JP2023549098A

JP2023549098A - 固形腫瘍を標的とする多重操作されたｉＰＳＣ及び免疫エフェクター細胞

Info

Publication number: JP2023549098A
Application number: JP2023526375A
Authority: JP
Inventors: バラメールバーラム; ティー．リートム; ピー－フェイヤン; プリバディモクタール; チャンチア－ウェイ
Original assignee: フェイトセラピューティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-11-22
Also published as: AU2021376382A1; KR20230096110A; CA3196555A1; EP4240834A1; MX2023004326A; WO2022099297A1; IL302481A; US20230381235A1

Abstract

ゲノム操作されたｉＰＳＣの指向性分化から得られる機能的に増強された誘導エフェクター細胞を取得するための方法及び組成物が提供される。本明細書で提供されるｉＰＳＣ誘導細胞は、改善又は増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を有している。機能的に増強された誘導エフェクター細胞を単独で、又は併用療法において抗体若しくはチェックポイント阻害剤と共に含む、治療組成物及びその使用も提供される。

Description

（関連出願）
本出願は、２０２０年１１月４日に出願された米国特許仮出願第６３／１０９，８４２号、及び２０２１年８月２日に出願された同第６３／２２８，４９０号の優先権を主張し、それらのそれぞれの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より詳細には、本開示は、ｉｎｖｉｖｏで治療に適切な特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処する。

（電子的に提出された配列表への言及）
本出願は、本出願と共に提出された、２０２１年１１月４日に作成された、３７，７３９バイトのサイズである、１８４１４３－６３３６０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題する、ＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表のコンピュータ可読形式（Computer Readable Form、ＣＲＦ）を参照により組み込む。

養子細胞療法の分野は現在、患者由来及びドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、癌免疫療法の一貫した製造を達成することと、恩恵を受ける可能性のある全ての患者に療法を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移入したリンパ球の有効性及び持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要性もある。Ｔ細胞及びナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫及び適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞及びＮＫ細胞、又は他の免疫エフェクター細胞の可能性を最大限に活用するための重要な機会がある。

応答率、細胞の疲弊、移植細胞の損失（生存率及び／又は持続性）、標的の喪失又は系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境及び関連する免疫抑制、動員、輸送、及び浸潤など、様々な問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。

本発明の目的は、単一細胞誘導ｉＰＳＣ（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ、誘導多能性幹細胞）クローン株から分化した誘導非多能性細胞を生成する方法及び組成物を提供することであり、このｉＰＳＣは、そのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。当該１つ又はいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡ挿入、欠失、及び置換が含まれ、これらの改変は、分化、増殖、継代及び／又は移植の後、その後の誘導細胞において保持され、機能し続ける。

本出願のｉＰＳＣ誘導非多能性細胞には、ＣＤ３４^＋細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍａｎｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ、造血幹細胞及び前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、並びに初代ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞には存在しない１つ以上の機能的特徴を有する免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ誘導非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。遺伝子操作された誘導細胞を取得するための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、及び操作されたモダリティが誘導細胞で意図したとおりに機能することも必要である。更に、この戦略は、末梢血から取得されたＴ細胞又はＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。更に、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で得られる不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。

本発明のいくつかの態様は、リプログラミングプロセスに続いて、同時に、及びその前に、それぞれ、ゲノム操作の戦略を反映する（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する。
（Ｉ）：以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方を任意の順序で実施してｉＰＳＣを遺伝子操作する。（ｉ）ｉＰＳＣに１つ以上のコンストラクトを導入して、選択された部位での標的化組み込みを可能にし、（ｉｉ）（ａ）選択された部位を認識することができる１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位（複数可）における１つ以上の二本鎖切断（複数可）をｉＰＳＣに導入し、（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位（複数可）に標的化インデルを同時に又は順次に生成することを可能にし、それによって、部分又は完全分化細胞に分化することができるゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。
（ＩＩ）：非多能性細胞を遺伝子操作及びリプログラミングして、（ｉ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子と、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始すること、及び（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）（ｉ）以下の（ａ）及び（ｂ）の一方又は両方を任意の順序でリプログラミング非多能性細胞に導入することを含む、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。（ａ）選択された部位（複数可）での標的化組み込みを可能にする１つ以上のコンストラクト（複数可）、（ｂ）選択された部位を認識することができる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断（複数可）。次いで、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位（複数可）に標的化インデルを生成することを可能にする。したがって、得られたゲノム操作されたｉＰＳＣは、少なくとも１つの機能的な標的化ゲノム編集を含み、当該ゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分又は完全分化細胞に分化することができる。
（ＩＩＩ）：リプログラミングして、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得るために、非多能性細胞を遺伝子操作する。（ｉ）以下の（ａ）及び（ｂ）の一方又は両方を任意の順序で非多能性細胞に導入する。（ａ）選択された部位（複数可）での標的化組み込みを可能にする１つ以上のコンストラクト（複数可）、（ｂ）選択された部位を認識することができる少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用する、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断（複数可）。ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復が、選択された部位に標的化インデルを生成することを可能にする。（ｉｉ）ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞と、１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物を接触させて、選択された部位での標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得、それによって、少なくとも１つの機能的な標的化ゲノム編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得、当該ゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分分化細胞又は完全分化細胞に分化することができる。

上述の方法の一実施形態では、１つ以上の選択された部位での少なくとも１つの標的化ゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はゲノム操作されたｉＰＳＣ若しくはそれからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、又は他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモーターを含む１つ以上の外因性プロモーター、又は（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択された部位に含まれる１つ以上の内因性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、又はＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、又はＲＵＮＸ１を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１及び／若しくはそれらのそれぞれの受容体の部分的又は完全長ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらのそれぞれの受容体の部分的又は完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。

いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び改変、又はｉＰＳＣ若しくはそれらからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を抑制するタンパク質に関連する１つ以上の内因性遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、ＣＤ３８、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。

更にいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、及びＨ１１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。

更にいくつかの他の実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたｉＰＳＣの多能性を維持することを更に含む。一実施形態では、少なくとも１つの標的化ゲノム編集を含む取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、機能的であり、分化能があり、同一の機能のゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。

したがって、一態様において、本発明は、細胞又はその集団を提供し、細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ又はそれらから分化した誘導細胞であり、細胞は、（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖は、第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドと、任意選択で（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）又は少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）ｔｇＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチド及びｔｇＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドは、バイシストロニックなコンストラクトに含まれ、任意選択で（ａ）コンストラクトは、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ）に挿入され、（ｂ）コンストラクトの挿入は、挿入部位での内因性ＴＣＲα若しくは内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは（ｃ）コンストラクトの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター若しくは外因性プロモーターによって駆動されるか、又は（ｉｉ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣに挿入され、任意選択で（ａ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドの挿入は、挿入部位における内因性ＴＣＲα若しくは内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは（ｂ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター若しくは外因性プロモーターによって駆動されるか、又は（ｉｉｉ）ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖、ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチド、若しくは１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、１つ以上のセーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、コンストラクト及びＣＡＲ又はエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されるが、同じ定常領域には挿入されず、それによって、内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊し、内因性ＴＣＲをノックアウトし、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβ、又は（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ及び内因性ＴＣＲαを含む不対合ＴＣＲを回避する。いくつかの実施形態では、コンストラクト及びＣＡＲ又はエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、セーフハーバー遺伝子座又は選択された遺伝子座を含む遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ又はＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、（ｉｉ）選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は（ｉｉｉ）外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、若しくはｉＰＳＣマスター細胞バンク（master cell bank、ＭＣＢ）細胞であるか、又は誘導細胞は、誘導ＣＤ３４^＋細胞、誘導造血幹細胞及び前駆細胞、誘導多能性造血前駆細胞、誘導Ｔ細胞前駆細胞、誘導ＮＫ細胞前駆細胞、誘導Ｔ系統細胞、誘導ＮＫＴ系統細胞、誘導ＮＫ系統細胞、誘導Ｂ系統細胞、若しくは対応する初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及び／若しくはＢ細胞に存在しない１つ以上の機能的特徴を有する誘導エフェクター細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、誘導エフェクター細胞は、造血細胞であり、その対応する初代細胞と比較してより長いテロメアを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、表１に列挙された遺伝子型のうちの１つを含むか、又は細胞は、（ｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＤ１９－ＣＡＲ、（２）ＴＲＡＣノックアウト、及び（３）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（４）ＴＲＢＣノックアウトあり若しくはなし；（ｉｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ及びｈｎＣＤ１６挿入、（２）ＴＲＡＣノックアウト、及び（３）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（４）ＴＲＢＣノックアウトあり若しくはなし；若しくは（ｉｉｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＭＩＣＡ／ＢＢ－ＣＡＲ挿入、（２）ＴＲＡＣノックアウト、（３）ＣＤ３８遺伝子座におけるｈｎＣＤ１６挿入、（４）ＣＤ３８ノックアウト、及び（５）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（６）ＴＲＢＣノックアウトあり若しくはなし；を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、同じ遺伝子編集（複数可）を有さない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加した細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、及び／又は活性化若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープの救済の改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、及び（ｉｘ）兄弟殺しを回避する能力のうちの１つ以上を含む治療特性を有する。

いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原及び第２の腫瘍抗原はそれぞれ、（ｉ）ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１；又は（ｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹＥＳＯ１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）及び病原体抗原；のうちの少なくとも１つを含み、第１の腫瘍抗原及び第２の腫瘍抗原は同じか又は異なっている。

いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原は、ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１及びＭＩＣＡ／Ｂのうちの少なくとも１つを含むか、又は（ｉ）ｔｇＴＣＲαは、配列番号７に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖα）断片、及び配列番号８に対して少なくとも約８５％の同一性を有する配列を含むＴＣＲα定常断片を含み、かつ／若しくは（ｉｉ）ｔｇＴＣＲβは、配列番号９に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖβ）断片、及び配列番号１０に対して少なくとも約８５％の同一性を有する配列を含むＴＣＲβ定常断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異性又はＮＫ細胞特異性、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、（ｖ）スプリットＣＡＲ、（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、（ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）不活性化ＣＡＲ、（ｉｘ）任意選択で別個のコンストラクト内で又はバイシストロニックなコンストラクト内で、細胞表面発現の外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドと共発現されたもの、（ｘ）任意選択で別個のコンストラクト内で又はバイシストロニックなコンストラクト内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたものである。

細胞がエンゲージャーをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含む実施形態では、エンゲージャーは、（ｉ）細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメイン、及び（ｉｉ）外因性ＴＣＲによって標的化される第１の腫瘍抗原とは異なる第２の腫瘍抗原を標的化する第２の結合ドメインを含み得、エンゲージャーの第２の結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１又はＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つに特異的である。

いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、（ｉｉｉ）導入されたＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、若しくはＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｖ）外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、（ｖ）キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、（ｖｉｉ）表１に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊、又は（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御のうちの１つ以上を更に含み得る。細胞が外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントは、（ａ）高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインのＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全又は部分外部ドメイン、（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達及び刺激ドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。

細胞がＣＦＲを含む実施形態では、ＣＦＲは、内部ドメインに作動可能に接続された膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み得、外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインは、小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）保持シグナル又はエンドサイトーシスシグナルを含まない。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、任意の機能的バリアント、及びこれらの組み合わせ若しくはキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の完全長若しくは部分長を含むか、（ｉｉ）ＣＦＲの外部ドメインは、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、又は（ｉｉｉ）ＣＦＲの内部ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも完全長若しくは一部を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で内部ドメインは、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド若しくはこれらの任意の組み合わせの完全長若しくは一部を含む共刺激ドメイン；（ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２若しくはこれらの組み合わせの完全長若しくは一部を含む共刺激ドメイン；（ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはこれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの完全長若しくは一部を含む持続性シグナル伝達ドメイン；及び／又は（ｄ）受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase、ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ、若しくはＦＡＳ受容体の完全若しくは部分的な細胞内部分；のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、選択されたアゴニストは、（ｉ）抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、又は（ｉｉ）エンゲージャーであり、選択されたアゴニストは、細胞に含まれるポリヌクレオチドによってコードされ得るか、若しくは細胞若しくはその集団を含む培地に含まれる。

細胞が細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分ペプチド又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を含む実施形態では、細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１及びそのそれぞれの受容体（複数可）のうちの少なくとも１つを含み得るか、若しくは（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断された若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含み得、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個のコンストラクト内で若しくはバイシストロニックなコンストラクト内で、ＣＡＲと共発現され得るか、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含み得、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個のコンストラクト内で若しくはバイシストロニックなコンストラクト内で、ＣＡＲと共発現され得、任意選択で（ｄ）一過性に発現され得る。

細胞がチェックポイント阻害剤を含む実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ）アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであり得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に開示される細胞又はその集団を含む組成物を提供する。組成物のいくつかの実施形態では、細胞又はその集団は、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含み、組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、エンゲージャー、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖（double stranded）ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（immunomodulatory drug、ＩＭｉＤ）を含む。組成物がチェックポイント阻害剤を含む実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、又は（ｉｉ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上を含み得る。組成物のいくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む。

１つ以上の治療剤が抗体又はその機能的バリアント若しくは断片である組成物の実施形態では、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／若しくは抗ＣＤ３８抗体、（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びこれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、並びにこれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、又は（ｃ）ダラツムマブを含み得、誘導エフェクター細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを含み、任意選択でＣＤ１６又はそのバリアントを発現する。１つ以上の治療剤がエンゲージャーである組成物の実施形態では、エンゲージャーは、（ｉ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bi-specific T cell engager、ＢｉＴＥ）、（ｉｉ）二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bi-specific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、若しくは（ｉｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャー（tri-specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）を含み得るか、又はエンゲージャーは、（ａ）細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメイン、及び（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１、若しくはＶＥＧＦ－Ｒ２のいずれか１つを含む抗原に特異的な第２の結合ドメインを含み得る。

更に別の態様では、本発明は、本明細書で提供される組成物を養子細胞療法に適した対象に当該組成物を導入することによる治療的使用を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する。

更に別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるクローンｉＰＳＣを含むマスター細胞バンク（master cell bank、ＭＣＢ）を提供する。

更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載される誘導エフェクター細胞を製造する方法を提供し、本方法は、遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させることを含み、ｉＰＳＣは、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び任意選択で（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択でｉＰＳＣは、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、（ｉｉｉ）導入されたＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、若しくはＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｖ）外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、（ｖ）キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、（ｖｉｉ）表１に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊、又は（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び任意選択で（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドをノックインすることを更に含み、任意選択で更にクローンｉＰＳＣをゲノム操作して、（ｉ）ＣＤ３８をノックアウトすること、（ｉｉ）Ｂ２Ｍ及び／若しくはＣＩＩＴＡをノックアウトすること、（ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方をノックアウトすること、並びに／又は（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＦＲ並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を導入すること、を更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作は、標的化編集を含む。特定の実施形態では、標的化編集は、欠失、挿入、又はインデルを含み、標的化編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる。

更に別の態様では、本発明は、腫瘍細胞表面抗原ＭＲ１に特異的なキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）を提供し、ＭＲ１－ＣＡＲは、（ｉ）少なくとも１つの抗原認識ドメインを含む外部ドメインであって、抗原認識ドメインは、（ａ）配列番号７に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖα）断片（ＭＲ１Ｖα）及び配列番号８に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変ベータ（Ｖβ）断片（ＭＲ１Ｖβ）、又は（ｂ）配列番号１５に対して少なくとも約８５％の同一性を有するＭＲ１ＴＣＲαの細胞外ドメイン及び配列番号１６に対して少なくとも約８５％の同一性を有するＭＲ１ＴＣＲβの細胞外ドメインを含む、少なくとも１つの抗原認識ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、第１のシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する、内部ドメインを含み、腫瘍細胞表面抗原ＭＲ１は、非多型である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達タンパク質は、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧＦｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＣＤ３ζ１ＸＸ（ＣＤ３ζバリアント）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つを含む。

ＣＡＲのいくつかの実施形態では、内部ドメインは、第２のシグナル伝達ドメイン、及び任意選択で第３のシグナル伝達ドメインを更に含み、第１のシグナル伝達ドメイン、第２のシグナル伝達ドメイン、及び第３のシグナル伝達ドメインは異なる。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメイン又は第３のシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部を含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域のアミノ酸配列又はその一部を含む。いくつかの態様では、外部ドメインは、（ｉ）シグナルペプチド及び／又は（ｉｉ）スペーサー／ヒンジ／リンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分又は完全長ペプチドを共発現するバイシストロニックなコンストラクトに含まれ、外因性サイトカイン又はその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体（複数可）のうちの少なくとも１つを含むか、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断された若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、任意選択で別個のコンストラクト内で若しくはバイシストロニックなコンストラクト内で、ＣＡＲと共発現されるか、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、ＭＲ１－ＣＡＲは、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、黒色腫、骨癌、乳癌、卵巣癌、又は血液癌のうちの１つ以上に特異的である。

更に別の態様では、本発明は、細胞又はその集団を提供し、細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、又はそれらから分化した誘導細胞であり、細胞は、少なくとも本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む。細胞又はその集団の様々な実施形態では、細胞は、（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖は、ＭＲ１以外の第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドと、任意選択で（ｉｉｉ）少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドと、を更に含む。様々な実施形態では、（ｉ）ｔｇＴＣＲα鎖をコードするポリヌクレオチド及びｔｇＴＣＲβ鎖をコードするポリヌクレオチドは、バイシストロニックなコンストラクトに含まれ、任意選択で（ａ）コンストラクトは、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ）に挿入され、（ｂ）コンストラクトの挿入は、挿入部位での内因性ＴＣＲα若しくは内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは（ｃ）コンストラクトの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター若しくは外因性プロモーターによって駆動されるか、又は（ｉｉ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣに挿入され、任意選択で（ａ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドの挿入は、挿入部位における内因性ＴＣＲα若しくは内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは（ｂ）ＣＡＲ若しくはエンゲージャーの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター若しくは外因性プロモーターによって駆動されるか、又は（ｉｉｉ）ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖、ＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチド、若しくは１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、１つ以上のセーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に挿入される。特定の実施形態では、（Ｉ）コンストラクト及びＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ）に挿入されるが、同じ定常領域には挿入されず、それによって、内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊し、内因性ＴＣＲをノックアウトし、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβ、若しくは（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ及び内因性ＴＣＲαを含む不対合ＴＣＲを回避するか、又は（ＩＩ）コンストラクト及びＣＡＲ若しくはエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座を含む遺伝子座に組み込まれる。

更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞又はその集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細胞又はその集団は、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含み、組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む。したがって、本発明の諸実施形態は、本明細書に記載の組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる本明細書に記載の組成物の治療的使用を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する。いくつかの実施形態では、対象は、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、骨癌、乳癌、卵巣癌、又は血液癌を有する。

更に別の態様では、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を増強する方法を提供し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を介した第１の腫瘍抗原の特異性を有し、方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞に、（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖は、第２の腫瘍抗原特異性を有する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドを導入することを含み、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力は、ＴＣＲ^ｅｘｏの発現によって増強される。本方法の様々な実施形態では、（ｉ）内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊することによる内因性ＴＣＲノックアウト、又は（ｉｉ）ＣＡＲは、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入され、それによって、ＶＡＲ－Ｔ細胞の内因性ＴＣＲα若しくはＴＣＲβの発現を破壊する。本方法の様々な実施形態では、本方法は、ＴＣＲ^ｅｘｏによって認識される第２の腫瘍抗原を用いてＴＣＲ^ｅｘｏを活性化することを更に含み、第１の腫瘍抗原特異性及び第２の腫瘍抗原特異性は異なる。本方法の様々な実施形態では、ＣＡＲ－Ｔへのポリヌクレオチドの導入の停止は、遺伝子操作されたｉＰＳＣをＴ細胞に分化させることであって、ｉＰＳＣは、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）第１の腫瘍抗原特異性を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、分化させることと、それによって、ＴＣＲ^ｅｘｏの発現を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を得ることと、を更に含む。本発明の様々な実施形態では、本方法は、クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）第１の腫瘍抗原特異性を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインし、それによって、Ｔ細胞分化のための操作されたｉＰＳＣを得ることを更に含む。

本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。

ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞におけるＭＲ１－ＴＣＲの異所性発現を示す図である。ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞におけるＭＲ１－ＴＣＲの異所性発現を示す図である。図１Ａは、Ｔ細胞（ＴｉＰＳＣ）又は線維芽細胞（ＦｉＰＳＣ）からリプログラミングされたｉＰＳＣへのＭＲ１－ＴＣＲコンストラクトの形質導入、及びその後のＴ系統エフェクター細胞（それぞれＴｉＰ－ｉＴ又はＦｉＰ－ｉＴ）へのその分化を示す。図１ＢはｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞におけるＭＲ１－ＴＣＲの異所性発現を示す。ＴｉＰＳＣにおける内因性ＴＣＲβの存在が、ＴＲＡＣ破壊による内因性ＴＣＲノックアウトを有する誘導Ｔ系統エフェクター細胞（ＴｉＰ－ｉＴ）におけるＴＣＲ不対合をもたらし得ることを示す。ＴＣＲαβの発現がＣＤ３分子の表面発現を安定化させ得ることを示す図である。ＭＲ１ＴＣＲ発現エフェクター細胞がＡ５４９腫瘍細胞を特異的に殺傷させることができ、これはＭＲ１遮断抗体によって阻害され得ることを示す図である。Ａは、ＦｉＰＳＣ誘導ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ｉＴ細胞が、ＭＲ１依存性サイトカイン放出及び脱顆粒応答を示すことを示す図である。Ｂは、ＴｉｐｓＳＣ誘導ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ｉＴ細胞が、ＭＲ１依存性サイトカイン放出及び脱顆粒応答を示すことを示す図である。インプット集団内でＭＲ１－ＴＣＲを発現するＦｉＰ－ｉＴ細胞の純度を示し、抗体によって遮断されたＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達がＢｉＴＥの添加によって回復され得ることを示す図である。ＭＲ１ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴがＡ５４９細胞でＭＲ１依存的に細胞傷害性を示すことを示し、及び抗体によって遮断されたＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達がＢｉＴＥの添加によって回復され得ることを示す図である。ＭＲ１遮断抗体が、腫瘍細胞のＭＲ１－ＴＣＲ媒介性殺傷を防止することができること（上）、及びＢｉＴＥの添加が、抗体の存在下であっても、ＭＲ１－ＴＣＲ再構成細胞のＣＤ３結合を介した腫瘍細胞の標的化を可能にすることを示す図である。ＭＲ１遮断抗体の存在下、ＢｉＴＥがＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ細胞における細胞活性化及び応答を回復させたことを示す図である。ＭＲ１遮断抗体の存在下、ＢｉＴＥがＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ細胞における細胞活性化及び応答を回復させたことを示す図である。ＴＣＲによるＭＲ１認識が遮断された場合、ＢｉＴＥがＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＴｉＰ－ｉＴ細胞における細胞活性化及び応答を回復させたことを示す図である。ＴＣＲによるＭＲ１認識が遮断された場合、ＢｉＴＥがＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＴｉＰ－ｉＴ細胞における細胞活性化及び応答を回復させたことを示す図である。ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴがＮａｌｍ６細胞でＭＲ１依存的に細胞傷害性を示したこと、並びに抗体によって遮断されたＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達及び細胞傷害性がＢｉＴＥの添加によって回復され得ることを示す図である。ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴがＮａｌｍ６細胞でＭＲ１依存的に細胞傷害性を示したこと、並びに抗体によって遮断されたＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達及び細胞傷害性がＢｉＴＥの添加によって回復され得ることを示す図である。膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインが変化し得る例示的なＭＲ１－ＣＡＲ設計を示す図である。ＴＲＢＣノックアウトが不対合問題を低減し、ＴＣＲ機能を回復させることを示す図である。ＴＲＢＣノックアウトが不対合問題を低減し、ＴＣＲ機能を回復させることを示す図である。ＴＲＢＣノックアウトが不対合問題を低減し、ＴＣＲ機能を回復させることを示す図である。ＴＲＢＣノックアウトが不対合問題を低減し、ＴＣＲ機能を回復させることを示す図である。ＴＲＢＣノックアウトが不対合問題を低減し、ＴＣＲ機能を回復させることを示す図である。図１１Ｄでは、％ＴＮＦαのｘ軸は、左から右に、０．０、０．５、１．０、１．５、及び２．０である。ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を示す図である。ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を示す図である。ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を示す図である。ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を示す図である。ＣＡＲ、ＴＣＲ、及びＣＤ１６共発現を有するＴｉＰ－ｉＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である（三峰性）。ＣＡＲ、ＴＣＲ、及びＣＤ１６共発現を有するＴｉＰ－ｉＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である（三峰性）。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。三峰性ＴｉＰ－ｉＴ細胞上でのＣＡＲとＴＣＲの共発現との間の相乗的関係を支持する更なるデータを示す図であり、三峰性細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性を実証する。ｉＴエフェクターにおいて発現された外因性ＴＣＲが、ＴＣＲ抗原特異的腫瘍殺傷を誘発することができることを示す図である。ＴＣＲの外因性発現が、ｉＴエフェクターにおけるＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力を増強することを示す図である。ＣＡＲ及びＴＣＲ腫瘍抗原の両方の存在下、ＣＡＲ／ＴＣＲｉＴエフェクターが、ＣＡＲｉＴと比較して増強された腫瘍殺傷効力を示すことを示す図である。ＴＣＲ及びＣＡＲの両方の活性化が、ＣＡＲ活性化単独と比較してより速い腫瘍殺傷をもたらすことを示す図である。ＣＡＲｉＴ細胞における外因性ＴＣＲ発現が、細胞増殖におけるより高いｉＴエフェクター数と相関することを示す図である。０日目の混合腫瘍細胞株がそれぞれ、ＣＤ１６に結合するＩｇＧ抗体によって媒介されるＣＡＲ、ＴＣＲ、又はＡＤＣＣの活性化を誘発することを示す図である。Ｎａｌｍ６マウスモデルを用いた三峰性ｉＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ検証のスキームである。ＢＣＭＡ－ｍＣｈｅｒｒｙシグナル及びＮＹＥＳＯ１－ＧＦＰシグナルについての骨髄由来のｅｘｖｉｖｏＣＤ１０^＋細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。示された全ての群における示された腫瘍株についての各骨髄試料における絶対腫瘍数を示す図である。ＣＡＲ／ＴＣＲｉＴ細胞が、７日目及び１０日目に骨髄中の腫瘍の大部分を排除したが、肺及び脳領域では排除しなかったことを示す図である。インプットのＣＡＲ標的化Ｎａｌｍ６（ＢＣＭＡ^＋）とＴＣＲ標的化Ｎａｌｍ６（ＢＣＭＡ^－）との間の比を示す代表的なＦＡＣＳプロット、並びにエフェクターなし群、ＢＣＭＡＣＡＲ単独群、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ^＋ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ^＋群及びＢＣＭＡ－ＣＡＲ^＋ＭＲ１－ＴＣＲ^＋群からの２２日目の骨髄細胞懸濁液の分析を示す図である。示されるような個々の群についてのＢＣＭＡ^＋ＭＲ１^ｋｏ及びＮＹＥＳＯ１^＋ＭＲ１^ｗｔＮａｌｍ６の絶対標的数を提示する図である。ＢＬＩ分析を用いてＣＡＲ／ＴＣＲｉＴ細胞で処置したマウスにおける腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の改善の確認を提供する図である。曲線下面積（ＡＵＣ）分析を用いてＣＡＲ／ＴＣＲｉＴ細胞で処置したマウスにおける腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の改善の確認を提供する図である。２２日目の骨髄からの各示された群のｅｘｖｉｖｏｉＴ細胞上にチェックポイント阻害受容体、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＰＤ１が存在しないことを示す代表的なＦＡＣＳプロットである。２２日目の骨髄からの各示された群のｅｘｖｉｖｏｉＴ細胞のサイトカイン産生及び脱顆粒能力を示す図である。

ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失及び置換が含まれる。ゲノム操作されたｉＰＳＣでの外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期のクローン増殖後、細胞分化後、及びゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシング、又は低下した遺伝子発現などの問題にしばしば遭遇する。一方、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製及び送達に障害をもたらす。様々な実施形態では、本発明は、自殺遺伝子及び他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、及び／又は生存率に関する改善された治療特性を、これらに限定されないが、ＨＳＣ（造血幹細胞及び前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統、並びに初代ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞には存在しない１つ以上の機能的特徴を有する免疫エフェクター細胞を含むｉＰＳＣ誘導細胞にもたらす。

定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。

本明細書で使用する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１又は１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。

代替（例えば、「又は」）の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。

「及び／又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用する場合、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、およそ、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、若しくは±１％の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

本明細書で使用する場合、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％、又はそれ以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

本明細書で使用する場合、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用する場合、例えば、特定の物質又はその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）機能的に不活性な低い濃度で組成物に含まれることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。

本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるだろう。特定の実施形態では、「含む（include）」、「有する」、「含む（contain）」、及び「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。

「～からなる（consisting of）」とは、「～からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。

「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

「ｅｘｖｉｖｏ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「ｅｘｖｉｖｏ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間若しくは７２時間又はそれ以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、そしてｅｘｖｉｖｏ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「ｉｎｖｉｔｒｏ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語はｅｘｖｉｖｏと互換可能に使用できる。

「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、一般に、生体内部で起こる活動を指す。

本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「脱分化」又は「細胞能力の増加」又は「発生能力の増加」という用語は、細胞の能力を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、細胞能力が増加した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。

本明細書で使用する場合、「分化」という用語は、特殊化していない（「未コミット」）又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化したり、分化度の低い細胞型に戻ったりすることのできない細胞を指す。本明細書で使用する場合、「多能性」という用語は、生体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞（すなわち、胚そのもの）の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全な又は部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までの範囲に及ぶ一連の発生能である。

本明細書で使用する場合、「誘導多能性幹細胞」又はｉＰＳＣという用語は、リプログラミング因子及び／又は低分子化学物質による駆動法を用いて、３つの全ての胚葉若しくは真皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の組織に分化できる細胞に誘導又は変更された、すなわちリプログラミングされた、分化した成人細胞、新生児細胞、又は胎児細胞からｉｎｖｉｔｒｏで産生された幹細胞を指す。産生されたｉＰＳＣは、天然に存在する細胞を指していない。

本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生時に３つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての誘導体を発生させる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。

本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞に分化するが、３つ全てには分化しない発生能を有する細胞を指す。したがって、多能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多能性細胞は当該技術分野で周知であり、多能性細胞の例には、例えば造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多能性」は、細胞が所与の系統での多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多能性造血細胞は多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。

多能性は、細胞の多能性特徴を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴としては、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無制限自己再生の潜在能力、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含むが、これらに限定されない、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成、並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が挙げられるが、これらに限定されない。

これまでに２つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」又は「準安定」状態の多能性と、多能性初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」又は「基底」状態である。両方の多能性状態が上記のような特徴を示す一方で、ナイーブ状態又は基底状態は、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の前不活性化又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低減、並びに（ｖ）プライミング状態多能性細胞と比較しての分化マーカーの発現低下を更に示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるか又は排除されるかのいずれかである細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性の準備状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、準備状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。

本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。

本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。

「多能性因子」又は「リプログラミング因子」は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子リプログラミング剤が含まれる。

「培養」又は「細胞培養」は、ｉｎｖｉｔｒｏ環境における細胞の維持、増殖及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合で単数は「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」）、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。

「培養する」又は「維持する（maintain）」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織又は体外の細胞を維持（sustaining）、増殖（propagating）（増殖（growing））、及び／又は分化させることを指す。「培養」又は「維持すること」は、細胞の増殖及び／又は維持に役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として培地を利用することができる。

本明細書で使用する場合、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に出現し、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、他の支持組織と結合組織を含む様々な特殊化された細胞型を生じさせる、３つの胚葉のうちの１つを指す。

本明細書で使用する場合、「決定的な造血内皮」（ＨＥ）又は「多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮」（ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞及び前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て決定的な造血内皮細胞及び造血前駆体へと順次進行する。

「造血幹細胞及び前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、又は「造血前駆体細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、更なる造血分化が可能であり、多能性造血幹細胞（血球）、骨髄前駆体、巨核球前駆体、赤血球前駆体、及びリンパ球前駆体を含む細胞を指す。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書で使用する場合、「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、及びＢ系統細胞を含む成熟骨髄性とリンパ性細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４^＋造血細胞を指す。造血細胞はまた、原始赤血球、巨核球、及びマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットを含む。

本明細書で使用する場合、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は互換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の同定、並びにＭＨＣクラスＩ拘束性での他の免疫細胞の活性化及び不活性化を含む免疫系における様々な役割を有する主要なタイプの白血球を指す。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、又は哺乳動物から取得されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ３^＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞であることができ、任意の発生段階のものであることができる。追加のタイプのヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、又はＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加のタイプのメモリーＴ細胞には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指すこともできる。Ｔ細胞又はＴ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化させることもできる。Ｔ細胞様誘導エフェクター細胞は、いくつかの点でＴ細胞系統を有し得るが、同時に、初代Ｔ細胞には存在しない１つ以上の機能的特徴を有する。

「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」は、それらの表面でＣＤ４を発現し、細胞性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、及びＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」分子は、もともとＴリンパ球の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見出される。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ、主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、ヘルパー／インデューサのサブセットを定義する。

「ＣＤ８^＋Ｔ細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性及びサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用の関連認識要素である。

本明細書で使用する場合、「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用する場合、「適応ＮＫ細胞」及び「メモリーＮＫ細胞」という用語は互換可能であり、表現型的にＣＤ３^－及びＣＤ５６^＋であり、ＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、並びに任意選択でＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、及びＥＡＴ－２のうちの１つ以上の発現を欠く、ＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化及び抑制性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、並びに／又はＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６^＋は、弱陽性（ｄｉｍ）又は強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）発現であり得る。ＮＫ細胞、又はＮＫ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化され得る。ＮＫ細胞様誘導エフェクター細胞は、いくつかの点でＮＫ細胞系統を有し得るが、同時に、初代ＮＫ細胞には存在しない１つ以上の機能的特徴を有する。

本明細書で使用する場合、「ＮＫＴ細胞」又は「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合性（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つのタイプのＮＫＴ細胞が認識される。インバリアント又はＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリー－限定された範囲のβ鎖（ヒトではＶβ１１）に関連する正規のα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的又は非インバリアントのタイプＩＩＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の第２の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を提示する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫療法に適していると考えられている。適応又はインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲＶａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、及びＣＤ５６のマーカーのうちの少なくとも１つ以上の発現によって識別できる。

「エフェクター細胞」という用語は、一般に、刺激及び／若しくは活性化に応答して特定の活性を実行する免疫系における特定の細胞、又は活性化の際に特定の機能をもたらす神経系における細胞に適用される。本明細書で使用する場合、「エフェクター細胞」という用語は、「分化した免疫細胞」と互換可能であり、これは、刺激及び／若しくは活性化に応答して特定の活性を実行するように編集され、かつ／又は改変される細胞を指す。エフェクター細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び好中球が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された細胞、又は細胞の集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない。この用語は、例えば、組織又は生検試料から単離された、その天然環境で見出されるようないくつか又は全ての成分から取り出された細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、細胞培養物又は細胞懸濁液から単離された環境で見出されるため、少なくとも１つ、いくつか、又は全ての成分から取り出された細胞を含む。したがって、単離された細胞は、天然で見出される場合、又は非天然の環境で増殖、保管、若しくは存続する場合、他の物質、細胞若しくは細胞集団を含む少なくとも１つの成分から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞若しくはその集団を、環境中の他の物質若しくは細胞から分離することによって、又は環境から１つ以上の他の細胞集団若しくは亜集団を取り除くことによって得ることができる。

本明細書中で使用する場合、「精製する」などの用語は、純度を増加することをいう。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％に増加させることができる。

本明細書で使用する場合、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子は、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子若しくはｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしているということができる。

「コンストラクト」は、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用する場合、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製かつ／又は発現することができる任意の核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、送達されるコンストラクトを含む。ベクターは、線状分子又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれることも組み込まれないこともできる。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

「組み込み」とは、コンストラクトの１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、コンストラクトのヌクレオチド（複数可）が、予め選択された部位又は「組み込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用する場合、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列若しくはヌクレオチドの欠失を伴うか若しくは伴わない、コンストラクトの１つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列又は１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換を更に含み得る。

本明細書で使用する場合、「外因性」という用語は、参照分子若しくは参照活性が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用する場合、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。

本明細書で使用する場合、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはｉｎｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）又はその断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４種類のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）からなり、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。

本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用する場合、これらの用語は、例えば、当該技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、一般に当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はこれらの組み合わせを含む。

本明細書で使用する場合、「サブユニット」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は１つ以上のサブユニットからなり、アミノ酸配列は、各サブユニットについて同一であるか、又は類似しているか、又は完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、ＣＤ３複合体は、ＣＤ３α、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及びＣＤ３ζサブユニットからなり、これらはＣＤ３ε／ＣＤ３γ、ＣＤ３ε／ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の連続部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立したユニットに折り畳まれることが多い。多くのタンパク質ドメインは、ドメインの共通機能に寄与する、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」を更に含み得る。したがって、本明細書で使用する場合、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメインの内部のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメインを指すか、又は細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメイン若しくはシグナル伝達ドメインを指す。

「作動可能に連結した」又は「作動可能なように連結された」は、「作動可能に接続した」又は「作動可能なように接続した」と互換可能であり、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列（又は複数のドメインを有するポリペプチド中のアミノ酸）の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。更なる例として、受容体結合ドメインは、リガンドへの受容体の結合が当該結合に応答するシグナルを変換するように、細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続され得る。

本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、別個のタンパク質をコードする配列をコードする２つ以上の部分的又は完全なポリヌクレオチドを連結するための遺伝子操作を介して作製されるタンパク質であり、これらの連結されたポリヌクレオチドの発現は、元のタンパク質若しくはその断片のそれぞれから誘導される機能的特性を有する単一のペプチド又は複数のポリペプチドを生じる。融合タンパク質における異なる供給源の２つの隣接するポリペプチドの間に、リンカー（又はスペーサー）ペプチドを付加することができる。本明細書に記載のキメラ融合受容体（chimeric fusion receptor、ＣＦＲ）は、融合タンパク質又はキメラタンパク質である。

本明細書で使用する場合、「遺伝的インプリント」という用語は、ソース細胞又はｉＰＳＣの優先的な治療属性に寄与し、ソース細胞誘導ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣ誘導造血系統細胞で保持可能な遺伝的又はエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用する場合、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞誘導ｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化し得る。ソース細胞誘導ｉＰＳＣ、及びそこから分化した細胞は、文脈に応じて、「誘導（derived）」細胞又は「誘導（derivative）」細胞と総称し得る。例えば、本出願全体で使用される誘導エフェクター細胞、又は誘導ＮＫ系統細胞若しくは誘導Ｔ系統細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然（natural）／天然（native）供給源から取得されたそれらのその対応する初代物と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用する場合、優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリント（複数可）は、ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、又はゲノム編集を使用してｉＰＳＣに遺伝子組換えモダリティを導入することにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞のｉＰＳＣ誘導細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的であるソース細胞は、ｉＰＳＣ及び誘導造血系統細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含んでもよく、この遺伝的インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの、予め配置された単一特異的ＴＣＲ、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異のホモ接合、及び所定のＨＬＡ要件、すなわち、増加した集団でハプロタイプを示す選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、優先的な治療属性には、誘導細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と改変、生存率、及び細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の低減を伴う改善されたオンターゲット特異性、化学療法などの治療に対する耐性により示され得る。優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリント（複数可）が組み込まれているｉＰＳＣを分化させることから、１つ以上の治療属性を有する誘導細胞が得られる場合、そのような誘導細胞はまた「合成細胞」とも呼ばれる。一般に、合成細胞は、その最も近い対応する初代細胞と比較した場合、合成細胞が、操作された多能性細胞から分化されるか、又は末梢血、臍帯血若しくは他のドナー組織などの天然（natural）／天然（native）供給源からの初代細胞を操作することによって得られるかにかかわらず、１つ以上の非天然細胞機能を有する。

本明細書で使用する場合、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な未改変及び／又は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強され、改善され、かつ／又は増加された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と改変、生存率、及び細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の低減を伴う改善されたオンターゲット特異性、化学療法などの治療に対する耐性により示される。

本明細書で使用する場合、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球）と腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、又は多重特異性キラー細胞エンゲージャー、及び複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャーが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現し、かつ活性化できることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識できるエンゲージャーに結合又は連結できる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、１つの特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープ結合領域に特異的なエピトープと、を含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端が表面トリガー受容体のエピトープに特異的であり、もう一方の端が腫瘍抗原に特異的である。

本明細書で使用する場合、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性又は他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化及び組織特異的及び／又は一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写及び転写後の遺伝子調節並びに／又は抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、及びこれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。

本明細書で使用する場合、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び／若しくは薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的又は緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減（relieve）、緩和、逆転又は軽減（lessen）するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、又はそれが出現した場合にそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用される。薬学的に活性なタンパク質としては、タンパク質又はペプチド全体、タンパク質又はペプチドの薬学的に活性な断片又はバリアント、タンパク質又はペプチドの薬学的に活性な類似体、及びタンパク質又はペプチドの断片の類似体が挙げられる。「薬学的に活性なタンパク質」という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質、抗体又はその断片、増殖因子、及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を改変、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。「シグナル伝達」とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）固有のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連するときの抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャーに関連するときのエンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）癌幹細胞の標的化、及びｖ）特異的な抗原又は表面分子の非存在下での他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原及び／又はエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用する場合、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば、受容体又はエンゲージャーの能力を指すために使用できる。

本明細書で使用する場合、「養子細胞療法」という用語は、輸注の前にｅｘｖｉｖｏで増殖している、遺伝子改変された若しくは改変されていない、Ｔ若しくはＢ細胞として同定される、自家性又は同種異系のリンパ球の輸注に関連する細胞ベースの免疫療法を指す。

本明細書で使用する場合、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療及び／若しくは医薬組成物の非毒性であるが十分かつ／又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供することを指す。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、並びに状態のステージ及び重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、「治療上十分な量」は、治療されている対象の疾患又は状態に関連する少なくとも１つの症状を寛解、軽減、かつ／若しくは改善するのに十分かつ／又は有効である。

多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤及び細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている三次元のクラスターであり、三次元領域内で多数の系統を発生させる。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、更に分化を続けるように処理される。ＥＢ形成は、細胞の三次元多層クラスターにおいて多能性幹細胞を互いに近接させることによって開始される。典型的には、これは、多能性細胞を液滴中で沈降させること、細胞を「Ｕ」底ウェルプレート中に沈降させることを含むいくつかの方法のうちの１つによって、又は機械的撹拌によって達成される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体には更に分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内の中程度の増殖の分化した細胞集団（すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の胚葉）を生成する。ＥＢは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化のキューに対する三次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、様々な分化状態の異種細胞を生じさせる。更に、ＥＢは作成と維持が面倒である。更に、ＥＢ形成による細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。

対照的に、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」とは異なり、多能性幹細胞誘導細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖の間、培養培地は、増殖及び多能性を維持するように選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、日常的に機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養で凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化のキューを必要とする。

本明細書で使用する場合、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターにわたる分化、すなわち「ＥＢ形成」とは異なる分化方法を指す用語である。単層分化は、本明細書に開示される他の利点の中でも特に、ＥＢ形成が分化を開始する必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つ全ての胚葉分化と比較して最小限とみなされる。

本明細書で使用する場合、「解離した細胞」又は「単一の解離した細胞」は、他の細胞から若しくは表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離又は精製された細胞をいう。例えば、細胞は、機械的若しくは酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、ｉｎｖｉｔｒｏで凝集する細胞は、例えば、クラスターの懸濁液、単一の細胞又は単一の細胞とクラスターの混合物への解離によって、互いに酵素的又は機械的に解離され得る。更に別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレート又は他の表面から解離され得る。したがって、解離には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基質（培養面など）との細胞相互作用を破壊すること、又は細胞間のＥＣＭを破壊することが含まれる。

本明細書で使用する場合、「マスター細胞バンク」又は「ＭＣＢ」は、１つ以上の治療属性を含むように操作され、特徴付けられ、試験され、適格化され、かつ拡大され、並びに製造設定での指向性分化により、細胞ベースの治療薬の製造のための出発細胞材料として確実に機能することが示されているｉＰＳＣのクローン集団であるクローンマスター操作ｉＰＳＣ株を指す。様々な実施形態では、ＭＣＢは、製造プロセス中にｉＰＳ細胞株が継代され、解凍され若しくは取り扱われる合計回数を低減かつ／若しくは排除することによって、遺伝的変異並びに／若しくは潜在的な汚染を防止するために、複数の容器中で維持、貯蔵、並びに／又は凍結保存される。

本明細書で使用する場合、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」は、フィーダー細胞が第２の細胞型を支持するために刺激、増殖因子及び栄養素を提供するので、第２の型の細胞と共培養され、第２の型の細胞が成長、増殖、又は分化できる環境を提供する、１つの型の細胞を表す用語である。フィーダー細胞は、それらが支持している細胞とは異なる種に由来してもよい。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞又は形質転換白血病細胞は、ナチュラルキラー細胞の増殖及び成熟を支持する。フィーダー細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射又はマイトマイシンなどの拮抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞又は線維芽細胞）、及び白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）であり得る。一般に、様々なフィーダー細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。

本明細書で使用する場合、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境とは、フィーダー若しくは間質細胞を本質的に含まない、かつ／若しくはフィーダー細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養又は培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地は、フィーダー細胞が培地内で一定期間、例えば、少なくとも１日間培養された後に回収された培地を指し、したがって、培地中で培養されたフィーダー細胞によって分泌される増殖因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含有する。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞又は間質細胞の両方を含まず、フィーダー細胞の培養によって前処理もされていない。

ｉＰＳＣ及びそれから分化したｉＰＳＣ誘導の非多能性細胞のゲノム編集又は改変、又は非多能性細胞及びそれからリプログラミングされた非多能性細胞誘導ｉＰＳＣのゲノム編集又は改変との関連で使用される「機能的」とは、（１）遺伝子レベルでの－成功したノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニック又は制御された遺伝子発現、例えば所望の細胞発生段階での誘導性若しくは一時的発現であって、直接ゲノム編集若しくは改変を通じて、若しくは最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」を通じて達成される発現、又は（２）細胞レベルでの－（ｉ）直接ゲノム編集を通じて当該細胞において得られる遺伝子発現改変；（ｉｉ）最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」を通じて当該細胞において維持される遺伝子発現改変；（ｉｉｉ）当該細胞のより初期の発生段階においてのみ出現するか、若しくは分化若しくはリプログラミングを介して当該細胞を生じる出発細胞においてのみ出現する遺伝子発現改変の結果としての、当該細胞における下流遺伝子調節；若しくは（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆細胞又は脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは改変から最初に誘導される成熟細胞産物内に示される、増強された若しくは新たに達成された細胞機能若しくは特性；を介した、成功した細胞機能／特徴の除去、付加、若しくは改変を指す。

ＨＬＡクラスＩ欠損若しくはＨＬＡクラスＩＩ欠損、又はその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／若しくはＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現のレベルが不足している、又はもはや維持されていない、又は低減している細胞を指し、減少又は低減したレベルが、他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている。

本明細書で使用する場合、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリン又はパラクリン）、走化性、及び細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって更に改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。

「リガンド」という用語は、標的分子と複合体を形成し、標的上の部位に結合することによってシグナルを生成する物質を指す。リガンドは、標的に特異的に結合することができる天然物又は人工物質であり得る。リガンドは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体複合体、コンジュゲート、核酸、脂質、多糖、単糖、小分子、ナノ粒子、イオン、神経伝達物質、又は標的に特異的に結合することができる任意の他の分子実体の形態であり得る。リガンドが結合する標的は、タンパク質、核酸、抗原、受容体、タンパク質複合体、又は細胞であり得る。標的に結合してその機能を変化させ、シグナル伝達応答を引き起こすリガンドは、「アゴニスト性」又は「アゴニスト」と呼ばれる。標的に結合し、シグナル伝達応答を遮断又は低減するリガンドは、「アンタゴニスト性」又は「アンタゴニスト」である。

「抗体」という用語は、目的の特定の標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含有する抗体及び抗体断片を包含し、標的は、抗原、又は特定の抗体と相互作用することができる受容体であり得る。「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子又はその抗原結合部分若しくは受容体結合部分を含むが、これらに限定されない。例えば、ＮＫ細胞は、抗体又は抗体のＦｃ領域のそのＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合によって活性化され得、それによって、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存的細胞傷害）媒介性エフェクター細胞活性化を誘発する。抗体が結合する抗原若しくは受容体の特定の断片若しくは部分、又は一般に標的は、エピトープ又は抗原決定基として知られている。抗体という用語はまた、天然抗体及びそのバリアント、天然抗体及びそのバリアントの断片、ペプチボディ及びそのバリアント、並びに一本鎖抗体及びその断片を含む、抗体又はその特定の断片若しくは部分の構造及び／又は機能を模倣する抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新抗原受容体（variable new antigen receptor、ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体若しくは多量体抗体、又はこれらの抗体断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）又はＢｉＫＥ（二重特異性キラー細胞エンゲージャー）であってもよく、多重特異性抗体は、ＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャー）であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、並びに抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。

「Ｆｃ受容体」はＦｃＲと略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞）と各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）など、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。

「キメラ受容体」は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列の２つ以上の部分を含むように作製された、操作された人工の又はハイブリッドの受容体タンパク質分子を記載するために使用される一般用語である。キメラ受容体タンパク質は、シグナル伝達を開始し、受容体へのアゴニストリガンドの結合時に下流機能を実行する能力を細胞に与えるように操作されている。例示的な「キメラ受容体」としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）、２つ以上の受容体の融合体、及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有する組換えＴＣＲ（ｒＴＣＲ又は外因性ＴＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。

「ＣＦｃＲ」と略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、又は非天然の膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通及びシグナル伝達ドメインの一方又は両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発による細胞活性化、増殖、及び機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、若しくは抗体のＦｃ領域、若しくはエンゲージャー若しくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的細胞を近傍に近づけるか、又は近づけなくとも、分子に結合して細胞機能を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する細胞内領域において選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／又はシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって産生される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性を更に改善させるために、ＣＤ６４の細胞外ドメイン又はＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインが含まれるＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解性切断部位が排除されているか、又は受容体の細胞外ドメインが非切断性であるように置き換えられて、すなわち、シェディングされないようになり、これにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが取得される。

ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６には、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）とＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームがあることが確認されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用する場合、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、ＣＤ１６の天然又は非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６Ｖ及びＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９位～２１２位）における切断部位（１９５位～１９８位）が変更又は排除されたＣＤ１６バリアントは、シェディングしない。切断部位及び膜近位領域は、国際公開第２０１５／１４８９２６号に詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６のＳ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンである。Ｆ１５８ＶとＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは親和性が高く、非切断性である。別の例示的な高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエクソンの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。

「ＴＣＲ」と略される「Ｔ細胞受容体」は、一般に、Ｔ細胞の表面上に見出されるタンパク質複合体を指し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原ペプチドの断片の認識に関与する。ＴＣＲの抗原ペプチドへの結合は、ＴＣＲ－ＣＤ３細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、並びにシグナル伝達経路の分岐及び統合を開始し、遺伝子発現並びにＴ細胞増殖及び機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。典型的なＴＣＲは、２つの高度に可変なタンパク質鎖（α及びβ）を含み、各鎖は、細胞膜に近接する定常領域及びペプチド／ＭＨＣに結合する可変領域（すなわち、結合ドメイン）を含む。本明細書で提供されるように、特定される場合、ＴＣＲはまた、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有し、トランスジェニックＴＣＲα鎖及びトランスジェニックＴＣＲβ鎖を含む組換えＴＣＲ（ｒＴＣＲ又は外因性ＴＣＲ）を含む。

Ｉ．増強された特性を持つ養子細胞療法に有用な細胞及び組成物
本明細書で提供されるのは、ｉＰＳＣから分化した誘導細胞の治療特性を増強しながら、ｉＰＳＣの分化能並びにｉＰＳＣ及びその誘導細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンｉＰＳＣの調節回路を体系的に操作する戦略である。ｉＰＳＣ誘導細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に適している。以前は、提供された１つ以上の遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが改変された活性及び／又は特性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力、及び／又は成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣからの指向性細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現又はその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、及び細胞の表現型及び／又は機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない態様に起因する。本出願は、本明細書で提供される１つ以上の選択されたゲノム改変がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさないこと、並びに操作されたｉＰＳＣから誘導される機能エフェクター細胞が、ｉＰＳＣ分化後にエフェクター細胞に保持される、個々の又は組み合わせたゲノム改変に起因する増強かつ／又は獲得した治療特性を有することを示す。更に、ｉＰＳＣ及びｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞との関連で記載され得る全てのゲノム改変及びこれらの組み合わせは、培養されているか増殖されているかにかかわらず、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は免疫調節細胞などの初代免疫細胞を含む初代起源細胞に適用可能であり、その改変は、養子細胞療法に有用な操作された免疫細胞をもたらす。

１．腫瘍関連抗原に特異的な外因性ＴＣＲ
アルファ－ベータＴ細胞受容体（ＴＣＲαβ）は、免疫応答に必須の抗原特異的受容体であり、αβＴリンパ球の細胞表面に存在する。ペプチド－主要組織適合性複合体（peptide-major histocompatibility complex、ｐＭＨＣ）へのＴＣＲαβの結合は、ＴＣＲ－ＣＤ３細胞内活性化、多数のシグナル伝達分子の動員、並びにシグナル伝達経路の分岐及び統合を開始し、遺伝子発現並びにＴ細胞増殖及び機能獲得に重要な転写因子の動員をもたらす。Ｔ細胞の直接編集によって、又は改変された誘導Ｔ系統細胞を得るための供給源としてのゲノムｉＰＳＣ編集及び分化によってのいずれかで、ＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）を破壊することは、ＴＣＲ^ｎｅｇＴ細胞を産生するためのアプローチの１つである。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ陰性」又は「ＴＣＲ^ｎｅｇ」という用語は、任意のＴＣＲ鎖の定常領域を編集することによるＴＣＲ遺伝子発現破壊に起因するか、又はゲノム中のＴＣＲ遺伝子座の存在にもかかわらずＴＣＲ遺伝子発現が天然に存在しないことに起因する、内因性ＴＣＲ発現の欠如を指す。ＴＣＲ^ｎｅｇＴ細胞は、同種異系養子療法において使用される場合、ＨＬＡマッチングを必要とせず、低減されたアロ反応性を有し、ＧｖＨＤ（ＧｒａｆｔｖｅｒｓｕｓＨｏｓｔＤｉｓｅａｓｅ、移植片対宿主病）を予防することができる。

しかしながら、Ｔ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）の場合、ＴＲＡＣのみ又はＴＲＢＣのみを破壊することは、内因性ＴＣＲ鎖を挿入された外因性ＴＣＲ鎖と対合させることによって、残りの内因性ＴＣＲ鎖（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣのいずれか）の発現から生じる不対合ＴＣＲ複合体の形成をもたらし得ることが本明細書において発見されている。例えば、ＴＲＡＣノックアウトのみを有する細胞へのトランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）及びトランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）の形質導入は、形質導入されたエフェクター細胞における外因性ＴＣＲα鎖と内因性ＴＣＲβ鎖との間の不対合をもたらし得、これは、非機能的不対合ＴＣＲをもたらす。

ＴＣＲ破壊はまた、細胞内での内因性ＣＤ３サブユニット遺伝子発現にもかかわらず、Ｔ細胞表面からのＣＤ３シグナル伝達複合体の排除をもたらす。細胞表面ＣＤ３の欠如は、細胞表面ＣＤ３認識及び結合を必要とする技術（ＣＤ３ベースの抗体及びエンゲージャー技術、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞活性化ビーズ技術及びＣＤ３－ＣＡＲ刺激技術が挙げられるが、これらに限定されない）との不適合性に起因して、細胞の増殖及び／又は生存能力を変化させ得、細胞の機能的潜在能力を低下させ得る。更に、ＴＣＲ^ｎｅｇｉＰＳＣが指向性Ｔ細胞分化のために使用される場合、Ｔ細胞発生生物学及びＴ細胞機能成熟に対する望ましくない影響も存在し得る。しかしながら、ＴＣＲ陰性である細胞におけるＣＤ３の過剰発現は、ＣＤ３複合体及び／又はＣＤ３シグナル伝達の細胞表面提示を回復しないようである。ＴＣＲ遺伝子の存在にもかかわらず、ＣＤ３及び／又はＴＣＲを発現しない細胞、例えば、ＮＫ細胞又はＮＫ前駆細胞に関して、獲得されたＣＤ３表面発現は、これらの細胞と自然に適合しなかったであろうＣＤ３ベースの抗体、エンゲージャー及びＣＡＲ技術を介して、ＮＫ系統細胞における特異的シグナル伝達及び細胞機能を可能にする。

本明細書で提供されるように、様々な実施形態では、内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方は、ゲノム編集ツールを使用して細胞においてノックアウトされ（ＴＣＲα^－／－及びＴＣＲβ^－／－又はＴＣＲα^ｎｅｇ及びＴＣＲβ^ｎｅｇ）、ＴＣＲ^ｎｅｇ細胞をもたらす。いくつかの他の実施形態では、内因性ＴＣＲαのみがノックアウトされ、これもまたＴＣＲ^ｎｅｇ細胞をもたらす。ＴＣＲノックアウトと同時に又はそれに続いて、ＴＣＲαの定義された可変領域及び完全又は部分的定常領域（ｔｇＴＣＲα）を含むＴＣＲαをコードする第１のポリヌクレオチド、並びにＴＣＲβの定義された可変領域及び完全又は部分的定常領域（ｔｇＴＣＲβ）を含むＴＣＲβをコードする第２のポリヌクレオチドが、ＴＣＲ^ｎｅｇに導入される。定義されたＴＣＲα又はＴＣＲβの可変領域は、その配列が同定されているか又は同定され得るような、抗原に対する任意の所与の特異性のものであり得る。定義されたＴＣＲα可変領域又はＴＣＲβ可変領域はまた、選択された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とするように特異的に選択することもできる。腫瘍関連抗原は、細胞表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）中のペプチドとして提示され、エフェクターＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し、抗腫瘍応答を刺激する。

いくつかの代替的な実施形態では、ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する抗原認識領域を含む外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する。特定の実施形態では、外因性ＴＣＲα及び外因性ＴＣＲβに含まれる当該抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（ＩｇＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片を含む供給源から誘導される。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）_２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲα及びＴＣＲβをコードする第１のポリヌクレオチド並びに第２のポリヌクレオチドの一方又は両方は、それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβの内因性プロモーターによって駆動される。いくつかの他の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの一方又は両方は、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβの内因性プロモーターによって駆動されるが、いくつかの他の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、外因性プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣのうちの１つを含む。一実施形態では、外因性プロモーターは、少なくともＣＡＧを含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲα定常領域及び所与の定義された可変領域の完全長又は部分長をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号１と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ定常領域の完全長又は部分長及び所与の定義された可変領域をコードするポリヌクレオチドは、例示的な配列である配列番号２又は配列番号３と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域の完全長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは更に、Ｃ’末端にポリＡテールを含む。ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域の部分長をコードするポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み込みは、内因性定常領域内の部位であり、組み込み部位の下流のＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域の残りの内因性配列とインフレームであり、その結果、完全長トランスジェニック／キメラＴＲＡＣ又はＴＲＢＣは、その配列の一部が外因性／トランスジェニックであり、別の部分が内因性であるように形成される。例示的なＮ末端シグナルペプチドとしては、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ（配列番号４、ＣＤ８ａｓｐ）若しくはＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲ（配列番号５、ＩｇＫｓｐ）、又は当該技術分野で公知の任意のシグナルペプチド配列若しくはその機能的バリアントが挙げられる。例示的なリンカーペプチドとしては、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６、ＦＬＡＧ）、又は当該技術分野で公知の任意のリンカーペプチド配列若しくはその機能的バリアントが挙げられる。

配列番号１：
ＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ
（ＴＲＡＣ）
配列番号２：
ＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＮＨＦＲＣＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ
（ＴＲＢＣ１）
配列番号３
ＤＬＫＮＶＦＰＰＫＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ
（ＴＲＢＣ２）

本明細書で議論されるように、定常領域及び定義された可変領域を有するトランスジェニックＴＣＲα（ｔｇＴＣＲα）は、任意選択で、定常領域及び定義された可変領域を有するトランスジェニックＴＣＲβ（ｔｇＴＣＲβ）と共に、ＣＤ３ζ鎖を含む内因性ＣＤ３サブユニットと会合することによって、外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成し得る。このようなＴＣＲ^ｅｘｏ複合体は、ｔｇＴＣＲα及びｔｇＴＣＲβの選択された可変領域の特異性に起因して、定義された（若しくは選択された、若しくは標的化された）ペプチド－ＭＨＣ結合を有するか、又はペプチド－ＭＨＣ結合を有さない。いくつかの実施形態では、ｔｇＴＣＲα鎖及びｔｇＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入され、それによって、挿入部位での内因性ＴＣＲα又は内因性ＴＣＲβの発現を破壊する。いくつかの他の実施形態では、組換えＴＣＲが発現されるように、ＴＣＲの外因性可変部分がＴＣＲ遺伝子座に挿入され、組換えＴＣＲは、ＴＣＲの内因性定常領域に作動可能に連結された外因性可変部分を含む。

本出願において、ＭＲ１－ＴＣＲは、増強された機能性を有する操作された免疫エフェクター細胞を提供する際の概念実証目的のために提供される。主要組織適合遺伝子複合体クラス関連タンパク質１（ＭＲ１）は、患者間で最小限の変動性で広く発現され、普遍的な癌免疫療法であるという独特の見通しを可能にする非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質である。したがって、一例では、細胞内で形成されるＴＣＲ^ｅｘｏは、ＭＲ１に特異的である。ＴＣＲ^ｅｘｏがＭＲ１Ｖα１に特異的である実施形態では、ｔｇＴＣＲαは、例示的配列である配列番号７（ＭＲ１Ｖα）と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む可変アルファ（Ｖα）断片と、例示的配列である配列番号８と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含むＴＣＲα定常断片と、を含む。ＭＲ１に特異的なＴＣＲ^ｅｘｏのいくつかの実施形態では、ｔｇＴＣＲβは、例示的な配列である配列番号９と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む可変ベータ（Ｖβ）断片と、例示的な配列である配列番号１０と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含むＴＣＲβ定常断片と、を含む。本明細書の別の態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ、その誘導体細胞又はその集団を提供し、細胞は、可変アルファ（Ｖα）断片及びＴＣＲα定常断片、並びに／又は可変ベータ（Ｖβ）断片及びＴＣＲβ定常断片を含む少なくともｔｇＴＣＲαをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、外因性ＴＣＲ鎖ポリヌクレオチドの組み込みは、細胞の内因性定常領域内の部位であり、それによって、内因性ＴＣＲ鎖及び内因性ＴＣＲ複合体の発現を破壊する。

配列番号７

（下線は可変領域）

配列番号８
ＩＱＮＤＰＡＶＹＱＬＲＤＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＣＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ

配列番号９

（下線は可変領域）

配列番号１０

（下線は可変領域）

別の例示的な抗原特異的ＴＣＲとして、ＭＩＣＡ／Ｂ認識を組み込み、組換え／外因性ＴＣＲを生成する。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは、ヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連遺伝子（ＭＩＣ）の発現ファミリーメンバーである。ＭＩＣファミリーのメンバーは、高度に多型である（１００を超えるヒト対立遺伝子）が、構造的に保存されたモチーフを有する。腫瘍関連抗原としてのＭＩＣＡ／Ｂは、ＧＩ上皮、内皮細胞及び線維芽細胞において主に発現され、その発現は細胞／遺伝毒性ストレスによって誘導され、上皮癌及び黒色腫癌において高い発現を有する。一方、腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂのシェディングは、ＮＫ細胞サブセット及びＴ細胞サブセット上で発現されるＮＫＧ２Ｄによって認識されない可溶性ＭＩＣＡ／Ｂの増加をもたらし、腫瘍回避／エスケープを可能にし、免疫監視を阻害する可能性がある。したがって、別の例では、細胞において形成されるＴＣＲ^ｅｘｏは、腫瘍抗原ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢを標的とする。いくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの保存されたα３ドメインに特異的に結合するｓｃＦｖである。一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される重鎖の可変領域、及び配列番号１２に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される軽鎖の可変領域を含む。ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖの一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表され、リンカー及び／又はシグナルペプチドは例示的であり、置換可能である。ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖの別の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表され、リンカー及び／又はシグナルペプチドは例示的であり、それらの長さ及び配列は変動し得る。本明細書の別の態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導細胞を提供し、細胞は、少なくともＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

配列番号１１
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＮＹＡＭＮＷＶＫＱＡＰＥＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＤＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＴＹＧＮＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
（１１８ＡＡ．ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖ重鎖（ＨＣ））

配列番号１２
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＤＴＳＩＬＨＬＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＫＦＰＲＴＦＧＧＧＴＴＬＥＩＫ
（１０７ＡＡ．ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖ軽鎖（ＬＣ））

配列番号１３（ＨＣ－リンカー－ＬＣ）

（シグナルペプチド－他のシグナルペプチドも可能である、リンカー－他のリンカーも可能である）

配列番号１４（ＬＣ－リンカー－ＨＣ）

更に提供されるように、ｔｇＴＣＲα及びｔｇＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドを含む単細胞又はその集団は、本明細書に記載される１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含み得る。表１に列挙される少なくとも１つの表現型を有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクが本明細書において更に提供され、この細胞バンクは、追加のｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。

２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現
遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で公知の任意のＣＡＲの設計であり得る。ＣＡＲは、抗原認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを一般に含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサーを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含むことができる。いくつかの態様では、内部ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み得、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患又は病原体に関連する抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は、腫瘍抗原であり、腫瘍は、液性腫瘍又は固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現するＴ系統細胞又はＮＫ系統細胞のいずれかを活性化するのに適している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ特異的シグナル伝達成分を含むＮＫ細胞特異的である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣから誘導され、誘導Ｔ系統細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣから誘導される。

特定の実施形態では、当該抗原認識領域／ドメインは、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（ＩｇＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片を含む。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）_２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識領域は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合ドメインに由来する。

ＣＡＲによって標的化され得る抗原の非限定的な例には、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹＥＳＯ１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び当該技術分野で公知の様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例には、疾患を引き起こす可能性のある、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が挙げられる。更にいくつかの他の実施形態では、外因性ＴＣＲ複合体を含むＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１のうちの１つに特異的なＣＡＲを更に含む。

本発明のいくつかの態様は、腫瘍関連抗原についてＴ細胞受容体に由来するＣＡＲ結合ドメインを提供する。様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＭＲ１タンパク質によって提示される腫瘍細胞表面抗原に特異的である（ＭＲ１－ＣＡＲ）。いくつかの実施形態では、ＭＲ１－ＣＡＲの外部ドメインの抗原認識ドメインは、可変アルファ（Ｖα）断片及び可変ベータ（Ｖβ）断片を含む。いくつかの実施形態では、可変アルファ（Ｖα）断片は、例示的配列である配列番号７（ＭＲ１Ｖα）と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、可変ベータ（Ｖβ）断片は、例示的配列である配列番号９（ＭＲ１Ｖβ）と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。

いくつかの実施形態では、ＭＲ１－ＣＡＲの外部ドメインの抗原認識ドメインは、ＭＲ１ＴＣＲαの細胞外ドメイン及びＭＲ１ＴＣＲβの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＲ１ＴＣＲαの細胞外ドメインは、例示的な配列である配列番号１５と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ＭＲ１ＴＣＲβの細胞外ドメインは、例示的な配列である配列番号１６と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を少なくとも含む。

配列番号１５

配列番号１６

（下線は可変領域）

本明細書の別の態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導細胞を提供し、細胞は、少なくともＭＲ１－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくともＭＲ１－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、少なくともＭＲ１－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの他の実施形態では、少なくともＭＲ１－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、ＮＫＴ細胞である。

別の例では、本明細書は、腫瘍抗原ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢを標的とする抗原認識領域を含むＣＡＲを提供する。ＭＩＣＡ／Ｂ標的化ＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの保存されたα３ドメインに特異的に結合するｓｃＦｖである。一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１１に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される重鎖の可変領域、及び配列番号１２に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される軽鎖の可変領域を含む。ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖの一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１３に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表され、リンカー及び／又はシグナルペプチドは例示的であり、置換可能である。ＭＩＣＡ／ＢｓｃＦｖの別の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表され、リンカー及び／又はシグナルペプチドは例示的であり、それらの長さ及び配列は変動し得る。本明細書の別の態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導細胞を提供し、細胞は、少なくともＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくともＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、少なくともＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの他の実施形態では、少なくともＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、ＮＫＴ細胞である。

いくつかの態様では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチドの天然若しくは改変膜貫通領域の完全長又は少なくとも一部を含む。

いくつかの実施形態では、内部ドメイン（又は細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧＦｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＣＤ３ζ１ＸＸ（ＣＤ３ζバリアント）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの内部ドメインは、第２のシグナル伝達ドメイン、及び任意選択で第３のシグナル伝達ドメインを更に含み、第１のシグナル伝達ドメイン、第２のシグナル伝達ドメイン、及び第３のシグナル伝達ドメインのそれぞれは異なる。特定の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメイン又は第３のシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部を含む。

特定の実施形態では、内部ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域を更に含む。当該共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４若しくはＮＫＧ２Ｄ、又はこれらの任意の組み合わせのポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含むことができる。

一実施形態では、本明細書で提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＣＤ２８から誘導される共刺激ドメイン、及び配列番号１７に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインを含む。更なる実施形態では、ＣＤ２８から誘導される共刺激ドメイン及びＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８から誘導されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを含み、ｓｃＦｖは、ヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号１８に対してと少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。

配列番号１７
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱ
ＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥ
ＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
（１５３ａ．ａ．ＣＤ２８共刺激＋ＣＤ３ζＩＴＡＭ）

配列番号１８

（２１９ａ．ａ．ＣＤ２８ヒンジ＋ＣＤ２８ＴＭ＋ＣＤ２８共刺激＋ＣＤ３ζＩＴＡＭ）

別の実施形態では、本明細書で提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄから誘導される膜貫通ドメイン、２Ｂ４から誘導される共刺激ドメイン、及び配列番号１９に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄから誘導される膜貫通ドメイン、２Ｂ４から誘導される共刺激ドメイン及び天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む当該ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジを更に含み得、そのような構造のアミノ酸配列は、配列番号２０に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のものである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、１００％である。

配列番号１９

（２６３ａ．ａ．ＮＫＧ２ＤＴＭ＋２Ｂ４＋ＣＤ３ζ）

配列番号２０

（３０８ａ．ａ．ＣＤ８ヒンジ＋ＮＫＧ２ＤＴＭ＋２Ｂ４＋ＣＤ３ζ）

非限定的なＣＡＲ戦略には、一対の細胞内ドメインの二量体化によるヘテロ二量体条件付き活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照）；スプリットＣＡＲ（ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ及び内部ドメインの相同組換え（例えば、米国特許第２０１７／０１８３４０７号を参照））；抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインにそれぞれ接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多重鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０１３４１４２号を参照）；二重特異性抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照）、又は同じ若しくは異なる抗原若しくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照）、又はタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２を参照）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、及び同第２０１７／０１６６８７７号を参照）；切り替え可能なＣＡＲ（例えば、米国特許公開第２０１４／０２１９９７５号を参照）；及び当該技術分野で公知の任意の他の設計が更に含まれる。

更なる実施形態では、ＣＡＲ及びＴＣＲ^ｅｘｏを含むｉＰＳＣ及びその誘導Ｔ細胞は、ＴＣＲ定常領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＣＲノックアウトをもたらし、ＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモーターの制御下に置く。いくつかの他の実施形態では、ＴＣＲ定常領域に挿入されたＣＡＲは、ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを含む腫瘍抗原に特異的である。追加のＣＡＲ挿入部位には、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ及びＣＡＲ、並びに任意選択でＣＦＲ若しくはエンゲージャーを含むｉＰＳＣ又はその誘導体は、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ及び／又はＳ１９７Ｐ）に天然な又はＣＤ６４から誘導される外部ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通、刺激及びシグナル伝達ドメインを有する外因性ＣＤ１６を更に含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣ及びその誘導ＮＫ細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ及びＣＡＲを含み、ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座又はＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入され、ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、それにより、ＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄプロモーターの制御下に置く。

したがって、本明細書で提供される機能的モダリティを含む遺伝子操作された免疫細胞に加えて、本発明の態様は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることから得られる誘導細胞を提供し、ｉＰＳＣ及び誘導細胞の両方は、本明細書で論じられるように、追加の改変モダリティと共に１つ以上のＣＡＲを含む。本出願で更に提供されるのは、少なくともＣＡＲ及びＴＣＲ^ｅｘｏを有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、追加のｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。

３．ＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、２つのアイソフォーム、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）として同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ１６ｂは、ヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用する場合、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は、親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを含む下方制御に供される。Ｆ１７６Ｖ（いくつかの刊行物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高親和性を有する例示的なＣＤ１６多型アレル／バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の遺伝子操作された非切断性バージョンの一例である。Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、国際公開第２０１５／１４８９２６号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＣＤ１６の外部ドメインがＣＤ６４の外部ドメインの少なくとも一部で本質的に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体は、ＡＤＣＣを実行できるＣＤ１６受容体の望ましい高親和性と切断不可能な機能も実現できる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４又はそのアイソフォーム又は多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３エクソンのうちの１つ以上を含む。

したがって、細胞に導入される外因性ＣＤ１６の様々な実施形態は、機能的ＣＤ１６バリアント及びそのキメラ受容体を含む。いくつかの実施形態では、機能的ＣＤ１６バリアントは、高親和性非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部を含む。

したがって、本明細書で企図されかつ記載されるように、他の編集の中にｉＰＳＣに導入された外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含むように遺伝子操作されたクローンｉＰＳＣが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、高親和性非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６から誘導されない膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）の形態である。

いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントを含む初代起源又は誘導エフェクター細胞は、ＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアントを含む初代起源又は誘導エフェクター細胞は、Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の完全長又は部分長の細胞外ドメインを含む。ｉＰＳＣ若しくはその誘導細胞に含まれる外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアントは、結合時に下流シグナル伝達を誘発するリガンドへの結合において高い親和性を有する。外因性ＣＤ１６又は機能的バリアントに結合するリガンドは、ＡＤＣＣ抗体又はその断片だけでなく、当該外因性ＣＤ１６のＣＤ１６若しくはＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャー又はバインダーも含む。このように、本出願の態様のうちの少なくとも１つは、本開示で更に詳述する状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量で、エフェクター細胞上で発現する外因性ＣＤ１６を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導エフェクター細胞又はその細胞集団を提供し、当該外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４の、又はＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。

いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６又はそのバリアントベースのＣＦｃＲを含む。キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）は、天然ＣＤ１６膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを改変又は置換することによって、非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン及び／又は非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生される。本明細書で使用される「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン又はシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体から誘導されることを意味する。本明細書での例示では、ＣＤ１６又はそのバリアントベースのＣＦｃＲは、ＣＤ１６から誘導される膜貫通ドメイン、刺激ドメイン又はシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴ細胞受容体ポリペプチドから誘導される非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドから誘導される非天然の刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドから誘導される非天然のシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの一実施形態では、提供されるキメラＦｃ受容体は、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つから誘導される膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインの両方を含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の１つの特定の一実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの完全長又は部分配列から誘導され、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の例示的な実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの完全長又は部分配列から誘導され、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。

上述のようなＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、抗体若しくはその断片のＦｃ領域に、又は二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャー若しくはバインダーに、高い親和性で結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化及びサイトカイン分泌、並びに抗体が、又は腫瘍抗原結合成分及びＦｃ領域を有する当該二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャー若しくはバインダーが標的とする腫瘍細胞の殺傷を可能にする。理論に束縛されることなく、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の、非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及び／若しくはシグナル伝達ドメインを通じて、又は外部ドメインへのエンゲージャーの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺傷能力に寄与し得、エフェクター細胞の増殖及び／又は増殖の可能性を増加させる。抗体とエンゲージャーは、抗原を発現している腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現しているエフェクター細胞を近接させることができ、これも増強された腫瘍細胞の殺傷に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャー又はバインダーのための例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに適したいくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性のエンゲージャー又はバインダーには、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、及びＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。

ＮＫ細胞活性化に続いて細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６とは異なり、誘導ＮＫ細胞の種々の非切断性バージョンのＣＤ１６は、ＣＤ１６のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。誘導ＮＫ細胞では、非切断性ＣＤ１６は、改善した細胞機能の指標であるＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現を増加させる。非切断性ＣＤ１６はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び二重特異的、三重特異的、又は多重特異的エンゲージャーの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介性溶解のメカニズムである。誘導ＮＫ細胞に導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＡＤＣＣ抗体のＮＫ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏローディングも可能になる。本明細書に提示されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態ではＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含み得るか、又はＣＤ６４から誘導される完全長若しくは部分長な外部ドメインを含み得るか、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。開示されるように、本出願はまた、本明細書で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導ＮＫ細胞又はその細胞集団を提供する。

初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然／天然源）由来の成熟Ｔ細胞はＣＤ１６を発現しない。発現した外因性非切断性ＣＤ１６を含むｉＰＳＣが、Ｔ細胞の発生生物学を損なうことなく、外因性ＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得したＡＤＣＣメカニズムを通じて機能を実行できる機能的な誘導Ｔ系統細胞に分化できることは予想外であった。誘導Ｔ系統細胞で獲得したこのＡＤＣＣは、二重標的化、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法でよく発生する、低下若しくは消失したＣＡＲ－Ｔ標的抗原の発現、若しくはＣＡＲによる認識を回避する変異抗原の発現を伴って腫瘍が再発する、抗原エスケープを救済するためのアプローチとして更に使用できる。当該誘導Ｔ系統細胞が、外因性ＣＤ１６（機能的バリアント及びＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを含む）発現を介して獲得したＡＤＣＣを含み、抗体が、ＣＡＲが標的とする腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用してＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的腫瘍の再発又は再発を軽減又は防止できる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減及び／又は防止するこのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用できる。

したがって、本発明の実施形態は、本明細書で提供されるＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲに加えて外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む、誘導Ｔ系統細胞を含む、遺伝子操作された免疫細胞及び誘導細胞を提供する。いくつかの実施形態では、誘導Ｔ系統細胞に含まれる外因性ＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含むＣＤ１６外部ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの他の実施形態では、誘導Ｔ系統細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４から誘導される完全長若しくは部分長の外部ドメインを含むか、又は非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。本明細書で説明されているように、そのような誘導Ｔ系統細胞は、抗体の治療効果を高めるためにＡＤＣＣによって媒介されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得されたメカニズムを有する。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、誘導Ｔ系統細胞又はその集団を含む遺伝子操作された免疫細胞及び誘導細胞を提供する。

本出願において更に提供されるのは、これらに限定されないがＴＣＲ^ｅｘｏ、ＣＡＲ及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。

４．エンゲージャー
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ並びに任意選択でＣＡＲ及び／若しくは外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含むｉＰＳＣ並びにその誘導エフェクター細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ及び／又はＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャー（すなわち、第２の腫瘍抗原）の導入された発現を更に含み得る。エンゲージャーは、異なる抗体若しくはその断片の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は他の機能的バリアントを含む融合タンパク質であり、エフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体に結合する少なくとも１つのｓｃＦｖ、及び標的細胞特異的表面分子を介して標的細胞に結合する少なくとも別のｓｃＦｖを有する。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、多重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャーが挙げられるが、これらに限定されない。このような二重特異性又は多重特異性エンゲージャーは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。いくつかの実施形態では、操作されたｉＰＳＣ誘導のエフェクター細胞によって発現されるエンゲージャーは、エンゲージャーによって認識され、かつ結合される表面分子を含むバイスタンダー免疫細胞に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む操作されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞によって発現されるエンゲージャーは、誘導エフェクター細胞に結合し、ＣＡＲ抗原とは異なる腫瘍抗原に結合する際に誘導エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む操作されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞によって発現されるエンゲージャーは、エフェクター細胞の内因性表面分子を介して誘導エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む操作されたｉＰＳＣ誘導のエフェクター細胞によって発現されるエンゲージャーは、エフェクター細胞の外因性表面トリガー受容体を介して誘導エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、エンゲージャーを発現するエフェクター細胞の外因性表面トリガー受容体は、本明細書において更に提供されるようなＣＦＲ（キメラ融合受容体）を含む。

いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、すなわちｉＰＳＣを操作し、任意選択でソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクを作成し、次いでＴ細胞、ＮＫ細胞又はソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型を含む他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。

このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、次いで、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることもできる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、異なるユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、同じユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、１つの特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープと、を含むか、又はその逆であり、表面トリガー受容体は、エンゲージャーの抗エピトープを認識可能若しくは特異的なエピトープを含む。例えば、二重特異性エンゲージャーは、一方の端が表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端が腫瘍抗原に特異的である。

二重特異性若しくは多重特異性エンゲージャー認識、又はカップリング、又は結合に使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又は本明細書に開示されるその任意の機能的バリアント若しくはキメラＦｃ受容体形態が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、本明細書に記載されるようにＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む）又はＣＤ６４細胞外ドメイン、及び天然又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面に発現するＣＤ１６は、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列から誘導され、任意選択でＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む。

二重特異性又は多重特異性エンゲージャー認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性エンゲージャーは、ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的な二重特異性抗体（ＣＤ３×ＣＤ１９又はＣＤ３－ＣＤ１９）であり、別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ３３である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＥｐＣＡＭである。エフェクター細胞上のＣＤ１６に結合するために、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０又はＣＤ６４－ＣＤ３０を含む。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡ又はＣＤ６４－ＢＣＭＡを含む。更に別の実施形態では、二重特異性抗体は更に、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間にリンカーを含み、例えば、改変ＩＬ１５は、エフェクター細胞増殖／自律性を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカー（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、又は三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる）として使用され得る。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥｐＣＡＭ又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥｐＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－Ｂ７Ｈ３、又はＣＤ６４－ＩＬ１５－Ｂ７Ｈ３である。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。更に別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。ＴｒｉＫＥにおけるＩＬ１５はまた、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１を含むが、これらに限定されない、他のサイトカインに由来し得る。

いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹＥＳＯ１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び様々な病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的である第１の結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性又は多重特異性のエンゲージャーのための表面トリガー受容体は、ときには細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、表１に列挙された遺伝子型を含むｉＰＳＣを更に操作し、ソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含むエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるようなエンゲージャーを発現するゲノム操作されたエフェクター細胞の代替として、エンゲージャーは、状態、疾患、又は適応症（上記のような）に関連する１つ以上の抗原を標的とする併用療法組成物においてエフェクター細胞と共に治療剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、多重特異性キラー細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、複数の免疫細胞型と適合するユニバーサルエンゲージャーである。いくつかの実施形態では、併用療法又はそのために使用される組成物中のエンゲージャーは、組成物のレシピエントにおける腫瘍殺傷のためにバイスタンダー免疫細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、併用療法又はそのために使用される組成物中のエンゲージャーは、併用療法組成物中に含まれるエフェクター細胞を活性化する。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な併用療法組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供されるＣＡＲを少なくとも含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物のｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物のｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＮＫ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物のｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含むＴ系統細胞を含む。

したがって、本明細書で提供される機能的モダリティを含む遺伝子操作された免疫細胞に加えて、本発明の諸実施形態は、本明細書で提供されるＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲと、任意選択で外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＴＣＲ^ｅｘｏ、又はエンゲージャーのうちの１つ以上と、を含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を提供する。本出願において更に提供されるのは、エンゲージャーを含むがこれに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。

５．細胞表面ＣＦＲ（キメラ融合受容体）
ＣＦＲの実装は、エフェクター細胞が、ＣＦＲを発現するエフェクター細胞の治療特性を増強するために選択されたアゴニストとのＣＦＲ結合を介して適切なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にする。このような増強されたエフェクター細胞治療特性としては、活性化及び細胞傷害性の増加；二重標的化能力の獲得；持続性の延長；輸送及び腫瘍浸透の改善；バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位にプライミング、活性化又は動員する能力の増強；免疫抑制に抵抗する能力の増強；腫瘍抗原エスケープをレスキューする能力の改善；並びに／又は細胞シグナル伝達フィードバック、代謝及びアポトーシスの制御；が挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、様々な態様では、ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント及びエンゲージャーのうちの１つ以上と、を含むｉＰＳＣ及び誘導細胞は、内部ドメインに作動可能に接続された膜貫通ドメインに融合された外部ドメインを一般に含むＣＦＲを更に含み得、ＣＦＲは、外部ドメイン、膜貫通ドメイン若しくは内部ドメインのいずれにおいてもＥＲ（小胞体）保持シグナル又はエンドサイトーシスシグナルを有さない。ＣＦＲの外部ドメインは、エンゲージャーに結合する際、シグナル伝達を開始するためのものであり、膜貫通ドメインは、ＣＦＲの膜固定のためのものであり、内部ドメインは、エフェクター細胞治療特性（腫瘍殺傷、持続性、移動性、分化、ＴＭＥ中和、及び／又は制御されたアポトーシスが挙げられるが、これらに限定されない）を増強するために選択されるシグナル伝達経路を調節する（すなわち、活性化又は不活性化する）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲからのＥＲ保持シグナルの排除は、発現された場合のＣＦＲの細胞表面提示を可能にし、一方、ＣＦＲからのエンドサイトーシスシグナルの排除は、ＣＦＲ内在化及び表面下方制御を減少させる。ＥＲ保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも有さないドメイン成分を選択するか、又は分子工学ツールを用いてＣＦＲの選択された成分からＥＲ保持シグナル若しくはエンドサイトーシスシグナルを排除することが重要である。加えて、本明細書で提供されるＣＦＲのドメインは、モジュール式であり、これは、ＣＦＲの所与の内部ドメインについて、ＣＦＲの外部ドメインが、当該ＣＦＲと共に使用される選択されたアゴニスト、例えば、抗体、ＢｉＴＥ、ＴＲｉＫＥ、又は任意の他のタイプのエンゲージャーの結合特異性に応じて切り替え可能であること、所与の外部ドメイン及び特異性マッチングアゴニストについて、内部ドメインが、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能であることを意味する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＦＲの外部ドメインは、細胞－細胞シグナル伝達又は相互作用に関与するタンパク質の細胞外部分の完全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアント若しくはこれらの組み合わせ及びキメラの細胞外部分の完全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、少なくともアゴニスト、例えば、ＣＦＲの外部ドメインに含まれるエピトープに特異的な結合ドメインを含む抗体又はエンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ）によって認識される。いくつかの実施形態では、ＣＦＲ発現細胞と共にアゴニストとして使用される抗体又はエンゲージャーは、ＣＦＲの少なくとも１つの細胞外エピトープに結合し、ＣＦＲは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアント若しくはこれらの組み合わせた／キメラ形態の細胞外部分の完全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、又はＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原を認識する。特定の実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ外部ドメインから排除若しくは排除される。

いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の完全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャーを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＣＤ３ベースのアゴニストは、ＣＤ３×ＣＤ１９、ＣＤ３×ＣＤ２０、ＣＤ３×ＣＤ３３、ＣＤ３×ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３×Ｂ７Ｈ３、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ＲＯ６９５８６８８、ＡＦＭ１１、ＭＴ１１０／ＡＭＧ１１０、ＭＴ１１１／ＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ－５６５、ＡＭＧ３３０、ＭＴ１１２／ＢＡＹ２０１０１１２、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、及び／又はＦＢＴＡ０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストを利用するために、ＮＫＧ２Ｃ若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の完全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャーを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストは、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ１９、及び／又はＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ２０を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ２８ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ２８若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の完全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャーを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＣＤ２８ベースのアゴニストは、１５Ｅ８、ＣＤ２８．２、ＣＤ２８．６、ＹＴＨ９１３．１２、３７．５１、９Ｄ７（ＴＧＮ１４１２）、５．１１Ａ１、ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０、及び／又は３７４０７のうちの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ１６、ＣＤ６４、若しくはそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の完全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャーを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストは、ＩｇＧ抗体、又はＣＤ１６若しくはＣＤ６４ベースのエンゲージャーを含む。ＩｇＧ抗体のＦｃ部分がＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのＣＦＲに結合する場合、それは、ＣＦＲの内部ドメインに含まれるシグナル伝達ドメインによって付与される他の増強された治療特性と共に、ＣＦＲ発現細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する。これらに限定されないが抗体又はエンゲージャーを含む、非限定的な例示的ＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストは、ＣＤ１６×ＣＤ３０、ＣＤ６４×ＣＤ３０、ＣＤ１６×ＢＣＭＡ、ＣＤ６４×ＢＣＭＡ、ＣＤ１６－ＩＬ－Ｂ７Ｈ３、ＣＤ６４－ＩＬ－Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１６－ＩＬ－ＥｐＣＡＭ又はＣＤ６４－ＩＬ－ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１６－ＩＬ－ＣＤ３３又はＣＤ６４－ＩＬ－ＣＤ３３のうちの少なくとも１つを含み、ＴｒｉＫＥに含まれる「ＩＬ」は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態を含む少なくとも１つのサイトカインの全て又は一部を含む。

一般に、膜貫通ドメインは、生体膜（例えば、細胞又は細胞小胞の膜）のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣＦＲの膜貫通ドメインは、単一のαヘリックス、いくつかの膜貫通αヘリックスの安定した複合体、膜貫通βバレル、グラミシジンＡのβヘリックス、又はこれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、ＣＦＲの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」若しくは「膜タンパク質」の全て又は一部を含む。本明細書で使用する場合、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に、かつ／又は膜内に位置するタンパク質である。本発明のＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに適した膜貫通タンパク質の例としては、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＳ１、ＣＴＬＡ－４、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、Ｔ細胞受容体ポリペプチド（ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβなど）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、又はこれらの任意の組合せの膜貫通ドメインの全部又は一部を含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はこれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ、グリコホリンＤ又はこれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部を含む。ＣＦＲ膜貫通ドメインの特定の実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作を使用して排除される。様々な実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ膜貫通ドメインから排除若しくは排除される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４の膜貫通ドメインの全部又は一部を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインは、選択された細胞内シグナル伝達経路を活性化する少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲ内部ドメインの様々な実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してそこから排除若しくは排除される。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、少なくとも１つの細胞傷害性ドメインを含む。いくつかの他の実施形態では、内部ドメインは、任意選択で、細胞傷害性ドメインに加えて、共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、内部ドメイン（又は細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＳ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、若しくはＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの傷害性ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、若しくはＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含む。一実施形態では、ＣＦＲの傷害性ドメインは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、改変ＣＤ３ζを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメインに加えて共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に適した共刺激ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄ若しくはこれらの任意の組み合わせのポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはこれらの組み合わせのポリペプチドの完全長又は少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ２８の共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ（「２８ζ」とも称される）の細胞傷害性ドメインを含む内部ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインに加えて、持続性シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に適した持続性シグナル伝達ドメインとしては、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、又はこれらの組み合わせなどのサイトカイン受容体の内部ドメインの全部又は一部が挙げられるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインは、腫瘍細胞制御を提供するためのＥＧＦＲなどの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、又は制御された細胞死能力を提供するためのＦＡＳなどの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の完全な又は部分的な細胞内部分を含み得る。

様々な実施形態では、例示的ＣＦＲは、ＣＤ３サブユニットＣＤ３ε、ＣＤ３δ、若しくはＣＤ３γ、又はＣＤ２８；ＣＤ２８、ＣＤ８、又はＣＤ４の膜貫通ドメイン；並びにＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、又はＣＤ２８の内部ドメインのうちの少なくとも１つの細胞外部分を含み、外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び／若しくは内部ドメインにおけるＥＲ保持モチーフ並びに／又はエンドサイトーシスモチーフが排除されている。様々な実施形態では、本明細書で提供されるＣＦＲは、ＣＦＲ外部ドメインのＮ末端にシグナルペプチドを更に含む。

いくつかの例示的な実施形態では、ＣＦＲは、１つのＣＤ３サブユニットの外部ドメインを含み、いくつかの他の実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ３δ又はＣＤ３γの外部ドメインと連結されたＣＤ３εの外部ドメインを含む単鎖ヘテロ二量体外部ドメインを含む。単鎖ヘテロ二量体外部ドメインにおけるリンカーのタイプ及び長さは、変動し得る。

本明細書に記載される様々なコンストラクト中の細胞表面発現ＣＦＲ（ＣＤ３ベースのＣＦＲを含み、いくつかの文脈においてｃｓ－ＣＤ３とも称される）は、選択された結合特異性を有する分子と結合するための細胞表面トリガー受容体として機能することができ、この分子には、抗体、エンゲージャー、及び／又はＣＡＲが含まれる。エフェクター細胞の細胞表面発現ＣＦＲはまた、エフェクター細胞によって発現されるエンゲージャーと共に機能し得る。ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は本発明の１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、ヒト細胞及び非ヒト細胞、多能性細胞若しくは非多能性細胞、免疫細胞若しくは免疫調節細胞、ＡＰＣ（抗原提示細胞）若しくはフィーダー細胞、初代供給源（例えば、ＰＭＢＣ）由来の細胞、又は培養若しくは操作された細胞（例えば、細胞株、細胞、及び／又はｉＰＳＣから分化した誘導細胞）由来の細胞を含む、任意のタイプの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、初代若しくは誘導ＣＤ３４^＋細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、又はＢ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む誘導細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣを分化させることから得られるエフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む誘導エフェクター細胞は、ｉＰＳＣから誘導エフェクター細胞を生成した後に、ＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、エンゲージャー、及び／又は１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上を組み込むように誘導エフェクター細胞を操作することから得られる。

更に提供されるように、ＴＣＲ^ｅｘｏ、並びに任意選択でＣＡＲ、任意選択でエンゲージャー、及び／若しくは１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又はその集団は、本明細書に記載される、かつ／又は表１に示される１つ以上の更なる操作されたモダリティを更に含み得る。本出願において更に提供されるのは、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質なエフェクター細胞を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。

６．外因的に導入されたサイトカイン及び／又はサイトカインシグナル伝達
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらの対応する受容体のうちの１つ以上の部分長又は完全長ペプチドを含むシグナル伝達複合体が細胞に導入され、可溶性サイトカインを投与せずにリンパ球自律性を達成するために、サイトカイン自体の発現を伴って又は伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にしてもよく、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖（growth）、増殖（proliferation）、増殖（expansion）、及び／若しくはエフェクター機能を維持又は改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び／又はそのそれぞれの天然若しくは改変された受容体（シグナル伝達複合体）は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。

ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１を含むが、これらに限定されない、サイトカインのシグナル伝達のためのタンパク質複合体を細胞に導入するための様々なコンストラクト設計が、本明細書において提供される。シグナル伝達複合体がＩＬ１５に対するものである実施形態では、膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対してネイティブであり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５が膜結合されるのを確保する。他の実施形態では、切断された細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、加えて、シス提示及び／又はその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される他の潜在的なシグナル伝達経路を排除する。更に他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、ＩＬ１５を持つエフェクター細胞の自律的特徴に悪影響を与えることなく省略することができる。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒα全体が本質的に削除されるが、一端でＩＬ１５と融合し、他端で膜貫通ドメインと融合し（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）、任意選択でＳｕｃｈｉドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーがあるＳｕｓｈｉドメインは例外である。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。したがって、ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含む、ＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達が排除される。

他の実施形態では、天然又は改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合及びトランス提示を維持する。他の実施形態では、天然又は改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達及び膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣはまた、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマ又はＩＬ２ＲＧとしても知られている。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１受容体を含むが、これらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。他の実施形態では、ＩＬ１５の不存在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。

シグナル伝達複合体がＩＬ７に対するものである実施形態では、様々な設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対してネイティブであり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換され得る。いくつかの実施形態では、天然（又は野生型）又は改変されたＩＬ７Ｒは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合され得、構成的シグナル伝達を可能にし、膜結合及び膜結合ＩＬ７を維持する。

一実施形態では、上記のような天然又は改変された共通受容体γＣは、構成的及び膜結合サイトカインシグナル伝達複合体のためのリンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合される。別の実施形態では、ＩＬ７の不存在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ７Ｒは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに同様に有用である。

したがって、様々な実施形態では、サイトカインＩＬ１５若しくはＩＬ７及び／又はこれらの受容体は、上記のコンストラクト設計のうちの１つ以上を使用してｉＰＳＣに導入されてもよく、ｉＰＳＣ分化時にその誘導細胞に導入されてもよい。人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）に加えて、本明細書に開示される少なくとも１つの操作されたモダリティを含むクローンｉＰＳＣ、クローンｉＰＳ細胞株又はｉＰＳＣ誘導細胞が提供される。更に提供されるのは、本項目に記載の細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分ペプチド又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を少なくとも有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。

ＣＡＲと外因性サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体シグナル伝達（シグナル伝達複合体、又は「ＩＬ」）の両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの誘導細胞では、ＣＡＲとＩＬは別々のコンストラクトで発現され得るか、ＣＡＲとＩＬの両方を含むバイシストロニックなコンストラクトで共発現され得る。いくつかの更なる実施形態では、シグナル伝達複合体は、自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現コンストラクトの５’末端又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬシグナル伝達複合体（例えば、ＩＬ７シグナル伝達複合体）及びＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内にあり得る。一実施形態では、シグナル伝達複合体は、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲコンストラクトに含まれる。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲが発現される場合、自己切断２Ａペプチドは、発現されたＣＡＲ及びＩＬが解離することを可能にし、次いで、解離したＩＬは、膜貫通ドメインが細胞膜に固定された状態で細胞表面に提示され得る。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲのバイシストロニックな設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のＯＲＦの発現のための誘導可能なプロモーター又は時間的若しくは空間的特異性を持つプロモーターを組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、ＣＡＲとＩＬシグナル伝達複合体の協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、及びブタテシオウイルス－１（ＰＴＶ－１）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などのアフトウイルス属、並びにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）及び脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含む、ピコルナウイルス科のメンバーで見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶから誘導される２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれることもある。

本明細書に開示されるバイシストロニックなＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲの実施形態はまた、本明細書で提供される他の任意のサイトカイン又はサイトカインシグナル伝達複合体、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１の発現も企図される。いくつかの実施形態では、バイシストロニックなＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１のうちの１つ以上の発現のためのものである。

ＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲの両方、任意選択でエンゲージャー、並びに細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはそのサイトカイン受容体の部分ペプチド又は完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を含むｉＰＳＣ及びそれからの誘導細胞において、ｉＰＳＣ及び誘導細胞は、ＣＦＲ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＣＤ３８陰性、ＨＬＡ－Ｉ及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、並びに／又はＨＬＡ－Ｇのうちの１つ以上を更に含み得る。

いくつかの実施形態では、表１の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその誘導エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊；又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体、及び二重特異的若しくは多重特異的若しくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御を更に含んでもよい。

７．ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの欠損
同種拒絶の問題を回避するために、複数のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書で提供されるのは、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩタンパク質の両方の発現が排除又は実質的に減少したｉＰＳＣ細胞株及びそれから分化したその誘導細胞である。ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、又はベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失若しくは破壊によって達成できる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍ陰性細胞は、ＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡクラスＩＩ関連遺伝子の機能的欠失又は破壊によって達成できる。ＣＩＩＴＡは、転写コアクチベーターであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を通じて機能する。ＣＩＩＴＡ陰性細胞は、ＨＬＡ－ＩＩ欠損である。本明細書で提供されるのは、ＨＬＡ－ＩとＨＬＡ－ＩＩ両方の欠損を持つ、例えばＢ２ＭとＣＩＩＴＡ両方の発現がないｉＰＳＣ株及びその誘導細胞であり、取得された誘導エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）マッチングの必要性を排除して宿主の（同種異系）Ｔ細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。

一部の細胞型では、ＨＬＡクラスＩ発現の欠如がＮＫ細胞による溶解を引き起こす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを任意選択でノックインして、操作されたｉＰＳＣから誘導されるＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識と殺傷を回避できる。一実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその誘導細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインを更に含む。いくつかの実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその誘導細胞は、ＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。ＣＤ５８（又はＬＦＡ－３）及びＣＤ５４（又はＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む、細胞の遊走を促進する接着タンパク質である。ＣＤ５８ノックアウトは、ＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞活性化の低減において高い効率を有するが、一方、ＣＤ５８及びＣＤ５４の両方の二重ノックアウトは、ＮＫ細胞活性化の最も増強された低減を有することが示された。いくつかの観察では、ＣＤ５８及びＣＤ５４二重ノックアウトは、「自己喪失」効果を克服することにおいて、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりも更に効果的である。

本明細書で提供されるように、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその誘導細胞は、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその誘導細胞は、ＣＤ５８陰性である。いくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその誘導細胞は、ＣＤ５４陰性である。更にいくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその誘導細胞は、ＣＤ５８陰性かつＣＤ５４陰性である。

更に、ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、１つ以上のＣＦＲ、エンゲージャー、並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはそのサイトカイン受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体のうちの１つ以上と、を含む、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ並びにそれらの誘導細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、１つ以上のＣＦＲ、エンゲージャー、並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはそのサイトカイン受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体のうちの１つ以上と、を含む、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ並びにそれらの誘導細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５８陰性である。ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、１つ以上のＣＦＲ、エンゲージャー、並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはそのサイトカイン受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体のうちの１つ以上と、を含む、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ並びにそれらの誘導細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５４陰性である。ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、１つ以上のＣＦＲ、エンゲージャー、並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはそのサイトカイン受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体のうちの１つ以上と、を含む、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ並びにそれらの誘導細胞の更にいくつかの他の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５８陰性及びＣＤ５４陰性の両方である。

本出願において更に提供されるのは、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損を含むがこれに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。

８．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方から誘導される多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これにより癌細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的な標的となっている。抗体を介した癌細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクターメカニズムには、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）も含まれ得る。

ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞にも発現する。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４^＋幹細胞、並びにリンパ系、赤血球系、及び骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、並びに形質細胞期まで続く成熟の最終段階で発現する。ＩＩ型膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３８は、受容体及びヌクレオチド代謝産物の産生に関与する多機能酵素の両方として細胞機能を果たす。酵素として、ＣＤ３８は、ＮＡＤ^＋からＡＤＰ－リボースへの合成と、反応の加水分解とを触媒し、これによって、カルシウム依存性である、細胞接着のプロセスに重要である、小胞体とリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲとＮＡＡＤＰを生成する。ＣＤ３８は、受容体としてＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞のサイトカイン放出と細胞傷害性を調節する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ^２＋フラックスを調節し、リンパ系及び骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介することも報告されている。

悪性腫瘍の治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞を全身的に使用すると、ＣＤ３４^＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞のＣＤ３８^＋画分が溶解し、レシピエントの免疫エフェクター細胞機能が損なわれるため、治療応答が不完全になり、効力が低下又は排除される。更に、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄と末梢血の両方でＮＫ細胞の減少が観察されたが、Ｔ細胞やＢ細胞などの他の免疫細胞型は、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆｅｔａｌ．，ＢｌｏｏｄＡｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に束縛されるものではないが、本出願は、ＣＤ３８特異的抗体及び／又はＣＤ３８抗原結合ドメインが誘導する兄弟殺しを通じたエフェクター細胞の枯渇又は減少を克服することにより、ＣＤ３８標的化癌治療の潜在能力を最大限に活用する戦略を提供する。更に、ＣＤ３８は、Ｔ細胞やＢ細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、同種異系エフェクター細胞のレシピエントでダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、これらのエフェクター細胞に対する同種拒絶反応を減少させる、かつ／又は防ぎ、それによってエフェクター細胞の生存率と持続性を増加させる。

このように、本出願はまた、レシピエントＴ細胞及びＢ細胞の活性化に対するＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャー又はＣＤ３８ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用する（すなわち、多くの場合、養子細胞移植の前の、活性化したＴ細胞及びＢ細胞のリンパ球の枯渇化）ことによる同種拒絶反応の低減又は防止を通じてエフェクター細胞の持続性及び／又は生存率を増強する戦略を提供する。具体的には、本明細書において提供される戦略は、ＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ株、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンＣＤ３８陰性ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクを作製することと、操作されたｉＰＳＣ株の指向性分化を通じてＣＤ３８陰性（ＣＤ３８^ｎｅｇ）誘導エフェクター細胞を得ることと、を含み、誘導エフェクター細胞は、ＣＤ３８標的化治療部分がエフェクター細胞と共に用いられる場合、他の利点の中でもとりわけ、兄弟殺し及び同種拒絶反応から保護される。加えて、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞区画に悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を著しく枯渇させる。ＣＤ３８陰性誘導細胞は、ＣＤ３８抗体媒介性枯渇に抵抗する能力を有し、毒性コンディショニング剤を使用せずに抗ＣＤ３８抗体又はＣＤ３８－ＣＡＲと組み合わせて有効に投与することができ、したがって化学療法に基づくリンパ球枯渇を低減する、かつ／又は置換することができる。

本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８陰性ｉＰＳＣ株は、少なくともＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲと、任意選択でＣＦＲ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントのうちの１つ以上とを更に含み、本明細書に記載され、表１に示されるような１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含んでもよく、当該ｉＰＳＣは、これらに限定されないが、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４^＋造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、共通骨髄前駆細胞、共通リンパ前駆細胞、赤血球、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、並びに初代ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特徴を有する誘導免疫エフェクター細胞を含む、免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されない機能的誘導造血細胞を産生するように指向性分化することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体を使用してＡＤＣＣを誘導するか、又は抗ＣＤ３８ＣＡＲを標的化細胞殺傷に使用する場合、ＣＤ３８^ｎｅｇｉＰＳＣ及び／又は誘導エフェクター細胞は抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３８ＣＡＲ又はレシピエント活性化Ｔ若しくはＢ細胞によって排除されず、これにより、そのような治療部分の存在下で、かつ／若しくは曝露後のｉＰＳＣ及びそのエフェクター細胞の持続性並びに／又は生存率を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療部分の存在下で、かつ／若しくは曝露後のｉｎｖｉｖｏでの持続性並びに／又は生存率を増加させる。

９．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ株及びｉＰＳＣ誘導細胞
上記を踏まえて、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらの集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる誘導エフェクター細胞を提供し、各細胞は、少なくともＴＣＲ^ｅｘｏをコードするポリヌクレオチド及び任意選択でＣＡＲを含み、細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞、免疫細胞、又はフィーダー細胞である。更に提供されるのは、本明細書に記載するような表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導細胞は、これらに限定されないが、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４^＋造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体を含み、並びに／又はＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージと特徴を共有する造血細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導造血細胞は、少なくともＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む。本明細書で更に提供されるのは、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらのクローン集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる誘導機能的細胞であり、各細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲ、並びに任意選択でＣＦＲ；外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント；サイトカイン及び／若しくはその受容体若しくはそのバリアントを含むサイトカインシグナル伝達複合体；ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損；ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト；並びにＣＤ３８ノックアウトのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含み、ｉＰＳＣは、機能的誘導造血細胞を産生するように指向性分化することができる。いくつかの実施形態では、機能的誘導造血細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、機能的誘導免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞と特徴を共有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞と特徴を共有する機能的誘導免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞又はＴ細胞ではない。

ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらのクローン集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる誘導機能的細胞のいくつかの実施形態では、各細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含み、細胞は、内因性ＴＣＲ^ｎｅｇである。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ^ｎｅｇ」は、ＴＣＲ陰性、ＴＣＲ^－／－、「ＴＣＲｎｕｌｌ」、又はＴＣＲノックアウトとも称され、それは、自然に（例えば、ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞）、ｉＰＳＣ細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ））若しくは内因性ＴＣＲ若しくはその１つ以上のサブユニットをノックアウトするためのＴ細胞の遺伝子発現調節若しくはゲノム編集によって、又はＴＣＲノックアウトを有するｉＰＳＣから分化したＴＣＲ陰性誘導細胞を得ることによって、内因性ＴＣＲ発現を有さない細胞を含む。したがって、本明細書に開示される細胞においてノックアウトされるＴＣＲは、内因性ＴＣＲ複合体である。細胞中のＴＣＲα又はＴＣＲβのいずれかの定常領域の発現を破壊することは、細胞の内因性ＴＣＲ複合体をノックアウトする多くの方法の１つである。ＴＣＲ^ｎｅｇ細胞は、ＴＣＲ^ｎｅｇ細胞における全てのＣＤ３サブユニットの発現にもかかわらず、ＣＤ３複合体を細胞表面に提示することができず、これは、細胞表面ＣＤ３認識、結合及び／又はシグナル伝達を必要とする細胞機能に悪影響を及ぼす。したがって、ＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含むＴＣＲ^ｎｅｇ細胞のいくつかの実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ３系である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ及び任意選択でＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＴＣＲ^ｎｅｇ細胞はまた、発現時に細胞表面ＣＤ３複合体、又はその１つ以上のサブユニット若しくはサブドメイン（ｃｓ－ＣＤ３）も含む。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーを含む細胞は、ＴＣＲの定常領域に挿入されたＣＡＲも含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーを含む細胞は、ＴＣＲ^ｎｅｇであり、ＴＣＲの定常領域に挿入されたＣＡＲを含み、ＣＡＲの発現は、内因性ＴＣＲプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーを含む細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、ＩＬ２１、又はこれらの任意の組み合わせの外因性サイトカインシグナル伝達も含む。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、細胞膜に結合している。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインシグナル伝達は、サイトカイン及び／若しくはそのそれぞれの受容体若しくはその変異した若しくは切断されたバリアントの導入された部分的又は完全なペプチドを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカインシグナル伝達の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、又はｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ４シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ７シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ９シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ１５シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、外因性細胞表面サイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２１シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択でエンゲージャーを含む細胞は、外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアント若しくはキメラ受容体を更に含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４の外部ドメインの完全長又は部分長を含む。いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、キメラＦｃ受容体を含む。外因性ＣＤ１６は、ＡＤＣＣによる細胞殺傷を可能にし、それによって、例えば、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞に二重標的メカニズムを提供する。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーを含む細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを更に含む。細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方から誘導される多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これにより癌細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的な標的となっている。ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞にも発現する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８^－／－であるエフェクター細胞は、ＣＤ３８誘導性兄弟殺しを回避することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体、ＣＤ３８結合ＣＡＲ、又は抗ＣＤ３８ｓｃＦＶを含むＣＤ３エンゲージャーを使用して、ＡＤＣＣ及び／又は腫瘍細胞標的化を誘導する場合、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣ及び／又はその誘導エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除、すなわちＣＤ３８発現エフェクター細胞の減少又は枯渇を引き起こさずに、ＣＤ３８発現（腫瘍）細胞を標的化することができ、それによってｉＰＳＣとそのエフェクター細胞の持続性及び／又は生存率を増加させる。

ＴＣＲ^ｅｘｏをコードするポリヌクレオチド、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損（例えば、Ｂ２Ｍノックアウト及び／又はＣＩＩＴＡノックアウト）、並びに任意選択でＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドを更に含む。ＴＣＲ^ｅｘｏをコードするポリヌクレオチド、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損（例えば、Ｂ２Ｍノックアウト及び／又はＣＩＩＴＡノックアウト）、並びに任意選択でＣＤ５８及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。

上記を考慮して、本明細書で提供されるのは、ＴＣＲ^ｅｘｏをコードするポリヌクレオチド、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でエンゲージャーをコードするポリヌクレオチド、更に任意選択で、ＴＣＲ^ｎｅｇ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＦＲ、細胞表面発現外因性ＩＬを含むシグナル伝達複合体、ＣＤ３８ノックアウト及びＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ、２つ、３つ、若しくはそれ以上、又は全てを含むｉＰＳＣであり、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇ、あるいはＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方をコードするポリヌクレオチドが任意選択で導入され、ｉＰＳＣは、機能的誘導造血細胞を産生するように指向性分化することができる。

したがって、本出願は、表１の以下の遺伝子型のいずれか１つを含む、ｉＰＳＣ及びその機能的誘導造血細胞を提供する。また本明細書に提供されるのは、ｉＰＳＣの分化能及び誘導エフェクター細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく、表１の以下の遺伝子型のいずれか１つを含む、すなわち、ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲと、エンゲージャー（表１の「Ｅｇ」）及びＣＦＲの一方又は両方と、任意選択で、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、細胞表面発現外因性ＩＬを含むシグナル伝達複合体、ＣＤ３８ノックアウト、並びにＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損のうちの１つ以上と、を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクである。当該細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、既製の操作された均質な細胞療法産物を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。外因性ポリヌクレオチドのいずれか１つの挿入部位に応じて、操作されたエフェクター細胞は、内因性ＴＣＲ発現で陰性であり得る。更に、操作されたエフェクター細胞がＮＫ細胞系統のものである場合、細胞もＴＣＲ陰性である。

表１に提供される「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体又は組み合わせ発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１のうちの１つを表し、ＩＬ７が選択される場合、ＩＬは、ＩＬ７Ｒα及びＩＬ７Ｒβを含むＩＬ７を表す。同様に、ＩＬ１５が選択される場合、ＩＬは、ＩＬ１５Ｒα及びＩＬ１５Ｒβを含むＩＬ１５を表す。いくつかの実施形態では、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体は、自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの共発現、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断又は排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質（共通受容体γＣは天然型又は改変型である）、及びＩＬ１５Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体は、自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ７とＩＬ７Ｒαの共発現、ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、ＩＬ７Ｒαの細胞内ドメインが切断又は排除されたＩＬ７／ＩＬ７Ｒα融合タンパク質、ＩＬ７とＩＬ７Ｒβとの融合タンパク質、ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質（共通受容体γＣは天然型又は改変型である）、及びＩＬ７Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む。

更に、ｉＰＳＣとその機能的誘導造血細胞がＣＡＲとＩＬの両方を含む遺伝子型を有する場合、ＣＡＲとＩＬは、任意選択で２Ａ配列を含むバイシストロニックな発現カセットに含まれ得る。対照的に、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬは、ｉＰＳＣ及びその機能的誘導造血細胞に含まれる別々の発現カセット中にある。

１０．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、若しくは適応症に関連する抗原を標的とする抗体又はその抗体断片を含む追加の治療剤を、ゲノム操作されたエフェクター細胞で発現されるのと比較して、これらのエフェクター細胞との併用療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、組み合わせ治療に適した抗体には、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ）、抗ＣＤ２２（イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ）、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）、抗ＧＤ２（ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（アベルマブ）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）、並びにそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に適した抗体には、標的細胞上の２つ以上の抗原若しくはエピトープを標的とするか、若しくは標的細胞を標的としながらエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ細胞）を標的細胞に向けて動員する、二重特異性抗体又は多重特異性抗体が更に挙げられる。このような二重特異性又は多重特異性抗体は、バイスタンダー免疫細胞（例えば、治療のレシピエントにおけるＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）であろうと治療用組成物中の操作されたエフェクター細胞であろうと、エフェクター細胞を腫瘍細胞に指向させ、腫瘍抗原の結合時に免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャーとして機能し、抗体治療の利益を最大化する大きな可能性を示している。エンゲージャーは、少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的であり、免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの表面トリガー受容体に特異的であり、これは、腫瘍抗原エスケープ及び腫瘍不均一性に対処するための、本明細書に開示される操作された細胞のための多重標的化アプローチを提供し得る。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャーが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、本明細書で提供される、少なくともＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、及び任意選択でＣＦＲを含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの他の実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくともＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、並びに任意選択でＣＦＲ及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントのうちの１つ以上を含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞と、を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、モノクローナル抗体と；少なくともＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、並びに任意選択でＴＣＲ^ｎｅｇ；外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント；ＣＦＲ；サイトカイン及び／又はその受容体若しくはそのバリアントを含む追加のサイトカインシグナル伝達複合体；並びにＣＤ３８ノックアウトのうちの１つ以上を含むｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞と、を含む。様々な実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６である。理論によって束縛されるものではないが、ｈｎＣＤ１６は、モノクローナル抗体の増強されたＡＤＣＣを提供するが、ＣＡＲは、特異的腫瘍抗原を標的化するだけでなく、異なる腫瘍抗原を標的化するモノクローナル抗体と組み合わせた二重標的化戦略を使用して腫瘍抗原エスケープも防止する。

いくつかの更なる実施形態では、ダラツムマブとの組み合わせに含まれるｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏと、任意選択でＣＡＲと、任意選択で外因性ＣＤ１６、ＩＬ７又はＩＬ１５のうちの１つ以上と、を含み、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とし、ＩＬ７又はＩＬ１５シグナル伝達複合体は、ＣＡＲと共発現されるか、又は別個に発現される。

１１．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御できる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子の発現又は遺伝子産物を減少させたり、チェックポイント分子の活性を低下させたりして、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ４を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。したがって、本出願の一態様は、ＣＩとの併用療法で本明細書で提供されるようにゲノム操作された機能的ｉＰＳＣ誘導細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。併用療法の一実施形態では、ｉＰＳＣ誘導細胞は、ＮＫ細胞である。併用療法の別の実施形態では、ｉＰＳＣ誘導細胞は、Ｔ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書で提供される誘導ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのＴ細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された誘導ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。

一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のためのｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞は、ＣＡＲと、任意選択でエンゲージャー発現、外因性ＣＤ１６発現、ＣＦＲ発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン及び／若しくは受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上と、を含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、誘導ＮＫ細胞は、表１に列挙された遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様では、上記の誘導エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊；又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異的若しくは多重特異的又はユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御を更に含む。

様々な実施形態では、誘導エフェクター細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ発現、ＣＡＲ発現、エンゲージャー発現、外因性ＣＤ１６発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、並びに外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上を含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で導入される。いくつかの態様では、上記のｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊；又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異的若しくは多重特異的若しくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御を更に含む。

本明細書で提供される誘導ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞との併用療法に適したチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ－３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ－３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ－４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（ＩｇＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用でき、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ、又は２つ、又は３つ、又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（抗ＫＩＲ）、ＩＰＨ４３（抗ＭＩＣＡ）、ＩＰＨ３３（抗ＴＬＲ３）、リリムマブ（抗ＫＩＲ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ）、ニボルマブ（抗－ＰＤ１ｍＡｂ）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ１ｍＡｂ）、及びそれらの誘導体、機能的同等物、又はそれらのバイオシミラーの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは、マイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＭｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイント拮抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、及びｍｉＲ－２９ｃを含むが、これらに限定されない。

提供されるｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞との併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的化する少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、ｉＰＳＣ誘導細胞は、表１に列挙された遺伝子型を有する。提供される誘導エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイント阻害剤及び表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態では、当該チェックポイント阻害剤は、抗体、又はヒト化若しくはＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーであり、当該チェックポイント阻害剤は、当該抗体、又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、ｉＰＳＣ誘導細胞により産生される。いくつかの実施形態では、抗体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、又はチェックポイントを阻害するその断片若しくはバリアントは、別個のコンストラクト又はＣＡＲと抗体若しくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロニックなコンストラクトのいずれかでＣＡＲと共発現される。いくつかの更なる実施形態では、抗体又はその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩ若しくはＣＩ－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現コンストラクトの５’末端又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、チェックポイント阻害剤とＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にあってもよい。チェックポイント阻害剤が送達され、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することができる誘導エフェクター細胞によってペイロードとして発現及び分泌されると、それは、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を打ち消し、ＣＡＲなどのモダリティを活性化するか、又は受容体を活性化することによって、エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、又は抑制性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を有する誘導細胞においてＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。他のいくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。

本明細書で提供されるｉＰＳＣ誘導細胞及びチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、ｉＰＳＣ誘導細胞によって、又はｉＰＳＣ誘導細胞内で産生されず、表１に列挙されている遺伝子型を持つｉＰＳＣ誘導細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。いくつかの実施形態では、提供される誘導ＮＫ細胞又は誘導Ｔ細胞との併用療法における１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時又は逐次的である。表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ誘導Ｔ細胞を含む併用治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、並びにそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びこれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーのうちの１つ以上である。表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ誘導Ｔ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ誘導Ｔ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表１に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞又は誘導Ｔ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。

ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座における標的化ゲノム編集の方法
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ）、又はゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃｅｄｉｔｉｎｇ）、又は遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにＤＮＡが挿入、欠失、及び／又は置換される一種の遺伝子工学のことを指す。標的化ゲノム編集（「標的化ゲノム編集」又は「標的化遺伝子編集」と互換可能である）は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、及び／又は置換を可能にする。標的化編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の欠失を伴うか又は伴わない、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメア領域及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変えたり、細胞の形質転換を促進したりする可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）などの事前に選択された遺伝子座に外来性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。

標的化編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、又はヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって実現できる。ヌクレアーゼに依存しない標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素メカニズムを介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって導かれる。

代替的に、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入により、より高い頻度で標的化編集を実現できる。このようなヌクレアーゼ依存の標的化編集は、ＤＳＢに応答して発生する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復メカニズムを利用する。外因性の遺伝物質を含むドナーベクターがない場合、ＮＨＥＪは少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）をしばしば引き起こす。対照的に、一対のホモロジーアームと隣接する外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在する場合、相同組換えによる相同指向性修復（ＨＤＲ）中に外因性遺伝物質がゲノムに導入され得、「標的化組み込み」がもたらされる。いくつかの状況では、標的化組み込み部位は、選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図され、したがって、標的化組み込みは、遺伝子発現を破壊し、１つの単一編集ステップにおいて同時ノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）をもたらし得る。

目的の遺伝子座（ＧＯＩ）における選択位置に１つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることを達成することができる。同時ノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）に適した遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化ホモロジーアームにより、導入遺伝子（複数可）が、部位の内因性プロモーター下又はコンストラクトに含まれる外因性プロモーター下のいずれかで発現されることが可能になる。２つ以上の導入遺伝子が、選択された位置（例えば、ＣＤ３８遺伝子座）に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、又はＴａＶから誘導される自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれる）をコードし、単一の翻訳から別々のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び／又は外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために、コンストラクトにインスレーターが含まれる。外因性プロモーターは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的若しくは細胞型特異的プロモーターであり得る。

特異的な標的化ＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）システムが含まれるが、これらに限定されない。更に、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）システムも、標的化組み込みのための有望なツールである。

ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な方法でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例には、Ｃ_２Ｈ_２ジンクフィンガー、Ｃ_３Ｈジンクフィンガー、及びＣ_４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、天然に存在しないドメインであり、その設計／構成は主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計と結合データの情報を格納するデータベースの情報を処理するための置換ルールとコンピュータ化アルゴリズムの適用に起因する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号、及び同第０３／０１６４９６号も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、その生産が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる天然では見られないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号及び同第７，９７２，８５４号で詳細に説明されており、それらの完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染時にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、反復可変残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置に多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮについては、米国特許公開第２０１１／０１４５９４０号に詳細に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへのＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。

本発明の方法で使用される標的化ヌクレアーゼの別の例は、標的化Ｓｐｏ１１ヌクレアーゼ、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。

本発明に適した標的化ヌクレアーゼの更なる例には、個別に又は組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が挙げられるが、これらに限定されない。

標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、及びｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連のヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。

例示的な例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な成分：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体とを必要とする。共発現すると、その２つの成分が複合体を形成し、ＰＡＭ及びＰＡＭ近位のシーディング領域（seeding region）を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、選択した配列を標的とするようにＣａｓ９を導くことができる。次いで、これら２つの成分は、トランスフェクション又は形質導入を介して哺乳動物細胞に送達できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ系を使用する場合、それは、選択された配列を標的化するようにＣｐｆエンドヌクレアーゼをガイドするために、（１）Ｃｐｆエンドヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１、ＭＡＤ７、及び当該技術分野において既知の更に多くのもの）及び（２）ｇＮＡ（これは、多くの場合、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない）を必要とする。

ＤＩＣＥを介した挿入は、例えば、ｐｈｉＣ３１とＢｘｂ１などのリコンビナーゼの対を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢ及びａｔｔＰ認識部位に厳しく制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的化ａｔｔ部位は哺乳動物のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位のゲノムに導入する必要がある。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたい。

本発明の一態様は、標的化ゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供する。一実施形態では、コンストラクトは、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームを更に含み、標的化組み込みの方法は、コンストラクトを細胞に導入して、細胞宿主酵素メカニズムによる部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入してＺＦＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入してＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセット及び所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入してＣａｓ９を介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含むコンストラクトを細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、ＤＩＣＥを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含む。

標的化組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内又は遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞又は生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座、又はゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質又は非コードＲＮＡの望ましいレベルを生成するために十分な導入遺伝子発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換しやすくしたり、細胞機能を変化させたりするものであってはならない。組み込み部位が、潜在的なセーフハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断されるような、調節エレメント又は遺伝子の破壊が存在しないこと、遺伝子密集領域内の遺伝子間領域、又は反対方向に転写された２つの遺伝子の間の収束位置であること、ベクターにコードされた転写活性化因子と、隣接する遺伝子、特に癌関連遺伝子及びマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離相互作用の可能性を最小限にする距離を保つこと、並びに遍在的な転写活性を示す、広範な空間的及び時間的発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるような、明らかに遍在的な転写活性を有すること。この後者の特徴は幹細胞で特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングと他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす。外因性挿入に適した領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素と保存された配列を欠き、ホモロジーアームの増幅用のプライマーを簡単に設計できるはずである。

ヒトゲノム編集、又は具体的には標的化組み込みに適した部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。更に、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログはまた、本明細書に開示される標的化組み込みの組成物及び方法を使用して挿入するための適切な部位であり得る。更に、コラーゲンとＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化組み込みのためのセーフハーバーとしても使用できる。しかしながら、選択した各部位の検証は、特定の組み込み事象のために特に幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列と配置及びコンストラクトの設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば必要である。

標的化されたインデルのために、編集部位はしばしばその発現及び／又は機能が破壊されることが意図されている内因性遺伝子に含まれている。一実施形態では、標的化されたインデルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節及び改変に関連する。他のいくつかの実施形態では、標的化インデルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び改変、あるいは幹細胞及び／又は前駆細胞、並びにそれらから誘導される細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を抑制するタンパク質に関連する。

したがって、本発明の別の態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、又は本明細書で提供されるような、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＲＡＣ、若しくはＣＤ３８遺伝子座などの継続的又は一時的な遺伝子発現について安全かつ十分に調節されていることがわかっている若しくは証明された事前に選択された遺伝子座における標的化組み込みの方法を提供する。一実施形態では、標的化組み込みの方法のためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい組み込み部位を含む。いくつかの実施形態では、標的化組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウン又はノックアウトが望まれる、１つ以上の遺伝子座にあり、そのような遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なホモロジーアームの対及び１つ以上の外因性配列を含むコンストラクトを導入して、細胞宿主酵素メカニズムによる部位特異的相同組換えを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。

別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＣａｓ９発現カセット、及びガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、ＤＩＣＥレコンビナーゼの対の１つ以上のａｔｔ部位を含むコンストラクトを細胞における所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入することと、ＤＩＣＥレコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥ媒介標的化組み込みを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。

更に、本明細書で提供されるように、セーフハーバーでの標的化組み込みのための上述の方法は、目的のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、並びに幹細胞及び／又は前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性並びに／又は生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、１つ以上のマーカー遺伝子を更に含む。一実施形態では、本発明のコンストラクト中の外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死のための好適な自殺遺伝子系としては、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）及びＡＰ１９０３；チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）及び５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。更に、一部の自殺遺伝子系は細胞型に特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０によるＴリンパ球の遺伝子改変は、ｍＡｂリツキシマブの投与時にそれらを排除することができる。更に、セツキシマブによって認識されるエピトープを含む改変されたＥＧＦＲは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３又は７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、及びＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化組み込みの方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化組み込みのためのコンストラクトに含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは誘導性又は構成的であり得、また時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本発明の方法に適した構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターは、ＣＡＧである。

本明細書に提供される方法によって組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位において、宿主ゲノム中の内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＡＡＶＳ１遺伝子座における１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨ１１遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるコラーゲン遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。更に別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムにおけるＨＴＲＰ遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置での正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。

いくつかの実施形態では、標的化組み込みの方法のためのコンストラクトに含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、同じプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含み、部分間の物理的分離を高め、酵素メカニズムへのアクセスを最大にする。リンカー配列のリンカーペプチドは、関連する機能に応じて、部分（外因性ポリヌクレオチド、及び／又はそこからコードされるタンパク質又はペプチド）間の物理的分離をより柔軟又はより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、プロテアーゼにより切断可能であり得るか、又は化学的に切断可能であり、別個の部分を生じ得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、及びトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるものであるか、又は外因的に導入される。代替的に、リンカー中の切断部位は、選択された化学物質又は状態、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、又は低ｐＨへの曝露時に切断され得る部位であり得る。任意のリンカー配列は、切断部位の提供以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であってもよい。更に、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない翻訳後改変を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体配座に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、及びセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主になっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０又は９０パーセント以上が、グリシン、アラニン、又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシング及びエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。更に、リンカー配列の好適なサイズ及び配列はまた、従来のコンピュータモデリング技術によって決定され得る。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。

標的化組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを細胞に導入する方法は、それ自体既知の細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、コンストラクトは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴｌ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達する、かつ／又は発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作に使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、又は置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれない。更に、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、相同指向性遺伝子標的化をはるかに高い割合で仲介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６又はＡＡＶ２ベクターを使用して、ｉＰＳＣのゲノム中の標的部位に挿入、欠失、又は置換を導入する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びそれらの誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得して維持する方法
一態様では、本発明は、１つ以上の所望の部位での１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得して維持する方法を提供し、標的化編集は、増殖されたゲノム操作されたｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ誘導非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位（複数可）で無傷で機能的であり続ける。標的化編集は、ｉＰＳＣとそこから誘導した細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び／又は置換を導入、すなわち、選択した部位での標的化組み込み及び／又はインデルを導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞の直接操作と比較して、本明細書で提供されるｉＰＳＣの編集及び分化を通じてゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を得ることの多くの利点としては、操作されたエフェクター細胞の供給源が無制限であること；特に複数の操作されたモダリティが関与する場合、エフェクター細胞の反復操作の必要がないこと；得られたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っていること；エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、並びに対立遺伝子変異、ランダム変異及び発現斑入りの欠如に関して均質であり、これは主に、本明細書において提供される操作されたｉＰＳＣにおけるクローン選択が可能であることに起因することを含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、１つ以上の選択された部位に１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（ＦＭＭ）として表２に示される細胞培養培地で長期間単一細胞として維持、継代、及び増殖され、ｉＰＳＣは、選択された部位（複数可）で標的化編集と機能改変（複数可）を保持する。培地の成分は、表２に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭ中で培養されたｉＰＳＣは、それらの未分化プロファイル、及び基底プロファイル又はナイーブプロファイル；培養洗浄又は選択を必要としないゲノム安定性を維持し続け、並びに胚様体又は単層（胚様体を形成しない）を介したｉｎｖｉｔｒｏ分化；及びテラトーマ形成によるｉｎｖｉｖｏ分化で３つの体細胞系列全てを容易に生じさせることが示されている。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１３４６５２号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で維持され、継代され、増殖され、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、又は本質的に含まず、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。

本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化編集を通じて、又は最初に標的化編集によりゲノム操作非多能性細胞を生成し、次に選択／分離されたゲノム操作非多能性細胞をリプログラミングして非多能性細胞と同じ標的化編集を含むｉＰＳＣを取得することを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明の更なる態様は、標的化組み込み及び／又は標的化インデルを細胞に導入することによって同時にリプログラミングを受けているゲノム操作非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞はリプログラミングに十分な条件下にあり、リプログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作及びリプログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び任意に小分子と接触させることによりリプログラミングを開始する前に、又は本質的に同時に、非標的多能性細胞に標的化組み込み及び／又は標的化インデルを導入することができる。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作及びリプログラミングするために、標的化組み込み及び／又はインデルはまた、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることによりリプログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入され得、リプログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１及びＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、コンストラクトを担持するベクターが導入される。

いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つのリプログラミング因子、及び任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表２）と接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表２）を使用して更に維持され、かつ増殖される。

ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを導入してｉＰＳＣをゲノム操作し、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作された非多能性細胞を取得することと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することと、を含む。あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣを作製する方法は、（ａ）非多能性細胞を、１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）ゲノム操作のためにリプログラミング非多能性細胞に１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを導入することと、（ｃ）選択された部位に標的組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。上記の方法のいずれかは、クローンｉＰＳＣを得るために、ゲノム操作されたｉＰＳＣの単一細胞ソーティングを更に含み得る。このゲノム操作されたｉＰＳＣのクローン増殖を通じて、本明細書の表１で提供されるような少なくとも１つの表現型を有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むようにマスター細胞バンクが生成される。マスター細胞バンクは、続いて凍結保存され、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供し、これらの製品は、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる。

リプログラミング因子は、国際公開第２０１５／１３４６５２号及び同第２０１７／０６６６３４号に開示されているような、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１つ以上のリプログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。リプログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、及びミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドはエピソームベクターによって導入される。他の種々の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０７５０５７号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同一の又は異なる選択された部位での標的化組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモーターを含む複数のコンストラクトでトランスフェクトされる。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、又は標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはそれからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、及び組織特異的又は細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、又は特定の分化した細胞型で発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣから分化した細胞で発現される。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモーターにより駆動され、例えば、ＣＡＧにより駆動されるキャパーゼ－９である。異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモーターを含むこれらのコンストラクトは、同時又は連続的に非多能性細胞にトランスフェクトすることができる。複数のコンストラクトの標的化組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上のリプログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時にリプログラミングを開始でき、これにより、同じ細胞のプールに複数の標的化組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得できる。このように、この堅牢な方法により、同時のリプログラミングと操作戦略により、選択された１つ以上の標的部位に組み込まれた複数のモダリティを持つクローンゲノム操作されたｉＰＳＣを誘導できる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びそれらの誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのｉｎｖｉｖｏ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、所望の部位（複数可）で標的化組み込み及び／又はインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからｉｎｖｉｖｏで誘導された分化細胞は、免疫応答の調節及び媒介に関連する内因性遺伝子の１つ以上のインデルを更に含む。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位（複数可）に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ベータ－２－ミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化編集を更に含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をｉｎｖｉｔｒｏで誘導するために使用され、誘導された非多能性細胞は、選択された部位（複数可）で標的化編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。いくつかの実施形態では、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をｉｎｖｉｔｒｏで誘導するために使用されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、凍結保存され、それらの使用直前に解凍される、マスター細胞バンク細胞である。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４^＋造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導するこれらの細胞は、所望の部位（複数可）で標的化編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。

ｉＰＳＣ誘導造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法及び組成物としては、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０７８８０７号を参照されたい。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダーを含まない、及び／又は間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞から誘導される決定的な造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化できる細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットした前駆細胞、及び多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した種々の系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞まで、及び全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。

単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び増殖させる方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞誘導中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＷＮＴ経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する増殖中胚葉細胞を取得する。その後のｂＦＧＦとの接触、及び任意選択でＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＷＮＴ経路活性化因子との接触により、決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なＨＥ細胞に分化する。

本明細書で提供される造血系統の細胞を得るための方法はＥＢ媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、ＥＢ形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均一な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、及び集団内の細胞の均一な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。

提供されている単層分化プラットフォームは、造血幹細胞及びＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせ、種々の治療用途のための多能性幹細胞誘導造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書で提供される方法を使用した単層培養は、ｉｎｖｉｔｒｏ分化、ｅｘｖｉｖｏ改変、及びｉｎｖｉｖｏ長期造血自己複製、再構成及び生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、ｉＰＳＣ誘導造血系統細胞には、決定的な造血内皮、造血多能性前駆細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに好中球が挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明は、決定的な造血系統の細胞への多能性幹細胞の分化を指示するための方法と提供し、方法は、（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることと、（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ及びＧＳＫ３阻害剤を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞からの決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、開始させることと、（ｉｉｉ）決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子並びにサイトカインと、任意選択でＷｎｔ経路活性化因子と、を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞誘導中胚葉細胞からの決定的な造血内皮の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、開始させることと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、多能性幹細胞を播種及び増殖させることを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、又はナイーブｉＰＳＣ、又は１つ以上の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、取得された多能性幹細胞誘導の決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、取得された決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－ＣＸＣＲ４^－ＣＤ７３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＸＣＲ４^－ＣＤ７３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－ＣＤ９３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ９３^－である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞誘導の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子と、を含む組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体への決定的な造血内皮の分化を開始させることと、任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体又はＴ細胞へのプレＴ細胞前駆体の分化を開始させることと、を更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋である。

多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上述の方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞誘導の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子と、を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮のプレＮＫ細胞前駆体への分化を開始させることと、任意選択で（ｉｉ）多能性幹細胞誘導のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない組成物と接触させ、プレＮＫ細胞前駆体からＮＫ細胞前駆体又はＮＫ細胞への分化を開始させることと、を更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導ＮＫ前駆体は、ＣＤ３^－ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ７^＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞誘導ＮＫ細胞は、ＣＤ３^－ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋であり、任意選択で、ＮＫｐ４６^＋、ＣＤ５７^＋及びＣＤ１６^＋であることによって更に規定される。

したがって、上記の分化方法を使用すると、以下のｉＰＳＣ誘導造血細胞の１つ以上の集団を取得し得る。すなわち、（ｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、決定的な造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、決定的なＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用する、多能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２、及びｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用する、Ｔ細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２、及びｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用する、ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、並びに／又は（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、及びｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、及びＥＰＯからなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子とを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインとを含む。
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子と、を含む。
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子と、を含む。
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む。

いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ誘導細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴ、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれる１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、及びＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答調節及び媒介に関連する１つ以上の内在性遺伝子に含まれる１つ以上のインデルを更に含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ誘導細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にインデルを含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている。

更に、第１の運命のゲノム操作造血細胞から第２の運命のゲノム操作造血細胞を取得するための適用可能な脱分化方法及び組成物は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１１／１５９７２６号に示されているものを含む。その中で提供される方法及び組成物は、リプログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的にリプログラミングすることを可能にし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びそれらの誘導細胞は、表１に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。

Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化した機能的モダリティを持つ誘導免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、本明細に開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された誘導免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物のｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ誘導免疫細胞に保持可能な開示される１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びそれらからの誘導細胞は、細胞ベースの養子療法に適している。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ誘導ＣＤ３４^＋細胞を含む。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ誘導ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ誘導プロＴ細胞又はＴ細胞を含む。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ誘導プロＮＫ細胞又はＮＫ細胞を含む。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ誘導免疫調節細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、本組成物のｉＰＳＣ誘導遺伝子操作されたエフェクター細胞は、改善された治療の可能性のために、ｅｘｖｉｖｏで更に改変される。本組成物の一実施形態では、ｉＰＳＣから誘導される遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞及び／若しくはセントラルメモリーＴ細胞の数又は比率の増加を含む。本組成物の一実施形態では、ｉＰＳＣから誘導される遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数又は比率の増加を含む。本組成物の別の実施形態では、ｉＰＳＣから誘導される遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、適応ＮＫ細胞の数又は比率の増加を含む。本組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣから誘導される遺伝子操作されたＣＤ３４^＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくは骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。本組成物の他のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣから誘導される遺伝子操作されたＣＤ３４^＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＭＤＳＣの単離された集団又は亜集団は、自家性である。

本組成物のいくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含み、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、当該ｉＰＳＣ誘導分化造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。

本組成物のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間若しくはその後に、多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失若しくは置換を通じて得られる１つ以上の遺伝子組換えモダリティ、又は（ｉｉ）ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である、供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣは、供給源治療属性を保持し、供給源治療属性はまた、ｉＰＳＣ誘導造血系統細胞にも含まれている。

本組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補；又はｉＰＳＣ若しくはそれからの誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び改変、並びに／若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を含む。本組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びそれからの誘導細胞は、表１に列挙された遺伝子型を含む。本組成物の他のいくつかの実施形態では、表１に列挙された遺伝子型を含む遺伝子改変ｉＰＳＣ及びそれからの誘導細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、又はＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１及び染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ以上の欠失又は破壊、並びに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、若しくは二重特異性若しくは多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャーとのカップリングのための表面トリガー受容体の導入又は上方制御を含む追加の遺伝子改変モダリティを更に含む。

本組成物の更にいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、以下のうちの少なくとも２つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む：（ｉ）１つ以上の抗原標的化受容体の発現、（ｉｉ）改変されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の動員、（ｉｖ）低減された腫瘍外効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに（ｖ）改善されたホーミング、持続性、細胞傷害性、又は抗原エスケープ救済。

本組成物のいくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を含むｉＰＳＣ誘導造血細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、若しくはＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカイン及び／若しくはその受容体、又はこれらの任意の改変タンパク質を発現し、少なくともＣＡＲを発現する。本組成物のいくつかの実施形態では、サイトカイン（複数可）及びＣＡＲ（複数可）の操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。本組成物のいくつかの他の実施形態では、サイトカイン（複数可）及びＣＡＲ（複数可）の操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８結合ドメインを含む。本組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。本組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的誘導エフェクター細胞は、液性腫瘍を標的とする。本組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的誘導エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。本組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ誘導造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。

いくつかの実施形態に従って、本発明の免疫細胞及び／又は組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｉＰＳＣ誘導造血細胞又は組成物は、同種異系養子細胞療法のためのものである。更に、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に適した対象にエフェクター細胞又は治療用組成物を導入することによる、上記エフェクター細胞及び／又は治療用組成物及び／又は併用療法の治療的使用を提供し、ここで対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が挙げられるが、これらに限定されない。固形癌の例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸、直腸、喉頭、及び食道の癌が挙げられるが、これらに限定されない。種々の自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の例には、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス、レンチウイルス、ＢＫポリオーマウイルス関連疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に開示されている実施形態のｉＰＳＣ誘導造血系統細胞又は本明細書で提供される組成物を使用する治療は、症状の提示に基づいて又は再燃防止のために行うことができる。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を取得することを意味するために使用される。効果は、疾患を完全に若しくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療剤（複数可）及び／又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を抑制、寛解及び／若しくは改善することができる疾患、状態並びに／又は傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄若しくは幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又は癌、例えば造血系の過剰増殖性障害若しくは癌を有するか又は有するリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するか又は発症するリスクがある対象、ウイルス感染若しくはウイルス感染に関連する疾患を有するか又は有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。

本明細書に開示された実施形態のｉＰＳＣ誘導造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価するとき、応答は、臨床的利益率、死亡までの生存率、病理学的完全奏功、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、及びＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準、のうちの少なくとも１つによって測定できる。

本明細書で開示されるｉＰＳＣ誘導造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、その間、及び／又はその後に対象に投与することができる。したがって、併用療法の方法は、１つ以上の追加の治療剤の使用前、使用中、及び／又は使用後のｉＰＳＣ誘導免疫細胞の投与又は調製を含み得る。上述のように、１つ以上の追加の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、エンゲージャー、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分又はその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ誘導免疫細胞の投与は、追加の治療剤の投与から、時間、日、又は週単位によって時間的に分離することができる。追加的、又は代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤又はモダリティと組み合わせることができる。

併用細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ誘導造血系細胞と、エンゲージャーである追加の治療剤とを含み、エンゲージャーは、（上記のような）状態、疾患、又は適応症に関連する抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、操作されたｉＰＳＣ誘導造血系細胞のＣＡＲとは異なる腫瘍標的化特異性を有する。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、多重特異性キラー細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは、複数の免疫細胞型と適合するユニバーサルエンゲージャーである。

併用細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ誘導造血系統細胞及び抗体又はその断片である追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ誘導造血系統細胞と共に投与する追加の治療剤として併用治療に適した抗体には、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ）、抗ＣＤ２２（イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ）、抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）、抗ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＧＤ２（例えば、ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ）、抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）、及びそれらのヒト化又はＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、いくつかの実施形態では、表１に列挙され、本明細書で提供される遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導造血系細胞を含むエフェクター細胞と、上記の抗体又は抗体断片である追加の治療剤と、を含む治療用組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御できる細胞分子、しばしば細胞表面分子として称される。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントの遺伝子発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させることができるアンタゴニストである。誘導エフェクター細胞との併用療法に適したチェックポイント阻害剤は、上に提供されている。

提供される誘導エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも１つの阻害剤を更に含む。提供される誘導エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ、又はそれ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、提供されるような誘導ＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、誘導Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための誘導ＮＫ細胞又はＴ細胞は、本明細書で提供されるように機能的に増強されている。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、誘導エフェクター細胞の投与と同時、前、又は後に併用療法で投与することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、又は一度に１つ（逐次的に）投与される。本発明は、いくつかの実施形態では、表１に列挙される遺伝子型を有するｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含むエフェクター細胞と、上記のような１つ以上のチェックポイント阻害剤と、を含む治療用組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（ＩｇＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、並びに抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用でき、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ又は３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体又は機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。

誘導エフェクター細胞及び１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫性皮膚弛緩症、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０^＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、二次皮膚ＣＤ３０^＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍；扁平上皮細胞癌、横紋筋肉腫、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）、非小細胞肺癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、乳癌、胃癌、前立腺小細胞神経内分泌癌（ＳＣＮＣ）、肝臓癌、膠芽腫、肝臓癌、口腔扁平上皮癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝内胆管細胞癌、肝細胞癌、骨癌、転移、及び上咽頭癌を含むがこれらに限定されない、液性癌及び固形癌の治療に適用できる。

本明細書で提供されるような誘導エフェクター細胞以外のいくつかの実施形態では、治療的使用のための組み合わせは、化学療法剤又は放射性部分を含む１つ以上の追加の治療剤を含む。化学療法剤とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、又は急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又は幹癌細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と呼ばれることもあり、当該技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが挙げられるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが挙げられる。他の好適な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＮｉｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。

サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、癌治療のためにｉＰＳＣ誘導治療用免疫細胞と共に使用され得る。

治療組成物に含まれるｉＰＳＣ誘導造血系統細胞の単離された集団以外に、対象／患者への投与に適した組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）及び／若しくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される媒体、例えば細胞培養培地）、又は他の薬学的に許容される成分を更に含むことができる。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈｅｄ．１９８５を参照されたい）。

一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ誘導Ｔ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ誘導ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ誘導ＨＳＣを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ誘導ＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ誘導造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、若しくは気管投与方法によって個別に、又は他の適切な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を与えることができる。

これらの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約５％もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。あるいは、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、又は約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、当該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。あるいは、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。

本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物及び／又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ誘導免疫細胞の維持、増殖、及び／又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び／又はフィーダーを含まない培地である。様々な実施形態では、無血清培地は、動物成分を含まず、任意選択で無タンパク質であり得る。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。「動物成分を含まない培地」とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物の供給源から取得される。対照的に、「無タンパク質培地」とは、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上述の培地の例は例示であり、本発明での使用に適した培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの適切な培地があることを理解するであろう。

単離されたｉＰＳＣ誘導造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離されたｉＰＳＣ誘導造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞治療を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製Ｔ細胞又はＮＫ細胞を有する治療用組成物を提供する。

様々な実施形態では、併用細胞療法又はそのために使用される組成物は、ＣＤ３エンゲージャーである治療用タンパク質又はペプチドと、表１に列挙されている遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導されるＮＫ細胞の集団とを含み、誘導ＮＫ細胞は、第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を含む。併用細胞療法又はそのために使用される組成物の一実施形態では、誘導ＮＫ細胞は、少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はエンゲージャー、並びに任意選択で外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント及び／又は１つ以上の外因性サイトカインを更に含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ１２３を標的とする。別の実施形態では、併用細胞療法又はそのために使用される組成物は、ＣＤ３エンゲージャーである治療用タンパク質又はペプチドと、表１に列挙されている遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導されるＴ細胞の集団とを含み、誘導Ｔ細胞は、第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を含む。更に別の実施形態では、誘導Ｔ細胞は、少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はエンゲージャー、並びに任意選択で外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント及び／又は１つ以上の外因性サイトカインを更に含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ１２３を標的とする。いくつかの実施形態では、併用細胞療法は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ＲＯ６９５８６８８、ＡＦＭ１１、ＭＴ１１０／ＡＭＧ１１０、ＭＴ１１１／ＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ－５６５、ＡＭＧ３３０、ＭＴ１１２／ＢＡＹ２０１０１１２、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、及び／又はＦＢＴＡ０５のうちの１つと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導されるＮＫ細胞又はＴ細胞の集団と、を含む。更にいくつかの他の実施形態では、併用細胞療法又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの１つと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導されるＮＫ細胞又はＴ細胞の集団と、を含む。更にいくつかの追加の実施形態では、併用細胞療法又はそのために使用される組成物は、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、及びエルツマキソマブのうちの１つと、表１に列挙される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣから誘導されるＮＫ細胞又はＴ細胞の集団と、を含み、誘導エフェクター細胞は、ＴＣＲ^ｅｘｏ、任意選択でＣＡＲ、並びに任意選択でエンゲージャー、ＣＦＲ、外因性ＣＤ１６若しくはそのバリアント、ＣＤ３８ノックアウト、及び／又は１つ以上の外因性サイトカインのうちの１つ以上を含む。

当業者であれば理解するように、本明細書に提供される方法及び組成物に基づくｉＰＳＣから誘導される自己と同種異系の造血系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、誘導造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、誘導造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、誘導造血系統細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩの欠損を有するＮＫ細胞又はＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、治療組成物中の誘導造血系統細胞の数は、１用量あたり、少なくとも０．１×１０^５細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、又は少なくとも５×１０^９細胞である。いくつかの実施形態では、治療用組成物中の誘導造血系統細胞の数は、１用量あたり、約０．１×１０^５細胞～約１×１０^６細胞、１用量あたり、約０．５×１０^６細胞～約１×１０^７細胞、１用量あたり、約０．５×１０^７細胞～約１×１０^８細胞、１用量あたり、約０．５×１０^８細胞～約１×１０^９細胞、１用量あたり、約１×１０^９細胞～約５×１０^９細胞、１用量あたり、約０．５×１０^９細胞～約８×１０^９細胞、１用量あたり、約３×１０^９細胞～約３×１０^１０細胞、又はその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０^８細胞／用量は、１．６７×１０^６細胞／ｋｇに変換される。

一実施形態では、治療組成物中の誘導造血系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも０．１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０^６細胞／体ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０^６細胞／ｋｇ体重、１×１０^８細胞／ｋｇ体重、５×１０^８細胞／ｋｇ体重、若しくは１×１０^９細胞／ｋｇ体重である。

一実施形態では、ある用量の誘導造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇ、若しくは少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇ、若しくは約１０×１０^６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、又は６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

いくつかの実施形態では、誘導造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、誘導造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごとの１回の投与、又はその間の任意の日数の任意の回数の投与である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、３回、又は４回、又は５回の週１回投与を含む。３回、又は４回、又は５回の週１回投与を含む複数回投与治療のいくつかの実施形態では、治療は、追加の単回投与又は複数回投与が必要かどうかを決定するための観察期間を更に含む。

本発明の誘導造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に適しており、そしてすぐに投与され得る（すなわち、更なる処理なしに投与され得る）。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、いずれかの更なる処理又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤の投与前に増殖及び／又は調整される、誘導造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように遺伝子的に操作された誘導造血系統細胞については、細胞は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号に記載されている方法を使用して活性化及び増殖させることができる。

特定の実施形態では、誘導造血系統細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）又は別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合され得る。あるいは、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であってもよく、次いで、本発明の実施形態でのＴリンパ球の活性化及び増殖での使用に企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）についての米国特許公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号に開示されているようなＦｃ受容体若しくは抗体又は他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋させることができる。

投与量、頻度、及びプロトコルのいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量、頻度及びプロトコルを決定する。

以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。

実施例１－材料及び方法
様々なプロモーターの制御下で自殺系を効果的に選択し、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一細胞の継代と高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリーソーティングを可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一又は複数の遺伝子調整によるクローンｈｉＰＳＣの誘導を可能にした。

小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：ｈｉＰＳＣは、培養のコンフルエンシーが７５％～９０％に達すると、単一細胞として日常的に継代された。単細胞解離の場合、ｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃において３～５分間処理した後、ピペッティングして単細胞解離を確実にした。次いで、単細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面に播種した。継代は通常１：６～１：８で、３７℃で２～４時間マトリゲルで前もってコーティングされた組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ_２に設定された加湿インキュベーターで維持された。

ＺＦＮによるヒトｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化編集のためのＣＲＩＳＰＲ：ＲＯＳＡ２６標的化挿入を例として使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、ＡＡＶＳ１標的化挿入のために、２．５μｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５μｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）及び５μｇのドナーコンストラクトの混合物でトランスフェクトされた。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、ＲＯＳＡ２６標的化挿入のために、５μｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）及び５μｇのドナーコンストラクトの混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクションは、パラメータ１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用するＮｅｏｎトランスフェクションシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。トランスフェクション後の２日目又は３日目に、プラスミドに人工プロモーター－ドライバーＧＦＰ及び／又はＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間０．１μｇ／ｍＬの濃度で、７日後に０．２μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加して、標的細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は１０日目に新鮮なマトリゲルコーティングされたウェルに継代された。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ^＋ｉＰＳ細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリーで分析した。

ゲノム編集されたｉＰＳＣの一括ソーティング及びクローンソーティング：ＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化編集を含むｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後にＧＦＰ^＋ＳＳＥＡ４^＋ＴＲＡ１８１^＋ｉＰＳＣの一括ソーティング及びクローンソーティングされた。単一細胞解離標的化ｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新規に作製した、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのコンジュゲート一次抗体を細胞溶液に加え、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体は、１００万細胞あたり１００μＬの染色緩衝液中に７μＬで使用した。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭチアゾビブを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーでのソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリーによるソーティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。一括ソーティングでは、ＧＦＰ^＋ＳＳＥＡ４^＋ＴＲＡ１８１^＋細胞にゲーティングし、７ｍＬのＦＭＭで満たされた１５ｍＬの標準チューブにソーティングした。クローンソーティングでは、１００μＭノズルを使用して、１ウェルあたり３イベントの濃度で、ソーティングされた細胞を９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬフィブロネクチンと１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）が補充された２００μＬのＦＭＭが予め充填されており、予め５×マトリゲルで一晩コーティングされていた。５×マトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に追加し、４℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェルあたり５０μＬで９６ウェルプレートに加え、３７℃で一晩インキュベートする。５×マトリゲルは、各ウェルに培地を加える直前に吸引される。ソーティングが完了したら、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離してからインキュベーションした。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。ウェルは、ソーティング後１０日目に追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーはソーティング後７～１０日の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで３７℃において約１０分間解離させた。長期間のアキュターゼ処理の必要性は、長期間培養で遊ばなかったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離しているのが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、予め５×マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、インキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１対１の継代は、増殖前の初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処理と、予めＦＭＭの１×マトリゲルでコーティングされた大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシーでの１：４～１：８の増殖で日常的に行われた。各クローン細胞株をＧＦＰ蛍光レベル及びＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析した。１００％に近いＧＦＰ^＋及びＴＲＡ１－８１^＋のクローン株を、更なるＰＣＲスクリーニング及び分析のために選択し、マスター細胞バンクとして凍結保存した。フローサイトメトリー分析は、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実行され、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して分析された。

実施例２－ＴｉＰＳＣ及びＦｉＰＳＣにおけるＭＲ１－ＴＣＲの発現
非多型ＭＨＣクラスＩ関連タンパク質であるＭＲ１は、患者間で最小の変動性で癌細胞の細胞表面で広く発現され、普遍的な癌免疫療法標的であるという独特の見通しを可能にする。図１Ａに示されるように、ＭＲ１クローンＴ細胞受容体（ＴＣＲ）コンストラクトを、ＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲを含有するＴ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＴＩＰＳＣ）（ＣＡＲ／ＴＣＲ^－ＴＩＰＳＣ）、又は線維芽細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＦｉＰＳＣ）に形質導入した。ＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲを含有するＴ細胞（ＴｉＰＳＣ）は、本出願において随時「ＴＲＡＣ－ＣＡＲＴｉＰＳＣ」とも称される。ＴＣＲα鎖又はＴＣＲβ鎖発現のいずれかを破壊することによってエフェクターＴ系統細胞において内因性ＴＣＲ複合体をノックアウトすることの利点には、養子細胞療法におけるＧｖＨＤの回避が含まれる。ｉＴ細胞に分化すると、ＭＲ１－ＴＣＲ／ＣＡＲ／ＴＣＲ^－Ｔ系統エフェクター細胞（ＴｉＰ－ｉＴ）は、ＣＡＲ及びＭＲ１－ＴＣＲを発現する。内因性ＴＣＲβ鎖は、ＴｉＰ－ｉＴにおいて依然として発現され、ＭＲ１－ＴＣＲコンストラクトによって提供される外因性ＴＣＲα鎖と不対合ＴＣＲを形成することができ、これは、その抗原特異的腫瘍標的化に利用可能なＭＲ１－ＴＣＲの量に影響を及ぼすことも発見されている。

ＴｉＰ－ｉＴとは異なり、ＦｉＰＳＣ誘導Ｔ系統細胞（ＦｉＰ－ｉＴ）は、ＴＣＲα及びＴＣＲβの予め再構成されたＶ（Ｄ）Ｊセグメントを有さず、これは、理論に束縛されるものではないが、ＦｉＰＳＣ誘導ｉＴ細胞が成熟し、内因性ＴＣＲを発現するのにはるかに長い時間がかかる理由であり得る。遅延された内因性ＴＣＲ発現は、ＴｉＰ－ｉＴと比較してＦｉＰ－ｉＴに関してＴＣＲの不一致の問題がないという観察をもたらす。

ＴｉＰ－ｉＴ細胞におけるＴＣＲ不対合の程度を評価するために、表面染色を実施し、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによって分析した。Ｄ３５分化由来のＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＦｉＰＳＣ及びＴＩＰＳＣ細胞を、分析のために、ＴＣＲｖβ１１（ＭＲ１－ＴＣＲβ鎖マーカー）、ＴＣＲαβ、ＣＤ３及びＣＤ４５で染色した。図１Ｂの右上四半分の下パネルは、ＴＣＲ染色では陽性であるが、ＴＣＲｖβ１１では低い（ＴＣＲｖβ１１^－ＴＣＲαβ^＋）、ＴｉｐｓＴＣ－ｉＴ（ＣＤ３陽性）における不対合ＴＣＲ複合体の一部を示し、この部分におけるＴＣＲ複合体の不対合性、及びＴｉｐｓＴＣにおける内因性ＴＣＲβがＴｉＰ－ｉＴにおけるＴＣＲ不対合をもたらすことを示している。

更に、ＦｉＰＳＣ又はＴＲＡＣ－ＣＡＲＴｉｐｓＣＴ系統分化プロセスの２０日目又は３５日目頃に、Ｔｈｙ１．１の存在について、及び誘導細胞の表面上に存在するＣＤ３について、細胞を染色した。図２に示すように、ＴＣＲαβを発現しているはずのＴｈｙ１．１陽性細胞は、細胞表面上に内因性ＣＤ３分子を保持することができる。しかし、ＭＲ１－ＴＣＲ形質導入の非存在下では、ＦｉＰＳＣｓは、ＴＣＲα鎖又はＴＣＲβ鎖のいずれも発現しないのに対し、ＴＲＡＣ－ＣＡＲＴｉＰＳＣは、ＣＤ３細胞表面提示に必要なＴＣＲ複合体を形成するＴＣＲα鎖を発現しないため、ＣＤ３表面発現は観察されない。したがって、ＭＲ１－ＴＣＲは、示されるように、ＴＣＲαノックアウトを有するＴ細胞及びＦｉＰＳＣ誘導Ｔ系統細胞を含む、内因性ＴＣＲ発現が陰性であるエフェクター細胞におけるＣＤ３分子の表面発現を安定化させることができる。

実施例３－ＭＲ１－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞の機能的特徴付け
標的化殺傷能力を有する活性化エフェクター細胞の指標であるＭＲ１依存性サイトカイン放出及び脱顆粒（ＣＲ／Ｄ）応答を評価するために、Ｄ４２分化由来のＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＦｉＰ－ｉＴ及びＴｉＰ－ｉＴ細胞を、ＭＲ１分子と共に腫瘍関連代謝産物を提示することが知られているＡ５４９肺癌細胞の５０：５０混合物と共培養した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＲ１遮断抗体の非存在下（Ａ５４９）又は存在下（Ａ５４９＋Ａｂ）で共培養した。プレートを加湿されたインキュベーター内で約３７℃及び約５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。その後、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによって分析された生／死染色、表面染色及び細胞内染色を、図３に示すように、ＭＲ１遮断抗体がＭＲ１依存性ＣＲ／Ｄ細胞応答を防止するかどうかを試験した。

ＭＲ１－ＴＣＲ依存性応答を、ＴＣＲｖβ１１陽性及び陰性集団を比較することによって分析し、Ａ５４９を添加していないエフェクター細胞を無刺激対照（ｕｎｓｔｉｍ）として使用した。図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、代表的なＦＡＣＳプロットは、ＭＲ１－ＴＣＲ^＋細胞（黒色）及びＭＲ１－ＴＣＲ^－細胞（灰色）のゲーティングを示し、棒グラフは、ＦｉＰＳＣから誘導される（図４Ａ）又はＴｉＰＳＣから誘導される（図４Ｂ）、ＭＲ１－ＴＣＲ^＋／－細胞におけるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａｂ及びグランザイムＢのサイトカイン産生を要約する。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａｂのサイトカイン産生は、ＭＲ１－ＴＣＲ依存性であり、グランザイムＢの産生はＭＲ１－ＴＣＲによって増強されることが示されている。

エフェクター細胞の細胞毒性は、１０μｇ／ｍＬのＭＲ１ブロッキング抗体の非存在下（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ）又は存在下（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ＋ＭＲ１Ａｂ）、Ｄ４２分化からの磁気濃縮ＭＲ１－ＴＣＲ発現ＦｉＰ－ｉＴ（エフェクター）と約３：１のエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）でＡ５４９（標的）を共培養して評価した。エフェクター細胞なしで腫瘍のみを含有するウェルを対照として含めた。Ａ５４９－ＮＬＲ数を、エフェクター細胞の添加後７２時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）によって監視した。Ａ５４９数のパーセンテージを腫瘍単独に対して正規化し、０時間から７２時間までプロットした。図５Ａに示すように、代表的なＦＡＣＳプロットは、インプット集団内のＭＲ１－ＴＣＲを発現するＦｉＰ－ｉＴ細胞を表す、Ｔｈｙ１．１^＋ＴＣＲｖβ１１^＋細胞の純度を示す。図５Ｂは、Ａ５４９肺癌細胞に対するＭＲ１－ＴＣＲエフェクター細胞のｉｎｖｉｔｒｏ７２時間ＭＲ１－ＴＣＲ依存性殺傷能力を示す。

実施例４－ＭＲ１－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、ＢｉＴＥ標的化に適合する
ＭＲ１－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞がＢｉＴＥ標的化に適合するかどうかを試験するために、内因性ＴＣＲをノックアウトしたＴｉＰ－ｉＴと内因性ＴＣＲを持たないＦｉＰ－ｉＴの両方において、ＭＲ１－ＴＣＲがＣＤ３細胞表面提示（ｃｓ－ＣＤ３；図６のＭＲ１－ＴＣＲ複合体のＣＤ３ε、δ、γサブユニット参照）を可能にするという考え方により、概念実証評価のためにＣＤ３ベースのＢｉＴＥを使用し、その結果、ｃｓ－ＣＤ３は、ＣＤ３ベースのＢｉＴＥが標的殺傷のためにエフェクター細胞と結合するのに必要である。ＣＲ／Ｄは、Ｄ４２分化由来のＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＦｉＰＳＣ細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＲ１遮断抗体の非存在下（Ｎａｌｍ６）又は存在下（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ）で、Ｎａｌｍ６細胞の５０：５０混合物と共培養することによって評価した。ＢｉＴＥ実験のために、抗ＣＤ１９ｘＣＤ３ＢｉＴＥ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）をＮａｌｍ６＋Ａｂ群で試験し、ＭＲ１抗原（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ＋ＣＤ１９ｘ３）の非存在下でＣＤ１９特異的ＴＣＲシグナル伝達を誘発した。Ｎａｌｍ６を添加していないエフェクター細胞を無刺激対照（ｕｎｓｔｉｍ）として使用した。プレートを加湿されたインキュベーター内で約３７℃及び約５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした。その後、生／死染色、表面染色及び細胞内染色、及びＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによる分析を行った。ＭＲ１－ＴＣＲ依存性応答を、ＴＣＲｖβ１１陽性集団と陰性集団とを比較することによって分析した。図７Ａに示されるように、代表的なＦＡＣＳプロットは、ＭＲ１－ＴＣＲ^＋細胞及びＭＲ１－ＴＣＲ^－細胞についてのゲーティングを実証し、一方、図７Ｂの棒グラフは、無刺激（ｕｎｓｔｉｍ）、Ｎａｌｍ６のみ、ＭＲ１遮断抗体を有するＮａｌｍ（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ）、及びＢｉＴＥの存在下でＭＲ１遮断抗体を有するＮａｌｍ６（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ＋ＣＤ１９ｘ３）などの条件に応答した、ＭＲ１－ＴＣＲ^＋細胞（黒色）及びＭＲ１－ＴＣＲ^－細胞（灰色）によるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａｂ及びグランザイムＢのサイトカイン産生を要約する。示されるように、ＭＲ１遮断抗体がＭＲ１－ＴＣＲ媒介性細胞応答を提示した場合、エフェクター細胞のｃｓ－ＣＤ３の結合によるＢｉＴＥは、サイトカイン放出及びグランザイムＢの産生を含むがこれらに限定されないＢｉＴＥ特異的細胞殺傷応答をもたらす。

１０μｇ／ｍＬのＭＲ１遮断抗体の非存在下（Ｎａｌｍ６）又は存在下（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ）で、Ｄ４２分化由来のＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＴｉＰＳＣ細胞をＮａｌｍ６細胞の５０：５０混合物と共培養することによっても、ＣＲ／Ｄを評価した。図８Ｂの棒グラフは、無刺激（ｕｎｓｔｉｍ）、Ｎａｌｍ６、ＭＲ１遮断抗体を有するＮａｌｍ（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ）、及びＣＤ１９ｘＣＤ３ＢｉＴＥの存在下でＭＲ１遮断抗体を有するＮａｌｍ６（Ｎａｌｍ６＋Ａｂ＋ＣＤ１９ｘ３）に応答した、ＭＲ１－ＴＣＲ^＋細胞（黒色）及びＭＲ１－ＴＣＲ^－細胞（灰色）（図８Ａにおいてゲーティングされている）についてのＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａｂ及びグランザイムＢのサイトカイン産生を要約する。灰色の棒は、ＣＤ１９－ＣＡＲ誘発応答に起因するＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＴｉＰＳＣについての基礎ＣＲ／Ｄレベルを示す。灰色の棒（ＭＲ１－ＴＣＲ^－ＴｉＰＳＣ）と比較して黒色の棒（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＴｉＰＳＣ）によって示される増加したＣＲ／Ｄレベルは、ＣＡＲ刺激の存在下でのＭＲ１－ＴＣＲ媒介性応答を定義する。

更に、ＢｉＴＥの添加がＭＲ１依存性様式で細胞傷害性を回復させることを実証するために、Ｄ４２分化由来の磁気的に濃縮されたＭＲ１－ＴＣＲ発現ＦｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＲ１ブロッキング抗体の非存在下（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ）又は存在下（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ＋ＭＲ１Ａｂ）でＮａｌｍ６－ＮＬＲ（標的）とＥ：Ｔ比で共培養をした。ＭＲ１遮断抗体の存在下でＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴを用いてＣＤ１９ｘ３ＢｉＴＥを試験し、ＭＲ１抗原の非存在下でＣＤ１９特異的ＴＣＲシグナル伝達を誘発した（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ＋ＭＲ１Ａｂ＋１９ｘ３）。腫瘍のみを含有するウェルを対照（腫瘍のみ）として含めた。Ｎａｌｍ６－ＮＬＲ数を、エフェクターの添加後７２時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって監視した。Ｎａｌｍ６数のパーセンテージを腫瘍単独に対して正規化し、０時間から７２時間までプロットした。図９Ａに示されるように、代表的なＦＡＣＳプロットは、インプット集団内のＴｈｙ１．１^＋ＴＣＲｖβ１１^＋細胞（ＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ）の純度を示す。図９Ｂのグラフは、ＭＲ１遮断抗体及びＢｉＴＥＣＤ１９ｘＣＤ３の非存在下／存在下でのＮａｌｍ６に対するＭＲ１－ＴＣＲ^＋ＦｉＰ－ｉＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ７２時間殺傷能力を示す。ＣＤ１９認識によるＢｉＴＥ標的化殺傷は、ＭＲ１遮断抗体の存在下でＭＲ１－ＴＣＲ指向性細胞傷害性の喪失をレスキューし、ＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達を回復させた。

したがって、ＢｉＴＥの添加は、外因性ＴＣＲ又はＣＡＲによって標的化される抗原が遮断される場合であっても、ＣＤ３を含むがこれに限定されない表面トリガータンパク質を介してエフェクター細胞に結合することによって腫瘍細胞の標的化を可能にし、それによって、集合的に２つ以上の標的化特異性を有するＢｉＴＥ、ＴＣＲ及びＣＡＲの間の任意の組み合わせを利用することによって腫瘍抗原エスケープを克服するエフェクター細胞の能力についての概念実証を提供する。

実施例５－ＴｉＰＳＣにおける更なるＴＲＢＣノックアウトは、不対合を補正し、外因性ＴＣＲ機能を改善する
表面染色を実施し、ＴＣＲ不対合を評価した。Ｄ３５分化由来のＭＲ１－ＴＣＲ形質導入ＦｉＰＳＣ及びＴｉＰＳＣ（ＴＣＲα^ｋｏＴＣＲβ^ｗｔ）を最初にＴＣＲｖβ１１で染色し、次いでＴＣＲαβ、ＣＤ３、及びＣＤ４５で染色し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）によって分析した。図１１Ａに示すように、代表的なＦＡＣＳプロットは、ＦｉＰＳＣ及びＴｉＰＳＣから誘導される表面ＣＤ３^＋細胞のＴＣＲｖβ１１並びにＴＣＲαβ発現を実証し、このことは、不対合の問題がＴＲＡＣノックアウトのみを有するＴｉｐｓＣには存在するが、ＦｉＰＳＣには存在しないことを示している。ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣノックアウトの両方を有するＤ３５ＴｉＰＳＣを、ＴＣＲｖβ１１及びＴＣＲαβ、Ｔｈｙ１．１及びＣＤ４５で染色し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）によって分析した。図１１Ｂに提示されるように、代表的なＦＡＣＳプロットは、ＴＣＲｖβ１１及びＴＣＲαβ発現を実証し、不対合が、ＴＣＲα及びＴＣＲβの両方をノックアウトすることによって、例えば、ＴｉｐｓＣ細胞においてＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを破壊することによって低減されることを示す。ソーティングされたＴＣＲｖβ１１．１^＋／－集団の配列決定分析は、ＴＣＲｖβ１１．１^＋細胞における効率的なＴＲＢＣＫＯを確認したが、ＴＲＢＣは、ＴＣＲｖβ１１．１^－集団において依然としてインタクトである（図１１Ｃ）。

更に、ＴＣＲ複合体不対合の程度は、サイトカイン分泌及び腫瘍溶解などのＴＣＲ機能と負に相関することが示された。サイトカイン放出及び脱顆粒を、約１０μｇ／ｍＬのＭＲ１遮断抗体の非存在下（Ａ５４９）又は存在下（Ａ５４９＋Ａｂ）で、示されたｉＴ細胞をＡ５４９細胞と１：１の比で共培養することによって評価した。プレートを一晩インキュベートした後、生／死染色、表面染色、細胞内染色、及びＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターによる分析を行った。Ａ５４９を添加していないエフェクター細胞を無刺激対照（ｕｎｓｔｉｍ）として使用した。示されたｉＴ細胞についてのＣＤ１０７ａｂ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びグランザイムＢについてのサイトカイン産生を図１１Ｄに示す。

示されたｉＴ細胞をＡ５４９細胞と１：１の比で共培養することによって、ＴＣＲ媒介性細胞傷害性を評価した。腫瘍単独及びＭＲ１－ＴＣＲを有さないｉＴ細胞を対照として含めた（腫瘍単独及びＴＲＡＣ^ｋｏＴＲＢＣ^{ｗｔ／ｋｏ}ＴＣＲなし）。Ａ５４９細胞を、エフェクター細胞の添加後７２時間、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）によって監視した。細胞溶解を腫瘍単独に対して正規化し、０時間から７２時間までプロットした。図１１Ｅは、ＴＲＢＣＫＯあり又はなしでのＡ５４９細胞に対するＭＲ１－ＴＣＲ^＋形質導入ｉＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ殺傷能力を示す。示されるように、腫瘍細胞殺傷を含むＴＣＲ機能の障害は、外因性ＴＣＲを発現する細胞においてＴＣＲβを更にノックアウトすることによって修正された。ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲを同じアッセイを使用して試験し、同様の相関が観察された。

実施例６－ｉＰＳＣの段階的操作と改変誘導エフェクター細胞の検証
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の強力な標的化療法を二次抗原及び三次抗原の普遍的標的化と組み合わせるために、例示的なＭＲ１クローンＴ細胞受容体（ＭＲ１－ＴＣＲ）及び高親和性非切断性ＣＤ１６Ｆｃ受容体（ｈｎＣＤ１６）を、白血病及びリンパ腫に対するｉＰＳＣ誘導ＣＡＲ１９Ｔ細胞（ＣＡＲ１９－ｉＴ細胞）又はｉＰＳＣ誘導ＣＡＲ－ＢＣＭＡＴ細胞（ＣＡＲ－ＢＣＭＡｉＴ細胞）において、並びに固形腫瘍に対するＣＡＲ－ＭＩＣＡ／ＢＴ細胞において発現させた。上記で実証されたように、ＭＲ１－ＴＣＲは、ＭＲ１タンパク質によって提示される腫瘍関連抗原の高度に特異的な認識を可能にする。非多型性ＭＨＣクラスＩ関連タンパク質ＭＲ１は、患者間で最小限の変動性で広く発現され、同族ＭＲ１－ＴＣＲを使用することによって普遍的な癌免疫療法であるという独特の見通しを可能にする。ｈｎＣＤ１６Ｆｃ受容体は、臨床的に検証された腫瘍抗原を標的とする広範囲の利用可能な治療用モノクローナル抗体を利用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改善することが示されている。

予備的評価は、Ｔ細胞において過剰発現されたＭＲ１－ＴＣＲが、複数の血液及び固形腫瘍細胞株の認識の増強を可能にすることを実証した。注目すべきことに、顕著な標的特異的殺傷が、ＭＲ１遮断抗体によって特異的に阻害された指向性細胞傷害性を有するＡ５４９肺癌細胞において見られた（総生存細胞において７５％超の減少）。次に、ＭＲ１－ＴＣＲ係合及びｈｎＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを介した腫瘍細胞の殺傷を測定する共培養アッセイにおいて、操作されたＣＡＲ１９－ｉＴ細胞に対してｉｎｖｉｔｒｏ機能試験を行った。具体的には、ｈｎＣＤ１６を発現するＣＡＲ１９－ｉＴ細胞は、リツキシマブ存在下でＣＤ２０^＋Ｒａｊｉ細胞又はハーセプチン存在下でＨＥＲ２^＋ＳＫＯＶ３細胞を溶解するように効率的に誘導されることができ、様々なモノクローナル抗体と組み合わせた１つの標的モダリティで血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の両方を標的化する可能性を実証する。更に、ＭＲ１－ＴＣＲ又はｈｎＣＤ１６のいずれかを発現するＣＡＲ１９－ｉＴ細胞は、共培養アッセイにおいてＣＤ１９ＫＯリンパ腫細胞の増殖を制御する能力を示し、抗原エスケープを標的化する複数の方法を誘発する固有の能力を更に強調した。要約すると、本明細書に提示される進歩は、ＭＲ１－ＴＣＲ及びｈｎＣＤ１６モダリティの両方が、長期応答を提供することができ、かつ単剤治療剤が患者に臨床的利益を提供できない追加の腫瘍抗原の標的化のための広範な適用可能性を可能にする既製の治療剤として、ＣＡＲ－ｉＴ細胞と相乗作用することを実証する。

更に、ＭＲ１－ＴＣＲは、内因性ＴＣＲβをノックアウトするためにＴＲＡＣ－ＣＡＲＴｉＰＳＣ中のＴＲＢＣに挿入され、それによって、ＭＲ１－ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβからなる不対合ＴＣＲ複合体を低減又は排除し、標的化殺傷のために外因性ＭＲ１－ＴＣＲのレベルを最大化する。得られた誘導Ｔ系統エフェクター細胞を同じアッセイを使用して試験し、ＭＲ１依存性様式でのそれらの改善された細胞傷害性を確認し、ＭＲ１遮断抗体の存在下でのそれらの遮断されたＭＲ１媒介性ＴＣＲシグナル伝達もまた、ＣＤ３ベースのＢｉＴＥの添加によって回復させることができる。

同じｉＴ細胞において発現されるトリ抗腫瘍抗原モダリティの適合性を評価するために、ｉ）ＣＡＲ（ＣＤ１９、ＭＩＣＡ／Ｂ、又はＢＣＭＡ）、ｉｉ）ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）及びｉｉｉ）ＴＣＲ（ＭＲ１又はＮＹＥＳＯ１）の組み合わせを概念実証について試験した。第１に、編集は首尾よく発現され、試験した全ての組み合わせは機能的ｉＴ細胞に分化した。図１２Ａに示されるように、代表的なＦＡＣＳプロットは、ＴＣＲαβ及びＣＡＲ１９発現について生ＣＤ４５^＋シングレットにゲーティングされ、ＴＣＲｎｕｌｌＣＡＲ１９－ｉＴ対照と比較して、ＣＡＲ及びＴＣＲの両方が同じｉＴにおいて首尾よく発現されることを実証する。図１２Ｂは、毎日のｉｎｖｉｔｒｏ再刺激及びサンプリングアッセイのスケジュールを示す。９日間の連続殺傷アッセイのためにＭＲ１－ＴＣＲを有するＣＡＲを使用して、ｉＴ細胞及び標的を１対１の比で設定し、標的を０日目から９日目まで培養物に添加した。サンプリングを毎日行い、ＦＡＣＳ計数ビーズを介して正確な腫瘍数を得た。ＣＡＲのみによって媒介される迅速な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が観察されたが（図１２Ｃ）、ＴＣＲのみによって媒介される腫瘍細胞殺傷はＣＡＲに遅れた。全ての条件（ＣＡＲ、ＴＣＲ、又はＣＡＲ＋ＴＣＲ）は、５日後にほぼ完全なＴＧＩを示した。注目すべきことに、ＣＡＲ及びＴＣＲを共発現させると、ＴＧＩの開始及びその完了の両方ははるかに速い速度で起こり、細胞の殺傷効果は長く持続する。

同じｉＴ細胞上でのＣＡＲ及びＴＣＲの発現は、ＣＤ２５上方制御によって更に実証されるように、腫瘍制御及びＴ細胞活性化に対して独立してかつ相乗的に機能することができることが示された。図１２Ｄに示されるように、ＣＡＲ及びＴＣＲの同時誘発は、最も高い持続可能なレベルで最も迅速なＣＤ２５上方制御を明らかにし、これは、同じエフェクター細胞において発現されるＣＡＲとＴＣＲとの間の適合性及び相乗効果を示す。ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ及びｈｎＣＤ１６を発現するｉＴ細胞を使用して、ＣＡＲの存在下でのＣＤ３ζシグナル伝達による細胞増殖、ＣＤ１６媒介性抗原特異的殺傷、及びサイトカイン放出を含む細胞機能を確認し、ＣＡＲとｈｎＣＤ１６との間の適合性を示した。

図１３Ａに示されるように、ＣＡＲ（ＣＡＲ－ＢＣＭＡ）、ＴＣＲ（ＴＣＲ－ＭＲ１）及びＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）は、ＣＡＲ１９－ｉＴ細胞対照（ｎｅｇｃｔｒｌ）と比較して、同じｉＴ（三峰性ｉＴ）細胞において首尾よく発現される。ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＤ１６（三峰性ｉＴ細胞）間の相加的殺傷及び相乗効果を実証するために、上記と同じ連続殺傷アッセイを行った。図１３Ｂに示すように、全ての群について、０日目から９日目までの、０日目に対する腫瘍数を、ＦＡＣＳ計数ビーズによって得た。治療用抗体を介したｈｎＣＤ１６の誘発は、ＴＣＲと同様のＴＧＩパターンを明らかにし、遅延発症であるが持続性のＴＧＩを伴う。治療用抗体の存在下でのＣＡＲ特異的殺傷、ＴＣＲ特異的殺傷及びＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣ機能の同時誘発は、試験した全ての群の中で、迅速で、深くかつ耐久性のあるＴＧＩを実証した。

ＣＡＲ及びＣＤ１６と組み合わせた異なる腫瘍抗原特異性を有するＴＣＲの適用可能性を試験するために、ｉ）ＣＡＲ（ＢＣＭＡ）、ｉｉ）ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）及びｉｉｉ）ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲの組み合わせを含むようにｉＰＳＣ並びにエフェクター細胞を作製し、様々な対照細胞を同様に作製した。図１４Ａに示すように、代表的なＦＡＣＳプロットは、Ｄ３５でのＢＣＭＡ－ＣＡＲ^＋ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ^＋ｉＴ細胞のＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８ｂ、表面ＣＤ３及びＴＣＲαβ発現を実証し、Ｄ４２での同じｉＴにおけるＣＡＲ及びＴＣＲの両方の発現の成功の確認を図１４Ｂに示す。図１４Ｃは、ｉｎｖｉｔｒｏ再刺激及びサンプリングアッセイのスケジュールを示す。この９日間の連続殺傷アッセイでは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ及びＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲの両方を発現するｉＴ細胞と標的を１：２のＥ：Ｔ比で設定し、０日目から８日目まで標的を培養物に添加した。サンプリングを毎日行い、ＦＡＣＳ計数ビーズを介して正確な腫瘍数を得た。ＭＲ１－ＴＣＲ及びＣＡＲの組み合わせで行われた観察と同様に、ＣＡＲのみによって媒介される迅速な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が観察されたが（図１４Ｄ）、ＴＣＲのみによって媒介される腫瘍細胞殺傷はＣＡＲに遅れ、それによって、同じｉＴ上のＣＡＲ及びＴＣＲが、抗原特異的様式で独立してかつ相乗的の両方で機能し得ることが確認された。全ての条件（ＣＡＲ、ＴＣＲ、又はＣＡＲ＋ＴＣＲ）は、３日後にほぼ完全なＴＧＩを示した。加えて、ＣＡＲ^＋ＴＣＲ^＋ｉＴは、毎日添加された標的（５００，０００～１００，０００数）の効率的かつ長期の殺傷を実証した（図１４Ｅ）。上記のように、ＣＡＲ及びＴＣＲの同時誘発は、エフェクターサイズ及び粒度の増加に加えて、最も高い持続可能なレベルでの最も迅速なＣＤ２５上方制御を明らかにし、エフェクター細胞の適合性及び活性化を示した（図１４Ｆ及び図１４Ｇ）。まとめると、同じエフェクター細胞において発現された場合のＣＡＲとＴＣＲとの間の適合性及び相乗効果は、三峰性ｉＴ細胞が、腫瘍細胞制御及びクリアランスにおいて増強された細胞機能を伝達する改善された細胞プラットフォームであることを証明した。

実施例７－外因性ＴＣＲの発現は、ＴＣＲリガンドによる活性化がなくてもＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力を増強する
三峰性ｉＴ細胞における外因性ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ発現も有効性に影響を及ぼすかどうかを評価し、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＣＡＲｉＴエフェクターの抗原特異的腫瘍殺傷効力を評価するために、ＴＲＢＣ２ノックアウト並びにＴＲＡＣにおけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ及びｈｎＣＤ１６の両アレル挿入を有するｉＰＳＣを、エフェクター細胞誘導のための供給源として生成した（ＴＣＲ^ｎｅｇ／ＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６ｉＰＳＣ）。ｉＴ分化の間（約Ｄ１０）、分化中のｉＰＳ細胞にＮＹＳＥＯ１－ＴＣＲを更に形質導入し、凍結保存、培養及び更なる評価のために、分化プロセスの終了時（約Ｄ４２）にＴＣＲ^ｎｅｇ／ＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６／ＮＹＳＥＯ１－ＴＣＲを有するエフェクターＴ細胞を得た。

ＣＲ／Ｄ応答アッセイは、刺激なし、ＴＣＲ活性化のみ、ＣＡＲ活性化のみ、又はＴＣＲ及びＣＡＲ活性化の両方のいずれかのアッセイにおいてエフェクター細胞を提供するために、（ｉ）エフェクター細胞（外因性ＴＣＲ発現を伴う又は伴わないＣＡＲ発現）、（ｉｉ）腫瘍標的（ＣＡＲ抗原を伴う又は伴わない）、及び（ｉｉｉ）エフェクター細胞の外因性ＴＣＲに特異的なＴＣＲリガンドの存在又は非存在の異なる組み合わせを使用するように設計された。このような設計を用いて、エフェクター細胞を、ＴＣＲ抗原特異的腫瘍殺傷効力、ＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力について別個に及び組み合わせて試験した。全てのアッセイにおけるＥ：Ｔ比は、約１：３であり、エフェクター細胞、腫瘍標的及び刺激の組み合わせは、図１５～図１８のそれぞれに示されるとおりである。

ＴＣＲのみがＣＡＲ／ＴＣＲエフェクター細胞において活性化され、ｉＴエフェクター細胞において発現された外因性ＴＣＲがＴＣＲ抗原特異性腫瘍を殺傷を誘発することができることが図１５に示される。興味深いことに、図１６においてＴＣＲリガンドの非存在下でのＢＣＭＡ－ＣＡＲｉＴ細胞及びＴＣＲ発現ＢＣＭＡ－ＣＡＲｉＴ細胞によるＮａｌｍ６（ＢＣＭＡ^＋）腫瘍細胞殺傷を比較することによって実証されるように、外因性ＴＣＲの単なる発現は、適合するＴＣＲリガンドの欠如のために活性化されなくても、ＣＡＲ－ｉＴエフェクター細胞におけるＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力を増強する。ＣＡＲ腫瘍抗原及びＴＣＲ腫瘍抗原の両方の存在下で、それぞれの腫瘍抗原特異性を有するＣＡＲ及びＴＣＲの両方を発現するエフェクター細胞は、ＣＡＲのみを発現するエフェクター細胞と比較して、増強された腫瘍殺傷効力を示す（図１７）。この包括的かつ簡潔に設計されたアッセイ及びデータ分析からの別の観察は、ＴＣＲ及びＣＡＲの両方の活性化が、ＣＡＲ活性化単独と比較して、より速いかつ／又は迅速な腫瘍殺傷をもたらすことである（図１８）。

加えて、外因性ＴＣＲ発現ＣＡＲエフェクター細胞は、全ての刺激条件（すなわち、刺激なし、ＣＡＲ刺激のみ、ＴＣＲ刺激のみ、又はＣＡＲ及びＴＣＲ刺激の両方）下で、ＴＣＲ発現なしのＣＡＲエフェクター細胞と比較してより高い増殖倍率を示し、ＣＡＲ活性化なしでＴＣＲシグナル伝達のみによって刺激された細胞において最も高いｉＴ細胞増殖を示した（図１９）。また、図１９に示されるように、ＣＡＲ活性化単独では、おそらくＣＡＲ誘導性細胞枯渇に起因して、ｉＴ細胞増殖が最低である。実際、ＴＣＲ活性化に加えてＣＡＲ活性化を用いると、ｉＴ細胞の増殖倍率は、ＴＣＲ活性化単独下のものと比較して低下する。理論によって束縛されるものではないが、ＣＡＲ－ｉＴ細胞における外因性ＴＣＲ発現及び／又は活性化は、腫瘍抗原刺激時のより良好な持続性及び細胞適合性と関連し得る。

実施例８－三峰性ｉＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ検証
三峰性ｉＴ細胞の機能をｉｎｖｉｖｏ評価するために、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ６（Ｎａｌｍ６－ｌｕｃ）、Ｂ細胞白血病のマウス異種移植モデルを使用した。この特定の試験における三峰性ｉＴ細胞は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＮＹＥＳＯ－ＴＣＲ、及びＣＤ１６を発現する。各個別の編集は、ＩｇＧ抗体によって活性化されるｈｎＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを用いて、その適合する刺激剤によって首尾よく誘発された。

ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを組み合わせることの効果を評価するために、ＣＡＲ、ＴＣＲ、又は抗ＣＤ３８抗体標的化のための細胞表面ＢＣＭＡ、ＮＹＥＳＯ１又はＣＤ３８をそれぞれ発現するＮａｌｍ６－ｌｕｃ腫瘍細胞株を作製し、混合して異種腫瘍細胞集団を得た。このアッセイセットでは、使用した抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブであった。ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＤ１６の相加効果を評価するために、Ｎａｌｍ６－ｌｕｃ株を作製し、ＣＡＲ、ＴＣＲ、又はＡＤＣＣのいずれかに対する所望の抗原を特異的に発現させた。異なる細胞株を１：１：１の比で混合し、合計１×１０^５個の異種腫瘍細胞を提供し、これを０日目にマウスに注射した（図２０Ａ）。図２０Ｂに示されるように、２×１０^６個の示されたｉＴ細胞（ＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、ＣＤ１６、及びＣＤ３８ｎｕｌｌ）を３日目に注射した。１．５ｍｇ／ｋｇのダラツムマブ（Ｄａｒａ）（ＩＶ、静脈内）、並びにＩＬ２（１００ＫＵ）及びＩＬ１５（１５０ｎｇ）サイトカインサポート（ＩＰ、腹腔内）を週２回（ＢＩＷ）投与した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）を週に２回記録した。

示されたｉＴ細胞によって標的化された結果としての異種集団における腫瘍細胞排除を、ＢＣＭＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＮＹＥＳＯ１－ＧＦＰシグナルについての骨髄（ＢＭ）由来のｅｘｖｉｖｏＣＤ１０^＋細胞のＦＡＣＳ分析によって評価した。示されるように、処理なし又はＤａｒａ単独では、３つの株全ての細胞の存在がＦＡＣＳによって検出され、一方、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを有するｉＴ細胞の標的化下では、混合集団中のＢＣＭＡ発現腫瘍細胞が排除され、ＴＣＲの標的化下では、ＮＹＥＳＯ１発現細胞が排除され、異種腫瘍細胞集団が、エフェクター細胞におけるＣＡＲ、ＴＣＲ及びＡＤＣＣ標的化特異性の組み合わせによって協調して標的化される場合、腫瘍細胞は最小のエスケープを有した（図２１Ａ）。更に、全ての群について示された腫瘍株についての各骨髄試料における絶対腫瘍数を図２１Ｂに示す。

週２回記録した生物発光画像（ＢＬＩ）は図２２に含まれ、ＣＡＲ＋ＴＣＲｉＴが７日目及び１０日目までに骨髄中の腫瘍の大部分を排除したが、肺及び脳領域中の腫瘍は排除されなかったか、又は制御下になかったことを示す。

図２３Ａにおける代表的なＦＡＣＳプロットは、インプットのＣＡＲ標的化Ｎａｌｍ６（ＢＣＭＡ^＋）とＴＣＲ標的化Ｎａｌｍ６（ＢＣＭＡ^－）との間の比を示し、並びにエフェクターなし、ＢＣＭＡＣＡＲ単独、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ^＋ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ^＋及びＢＣＭＡ－ＣＡＲ^＋ＭＲ１－ＴＣＲ^＋群からの２２日目の骨髄細胞懸濁液の分析を示す。ＢＣＭＡ^＋ＭＲ１^ｋｏ及びＮＹＥＳＯ１^＋ＭＲ１^ｗｔＮａｌｍ６について、示された群及び個々の群の各骨髄試料における絶対腫瘍数を図２３Ｂにプロットする。骨髄におけるこれらの腫瘍数は、様々なＣＡＲ及びＴＣＲ抗原の組み合わせについてのＣＡＲ及びＴＣＲ共発現ｉＴ細胞の抗原特異的ｉｎｖｉｖｏ有効性を確認した。

ＢＬＩ（図２４Ａ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）データ（図２４Ｂ）により、ＣＡＲ^＋ＴＣＲ^＋ｉＴ細胞で処置したマウスにおいて著しく良好なＴＧＩが確認され、ＴＣＲ標的化特異性はＮＹＥＳＯ１又はＭＲ１であった。更に、ＦＡＣＳ分析は、示された群からのｅｘｖｉｖｏｉＴ細胞上にチェックポイント阻害受容体、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＰＤ１が存在しないことを実証し、これは、ｉＴ細胞が２２日目までに枯渇しなかったことを示す（図２５）。更に、ＣＤ４５^＋ｉＴ細胞を、２２日目に骨髄の単一細胞懸濁液から磁気ビーズを用いて濃縮した。濃縮された細胞を２つのウェルに分割し、一方は無刺激対照用であり、他方はＮＹＥＳＯ１ペプチドの存在下でＢＣＭＡを発現するＮａｌｍ６ＭＲ１^ｗｔで刺激した。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）、Ｇｏｌｇｉｂｌｏｃｋ（商標）並びにＣＤ１０７ａ抗体及びＣＤ１０７ｂ抗体を全ての試料に添加した。４時間後、試料を表面タンパク質、生／死について染色し、細胞内染色について固定／ｐｅｒｍ処理した。図２６に示すように、２２日目の骨髄からのｅｘｖｉｖｏｉＴ細胞のサイトカイン産生及び脱顆粒能力は、エフェクター細胞が依然として機能的であることを確認した。

したがって、本明細書に提示されるデータは、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ腫瘍モデルの両方による腫瘍不均一性から生じる腫瘍エスケープの緩和におけるＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣの間の適合性及び増強された機能性を実証し、不均質で治療が困難な固形腫瘍に対処する際の既製の細胞免疫療法の戦略を提供する。

実施例９－抗原特異的ＴＣＲの代替としてのＣＡＲ設計
ＣＡＲが組換えＴＣＲ（又は外因性ＴＣＲ）と同じ腫瘍関連抗原を標的化するように設計され得るかどうかを評価するために、ＭＲ１－ＴＣＲを概念実証のために使用する。ＭＲ１の場合、トランスジェニックＴＣＲα鎖及びトランスジェニックＴＣＲβ鎖は、ＣＤ３ベースのエンゲージャーに有用な細胞表面ＣＤ３を再構成することに加えて、ＭＲ１特異的ＴＣＲシグナル伝達及び細胞傷害性を媒介する外因性ＴＣＲ複合体を形成する。図１０に示されるように、ＣＡＲ設計の１つの群において、ＣＡＲの外部ドメインは、任意の順序で連結された、トランスジェニックＴＣＲα鎖（Ｖα）の可変アルファ断片及びトランスジェニックＴＣＲβ鎖（Ｖβ）の可変ベータ断片からなる。図１０に示されるＣＡＲ設計の別の群は、ＣＡＲの結合領域が、トランスジェニックＴＣＲα鎖の可変領域及び部分定常領域並びにトランスジェニックＴＣＲβ鎖の可変領域及び部分定常領域からなるように、トランスジェニックＴＣＲα鎖（ＴＣＲαＥＣＤ）及びトランスジェニックＴＣＲβ鎖（ＴＣＲβ ＥＣＤ）の細胞外ドメインを利用する。

ＭＲ１－ＴＣＲに関連して、ＭＲ１Ｖα（ＭＲ１の可変アルファ（Ｖα）断片）は、配列番号２１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表され、ＭＲ１Ｖβ（ＭＲ１の可変アルファ（Ｖβ）断片）は、配列番号２２と少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表され、ＭＲ１ＴＣＲαＥＣＤは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表され、ＭＲ１ＴＣＲβＥＣＤは、配列番号２４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表される。

配列番号２１

（下線を付したシグナルペプチドは、長さ及び配列が柔軟である。以下も同じ）。
配列番号２２

配列番号２３

配列番号２４

試験目的のために、ＣＡＲの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインは、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ１ＸＸを組み込んだ。細胞特異的表面発現プロファイルを調べるために、設計されたＣＡＲをそれぞれ初代ＮＫ細胞及び初代Ｔ細胞において発現させる。図１０の各ＣＡＲコンストラクトは、Ｃ末端にＴｈｙ１．１マーカーを更に含有し、これは、２Ａペプチド（図示せず）によってコンストラクトから分離されている。形質導入後約１０日目に、形質導入された細胞をＦＡＣＳによってＣＡＲ発現及びＴｈｙ１．１発現についてアッセイする。形質導入に成功した細胞をＴｈｙ１．１発現に基づいてソーティングする一方で、ＣＡＲの抗原結合領域に特異的な抗体を用いてＣＡＲ染色を実施した。

ＣＡＲ候補によって媒介される抗原特異的殺傷を示すために、ＭＲ１－ＣＡＲＮＫ細胞又はＴ細胞を、陰性対照としてＭＲ１－ＣＡＲを有さない細胞を使用して、ＭＲ１を発現するか、又はＭＲ１ｎｕｌｌ若しくは低ＭＲ１である腫瘍細胞と共培養する。次いで、特異的な殺傷能力を示す各ＭＲ１－ＣＡＲをｉＰＳＣに形質導入する。全てのＭＲ１－ＣＡＲｉＰＳＣ株を、ＣＡＲ発現、核型異常、及びゲノム安定性について試験する。ｉＰＳＣにおける発現の有無にかかわらず、各ＭＲ１－ＣＡＲ－ｉＰＳＣ株を、本明細書に記載の方法に従って、Ｔ細胞分化及びＮＫ細胞分化の両方のために継続する。１０日目及び２０日目の中間細胞、並びに分化中の他の時点での細胞を、マーカー発現プロファイル及び細胞増殖について特徴付ける。重要な時点及び分化プロセスの終わりにおける細胞増殖も評価する。

ＭＲ１－ＣＡＲを発現する誘導エフェクター細胞の機能プロファイルを決定するために、エフェクター細胞及びＭＲ１発現腫瘍細胞株細胞（標的細胞）を共培養する。同じ共培養条件内で、ＭＲ１－ＣＡＲエフェクター細胞活性化を、サイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生、表面ＣＤ１０７ａの評価による脱顆粒、並びにカスパーゼベースのフローアッセイを用いた標的細胞株の直接殺傷によって調べる。ＭＲ１陰性標的と共培養した場合に活性の差が観察されなかった場合と比較して、ＭＲ１陽性標的細胞に応答した、サイトカイン及び脱顆粒のレベルの増加並びにＭＲ１－ＣＡＲエフェクター細胞対非改変エフェクター細胞による直接殺傷の増加は、ＭＲ１細胞表面抗原の存在下でのＭＲ１－ＣＡＲエフェクター細胞活性化及び細胞傷害性を示す。

ヒトＭＲ１発現癌細胞株を標的として使用して、ＭＲ１－ＣＡＲのｉｎｖｉｖｏ機能を評価する。ｉｎｖｉｖｏ評価のために、マウスＴ細胞又はヒトＴ細胞を免疫不全ＮＳＧマウスに移植する。腫瘍進行の遅延、腫瘍退縮の誘導、及び／又は生存の延長は、ＭＲ１－ＣＡＲ発現初代又は誘導エフェクター細胞を使用した腫瘍型のいずれかを有するＮＳＧマウスの処置において評価される。

当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。

本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び必要に応じた特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によってしばしば想到され得、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。

Claims

細胞又はその集団であって、前記細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ又はそれらから分化した誘導細胞であり、前記細胞は、
（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｔｇＴＣＲα鎖及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖は、第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドと、任意選択で、
（ｉｉｉ）少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドと、を含む、細胞又はその集団。
（ｉ）前記ｔｇＴＣＲα鎖をコードする前記ポリヌクレオチド及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖をコードする前記ポリヌクレオチドは、バイシストロニックなコンストラクトに含まれ、任意選択で、
（ａ）前記コンストラクトは、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入され、
（ｂ）前記コンストラクトの挿入は、前記挿入部位における内因性ＴＣＲα又は内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは
（ｃ）前記コンストラクトの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター又は外因性プロモーターによって駆動されるか、又は
（ｉｉ）前記ＣＡＲ又は前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣに挿入され、任意選択で、
（ａ）前記ＣＡＲ又は前記エンゲージャーをコードするポリヌクレオチドの挿入は、前記挿入部位における前記内因性ＴＣＲα又は前記内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは
（ｂ）前記ＣＡＲ又は前記エンゲージャーの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター又は外因性プロモーターによって駆動されるか、又は
（ｉｉｉ）前記ｔｇＴＣＲα鎖及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖、前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチド、若しくは前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、１つ以上のセーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に挿入される、請求項１に記載の細胞又はその集団。
（Ｉ）前記コンストラクト及び前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドはそれぞれ、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されるが、同じ定常領域には挿入されず、それによって、内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊し、前記内因性ＴＣＲをノックアウトし、
（ａ）前記トランスジェニックＴＣＲα及び前記内因性ＴＣＲβ、若しくは、
（ｂ）前記トランスジェニックＴＣＲβ及び前記内在性ＴＣＲαを含む不対合ＴＣＲを回避するか、
又は（ＩＩ）前記コンストラクト及び前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドはそれぞれ、セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座を含む遺伝子座に組み込まれる、請求項２に記載の細胞又はその集団。
（ｉ）前記セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、又はＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み、
（ｉｉ）前記選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴのうちの１つであり、かつ／又は、
（ｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドの前記組み込みは、前記遺伝子座における前記遺伝子の発現をノックアウトする、請求項３に記載の細胞又はその集団。
前記第１の腫瘍抗原及び前記第２の腫瘍抗原はそれぞれ、
（ｉ）ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ及びＰＤＬ１、又は
（ｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、Ｂ７Ｈ３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＲ１、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、ＮＹＥＳＯ１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＤＬ１、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原のうちの少なくとも１つを含み、
前記第１の腫瘍抗原及び前記第２の腫瘍抗原は、同じか又は異なっている、請求項１に記載の細胞又はその集団。
前記第１の腫瘍抗原は、ＭＲ１、ＮＹＥＳＯ１、及びＭＩＣＡ／Ｂのうちの少なくとも１つを含むか、又は
（ｉ）前記ｔｇＴＣＲαは、配列番号７に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖα）断片と、配列番号８に対して少なくとも約８５％の同一性を有する配列を含むＴＣＲα定常断片と、を含み、かつ／若しくは
（ｉｉ）前記ｔｇＴＣＲβは、配列番号９に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖβ）断片と、配列番号１０に対して少なくとも約８５％の同一性を有する配列を含むＴＣＲβ定常断片と、を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
前記ＣＡＲは、
（ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、
（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
（ｖ）スプリットＣＡＲ、
（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
（ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、
（ｖｉｉｉ）不活性化ＣＡＲ、
（ｉｘ）任意選択で別個のコンストラクト内で、又はバイシストロニックなコンストラクト内で、細胞表面発現の外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分長又は完全長ペプチドと共発現されたもの、
（ｘ）任意選択で別個のコンストラクト内で、又はバイシストロニックなコンストラクト内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたものである、請求項１に記載のその集団の細胞。
前記エンゲージャーは、
（ｉ）前記細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメインと、
（ｉｉ）前記外因性ＴＣＲによって標的化される前記第１の腫瘍抗原とは異なる前記第２の腫瘍抗原を標的化する第２の結合ドメインであって、前記エンゲージャーの前記第２の結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１、又はＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つに特異的である、第２の結合ドメインと、を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
前記細胞は、
（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉｉ）導入されたＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、若しくはＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
（ｉｖ）ＣＤ１６若しくはそのバリアント、
（ｖ）キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、
（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、
（ｖｉｉ）表１に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊、又は
（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御のうちの１つ以上を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
前記ＣＤ１６又はそのバリアントは、
（ａ）高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインのＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全又は部分外部ドメイン、
（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達及び刺激ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の細胞又はその集団。
前記ＣＦＲは、内部ドメインに作動可能に接続された膜貫通ドメインに融合した外部ドメインを含み、前記外部ドメイン、前記膜貫通ドメイン及び前記内部ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持シグナル又はエンドサイトーシスシグナルを含まない、請求項９に記載の細胞又はその集団。
（ｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、任意の機能的バリアント、及びこれらの組み合わせ若しくはキメラのうちの少なくとも１つを含むシグナル伝達タンパク質の細胞外部分の完全長若しくは部分長を含むか、
（ｉｉ）前記ＣＦＲの前記外部ドメインは、選択されたアゴニストに結合するとシグナル伝達を開始するか、又は
（ｉｉｉ）前記ＣＦＲの前記内部ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドの少なくとも完全長若しくは一部を含む細胞傷害性ドメインを含み、任意選択で前記内部ドメインは、
（ａ）ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、若しくはこれらの任意の組み合わせの完全長若しくは一部を含む共刺激ドメイン、
（ｂ）ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはこれらの組み合わせの完全長若しくは一部を含む共刺激ドメイン、
（ｃ）ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、若しくはこれらの組み合わせを含むサイトカイン受容体の内部ドメインの完全長若しくは一部分を含む持続シグナル伝達ドメイン、及び／又は
（ｄ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＥＧＦＲ若しくはＦＡＳ受容体の完全な若しくは部分的な細胞内部分のうちの１つ以上を更に含む、請求項１１に記載の細胞又はその集団。
前記選択されたアゴニストは、（ｉ）抗体、若しくはその機能的バリアント若しくは断片、又は（ｉｉ）エンゲージャーであり、
前記選択されたアゴニストは、前記細胞に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか、若しくは前記細胞若しくはその集団を含む培地に含まれる、請求項１２に記載の細胞又はその集団。
前記細胞表面発現外因性サイトカイン又はその受容体は、
（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体（複数可）のうちの少なくとも１つを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、
（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断された若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣは、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに
（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個のコンストラクトで若しくはバイシストロニックなコンストラクトで、ＣＡＲと共発現され得、又は
（ｃ）
（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣは、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含み、（ｃ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個のコンストラクトで若しくはバイシストロニックなコンストラクトで、ＣＡＲと共発現され得、
任意選択で、
（ｄ）一過性に発現される、請求項９に記載の細胞又はその集団。
前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストである、請求項９に記載の細胞又はその集団。
前記細胞は、同じ遺伝子編集（複数可）を有さない末梢血、臍帯血又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
（ｉ）増加された細胞傷害性、
（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
（ｉｉｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走、及び／又は活性化若しくは動員する増強された能力、
（ｉｖ）改善された腫瘍浸透、
（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープの救済の改善された能力、
（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
（ｖｉｉｉ）増強又は獲得したＡＤＣＣ、並びに
（ｉｘ）兄弟殺しを回避する能力、
のうちの１つ以上を含む治療特性を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
前記誘導細胞は、誘導ＣＤ３４^＋細胞、誘導造血幹細胞及び前駆細胞、誘導多能性造血前駆細胞、誘導Ｔ細胞前駆細胞、誘導ＮＫ細胞前駆細胞、誘導Ｔ系統細胞、誘導ＮＫＴ系統細胞、誘導ＮＫ系統細胞、誘導Ｂ系統細胞、若しくは対応する初代Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及び／若しくはＢ細胞に存在しない１つ以上の機能的特徴を有する誘導エフェクター細胞を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
前記誘導エフェクター細胞は造血細胞であり、その対応する初代細胞と比較してより長いテロメアを含む、請求項１７に記載の細胞又はその集団。
前記細胞は表１に列挙される遺伝子型のうちの１つを含むか、又は前記細胞は、
（ｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＤ１９－ＣＡＲ、（２）ＴＲＡＣノックアウト、及び（３）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（４）ＴＲＢＣノックアウト；
（ｉｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ及びｈｎＣＤ１６挿入、（２）ＴＲＡＣノックアウト、及び（３）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（４）ＴＲＢＣノックアウト；若しくは
（ｉｉｉ）（１）ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ挿入、（２）ＴＲＡＣノックアウト、（３）ＣＤ３８遺伝子座におけるｈｎＣＤ１６挿入、（４）ＣＤ３８ノックアウト、及び（５）ＭＲ１－ＴＣＲ若しくはＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ、並びに任意選択で（６）ＴＲＢＣノックアウト；を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞又はその集団を含む組成物。
前記細胞又はその集団は、前記ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含み、前記組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
前記１つ以上の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、エンゲージャー、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項２１に記載の組成物。
（ａ）前記チェックポイント阻害剤は、
（ｉ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ_２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、
（ｉｉ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、若しくは
（ｉｉｉ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つを含むか、又は
（ｂ）前記１つ以上の治療薬は、ベネトクラクス、アザシチジン、及びポマリドマイドのうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の組成物。
前記抗体、又はその機能的バリアント若しくは断片は、
（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、及び／若しくは抗ＣＤ３８抗体、
（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オクレリズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、及びこれらのヒト化若しくはＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、並びにこれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、又は
（ｃ）ダラツムマブを含み、前記誘導エフェクター細胞は、ＣＤ３８ノックアウトを含み、任意選択でＣＤ１６若しくはそのバリアントを発現する、請求項２２に記載の組成物。
前記エンゲージャーは、
（ｉ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
（ｉｉ）二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、若しくは
（ｉｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を含むか、又は
前記エンゲージャーは、
（ａ）前記細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメインと、
（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＰ１、若しくはＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つを含む抗原に特異的な第２の結合ドメインと、を含む、請求項２２に記載の組成物。
請求項２０～２５のいずれか一項に記載の治療用組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
請求項１～１９のいずれか一項に記載のクローンｉＰＳＣを含むマスター細胞バンク（ＭＣＢ）。
請求項１～１９のいずれか一項に記載の誘導エフェクター細胞を製造する方法であって、前記方法は、
遺伝子操作されたｉＰＳＣをＴ細胞に分化させることを含み、前記ｉＰＳＣは、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び任意選択で（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択で前記ｉＰＳＣは、
（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉｉ）導入されたＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、若しくはＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、
（ｉｖ）ＣＤ１６若しくはそのバリアント、
（ｖ）キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、
（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体、
（ｖｉｉ）表１に列挙される遺伝子型のうちの少なくとも１つ、
（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つの欠失若しくは破壊、又は
（ｉｘ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入若しくは上方制御のうちの１つ以上を更に含む、方法。
クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、（ａ）前記トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードする前記ポリヌクレオチド、（ｂ）前記トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードする前記ポリヌクレオチド、及び任意選択で（ｃ）前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は前記第２の腫瘍抗原を標的とする前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドをノックインすることを更に含み、任意選択で前記クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、
（ｉ）ＣＤ３８をノックアウトすること、
（ｉｉ）Ｂ２Ｍ及び／若しくはＣＩＩＴＡをノックアウトすること、
（ｉｉｉ）ＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方をノックアウトすること、並びに／又は
（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇ、前記ＣＤ１６若しくはそのバリアント、前記ＣＦＲ並びに／又は細胞表面発現外因性サイトカイン及び／若しくはその受容体の部分ペプチド若しくは完全ペプチドを含むシグナル伝達複合体を導入することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
前記ゲノム操作することは、標的化編集を含む、請求項２９に記載の方法。
前記標的化編集は、欠失、挿入、又はインデルを含み、前記標的化編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の任意の他の機能的バリエーションによって行われる、請求項３０に記載の方法。
腫瘍細胞表面抗原ＭＲ１に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＭＲ１－ＣＡＲは、
（ｉ）少なくとも１つの抗原認識ドメインを含む外部ドメインであって、前記抗原認識ドメインは、
（ａ）配列番号７（ＭＲ１Ｖα）に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変アルファ（Ｖα）断片及び配列番号８（ＭＲ１Ｖβ）に対して少なくとも約８５％の同一性を有する可変ベータ（Ｖβ）断片、又は
（ｂ）配列番号１５に対して少なくとも約８５％の同一性を有するＭＲ１ＴＣＲαの細胞外ドメイン及び配列番号１６に対して少なくとも約８５％の同一性を有するＭＲ１ＴＣＲβの細胞外ドメインを含む、外部ドメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインであって、前記第１のシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の活性化又は機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来する、内部ドメインと、を含み、
前記腫瘍細胞表面抗原ＭＲ１は、非多型である、キメラ抗原受容体。
前記シグナル伝達タンパク質は、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧＦｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＣＤ３ζ１ＸＸ（ＣＤ３ζバリアント）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つを含む、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
前記内部ドメインは、第２のシグナル伝達ドメイン、及び任意選択で第３のシグナル伝達ドメインを更に含み、前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、及び前記第３のシグナル伝達ドメインは異なる、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
前記第２のシグナル伝達ドメイン又は前記第３のシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部を含む、請求項３４に記載のキメラ抗原受容体。
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域のアミノ酸配列又はその一部を含む、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
前記外部ドメインは、
（ｉ）シグナルペプチド、及び／又は、
（ｉｉ）スペーサー／ヒンジ／リンカーを更に含む、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＣＡＲは、細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分又は完全長ペプチドを同時発現するバイシストロニックなコンストラクトに含まれ、前記外因性サイトカイン又はその受容体は、
（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及びそのそれぞれの受容体（複数可）のうちの少なくとも１つを含むか、又は
（ｂ）
（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの共発現、
（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断された若しくは排除されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣは、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに
（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個のコンストラクトで若しくはバイシストロニックなコンストラクトで、ＣＡＲと共発現され得、又は
（ｃ）
（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣは、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含む、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＭＲ１－ＣＡＲは、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、黒色腫、骨癌、乳癌、卵巣癌、又は血液癌のうちの１つ以上に特異的である、請求項３２に記載のキメラ抗原受容体。
細胞又はその集団であって、前記細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ又はそれらから分化した誘導細胞であり、前記細胞は、少なくとも請求項３２～３９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞又はその集団。
前記細胞は、
（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｔｇＴＣＲα鎖及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖は、ＭＲ１以外の第１の腫瘍抗原を認識する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドと、任意選択で、
（ｉｉｉ）少なくとも第２の腫瘍抗原を標的とするエンゲージャーをコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドと、を更に含む、請求項４０に記載の細胞又はその集団。
（ｉ）前記ｔｇＴＣＲα鎖をコードする前記ポリヌクレオチド及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖をコードする前記ポリヌクレオチドは、バイシストロニックなコンストラクトに含まれ、任意選択で、
（ａ）前記コンストラクトは、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ）に挿入され、
（ｂ）前記コンストラクトの挿入は、前記挿入部位における内因性ＴＣＲα若しくは内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは
（ｃ）前記コンストラクトの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター又は外因性プロモーターによって駆動されるか、又は
（ｉｉ）前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣに挿入され、任意選択で、
（ａ）前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドの挿入は、前記挿入部位における前記内因性ＴＣＲα若しくは前記内因性ＴＣＲβの発現を破壊し、かつ／若しくは
（ｂ）前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーの発現は、ＴＣＲの内因性プロモーター若しくは外因性プロモーターによって駆動されるか、又は
（ｉｉｉ）前記ｔｇＴＣＲα鎖及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖、前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチド、若しくは前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、１つ以上のセーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座に挿入される、請求項４１に記載の細胞又はその集団。
（Ｉ）前記コンストラクト及び前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドはそれぞれ、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されるが、同じ定常領域には挿入されず、それによって、内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊し、前記内因性ＴＣＲをノックアウトし、
（ａ）前記トランスジェニックＴＣＲα及び前記内因性ＴＣＲβ、若しくは、
（ｂ）前記トランスジェニックＴＣＲβ及び前記内在性ＴＣＲαを含む不対合ＴＣＲを回避するか、
又は（ＩＩ）前記コンストラクト及び前記ＣＡＲ若しくは前記エンゲージャーをコードする前記ポリヌクレオチドはそれぞれ、セーフハーバー遺伝子座若しくは選択された遺伝子座を含む遺伝子座に組み込まれる、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
請求項４０～４３のいずれか一項に記載の細胞又はその集団を含む組成物。
前記細胞又はその集団は、前記ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞を含み、前記組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む、請求項４４に記載の組成物。
請求項４４又は４５に記載の治療用組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、癌、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
前記対象は、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、骨癌、乳癌、卵巣癌、又は血液癌を有する、請求項４６に記載の組成物の治療的使用。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を増強する方法であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲを介した第１の腫瘍抗原特異性を有し、前記方法は、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞に、
（ｉ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｔｇＴＣＲα鎖及び前記ｔｇＴＣＲβ鎖は、第２の腫瘍抗原特異性を有する外因性ＴＣＲ複合体（ＴＣＲ^ｅｘｏ）を形成する、ポリヌクレオチドと、を導入することを含み、
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ誘導性腫瘍殺傷効力は、ＴＣＲ^ｅｘｏの発現によって増強される、方法。
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、
（ｉ）内因性ＴＣＲα及び内因性ＴＣＲβの両方の発現を破壊することによる内因性ＴＣＲノックアウトを含むか、又は
（ｉｉ）前記ＣＡＲは、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入され、
それにより、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の内因性ＴＣＲα又は内因性ＴＣＲβの発現を破壊する、請求項４８に記載の方法。
前記方法は、ＴＣＲ^ｅｘｏによって認識される前記第２の腫瘍抗原を用いてＴＣＲ^ｅｘｏを活性化することを更に含み、前記第１の腫瘍抗原特異性及び前記第２の腫瘍抗原特異性は異なる、請求項４８又は４９に記載の方法。
前記ＣＡＲ－Ｔ細胞にポリヌクレオチドを導入するステップは、
遺伝子操作されたｉＰＳＣをＴ細胞に分化させることであって、前記ｉＰＳＣは、（ａ）トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）第１の腫瘍抗原特異性を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、分化させることと、それによって、前記ＴＣＲ^ｅｘｏの発現を有する前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を得ることと、を更に含む、請求項４８に記載の方法。
クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、（ａ）前記トランスジェニックＴＣＲα鎖（ｔｇＴＣＲα）をコードする前記ポリヌクレオチド、（ｂ）前記トランスジェニックＴＣＲβ鎖（ｔｇＴＣＲβ）をコードする前記ポリヌクレオチド、及び（ｃ）第１の腫瘍抗原特異性を有するＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドをノックインし、それによって、Ｔ細胞分化のための操作されたｉＰＳＣを得ることを更に含む、請求項５１に記載の方法。