)(doi: 10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015); Miyaraらの文献、Nat. Rev. Rheumatol. 10:543-551(2014); Liuらの文献、J. Exp. Med. 203:1701-1711(2006); Seddikiらの文献、J. Exp. Med. 203:1693-1700(2006); Ukenaらの文献、Exp. Hematol. 39:1152-1160(2011); Chenらの文献、J. Immunol. 183:4094-4102(2009); Putnamらの文献、Diabetes 58:652-662(2009); Putnamらの文献、Am. J. Tranplant. 13:3010-3020(2013); Leeらの文献、Cancer Res. 71:2871-2881(2011); MacDonaldらの文献、J Clin. Invest. 126:1413-1424(2016)を参照)。制御性T細胞のインビトロ作製(iTreg)も記載されている(例えば、Lanらの文献、J. Mol. Cell. Biol. 4:22-28(2012); Yamagiwaらの文献、J. Immunol. 166:7282-7289(2001); Zhengらの文献、J. Immunol. 169:4183-4189(2002)を参照)。通常、本発明の制御性T細胞はCD4+、例えば、CD4+CD25+、特に、CD4+CD127lo/-CD25+である。そのような制御性T細胞は、フォークヘッド/ウィングド-ヘリックスファミリーの転写因子に属するFoxp3(フォークヘッドボックスP3)を発現する(Bluestoneらの文献、J. Clin. Invest. 125:2250-2260(2015); Rileyらの文献、Immunity 30:656-665(2009))。本発明の免疫抑制性細胞である制御性T細胞は、CD8+制御性T細胞でもあり得る(Guillonneauらの文献、Curr. Opin. Organ Transplant. 15:751-756(2010))。制御性T細胞を単離し及び増幅させる方法は市販もされている(例えば、BD Biosciences, San Jose, CA; STEMCELL Technologies社、Vancouver, Canada; eBioscience, San Diego, CA; Invitrogen, Carlsbad, CAを参照)。本発明の免疫抑制性T細胞は、濾胞性制御性T細胞(T(FR))でもあり得る(Sageらの文献、Nat. Immunol. 14:152-161(2013))。特定の実施態様において、本発明の濾胞性制御性T細胞はCD4+CXCR5+であり、かつFoxp3を発現する(Sageらの文献、上記、2013)。
細胞分離の手順としては、密度勾配遠心分離、細胞密度を修飾する粒子へのカップリング、抗体をコーティングした磁気ビーズによる磁気分離、親和性クロマトグラフィー;限定されないが、補体及び細胞毒素を含む、モノクローナル抗体(mAb)に結合しているもしくはそれとともに使用される細胞毒性剤、並びに固体マトリックス、例えば、プレートもしくはチップに結合した抗体によるパニング、エルトリエーション、フローサイトメトリー、又は任意の他の好都合な技法が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Recktenwaldらの文献、細胞分離の方法及び用途(Cell Separation Methods and Applications)、Marcel Dekker社、New York(1998)を参照)。
T細胞は、それが本発明の治療方法において投与される対象にとって自己又は非自己であることができる。自己細胞は、改変されたT細胞が投与されることになっている対象から単離される。好ましい実施態様において、自己細胞は、CARを組換え発現する改変された細胞が投与されることになっている対象から単離される。任意に、該細胞を、白血球が採取された血液から選択的に除去される白血球アフェレーシスによって取得し、組換体にし、その後、ドナーに再輸血することができる。或いは、対象ではない非自己ドナー由来の同種異系細胞を使用することができる。非自己ドナーの場合、当技術分野で周知であるように、該細胞をヒト白血球抗原(HLA)についてタイピング及びマッチングして、適切な適合性レベルを決定する。自己細胞と非自己細胞の両方について、該細胞は、当技術分野で周知の方法を用いた対象への遺伝子操作及び/又は投与に使用する準備が整うまで、任意に凍結保存することができる。
CARの組換え発現に使用することができるT細胞を単離するための様々な方法は、以前に記載されており、かつ使用することができる。これらには、末梢ドナー白血球の使用(Sadelainらの文献、Nat. Rev. Cancer 3:35-45(2003); Morganらの文献、Science 314:126-129(2006)、腫瘍生検中の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)に由来するリンパ球培養物の使用(Panelliらの文献、J. Immunol. 164:495-504(2000); Panelliらの文献、.J Immunol. 164:4382-4392(2000))、及び人工抗原提示細胞(AAPC)又は樹状細胞を利用して選択的にインビトロで増殖させた抗原特異的末梢血白血球の使用(Dupontらの文献、Cancer Res. 65:5417-5427(2005); Papanicolaouらの文献、Blood 102:2498-2505(2003))が含まれるが、これらに限定されない。幹細胞を使用する場合、該細胞を当技術分野で周知の方法によって単離することができる(例えば、Klugらの文献、Hematopoietic Stem Cell Protocols, Humana Press, New Jersey(2002); Freshneyらの文献、Culture of Human Stem Cells, John Wiley & Sons(2007)を参照)。
具体的な実施態様において、単離されたT細胞は、トランスジーンの組換え発現用にエクスビボで遺伝子改変される。好ましい実施態様において、単離されたT細胞は、CARの組換え発現用にエクスビボで遺伝子改変される。該細胞は、当技術分野で周知の方法によって、組換え発現用に遺伝子改変することができる。
別の実施態様において、本発明は、トランスジーンの組換え発現用に後に遺伝子改変される、標的抗原を認識し、それに対して感作されるT細胞を提供する。そのようなT細胞は、標的抗原に結合するCARを発現することができるが、必ずしもその必要はない。なぜなら、該細胞は、その免疫応答(例えば、細胞傷害性)がそのような標的抗原によって特異的に刺激されるように、既に標的抗原特異的であるからである。標的抗原を認識し、それに対して感作されるそのようなT細胞は、既知の方法、例として、ナイーブT細胞(例えば、Wolflらの文献、Nat. Protocols 9:950-966(2014)を参照)もしくは造血前駆細胞(van Lentらの文献、J. Immunol. 179:4959-4968(2007)を参照)を用いるインビトロ感作法によって取得するか;又は標的抗原に曝露され、それに対する免疫応答を開始している対象から取得することができる(すなわち、インビボで感作されたT細胞)。対象から抗原特異的T細胞を取得する方法は、当技術分野で周知である。そのような方法としては、抗原特異的細胞を同定及び単離するために使用することができる抗原刺激T細胞からのサイトカインの分泌に基づくサイトカイン捕捉システム又はサイトカイン分泌アッセイ、並びにインビトロでの細胞の増殖が挙げられるが、これらに限定されない(T細胞応答の解析:腫瘍関連抗原に対する細胞性免疫応答を解析する方法(Analyzing T Cell Responses: How to Analyze Cellular Immune Responses Against Tumor Associated Antigens)、Nagorsenら編、第10章、183～195頁に所収のAssenmacherらの文献、サイトメトリックサイトカイン分泌アッセイ(Cytometric Cytokine Secretion Assay)、Springer, The Netherlands(2005); Haneyらの文献、J. Immunol. Methods 369:33-41(2011); Bunosらの文献、Vox Sanguinis DOI: 10.1111/vox.12291(2015); Montesらの文献、Clin. Exp. Immunol. 142:292-302(2005); Adusumilliらの文献、Sci Transl Med. 6:261ra151(2014)を参照)。そのようなサイトカインとしては、インターフェロン-γ及び腫瘍壊死因子-αが挙げられるが、これらに限定されない。対象から抗原特異的制御性T細胞を取得する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Noyanらの文献、Eur. J. Immunol. 44:2592-2602(2014); Bruskoらの文献、PLoS One 5(7) e11726(doi: 10.1371)(2010); Bacherらの文献、Mucosal Immunol. 7:916-928(2014); Koenenらの文献、J. Immunol. 174:7573-7583(2005)を参照)。抗原特異的T細胞は、T細胞を単離するための上記のような周知の技法を用いて単離することができ、これには、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、固相上でのパニングなどが含まれるが、これらに限定されない。臨床用途に使用し又は適合させることができる抗原特異的T細胞単離法も市販されている(例えば、Miltenyi Biotec, Cambridge, MA; Proimmune, Oxford, UK;などを参照)。
T細胞を、該細胞の維持又は増殖に有利に働く条件に供することができる(Kearseの文献、T細胞プロトコル:発生及び活性化(T Cell Protocols: Development and Activation)、Humana Press, Totowa NJ(2000); De Liberoの文献、T細胞プロトコル(T Cell Protocols)、分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)の第514巻、Humana Press, Totowa NJ(2009); Parente-Pereiraらの文献、J. Biol. Methods 1(2) e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014); Movassaghらの文献、Hum. Gene Ther. 11:1189-1200(2000); Rettigらの文献、Mol. Ther. 8:29-41(2003); Agarwalらの文献、J. Virol. 72:3720-3728(1998); Pollokらの文献、Hum. Gene Ther. 10:2221-2236(1999); Quinnらの文献、Hum. Gene Ther. 9:1457-1467(1998); Suらの文献、Methods Mol. Biol. 806:287-299(2012); Bluestoneらの文献、Sci. Transl. Med. 7(315)(doi: 10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015); Miyaraらの文献、Nat. Rev. Rheumatol. 10:543-551(2014); Liuらの文献、J. Exp. Med. 203:1701-1711(2006); Seddikiらの文献、J. Exp. Med. 203:1693-1700(2006); Ukenaらの文献、Exp. Hematol. 39:1152-1160(2011); Chenらの文献、J. Immunol. 183:4094-4102(2009); Putnamらの文献、Diabetes 58:652-662(2009); Putnamらの文献、Am. J. Tranplant. 13:3010-3020(2013); Leeらの文献、Cancer Res. 71:2871-2881(2011); MacDonaldらの文献、J. Clin. Invest. 126:1413-1424(2016)を参照;市販の方法、例えば、Dynabeads(商標)ヒトT細胞アクチベーター製品、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)も参照)。該細胞を、エクスビボでの遺伝子改変の前又は後に、任意に増殖させることができる。該細胞の増殖は、対象への投与用の細胞の数を増加させるのに特に有用である。免疫細胞、例えば、T細胞の増殖のためのそのような方法は、当技術分野で周知である(Kaiserらの文献、Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015); Wolflらの文献、Nat. Protocols 9:950-966(2014)を参照)。さらに、該細胞を、単離及び/又は遺伝子改変及び/又は遺伝子改変細胞の増殖の後に、任意に凍結保存することができる(Kaiserらの文献、上記、2015)を参照)。細胞を凍結保存するための方法は、当技術分野で周知である(例えば、Freshneyの文献、動物細胞の培養:基礎的技法の手引き(Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques)、第4版、Wiley-Liss, New York(2000); Harrison及びRaeの文献、細胞培養の一般的技法(General Techniques of Cell Culture)、Cambridge University Press(1997)を参照)。
(7.2 標的化組込み法)
内在性T細胞プロモーターの制御下でトランスジーンを組換え発現する細胞の作製に関して、トランスジーンは、T細胞のゲノムに導入される。好ましい実施態様において、CARを組換え発現する細胞の作製に関して、CARをコードする核酸は、T細胞に導入される。従来、そのような方法では、好適な発現ベクターが利用されており、その場合、T細胞に、トランスジーン、例えば、CARをコードする核酸が形質導入される。本発明では、トランスジーンは、ゲノム内の部位でのトランスジーンの標的化組込みをもたらす標的化コンストラクトにクローニングされる。好ましい実施態様において、CARをコードする核酸は、ゲノム内の部位、特定の実施態様において、細胞内での機能的TCR複合体の発現に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子の発現を妨害する部位でのCARをコードする核酸配列の標的化組込みをもたらす標的化コンストラクトにクローニングされる。例えば、本発明のトランスジーン、例えば、CARをコードするポリヌクレオチドを、周知の分子生物学の技法を用いて、好適な標的化コンストラクト、又はレトロウイルスベクターなどの好適なベクターにクローニングし、T細胞に導入することができる(Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)を参照)。
本発明の細胞、特に、ヒトT細胞における発現に好適な任意の好適な標的化コンストラクトを利用することができる。特定の実施態様において、該標的化コンストラクトは、細胞のゲノム内の部位での核酸配列(トランスジーン)の標的化組込みに好適な相同組換えシステムとの併用に適合する。例示的な相同組換えシステムは当技術分野で周知であり、これには、例えば、細胞のゲノム内の所望の標的部位での相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ、例えば、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)システム、例えば、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)、及びCpf1、並びに/又はメガヌクレアーゼもしくはMega-Tal(Talドメインとメガヌクレアーゼの融合体)などを利用する技術が含まれるが、これらに限定されない(実施例を参照;米国特許第8,697,359号;米国公開第20140068797号; Gajらの文献、Trends Biotechnol. 31:397-405(2013); Gersbachらの文献、Nucl. Acids Res. 39:7868-7878(2011); Vasilevaらの文献、Cell Death Dis. 6:e1831.(Jul 23 2015); Sontheimerの文献、Hum. Gene Ther. 26(7):413-424(2015); Osbornらの文献、Mol. Ther. 24(3):570-581(2016))も参照)。そのような方法は当技術分野で周知であり、かつ市販されている(ThermoFisher, Carlsbad, CA; GenScript, Piscataway, NJ; Clontech, Mountain View, CA)。他のCRISPRベースのシステムとしては、パイロジェン及びAureusが挙げられる。そのような方法を用いて、相同組換えを実施又は促進することができる。
(7.3 ベクター及び標的化コンストラクト)
好適な標的化コンストラクトは、本発明において利用される相同組換えシステムに適合している任意の核酸配列を含むことができる。一実施態様において、標的化コンストラクトは、アデノ随伴ウイルス(AAV)配列を含む。標的化コンストラクトは、1以上のAAV血清型由来の核酸配列を有することができる。例えば、標的化コンストラクトは、AAV2配列又は他の血清型配列、例えば、AAV5を含むことができる。標的化コンストラクトの一部として機能するAAV核酸配列は、いくつかの天然又は組換えAAVカプシド又は粒子にパッケージングすることができる。特定の実施態様において、AAV粒子はAAV6である。特定の実施態様において、AAV2ベースの標的化コンストラクトは、AAV6ウイルス粒子を用いて標的細胞に送達される。特定の実施態様において、AAV配列は、AAV2、AAV5、又はAAV6配列である。特定の実施態様において、AAV配列はAAV2由来のものである。別の特定の実施態様において、AAV配列はAAV6由来のものである。別の特定の実施態様において、標的化コンストラクトは、5'から3'の順に:第一のウイルス配列、左相同性アーム、自己切断型ブタテッショウウイルス2Aをコードする核酸配列、トランスジーン、ポリアデニル化配列、右相同性アーム、及び第二のウイルス配列を含む。好ましい実施態様において、標的化コンストラクトは、5'から3'の順に:第一のウイルス配列、左相同性アーム、自己切断型ブタテッショウウイルス2Aをコードする核酸配列、CARをコードする核酸配列、ポリアデニル化配列、右相同性アーム、及び第二のウイルス配列を含む。別の好適な標的化コンストラクトは、組込み欠損レンチウイルス由来の配列を含むことができる(例えば、Wanischらの文献、Mol. Ther. 17(8):1316-1332(2009)を参照)。特定の実施態様において、ウイルス核酸配列は、組込み欠損レンチウイルスの配列を含む。利用される相同組換えシステムに適合している任意の好適な標的化構築を利用することができることが理解される。
標的コンストラクトに含めることができるウイルスベクター配列としては、レトロウイルス、アデノウィルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス由来ベクター、並びにヘルペスウイルスベクター、例えば、エプスタイン・バーウイルスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Millerの文献、Hum. Gene Ther. 1(1):5-14(1990); Friedmanの文献、Science 244:1275-1281(1989); Eglitisらの文献、BioTechniques 6:608-614(1988); Tolstoshevらの文献、Current Opin. Biotechnol. 1:55-61(1990); Sharpの文献、Lancet 337:1277-1278(1991); Cornettaらの文献、Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 36:311-322(1989); Andersonの文献、Science 226:401-409(1984); Moenの文献、Blood Cells 17:407-416(1991); Millerらの文献、Biotechnology 7:980-990(1989); Le Gal La Salleらの文献、Science 259:988-990(1993);及びJohnsonの文献、Chest 107:77S- 83S(1995); Rosenbergらの文献、N. Engl. J. Med. 323:370(1990); Andersonらの文献、米国特許第5,399,346号; Schollerらの文献、Sci. Transl. Med. 4:132-153(2012; Parente-Pereiraらの文献、J. Biol. Methods 1(2):e7(1-9)(2014); Lamersらの文献、Blood 117(1):72-82(2011); Reviereらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737(1995); Wangらの文献、Gene Therapy 15:1454-1459(2008)を参照)。
相同組換え媒介性標的化のためのトランスジーンベクター化をもたらす標的コンストラクトを作製するための特に有用なベクターとしては、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)、組換え非組込み型レンチウイルス(rNILV)、組換え非組込み型γ-レトロウイルス(rNIgRV)、一本鎖DNA(線状又は環状)などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなベクターを用いて、上記のように、標的コンストラクトを作製することにより、本発明のT細胞にトランスジーンを導入することができる。
一実施態様において、ベクターは、組換え非組込み型γ-レトロウイルス(rNIgRV)である。一実施態様において、rNIgRVは、DDEモチーフで突然変異しており、それにより、インテグラーゼ活性が消失している、γ-レトロウイルスインテグラーゼを使用することにより得られる。したがって、γ-レトロウイルスは、そのインテグラーゼの不活化によって、非組込み型γ-レトロウイルスに変換される(実施例4及び図18を参照)。特定の実施態様において、該インテグラーゼは、D164A、D164E、D164N、D164V、D183A、D183N、D164AとD168A、D164AとD183N、D164NとD183A、D164NとD183N、D164VとD168A、D164VとD183N、D164VとD183A、及びD164VとD183Nからなる群から選択されるDDE突然変異を含む。そのようなrNIgRVベクターは、従来使用されているベクターよりも容易にかつ安く産生することができるので有利である。
rNIgRVベクターを用いて、任意の所望のDNAを任意の細胞に導入することができることが容易に理解されるであろう。したがって、rNIgRVを用いて、任意のタイプの所望のDNAをベクターが機能する任意のタイプの細胞に導入することができる。
細胞のゲノム内の部位に組み込まれるトランスジーンの発現を制御するために内在性プロモーターを利用する本発明の方法において、標的化コンストラクトは、好ましくは、プロモーターレスである。細胞のゲノム内の部位に組み込まれるCARをコードする核酸配列の発現を制御するために内在性プロモーターを利用する本発明の方法の好ましい実施態様において、標的化コンストラクトは、好ましくは、プロモーターレスである。そのようなコンストラクトは、組み込まれた核酸配列(トランスジーン)が内在性プロモーターの制御下にあるように、トランスジーン、例えば、CARをコードする核酸配列のゲノム内の部位への組込みを可能にする。一実施態様において、内在性プロモーターは、TCRプロモーターである。特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである。具体的な実施態様において、CARをコードする核酸配列は組み込まれる。
本発明の方法は、好ましくは、内在性プロモーターを用いて、組換えトランスジーン、例えば、CARをコードする核酸配列の発現を制御するが、特定の宿主細胞における発現のための好適なプロモーターを利用するベクター、例えば、内在性プロモーター、例えば、TCRプロモーターを組み込んでいるベクターを利用することができることが理解される。そのようなベクターは、内在性プロモーター、例えば、TCRプロモーターによってもたらされるのと同様の様式での発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、例えば、組込みの部位がトランスジーンの効率的な発現をもたらさない場合、又は内在性プロモーターによって制御される内在性遺伝子の破壊がT細胞にとって有害であるかもしくはT細胞療法におけるその有効性の減少をもたらす場合に有用であることができる。好ましい実施態様において、そのようなベクターは、例えば、組込みの部位がCARをコードする核酸配列の効率的な発現をもたらさない場合に有用であることができる。該プロモーターは、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターであることができる。内在性又はベクター関連プロモーターの制御下での核酸配列の発現は、細胞が核酸を発現するのに好適な条件、例えば、成長条件の下で、又は誘導性プロモーターの場合は誘導因子の存在下などで起こる。そのような条件は、当業者によって十分に理解される。
標的化コンストラクトは、トランスジーンをコードする核酸配列のちょうど上流にP2A配列を含むように任意に設計することができる。好ましい実施態様において、標的化コンストラクトは、CARをコードする核酸配列のちょうど上流にP2A配列を含むように任意に設計することができる。P2Aは、タンパク質配列の2シストロン性又は多シストロン性発現に使用することができる自己開裂ペプチド配列である(Szymczakらの文献、Expert Opin. Biol. Therapy 5(5):627-638(2005)を参照)。望ましい場合、標的化コンストラクトは、レポーター、例えば、形質導入細胞の同定をもたらすレポータータンパク質を含むように任意に設計することができる。例示的なレポータータンパク質としては、蛍光タンパク質、例えば、mCherry、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質、例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、及びmKalama1、青緑色蛍光タンパク質、例えば、ECFP、Cerulean、及びCyPet、並びに黄色蛍光タンパク質、例えば、YFP、Citrine、Venus、及びYPetが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、標的化コンストラクトは、トランスジーンの3'側にポリアデニル化(ポリA)配列を含む。好ましい実施態様において、標的化コンストラクトは、CARをコードする核酸配列の3'側にポリアデニル化(ポリA)配列を含む。
本明細書に開示されるように、具体的な実施態様において、CARをコードする核酸は、CARが細胞内で発現され、細胞表面で産生されることができるように、細胞のゲノム内の部位で組み込まれる。組込みの部位は、細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる。細胞は、それにより、TCR陰性細胞になることができる。そのようなTCR陰性細胞は、例えば、非自己T細胞を利用する場合、レシピエントにおける移植片対宿主病(GVHD)を軽減するのに有用であることができる。対象自身のT細胞によってもたらされる自己免疫反応は、自己抗原を標的とする機能的TCR複合体の発現を低下させ又は妨げることにより軽減することができるので、TCR陰性細胞の作製を用いて、自己免疫疾患を有する対象を自己細胞で治療することもできる。
T細胞受容体(TCR)は、TCR-α鎖とTCR-β鎖のヘテロ二量体である。TCR複合体は、TCRとCD3ガンマ(γ)、CD3デルタ(δ)、CD3イプシロン(ε)、及びCD3ゼータ(ζ)とによって形成される(例えば、Callらの文献、Cell 111:967-979(2002)を参照)。T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖のうちの1つ又は複数の発現の妨害又は低下を用いて、機能的T細胞受容体(TCR)複合体の形成を低下させ又は妨げることができる。機能的TCR複合体の形成を低下させ又は妨げることにより、T細胞は、そのTCR複合体を介する免疫応答をもはや媒介しない。一実施態様において、CARをコードする核酸は、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖の発現を妨害し又は低下させるゲノム内の部位で組み込まれる。TCR複合体タンパク質のうちの1つの低下で十分であり得るが、望ましい場合、TCR複合体の複数の成分を低下させることができることが理解される。
細胞のゲノム内の組込みの部位は、トランスジーンを内在性プロモーターの制御下に置くように標的化されることが理解される。組込みは、例として、エクソンへの組込み、イントロンへの組込み、又は遺伝子の5'末端での組込みであることができるが、これらに限定されない。一実施態様において、トランスジーンの組込みは、組込みの部位での内在性遺伝子の破壊をもたらす。好ましい実施態様において、細胞のゲノム内の組込みの部位は、TCR複合体の成分、例えば、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖の発現を低下させ又は妨害するように標的化されることが理解される。当業者は、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖の発現を低下させ又は妨害するように、CARをコードする核酸を組み込むためのT細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子内の好適な位置を容易に決定することができる。そのような方法は当技術分野で周知であり、これには、エクソンへの組込み、イントロンへの組込み、遺伝子の5'末端での組込みなどが含まれ得るが、これらに限定されない。遺伝子の任意のイントロン又はエクソンが標的化コンストラクトを支持することができることが理解される。当業者は、望ましい場合、組込みの部位での内在性プロモーターの制御下における内在性遺伝子の発現を低下させ又は妨害するトランスジーンの標的化組込みのための好適な位置を容易に決定することができる。特定の実施態様において、組込みの部位は、第一のエクソン内にある。トランスジーンの組込みのための部位を選択するとき、該組込み部位は、特に、内在性遺伝子の発現が妨害される場合、非必須遺伝子、すなわち、細胞の生存又は細胞の増殖に必要でない遺伝子に生じることが理解される。好ましい実施態様において、当業者は、TCR複合体タンパク質、例えば、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、もしくはCD3ζ鎖の発現を低下させもしくは妨害し、及び/又はCARをコードする核酸配列を、TCR複合体成分をコードするそれぞれの遺伝子の内在性プロモーターの制御下に置く、CARをコードする核酸配列の標的化組込みのための好適な部位を容易に決定することができる。一実施態様において、組込みの部位は、第一のエクソン内にある(実施例を参照)。特定の実施態様において、組込みの部位は、TCRα定常鎖(TRAC)の第一のエクソン内にある。好ましい実施態様において、トランスジーン、例えば、CARをコードする核酸は、内在性TCRプロモーターの制御下に置かれる。その詳細は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2016年4月15日に出願された仮出願第62/323,623号及び2106年4月16日に出願された同第62/323,675号に記載されている。
望ましい場合、組込み部位及び標的化コンストラクトを、内在性遺伝子とインフレームのトランスジーンの組込みをもたらすように設計して、トランスジーンと内在性遺伝子の融合タンパク質の発現をもたらすことができる(US20130280222号も参照)。好ましい実施態様において、組込み部位及び標的化コンストラクトを、内在性遺伝子とインフレームのトランスジーンの組込みをもたらすように設計して、CARとTCR複合体タンパク質の融合タンパク質の発現をもたらすことができる。任意に、そのようなコンストラクトは、トランスジーンのちょうど5'側にP2Aを含有し、内在性遺伝子の遺伝子産物と融合することなく、細胞内の所望の場所でのトランスジーンの発現を可能にすることができる。そのようなコンストラクトは、組込みの部位でのトランスジーンと内在性遺伝子の両方の発現をもたらし、そのようなコンストラクトは、内在性遺伝子の破壊がT細胞にとって有害であるか又はT細胞療法におけるその有効性の減少をもたらす場合に利用することができる。好ましい実施態様において、そのようなコンストラクトは、CARをコードする核酸配列のちょうど5'側にP2Aを含有し、TCR複合体タンパク質と融合することなく、細胞表面でのCARの発現を可能にすることができる。別の遺伝子、例えば、第二のCAR、又は安全性スイッチ(例えば、誘導性カスパーゼ9(iCasp9)もしくは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)、Teyの文献Clin. Transl. Immunology 3(6):e17を参照)、又は免疫調節性分子などをコードする遺伝子をゲノムに組み込むこともできることがさらに理解される。一実施態様において、同じ又は異なる遺伝子(トランスジーン)の組込みは、それぞれ、異なる標的遺伝子で起こる。具体的な態様において、異なる遺伝子(トランスジーン)は、それぞれ、異なる組込み部位で組み込まれる。
相同組換えシステムは、当技術分野で周知の方法を用いて、当技術分野で公知であるような、ゲノム内の所望の部位、例えば、T細胞受容体α鎖(第14番染色体、NC_000014.9(22547506..22552132))、T細胞受容体β鎖(第7番染色体、NC_000007.14(142299011..142813287))、CD3γ鎖(第11番染色体、NC_000011.10(118344316..118353782))、CD3δ鎖(第11番染色体、NC_000011.10(118339074..118342744))、CD3ε鎖(第11番染色体、NC_000011.10(118304580..118316175))、又はCD3ζ鎖(第1番染色体、NC_000001.11(167430640..167518616))をコードする遺伝子内の部位を標的とするように設計される(染色体位置番号は、現在のアセンブリ: GRCh38.p2に対応する)。
本明細書に記載されるように、一実施態様において、組込み部位は、一方のアレルのみから発現される遺伝子、例えば、TCRα、TCRβ、Y又はX染色体特異的遺伝子を標的化することができる。そのような場合、トランスジーンをゲノム内の単一の部位で組み込むだけで十分であり得る。トランスジーンがCARをコードする好ましい実施態様において、そのような場合、CARをコードする核酸をゲノム内の単一の部位で組み込むだけで十分であり得る。この戦略を利用して、1細胞当たり1コピーのトランスジーンしか発現されないことを保証することができる。任意に、組込みのために標的化されることになる遺伝子が2つのアレル上に存在する場合、標的化相同組換えは、両方のアレルで起こり得る。そのような場合、標的化組込みは、1つの遺伝子座又は2つの遺伝子座で起こり得る。
ルーチンの分子生物学的技法を用いるアッセイを用いて、好ましくは、CARをコードするトランスジーンの形質導入効率を決定することができる。遺伝子移入効率は、形質導入されたT細胞の割合を定量するための蛍光活性化細胞選別(FACS)解析によって、及び/又は定量的PCRによってモニタリングすることができる。十分に確立された共培養システム(Gadeらの文献、Cancer Res. 65:9080-9088(2005); Gongらの文献、Neoplasia 1:123-127(1999); Latoucheらの文献、Nat. Biotechnol. 18:405-409(2000))を用いて、癌抗原を発現する線維芽細胞AAPCが(対照と比べて)、CARを発現する形質導入されたT細胞からのサイトカイン放出(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFについての細胞上清LUMINEX(Austin TX)アッセイ)、T細胞増殖(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)標識による)、並びにT細胞生存(アネキシンV染色による)を導くかどうかを決定することができる。CARを発現するT細胞を標的抗原陽性細胞による繰り返しの刺激に曝露することができ、T細胞増殖及びサイトカイン応答が繰り返しの刺激によって同様のままであるか又は減少するかを決定することができる。好ましい実施態様において、CARを発現するT細胞を癌抗原陽性標的細胞による繰り返しの刺激に曝露することができ、T細胞増殖及びサイトカイン応答が繰り返しの刺激によって同様のままであるか又は減少するかを決定することができる。多数のE:T比での細胞傷害性アッセイは、クロム放出アッセイを用いて実施することができる。
(7.4 内在性T細胞プロモーター)
本発明は、治療的トランスジーンをT細胞の内在性プロモーターの制御下に置くように該トランスジーンをT細胞のゲノム内の部位で組み込むことにより、該トランスジーンをT細胞で発現させることに関する。内在性プロモーターを利用することにより、T細胞は、治療的トランスジーン又は種々の治療的トランスジーンを異なる内在性プロモーターの制御下で発現するように改変される。具体的な実施態様において、該トランスジーンの発現は、T細胞の微小環境に依存する。例えば、治療的トランスジーンの発現は、T細胞が特定の位置にあるときに誘導される内在性プロモーターを使用することにより(例えば、T細胞が腫瘍の位置にあり、腫瘍抗原への結合によって活性化され、それにより、内在性プロモーターを誘導するときに)、T細胞の位置に依存するようにすることができるか(例えば、腫瘍に近接しているときのみのトランスジーンの発現)、又は規定の時点におけるものである(例えば、規定の時点で、例えば、腫瘍細胞と遭遇したときのT細胞の活性化によって誘導される内在性プロモーターを使用することによる)ことができる。プロモーターは、例えば、それがT細胞と抗原との遭遇後にどのくらい早く活性化又は抑制されるか、それがどのくらい強く及びどのくらい長く発現されるかに基づいて選択される。プロモーターは、該プロモーターがその発現を調節するトランスジーンの薬理作用に適合するように選択される(例えば、あるトランスジーンは低いレベルでより効果的であり、あるトランスジーンは高い発現レベルでより効果的である、など)。T細胞におけるトランスジーンの発現を制御する内在性プロモーター(単数)の使用に関する本開示における記載は、文脈からそうでないことが示されない限り、T細胞におけるトランスジーン(他のトランスジーンと同じ又は異なるものであり得る)の発現を各々制御する複数の内在性プロモーターの使用に同等に適用されることが理解されるであろう。当業者は、T細胞療法において使用するためのT細胞の有効性を高める1以上のトランスジーンの所望の発現及び/又は調節をもたらすように、適切な内在性プロモーターを容易に選択することができる。
内在性T細胞プロモーターは、構成的又は誘導性であることができる。具体的な実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞のサブセットに特異的である。複数のトランスジーンがT細胞で発現される場合、トランスジーン(互いに異なり得る)は、それぞれ、そのうちの1つ又は複数が、例えば、T細胞のサブセットに特異的であり得る、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの組合せの制御下に置かれることができる。
本明細書に記載される実施態様の一態様において、内在性プロモーターは、インターロイキン4(IL4)プロモーターではない。
一実施態様において、内在性T細胞プロモーターは構成的である。別の実施態様において、内在性T細胞プロモーターは誘導性である。具体的な実施態様において、内在性T細胞プロモーターは、T細胞のサブセットで活性がある。一実施態様において、2以上のトランスジーンは、各々のトランスジーンの発現がT細胞の異なる内在性プロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム中に組み込まれる。具体的な実施態様において、2つのトランスジーンは、このように組み込まれる。特定の実施態様において、2つのトランスジーンの各々の発現は、構成的である異なる内在性プロモーターの制御下にある。別の特定の実施態様において、2つのトランスジーンの各々の発現は、誘導性である異なる内在性プロモーターの制御下にある。別の特定の実施態様において、第一のトランスジーンの発現は、構成的な内在性プロモーターの制御下にあり、第二のトランスジーンの発現は、誘導性の内在性プロモーターの制御下にある。別の特定の実施態様において、3つのトランスジーンは、各々のトランスジーンの発現がT細胞の異なる内在性プロモーターの制御下にあるように、T細胞のゲノム中に組み込まれ、この場合、第一のトランスジーンの発現は、構成的な内在性プロモーターの制御下にあり、第二及び第三のトランスジーンの発現は、ぞれぞれ、2つの異なる誘導性の内在性プロモーターの制御下にある。T細胞で発現されることになるトランスジーンに応じて、プロモーターを、適切な発現レベル、発現の時間、T細胞が特定の微小環境にあるときの発現などをもたらすように選択することができることが理解される。例えば、トランスジーン1の発現は、構成的プロモーターの制御下にあることができ、トランスジーン2の発現は、T細胞によって認識される抗原と接触した後すぐに活性化される誘導性プロモーターの制御下にあることができ、トランスジーン3の発現は、トランスジーン2よりも後の時間に又はそれとは異なるレベルで活性化される異なる誘導性プロモーターの制御下にあることができる。この特定の例において、トランスジーン1は構成的に発現され、トランスジーン2及び3は、異なる特徴を有する誘導性プロモーターの制御下にある。
内在性T細胞プロモーターからトランスジーンを発現するための本発明のT細胞の改変は、T細胞によるトランスジーン発現の自律的調節をもたらす。したがって、特に、少なくとも1つの遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にあるとき、T細胞の微小環境を用いて、複数のトランスジーンの発現を調整し、トランスジェニックT細胞の活性の最適化をもたらすことができる。例えば、T細胞療法は、T細胞刺激性サイトカインの投与を伴うことができる(Sadelainらの文献、Cancer Disc. 3:388-398(2013)を参照)。一実施態様において、本発明のT細胞を改変して、CARと第二のトランスジーン、例えば、T細胞活性化サイトカインを共発現させることができる。例えば、T細胞が、CARによって認識される、例えば、腫瘍上の、抗原に近接しているときに、例えば、T細胞がCARへの結合によって標的腫瘍抗原と結合したときに、第二のトランスジーンを制御する誘導性プロモーターの活性化が起こるように、CARを構成的プロモーターの制御下に置くことができ、第二のトランスジーン、例えば、T細胞活性化サイトカイン(例えば、インターロイキン12(IL12))を誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。この例において、そのようなコンストラクトは、毒性を生じ得る、T細胞活性化サイトカインの全身又は局所投与の必要性をなくす。さらに、T細胞が、薬物の投与によって調節され得る誘導性プロモーターの制御下でT細胞活性化サイトカインを発現するように改変されている場合、そのようなコンストラクトは、薬物を投与する必要性をなくす。そのような場合、トランスジーンの発現を誘導するために薬物を投与することが必要となる代わりに、トランスジーン発現の調節が内在性プロモーターの制御下となり、それにより、トランスジーンの発現がもたらされる。その代わりとして、T細胞自体が、標的抗原との結合時に、T細胞活性化サイトカインの発現を活性化し、サイトカインの局所的発現、それゆえ、トランスジーンの発現の空間的・時間的調節をもたらして、免疫療法に使用されることになるT細胞の有効性を最適化する。
別の例において、CARを発現するT細胞は、毒性を示し得ることもある。そのような毒性を軽減するために、具体的な実施態様においては、それゆえ、T細胞がCARによって認識される標的、例えば、標的腫瘍と結合するまで、プロモーターが誘導されず、CARの発現が起こらないように、CARをコードするトランスジーンを誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。さらに別の実施態様において、T細胞を、特定の標的に対するより高い選択性を有するように改変することができる。例えば、場合によっては、腫瘍上の標的抗原は、腫瘍のみに発現されているわけではない可能性がある。それゆえ、標的抗原へのT細胞の標的化は、同じ抗原を発現する非標的細胞又は組織に対する免疫応答を生じ得る。したがって、一実施態様において、本発明のT細胞は、標的腫瘍上の2つの抗原を認識するように改変され、それにより、標的腫瘍に対するより高い選択性がもたらされる。例えば、T細胞は、2つの異なる腫瘍抗原に特異的な2つのCARを発現するように改変することができる。この場合、2つの標的抗原を担持する標的に対するT細胞の選択的結合を、誘導性の内在性プロモーターの制御下の第三のトランスジーン、例えば、上記のT細胞活性化サイトカインと連動させ、それにより、T細胞の活性化を標的との選択的結合時にのみ該サイトカインで刺激することができる。当業者であれば、構成的であるか、T細胞のサブタイプに特異的であるか、誘導性であるか、又はこれらの組合せであるかのいずれかの、好適な内在性T細胞プロモーターの制御下で発現されることになる好適な治療的トランスジーンの選択を用いて、トランスジーンの自律調節発現を生じさせ、より効果的なT細胞療法を提供することができることを容易に理解するであろう。一実施態様において、1つの抗原を標的とする十分に適格なCARを使用する代わりに、2つの異なる抗原を標的とする2つの準最適なCARを十分な抗腫瘍応答に関与する必要がある。健康な組織が一方又は他方の抗原を発現する場合、該健康な組織は、CAR T細胞応答に十分には関与しない。腫瘍が2つの抗原を発現する場合、完全なCAR T細胞活性が誘発される。
T細胞を特定の分子信号に特異的に応答するように改変して、新しい治療的分子を選択された場所及び時間で産生することができるので、本発明は、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方を任意に使用することに関する。例えば、抗原特異的細胞表面受容体をコードするトランスジーンは、構成的プロモーターから発現されることができ、かつその特定の抗原と相互作用したときにのみシグナルを伝達する。その後、この相互作用は、治療的分子の発現を制御する特異的プロモーターの活性化を誘導する。この特定の改変されたT細胞の治療的利益は、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方の機能によって決まる。特定の実施態様において、CARは、構成的プロモーター(例えば、TRAC、CD3s、B2M…)の制御下にあることができる。特定の実施態様において、別の治療的トランスジーン(モノクローナル抗体(チェックポイント阻害剤など)又はサイトカイン(例えば、IL12、IL18など)は、CAR結合(例えば、IL2、IFNg、CD69…)によって活性化されるプロモーターの制御下にある。そのような場合、トランスジーンは、CAR活性化時に発現され、かつ腫瘍で特異的に発現される。
一実施態様において、本発明は、3以上のトランスジーンを発現することに関する。例えば、トランスジーン1は構成的であることができ、トランスジーン2は、抗原との接触後すぐに生じることができ、トランスジーン3は、トランスジーン2よりも後の時間に又はそれとは異なるレベルで生じることができる。この例において、トランスジーン1の発現は、内在性の構成的プロモーターの制御下にあり、トランスジーン2の発現は、抗原結合によって誘導される内在性プロモーターによって制御されているので、抗原との接触後すぐに開始され、トランスジーン3の発現は、トランスジーン2を調節する内在性プロモーターよりも後に誘導されるか又はそれとは異なるレベルの発現をもたらす内在性プロモーターによって制御されているので、トランスジーン2よりも後に又はそれとは異なるレベル開始される。この例において、トランスジーン1は構成的であり、トランスジーン2及び3は誘導性である(各々異なる動力学的特徴を有する)。特定の実施態様において、トランスジーン1は、例えば、腫瘍細胞上の抗原Aに特異的なCARをコードし、この場合、トランスジーン1は、構成的に発現される。抗原Aに結合した後、(例えば、同じく腫瘍細胞上で又は腫瘍微小環境内の他の細胞上で発現される)抗原Bに特異的な別のCARをコードするトランスジーン2が発現される。トランスジーン3は、例えば、第三のCARであることができ;この第三のCARは、例えば、同じく腫瘍細胞又は腫瘍微小環境内の他の細胞上の抗原Cを認識することができる。この例は、同じT細胞による異なるCARの時間的/連続的発現を用いた「コンビナトリアル標的化」の一形態である。別の特定の実施態様において、トランスジーン1は抗原Aに特異的なCAR(又はTCR)をコードし;トランスジーンBはサイトカインをコードし、トランスジーン3は、別のサイトカイン又は共刺激性リガンド又は例えば、抗原Aを発現する同じ細胞(例えば、腫瘍細胞)もしくは同じ微小環境中の細胞上の抗原を認識するscFvをコードする。これは、遺伝子発現を腫瘍微小環境などの微小環境に制限することにより、T細胞の効力及び安全性を増大させるように設計された連続的遺伝子活性化の例である。したがって、当業者は、トランスジーンの所望の発現特徴をもたらす所望のトランスジーンの配置のために内在性T細胞プロモーターを選択することができる。
あるトランスジーン(例えば、免疫刺激性トランスジーン--発現すると、免疫刺激効果をもたらすもの)が免疫刺激性であるT細胞で発現するのが望ましいのに対し、他のトランスジーン(例えば、免疫抑制性トランスジーン--発現すると、免疫抑制効果をもたらすもの)は免疫抑制性であるT細胞で発現するのが望ましいことがさらに理解される。当業者は、免疫応答を刺激することが望ましいのか、それとも免疫応答を抑制することが望ましいのかによって、T細胞で発現すべき好適なトランスジーンを容易に決定することができることが理解される。明白なことであるが、好ましい実施態様において、免疫刺激性トランスジーンを免疫刺激性T細胞で発現させて、該T細胞が投与される対象で免疫応答を刺激し、免疫抑制性トランスジーンを免疫抑制性T細胞で発現させて、該T細胞が投与される対象で免疫応答を抑制する。
(構成的プロモーター)
一実施態様において、治療的トランスジーンは、該トランスジーンの発現が、構成的である内在性プロモーターの制御下に置かれるように、T細胞のゲノム内の部位で組み込まれる。構成的プロモーターを用いて、トランスジーン、例えば、CAR又はCCRを発現させ、免疫応答を活性化することができる。PD1及び又はcTLA4 細胞内ドメインなどを含有する抑制性CAR(iCAR)の発現を制御する場合、構成的プロモーターを用いて、免疫応答を抑制することもできる。
一実施態様において、構成的プロモーターは、TCRプロモーター、すなわち、T細胞受容体複合体(TCR)のタンパク質のプロモーターである(実施例を参照)。特定の実施態様において、内在性プロモーターは、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである。
別の実施態様において、構成的プロモーターは、例えば、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターなどのプロモーターであることができるが、これらに限定されない(表1、構成的と表示されたプロモーターも参照)。
表1.例示的な構成的及び誘導性プロモーター並びに対応する誘導因子。
Figure 0007058223000003
Figure 0007058223000004
(T細胞サブセット特異的プロモーター)
一実施態様において、治療的トランスジーンは、該トランスジーンの発現がT細胞のサブセットで活性がある内在性プロモーターの制御下に置かれるように、T細胞のゲノム内の部位で組み込まれる。T細胞のサブセットで活性があるそのようなプロモーターは、他のT細胞で不活性であるか又は低い活性を有することが理解される。T細胞のサブセットで活性がある例示的なプロモーターとしては、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターなどのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない(表1及び2を参照)。
表2において、発現レベルは、Mahnkeらの文献、Eur. J. Immunol. 43(11):2797-809. doi: 10.1002/eji.201343751(2013)によって報告されているような、様々なT細胞分化サブセットの未感作T細胞と比較されている。TCR又はCARによる活性化の後、T細胞は分化を経ることになり、特定の遺伝子は活性化又は抑制されることになる。誘導因子は、TCR又はCARによる初期の活性化であるが、シグナル伝達もT細胞の分化に影響を及ぼす共刺激を持続する(Mahnkeらの文献、Eur. J. Immunol. 43(11):2797-809. doi: 10.1002/eji.201343751(2013)も参照)。
表2.T細胞サブセットに特異的な例示的なプロモーター(Mahnkeらの文献、Eur. J. Immunol. 43(11):2797-809. doi: 10.1002/eji.201343751(2013)を参照)。
Figure 0007058223000005
一般に、単一のプロモーターに対して単一の誘導因子がいつも存在するのではなく、プロモーター活性化をもたらすシグナル経路関与及び活性化/抑制ループが存在する。これらのシグナル伝達経路は、複数の誘導因子によって誘発され、サブセット又は表現型へのT細胞のコミットメントをもたらす。しかしながら、ある遺伝子発現パターンは、サブセット及び表現型に極めて特異的であり;そのプロモーターは、例えば、Th1ではT-bet及びINFγ; Th2では、GATA3、IL4、及びIL10; Th17ではIL6; TregではFoxP3と、標的化され得る。したがって、内在性プロモーターを、特定のT細胞サブタイプにおけるトランスジーンの発現をもたらすトランスジーンの組込みのために選択することができる。
(誘導性プロモーター)
一実施態様において、治療的トランスジーンは、該トランスジーンの発現が誘導性である内在性プロモーターの制御下に置かれるように、T細胞のゲノム内の部位で組み込まれる。誘導性プロモーターは、シグナルを核に伝達し、誘導性プロモーターの活性化をもたらす誘導因子に応答性であるプロモーターである(例えば、表1を参照)。一般に、誘導因子は、T細胞によって発現される分子の結合パートナーである。例えば、受容体の場合、結合パートナーは、その同族リガンドであることができ、又はCAR、CCR、もしくはTCRの場合、結合パートナーは、標的抗原であることができる。
一実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、T細胞の活性化によって誘導される。一実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、例えば、その対応する抗原と相互作用したときに、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)又はキメラ共刺激性受容体(CCR)のそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。CAR及びCCRのより詳細な説明は、治療的トランスジーンを説明する下記の節で提供されている。簡潔に述べると、CARとCCRはどちらも、細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。CARの場合、細胞内シグナル伝達ドメインはT細胞を活性化し、任意に、共刺激ドメインを含有する(第二及び第三世代のCARの場合)(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3(4):388-398(2013)を参照)。CCRの場合、それは、共刺激シグナルを含有するが、T細胞活性化シグナルを有しない(Sadelainらの文献、上記、2013)。対応する抗原のCAR又はCCRへの結合は、T細胞シグナル伝達ドメイン及び/又は共刺激ドメインの活性化をもたらす。これらのシグナル伝達ドメインの活性化は、T細胞における核へのシグナルの伝播及び特定の内在性プロモーターの活性化をもたらす。CAR又はCCRの細胞内シグナル伝達ドメインとしては、CD28、4-1BB、CD27、ICOS、CD3zなどの細胞内ドメイン及び本明細書に開示される他の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達は、これらのドメインの突然変異型(例えば、突然変異型ITAM)、切断型、又は融合型でも生じることができる。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、T細胞によって発現されるT細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、4-1BBなどのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される。これらの分子は、細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。活性化されると、該シグナル伝達ドメインは、T細胞における核へのシグナルの伝播及び特定の内在性プロモーターの活性化をもたらす。別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、iCAR(抑制性細胞内ドメイン、例えば、PD1、CTLA4を有するCAR)又は切断型CAR(細胞内ドメインなし)の結合によって誘導される。一実施態様において、iCARは、CTLA4又はPD1細胞内ドメインのシグナル伝達を介する標的遭遇時のT細胞活性化の「ブレーキ」として機能する。したがって、PD1又はCTLA4によって調節されるプロモーターを用いて、iCARの抗原との遭遇時にトランスジーンを発現させることができる。トランスジーンは、例えば、T細胞活性化をさらに制御するための免疫抑制分子であり得る。
本発明者らは、切断型CARによって、T細胞をその標的が発現される特定の場所に向けることが可能になるであろうと考えている。本発明者らは、CAR T細胞と標的細胞の接触を作り出すことにより、トランスジーン発現のために標的化され得るプロモーターが最終的に調節されるであろうとも考えている。
特定の実施態様において、CAR、CCR、又はTCRによって誘導されるプロモーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、PD-1プロモーター、TIM-3プロモーター、CTLA4プロモーター、LAG3プロモーター、TRAILプロモーター、BTLAプロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、FasLプロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される。特定の実施態様において、CARとTCRはどちらも、CD3 ITAMリン酸化のシグナル経路中にあり、かつCa2+依存性転写因子(例えば、NFAT、NFkB、AP1、又はCREB調節遺伝子、例えば、IL2)によって調節されるプロモーターを調節することができる。そのようなプロモーターは、該経路からのシグナル伝達時に発現の増大をもたらす。CAR及びCCRについて、抗原遭遇時に調節される遺伝子は、CAR及びCCRが、それぞれ、構成されるドメインによって決まり、例えば、CD28共刺激ドメインはPI3K経路によって活性化されるプロモーターを誘導し、一方、41BB共刺激ドメイン活性化はTRAF経路によって活性化されるプロモーターを誘導する。例えば、TCR/CD28(並びにCD28及びCD3ζから構成されるCAR)活性化に応答するプロモーターの適時調節を用いて、トランスジーンの発現のタイミングを調節することができる(図17; Bestらの文献、Nat. Immunol. 14:404-413(2013)を参照)。例えば、CD8+ T細胞の活性化及び記憶形成に関して、クラスター1(12～24時間)のプロモーターには、例えば、CTLA4プロモーター、IFNγプロモーター、Gzmbプロモーター、IL2raプロモーター、IL2プロモーターなどが含まれ;クラスター2(12～48時間)のプロモーターには、例えば、CD69プロモーター及びPkm2プロモーターなどが含まれ;クラスター3(24時間～数日)のプロモーターには、例えば、Id2プロモーター、KLRg1プロモーター、Cxcr3プロモーター、Cxcr3r1プロモーター、Itgamプロモーターなどが含まれる(さらなる例示的なプロモーターに関する図17、及びBestらの文献、上記、2013も参照)。例示的な誘導性プロモーターは、4-1BBプロモーターである。別の例示的な誘導性プロモーターは、低酸素に対する代謝応答に関与するHIF1αである。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、T細胞上に発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される。例示的な抑制性受容体としては、受容体のプログラム細胞死1(PD-1)、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL、受容体1及び2)、Fas、Ig及びITIMドメインを含むT細胞免疫受容体(TIGIT)、並びに2B4(CD244)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抑制性受容体の対応するリガンドとしては、例えば、PD-L1(PD-1の場合); PD-L2(PD-1の場合); CD80、CD86(CTLA-4の場合); HVEM(BTLAの場合);ガレクチン-9、HMGB1(TIM-3の場合); MHC II(LAG-3の場合); TRAIL(TRAIL受容体1及びTRAIL受容体2の場合); Fasリガンド(FasL)(Fasの場合)などが挙げられる(Chenらの文献、Nat. Rev. Immunol. 13(4):227-242(2013); Tollefsonらの文献、J. Virol. 75:8875-8887(2001); Waringらの文献、Immunol. Cell Biol. 77:312-317(1999)を参照)。
特定の実施態様において、抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導されるプロモーターは、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、T細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される。一実施態様において、サイトカインは、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される免疫刺激性サイトカインである。別の実施態様において、サイトカインは、インターロイキン10(IL10)、形質転換成長因子-β(TGFβ); IL4、IL9、又は胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)などの、免疫抑制性サイトカインである。
特定の実施態様において、プロモーターは、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択されるサイトカインによって誘導される。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、細胞と核酸との接触によって誘導される。特定の実施態様において、核酸は、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される。細胞と核酸との接触によって誘導される例示的なプロモーターとしては、I型インターフェロン(IFN)(α及びβ)、IRF3及びIRF7転写因子、NFkB及びAP-1転写因子、炎症促進性サイトカイン(TNF-α、IL1、IL6)などのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、代謝物質によって誘導される。特定の実施態様において、代謝物質は、ピルベート、グルタミン、β-ヒドロキシブチレート、ラクテート、及びセリンからなる群から選択される。これらの代謝物質は、T細胞活性化時に生成又は摂取され、T細胞での代謝変化につながる。代謝物質によって誘導される例示的なプロモーターは: c-Myc、HIF-1α、ERRα、CD98、SLC1A5、Psat1、Phgdh、psph、Mthfd2、Mthfd1、Mat2a、Mtrr、Mtr、Shmt1、Shmt2のプロモーターである(Wangらの文献、Immunity 35:871-882(2011); Changらの文献、Nat. Immunol. 17: 364-368(2016); Maらの文献、Cell Metab. 25:345-357(2017)を参照)。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、代謝変化によって誘導される。これは、細胞の代謝状態を表す。例えば、ナイーブT細胞が酸化的リン酸化に依存して、エネルギーを生み出すとき、及びそれらが活性化されるようになって、エフェクターT細胞に分化するとき、それらは、解糖に切り替えてエネルギーを生み出す。低酸素及び低pHも代謝変化を誘導する(Changらの文献、Nat. Immunol 17:364-368(2016); McNameeらの文献、Immunol. Res. 55: 58-70(2013))。
特定の実施態様において、代謝変化によって誘導されるプロモーターは、PKM2プロモーターである。PKM2プロモーターは、PKM1のものと同じである。PKM2は、細胞が酸化的リン酸化から解糖に切り替えるときに、選択的スプライシングによって生成される。
別の実施態様において、内在性の誘導性プロモーターは、イオン、例えば、特定のイオン濃度によって誘導される。一実施態様において、イオンは、カリウム又はカルシウムである。イオンによって誘導される例示的なプロモーターとしては、NFAT依存的に活性化されるIL2、TNFα、及びIFNγのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。NFATは、細胞内カルシウムのレベルの増加によって活性化される。
(7.5 治療的トランスジーン)
本発明は、治療的トランスジーンの発現がT細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンを該T細胞のゲノム内の部位で組み込むことにより、該T細胞で該トランスジーンを発現させることに関する。治療的トランスジーンは、治療的タンパク質又は治療的核酸をコードするヌクレオチド(例えば、DNA又はその修飾形態)配列である。該治療的タンパク質又は治療的核酸は、T細胞によって発現される場合、ヒト又は動物の疾患又は障害の治療に役に立つ。治療的核酸は、好ましくは、治療的RNAである。治療的タンパク質は、ペプチド又はポリペプチドであることができる。
本明細書に記載される実施態様の一態様において、治療的トランスジーンは、膜結合型のインターロイキン4(IL4)をコードしない。
治療的トランスジーンとしては、CAR、キメラ共刺激性受容体(CCR)、TRC、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、レポーター、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター又はリプレッサー、非コードRNAなどをコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。
トランスジーンは、例えば、cDNA、遺伝子、miRNA、又はlncRNAなどをコードすることができることが理解される。さらに、トランスジーンは、ポリシストロン性メッセージ、すなわち、並んだcDNA又は並んだmiRNAであることができる。1つの例示的なポリシストロン性トランスジーンは、TCR鎖である。ポリシストロン性メッセージをT細胞で改変して、同じ内在性プロモーターの制御下で複数のトランスジーンを発現させることができる。したがって、3つの2シストロン性トランスジーンを3つの選択された遺伝子座にノックインすることにより、改変されたT細胞で6つの遺伝子産物を発現させることができる。したがって、いくつかのトランスジーン(望ましい場合、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど)を、各々別々の内在性プロモーターの制御下で、又はいくつかのトランスジーン(すなわち、ポリシストロン性トランスジーン)を同じ内在性プロモーターの制御下で、T細胞で発現させることができる。複数のトランスジーンを独立に構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。したがって、構成的プロモーター及び/又は誘導性プロモーターの組合せをT細胞で用いて、複数のトランスジーンを同じ細胞で発現させることができる。
具体的な実施態様において、トランスジーンは、ポリシストロン性、例えば、2シストロン性である。具体的な実施態様において、トランスジーンはポリシストロン性であり、かつ複数の治療的タンパク質又は治療的RNAをコードし、その場合、両方の発現は、T細胞の同じ内在性プロモーターの制御下にある。具体的な実施態様において、トランスジーンは2シストロン性であり、かつ2つの治療的タンパク質(例えば、scFv)をコードし、その場合、scFvの発現はどちらも、T細胞の同じ内在性プロモーターの制御下にある。
一実施態様において、治療的トランスジーンはTCRをコードする。複数のポリペプチド鎖上にコードされるトランスジーンの場合、該トランスジーンは、複数のポリヌクレオチドから発現させることができる、すなわち、2つのコード核酸(例えば、cDNA)はT細胞で共発現される。したがって、多サブユニットタンパク質を発現させることが望ましい場合、異なるポリペプチドサブユニットを異なるトランスジーンから発現させることができる、すなわち、2つのコードヌクレオチド配列(例えば、cDNA配列)は、T細胞で異なる内在性T細胞プロモーターによって調節される異なるトランスジーンから共発現される。一実施態様において、TCRのa鎖及びb鎖が発現される。
(キメラ抗原受容体(CAR))
キメラ抗原受容体(CAR)は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。本発明の細胞によって組換え発現されるCARは、抗原に結合する抗原結合ドメインである。抗原は、対象に存在するか、又はT細胞が投与される対象において予防されることが望ましい、疾患又は障害と関連する。
具体的な実施態様において、CARは、「第一世代」、「第二世代」、又は「第三世代」CARであることができる(例えば、Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3(4):388-398(2013); Jensenらの文献、Immunol. Rev. 257:127-133(2014); Sharpeらの文献、Dis. Model Mech. 8(4):337-350(2015); Brentjensらの文献、Clin. Cancer Res. 13:5426-5435(2007); Gadeらの文献、Cancer Res. 65:9080-9088(2005); Maherらの文献、Nat. Biotechnol. 20:70-75(2002); Kershawらの文献、J. Immunol. 173:2143-2150(2004); Sadelainらの文献、Curr. Opin. Immunol.(2009); Hollymanらの文献、J. Immunother. 32:169-180(2009)を参照)。
「第一世代」CARは、通常、細胞外抗原結合ドメイン、例えば、単鎖可変断片(scFv)が膜貫通ドメインと融合し、それがT細胞受容体鎖の細胞質/細胞内ドメインと融合したものから構成される。「第一世代」CARは、通常、内在性T細胞受容体(TCR)からのシグナルの主要な伝達装置であるCD3ζ鎖由来の細胞内ドメインを有する(図1Aの例示的な第一世代CARを参照)。「第一世代」CARは、デノボの抗原認識をもたらし、HLA媒介性抗原提示とは独立に、単一の融合分子中のそのCD3ζ鎖シグナル伝達ドメインを介して、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。本発明において使用するための「第二世代」CARは、T細胞を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメイン並びにT細胞の効力及び持続性を強化するように設計された共刺激ドメインに融合された抗原結合ドメインを含む(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:388-398(2013))。それゆえ、CARの設計は、抗原認識をシグナル伝達と組み合わせることができ、これらは、TCRヘテロ二量体及びCD3複合体という2つの別々の複合体によって生理的に担われる2つの機能である。「第二世代」CARは、細胞にさらなるシグナルを提供するための様々な共刺激分子、例えば、CD28、4-1BB、ICOS、OX40などに由来する細胞内ドメインをCARの細胞質テールに含む(図1Aの例示的な第二世代CARを参照)。「第二世代」CARは、例えば、CD28又は4-1BBドメインによる共刺激と例えば、CD3ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方をもたらす。前臨床研究により、「第二世代」CARがT細胞の抗腫瘍活性を改善することができることが示されている。例えば、「第二世代」CAR改変型T細胞の強い効力は、慢性リンパ芽球性白血病(CLL)及び急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者においてCD19分子を標的化する臨床試験で立証された(Davilaらの文献、Oncoimmunol. 1(9):1577-1583(2012))。「第三世代」CARは、例えば、CD28ドメインと4-1BBドメインの両方を含むことによる複数回の共刺激及び例えば、CD3ζ活性化ドメインを含むことによる活性化をもたらす。
本明細書に開示される実施態様において、CARは、通常、上記のような、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、その場合、細胞外抗原結合ドメインは、対象となる抗原、例えば、癌抗原、又は感染性病原体の抗原、又は自己免疫障害の抗原、又は移植された組織の抗原に結合する。特定の非限定的な実施態様において、細胞外抗原結合ドメインはscFvである。
本明細書に開示されるように、本発明の方法は、CARを発現するように改変されている細胞を投与することを含む。CARの細胞外抗原結合ドメインは、通常、モノクローナル抗体(mAb)又は受容体もしくはそのリガンドに由来する。
CARの設計は当技術分野で周知である(例えば、Sadelainらによる総説、Cancer Discov. 3(4):388-398(2013); Jensenらの文献、Immunol. Rev. 257:127-133(2014); Sharpeらの文献、Dis. Model Mech. 8(4):337-350(2015)、及びこれらの中で引用されている参考文献を参照)。所望の抗原に対するCARは、本明細書に記載される方法を含む、周知のCAR設計方法を用いて作製することができる。CARは、第一世代CARであれ、第二世代CARであれ、第三世代CARであれ、標的抗原結合活性、例えば、癌抗原結合活性、例えば、抗原に対するscFv抗体を、免疫細胞シグナル伝達ドメイン、例えば、T細胞受容体細胞質/細胞内ドメインに融合することより、容易に設計することができる。上記のように、CARは、通常、細胞外ドメインの少なくとも一部が膜貫通ドメインに融合し、それがT細胞における細胞シグナル伝達活性を有する細胞内ドメインに融合したものとしての、抗原結合活性、例えば、scFvを有する、細胞表面受容体の構造を有する。CARは、本明細書に記載される共刺激分子を含むことができる。当業者は、T細胞における所望のシグナル伝達能力を提供するように、本明細書に記載されかつ当技術分野で公知の適切な膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを容易に選択することができる。
本発明において使用するためのCARは、抗原に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。具体的な実施態様において、該抗原結合ドメインは、標的癌細胞又は組織上の抗原に結合する。そのような抗原結合ドメインは、通常、抗体に由来する。一実施態様において、該抗原結合ドメインは、scFvもしくはFab、又は抗体の任意の好適な抗原結合断片であることができる(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:38-398(2013)を参照)。抗原、例えば、癌抗原に結合する多くの抗体又は抗体に由来する抗原結合ドメインは当技術分野で公知である。或いは、そのような抗体又は抗原結合ドメインは、ルーチンの方法によって産生することができる。抗体を作製する方法は当技術分野で周知であり、これには、モノクローナル抗体を産生する方法又はライブラリーをスクリーニングして、抗原結合ポリペプチドを取得する方法が含まれ、これには、ヒトFabのライブラリーをスクリーニングすることが含まれる(Winter及びHarrisの文献、Immunol. Today 14:243-246(1993); Wardらの文献、Nature 341:544-546(1989); Harlow及びLaneの文献、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988); Hilyardらの文献、タンパク質工学:実践的手法(Protein Engineering: A practical approach)(IRL Press 1992); Borrabeckの文献、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)、第2版(Oxford University Press 1995); Huseらの文献、Science 246:1275-1281(1989))。CARについて、抗体に由来する抗原結合ドメインは、望ましい場合、ヒト、ヒト化、キメラ、CDR移植されたものなどであることができる。例えば、マウスモノクローナル抗体がCARの抗原結合ドメインを作製するためのソース抗体である場合、そのような抗体は、マウス抗体のCDRをヒトフレームワーク上に移植することによりヒト化することができ(Borrabeck、上記、1995)、これは、CARをヒト対象に投与するのに有益であり得る。好ましい実施態様において、抗原結合ドメインはscFvである。scFvの作製は当技術分野で周知である(例えば、Huston,らの文献、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988); Ahmadらの文献、Clin. Dev. Immunol. 2012: ID980250(2012);米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、及び第4,956,778号;並びに米国特許公開第20050196754号及び第20050196754号を参照)。
抗原結合活性の取得に関して、当業者は、好適な抗原結合活性、例えば、抗体を、CARにおいて特に有用である、抗原に結合するscFvの作製を含む、本明細書に開示される、所望の抗原に結合する抗体を作製及びスクリーニングする周知の方法のいずれかを用いて容易に取得することができる。さらに、抗体、特に、モノクローナル抗体のいくつかの抗原、例えば、癌抗原又は他の抗原は市販されており、これを、抗原結合活性、例えば、scFvの供給源として用いて、CARを作製することもできる。
抗体由来の抗原結合ドメインを使用する代わりに、CAR細胞外ドメインは、受容体のリガンド又は細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:388-398(2013); Sharpeらの文献、Dis. Model Mech. 8:337-350(2015)を参照)。この場合、受容体のリガンド又は細胞外リガンド結合ドメインは、CARに対して、対応する受容体又はリガンドに対するCARを発現する細胞を標的化する能力を提供する。具体的な実施態様において、該リガンド又は細胞外リガンド結合ドメインは、CARを発現する細胞が癌細胞又は腫瘍に標的化されるように選択される(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:388-398(2013); Sharpeらの文献、Dis. Model Mech. 8:337-350(2015)、及びその中に引用されている参考文献を参照)。本発明の実施態様において、該リガンド又は細胞外リガンド結合ドメインは、対応する受容体又はリガンドである抗原に結合するように選択される(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:388-398(2013)を参照)。
標的抗原に対するCARについて、CARの抗原結合ドメインは、標的抗原(標的細胞上に発現される抗原)に結合するように選択される。そのような標的抗原は、標的細胞上で特有に発現されることができるか、又は該標的抗原は、非標的細胞もしくは組織と比べて標的細胞で過剰発現されることができる。CARによって結合されることになる標的抗原は、非標的細胞又は組織よりもCARを発現する細胞の標的化をもたらすように選択される。好ましい実施態様において、癌抗原に対するCARについて、該CARの抗原結合ドメインは、癌細胞上で発現される抗原に結合するように選択される。そのような癌抗原は、癌細胞上で特有に発現されることができるか、又は該標的抗原は、非癌性細胞もしくは組織と比べて癌細胞で過剰発現されることができる。CARによって結合されることになる癌抗原は、非癌性細胞又は組織よりもCARを発現する細胞の標的化をもたらすように選択される。癌を治療するための本発明の方法の一実施態様において、T細胞は、本明細書に記載される、患者の癌の好適な癌抗原に結合するCARを細胞内で発現することにより、癌患者を治療するように設計される。同様に、CARを用いて、感染性疾患病原体もしくは自己免疫障害の抗原、又は移植した組織の抗原を標的化する場合、該抗原は、標的上もしくは標的部位で特有に発現されるか又は非標的組織もしくは非標的部位と比べて過剰発現されることができる。
癌抗原は腫瘍抗原であることができる。任意の好適な癌抗原は、治療されることになる対象(癌患者)によって示される癌の種類に基づいて選択することができる。選択される癌抗原は、癌抗原がCARによって結合されやすいような形で発現されることが理解される。通常、CARを発現する細胞によって標的化されることになる癌抗原は、癌細胞の細胞表面で発現される。しかしながら、CARに結合しやすい任意の癌抗原は、CARを発現する細胞を癌細胞に標的化するのに好適であることが理解される。例示的な癌抗原及び例示的な癌は、下の表3に提供されている。
表3.標的とされる癌抗原及び対応する癌標的。
Figure 0007058223000006
Figure 0007058223000007
Figure 0007058223000008
Figure 0007058223000009
Figure 0007058223000010
好適な癌抗原としては、メソテリン(MSLN)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺幹細胞抗原(PCSA)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CAIX)、癌胎児性抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、上皮糖タンパク質2(EGP 2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-α及びβ(FRα及びβ)、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト表皮成長因子受容体2(HER-2/ERB2)、表皮成長因子受容体vIII(EGFRvIII)、ERB3、ERB4、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Rα2)、κ-軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(LlCAM)、メラノーマ関連抗原1(メラノーマ抗原ファミリーA1、MAGE-A1)、ムチン16(Muc-16)、ムチン1(Muc-1)、NKG2Dリガンド、癌精巣抗原NY-ESO-1、癌胎児性抗原(h5T4)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、血管内皮成長因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、1型チロシン-タンパク質キナーゼ膜貫通受容体(ROR1)、B7-H3(CD276)、B7-H6(Nkp30)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン-4(CSPG4)、DNAX補助分子(DNAM-1)、エフリンA型受容体2(EpHA2)、線維芽細胞関連タンパク質(FAP)、Gp100/HLA-A2、グリピカン3(GPC3)、HA-1H、HERK-V、IL-11Rα、潜在膜タンパク質1(LMP1)、神経細胞接着分子(N-CAM/CD56)、並びにトレイル受容体(TRAIL R)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの又はその他の癌抗原を癌抗原CARによる標的化に使用することができることが理解される。
上記のように、CARは、CARを発現するT細胞で機能するシグナル伝達ドメインも含有する。そのようなシグナル伝達ドメインは、例えば、CDζ又はFc受容体γに由来することができる(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3:288-298(2013)を参照。一般に、該シグナル伝達ドメインは、形質導入されたT細胞又はその前駆細胞における持続性、輸送、及び/又はエフェクター機能を誘導する(Sharpeらの文献、Dis. Model Mech. 8:337-350(2015); Finneyらの文献、J. Immunol. 161:2791-2797(1998); Krauseらの文献、J. Exp. Med. 188:619-626(1998))。CDζ又はFc受容体γの場合、該シグナル伝達ドメインは、それぞれのポリペプチドの細胞内ドメイン、又はシグナル伝達に十分である細胞内ドメインの断片に対応する。例示的なシグナル伝達ドメインは、以下でより詳細に記載されている。
例示的なポリペプチドは、GenBank番号、GI番号、及び/又は配列番号を参照して、本明細書に記載されている。当業者は、限定されないが、GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)及びEMBL(embl.org/)を含む、配列源を参照して、相同配列を容易に同定することができることが理解される。
(CD3ζ)
非限定的な実施態様において、CARは、T細胞を活性化又は刺激することができる、CD3ζポリペプチドに由来するシグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ζの細胞内ドメインに由来するシグナル伝達ドメインを含むことができる。CD3ζは、3つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含み、抗原が結合した後、活性化シグナルを、細胞、例えば、リンパ系の細胞、例えば、T細胞に伝達する。CD3ζポリペプチドは、GenBank番号NP_932170(GI:37595565;下記参照)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。一実施態様において、CD3ζポリペプチドは、以下に提供されるCD3ζポリペプチド配列のアミノ酸52～164のアミノ酸配列、又はシグナル伝達活性に十分であるその断片を有する。CD3ζ内のドメイン、例えば、アミノ酸1～21のシグナルペプチド;アミノ酸22～30の細胞外ドメイン;アミノ酸31～51の膜貫通ドメイン;アミノ酸52～164の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_932170を参照されたい。「CD3ζ核酸分子」は、CD3ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
Figure 0007058223000011
特定の非限定的な実施態様において、CARの細胞内ドメインは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。そのような共刺激シグナル伝達ドメインは、T細胞の活性化の増大をもたらすことができる。共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28ポリペプチド、4-1BB ポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、DAP10ポリペプチド、2B4ポリペプチドなどに由来することができる。4-1BB、ICOS、又はDAP-10を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含むCARは、以前に記載されている(引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第7,446,190号を参照されたく、これは、4-1BB、ICOS、及びDAP-10の代表的な配列も記載している)。いくつかの実施態様において、CARの細胞内ドメインは、2つの共刺激分子、例えば、CD28と4-1BB(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3(4):388-398(2013)を参照)、又はCD28とOX40、又は本明細書に開示される共刺激リガンドの他の組合せを含む、共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。
(CD28)
分化抗原群28(CD28)は、T細胞の活性化及び生存のための共刺激シグナルをもたらすT細胞上で発現されるタンパク質である。CD28は、CD80(B7.1)及びCD86(B7.2)タンパク質の受容体である。一実施態様において、CARは、CD28に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、本明細書に開示されるように、CARは、CD28の細胞内/細胞質ドメインの少なくとも一部、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインとして機能することができる細胞内/細胞質ドメインを含むことができる(図1B参照)。CD28ポリペプチドは、以下に提供されるGenBank番号P10747もしくはNP_006130(GI:5453611)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。望ましい場合、細胞内ドメインに付加的なCD28配列を本発明のCARに含めることができる。例えば、CARは、CD28ポリペプチドの膜貫通部を含むことができる。一実施態様において、CARは、CD28のアミノ酸180～220に対応するCD28の細胞内ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。別の実施態様において、CARは、アミノ酸153～179に対応するCD28の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。CD28内のドメイン、例えば、アミノ酸1～18のシグナルペプチド;アミノ酸19～152の細胞外ドメイン;アミノ酸153～179の膜貫通ドメイン;アミノ酸180～220の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_006130を参照されたい。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いCD28の配列をCARに含めることができることが理解される。「CD28核酸分子」は、CD28ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
Figure 0007058223000012
(4-1BB)
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9とも呼ばれる4-1BBは、腫瘍壊死因子(TNF)リガンドとして作用し、刺激活性を有することができる。一実施態様において、CARは、4-1BBに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。4-1BBポリペプチドは、GenBank番号P41273もしくはNP_001552(GI:5730095)を有する配列に対応するアミノ酸配列又はその断片を有することができる。一実施態様において、CARは、アミノ酸214～255に対応する4-1BBの細胞内ドメインを含む共刺激ドメイン、又はその断片を有することができる。別の実施態様において、CARは、アミノ酸187～213に対応する4-1BBの膜貫通ドメイン、又はその断片を有することができる。4-1BB内のドメイン、例えば、アミノ酸1～17のシグナルペプチド;アミノ酸18～186の細胞外ドメイン;アミノ酸187～213の膜貫通ドメイン;アミノ酸214～255の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_001552を参照されたい。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長い4-1BBの配列をCARに含めることができることが理解される。「4-1BB核酸分子」は、4-1BBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000013
(OX40)
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4前駆体又はCD134とも呼ばれるOX40は、TNFRスーパーファミリーの受容体のメンバーである。一実施態様において、CARは、OX40に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。OX40ポリペプチドは、以下に提供されるGenBank番号P43489もしくはNP_003318(GI:4507579)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。一実施態様において、CARは、アミノ酸236～277に対応するOX40の細胞内ドメインを含む共刺激ドメイン、又はその断片を有することができる。別の実施態様において、CARは、OX40のアミノ酸215～235に対応するOX40の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。OX40内のドメイン、例えば、アミノ酸1～28のシグナルペプチド;アミノ酸29～214の細胞外ドメイン;アミノ酸215～235の膜貫通ドメイン;アミノ酸236～277の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_003318を参照されたい。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いOX40の配列をCARに含めることができることが理解される。「OX40核酸分子」は、OX40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000014
(ICOS)
CD278とも呼ばれる誘導性T細胞共刺激因子前駆体(ICOS)は、活性化されたT細胞上で発現されるCD28スーパーファミリー共刺激分子である。一実施態様において、CARは、ICOSに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。ICOSポリペプチドは、以下に提供されるGenBank番号NP_036224(GI:15029518)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。一実施態様において、CARは、ICOSのアミノ酸162～199に対応するICOSの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインを有することができる。別の実施態様において、CARは、ICOSのアミノ酸141～161に対応するICOSの膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。ICOS内のドメイン、例えば、アミノ酸1～20のシグナルペプチド;アミノ酸21～140の細胞外ドメイン;アミノ酸141～161の膜貫通ドメイン;アミノ酸162～199の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_036224を参照されたい。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いICOSの配列をCARに含めることができることが理解される。「ICOS核酸分子」は、ICOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000015
(DAP10)
造血細胞シグナル伝達因子とも呼ばれるDAP10は、造血細胞における大きな受容体ファミリーと関連するシグナル伝達サブユニットである。一実施態様において、CARは、DAP10に由来する共刺激ドメインを含むことができる。DAP10ポリペプチドは、以下に提供されるGenBank番号NP_055081.1(GI:15826850)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。一実施態様において、CARは、アミノ酸70～93に対応するDAP10の細胞内ドメインを含む共刺激ドメイン、又はその断片を有することができる。別の実施態様において、CARは、アミノ酸49～69に対応するDAP10の膜貫通ドメイン、又はその断片を有することができる。DAP10内のドメイン、例えば、アミノ酸1～19のシグナルペプチド;アミノ酸20～48の細胞外ドメイン;アミノ酸49～69の膜貫通ドメイン;アミノ酸70～93の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_055081.1を参照されたい。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いDAP10の配列をCARに含めることができることが理解される。「DAP10核酸分子」はDAP10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000016
CARの細胞外ドメインは、新生タンパク質を小胞体に向け、その後の細胞表面への移行を導くリーダー又はシグナルペプチドに融合することができる。ひとたびシグナルペプチドを含有するポリペプチドが細胞表面で発現されると、シグナルペプチドは、通常、小胞体内でのポリペプチドのプロセシング及び細胞表面への移行の間にタンパク質分解によって除去されてしまうと理解されている。したがって、CARなどのポリペプチドは、通常、シグナルペプチドを欠く成熟タンパク質として細胞表面で発現されるのに対し、該ポリペプチドの前駆体形態はシグナルペプチドを含む。CARが細胞膜でグリコシル化及び/又はアンカリングされることになっている場合、シグナルペプチド又はリーダーは必須であり得る。シグナル配列又はリーダーは、分泌経路へのその進入を導く、新たに合成されたタンパク質のN-末端に通常存在するペプチド配列である。シグナルペプチドは、融合タンパク質として、CARの細胞外抗原結合ドメインのN-末端に共有結合的に接続される。当技術分野で周知である、任意の好適なシグナルペプチドをCARに適用して、T細胞における細胞表面発現をもたらすことができる(Gierasch Biochem. 28:923-930(1989); von Heijneの文献、J. Mol. Biol. 184(1):99-105(1985)を参照)。特に有用なシグナルペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドのシグナルペプチドのいずれかを含め、そのT細胞で天然に発現される細胞表面タンパク質に由来することができる。したがって、任意の好適なシグナルペプチドを利用して、発現されることになるCARをT細胞の細胞表面に向けることができる。
特定の非限定的な実施態様において、CARの細胞外抗原結合ドメインは、該細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域を接続するリンカー配列又はペプチドリンカーを含むことができる。特定の非限定的な実施態様において、CARは、CARのドメインを互いに繋ぐスペーサー領域又は配列を含むこともできる。例えば、スペーサーを、シグナルペプチドと抗原結合ドメインの間、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間、膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間、及び/又は細胞内ドメイン内のドメインの間、例えば、刺激ドメインと共刺激ドメインの間に含めることができる。スペーサー領域は、様々なドメインと他のポリペプチドとの相互作用を可能にするのに、例えば、抗原結合ドメインが抗原認識を容易にするような向きで柔軟性を有するのを可能にするのに十分に柔軟であることができる。スペーサー領域は、例えば、IgG由来のヒンジ領域、免疫グロブリンのCH2CH3(定常)領域、及び/もしくはCD3(分化抗原群3)の部分、又はスペーサーとして好適ないくつかの他の配列であることができる。
CARの膜貫通ドメインは、通常、膜の少なくとも一部にまたがる疎水性αヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体はクラスター化し、シグナルは細胞に伝達される。一実施態様において、CARの膜貫通ドメインは、T細胞で天然に発現される別のポリペプチドに由来することができる。一実施態様において、CARは、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、又は膜貫通ドメインを有する、T細胞で発現される他のポリペプチド、例えば、本明細書に開示されるかもしくは当技術分野で周知である他のポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを有することができる。任意に、膜貫通ドメインは、該膜貫通ドメインがCARに結合した抗原からのシグナルを細胞内シグナル伝達及び/又は共刺激ドメインに伝達する際に機能することができる限り、T細胞で天然に発現されないポリペプチドに由来することができる。望ましい場合、ポリペプチドの膜貫通ドメインを含むポリペプチドの部分は、該ポリペプチド由来のさらなる配列、例えば、膜貫通ドメインのN-末端もしくはC-末端、又は該ポリペプチドの他の領域に隣接したさらなる配列を含むことができることが理解される。
(CD8)
分化抗原群8(CD8)は、T細胞受容体(TCR)の共受容体としての役割を果たす膜貫通糖タンパク質である。CD8は主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合し、クラスI MHCタンパク質に特異的である。一実施態様において、CARは、CD8に由来する膜貫通ドメインを含むことができる。CD8ポリペプチドは、以下に提供されるGenBank番号NP_001139345.1(GI:225007536)を有する配列に対応するアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。一実施態様において、CARは、アミノ酸183～203に対応するCD8の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。CD8内のドメイン、例えば、アミノ酸1～21のシグナルペプチド;アミノ酸22～182の細胞外ドメイン;アミノ酸183～203の膜貫通ドメイン;アミノ酸204～235の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_001139345.1を参照されたい。望ましい場合、アミノ酸183～203の膜貫通ドメインを超える追加のCD8の配列をCARに含めることができることが理解される。範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いCD8の配列をCARに含めることができることがさらに理解される。「CD8核酸分子」はCD8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000017
(CD4)
T細胞表面糖タンパク質CD4とも呼ばれる分化抗原群4(CD4)は、Tヘルパー細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質である。一実施態様において、CARは、CD4に由来する膜貫通ドメインを含むことができる。CD4は、様々なアイソフォームで存在する。所望の機能を達成するように任意のアイソフォームを選択することができることが理解される。例示的なアイソフォームとしては、include アイソフォーム1(NP_000607.1、GI:10835167)、アイソフォーム2(NP_001181943.1、GI:303522479)、アイソフォーム3(NP_001181944.1、GI:303522485;又はNP_001181945.1、GI:303522491;又はNP_001181946.1、GI:303522569)などが挙げられる。1つの例示的なアイソフォーム配列であるアイソフォーム1が以下に提供されている。一実施態様において、CARは、アミノ酸397～418に対応するCD4の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列、又はその断片を有することができる。CD4内のドメイン、例えば、アミノ酸1～25のシグナルペプチド;アミノ酸26～396の細胞外ドメイン;アミノ酸397～418の膜貫通ドメイン;アミノ酸419～458の細胞内ドメインに対する参照については、GenBank NP_000607.1を参照されたい。望ましい場合、アミノ酸397～418の膜貫通ドメインを超える追加のCD4の配列をCARに含めることができることが理解される。望ましい場合、範囲が定められた特定のドメインよりも短い又は長いCD4の配列をCARに含めることができることがさらに理解される。「CD4核酸分子」は、CD4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
Figure 0007058223000018
本明細書に記載されるポリペプチドのドメインを、望ましい機能、例えば、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/又は共刺激ドメインを提供するのに有用なものとして、癌抗原CARにおいて使用することができることが理解される。例えば、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、又は他のドメインなどのドメインを望み通りに選択して、本発明のCARに特定の機能を提供することができる。考え得る望ましい機能としては、シグナルペプチド及び/又は膜貫通ドメインの提供を挙げることができるが、これらに限定されない。
(キメラ共刺激受容体(CCR))
キメラ共刺激性受容体(CCR)は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。キメラ共刺激受容体(CCR)は、CARと同様に、抗原結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である(Sadelainらの文献、Cancer Discov. 3(4):388-398(2013))。CCRは、T細胞活性化ドメインを有さないが、共刺激ドメイン、例えば、CARについて上で記載されている共刺激ドメイン、例えば、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD70などのうちの1つを有する。CCRをT細胞受容体又はCARとともに用いて、二重抗原発現T細胞に対するT細胞反応性を増強することができる(Sadelainらの文献、上記、2013)。CCRを用いて、選択的腫瘍標的化を増強することもできる(Sadelainらの文献、上記、2013)。CCRは、その結合パートナー、すなわち、標的抗原に結合したときに、(CCRの共刺激ドメインに応じて)4-1BB、OX40、ICOS、又はCD70の効果を模倣する抗原特異的共刺激受容体である。
治療的トランスジーンによってコードされることができる産物として有用な例示的な共刺激リガンド(CL)としては、共刺激性リガンドの4-1BBL; OX40L; ICOSL; CD70などが挙げられるが、これらに限定されない。治療的トランスジーンによってコードされることができる例示的なキメラ共刺激受容体(CCR)としては、標的抗原に結合したときに、4-1BB、OX40、ICOS、又はCD70の効果を模倣する抗原特異的共刺激受容体が挙げられるが、これに限定されない。
(サイトカイン)
サイトカインは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。治療的トランスジーンによってコードされる場合に特に有用であるサイトカインとしては、本発明のT細胞の活性化を刺激又は持続するものが挙げられる。免疫応答を刺激するための治療的トランスジーンによってコードされる産物として有用な例示的なサイトカインとしては、IL2、IL12、IL15、IL18などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答を抑制するための治療的トランスジーンによってコードされる産物として有用な例示的なサイトカインとしては、TGFβ、IL10などが挙げられるが、これらに限定されない。
(ドミナントネガティブ体)
ドミナントネガティブ体は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。治療的トランスジーンによってコードされる場合に特に有用であるドミナントネガティブ体としては、本発明のT細胞の活性化を刺激又は持続するものが挙げられる。例示的なドミナントネガティブ体としては、抑制性キメラ抗原受容体(iCAR)、分泌可能な可溶性サイトカイン受容体(例えば、TGFβ、IL10の場合)、分泌可能な可溶性T細胞抑制性受容体(例えば、PD1、CTLA4、LAG3、又はTIM-3に由来するもの)などが挙げられるが、これらに限定されない。抑制性キメラ抗原受容体は、細胞外scFVドメイン(標的細胞で細胞表面分子に結合する)が抑制性T細胞受容体(例えば、PD1、CTL4)に由来する細胞内シグナル伝達ドメインに融合したものから構成される細胞表面受容体である。改変されたT細胞は、標的細胞と相互作用すると阻害される。
(微小環境モジュレーター)
微小環境モジュレーターは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。微小環境モジュレーターは、治療的な改変されたT細胞の近くの細胞の活性を調節する分子を指す。治療的トランスジーンによってコードされる場合に特に有用である微小環境モジュレーターとしては、本発明のT細胞の活性化を刺激又は持続するものが挙げられる。例示的な微小環境モジュレーターとしては、ヘパラナーゼ、TNFRSF14とも呼ばれるヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)などが挙げられるが、これらに限定されない。
(抗体)
抗体は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。例示的な抗体としては、T細胞抑制性リガンド、例えば、PD1L、CD80、CD86、ガレクチン-9、Fasリガンドなどに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体は、免疫グロブリン、例えば、IgGとして、又は二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化抗体(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、ナノボディ、二重親和性抗体などとして発現させることができる(例えば、Harlow及びLaneの文献、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Chamesらの文献、Br. J. Pharmacol. 157:220-233(2009); Raderの文献、Blood, 117:4403-4404(2011)を参照)。
(バイオセンサー)
バイオセンサーは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。バイオセンサーは、リガンド結合時に、細胞にシグナルを伝達して、特定の効果を生じさせる生体分子(タンパク質、DNA、又はRNA)である。バイオセンサーは、例えば、タンパク質、DNA、RNA、マイクロRNA、代謝物質、イオンなどのバイオセンサーであることができる。例示的なバイオセンサーとしては、DNA、RNA、毒素のバイオセンサーであるtoll様受容体(TLR)、及びイオンのバイオセンサー、例えば、カルシウム感知カルモジュリン(CaM)-カルモジュリン結合ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。特異的TLRの発現は、改変されたT細胞が細胞質中の標的分子(例えば、RNA、毒素)の存在に応答し、それにより、細胞が治療的分子の発現を活性化するのに使用することができる所定のシグナルを誘発するのを可能にする。同様の戦略は、CaM-カルモジュリン結合タンパク質(細胞内カルシウムを感知する)に適用される。これらのバイオセンサーは、治療的分子の産生時に中間体として作用することができ、それらは、そのような効果を有することが要求されるときにのみ作用する。例えば、バイオセンサーを用いて、細胞の状態を感知し、その後、別のトランスジーンの発現を活性化することができる。特定の実施態様又は例において、特異的なHIV RNA配列を特異的に検出するバイオセンサーを使用することができる。結合すると、バイオセンサーは、キメラ転写リプレッサーの放出を引き起こす立体構造変化を受け、該キメラ転写リプレッサーは、その後、核に移行し、HIVゲノム転写を特異的に阻害する。
(キメラ受容体リガンド(CRL))
キメラ受容体リガンド(CRL)は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。CRLは、標的細胞受容体(例えば、サイトカイン受容体)によって認識される細胞表面リガンドであって、その特異的受容体と相互作用したとき、T細胞応答を誘発する、細胞表面リガンドである。CRLは、標的細胞でその特異的受容体と相互作用したときにT細胞応答を開始する細胞内ドメインを含有する。
(キメラ免疫受容体リガンド(CIRL))
キメラ免疫受容体(CIRL)は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。CIRLは、免疫細胞受容体(例えば、TCR又は免疫グロブリン)によって認識される細胞表面リガンドであって、その特異的受容体と相互作用したとき、T細胞応答を誘発する、細胞表面リガンドである。CIRLは、標的細胞でその特異的受容体と相互作用したときにT細胞応答を開始する細胞内ドメインを含有する。
(可溶性受容体)
可溶性受容体は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。そのような可溶性受容体は、細胞内のもの又は細胞外のものであることができる。例示的な可溶性受容体としては、IL4R、IL10R、PD1、CTL4、TIM-3、LAG3などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような可溶性受容体は、通常、免疫応答に対する刺激作用を有する。
(溶質輸送体)
溶質輸送体は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。例示的な溶質輸送体としては、Glut1又はGlut3などのグルコース輸送体が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクターT細胞は、エネルギーを生み出すのにグルコースの取込みの増加を必要とすることが知られている。T細胞が、(通常、数多くの)腫瘍細胞がグルコースを消費している競合的環境にある場合、グルコース輸送体を発現する改変されたT細胞は、グルコース輸送体の数の増加による恩恵を受けることができる。
(酵素)
酵素は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。例示的な治療的酵素としては、PKM2が挙げられるが、これに限定されない。ピルビン酸キナーゼ筋肉アイソザイム2(PKM2)は、解糖速度が速くかつ生合成前駆体の需要が高い、エフェクターT細胞などの分裂細胞で必要とされる酵素である。PKM2の過剰発現は、生合成前駆体が増加するのを助け、それにより、改変されたT細胞の増殖を向上させる。
(リボザイム)
リボザイムは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。治療的トランスジーンの産物である例示的なリボザイムとしては、それぞれ、病原体ゲノム又はウイルスゲノムを切断する病原体特異的又はウイルス特異的リボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性病原体の場合、リボザイムは、したがって、ウイルス侵入時のウイルスRNA逆転写とウイルス集合時のウイルスRNAゲノムパッケージングの両方を阻害することができる。標的化ウイルスゲノムを含む、様々な病原体に対するリボザイムは、治療的トランスジーンの産物として発現されることができることがすぐに分かる。具体的な実施態様において、該トランスジーンは、HIV RNAゲノムを切断するHIV特異的リボザイムをコードし、そのため、ウイルス侵入時のウイルスRNA逆転写とウイルス集合時のウイルスRNAゲノムパッケージングの両方を阻害する。
(遺伝子回路)
遺伝子回路は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。遺伝子回路は、機能的に関連がある遺伝子発現ユニットのセットである。
遺伝子回路の一実施態様は、細胞表面リガンド特異的合成転写因子(TF)を発現する構成的転写ユニットであり、このユニットでは、リガンド結合時に、TF部分が放出され、核に移行する。その後、TFは、第二の転写ユニット(定義により、誘導性である)中のその同族DNA配列に結合し、それにより、微小環境中に分泌されて、そのような抑制性リガンドを捕捉する抑制性リガンド特異的可溶性受容体の発現が活性化される。別の実施態様において、標的細胞認識時に、NFAT応答エレメントを介して、分泌性腫瘍サプレッサー(例えば、リンパ腫特異的soIHEVM)の発現を誘導するキメラ抗原受容体(CAR)を発現する構成的転写ユニット;そのような実施態様において、CARは、構成的な内在性プロモーターの制御下の第一のトランスジーンによってコードされ、このCARは、標的細胞認識時に、NFAT応答誘導性の内在性プロモーターの制御下のトランスジーンからの分泌性腫瘍サプレッサー(例えば、リンパ腫特異的soIHEVM)の発現を誘導する。特定の実施態様において、合成TFは、1つの転写ユニット(1つの場所で組み込まれた単一のトランスジーン)から発現され;可溶性受容体は、第二の転写ユニット(同じ又は異なる場所で組み込まれた単一のトランスジェニック発現カセット)から発現され、その発現は、TFがこの第二の転写ユニットに結合したときに起こる。
遺伝子回路の特定の実施態様において、CAR発現T細胞は、HIF1a依存性及びTALE-VP64依存性転写ユニットから構成される遺伝子回路を含有する。CAR T細胞が、酸素レベルが低い腫瘍微小環境にある場合、HIF1α転写因子がT細胞で活性化され、HIF1a依存性転写ユニットに結合し、キメラ転写因子TALE-VP64の発現を誘導し、その後、これがTALE-VP64依存性転写ユニットに結合し、微小環境中の抑制性分子、例えば、PD1L又はCD80を標的とする分泌性scFvの発現を刺激する。この第二の転写ユニットから、組換えHIF1aも発現され、これにより、第一の転写ユニットに対する正のフィードバックが生じる。前述の具体的な実施態様において、第一のトランスジーンの発現は、HIF1α転写因子によって誘導される内在性の誘導性プロモーターの制御下にあり、第二のトランスジーンの発現は、TALE-VP64によって誘導される内在性の誘導性プロモーターの制御下にあり、該第一のトランスジーンはTALE-VP64をコードし、第二のトランスジーンは分泌性scFvをコードする。任意に、第三のトランスジーン(この第三のトランスジーンはHIF1aをコードする)の発現は、同じくTALE-VP64によって誘導される異なる内在性の誘導性プロモーターの制御下にある。一実施態様において、転写因子は、1つ又は複数の遺伝子産物の発現を駆動することができ、後者は、ポリシストロン性メッセージの場合に起こる。2シストロン性転写ユニットの例: TCRを会合するα及びβ鎖;縦一列になった2つのscFvなど。一実施態様において、単一のTALE-VP64応答性転写ユニットは、scFvとHIF1aの両方を含有し;これは2シストロン性コンストラクトであり: 2つの遺伝子は単一のプロモーターから発現される。
別の特定の実施態様において、B細胞に結合したときに、NFAT部分が放出され、それが核に移行し、キメラ免疫受容体リガンドが発現される第二の転写ユニット中のその同族DNA配列に結合する細胞表面CD19特異的scFV-NFAT融合タンパク質を発現する構成的転写ユニット。この第二の遺伝子は、細胞外抗原(標的B細胞上の特異的免疫グロブリン受容体によって認識されるもの)と改変されたT細胞を活性化し、標的B細胞の死をもたらす細胞内シグナル伝達ドメインとから構成される融合タンパク質をコードする。したがって、この特定の実施態様において、第一のトランスジーンの発現は、内在性の構成的プロモーターの制御下にあり(この第一のトランスジーンは細胞表面CD19特異的scFv-NFAT融合タンパク質をコードする)、第二のトランスジーンの発現は、B細胞に対する細胞表面CD19特異的scFv-NFAT融合タンパク質の結合によって誘導される内在性の誘導性プロモーターの制御下にあり、該第二のトランスジーンは、(i)細胞外抗原(標的B細胞上の免疫グロブリン受容体によって認識されるもの)、及び(ii)改変されたT細胞を活性化し、標的B細胞の死(例えば、活性化T細胞の細胞溶解活性による)をもたらす少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質をコードする。
(エピジェネティックモディファイアー)
エピジェネティックモディファイアーは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。エピジェネティックモディファイアーは、特定のゲノム位置における、ヒストンタンパク質又はDNAのいずれかのクロマチンの特異的修飾を触媒するタンパク質/酵素である。これらの修飾は、活性化又は抑制のいずれかの遺伝子発現の特異的変化をもたらす。例示的なエピジェネティックモディファイアーとしては、標的遺伝子発現を活性化するp300アセチルトランスフェラーゼドメイン(ヒストンH3アセチラーゼ)に融合したプログラム可能なキメラ配列特異的DNA結合ドメイン;及び標的遺伝子発現を抑制するKRABリプレッサードメイン(ヘテロクロマチン形成複合体を動員するタンパク質)に融合したプログラム可能なキメラ配列特異的DNA結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
(転写アクチベーター又はリプレッサー)
転写アクチベーター又はリプレッサー(転写因子)は、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。転写アクチベーター又はリプレッサーは、天然に存在するものであるか又はキメラであることができる。場合により、ある遺伝子のアクチベーターが別の遺伝子のリプレッサーであることができ、又はある遺伝子のリプレッサーが別の遺伝子のアクチベーターであることができる。治療的トランスジーンによって発現されることができる例示的な転写因子としては、Foxp3、NFAT、HIF-1αなどが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なキメラ転写アクチベーターとしては、cDNA結合ドメイン(例えば、TAL、ジンクフィンガー、CRISPR/失活したCas9)及び1以上の遺伝子を特異的に活性化するように設計することができるトランス活性化ドメイン(例えば、VP16、VP64、p65、Rta、又はこれらの組合せ)から構成される融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、具体的な実施態様において、治療的トランスジーンは、DNA結合ドメイン及びトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質をコードする。
例示的なキメラ転写リプレッサーとしては、DNA結合ドメイン(例えば、TAL、ジンクフィンガー、CRISPR/失活したCas9)及び1以上の遺伝子を特異的に抑制するように設計することができるリプレッサードメイン(例えば、KRAB)から構成される融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、具体的な実施態様において、治療的トランスジーンは、DNA結合ドメイン及びリプレッサードメインを含む融合タンパク質をコードする。
(非コードRNA)
非コードRNAは、本発明の治療的トランスジーンによってコードされる例示的な産物である。例示的な非コードRNA(マイクロRNA又は低分子干渉RNA)としては、抑制性受容体遺伝子メッセンジャーRNA、例えば、PD1、TIM-3、LAG3、CTLA-4などを標的とするものが挙げられる。したがって、具体的な実施態様において、治療的トランスジーンは、非コードRNA、例えば、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、アンチセンスRNAなどをコードする。改変されたT細胞の活性の刺激が望ましい具体的な実施態様において、非コードRNAは、例えば、標的抑制性受容体遺伝子メッセンジャーRNA、例えば、PD1、TIM-3、LAG3、CTLA-4などを標的とすることができる。
免疫応答を刺激することが望ましい場合、治療的トランスジーンは、免疫応答を刺激する産物をコードするように選択されることが好ましい。免疫応答を刺激するそのような産物は、IL12、IL15、IL18、又はこれらの因子のいずれかに由来する機能ドメインであることができるが、これらに限定されない。免疫応答の抑制因子を阻害することが望ましい場合、治療的トランスジーンは、免疫応答の抑制因子を阻害する産物をコードするように選択されることが好ましい。免疫応答の抑制因子を阻害するそのような産物は、T細胞抑制性受容体(例えば、PD1、CTLA4、LAG3、又はTIM3)に結合するリガンド(例えば、PD1L、CD80、CD86、又はガレクチン-9); TGFβ、TNFα、IL1、IL4、IL6、又はIL10などの因子に結合し、それにより、これらの因子の細胞表面受容体の活性化を妨げる可溶性受容体; B又はT細胞上の特異的自己免疫免疫受容体に結合して、免疫寛容又は細胞死を誘導する抗原又は機能的誘導体などに特異的な抗体であることができるが、これらに限定されない。一実施態様において、例えば、PD1L、CD80、CD86、ガレクチン-9リガンドは、T細胞上の特異的受容体に結合することによってT細胞活性を阻害することが知られている。治療的抗体は、T細胞抑制性受容体ではなく－リガンドに結合し;該抗体は、リガンドとその対応するT細胞抑制性受容体の相互作用を遮断する。それゆえ、これらの抗体を分泌する改変されたT細胞は、これらのリガンドによって阻害されない。一実施態様において、例えば、TGFβは、同じくT細胞活性を阻害するサイトカインである。このサイトカインに特異的な治療的可溶性受容体は、T細胞上に発現される受容体に対するその結合を妨げることによってその活性を遮断する。それゆえ、TGFβ可溶性受容体を分泌する改変されたT細胞は、このサイトカインによって阻害されない。
別の実施態様において、T細胞は、レポーターを産生するトランスジーンを任意に発現することができる。レポーターは、T細胞で治療的トランスジーンと共発現させることができる本発明の例示的なトランスジーンである。そのようなトランスジーンの例は、必要な場合、治療的T細胞の検出と除去の両方を可能にする(すなわち、細胞自殺スイッチとして機能することができる)、切断型EGF受容体(EGFRt)である。このレポーターを認識し、インビボで抗体媒介性標的細胞死を誘発する特異的抗体(例えば、セツキシマブ)が存在する(米国特許第8,802,374号を参照)。したがって、具体的な実施態様において、(治療的トランスジーンの発現が内在性プロモーターの制御下にある)改変されたT細胞は、レポータートランスジーンをさらに含み、該レポータートランスジーンは、検出可能なマーカー(好ましくは、細胞表面)タンパク質をコードするトランスジーンであり、ここで、該レポータートランスジーンの発現は、T細胞の内在性プロモーター(例えば、本明細書に上で記載される内在性プロモーターのいずれか)の制御下にある。具体的な実施態様において、レポータートランスジーンは、IL4も膜結合型のIL4もコードしない。別の具体的な実施態様において、レポータートランスジーンは、細胞自殺スイッチをコードする。具体的な実施態様において、細胞自殺スイッチはEGFRtであり;そのような実施態様において、改変されたT細胞を治療目的で対象に投与した後、該対象に、EGFRtを認識し、望ましい場合、治療後にT細胞活性を停止するように、改変されたT細胞の細胞死を誘発する抗体を投与することができる。
(7.6.治療方法)
本発明は、対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象がそのような治療を必要としている、方法にも関する。T細胞療法が免疫応答を促進することになる(すなわち、免疫応答の刺激を必要としている対象を治療する)実施態様において、例として、治療されている対象は、癌又は感染性疾患を有し得、本発明の組換えT細胞の投与は、それぞれ、癌又は感染性疾患を治療することになる。T細胞は、癌もしくは感染性疾患と関連する標的抗原に対する(治療的トランスジーンによってコードされ得る)結合パートナー(例えば、CARもしくは抗体もしくは受容体)を組換え発現することにより、又は癌もしくは感染性疾患と関連する標的抗原に対して感作することにより、該癌又は感染性疾患に標的化することができる。感作されたT細胞を使用する具体的な実施態様において、該T細胞は、それぞれ、癌又は感染性疾患の抗原に対して感作される。好ましい実施態様において、本発明は、対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象がそのような療法を必要としている、方法にも関する。CAR療法が免疫応答を促進することになる実施態様において、例として、治療されている対象は、癌又は感染性疾患を有し得、本発明の組換えT細胞の投与は、癌又は感染性疾患を治療することになり、CARは、それぞれ、癌又は感染性疾患病原体の抗原に結合する。そのような実施態様において、該T細胞は、CD8+、CD4+、TSCM、TCM、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、Tfh(濾胞性ヘルパー)細胞、又は本明細書に開示される他のT細胞であることができる。
T細胞療法が免疫応答を抑制することになる(すなわち、免疫応答の抑制を必要としている対象を治療する)実施態様において、例として、治療されている対象は、自己免疫疾患を有し得るか又は移植片拒絶反応のリスクがあり、本発明の組換えT細胞の投与は、それぞれ、自己免疫疾患を治療することになるか又は移植寛容を促進することになる。T細胞療法が免疫応答を抑制することになる別の例として、治療されている対象は、移植片対宿主病のリスクがあり得るか又はそれを有し得、本発明の組換え(本明細書において「改変された」と互換的に使用される)T細胞の投与は、移植片対宿主病を予防し又は低下させることになる。T細胞は、自己免疫疾患(例えば、自己抗原)、移植、もしくは移植片と関連する標的抗原に対する(治療的トランスジーンによってコードされ得る)結合パートナー(例えば、CARもしくは抗体もしくは受容体)を組換え発現することにより、又は自己免疫疾患、移植、もしくは移植片と関連する標的抗原に対して感作することにより、自己免疫疾患、移植、又は移植片に標的化することができる。感作されたT細胞を使用する具体的な実施態様において、該T細胞は、それぞれ、自己免疫反応の部位の抗原又は移植細胞もしくは移植片(もしくはそれに由来する細胞)に対して感作される。そのような実施態様において、T細胞は、T制御性細胞(Treg)であることができる。CAR療法が免疫応答を抑制することになる好ましい実施態様において、例として、治療されている対象は、自己免疫疾患を有し得るか、又は移植片拒絶反応のリスクがあり、本発明の組換えT細胞の投与は、自己免疫疾患を治療することになるか、又は移植寛容を促進することになり、CARは、それぞれ、自己免疫反応の部位の抗原又は移植細胞に結合する。別の例として、治療されている対象は、移植片対宿主病(GVHD)を有し得るか、又はそのリスクがあり得、本発明の組換えT細胞の投与は、GVHDのリスクを治療又は予防又は軽減することになり、CARは、GVHDと関連する抗原に結合する。そのような実施態様において、該T細胞は、T制御性細胞(Treg)であることができる。そのような自己免疫障害としては、関節リウマチ、全身エリテマトーデス、セリアックスプルー病、悪性貧血、白斑、強皮症、乾癬、炎症性腸疾患、橋本病、アジソン病、グレーブス病、反応性関節炎、シェーグレン症候群、及び1型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。移植は、臓器又は組織移植、例えば、肺、腎臓、心臓、腸、肝臓、及び膵臓などの移植であることができる。GVHDの治療又は予防に続いて、対象の造血幹細胞移植を行うことができる。
一実施態様において、対象は癌を有する。そのような実施態様において、T細胞療法は、癌を標的とする。特定の実施態様において、T細胞はCARを発現する(したがって、治療的トランスジーンはCARをコードする)。好ましい実施態様において、CARは、癌抗原に結合する。癌抗原は、対象の癌を標的とするように選択される。
本発明は、トランスジーンを発現するT細胞の様々な使用方法に関する。具体的な実施態様において、該細胞は、トランスジーンを発現する細胞の集団として投与される。好ましい実施態様において、本発明は、CAR(ここで、トランスジーンはCARをコードする)を発現するT細胞の様々な使用方法に関する。具体的な実施態様において、該細胞は、CARを発現する細胞の集団として投与される。任意に、投与されることになる細胞は、本発明の細胞について純化又は濃縮することができる。
一実施態様において、本発明の方法を用いて、癌を治療する。一実施態様において、T細胞は、CARを発現する。したがって、トランスジーンは、CARをコードする。一実施態様において、CARは、癌抗原特異的CARである。
癌を治療する方法は、癌と関連する兆候又は症状を改善する任意の効果を含むことができることが理解される。そのような兆候又は症状としては、白血病細胞の数の低下、腫瘍の成長の阻害、腫瘍の成長速度の減速、腫瘍のサイズの低下、腫瘍の数の低下、腫瘍の消失を含む、腫瘍負荷の低下が挙げられるが、これらに限定されず、これらは全て、当技術分野で周知のルーチンの腫瘍イメージング技法を用いて測定することができる。癌と関連する他の兆候又は症状としては、疲労、疼痛、体重減少、及び様々な癌と関連する他の兆候又は症状が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の細胞の投与は、対象において、腫瘍細胞の数を低下させ、腫瘍サイズを低下させ、及び/又は腫瘍を根絶することができる。腫瘍は、血液癌又は固形腫瘍であることができる。本発明の方法は、癌を有する対象の生存の増大又は延長をもたらすこともできる。さらに、本発明の方法は、対象における免疫応答の増大、例えば、癌に対する免疫応答の増大をもたらすことができる。
本発明の方法において、T細胞は、T細胞療法を必要としている対象、例えば、治療、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫障害、移植片拒絶反応、及び本明細書に開示される同様の疾患の治療を必要としている対象に投与される。本発明の方法の好ましい実施態様において、T細胞は、CAR療法を必要としている対象、例えば、治療、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫障害、移植片拒絶反応、及び本明細書に開示される同様の疾患の治療を必要としている対象に投与される。該対象は、哺乳動物、特に、ヒトであることができる。好ましくは、該対象はヒトである。本発明の細胞を含む医薬組成物は、対象の状態を緩和する目的で、免疫応答を誘発するために対象に投与される。臨床的改善は、T細胞療法で治療されている障害、例えば、癌のリスクもしくは進行速度の減少又は病理学的結果の軽減を含む。好ましい実施態様において、臨床的改善は、CAR療法で治療されている障害、例えば、癌のリスクもしくは進行速度の減少又は病理学的結果の軽減を含む。
対象は、進行型の疾患を有し得、この場合、治療目的は、疾患進行の緩和もしくは反転、及び/又は副作用の改善を含むことができる。対象は、既に治療を受けている病歴を有し得、その場合、治療目的は、再発のリスクを減少又は遅延させることであり得る。癌治療の場合、不応性又は再発性悪性腫瘍は、本発明の細胞を用いて治療することができる。任意に、本発明の細胞を治療のために予防的に投与して、例えば、家族歴及び/又は遺伝子検査に基づいて、疾患又は疾病に罹りやすい素因を有することが疑われる対象における疾患又は疾病の発生を予防することができる。
本発明の細胞は、T細胞療法、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶反応などの治療を必要としている、対象、例えば、ヒト対象に投与される。好ましい実施態様において、本発明の細胞は、CAR療法、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶反応などの治療を必要としている、対象、例えば、ヒト対象に投与される。癌の場合、該癌は、固形腫瘍又は固形腫瘍を含まない血液癌を含むことができる。本発明の細胞を用いて治療されることになる癌は、免疫療法に通常応答する癌を含む。例示的なタイプの癌としては、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、脳脊髄腫瘍、胚細胞腫瘍、神経内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。癌は、固形腫瘍又は固形腫瘍を形成しない血液癌であることができる。固形腫瘍の場合、腫瘍は、原発性腫瘍又は転移性腫瘍であることができる。
本発明の方法を用いて治療することができる他の新生物又は癌の例としては、骨癌、腸癌、肝臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、メラノーマ(皮膚又は眼内悪性メラノーマ)、腎臓癌(例えば、明細胞癌)、咽喉癌、前立腺癌(例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌)、血液癌(例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫)、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、膀胱癌、脳腫瘍、胃癌、精巣癌、ファローピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、白血病(例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病、非ホジキン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、腎臓癌又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、T細胞リンパ腫、石綿によって誘発されるものを含む環境誘発癌、重鎖病、並びに固形腫瘍、例えば、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫、悪性胸膜疾患、中皮腫、肺癌(例えば、非小細胞肺癌)、膵癌、卵巣癌、乳癌(例えば、転移性乳癌、転移性トリプルネガティブ乳癌)、結腸癌、胸膜腫瘍、膠芽腫、食道癌、胃癌、並びに滑膜肉腫が挙げられる。固形腫瘍は、原発性腫瘍又は転移状態の腫瘍であることができる。
具体的な実施態様において、対象に投与されるトランスジーンを組換え発現する細胞は、対象においてヘルパーTリンパ球応答と細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の両方を発生させる目的で、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を含む。CARがトランスジーンによってコードされる好ましい実施態様において、対象に投与されるCARを組換え発現する細胞は、対象においてヘルパーTリンパ球応答と細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の両方を発生させる目的で、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を含む。
一実施態様において、本発明は、それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、免疫抑制性細胞である本発明のT細胞を投与することを含む、方法である。一実施態様において、対象は、自己免疫疾患を有する。特定の実施態様において、T細胞が(トランスジーンによってコードされる)CARを発現する場合、該CARは、自己免疫障害の自己免疫抗原に結合する。自己免疫障害としては、関節リウマチ、全身エリテマトーデス、セリアックスプルー病、悪性貧血、白斑、強皮症、乾癬、炎症性腸疾患、橋本病、アジソン病、グレーブス病、反応性関節炎、シェーグレン症候群、及び1型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施態様において、免疫抑制性細胞による治療を必要としている対象は、臓器移植を受ける。そのような方法において、免疫抑制性である本発明のT細胞は、移植された臓器に対する免疫寛容を増強するために対象に投与される。特定の実施態様において、T細胞が(トランスジーンによってコードされる)CARを発現する場合、CARは、移植された臓器の抗原に結合する。移植は、肺、腎臓、心臓、腸、肝臓、及び膵臓などの移植であることができる。
別の実施態様において、免疫抑制性細胞による治療を必要としている対象は、例えば、該対象が造血幹細胞移植を受けた場合、GVHDの軽減又は予防を必要としている。そのような方法において、免疫抑制性である本発明のT細胞は、幹細胞移植又はそれにより得られる細胞による対象の抗原の免疫寛容を増強するために対象に投与される。特定の実施態様において、T細胞が(トランスジーンによってコードされるCAR)を発現する場合、CARは、移植された細胞の抗原に結合する。
治療のために、投与される量は、所望の効果を生じさせるのに有効な量である。有効量又は治療的有効量は、治療時に有益な又は所望の臨床的結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、単一の投与又は一連の投与(1以上の用量)で提供することができる。有効量は、急速静注で又は連続灌流によって提供することができる。治療に関して、有効量は、疾患の進行を緩和し、改善し、安定化し、反転させ、もしくは減速させるか、又は疾患の病理学的結果を別の形で軽減するのに十分である量である。有効量は、特定の対象について、医師により決定されることができる。いくつかの因子は、通常、有効量を達成するための適切な投薬量を決定する場合に検討される。これらの因子には、対象の年齢、性別、及び体重、治療されている状態、状態の重症度、並びに投与されている本発明の細胞の形態及び有効濃度が含まれる。
本発明の細胞は、通常、体重のキログラム当たりの細胞(細胞/kg)に基づく用量として投与される。通常、細胞用量は、投与の様式及び場所に応じて、体重のkg当たり約104～約1010細胞、例えば、約105～約109、約105～約108、約105～約107、又は約105～106の範囲である。一般に、全身投与の場合、本発明のT細胞が、局所、臓器、又は腫瘍に投与される局所投与よりも大きい量が使用される。例示的な用量範囲としては、1×104～1×108、2×104～1×108、3×104～1×108、4×104～1×108、5×104～1×108、6×104,～1×108、7×104～1×108、8×104～1×108、9×104～1×108、1×105～1×108、例えば、1×105～5×107、1×105～4×107、1×105～3×107、1×105～2×107、1×105～1×107、1×105～9×106、1×105～8×106、1×105～7×106、1×105～6×106、1×105～5×106、1×105～4×106、1×105～3×106、1×105～2×106、2×105～7×106、2×105～6×106、2×105～5×106、2×105～4×106、3×105～3×106などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような用量範囲は、局所投与に特に有用であることができる。特定の実施態様において、細胞は、局所投与、例えば、胸膜内投与のために、1×105～5×106、特に、1×105～3×106又は3×105～3×106細胞/kgの用量で提供される。例示的な用量範囲としては、5×105～1×108、例えば、6×105～1×108、7×105～1×108、8×105～1×108、9×105～1×108、1×106～1×108、1×106～9×107、1×106～8×107、1×106～7×107、1×106～6×107、1×106～5×107、1×106～4×107、1×106～3×107などを挙げることもできるが、これらに限定されない。そのような用量は、全身投与に特に有用であることができる。特定の実施態様において、細胞は、全身投与のために、1×106～3×107細胞/kgの用量で提供される。例示的な細胞用量としては、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109の用量、及び約104～約1010の範囲のその他の用量が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、該用量は、単一用量が投与されることになるかどうか、又は複数用量が投与されることになるかどうかを説明するように調整することもできる。有効用量とみなされるものの正確な決定は、上記のような、特定の対象のそのサイズ、年齢、性別、体重、及び状態を含む、各々の対象にとって個別の因子に基づくことができる。投薬量は、本明細書における開示及び当技術分野における知識に基づいて、当業者により容易に決定されることができる。
本発明の細胞は、限定されないが、胸膜投与、静脈内投与、皮下投与、節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、及び胸腺への直接投与を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって投与することができる。一実施態様において、本発明の細胞は、限定されないが、肝臓又は大動脈ポンプ;肢、肺、又は肝臓灌流;門脈内のもの;静脈分流によるもの;腔内のもの又は腫瘍の近くにある静脈内のものなどを含む、周知の方法を用いて、臓器、腫瘍、自己免疫疾患の部位、又は感染性疾患の部位に局所的に送達することができる。別の実施態様において、本発明の細胞は、全身投与することができる。さらに別の実施態様において、該細胞は、所望の療法の部位に、例えば、腫瘍の部位に局所投与される。腫瘍の場合、該細胞は、例えば、腫瘍の部位での及び/又は腫瘍血管系への該細胞の直接注射によって、腫瘍内投与することもできる。当業者は、治療されることになる標的組織もしくは標的領域の種類及び/又は標的組織もしくは標的領域の場所に基づいて好適な投与様式を選択することができる。該細胞は、注射又はカテーテルによって導入することができる。任意に、増殖及び/又は分化作用物質を、細胞の投与の前、その間、又はその後に、対象に投与して、本発明の細胞の産生をインビボで増大させることができる。
本発明の細胞の増殖は、通常、対象への投与の前にエクスビボで行われ、対象への投与後にはインビボで望ましいものであることができる(Kaiserらの文献、Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015)を参照)。細胞増殖は、例えば、T細胞を用いて、細胞の増殖及び持続性を可能にする細胞生存を伴うべきである。したがって、T細胞は、望み通りに、エクスビボ又はインビボで増殖させることができる。
本発明の方法は、本発明の細胞による治療の前、その間、又はその後のいずれかで組み合わせた、アジュバント療法をさらに含むことができる。したがって、本発明の細胞療法の方法を、本発明の細胞の投与に適合している他の標準治療及び/又は療法とともに使用することができる。
(7.7.医薬組成物)
本発明は、本発明の細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。該医薬組成物は、本発明の細胞の有効量及び医薬として許容し得る担体を含む。本発明の細胞及び該細胞を含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば、通常、細胞懸濁物を含む等張水溶液中に、又は任意に、選択されたpHに対して通常緩衝化されているエマルジョン、分散液などとして、好都合に提供することができる。該組成物は、細胞の完全性及び生存性に及び細胞組成物の投与に好適な担体、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水などを含むことができる。
滅菌注射溶液は、望ましい場合、好適な量の適切な溶媒中の本発明の細胞を様々な量の他の成分とともに組み入れることにより調製することができる。そのような組成物としては、細胞組成物とともに、及び対象、例えば、ヒトへの投与のために使用するのに好適である、医薬として許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤、例えば、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロースなどを挙げることができる。細胞組成物を提供するための好適な緩衝剤は、当技術分野で周知である。使用される任意のビヒクル、希釈剤、又は添加剤は、本発明の細胞の完全性及び生存性の維持に適合している。
組成物は、通常、等張である、すなわち、組成物は、血液及び涙液と同じ浸透圧を有する。本発明の細胞組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウム、或いは他の医薬として許容し得る薬剤、例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、又は他の無機もしくは有機溶質を用いて達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液に特に好ましい。1つの特に有用な緩衝液は、食塩水、例えば、生理食塩水である。当業者は、該組成物の成分が化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本発明の細胞の生存性又は有効性に影響を及ぼさず、かつ対象、例えば、ヒトへの投与に適合していることを認識しているであろう。当業者は、本発明の方法において投与されることになる組成物中の細胞、並びに任意の添加剤、ビヒクル、及び/又は担体の量を容易に決定することができる。
本発明の細胞は、任意の生理的に許容し得るビヒクル中で投与することができる。投与のための好適な用量は、本明細書に記載されている。本発明の細胞を含む細胞集団は、純化された細胞集団を含むことができる。当業者は、本明細書に記載される様々な周知の方法を用いて、細胞集団内の細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。本発明の遺伝子修飾細胞を含む細胞集団の純度の範囲は、約25％～約50％、約30％～約50％、約30％～約40％、約40％～50％、約50％～約55％、約55％～約60％、約65％～約70％、約70％～約75％、約75％～約80％、約80％～約85％;約85％～約90％、約90％～約95％、又は約95～約100％であることができる。そのような集団を、本明細書に開示されるように、本発明の方法で効率的に作製するか、又は本明細書に開示されるように、トランスジーンを発現する遺伝子修飾細胞について任意に濃縮することができることが理解される。トランスジーンがCARをコードする好ましい実施態様において、そのような集団を、本明細書に開示されるように、本発明の方法で効率的に作製するか、又は本明細書に開示されるように、CARを発現する遺伝子修飾細胞について任意に濃縮することができることが理解されることが理解される。投薬量は、当業者によって容易に調整されることができ;例えば、純度の減少は、投薬量の増加を必要とし得る。
本発明は、本発明の細胞の調製のためのキットも提供する。一実施態様において、該キットは、1以上の容器中に:トランスジーンの発現がT細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、そのゲノム内に組み込まれたトランスジーンを含有する遺伝子改変されたT細胞を作製するための1以上のベクターを含む。好ましい実施態様において、該トランスジーンはCARであり、特定の実施態様において、該キットは、CARを発現する遺伝子改変されたT細胞を作製するための1以上のベクターを含む。特定の実施態様において、該キットは、容器中に、本明細書に開示される組換え非組込み型γレトロウイルスを含む。該キットは、好ましくは、別々の容器中に、好適な相同組換えシステム、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを含有することもできる。該キットを用いて、遺伝子改変されたT細胞を、対象に由来する自己細胞から又は適合する対象に投与されることになる非自己細胞から作製することができる。別の実施態様において、該キットは、対象への自己又は非自己投与のための本発明の細胞を含むことができる。具体的な実施態様において、該キットは、本発明のT細胞を1以上の容器中に含む。
別の実施態様において、本発明は、本明細書に開示される組換え非組込み型γレトロウイルスを含むキットを提供する。具体的な実施態様において、該キットは、本発明の非組込み型γレトロウイルスを1以上の容器中に含む。
(7.8.レポータートランスジーンに関する代わりの実施態様)
本発明の代わりの具体的な実施態様において、T細胞は、そのゲノム中に(任意に、治療的トランスジーンの代わりに)レポータートランスジーンを組み込んでおり、ここで、該レポータートランスジーンの発現は、内在性プロモーターの制御下にあり、該内在性プロモーターは、本明細書に上で記載されるプロモーターのいずれかであることができる。レポータートランスジーンは、検出可能なマーカー(好ましくは、細胞表面)タンパク質をコードするトランスジーンである。具体的な実施態様において、レポータートランスジーンは、IL4も膜結合型のIL4もコードしない。別の具体的な実施態様において、レポータートランスジーンは、細胞自殺スイッチをコードする。具体的な実施態様において、細胞自殺スイッチは切断型EGF受容体(EGFRt)であり、これは、必要な場合、治療的T細胞の検出と除去の両方を可能にする。このレポーターを認識し、インビボで抗体媒介性標的細胞死を誘発する特異的抗体(例えば、セツキシマブ)が存在する(米国特許第8,802,374号を参照)。したがって、例えば、EGFRtをコードするトランスジーンは、内在性の構成的又は誘導性プロモーターの制御下にあることができ、改変されたT細胞を治療目的で対象に投与した後、該対象に、EGFRtを認識し、望ましい場合、治療後にT細胞活性を停止するように、改変されたT細胞の細胞死を誘発する抗体を投与することができる。
(7.9.例示的な実施態様)
本発明は、以下の例示的な実施態様を提供する。
実施態様1。T細胞であって、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、T細胞。
実施態様2。トランスジーンが治療的タンパク質をコードする、実施態様1のT細胞。
実施態様3。トランスジーンが治療的核酸をコードする、実施態様1のT細胞。
実施態様4。トランスジーンがゲノム内の単一の部位で組み込まれる、実施態様1～3のいずれか1つのT細胞。
実施態様5。トランスジーンが細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる、実施態様1～3のいずれか1つのT細胞。
実施態様6。第一の部位が内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子のエクソンである、実施態様1～5のいずれか1つのT細胞。
実施態様7。第一の部位が内在性遺伝子の第一のエクソン内にある、実施態様6のT細胞。
実施態様8。内在性プロモーターが構成的である、実施態様1～7のいずれか1つのT細胞。
実施態様9。プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される、実施態様8のT細胞。
実施態様10。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある、実施態様1～7のいずれか1つのT細胞。
実施態様11。内在性プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される、実施態様10のT細胞。
実施態様12。内在性プロモーターが誘導性である、実施態様1～7のいずれか1つのT細胞。
実施態様13。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様14。プロモーターが、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様15。プロモーターが、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様14のT細胞。
実施態様16。プロモーターが、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される、実施態様15のT細胞。
実施態様17。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様18。抑制性受容体が、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される、実施態様17のT細胞。
実施態様19。プロモーターが、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される、実施態様17のT細胞。
実施態様20。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様21。サイトカインが、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される、実施態様20のT細胞。
実施態様22。サイトカインが、インターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される、実施態様20のT細胞。
実施態様23。プロモーターが、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される、実施態様20のT細胞。
実施態様24。プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様25。核酸が、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される、実施態様24のT細胞。
実施態様26。プロモーターが、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される、実施態様25のT細胞。
実施態様27。プロモーターが細胞と代謝物質との接触によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様28。代謝物質が、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、実施態様27のT細胞。
実施態様29。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様30。プロモーターがPKM2プロモーターである、実施態様29のT細胞。
実施態様31。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される、実施態様12のT細胞。
実施態様32。イオンがカリウム又はカルシウムである、実施態様31のT細胞。
実施態様33。プロモーターが、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される、実施態様31のT細胞。
実施態様34。トランスジーンが、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする、実施態様1～33のいずれか1つのT細胞。
実施態様35。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫刺激性である、実施態様34のT細胞。
実施態様36。サイトカインが免疫刺激性であり、該サイトカインが、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される、実施態様35のT細胞。
実施態様37。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫抑制性である、実施態様34のT細胞。
実施態様38。サイトカインが免疫抑制性であり、該サイトカインがTGFβ及びIL10からなる群から選択される、実施態様37のT細胞。
実施態様39。トランスジーンが抗体をコードし、任意に、該抗体が、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される、実施態様34のT細胞。
実施態様40。トランスジーンがCARをコードする、実施態様34のT細胞。
実施態様41。CARが癌抗原に結合する、実施態様40のT細胞。
実施態様42。T細胞が標的抗原に対して感作される、実施態様1～39のいずれか1つのT細胞。
実施態様43。レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)がT細胞のゲノム内に組み込まれる、実施態様1～42のいずれか1つのT細胞。
実施態様44。ヒトに由来する、実施態様1～43のいずれか1つのT細胞。
実施態様45。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様44のT細胞。
実施態様46。トランスジーンが、標的化相同組換えによって、第一の部位に組み込まれる、実施態様1～45のいずれか1つのT細胞。
実施態様47。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される、実施態様46のT細胞。
実施態様48。トランスジーンが、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、実施態様1～47のいずれか1つのT細胞。
実施態様49。T細胞であって、第一のトランスジーンの発現が該T細胞の第一の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第一のトランスジーンが細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンの発現が第二の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第二のトランスジーンが細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、ここで、該第一及び第二の内在性プロモーターが異なるプロモーターであり、該第一のトランスジーンが第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸をコードし、該第二のトランスジーンが第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸をコードし、好ましくは、ここで、該第一の治療的タンパク質又は該第一の治療的核酸が、それぞれ、該第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸と異なっている、T細胞。
実施態様50。第一のトランスジーンが第一の治療的タンパク質をコードする、実施態様49のT細胞。
実施態様51。第一のトランスジーンが第一の治療的核酸をコードする、実施態様49のT細胞。
実施態様52。第二のトランスジーンが第二の治療的タンパク質をコードする、実施態様49のT細胞。
実施態様53。第二のトランスジーンが第二の治療的核酸をコードする、をコードする、実施態様49のT細胞。
実施態様54。第一の内在性プロモーターが構成的であり、第二の内在性プロモーターが誘導性である、実施態様49～53のいずれか1つのT細胞。
実施態様55。構成的プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される、実施態様54のT細胞。
実施態様56。第一の内在性プロモーター及び/又は第二の内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある、実施態様54のT細胞。
実施態様57。第一の内在性プロモーター及び/又は第二の内在性プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から独立に選択される、実施態様56のT細胞。
実施態様58。誘導性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様59。誘導性プロモーターが、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、及び4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様60。誘導性プロモーターが、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様59のT細胞。
実施態様61。誘導性プロモーターが、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される、実施態様60のT細胞。
実施態様62。誘導性プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様63。抑制性受容体が、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される、実施態様62のT細胞。
実施態様64。誘導性プロモーターがCPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される、実施態様62のT細胞。
実施態様65。誘導性プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様66。サイトカインが、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される、実施態様65のT細胞。
実施態様67。サイトカインがインターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される、実施態様65のT細胞。
実施態様68。誘導性プロモーターが、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される、実施態様65のT細胞。
実施態様69。誘導性プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様70。核酸が、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される、実施態様69のT細胞。
実施態様71。誘導性プロモーターが、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される、実施態様70のT細胞。
実施態様72。誘導性プロモーターが細胞と代謝物質との接触によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様73。代謝物質が、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、実施態様72のT細胞。
実施態様74。誘導性プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様75。誘導性プロモーターがPKM2プロモーターである、実施態様74のT細胞。
実施態様76。誘導性プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様77。イオンがカリウム又はカルシウムである、実施態様76のT細胞。
実施態様78。誘導性プロモーターが、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される、実施態様76のT細胞。
実施態様79。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンが各々、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から独立に選択される分子をコードする、実施態様49～78のいずれか1つのT細胞。
実施態様80。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンがサイトカインをコードし、好ましくは、ここで、該サイトカインが免疫刺激性である、実施態様79のT細胞。
実施態様81。サイトカインが免疫刺激性であり、かつIL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される、実施態様80のT細胞。
実施態様82。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンがサイトカインをコードし、好ましくは、ここで、該サイトカインが免疫抑制性である、実施態様79のT細胞。
実施態様83。サイトカインが免疫抑制性であり、かつTGFβ及びIL10からなる群から選択される、実施態様82のT細胞。
実施態様84。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンが抗体をコードし、該抗体が、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディである、実施態様79のT細胞。
実施態様85。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンがCARをコードする、実施態様79のT細胞。
実施態様86。CARが癌抗原に結合する、実施態様85のT細胞。
実施態様87。T細胞が標的抗原に対して感作される、実施態様49～84のいずれか1つのT細胞。
実施態様88。レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)がT細胞のゲノム内に組み込まれる、実施態様49～87のいずれか1つのT細胞。
実施態様89。ヒトに由来する、実施態様49～88のいずれか1つのT細胞。
実施態様90。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様89のT細胞。
実施態様91。第一のトランスジーン及び/又は第二のトランスジーンが標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる、実施態様49～90のいずれか1つのT細胞。
実施態様92。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される、実施態様91のT細胞。
実施態様93。第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸が、それぞれ、該第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸と異なっている、実施態様49～92のいずれか1つのT細胞。
実施態様94。第二の内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様54のT細胞。
実施態様95。第一のトランスジーンがCARをコードする、実施態様54のT細胞。
実施態様96。第一の内在性プロモーターがT細胞受容体プロモーターである、実施態様95のT細胞。
実施態様97。プロモーターが、T細胞受容体α鎖プロモーター、T細胞受容体β鎖プロモーター、CD3γ鎖プロモーター、CD3δ鎖プロモーター、CD3ε鎖プロモーター、及びCD3ζ鎖プロモーターからなる群から選択される、実施態様96のT細胞。
実施態様98。プロモーターがT細胞受容体α鎖プロモーターである、実施態様97のT細胞。
実施態様99。T細胞が免疫刺激性T細胞である、実施態様1～36、39～81、又は84～98のいずれか1つのT細胞(上記の実施態様が直接的又は間接的に実施態様37～38に依存する場合を除く)。
実施態様100。T細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、及びTfh(濾胞性ヘルパー)細胞からなる群から選択される、実施態様99のT細胞。
実施態様101。T細胞がCD4+である、実施態様100のT細胞。
実施態様102。T細胞がCD8+である、実施態様100のT細胞。
実施態様103。T細胞が免疫抑制性T細胞である、実施態様1～34、37～79、又は82～98のいずれか1つのT細胞(上記実施態様が直接的又は間接的に実施態様35～36に依存する場合を除く)。
実施態様104。T細胞が制御性T細胞である、実施態様103のT細胞。
実施態様105。複数の実施態様1～98のいずれか1つのT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
実施態様106。複数の実施態様99～102のいずれか1つのT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
実施態様107。複数の実施態様103又は104のT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
実施態様108。実施態様1～98のいずれか1つのT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様109。複数の実施態様1～98のいずれか1つのT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様110。実施態様99～102のいずれか1つのT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様111。複数の実施態様99～102のいずれか1つのT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様112。実施態様103又は104のT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様113。複数の実施態様103又は104のT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様114。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様1～98のいずれか1つのT細胞の治療的有効量を投与することを含む、方法。
実施態様115。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様105のT細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、方法。
実施態様116。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様108又は109の医薬組成物を投与することを含む、方法。
実施態様117。対象がヒトであり、細胞がヒトに由来する、実施態様114～116のいずれか1つの方法。
実施態様118。T細胞が対象にとって自己である、実施態様114～117のいずれか1つの方法。
実施態様119。T細胞が対象にとって非自己である、実施態様114～117のいずれか1つの方法。
実施態様120。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、該対象にT細胞の治療的有効量を投与することを含み、ここで、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、方法。
実施態様121。細胞又は細胞集団が医薬組成物として対象に投与される、実施態様116の方法。
実施態様122。トランスジーンが治療的タンパク質をコードする、実施態様120の方法。
実施態様123。トランスジーンが治療的核酸をコードする、実施態様120の方法。
実施態様124。トランスジーンがゲノム内の単一の部位で組み込まれる、実施態様116～123のいずれか1つの方法。
実施態様125。トランスジーンが細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる、実施態様116～123のいずれか1つの方法。
実施態様126。第一の部位が内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子のエクソンである、実施態様116～125のいずれか1つの方法。
実施態様127。第一の部位が内在性遺伝子の第一のエクソン内にある、実施態様126の方法。
実施態様128。内在性プロモーターが構成的である、実施態様116～127のいずれか1つの方法。
実施態様129。プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される、実施態様128の方法。
実施態様130。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある、実施態様116～127のいずれか1つの方法。
実施態様131。内在性プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される、実施態様130の方法。
実施態様132。内在性プロモーターが誘導性である、実施態様116～127のいずれか1つの方法。
実施態様133。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様134。プロモーターが、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様135。プロモーターが、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様134の方法。
実施態様136。プロモーターが、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される、実施態様135の方法。
実施態様137。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様138。抑制性受容体が、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される、実施態様137の方法。
実施態様139。プロモーターがCPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される、実施態様137の方法。
実施態様140。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様141。サイトカインが、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される、実施態様140の方法。
実施態様142。プロモーターが、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される、実施態様140の方法。
実施態様143。プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様144。核酸が、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される、実施態様143の方法。
実施態様145。プロモーターが、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される、実施態様144の方法。
実施態様146。プロモーターが細胞と代謝物質との接触によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様147。代謝物質が、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、実施態様146の方法。
実施態様148。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様149。プロモーターがPKM2プロモーターである、実施態様148の方法。
実施態様150。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される、実施態様132の方法。
実施態様151。イオンがカリウム又はカルシウムである、実施態様150の方法。
実施態様152。プロモーターが、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される、実施態様150の方法。
実施態様153。トランスジーンが、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする、実施態様120～152のいずれか1つの方法。
実施態様154。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫刺激性である、実施態様153の方法。
実施態様155。サイトカインが免疫刺激性であり、該サイトカインが、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される、実施態様154の方法。
実施態様156。トランスジーンが抗体をコードし、任意に、該抗体が、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される、実施態様153の方法。
実施態様157。トランスジーンがCARをコードする、実施態様153の方法。
実施態様158。CARが癌抗原に結合する、実施態様157の方法。
実施態様159。T細胞が標的抗原に対して感作される、実施態様120～156のいずれか1つの方法。
実施態様160。レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)がT細胞のゲノム内に組み込まれる、実施態様120～159のいずれか1つの方法。
実施態様161。ヒトに由来する、実施態様120～160のいずれか1つの方法。
実施態様162。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様161の方法。
実施態様163。トランスジーンが標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる、実施態様120～162のいずれか1つの方法。
実施態様164。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される、実施態様163の方法。
実施態様165。トランスジーンが、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、実施態様120～164のいずれか1つのT細胞。
実施態様166。T細胞が免疫刺激性T細胞である、実施態様120～165のいずれか1つのT細胞。
実施態様167。T細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、及びTfh(濾胞性ヘルパー)細胞からなる群から選択される、実施態様166のT細胞。
実施態様168。T細胞がCD4+である、実施態様167のT細胞。
実施態様169。T細胞がCD8+である、実施態様167のT細胞。
実施態様170。対象が癌を有する、実施態様120～169のいずれか1つの方法。
実施態様171。癌が白血病である、実施態様170の方法。
実施態様172。対象が腫瘍を有する、実施態様120～170のいずれか1つの方法。
実施態様173。対象がヒトであり、細胞がヒトに由来する、実施態様120～172のいずれか1つの方法。
実施態様174。細胞が対象にとって自己である、実施態様120～173のいずれか1つの方法。
実施態様175。細胞が対象にとって非自己である、実施態様120～173のいずれか1つの方法。
実施態様176。それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、該対象に、細胞又は細胞集団の治療的有効量を投与することを含み、ここで、該細胞がT細胞であり、ここで、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、方法。
実施態様177。細胞又は細胞集団が医薬組成物として投与される、実施態様176の方法。
実施態様178。トランスジーンが治療的タンパク質をコードする、実施態様176の方法。
実施態様179。トランスジーンが治療的核酸をコードする、実施態様176の方法。
実施態様180。トランスジーンがゲノム内の単一の部位で組み込まれる、実施態様176～179のいずれか1つの方法。
実施態様181。トランスジーンが細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる、実施態様176～179のいずれか1つの方法。
実施態様182。第一の部位が内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子のエクソンである、実施態様176～181のいずれか1つの方法。
実施態様183。第一の部位が内在性遺伝子の第一のエクソン内にある、実施態様182の方法。
実施態様184。内在性プロモーターが構成的である、実施態様176～183のいずれか1つの方法。
実施態様185。プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される、実施態様184の方法。
実施態様186。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある、実施態様176～183のいずれか1つの方法。
実施態様187。内在性プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される、実施態様186の方法。
実施態様188。内在性プロモーターが誘導性である、実施態様176～183のいずれか1つの方法。
実施態様189。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様190。プロモーターが、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、又は4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様191。プロモーターが、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様190の方法。
実施態様192。プロモーターが、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される、実施態様191の方法。
実施態様193。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様194。抑制性受容体が、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される、実施態様193の方法。
実施態様195。プロモーターが、CPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される、実施態様193の方法。
実施態様196。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様197。サイトカインがインターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される、実施態様196の方法。
実施態様198。プロモーターが、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される、実施態様196の方法。
実施態様199。プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様200。核酸が、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される、実施態様199の方法。
実施態様201。プロモーターが、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される、実施態様200の方法。
実施態様202。プロモーターが細胞と代謝物質との接触によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様203。代謝物質が、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、実施態様202の方法。
実施態様204。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様205。プロモーターがPKM2プロモーターである、実施態様204の方法。
実施態様206。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される、実施態様188の方法。
実施態様207。イオンがカリウム又はカルシウムである、実施態様206の方法。
実施態様208。プロモーターが、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される、実施態様206の方法。
実施態様209。トランスジーンが、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする、実施態様176～208のいずれか1つの方法。
実施態様210。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫抑制性である、実施態様209の方法。
実施態様211。サイトカインが免疫抑制性であり、該サイトカインがTGFβ及びIL10からなる群から選択される、実施態様210の方法。
実施態様212。トランスジーンが抗体をコードし、任意に、該抗体が、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される、実施態様209の方法。
実施態様213。トランスジーンがCARをコードする、実施態様209の方法。
実施態様214。CARが癌抗原に結合する、実施態様213の方法。
実施態様215。T細胞が標的抗原に対して感作される、実施態様176～212のいずれか1つの方法。
実施態様216。レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)がT細胞のゲノム内に組み込まれる、実施態様176～215のいずれか1つの方法。
実施態様217。ヒトに由来する、実施態様176～216のいずれか1つの方法。
実施態様218。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様217の方法。
実施態様219。トランスジーンが標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる、実施態様176～218のいずれか1つの方法。
実施態様220。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される、実施態様219の方法。
実施態様221。トランスジーンが、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、実施態様176～220のいずれか1つの方法。
実施態様222。T細胞が免疫抑制性T細胞である、実施態様176～221のいずれか1つの方法。
実施態様223。T細胞が制御性T細胞である、実施態様222の方法。
実施態様224。対象がヒトであり、細胞がヒトに由来する、実施態様176～223のいずれか1つの方法。
実施態様225。細胞が対象にとって自己である、実施態様176～224のいずれか1つの方法。
実施態様226。細胞が対象にとって非自己である、実施態様176～224のいずれか1つの方法。
実施態様227。治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法であって:
T細胞に:
(i)トランスジーン、及び
(ii)該細胞のゲノム内の部位における該トランスジーンの標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該トランスジーンを該細胞のゲノム内の該部位で組み込み、ここで、該トランスジーンの発現が内在性プロモーターの制御下にあり、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、相同組換えシステム
を導入することを含む、方法。
実施態様228。トランスジーンが治療的タンパク質をコードする、実施態様227の方法。
実施態様229。トランスジーンが治療的核酸をコードする、実施態様227の方法。
実施態様230。内在性プロモーターが構成的である、実施態様227の方法。
実施態様231。プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、及びCD3zプロモーターからなる群から選択される、実施態様230の方法。
実施態様232。内在性プロモーターがT細胞のサブセットで活性がある、実施態様227の方法。
実施態様233。内在性プロモーターが、CD4プロモーター、CD8aプロモーター、CD8bプロモーター、TCRaプロモーター、TCRbプロモーター、CD3dプロモーター、CD3gプロモーター、CD3eプロモーター、CD3zプロモーター、アクチンプロモーター、CD25プロモーター、IL2プロモーター、CD69プロモーター、GzmBプロモーター、T-betプロモーター、IFNγプロモーター、TIM3プロモーター、IL4プロモーター、GATA3プロモーター、IL5プロモーター、IL13プロモーター、IL10プロモーター、IL17Aプロモーター、IL6プロモーター、IL21プロモーター、IL23Rプロモーター、FoxP3プロモーター、CTLA4プロモーター、CD25プロモーター、PD1プロモーター、CD45ROプロモーター、CCR7プロモーター、CD28プロモーター、CD95プロモーター、CD28プロモーター、CD27プロモーター、CD127プロモーター、PD-1プロモーター、CD122プロモーター、CD132プロモーター、KLRG-1プロモーター、HLA-DRプロモーター、CD38プロモーター、CD69プロモーター、Ki-67プロモーター、CD11aプロモーター、CD58プロモーター、CD99プロモーター、CD62Lプロモーター、CD103プロモーター、CCR4プロモーター、CCR5プロモーター、CCR6プロモーター、CCR9プロモーター、CCR10プロモーター、CXCR3プロモーター、CXCR4プロモーター、CLAプロモーター、グランザイムAプロモーター、グランザイムBプロモーター、パーフォリンプロモーター、CD57プロモーター、CD161プロモーター、IL-18Raプロモーター、c-Kitプロモーター、及びCD130プロモーターからなる群から選択される、実施態様232の方法。
実施態様234。内在性プロモーターが誘導性である、実施態様227の方法。
実施態様235。内在性プロモーターがT細胞の活性化によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様236。プロモーターが、T細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)、キメラ共刺激性受容体(CCR)、T細胞受容体(TCR)、CD28、CD27、及び4-1BBのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様237。プロモーターが、T細胞によって発現されるCAR、CCR、又はTCRのそのそれぞれの結合パートナーへの結合によって誘導される、実施態様236の方法。
実施態様238。プロモーターが、活性化T細胞核内因子(NFAT)プロモーター、プログラム細胞死1(PD-1)プロモーター、T細胞免疫グロブリンムチン-3(TIM-3)プロモーター、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA4)プロモーター、リンパ球活性化タンパク質3(LAG-3)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)プロモーター、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)プロモーター、CD25プロモーター、CD69プロモーター、Fasリガンド(FasL)プロモーター、TIGITプロモーター、及び2B4プロモーターからなる群から選択される、実施態様237の方法。
実施態様239。プロモーターがT細胞によって発現される抑制性受容体へのリガンドの結合によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様240。抑制性受容体が、PD-1、CTLA4、TRAIL、LAG-3、BTLA、TIM-3、Fas、TIGIT、及び2B4からなる群から選択される、実施態様239の方法。
実施態様241。プロモーターがCPT1aプロモーター及びATGLプロモーターからなる群から選択される、実施態様239の方法。
実施態様242。プロモーターがT細胞によって発現されるサイトカイン受容体へのサイトカインの結合によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様243。サイトカインが、インターロイキン2(IL2)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、及びインターロイキン21(IL21)からなる群から選択される、実施態様242の方法。
実施態様244。サイトカインがインターロイキン10(IL10)及び形質転換成長因子β(TGFβ)からなる群から選択される、実施態様242の方法。
実施態様245。プロモーターが、T-betプロモーター、Eomesプロモーター、GATA3プロモーター、及びCD45RAプロモーターからなる群から選択される、実施態様242の方法。
実施態様246。プロモーターが細胞と核酸との接触によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様247。核酸が、ウイルスDNA、ウイルスRNA、及び細胞内マイクロRNAからなる群から選択される、実施態様246の方法。
実施態様248。プロモーターが、I型インターフェロン(IFN)α、I型IFNβ、IRF3、IRF7、NFkB、AP-1、TNF-α、IL1、及びIL6からなる群から選択される、実施態様247の方法。
実施態様249。プロモーターが細胞と代謝物質との接触によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様250。代謝物質が、ピルベート、グルタミン、及びβ-ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、実施態様249の方法。
実施態様251。プロモーターが細胞内の代謝変化又は細胞と細胞内の代謝変化を引き起こす物質との接触によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様252。プロモーターがPKM2プロモーターである、実施態様251の方法。
実施態様253。プロモーターが細胞内の特定のイオン濃度又は細胞と特定のイオン濃度との接触によって誘導される、実施態様234の方法。
実施態様254。イオンがカリウム又はカルシウムである、実施態様253の方法。
実施態様255。プロモーターが、IL2プロモーター、TNFαプロモーター、及びIFNγプロモーターからなる群から選択される、実施態様253の方法。
実施態様256。トランスジーンが、CAR、CCR、サイトカイン、ドミナントネガティブ体、微小環境モジュレーター、抗体、バイオセンサー、キメラ受容体リガンド(CRL)、キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)、可溶性受容体、溶質輸送体、酵素、リボザイム、遺伝子回路、エピジェネティックモディファイアー、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び非コードRNAからなる群から選択される分子をコードする、実施態様227～255のいずれか1つの方法。
実施態様257。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫刺激性である、実施態様256の方法。
実施態様258。サイトカインが免疫刺激性であり、該サイトカインが、IL2、IL12、IL15、及びIL18からなる群から選択される、実施態様257の方法。
実施態様259。トランスジーンがサイトカインをコードし、任意に、該サイトカインが免疫抑制性である、実施態様256の方法。
実施態様260。サイトカインが免疫抑制性であり、該サイトカインがTGFβ及びIL10からなる群から選択される、実施態様259の方法。
実施態様261。トランスジーンが抗体をコードし、任意に、該抗体が、免疫グロブリン、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、ダイアボディ、二重親和性再標的化(DART)、Fab、F(ab')、単鎖可変断片(scFv)、及びナノボディからなる群から選択される、実施態様256の方法。
実施態様262。トランスジーンがCARをコードする、実施態様256の方法。
実施態様263。CARが癌抗原に結合する、実施態様262の方法。
実施態様264。T細胞が標的抗原に対して感作される、実施態様227～263のいずれか1つの方法。
実施態様265。レポータートランスジーンの発現が、プロモーター、好ましくは、T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、レポーター分子をコードするトランスジーン(以後、「レポータートランスジーン」)がT細胞のゲノム内に組み込まれる、実施態様227～264のいずれか1つの方法。
実施態様266。ヒトに由来する、実施態様227～265のいずれか1つの方法。
実施態様267。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様266の方法。
実施態様268。トランスジーンが標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる、実施態様227～267のいずれか1つの方法。
実施態様269。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、パイロジェン、Aureus、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを使用することを含む方法によって実施される、実施態様268の方法。
実施態様270。トランスジーンが、T細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位での該トランスジーンの発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、実施態様227～269のいずれか1つの方法。
実施態様271。細胞に導入されるトランスジーンが標的化コンストラクトに含まれる、実施態様227～270のいずれか1つの方法。
実施態様272。標的化コンストラクトがウイルス核酸配列を含む、実施態様271の方法。
実施態様273。標的化コンストラクトが天然又は組換えアデノ随伴ウイルス(AVV)のウイルス粒子にパッケージングされる、実施態様271又は272の方法。
実施態様274。AAV粒子がAAV6配列を含む、実施態様273の方法。
実施態様275。標的化コンストラクトが非組込み型γ-レトロウイルスにパッケージングされる、実施態様271又は272の方法。
実施態様276。標的化コンストラクト中のトランスジーンがプロモーターに機能的に連結されていない、実施態様227～275のいずれか1つの方法。
実施態様277。第二のトランスジーンをT細胞に導入することをさらに含む、実施態様227～276のいずれか1つの方法。
実施態様278。第一のトランスジーンが内在性の構成的プロモーターの制御下にあり、第二のトランスジーンが内在性の誘導性プロモーターの制御下にある、実施態様277の方法。
実施態様279。第一のトランスジーンがCARである、実施態様278の方法。
実施態様280。内在性の構成的プロモーターがT細胞受容体プロモーターである、実施態様279の方法。
実施態様281。プロモーターが、T細胞受容体α鎖プロモーター、T細胞受容体β鎖プロモーター、CD3γ鎖プロモーター、CD3δ鎖プロモーター、CD3ε鎖プロモーター、及びCD3ζ鎖プロモーターからなる群から選択される、実施態様280の方法。
実施態様282。プロモーターがT細胞受容体α鎖プロモーターである、実施態様281の方法。
実施態様283。非組込み型γ-レトロウイルスを含むベクター。
実施態様284。非組込み型γ-レトロウイルスが突然変異したインテグラーゼを含む、実施態様283のベクター。
実施態様285。突然変異したインテグラーゼがDDEモチーフで突然変異している、実施態様284のベクター。
実施態様286。突然変異したインテグラーゼが、D124A、D124E、D124N、D124V、D183A、D183N、D124AとD183A、D124AとD183N、D124EとD183A、D124EとD183N、D124NとD183A、D124NとD183N、D124VとD183A、及びD124VとD183Nからなる群から選択される突然変異を有する、実施態様285のベクター。
実施態様287。T細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、T細胞。
実施態様288。CARをコードする核酸配列がゲノム内の単一の部位で組み込まれる、実施態様287のT細胞。
実施態様289。CARをコードする核酸配列が細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる、実施態様287のT細胞。
実施態様290。第一の部位がTCR複合体のタンパク質をコードする遺伝子のエクソンである、実施態様289のT細胞。
実施態様291。第一の部位におけるCARをコードする核酸配列の組込みが、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、及びCD3ζ鎖からなる群から選択されるタンパク質の発現を低下させ又は妨げる、実施態様287～290のいずれか1つのT細胞。
実施態様292。T細胞における組み込まれた核酸配列の発現が内在性プロモーターの制御下にある、実施態様287～291のいずれか1つのT細胞。
実施態様293。内在性プロモーターがT細胞受容体複合体プロモーターである、実施態様292のT細胞。
実施態様294。内在性プロモーターが、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである、実施態様292のT細胞。
実施態様295。CARが癌抗原に結合する、実施態様287～294のいずれか1つのT細胞。
実施態様296。T細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、Tfh(濾胞性ヘルパー)細胞、及びT制御性細胞からなる群から選択される、実施態様287～295のいずれか1つのT細胞。
実施態様297。ヒトに由来する、実施態様287～296のいずれか1つのT細胞。
実施態様298。T細胞が、初代ヒトT細胞、CD34造血幹細胞に由来するT細胞、胚性幹細胞に由来するT細胞、又は誘導多能性幹細胞に由来するT細胞である、実施態様297のT細胞。
実施態様299。CARをコードする核酸配列が標的化相同組換えによって第一の部位に組み込まれる、実施態様287～298のいずれか1つのT細胞。
実施態様300。標的化相同組換えが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを用いて実施される、実施態様299のT細胞。
実施態様301。CARをコードする核酸配列が、該細胞のゲノム内の複数の部位で、及び該複数の部位における該CARをコードする核酸配列の発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、実施態様287のT細胞。
実施態様302。CARが細胞によって細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする該核酸配列も細胞のゲノム内の第二の部位に組み込まれる、実施態様287～301のいずれか1つのT細胞。
実施態様303。CARをコードする核酸の該第二の部位での組込みも細胞の表面での機能的TCR複合体の発現を低下させ又は妨げ、ここで、該第一の部位及び該第二の部位が異なる遺伝子中にある、実施態様302のT細胞。
実施態様304。第二のCARが細胞によって細胞の表面で発現されるように、かつ第二の核酸配列の発現が該第二の部位で内在性プロモーターの制御下にあるように、第二のCARをコードする第二の核酸配列が該細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、ここで、該第一の部位及び該第二の部位が異なる遺伝子中にある、実施態様287～303のいずれか1つのT細胞。
実施態様305。ヒトT細胞であって、CARが内在性TCRα鎖プロモーターの制御下で発現されて、該細胞の表面で該CARを産生するように、該CARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が、TCRα鎖の第一のエクソンである該細胞のゲノム内の部位で組み込まれ、かつ該CARの該部位での組込みが機能的TCRα鎖の発現を低下させ又は妨げる、ヒトT細胞。
実施態様306。CARがCD19に結合する、実施態様305のヒトT細胞。
実施態様307。複数の実施態様287～306のいずれか1つの細胞を含む、単離されたT細胞集団。
実施態様308。実施態様287～306のいずれか1つの細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
実施態様309。複数の実施態様287～306のいずれか1つの細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体、を含む、医薬組成物。
実施態様310。それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様287～306のいずれか1つの細胞の治療的有効量を投与することを含む、方法。
実施態様311。それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様308の医薬組成物を投与することを含む、方法。
実施態様312。それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様307の細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、方法。
実施態様313。それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、実施態様309の医薬組成物を投与することを含む、方法。
実施態様314。対象が癌を有し、CARが該癌の癌抗原に結合する、実施態様310～313のいずれか1つの方法。
実施態様315。癌が白血病である、実施態様314の方法。
実施態様316。対象が腫瘍を有する、実施態様310～314のいずれか1つの方法。
実施態様317。対象がヒトであり、細胞がヒトに由来する、実施態様310～316のいずれか1つの方法。
実施態様318。細胞が対象にとって自己である、実施態様310～317のいずれか1つの方法。
実施態様319。細胞が対象にとって非自己である、実施態様310～317のいずれか1つの方法。
実施態様320。キメラ抗原受容体(CAR)を発現し、かつ機能的T細胞受容体(TCR)複合体を欠くT細胞を作製する方法であって:
T細胞に:
(i)CARをコードする核酸配列、及び
(ii)該細胞のゲノム内の部位における該核酸配列の標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該CARの該部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を低下させ又は妨げるように、該CARをコードする核酸配列を該細胞のゲノム内の該部位で組み込む、相同組換えシステムを導入することを含み、それにより、該CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する、方法。
実施態様321。CARの発現が内在性プロモーターの制御下にある、実施態様320の方法。
実施態様322。内在性プロモーターが、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである、実施態様321の方法。
実施態様323。相同組換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、もしくはクラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)、Cpf1、メガヌクレアーゼ、又はMega-Talを含む、実施態様320～322のいずれか1つの方法。
実施態様324。細胞に導入されるCARをコードする核酸配列が標的化コンストラクトに含まれる、実施態様320～323のいずれか1つの方法。
実施態様325。標的化コンストラクトがアデノ随伴ウイルス2(AAV2)配列を含む、実施態様324の方法。
実施態様326。標的化コンストラクトが天然又は組換えアデノ随伴ウイルス(AVV)のウイルス粒子にパッケージングされる、実施態様324又は325の方法。
実施態様327。AAV粒子がAAV6配列を含む、実施態様326の方法。
実施態様328。標的化コンストラクト中のCARをコードする核酸配列がプロモーターに機能的に連結されていない、実施態様320～327のいずれか1つの方法。
実施態様329。標的化コンストラクトが5'から3'の順に:第一のウイルス配列、左相同性アーム、自己切断型ブタテッショウウイルス2Aをコードする核酸配列、CARをコードする核酸配列、ポリアデニル化配列、右相同性アーム、及び第二のウイルス配列を含む、実施態様320～328のいずれか1つの方法。
実施態様330。第一又は第二のウイルス配列がアデノ随伴ウイルス(AAV)由来のものである、実施態様329の方法。
実施態様331。AAVが、AAV2、AAV5、又はAAV6である、実施態様330の方法。
実施態様332。誘導多能性幹細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、誘導多能性幹細胞。
本発明の様々な実施態様の活性に実質的には影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供される本発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を限定するのではなく、例示することが意図される。
(8.実施例)
(8.1 実施例1:汎用CAR T細胞の1ステップ作製)
下記は、汎用CAR T細胞の1ステップ作製の戦略である。
本方法は、CARがTCRαプロモーターの制御下にある汎用CAR T細胞を作製するための一石二鳥のゲノム編集戦略を含む。そうするために、CARをTCRα定常鎖遺伝子に標的化することにより、TCR発現を妨害し、内在性プロモーターを用いて、CARを発現させた。TRAC遺伝子の第一のエクソンを標的とするオーダーメイドのヌクレアーゼ(TALEN及びCRISPR/cas9)を設計し、AAVベクターを用いて、相同配向性修復(HDR)によるTRAC遺伝子とインフレームでのCARの組込みを促進した。
(オーダーメイドのヌクレアーゼ:)
TRAC遺伝子上の第一のエクソンを標的とするように、TALEN及びgRNAを設計した。標的とされる配列は、TCRαの膜貫通ドメインの上流に位置する。このドメインは、TCRα及びβの会合並びに細胞表面へのアドレッシングに必要とされる。この遺伝子座での非相同末端結合(NHEJ)又はHDRによるCARの組込みは、TCR複合体を効率的に破壊する。
TRAC-gRNA配列:
Figure 0007058223000019
*2'-O-メチル 3'ホスホロチオエート
TALEN標的配列(スペーサーには下線が引かれている):
Figure 0007058223000020
(メッセンジャーRNA:)
TALENをコードするプラスミドをTransposagenによって合成し、AgeIで線状化した。TALEN mRNAを転写し、mMessage mMachine T7 Ultraキット(Life Technologies; Carlsbad, CA)を用いて、インビトロでポリアデニル化した。RNAをRNeasyカラム(Qiagen; Valencia, CA)で精製し、Nanodrop機器を用いて定量した。RNAの品質は、変性ホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲル上で確認した。修飾されたガイドRNA(gRNA)及びCas9 mRNAは、TriLink Biotechnologiesによって合成された。gRNAは、1ug/uLでサイトポレーションTバッファー(Harvard Apparatus; Holliston, MA)中で再構成した。
(AAV:)
TRAC標的化(図1Aを参照)のために、pAAV-GFP骨格(Cellbiolabs; San Diego, CA)に基づいて、TALEN及びgRNA標的化配列が両側に隣接している1.9kbのゲノムTRAC(PCRにより増幅)と、TRACの第一のエクソンとインフレームの自己切断型P2Aペプチドと、その後ろにある、臨床試験で使用されている1928z CARとを含有するpAAV-TRAC-P2A-1928zを設計し、クローニングした(Brentjensらの文献、Sci. Transl. Med. 5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930(2013))。簡潔に述べると、CARは、その前にCD8aリーダーペプチドがあり、その後ろにCD28ヒンジ-膜貫通-細胞内領域及びCD3ζ細胞内ドメインがある、ヒトCD19に特異的な単鎖可変断片19scFVを含む。このカセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナル(BGHpA)で終わる。
(細胞:)
健康ボランティアドナー由来のバフィーコートをNew York Blood Centerから入手した。末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離によって単離し、その後、Tリンパ球を汎T細胞単離キット(Miltenyi Biotech; San Diego, CA)を用いて純化した。細胞を、106細胞/mlの密度で、200U/ml IL-2(Miltenyi Biotech)とともにヒト血清(Gemini Bioproducts; West Sacramento, CA)が補充されたX-vivo 15培地(Lonza; Basel, Switzerland)中のDynabeads(1:1ビーズ:細胞) Human T-Activator CD3/CD28(ThermoFisher; Carlsbad CA)で活性化した。培地を2日毎に交換し、細胞を106細胞/mlでプレーティングし直した。
(遺伝子標的化:)
48時間の活性化の後、CD3/CD28ビーズを磁気的に除去し、細胞をビーズの非存在下で12～16時間培養した。Tリンパ球を、AgilePulse MAXシステム(Harvard Apparatus)を用いるTALEN又はCas9/gRNA RNAの電気的導入によってトランスフェクトした。簡潔に述べると、細胞をサイトポレーション培地T(Harvard Apparatus)中で洗浄した。その後、細胞をペレット化し、サイトポレーション培地Tに30×106細胞/mlで再懸濁させた。3×106個の細胞をオーダーメイドのヌクレアーゼをコードする表示された用量の各々のmRNAと混合して、0.2cmキュベットに入れた。エレクトロポレーションは、600Vでの2回の0.1msパルスと、それに続く、100Vでの4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーション後、細胞を希釈して、培養培地に入れ、37℃、5％CO2でインキュベートした。エレクトロポレーションから2～4時間後、AAVを培地に添加し、その後、30℃でさらに20時間インキュベートし続けた。AAVドナーを表示されたMOI(1e5～1e6 MOI)で添加した。その後、編集された細胞を、標準的な条件を用いて培養した(37℃、～1e6細胞/mlの密度を維持するように、必要に応じて、2～3日毎に補充された、T細胞成長培地中で増殖させた)。
これらの条件はドナー間で再現性が高く、TALENとCRISPRの両方に関して、1ステップで最大50％のTCR-/CAR+ T細胞を生じさせた。
TCR陰性T細胞を得るために、TCR陽性T細胞を、磁気PE-抗TCRab及び抗PEマイクロビーズ及びLSカラム(Miltenyi Biotech)を用いて培地から除去した。
(レトロウイルスベクターコンストラクト及びレトロウイルス産生:)
SFG γ-レトロウイルスベクター(Riviereらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15):6733-6737(1995))をコードするプラスミドを標準的な分子生物学の技法を用いて調製した。SFG-1928z及びSFG-P28zの合成は、以前に記載されている(Brentjensらの文献、Nat Med. 9(3):279-286(2003), Brentjensらの文献、2007 Clin. Cancer Res. 13(18 Pt 1):5426-5435(2007); Maherらの文献、Nat. Biotechnol. 20(1):70-5(2002))。形質導入されたgpg29線維芽細胞(H29)から得られたVSV-Gシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いて、以前に記載されている通りに、安定なレトロウイルス産生細胞株を構築した(Gongらの文献、Neoplasia 1:123-127(1999))。
(レトロウイルス形質導入:)
Retronectin(Takara; Mountain View, CA)をコーティングした癌レトロウイルスベクター結合プレート上での遠心分離により、T細胞に連続2日間で形質導入した。
(細胞傷害性アッセイ:)
CARが形質導入されたT細胞の細胞傷害性を標準的なルシフェラーゼベースのアッセイによって決定した。簡潔に述べると、ホタルルシフェラーゼ-GFPを発現するNALM6は、標的細胞としての役割を果たした。エフェクター(E)細胞と腫瘍標的(T)細胞を、NALM6培地中に100μl/ウェルの全容量で、1×105個の標的細胞を含む黒壁の96ウェルプレートを用いて、表示されたE/T比で、3連で共培養した。標的細胞のみを同じ細胞密度でプレーティングして、最大ルシフェラーゼ発現(相対発光単位; RLUmax)を決定した。18時間後、100μlのルシフェラーゼ基質(Bright-Glo、Promega; Madison, WI)を各々のウェルに直接添加した。放射光を発光プレートリーダー又はXenogen IVISイメージングシステム(Xenogen; Alameda, CA)で検出し、Living Imageソフトウェア(Xenogen)を用いて定量した。溶解は、[1-(RLUsample)/(RLUmax)]×100として決定した。
(マウス全身性腫瘍モデル:)
使用されたマウスモデルは、MSKCC施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、8～12週齢のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウス(Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME)であった。マウスに0.5×106個のFFLuc-GFP NALM6細胞を尾静脈注射により接種し、続いて、4日後に、2×105個のCAR T細胞を注射した。NALM6は、極めて均一な腫瘍負荷をもたらし、処置前に除外されるマウスはいなかった。盲検法は使用しなかった。イメージングデータセットの獲得のために、生体発光イメージングは、Living Imageソフトウェア(Xenogen)とともにXenogen IVISイメージングシステム(Xenogen)を利用した。腫瘍負荷は、以前に記載されている通りに評価した(Gadeらの文献、Cancer Res. 65(19):9080-9088(2005))。
図1Aは、オーダーメイドのヌクレアーゼ(TALEN又はCRISPR/Cas9)によって誘導されるTCRα定常(TRAC)遺伝子座への標的化組込みの模式図を示している。標的化コンストラクト(AAV6)は、相同性配列(左相同性アーム、LHA及び右相同性アーム、RHA)が両側に隣接しているCAR遺伝子を含有する。ひとたび組み込まれると、CAR発現が内在性TCRaプロモーターによって駆動される一方で、TRAC遺伝子座は破壊される(TRAV: TCRα可変領域; TRAJ: TCRα接続領域; 2A:自己切断型ブタテッショウウイルス2A; pA:ウシ成長ホルモンポリA配列)。図1Bは、TRAC TALEN mRNAによるT細胞のトランスフェクション及び表記されたMOIでのAAV6の添加から5日後の代表的なTCR/CARフロープロットを示している。図1Bに示されているように、AAV MOIが増大するにつれて、CARの発現は増大し、TCRの発現は減少した。図1Cは、AAV6 MOIに応じたTCR破壊(KO:ノックアウト)及び標的化組込み(KI:ノックイン)のパーセンテージの棒グラフを示している。パーセンテージは、FACS解析により評価した。図1Dは、T細胞へのCARベクター化から5日後の平均CAR発現平均蛍光強度(MFI)を示している(n＝6～8回の独立した実験)。結果は、TRAC遺伝子座におけるCARの標的化組込みが同様のCAR発現レベルを有する均一なT細胞集団を生じさせたことを示している。図1Eは、CAR発現の分散(平均に対する標準偏差の比)を測るCAR+ T細胞の変動係数を示している。TRAC-P2A-1928z: TRACへの標的化組込み。SFG-1928z: SFGレトロウイルスを用いた半ランダムな組込み。****P＜0.0001(対応のないT-検定)。これらの結果は、TRAC遺伝子座におけるCARの標的化組込みが同様の発現を有する均一なT細胞集団を生じさせたことを示している。
図2Aは、CAR及びTCR発現を示すフローサイトメトリー解析を示している。TRAC-P2A-1928zを図1と同様に作製した。TALENによって作製されたTCR細胞にSFG-1928zレトロウイルスを形質導入した。TCR+細胞にSFG-1928zレトロウイルス又はSGF-P28zレトロウイルスのいずれかを形質導入した。図2Bは、CD19+標的細胞で週1回刺激したときの表示されたCAR T細胞の累積細胞数を示し、1928zを発現する細胞がインビトロ増殖を示したことを示している。図2Cは、ホタルルシフェラーゼ(FFL)発現NALM6を標的細胞として使用する18時間の生体発光アッセイを用いた細胞傷害活性を示している。1928zを発現する細胞は細胞傷害活性を示した。図2D及び2Eは、2×105個のCAR T細胞で処置したFFL-NALM6担持マウスを示している。腫瘍負荷は、40日間にわたって毎週定量された動物1匹当たりの生体発光シグナルとして示されている。定量は、全て所与の時点における動物1匹当たりの腹部及び背部獲得物の平均光子数であり、これは放射輝度として表される。図2E中の各々の線は、1匹のマウスを表している。群当たりn＝7匹のマウス。右下の図は、図2D及び2Eにおけるマウスの生存のカプラン・マイヤー解析である。これらの結果は、TRACへのCARの標的化組込みがSFG レトロウイルスを用いた半ランダムな組込みの場合よりも有意に長い生存をもたらしたことを示している。
総合すると、これらの結果は、注入された等用量のCAR T細胞では、TRAC遺伝子座にCARが標的化された細胞が、レトロウイルスによってCARが形質導入された細胞よりも非常に強力であることを示している。
上記のように、TCRα定常鎖(TRAC)の第一のエクソンにおけるプロモーターレスCAR遺伝子カセットの組込みを標的化することにより、汎用CAR T細胞の1ステップ作製の戦略を開発した。これにより、TCRα遺伝子発現の妨害を同時に伴う内在性TCRαプロモーターの制御下でのCAR発現がもたらされる。TCR複合体の全成分が細胞質膜へのその局在化に必要となるので、TCRα破壊は、TCR陰性細胞を生じさせる。この手法は、一般に使用されるゲノム編集プラットフォーム(例えば、TALEN、CRISPR/Cas9、ZFN)で好適であり、T細胞でAAVドナー鋳型を用いるTRAC標的部位での相同組換えをもたらす。T細胞でAAV6ドナー鋳型を用いる相同組換えを促進するためのTALEN及びCRISPR/Cas9の効率を比較した。標的遺伝子破壊とCAR標的化挿入を1ステップで組み合わせて、最大50％の汎用CAR T細胞を生じさせる条件を確立した。ヒト末梢血T細胞における非常に均一でかつ安定なCAR発現をもたらすCARトランスジーンの標的化組込みが分子的に確認された。これらのT細胞は、レトロウイルスによって形質導入されたCAR T細胞と同じインビトロ腫瘍溶解活性及び増殖を示し、これにより、インビボ抗腫瘍活性におけるその有用性が支持される。内在性TCRαプロモーターは、予期せぬ利益をもたらした。本方法は、ヒト末梢血T細胞で非常に均一でかつ安定なCAR発現をもたらし、T細胞の持続性も改善した。最も重要なことに、これらのT細胞が、レトロウイルスによって形質導入されたCAR T細胞よりも高いインビトロ及びインビボ腫瘍溶解活性、増殖、並びに持続性を示した一方で、細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を低下させ又は妨げることにより、その移植片対宿主病の可能性が取り除かれた。汎用T細胞製造の拡張性と標的化CAR遺伝子組込みの均一性及び安定性とを組み合わせている本明細書に記載されるプロセスは、必要に応じて、規模を拡大し、患者にすぐに提供することができる、市販のCAR療法の開発に有用である。
(8.2 実施例2: CARをCRISPR/Cas9を用いてTRAC遺伝子座に標的化すると腫瘍拒絶が増強される)
本実施例は、トランスジーンによってコードされるCARのT細胞による発現が実施され、ここで、該トランスジーンの発現は、内在性T細胞プロモーター、具体的には、ヒトT細胞受容体a鎖(TRAC)プロモーターの制御下にあったことを示している。以下に記載されているのは、CD19特異的CARをヒトT細胞受容体a鎖(TRAC)遺伝子座に向けると、ヒト末梢血T細胞における均一なCAR発現がもたらされるだけでなく、T細胞の効力も増強され、編集された細胞が急性リンパ芽球性白血病のマウスモデルにおいて従来作製されたCAR T細胞よりも大いに優れていることを示す実験である。CARをTRAC遺伝子座に標的化すると、持続的なCARシグナル伝達が回避され、抗原に対する1回又は繰り返しの曝露の後にCARの効果的な内在化及び再発現が確立され、エフェクターT細胞の分化及び疲弊が遅延することがさらに示されている。これらの研究結果は、CAR免疫生物学の諸側面を明らかにし、免疫療法を前進させるCRISPR/Cas9ゲノム編集の大きな可能性を強調する。
(方法)
(ガイド-RNA:)
TCRα遺伝子の定常鎖(TRAC)の第一のエクソンを標的とするように、ガイドRNA(gRNA) gRNAを設計した。標的とされる配列は、TCRαの膜貫通ドメインの上流にある。このドメインは、TCRα及びβの会合並びに細胞表面へのアドレッシングに必要とされる。その後、この遺伝子座での非相同末端結合(NHEJ)とHDRによるCARの組込みの両方によって、TCR複合体が効率的に破壊される。
B2Mについては、B2M遺伝子の第一のエクソンを標的とするgRNAとTALEN(転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ)の両方を設計し、より高い切断効率がTALENで得られた。同じプロトコルを使用し、両方の方法について同様の細胞傷害性及び特異性が得られ、得られたCAR T細胞は、活性及び増殖の点では識別できなかった。製造上の理由から、B2M TALENを本検討で主に使用した。
TRAC-gRNA配列:
Figure 0007058223000021
B2M-gRNA配列:
Figure 0007058223000022
*2'-O-メチル 3'ホスホロチオエート
B2M-TALEN標的化配列:
Figure 0007058223000023
 左 TALエフェクター(スペーサー) 右 TALエフェクター
(メッセンジャーRNA:)
修飾されたガイドRNA(gRNA)及びCas9 mRNAは、TriLink Biotechnologies(San Diego, CA)によって合成された。ガイドRNAは、1μg/μLでサイトポレーションTバッファー(Harvard Apparatus; Holliston, MA)中で再構成した。
(AAV:)
pAAV-GFP骨格(Cell Biolabs; San Diego, CA)に基づいて、gRNA標的化配列が両側に隣接している1.9kbのゲノムTRAC(PCRにより増幅)と、TRACの第一のエクソンとインフレームの自己切断型P2Aペプチドと、その後ろにある、臨床試験で使用されている1928z CARとを含有するpAAV-TRAC-1928zを設計し、クローニングした(Brentjensらの文献、Sci. Trans. Med. 5:177ra138(2013))。簡潔に述べると、CARは、その前にCD8aリーダーペプチドがあり、その後ろにCD28ヒンジ-膜貫通-細胞内領域及びCD3ζ細胞内ドメインがある、ヒトCD19に特異的な単鎖可変断片19scFVを含む。CAR cDNAの後ろに、ウシ成長ホルモンポリAシグナル(bGHpA)がある。B2M遺伝子座を標的とする場合、1928z-pA配列がB2M遺伝子のATGとインフレームで配置されているのでP2A配列が必要ないことを除き、同様の戦略に従った。外因性プロモーター(EF1α、LTR、PGK、又はPGK100)を使用する場合、プロモーター-1928z-pAカセットを同じTRAC又はB2M侵入地点で逆向きに配置した。
(細胞:)
健康ボランティアドナー由来のバフィーコートをNew York Blood Centerから入手した。末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離によって単離し、その後、Tリンパ球を、汎T細胞単離キット(Miltenyi Biotech; San Diego, CA)を用いて純化した。細胞を、106細胞/mlの密度で、200U/ml IL-2(Miltenyi Biotech)とともに5％ヒト血清(Gemini Bioproducts; West Sacramento, CA)が補充されたX-vivo 15培地(Lonza; Basel, Switzerland)中のDynabeads(1:1ビーズ:細胞) Human T-Activator CD3/CD28(ThermoFisher; Carlsbad CA)で活性化した。培地を2日毎に交換し、細胞を106細胞/mlでプレーティングし直した。
(遺伝子標的化:)
T細胞活性化を開始してから48時間後、CD3/CD28ビーズを磁気的に除去し、T細胞を、AgilePulse MAXシステム(Harvard Apparatus)を用いるCas9 mRNA及びgRNAの電気的導入によってトランスフェクトした。3×106個の細胞を5μgのCas9及び5μgのgRNAと混合して、0.2cmキュベットに入れた。エレクトロポレーション後、細胞を希釈して、培養培地に入れ、37℃/5％CO2でインキュベートした。エレクトロポレーションから2～4時間後、組換えAAV6ドナーベクター(SignaGenにより製造されたもの; Gaithersburg, MD)を表示されたMOI(1×105～1×106の範囲)で培地に添加した。その後、編集された細胞を、標準的な条件を用いて培養した(37℃、～1×106細胞/mlの密度を維持するように、必要に応じて、2～3日毎に補充された、T細胞成長培地中で増殖させた)。
TCR陰性T細胞を得るために、TCR陽性T細胞を、磁気ビオチン-抗TCRαβ及び抗ビオチンマイクロビーズ及びLSカラム(Miltenyi Biotech)を用いて培地から除去した。標的化コンストラクト及び戦略の詳細については、図7及び14を参照されたい。
(レトロウイルスベクターコンストラクト、レトロウイルス産生、及び形質導入:)
SFG γ-レトロウイルス(RV)ベクター(Riviereらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737(1995))をコードするプラスミドを以前に記載されている通りに調製した(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9, 279-286,(2003); Maherらの文献、Nat. Biotechnol. 20:70-75(2002))。形質導入されたgpg29線維芽細胞(H29)から得られたVSV-Gシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いて、以前に記載されている通りに、安定なレトロウイルス産生細胞株を構築した(Gongらの文献、前立腺特異的膜抗原に遺伝子標的化された癌患者のT細胞は、前立腺癌細胞を特異的に溶解させ、前立腺特異的膜抗原に応答してサイトカインを放出する(Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membrane antigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines in response to prostate-specific membrane antigen.)、Neoplasia 1:123-127(1999))。Retronectin(Takara)をコーティングしたプレート上での遠心分離により、T細胞に形質導入した。
(細胞株:)
NALM-6及びNIH/3T3をATCCから入手し、MycoAlertマイコプラズマ検出キット(Lonza)を用いて、マイコプラズマ汚染を定期的に検査した。NALM-6細胞に形質導入して、ホタルルシフェラーゼ-GFPを発現させ、NIH/3T3細胞に形質導入して、ヒトCD19を発現させた(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9, 279-286,(2003); Zhaoらの文献、Cancer Cell 28:415-428(2015))。
(細胞傷害性アッセイ:)
CARが形質導入されたT細胞の細胞傷害性を標準的なルシフェラーゼベースのアッセイによって決定した。簡潔に述べると、ホタルルシフェラーゼ-GFPを発現するNALM6は、標的細胞としての役割を果たした。エフェクター(E)細胞と腫瘍標的(T)細胞を、NALM6培地中に100μl/ウェルの全容量で、1×105個の標的細胞を含む黒壁の96ウェルプレートを用いて、表示されたE/T比で、3連で共培養した。標的細胞のみを同じ細胞密度でプレーティングして、最大ルシフェラーゼ発現(相対発光単位; RLUmax)を決定した。18時間後、100μlのルシフェラーゼ基質(Bright-Glo、Promega; Madison, WI)を各々のウェルに直接添加した。放射光を発光プレートリーダー又はXenogen IVISイメージングシステム(Xenogen; Alameda, CA)で検出し、Living Imageソフトウェア(Xenogen)を用いて定量した。溶解は、[1-(RLUsample)/(RLUmax)]×100として決定した。
(抗原刺激及び増殖アッセイ:)
ヒトCD19を発現するNIH/3T3を人工抗原提示細胞として使用した(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9, 279-286,(2003))。週1回の刺激のために、3×105個の放射線照射CD19+ AAPCを24ウェルプレートにプレーティングし、12時間後、X-vivo 15＋ヒト血清＋50U IL-2/mL中の5×105個のCAR T細胞を添加した。2日毎に、細胞を計数し、1×106 T細胞/mLの濃度に達するように培地を添加した。繰り返しの近位刺激のために(図6D)、細胞を、24時間後に(2回の刺激)又は12時間毎に(4回の刺激)、3T3-CD19がプレーティングされた新しいウェルに移した。各々の条件について、12時間毎に、T細胞を計数し、CAR、表現型及び疲弊マーカー発現について、FACSにより解析した。
(抗体及び細胞内染色:)
CARをヤギ抗マウスFab(Jackson ImmunoResearch, 115-606-003; West Grove, PA)で標識した。T細胞の表現型決定のために、以下の抗体を使用した: BD biosciences(San Jose, CA)製のマウス抗ヒトBUV-395CD4(563552)、APC-cy7-CD8(557834)、BV-421-CD62L(563862)、BV-510-CD279(PD1、563076); eBiosciences(Carslbad, CA)製のマウス抗ヒトAPC-CD25(17-0259-42)、FITC-CD45RA(11-0458-42)、PerCP-eFluor710 CD223(LAG-3、46-2239-42)、及びBiolegend(San Diego, CA)製のFITCマウス抗ヒトCD366(TIM-3、345032)。細胞内染色のために、T細胞を固定し、BD Cytofix/Cytoperm Plusキット(BD Biosciences)を製造元の推奨に従って用いて透過処理した。抗CD8-FITC(クローンHIT8a、ebiosciencce)及び抗CD4-BUV-395(クローンSK3、BD Horizon; BD Biosciences)を細胞外染色に使用した。抗TNF-Alexa Fluor 700(クローンMAb11、BD pharmingen; BD Biosciences)、抗IL2-BV421(クローン5344.111、BD Horizon)、及び抗IFNg-BV510(クローンB27、BD Horizon)を細胞内染色に使用した。
(マウス全身腫瘍モデル:)
8～12週齢のNOD/SCID/IL-2Rγ-ヌル(NSG)雄マウス(Jackson Laboratory)をMSKCC施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って使用した。マウスに0.5×106個のFFLuc-GFP NALM6細胞を尾静脈注射により接種し、続いて、4日後に、2×105個、1×105個、又は5×104個のCAR T細胞を注射した。NALM6は、極めて均一な腫瘍負荷をもたらし、処置前に除外されるマウスはいなかった。無作為化も盲検法も使用しなかった。イメージングデータセットの獲得のために、生体発光イメージングは、Living Imageソフトウェア(Xenogen)とともにXenogen IVISイメージングシステム(Xenogen)を利用した。腫瘍負荷は、以前に記載されている通りに評価した(Gadeらの文献、Cancer Res. 65:9080-9088(2005))。
(RNA抽出及びリアルタイム定量PCR:)
製造元の指示に従って、RNeasyキット(QIAGEN; Hilden, Germany)をQIAshredder(QIAGEN)と組み合わせて用いて、全RNAをT細胞から抽出した。RNAの濃度及び品質を、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific; Carslbad, CA)を用いるUV分光法 によって評価した。100～200ngの全RNAを用いて、1:1の容量比のランダムヘキサマーとオリゴdTとともにSuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen; Carlsbad, CA)を用いて、cDNAを調製した。終了したcDNA合成反応液を2UのRNアーゼHにより37℃で20分間処理した。ABsolute Blue qPCR SYBR Green Low ROX Mix(Thermo Fisher Scientific)、及び以下のプライマーセット:
Figure 0007058223000024
 を用いて、定量的PCRを実施した。PCRアッセイをQuantStudio(商標) 7 Flex System(Thermo Fisher Scientific)で実施し、Ct値をQuantStudioリアルタイムPCRソフトウェアで得た。遺伝子発現の相対変化を2ΔΔCt法で解析した。RNA発現レベルを解析されたT細胞の各々の群についてのCAR+ T細胞のパーセンテージに対して標準化した。
(統計:)
実験データは全て、平均±s.e.m.として提示されている。標本の大きさを前もって決める統計法は使用しなかった。パラメトリックデータ(標本の大きさ＞10)に対するウェルチの2標本t-検定又は非パラメトリックデータ(標本の大きさ＜10)に対するマン・ホイットニー検定を用いて、群を比較した。分散が等しくなかったので、ウェルチ補正を使用した。CAR刺激時のCAR MFIとRNAレベルの比較のために、ANOVA F-検定を使用した。統計解析は、GraphPad Prism 7ソフトウェア(GraphPad Software; La Jolla, CA)で行った。
TRAC遺伝子座を破壊し、1928z CAR(Brentjensらの文献、Sci. Transl. Med. 5, 177ra138(2013))をその転写制御(TRAC-CAR)下に置くために、TRACの第一のエクソンの5'末端を標的とするガイドRNA、及び自己切断型P2Aペプチドとそれに続くCAR cDNAをコードするプラスミドアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター修復マトリックスを設計した(図3A及び図7A)。Cas9 mRNA及びgRNAのT細胞エレクトロポレーションにより、細胞死の制限を伴わずに、高いノックアウト(KO)頻度が得られた(～70％、図3B及び図7D)。ノックイン(KI)はAAV投与量に比例し、106の感染多重度(MOI)で40％を超えた(図3B並びに図7C及び7E)。ここに初めて報告されたTRAC遺伝子座でのこの効率的な標的化は、T細胞においてAAVS1、CCR5、又はCD40L遺伝子座で到達されるレベルと同程度である(Satherらの文献、Sci. Transl. Med. 7:307ra156(2015); Wangらの文献、Nucleic Acids Res. 44:e30(2016); Hubbardらの文献、Blood 127:2513-2522(2016))。CAR+細胞の約95％はT細胞受容体(TCR)陰性であり(図7G)、1つで2つの効果を有するTCRノックアウト及びCARノックイン戦略の正当性を立証した。CAR+/TCR+細胞の観察された5％は、二重TCRα発現T細胞の典型的な頻度と一致している(Corthayらの文献、J. Autoimmun. 16:423-429(2001))。標的化特異性は、全ゲノムにわたるAAVベクター組込みのマッピングによって確認され(de Vreeらの文献、Nat. Biotechnol. 32:1019-1025(2014))、これにより、TRAC組込みの高い選択性及びオフターゲットホットスポットの不在が確認された(図8)。これらの結果は、CRISPR/Cas9によって提供される遺伝子標的化の高い効率及び正確性、並びに本発明者らが最大50×106個のTRAC-CAR T細胞を再現性良く作製する能力を示している。2倍高い平均発現を伴う斑入り発現を示すレトロウイルスによってコードされたCAR(RV-CAR)とは対照的に、均一でかつ一貫性のあるTRAC-CARの発現が複数のドナーで見られた(図3C及び3D)。
インビトロ機能試験は、CD19+抗原提示細胞による週1回の刺激に応答した細胞傷害性に関してもT細胞増殖に関しても、TRACによってコードされた1928zとランダムに組み込まれた1928zの顕著な違いを明らかにしなかった(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9:279-286(2003))(図9A及び9C)。これらの実験には、対照群が含まれ、その場合、レトロウイルスによって形質導入されたCARを発現するTCRが破壊されたT細胞(RV-CAR-TCR-)は、RV-CAR TCR+ T細胞と同様に応答した(図9A)。しかしながら、インビボでは、異なるT細胞集団の機能的限界を明らかにするためにCAR T細胞投与量を徐々に低下させる「CARストレス試験」を用いたプレB急性リンパ芽球性白血病NALM-6マウスモデル(Brentjensらの文献、Nat. Med. 9:279-286(2003); Zhaoらの文献、Cancer Cell 28:415-428(2015))において、TRAC-CAR T細胞、RV-CAR T細胞、及びRV-CAR-TCR- T細胞は、その抗腫瘍活性が顕著に異なっていた。TRAC-CAR T細胞は、全てのT細胞用量ではるかに大きい応答及び顕著に延長された中央値生存を誘導した(図3E及び図10A)。TCR破壊は、RV-CAR T細胞の効力に対して目に見える効果がなかった。1×105個のCAR T細胞が注射されたマウスにおける骨髄試験は、10日後に腫瘍部位で同様のT細胞蓄積を示した(図3F)。しかしながら、TRAC-CAR T細胞のみが腫瘍制御を達成した(図3G及び3H)。RV-CAR T細胞が、CD19+腫瘍細胞が存在し続けたにもかかわらず、10日目と比べて減少したため、17日目までに、TRAC-CAR T細胞は、RV-CAR T細胞の数を超えた(図3F～3G及び図10B)。さらに、CAR T細胞群は、それぞれ、終末エフェクター細胞(CD45RA+CD62L-)の比率並びに共発現されるPD1、LAG3、及びTIM3の蓄積において反映される、そのT細胞分化及び疲弊の程度が異なっていた(Blackburnらの文献、Nat. Immunol. 10:29-37(2009))。したがって、従来のCAR T細胞は、より大きいエフェクター記憶組成も保持していたTRAC-CAR T細胞の2％未満とは対照的に、17日目までに疲弊のマーカーの最大50％の陽性発現を示した(図3I～3J及び図10C～10D)。終末分化及びこの疲弊表現型の獲得は、抗腫瘍活性の減少と一致している(Gattinoniらの文献、Nat. Med. 17:1290-1297(2011))。興味深いことに、骨髄T細胞におけるCAR発現は、TRAC-CAR T細胞の注入前レベルと同様であったが、両方のRV-CAR群で減少した(図10E)。重要なことに、突然変異体LNGFRレポーター(Gallardoらの文献、Gene Ther. 4:1115-1119(1997))(自己切断型2Aエレメントを介して共発現される)の細胞表面発現は減少しておらず、CAR発現の減少の説明としてのベクターサイレンシングが除外された(図10G～10H)。RV-CAR T細胞で測定されたCAR発現レベルは、腫瘍負荷と負の相関があり(図10I)、細胞表面CARが腫瘍抗原に比例して下方調節されることが示唆された。したがって、これらのインビボでの研究結果は、TRAC-CAR T細胞の優れた抗腫瘍活性を示しただけでなく、腫瘍制御とT細胞の分化及び及び疲弊とCAR発現レベルの関連を築いた。これらと同じパターンは、4-1BB細胞質ドメインをその共刺激部分として利用している19BBzという別のCARで観察された(図11)。
T細胞機能に対するCAR発現レベルの影響をさらに解析するために、本発明者らは、抗原の非存在下又は存在下で培養したときのT細胞表現型をまず調べた(図4)。形質導入から5日後、RV-CAR T細胞は、以前に記載されているレトロウイルスによって送達されたCAR22で得られた結果と同様に、活性化、疲弊、及び分化の証拠を既に示した(図4A及び図12A)。それに反して、TRAC-CAR T細胞は、より大きいインビボ抗腫瘍活性と関連する表現型であるナイーブ細胞及び中心記憶細胞(CD62L+細胞)(Gattinoniらの文献、Nat. Med. 17:1290-1297(2011); Sommermeyerらの文献、Leukemia 30:492-500(2016))から主に構成される、形質導入されなかったT細胞と類似した表現型を維持した(図4A)。構成的活性化シグナル伝達と一致して、本発明者らは、TRAC-CARではなく、RV-CARが、リン酸化された免疫ベースのチロシン活性化モチーフを有することを見出した(Longらの文献、Nat. Med. 21:581-590(2015))(図4B及び4C)。抗原に曝露したときに、さらなる違いが顕著であった。TRAC-CAR T細胞とは対照的に、48時間のうちに1、2、又は4回刺激されたRV-CAR T細胞は、表現型(CD62Lの喪失)、サイトカイン分泌(IFNγ、IL2、及びTNFαの増加)、並びにマスター転写因子の発現(T-bet、EOMES、及びGATA3の増加)を基にして同定される、エフェクターT細胞へと分化する(図4D～4E及び図12B～12D)。これらの結果は、持続的シグナル伝達を低下させ、刺激時にT細胞分化を遅延させることにより、TRAC-CAR T細胞の効力の向上がそのCAR発現レベルと関連することを示した。
CAR発現を制御するために、まず、レトロウイルスベクターのコピー数を変化させようとした。遺伝子移入効率の低下は、CAR発現レベルに控え目にしか影響を及ぼさなかった(図13)。興味深いことに、平均RV-CAR発現がTRAC-CARの発現に匹敵したときでさえも、前者は、複数回刺激したときに、依然として分化の加速を示し、ベースライン発現に限らず、CAR発現の動的調節が異なる機能的特徴を促進することを示唆した。
CAR発現レベルの重要性をさらに決定付けるために、異なるゲノム遺伝子座及びプロモーターからCARを発現するT細胞を作製した。TRAC遺伝子座及びそのプロモーターの具体的な寄与を調べるために、内在性プロモーター又は外因性プロモーターのどちらかを用いて、1928z CARをTRAC又はβ2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子座(全てのT細胞で発現することが知られているMHC-I関連遺伝子)に標的化するさらに7つのコンストラクトを設計した(図5A～5B及び図14A～14E)。改変されたCAR T細胞を両方の遺伝子座で改変することに成功し、TRAC-CAR内在性プロモーターの7分の1(B2M-PGK100)～2倍超(TRAC-EF1α)の範囲の平均レベルを有する均一なCAR発現を達成した(図5C～5E及び図14)。
TRAC-CARよりも高いCAR発現を付与する組合せは全て、より低い発現をもたらすものとは全く対照的に、持続的シグナル伝達シグナチャーを示し、発現レベルを抗原非依存的シグナル伝達と関連付ける以前の研究と一致した(Frigaultらの文献、Cancer Immunol Res. 3:356-367(2015))(図5E及び図14F)。これらのうちの3つ:高発現TRAC-EF1α及び低発現B2M-CAR及びTRAC-LTR(RVエンハンサー-プロモーター)を詳細解析のために選択し、TRAC-CARに対するインビトロ及びインビボ効力を比較した。インビトロでは、繰り返しの抗原刺激の後、TRAC-EF1α CAR T細胞が速やかにエフェクタープロファイルを獲得した一方、B2M及びTRAC-CAR T細胞は、中心記憶表現型を保持した(図5F及び図15A)。興味深いことに、TRAC-LTRは、RV-CARよりも低いベースラインCAR発現を導き、持続的シグナル伝達を回避したが、LTRは、依然として、TRAC遺伝子座内からRV-CARと同じ分化パターンを促進した。NALM-6ストレス試験モデルにおいて、3つの遺伝子座-プロモーター組合せはいずれも、TRAC-CARと同じ抗腫瘍効力を示さなかった(図5G～5H)。1×105個のCAR T細胞の注入から10及び17日後、骨髄に蓄積したCAR T細胞の数は、TRAC-CAR T細胞の場合と同様か又はそれよりも多かったが; TRAC-CAR T細胞だけが腫瘍進行を効率的に制御することができた(図15C～15E)。B2M-CAR T細胞は、TRAC-CAR T細胞と同様のエフェクター/エフェクター-記憶比を維持するように思われたが、これらも優勢な疲弊シグナチャーを獲得し(図15F～15G)、分化の遅延が疲弊とは無関係であり得ることが示唆された。総合すると、これらの結果は、CAR標的化の効果を強調し、ベースライン転写制御を超えるCAR発現の調節をさらに示唆した。
CAR発現を抗原との遭遇時に綿密に解析した。この目的のために、CAR T細胞をCD19+抗原提示細胞と混合し、細胞表面CAR発現を一定時間毎に調べた(図6A)。CAR発現は、CD19への曝露から数時間以内に、標的化されたCAR T細胞とランダムに組み込まれたCAR T細胞の両方で減少し、初期レベルが低いとき、より深い低下とより長い回復の遅れを伴った。中でも特に、その後のベースライン発現への回復が異なるT細胞集団を識別した。
CAR細胞表面発現の低下の背後にあるメカニズムをより良く調べるために、本発明者らは、CAR-GFP融合タンパク質を設計して、細胞表面CAR発現と細胞内CAR発現の両方を解析し、それを、同時に翻訳されるが、切断型のLNGFRレポーターを有するCARを発現する細胞と比較した(図6B～6C)。本発明者らは、CAR発現がLNGFRとは無関係に下方調節されることを観察し、転写プロセスではなく物理的内在化が示唆された。抗原遭遇後のCARとGFPシグナルの同時低下は、CAR内在化の後にその分解が起こることを示した。抗原への曝露後のCAR分解の発生は、CAR mRNAからのデノボCAR合成がCAR発現を正確にかつ適時に回復させ、効果的なT細胞機能を支持するのに必要であることを示唆した。繰り返しの抗原刺激後のCAR細胞表面発現の注意深い解析(図6D及び図16A)により、回復期(抗原曝露から12～48時間後)における2つの主なパターンが特定された。TRAC-EF1α、TRAC-LTR、及びRV-CAR T細胞において、CAR細胞表面発現は、各々の刺激後に増大し、24時間以内にベースラインを2～4倍上回った。TRAC-CAR T細胞とB2M-CAR T細胞の両方において、CAR発現は、繰り返しの刺激によって減少し、48時間後にベースラインを下回ったままであった(図6D)。定常状態mRNA解析は、細胞表面タンパク質レベル(図6E及び図16B)とCAR T細胞活性化に対する転写応答(図6F)の間の線形相関を示し、細胞表面CAR発現の最適な刺激後補充を可能にするプロモーター強度及び調節の重要な役割を示している。
このCARタンパク質/RNA下方調節及びその後の再発現は、ヒトT細胞刺激時のTCR調節(Schrumらの文献、Immunol Rev. 196:7-24,(2003))及びマウスT細胞における抗原誘導性TCR再循環(Liuらの文献、Immunity 13, 665-675,(2000); Callらの文献、Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125,(2005); Allisonらの文献、Elife. 5,(2016))によく似ている。同様に、分化及び疲弊の加速は、過剰かつ連続的なTCRの活性化との関連において報告されている(Schietingerらの文献、Trends Immunol. 35, 51-60,(2014); Wherryらの文献、Nat. Rev. Immunol. 15, 486-499,(2015))。まとめると、これらの集まった研究結果は、TRACが2つの決定的に重要な方法でCAR発現の制御において役割を有するという結論を支持する。1つは、最適なベースライン発現を促進することであり、これにより、抗原の非存在下での持続的シグナル伝達が妨げられ、抗原と1回又は複数回接触したときの効果的なCAR内在化が可能になった。もう1つは、均衡の取れた転写応答を導き、抗原接触後のベースラインCAR発現の動力学的に最適な回復をもたらすことである。より高いCAR発現を有するT細胞とは対照的に、TRAC-CARプロファイルは、T細胞分化及び疲弊の減少と相関し、優れた腫瘍根絶をもたらした。8つの異なる転写配置でランダムに組み込むCARと2つの遺伝子座に標的化されるCARを比較した本発明者らの試験は、優れたCAR調節の感度を示している。したがって、CAR刺激時に、内在性B2MプロモーターはTRACと同様に応答したが、B2M-CARは、インビボでTRAC-CARと同様には機能せず、それが提供したより低い基本発現レベルが効果的なCAR活性にとって不十分であることを示した。TRAC-LTRも同様に、TRACと同程度のベースライン発現をもたらしたが、活性化後のその迅速な回復は、T細胞性能の低さ及び分化の加速と関連していた。それゆえ、本発明者らは、基本的なCAR発現レベルと動的なCAR発現レベルの両方がT細胞機能の持続に寄与すると結論付けている。
まとめると、これらの結果は、CARをコードする配列をTCR遺伝子座に標的化し、それを内在性調節エレメントの制御下に置くと、持続的シグナル伝達が低下し、T細胞分化及び疲弊の加速が回避され、改変されたT細胞の治療的効力が増大することを示している。抗原によって誘導されるCARの内在化及び分解の動力学的測定により、CAR発現を駆動するエンハンサー/プロモーターエレメントに応じた細胞表面CARの示差的回復が明らかになった。これらの研究結果は、CAR発現の厳密な転写調節が効果的な腫瘍根絶に極めて重要であることを示している。したがって、TCR遺伝子座へのCARの標的化は、より安全な治療的T細胞(挿入による腫瘍形成及びTCR誘導性自己免疫及び同種抗原反応のリスクを最小限に抑えることによる)、より良く規定されたT細胞産物(一定のCAR発現を生じさせ、斑入り位置効果及びベクターコピー数のばらつきを避けることによる)、並びにより強力なT細胞(構成的シグナル伝達を低下させ、T細胞疲弊を遅延させることによる)を提供し得る。最後に、これらの結果は、CAR免疫生物学とT細胞療法を前進させるゲノム編集の大きな可能性とを研究する妥当性を示している。
(8.3 実施例3.内在性プロモーターの制御下での治療的トランスジーンの発現)
1つの例において、治療的キメラ抗原受容体(CAR)を(内在性プロモーター/エンハンサーエレメントの制御下の)TRAC遺伝子座で組み込み; NFAT応答性転写ユニットをT細胞受容体β鎖定常(TRBC)遺伝子座で組み込み、これらから、2つの治療的PD1L特異的及びCTLA4 scFvを発現させる。この設定を用いて、改変されたT細胞をCARによって活性化させ、これは、NFAT活性化、それに続いて、治療的scFvの発現をもたらす。或いは、これらのトランスジーンをNFAT応答性CD69遺伝子座で組み込むことができる。特定の実施態様において、キメラ細胞表面リガンド-転写因子は、CD19-NFATである。したがって、一実施態様において、CARは、第一のトランスジーンによってコードされ、PD1L scFv及びCTLA4 scFVは、2シストロン性である第二のトランスジーンによってコードされ、ここで、該第二のトランスジーンの発現は、NFATによって誘導される内在性TRBCプロモーターの制御下にある。代わりの実施態様において、PD1L及びCTLA4 scFvを別々のトランスジーン(すなわち、第二及び第三のトランスジーン)から発現させる。具体的な実施態様において、PD1L及びCTLA4 scFvを単一のポリシストロン性トランスジーンから発現させる。そのようなコンストラクトは、別々の分子としてのPD1L及びCTLA4 scFvの発現をもたらすために、P2A配列などの切断可能な配列を任意に含むことができる。
別の例において、キメラ細胞表面リガンド(細胞外)-転写因子(TF;細胞内)融合遺伝子をB細胞でCD19分子と特異的に相互作用する(内在性プロモーター/エンハンサーエレメントの制御下の)TRAC遺伝子座で組み込み; TF応答性転写ユニットをTRBC遺伝子座で組み込み、これらから、治療的キメラ免疫受容体リガンド(CIRL)を発現させる。この設計は、改変されたT細胞が、TFを放出することにより、B細胞との相互作用に応答するのを可能にし、これが、その後、特異的自己免疫B細胞免疫グロブリン受容体(IgR)と相互作用するCIRLの発現を活性化する。後者の相互作用は、シグナルを伝達し/細胞傷害性T細胞応答を活性化し、自己免疫B細胞死を引き起こす。一実施態様において、キメラ細胞表面リガンド(細胞外)-転写因子(TF;細胞内)融合遺伝子は、第一のトランスジーンによってコードされる。一実施態様において、CIRLは、第二のトランスジーンによってコードされる。
別の例において、HIV特異的リボザイムをコードするDNA配列をCD4遺伝子座で組み込み;インターフェロン応答性転写ユニットをHIV Revタンパク質と相互作用する細胞内scFvを発現するCCR5遺伝子座で組み込む。この治療的T細胞は、リボザイムによりHIVゲノムを切断すること、CCR5発現を消失させることによりHIV感染を予防すること、及びHIV Rev活性を遮断することによりHIVパッケージングを阻害することにより: HIV複製を3倍を阻害する。一実施態様において、HIV特異的リボザイムは、第一のトランスジーンによってコードされる。一実施態様において、細胞内scFv、例えば、HIV revタンパク質と相互作用するscFvは、第二のトランスジーンによってコードされる。
(8.4 実施例4.非組み込み型γ-レトロウイルスの作製)
組換え非組み込み型(又は組込み欠損)γ-レトロウイルス(rNIgRV又はIDgRV)は、宿主細胞ゲノムへのウイルスDNAの組込みを触媒することができない突然変異体インテグラーゼタンパク質を含有するレトロウイルスベクターである。この突然変異体レトロウイルスベクターを作製するために、突然変異体インテグラーゼタンパク質(先に示された突然変異を有する)をコードするプラスミドDNAを、エンベロープをコードするプラスミドDNA及びレトロウイルスゲノムをコードするプラスミドDNAと組み合わせて使用した。これら3つのプラスミドをプロデューサー哺乳動物細胞にトランスフェクトし、組換え突然変異体ウイルスベクターを培地中に放出させ、これを後に回収し、ヒト末梢血T細胞を形質転換するために使用した。
図18に示されているように、DDEモチーフ中のアミノ酸を突然変異させることにより、突然変異体インテグラーゼを作製した(Andrake及びSkalkaの文献(2015)。レトロウイルスインテグラーゼ:昔と今(Retroviral Integrase: Then and Now). Ann. Rev. Virol. 2:241-264参照。DDEアミノ酸の位置は: D124、D183、E219(GenBankアクセッション番号NP_955592(NP_955592.1)に基づく残基付番である。作製された突然変異体は、D124A、D124E、D124N、D124V、D183A、D183N、D124AとD183A、D124AとD183N、D124EとD183A、D124EとD183N、D124NとD183A、D124NとD183N、D124VとD183A、及びD124VとD183Nであった。突然変異体を標準的な分子生物学の技法を用いて作製した。モロニーマウス白血病ウイルス(MLV) Gag-Pol配列を含有するプラスミドを標準的な分子技法を用いて修飾した。DDEモチーフを含有するDNA配列領域を、各々の特定の突然変異体を生じるように特定のコドンが突然変異させられている新しいDNA配列と交換することにより、突然変異体を作製した。得られたプラスミドを用いて、NIgRVを産生した。
標的細胞内でのその一過性の性質を利用して、rNIgRVを様々な用途に使用することができる。例えば、記憶T細胞のような特定の細胞表現型を維持する遺伝子を一過性発現させるために;特定のDNA配列を破壊するためのキメラヌクレアーゼ又はCRISPR/Cas成分を一過性発現させるために;特定のゲノム位置に相同なDNA配列が両側に隣接している外因性DNAを送達し、それにより、両側に隣接したDNA配列の相同組換えによるT細胞ゲノムへの組込みを可能にするために;トランスジェニックレトロウイルスDNAを送達し、インテグラーゼ非依存的NHEJ依存的な様式で特異的なDNA切断に組み込むために。
(9.引用された参考文献)
本明細書に引用された全ての参考文献は、あたかも各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別的に示されるのと同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。
当業者には明白であるが、本発明の多くの修飾及びバリエーションを、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施態様は、例として提供されているにすぎず、本発明は、付随する特許請求の範囲の条項と、そのような特許請求の範囲が権利付与される等価物の全範囲とによってのみ限定されるものとする。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
T細胞であって、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、前記T細胞。
（態様２）
T細胞であって、第一のトランスジーンの発現が該T細胞の第一の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第一のトランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、第二のトランスジーンの発現が第二の内在性プロモーターの制御下にあるように、該第二のトランスジーンが該T細胞のゲノム内の第二の部位で組み込まれ、ここで、該第一及び第二の内在性プロモーターが異なるプロモーターであり、該第一のトランスジーンが第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸をコードし、該第二のトランスジーンが第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸をコードし、好ましくは、ここで、該第一の治療的タンパク質又は第一の治療的核酸が、それぞれ、該第二の治療的タンパク質又は第二の治療的核酸と異なっている、前記T細胞。
（態様３）
免疫刺激性T細胞である、態様1又は2記載のT細胞。
（態様４）
免疫抑制性T細胞である、態様1又は2記載のT細胞。
（態様５）
複数の態様1又は2記載のT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
（態様６）
複数の態様3記載のT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
（態様７）
複数の態様4記載のT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
（態様８）
態様1又は2記載のT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様９）
複数の態様1又は2記載のT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様１０）
態様3記載のT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様１１）
複数の態様3記載のT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様１２）
態様4記載のT細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様１３）
複数の態様4記載のT細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様１４）
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、態様1又は2記載のT細胞の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
（態様１５）
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、態様5記載のT細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
（態様１６）
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象に、態様8又は9記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（態様１７）
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の刺激を必要としており、該対象に、細胞又は細胞集団の治療的有効量を投与することを含み、ここで、該細胞がT細胞であり、ここで、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、前記方法。
（態様１８）
免疫刺激性T細胞である、態様17記載のT細胞。
（態様１９）
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD4+サブタイプ、CD8+サブタイプ、中心記憶T細胞(TCM)、ステム記憶T細胞(TSCM)、エフェクター記憶T細胞、エフェクターT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、及びTfh(濾胞性ヘルパー)細胞からなる群から選択される、態様18記載のT細胞。
（態様２０）
それを必要としている対象をT細胞療法で治療する方法であって、該対象が免疫応答の抑制を必要としており、該対象に、細胞又は細胞集団の治療的有効量を投与することを含み、ここで、該細胞がT細胞であり、ここで、トランスジーンの発現が該T細胞の内在性プロモーターの制御下にあるように、該トランスジーンが該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、前記方法。
（態様２１）
前記T細胞が免疫抑制性T細胞である、態様20記載の方法。
（態様２２）
前記T細胞が制御性T細胞である、態様21記載の方法。
（態様２３）
治療的トランスジーンを発現するT細胞を作製する方法であって:
T細胞に:
(i)トランスジーン、及び
(ii)該細胞のゲノム内の部位における該トランスジーンの標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該トランスジーンを該細胞のゲノム内の該部位で組み込み、ここで、該トランスジーンの発現が内在性プロモーターの制御下にあり、ここで、該トランスジーンが治療的タンパク質又は治療的核酸をコードする、相同組換えシステム
を導入することを含む、前記方法。
（態様２４）
非組込み型γ-レトロウイルスを含むベクター。
（態様２５）
前記非組込み型γ-レトロウイルスが突然変異したインテグラーゼを含む、態様24記載のベクター。
（態様２６）
T細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、前記T細胞。
（態様２７）
ヒトT細胞であって、CARが内在性TCRα鎖プロモーターの制御下で発現されて、該細胞の表面で該CARを産生するように、該CARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が、TCRα鎖の第一のエクソンである該細胞のゲノム内の部位で組み込まれ、かつ該CARの該部位での組込みが機能的TCRα鎖の発現を低下させ又は妨げる、前記ヒトT細胞。
（態様２８）
複数の態様26又は27記載の細胞を含む、単離されたT細胞集団。
（態様２９）
態様26又は27記載の細胞の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様３０）
複数の態様26又は27記載の細胞を含むT細胞集団の治療的有効量;及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
（態様３１）
それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、態様26又は27記載の細胞の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
（態様３２）
それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、態様29記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（態様３３）
それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、態様28記載の細胞集団の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
（態様３４）
それを必要としている対象をCAR療法で治療する方法であって、該対象に、態様30記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（態様３５）
キメラ抗原受容体(CAR)を発現し、かつ機能的T細胞受容体(TCR)複合体を欠くT細胞を作製する方法であって:
T細胞に:
(i)CARをコードする核酸配列、及び
(ii)該細胞のゲノム内の部位における該核酸配列の標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該CARの該部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を低下させ又は妨げるように、該CARをコードする核酸配列を該細胞のゲノム内の該部位で組み込む、相同組換えシステムを導入することを含み、それにより、該CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する、前記方法。
（態様３６）
誘導多能性幹細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を低下させ又は妨げる、前記誘導多能性幹細胞。

Claims (25)

  1. T細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該T細胞によって該T細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該T細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該T細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を妨げ、かつ、該T細胞における組み込まれた核酸配列の発現が、TCR複合体の内在性プロモーターの制御下にある、前記T細胞。
  2. 前記CARをコードする核酸配列が、前記T細胞のゲノム内の単一の部位で組み込まれる、請求項1記載のT細胞。
  3. 前記CARをコードする核酸配列が、前記T細胞のゲノム内の2つの部位で組み込まれる、請求項1記載のT細胞。
  4. 前記第一の部位が、TCR複合体のタンパク質をコードする遺伝子のエクソンにある、請求項3記載のT細胞。
  5. 前記第一の部位における前記CARをコードする核酸配列の組込みが、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、及びCD3ζ鎖からなる群から選択されるタンパク質の発現を妨げる、請求項1～4のいずれか一項記載のT細胞。
  6. 前記内在性プロモーターが、T細胞受容体α鎖、T細胞受容体β鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、又はCD3ζ鎖をコードする遺伝子のプロモーターである、請求項1記載のT細胞。
  7. 前記CARが、癌抗原に結合する、請求項1～6のいずれか一項記載のT細胞。
  8. ヒトに由来する、請求項1～7のいずれか一項記載のT細胞。
  9. 前記CARをコードする核酸配列が、標的化相同組換えによって前記第一の部位に組み込まれる、請求項1～8のいずれか一項記載のT細胞。
  10. 前記CARをコードする核酸配列が、前記T細胞のゲノム内の複数の部位で、該複数の部位における該CARをコードする核酸配列の発現が異なる内在性プロモーターの制御下にあるように組み込まれる、請求項9記載のT細胞。
  11. 前記CARが前記T細胞によって該T細胞の表面で発現されるように、前記CARをコードする核酸配列も該T細胞のゲノム内の第二の部位に組み込まれる、請求項1～10のいずれか一項記載のT細胞。
  12. 前記第二の部位での前記CARをコードする核酸の組込みも、前記T細胞の表面での機能的TCR複合体の発現を妨げ、ここで、前記第一の部位及び前記第二の部位が、異なる遺伝子中にある、請求項11記載のT細胞。
  13. 第二のCARが前記T細胞によって該T細胞の表面で発現されるように、かつ第二の核酸配列の発現が前記第二の部位で内在性プロモーターの制御下にあるように、該第二のCARをコードする第二の核酸配列が、該T細胞のゲノム内の該第二の部位で組み込まれ、ここで、前記第一の部位及び第二の部位が、異なる遺伝子中にある、請求項1～12のいずれか一項記載のT細胞。
  14. ヒトT細胞であって、CARが内在性TCRα鎖プロモーターの制御下で発現されて、該T細胞の表面で該CARを産生するように、該CARをコードするプロモーターレス組換え核酸配列が、該T細胞のゲノム内のT細胞受容体(TCR)α鎖の第一のエクソンである部位で組み込まれ、かつ該CARの該部位での組込みが機能的TCRα鎖の発現を妨げる、前記ヒトT細胞。
  15. 前記CARが、CD19に結合する、請求項14記載のヒトT細胞。
  16. 複数の請求項1～15のいずれか一項記載のT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
  17. 請求項1～15のいずれか一項記載のT細胞を含む、医薬組成物。
  18. 複数の請求項1～15のいずれか一項記載のT細胞を含むT細胞集団を含む、医薬組成物。
  19. 癌を有する対象を治療する方法に使用するための請求項17記載の医薬組成物であって、前記CARが、該癌の癌抗原に結合する、前記医薬組成物。
  20. 癌を有する対象を治療する方法に使用するための請求項18記載の医薬組成物であって、前記CARが、該癌の癌抗原に結合する、前記医薬組成物。
  21. 癌を有する対象を治療する方法に使用するための請求項16記載の単離された集団であって、前記CARが、該癌の癌抗原に結合する、前記集団。
  22. 前記対象がヒトであり、前記T細胞がヒトに由来する、請求項19又は20記載の医薬組成物。
  23. 前記対象がヒトであり、前記T細胞がヒトに由来する、請求項21記載の単離された集団。
  24. キメラ抗原受容体(CAR)を発現し、かつ機能的T細胞受容体(TCR)複合体を欠くT細胞をインビトロで作製する方法であって、
    T細胞に:
    (i)CARをコードする核酸配列、及び
    (ii)該核酸の発現がTCR複合体の内在性プロモーターの制御下にあるような該T細胞のゲノム内の部位における該核酸配列の標的化組込みに好適な相同組換えシステムであって、該CARの該部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体複合体の発現を妨げるように、該CARをコードする核酸配列を該T細胞のゲノム内の該部位で組み込む、該相同組換えシステムを導入することを含み、それにより、該CARを発現し、かつ機能的TCR複合体を欠くT細胞を作製する、前記方法。
  25. 誘導多能性幹細胞であって、キメラ抗原受容体(CAR)が該細胞によって該細胞の表面で発現されるように、該CARをコードする組換え核酸配列が該細胞のゲノム内の第一の部位で組み込まれ、かつ該CARをコードする核酸の該第一の部位での組込みが該細胞の表面での機能的T細胞受容体(TCR)複合体の発現を妨げ、かつ、該細胞における組み込まれた核酸配列の発現が、TCR複合体の内在性プロモーターの制御下にある、前記誘導多能性幹細胞。
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