KR20180066263A - 조혈 세포 분화를 유도하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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hematopoietic
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바흐람 발라메르
라둔 클라크
라이언 비요달
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페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 배양 플랫폼, 세포 배지, 및 만능 세포를 조혈 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 배양 플랫폼 및 방법을 이용하여 생성된 만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 추가로 제공하는데, 이는 EB 형성의 부재 하에 무 공급물 단일층 배양을 가능하게 한다. 구체적으로, 본 발명의 만능 줄기세포-유래 조혈 세포는 iHSC, 확정적 조혈 내피세포, 조혈 다능성 전구체, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 B 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

Description

조혈 세포 분화를 유도하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 2015년 11월 4일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/251,016호; 2016년 1월 26일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US16/14918; 및 2015년 5월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제 62/337,093호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 만능 줄기세포로부터의 모든 조혈 계통 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 유도 만능 줄기세포를 포함하는 만능 줄기세포로부터의 모든 조혈 계통 세포를 제조하기 위한 개선된 배양 플랫폼에 관한 것이다.
인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC) 기법은 암을 포함하는 수많은 혈액학적 및 비-혈액학적 악성종양의 치료를 위한 고도로 유망하고 잠재적으로 제한되지 않은 공급원을 나타낸다. 조혈 세포 치료제의 동종이계 공급원으로서 hiPSC 및 게놈 조작된 hiPSC 기법의 장래성을 진행시키기 위해, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC)뿐만 아니라 T, B, NKT 및 NK 림프 세포의 서브세트, 및 이들의 전구 세포를 포함하는 면역 효과기 집단을 효율적으로 그리고 재현 가능하게 생성할 수 있는 것은 필수적이다.
림프구를 생성하기 위한 잠재력을 갖는 HSC의 시험관내 유도는 배아 발생 동안 혈액 형성의 적어도 2가지의 일시적으로 그리고 공간적으로 별개의 웨이브(원시적 및 확정적 조혈)의 존재에 의해 복잡하게 된다. 원시적 조혈작용은 배아외 난황낭에서 개시되며, 원시적 적혈구 및 골수성 세포(그러나, HSC는 아님)를 주로 포함하는 일시적이고 제한된 조혈 레퍼토리를 생성한다. 발생기 HSC는 이후에 확정적 조혈 내피세포(HE)로 칭해지는 동맥 혈관 내의 전문화된 내피세포 전구체로부터의 확정적 웨이브 동안 나타난다. 이어서, 확정적 HE는 내피세포에서 조혈로의 이행을 겪어서 HSC이 생기게 되고, 이어서, 그들이 T, B, NKT 및 NK 림프 세포를 포함하는 다계통 조혈작용을 지속하는 경우 성인 수명 내내 궁극적으로 골수로 이동한다. 따라서, 만능 줄기세포로부터의 HSC 및 림프구 효과기 세포의 생성은 잘 설계된 그리고 입증된 방법 및 조성물을 통해 확정적 프로그램에 대한 초기 배아 조혈 발생의 복잡한 단계를 정확하게 요약하는 능력에 따른다.
제한된 수의 연구는 시험관내 확정적 HE로의 hiPSC의 관련된 분화를 기재하였다. 치료적 목적을 위해 hiPSC를 이용하는데 있어서 주된 장애는 만능성을 유지하기 위해 그리고 분화를 유도하기 위해 질병-한정 혈청 함유 배지의 존재 하에 뮤린- 또는 인간- 유래 기질 세포와 함께 이러한 세포를 초기에 공동 배양시키는 것의 필요였다. 추가로, 현재의 프로토콜은 또한 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포를 포함하는 다양한 분화 세포를 포함하는 세포의 이종성 응집물인 배상체(embryoid body: EB)를 형성하기 위해 iPSC를 배양시키는 것으로 이루어진 전략을 사용하였다. 해당 절차는, 예를 들어, 클럼프를 형성하기 위해 교반시킴으로써, 웰에서 세포가 침강되고 응집되게 하거나 또는 현탁 배양물에서 수동 응집 및 클럼프 형성을 허용하여 만능 세포를 응집시키는 것을 필요로 한다. 형성된 EB는 배양 시스템을 포함하는 분화의 특정 지속기간, 전형적으로 7일 내지 10일 동안 유지되어, 적절한 분화를 허용하고, 이어서, EB는 추가 성숙 동안 부착 배양물에 전달되거나 또는 후속적 분화 단계로 진행하기 위해 세포 유형 선택 동안 단일 세포 내로 해리된다. (Kennedy et al., Cell Reports 2012:1722-1735; Knorr, et al., Stem Cells Translational Medicine 2013 (2):274-283). 예를 들어, 케네디(Kennedy) 등은 iPSC 분화를 위해 EB를 생성하는 것을 교시하며, 여기서 만능 세포는 콜라게나제 및 트립신으로 처리되어 작은 응집물을 형성하기 위한 세포의 스크레이핑(scraping)을 허용하고, 이어서 EB를 형성하기 위해 배양되었다. EB 형성은 만능 줄기세포 분화를 용이하게 하는 것으로 나타났지만, 그러나, 응집물 및 후속적 EB 형성의 필요는 노동 집약적이고, 이 과정에서 세포 수는 최소로 증가하며, 3차원 EB에서 세포 함량은 일관되지 않게 그리고 균질하지 않게 배지 인자에 노출되는데, 이는 가변 분화 단계에서의 이종성 세포 생성물을 야기하고, 효율적이고 능률적이 되는 데 필요한 제조 과정의 확장성 및 재현성을 크게 방해한다.
따라서, 공동 배양 또는 혈청-함유 배지에 의존하는 일 없이, 그리고 중간체로서 배상체 응집물의 형성을 필요로 하는 일 없이 확정적 조혈작용에 대해 줄기세포를 분화시키는 방법 및 조성물에 대한 필요가 있다.
본 발명은 일반적으로 세포 배양 조건, 배지, 배양 플랫폼, 및 줄기세포를 조혈 세포 운명으로 배양시키고 분화시키는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 혈청/무 피더(feeder -free) 조건 하의 hiPSC 그리고 EB 형성의 필요 없이 확장성 있는(scalable) 단일층 배양 플랫폼을 포함하는 만능 줄기세포로부터 유래된 확정적 조혈 내피세포(HE)를 통한 조혈 세포 계통의 생성을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기세포로부터 특정 말기에 분화되는 세포 및 교차분화되는(transdifferentiated) 세포로 구속된 전구 세포, 만능 중간체를 통하는 일 없이 조혈 운명으로 직접 이행되는 다양한 계통의 세포의 범위에 있다. 유사하게, 줄기세포의 분화에 의해 생성된 세포는 다능성 줄기 또는 전구 세포로부터 말기에 분화되는 줄기세포, 및 모든 사이에 오는 조혈 세포 계통까지의 범위에 있다.
본 발명은 단일층 배양에서 만능 줄기세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화시키고 확장시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는데, 이는 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이렇게 해서, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하는 일 없이 얻어지고, 확장된다. 이어서, 중배엽 세포는 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와 접촉되어 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하는 일 없이 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 확장된 중배엽 세포를 얻는다. bFGF, 및 선택적으로, ROCK 저해제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속적 접촉에 의해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 확정적 HE 세포로 분화되는데, 이는 또한 분화 동안 확장된다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위해, 본 명세서에 제공된 방법은 EB-매개 만능 줄기세포 분화보다 우수한데, EB 형성은 보통 내지 최소 세포 확장을 야기하며, 집단 내 세포의 균일한 확장 및 균일한 분화를 필요로 하는 다수의 적용분야에 중요한 단일층 배양을 허용하지 않고, 그리고 힘이 들며, 효율이 낮기 때문이다.
본 명세서에서 조혈 줄기세포 및 분화된 자손, 예컨대 T, B, NKT 및 NK 세포의 유도를 초래하는 확정적 조혈 내피세포로의 분화를 용이하게 하는 단일층 분화 플랫폼이 제공된다. 입증된 단일층 분화 전략은 다양한 치료적 적용을 위해 치료적으로 적절한 수의 만능 줄기세포-유래 조혈 세포의 전달을 가능하게 하는 대규모 확장과 향상된 분화 효율을 조합한다. 추가로, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법을 이용하여 단일층을 배양시키는 것이 시험관내 분화, 생체밖 조정, 및 생체내 장기간 조혈 자기-재생, 재구성 및 생착의 완전한 범위를 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포를 야기한다는 것을 개시하였다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, iPSC 유래 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양상은 하기를 포함하는, 만능 줄기세포-유래 조혈 계통 세포를 얻기 위한 배양 플랫폼을 제공한다: (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화시키고 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 데 적합한, 배양 배지; 및 (iii) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화시키고 확장시키는 데 적합한, 배양 배지. 일부 실시형태에서, 상기 배양 플랫폼의 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 배양 플랫폼은 (iv) MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지를 추가로 포함하되, 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종하고 확장시키는 데 적합하다.
상기 배양 플랫폼의 일부 실시형태에서, 하기의 추가적인 배양 배지: (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상은 없는 배양배지로서, 상기 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체가 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화하는 데 적합한, 배양 배지; 또는 (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 프레-T 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한, 배양 배지를 추가로 포함하고, 이들 추가적인 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 데 적합하다.
상기 배양 플랫폼의 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 추가로 (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고, 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체를 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지; 또는 (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 배지로서; 상기 배지는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 프레-NK 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한 배양 배지를 포함할 수 있고; 그리고 이들 추가적인 배지는 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 데 적합하다.
일 실시형태에서, 상기 제공된 배양 플랫폼은 (i) BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하지만, ROCK 저해제는 없는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 프레-HSC를 조혈 다능성 전구체로 분화시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, ROCK 저해제 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 프레-HSC로 분화시키는 데 적합한, 배양 배지를 추가로 포함하고; 그리고 이들 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 조혈작용 다능성 전구체를 생성하기 위해 제공되는, 상기 배양 배지.
본 발명의 다른 양상은 만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 분화 및 확장시키기 위한 조성물을 제공하며, 이는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 선택적으로, Wnt 경로 활성자; 및 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고, 상기 배지는 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제(TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없음); 및 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; 및 (iii) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF; 및 iPSC를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 상기 배양 배지.
만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 분화 및 확장시키기 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 조혈 계통 세포에 보유된다.
만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 분화 및 확장시키기 위한 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 추가적인 배양 배지, 예컨대: (vi) MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제(TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없음); 및 만능 줄기세포를 포함하는 배양 배지로서; 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종하고 확장시키는 데 적합한, 상기 배양 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 조혈 계통 세포에 보유된다.
만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 분화 및 확장시키기 위한 상기 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 추가적으로: (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인(VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상은 없음); 및 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체가 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화하는 데 적합한, 배양 배지; 또는 (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자; 및 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-T 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한, 상기 배양 배지를 포함한다. 이들 추가적인 배지는 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 데 적합하다.
만능 줄기세포-유래 조혈 세포를 분화 및 확장시키기 위한 상기 조성물의 일 실시형태에서, 상기 조성물은 만능 줄기세포-유래 조혈작용 다능성 전구체를 생성하기 위한 하나 이상의 배지를 포함하되, 상기 배지는: (i) BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하지만, ROCK 저해제 및 만능 줄기세포-유래 프레-HSC는 없는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 프레-HSC가 조혈 다능성 전구체로 분화하는 데 적합한, 배양 배지; 및/또는 (ii) BMP 활성자, ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 확정적 조혈 내피세포가 프레-HSC로 분화하는 데 적합한, 상기 배양 배지를 포함한다.
본 발명의 일 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다: (i) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터의 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 데 적합한, 배양 배지; (iii) ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하고; 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장하는 데 적합한, 배양 배지; (iv) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자; 및 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 확정적 조혈 내피세포가 프레-T 세포 전구체로 분화하는 데 적합한, 배양 배지; 및 (v) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인(그러나, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없음); 및 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배양 배지는 프레-T 세포 전구체가 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화하는 데 적합한, 상기 배양 배지.
만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하기 위한 상기 배양 플랫폼의 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 하기를 추가로 포함한다: (vi) MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종하고, 확장시키는 데 적합한, 상기 배양 배지. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 T 계통 세포에 보유된다.
본 발명의 다른 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포-유래 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다: (i) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터의 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 데 적합한, 배양 배지; (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화시키는 데 적합한, 배양 배지; (iv) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-NK 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한, 배양 배지; 및 (v) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고, 프레-NK 세포 전구체를 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로 분화시키는 데 적합한, 배지.
만능 줄기세포-유래 NK 세포를 생성하기 위한 상기 배양 플랫폼의 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 (vi) MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종하고 확장시키는 데 적합한, 배양 배지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 NK 계통 세포에서 보유된다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다: (i) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터의 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 데 적합한, 배양 배지; 및 (iii) ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지.
만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하기 위한 배양 플랫폼의 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 (iv) MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키는 데 적합한, 배양배지를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포-유래 조혈작용 다능성 전구체를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다: (i) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFG를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포로부터의 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 분화 및 확장하는 데 적합한, 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 데 적합한, 배양 배지; (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없으며, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (iv) BMP 활성자, ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지로서; 상기 배양 배지는 확정적 조혈 내피세포가 프레-HSC로 분화하는 데 적합한, 배양 배지; 및 (v) BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지로서, 상기 배지는 ROCK 저해제가 없고, 배양 배지는 프레-HSC가 조혈 다능성 전구체로 분화하는 데 적합한, 배양 배지. 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 (vi) MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 배양 배지로서, 상기 배지는 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 조혈 세포에서 보유된다.
본 발명의 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 만능 줄기세포의 확정적 조혈 계통의 세포로의 분화를 지시하는 방법을 제공한다: (i) 만능 줄기세포로부터의 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 단계, (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 단계; 및 선택적으로, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 조혈 내피세포를 갖는 중배엽 세포 및/또는 확정적 조혈 내피세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압하에서 처리하는 단계.
만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 조혈 세포에서 보유된다.
만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화는 배상체의 생성이 결여되며, 단일층 배양 형태이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻어진 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻어진 확정적 조혈 내피세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+ CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) 확정적 조혈 내피세포의 프레-T 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) 프레-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 개시하기 위해 프레-T 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인(VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없음)을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다.
만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하기 위한 상기 방법의 또 다른 일부 실시형태에서, 상기 방법은: (i) 확정적 조혈 내피세포의 프레-NK 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) 프레-NK 세포 전구체의 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는, 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 전구체는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 추가로 나타낸다.
본 발명의 다른 양상은 하기 단계들을 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다: (i) 만능 줄기세포로부터의 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시시키기 위해 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 단계; (iv) 확정적 조혈 내피세포의 프레-T 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (v) 프레-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 개시하기 위해 프레-T 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 단계; 및 선택적으로, 파종된 만능 줄기세포, 중배엽 세포, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포 및/또는 확정적 조혈 내피세포는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압으로 처리될 수 있는 단계. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 그룹 II는 추가로: 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제(TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없음); 및/또는 만능 줄기세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 T 세포 계통으로의 분화는 배상체 생성이 결여되며, 단일층 배양 형식이다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법을 제공한다: (i) 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 및 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; ROCK 저해제; 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고; 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; (iv) 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포의 프레-NK 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (v) 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체의 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 조혈 내피세포를 갖는 중배엽 세포 및/또는 확정적 조혈 내피세포는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리되는 단계. 실시형태에서, 그룹 II의 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법은 iPSC를 파종 및 확장시키기 위해 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하기 위한 방법은 배상체 생성이 결여되며, 단일층 배양 형식이다.
본 발명의 다른 양상은 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 만능 줄기세포로부터의 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 iPSC를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; ROCK 저해제; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 및/또는 확정적 조혈 내피세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압하에서 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하기 위한 상기 방법은 iPSC를 파종 및 확장시키기 위해 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없는 조성물과 접촉시키되, 그리고/또는 iPSC는 미경험 iPSC인 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포에서 보유된다. 일부 실시형태에서, iPSC를 확정적 조혈 내피세포로 분화시키는 상기 방법은 배상체 생성이 결여되며, 단일층 배양 형식이다.
본 발명의 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 조혈 계통의 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체를 생성하는 방법을 제공한다: (i) iPSC로부터의 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 iPSC를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 단계; (iv) 확정적 조혈 내피세포의 프레-HSC로의 분화를 개시하기 위해 확정적 조혈 내피세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (v) 프레-HSC의 조혈 다능성 전구체로의 분화를 개시하기 위해, 프레-HSC를 BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하지만, ROCK 저해제가 없는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, 파종된 만능 줄기세포, 중배엽 세포 및/또는 확정적 조혈 내피세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압하에서 처리하는 단계. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 조혈작용 다능성 전구체를 생성하기 위한 상기 방법은 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제는 없는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 만능 줄기세포 유래 조혈 다능성 전구 세포에 보유된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 이용하는 만능 줄기세포의 조혈작용 다능성 전구체로의 분화는 배상체 생성이 결여되며, 단일층 배양 형식이다.
본 발명의 추가 양상은 본 명세서에 개시된 배양 플랫폼으로부터 생성된 하나 이상의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다: 만능 줄기세포-유래 (i) CD34+ 확정적 조혈 내피세포(iCD34)(여기서, iCD34 세포는 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 B 세포로 분화하는 능력을 가지고, iCD34 세포는 CD34+CD43-임); (ii) 확정적 조혈 내피세포(iHE)(여기서, iHE 세포는 CD34+, 및 CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73- 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나임); (iii) 만능 줄기세포-유래 확정적 HSC(여기서, iHSC는 CD34+CD45+임); (iv) 조혈 다능성 전구 세포(여기서, iMPP 세포는 CD34+CD45+임); (v) T 세포 전구체(여기서, T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+임); (vi) T 세포(여기서, T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+임); (vii) NK 세포 전구체(여기서, NK 세포 전구체는 CD45+CD56+CD7+임); (viii) NK 세포(여기서, NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 추가로 NKp46+, CD57+, 및 CD16+에 의해 나타냄); (ix) NKT 세포(여기서, NKT 세포는 CD45+Vα24Jα18+CD3+임); 및 (x) B 세포(여기서, B 세포는 CD45+CD19+임).
또한 본 발명의 추가 양상은 1종 이상의 세포주, 또는 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 생성된 클론 세포: 만능 줄기세포-유래 (i) CD34+ 확정적 조혈 내피세포(iCD34)(여기서, iCD34 세포는 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 분화하는 능력을 가지고, iCD34 세포는 CD34+CD43-임); (ii) 확정적 조혈 내피세포(iHE)(여기서, iHE 세포주 또는 클론 세포는 CD34+, 및 CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73-, 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나임); (iii) 확정적 HSC(여기서, iHSC는 CD34+CD45+임); (iv) 조혈 다능성 전구 세포(iMPP)(여기서, iMPP 세포는 CD34+CD45+임); (v) T 세포 전구체(여기서, T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+임); (vi) T 세포(여기서, T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+임); (vii) NK 세포 전구체(여기서, NK 세포 전구체는 CD45+CD56+CD7+임); (viii) NK 세포(여기서, NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 추가로 나타냄); (ix) NKT 세포(여기서, NKT 세포는 CD45+Vα24Jα18+CD3+임); 및 (x) B 세포(여기서, B 세포는 CD45+CD19+임)를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 개시된 방법을 이용하여 생성된 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포 중 하나 이상을 이용하여 조혈 자기-재생 재구성 또는 생착을 촉진시키는 방법을 제공한다: 만능 줄기세포-유래 (i) CD34+ 확정적 조혈 내피세포(iCD34)(여기서, iCD34 세포는 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 분화하는 능력을 가지고, iCD34 세포는 CD34+CD43-임); (ii) 확정적 조혈 내피세포(iHE)(여기서, iHE 세포주 또는 클론 세포는 CD34+, 및 CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73- 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나임); (iii) 확정적 HSC(여기서, iHSC는 CD34+CD45+임); (iv) 조혈 다능성 전구 세포(여기서, iMPP 세포는 CD34+CD45+임); (v) T 세포 전구체(여기서, T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+임); (vi) T 세포(여기서, T 세포는 CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+임); (vii) NK 세포 전구체(여기서, NK 세포 전구체는 CD45+CD56+CD7+임); (viii) NK 세포(여기서, NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 추가로 나타냄); (ix) NKT 세포(여기서, NKT 세포는 CD45+Vα24Jα18+CD3+임); 및 (x) B 세포(여기서, B 세포는 CD45+CD19+임).
본 발명의 추가 양상은 향상된 치료적 특성을 갖는 조혈 계통 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC를 얻는 단계; 및 iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계를 포함한다. 분화를 지시하는 단계는 추가로 하기를 포함한다: (i) 중배엽 세포를 얻기 위해, 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF, 및 WNT 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 조혈 계통 세포를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 중배엽 세포 및 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 배상체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 얻어지고, 얻어진 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포를 포함한다. 게다가, 조혈 계통 세포는 지시된 분화를 위해 iPSC에 포함된 유전자 각인을 보유한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법의 지시된 분화 단계는 추가로: (i) 확정적 HE 세포를 얻기 위해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 얻기 위해, 확정적 HE 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 프레-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 얻기 위해, 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, TPO, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 또는 (iv) 프레-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 얻기 위해, 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC를 얻기 위해, 하나의 접근은 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안 또는 재프로그래밍한 후에 유전자 편집에 의해 하나 이상의 유전자 각인을 iPSC에 도입하되, 유전자 각인은 하나 이상의 유전자 변형된 양상을 포함하고, 유전자 각인은 iPSC의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 도입된다. 다른 접근은 (i) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포를 얻음으로써 iPSC에 하나 이상의 유전자 각인을 도입하되, 면역 세포는 보유 가능한 치료적 속성을 제공하는 것; (ii) 공급원 특이적 면역 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 것; 및 선택적으로 (iii) 공급원 특이적 면역 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안 또는 재프로그래밍한 후에 유전자 편집에 의해 단계 (ii)의 iPSC에 추가적인 유전자 각인을 도입하는 것일 수 있다. 공급원 세포, iPSC 및 또는 iPSC 유래 세포 내에 포함된 유전자 변형된 양상에 관해, 그들은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신(Tapasin), NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 관여자(engager)에 대한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형된 양상은 만능 줄기세포 유래 확정적 HE 세포, 조혈 다능성 전구체, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 B 세포 중 하나 이상에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이성 관여자는 하나 이상의 림프구 세포 표면 수용체에 대해 특이적이며, 종양 세포의 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적이다. 특정 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포, 및 호중구를 포함하는 조혈 계통 세포에 대해 보편적이다. 특정 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 IL2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 림프구 세포 표면 수용체는 조작된 양상, CD3, CD16, CD64 및 CD89를 발현시키는 표면 중 하나 이상을 포함하는 반면; 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 향상된 치료적 특성을 갖는 조혈 계통 세포를 제공하며, 이 세포는 조혈 계통 세포가 유래된 만능 줄기세포에 포함된 동일한 유전자 각인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 유전자 각인은 (i) iPSC로 비-만능 세포의 재프로그래밍 동안에 또는 재프로그래밍 후에 만능 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻어진 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하되, 만능 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 대한 표면 촉발 수용체의 도입 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 조혈 계통 세포에 대해 보편적이다. 특정 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 IL2를 포함한다. 또한 일부 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상에 관한 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다.
특정 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적이며, 종양 세포의 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태는 iPSC에 하나 이상의 유전자 각인을 도입하기 전에 세포를 파종하고 확장시키기 위해 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 조혈 계통 세포에 대해 보편적이다. 특정 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 IL2를 포함한다.
특정 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 종양 세포의 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 또는호중구를 포함한다. 일부 실시형태에서, T 세포는 T 조절 세포(Treg), 중앙 기억 T 세포(Tcm), 줄기세포 기억(Tscm) 및/또는 효과기 기억 T 세포(Tem)를 포함한다. 특정 실시형태에서, NK 세포는 적응 NK 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 표면 수용체에 대해 하나 이상의 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 a) 조혈 계통 세포 유형 특이적이고, 상기 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89를 포함하는 표면 수용체에 특이적이거나; 또는 b) 조혈 계통 세포 유형 독립적이고, 조혈 계통 세포는 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하되, 상기 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적이다.
유도 만능 줄기세포(iPSC) 분화로부터 유래된 치료적으로 충분한 수의 T 세포 전구체를 투여하는 단계를 포함하는 세포 요법이 필요한 대상체를 치료하는 특정 양상이 도출된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 (i) 골수 또는 줄기세포 이식에 대한 후보이거나, 또는 대상체는 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받았거나; (ii) 골수 제거 또는 비-골수소멸성 화학요법 또는 방사선 요법을 받았거나; (iii) 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나; (iv) 고형 종양을 갖거나; 또는 (v) 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖되; 투여된 T 세포 전구체는 흉선의 활력을 되찾게 하고, 생체내 T 세포를 재구성한다. 일부 실시형태에서, 세포 요법이 필요한 대상체를 치료하는 방법은 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 a) 효과기 세포 유형 특이적이고, 상기 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89를 포함하는 표면 수용체에 특이적이거나; 또는 b) 효과기 세포 유형 독립적이되, 관여자는 T-전구 세포 및 그것으로부터 유래된 T 세포에 포함된 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 공급원 특이적 면역 세포로부터의 유전자 각인은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 도입; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함한다.
또한 약제학적으로 허용 가능한 배지, 및 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생성된 향상된 치료적 특성을 갖는 조혈 계통 세포 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 향상된 치료적 특성을 갖는 이들 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, T 세포는 T 조절 세포(Treg), 중앙 기억 T 세포(Tcm), 줄기세포 기억(Tscm) 및/또는 효과기 기억 T 세포(Tem)를 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 적응 NK 세포를 포함한다. 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 상기 조성물을 도입하는 것에 의한 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도가 추가로 제공되되, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 가진다.
본 발명의 다른 양상은 CCR10, CD164, CD95, CD144, CD166, 림포톡신 β 수용체, CD252, CD55, CD40, CD46, CD340, CD119, CD106, CD66a/c/e, CD49d, CD45RB, DLL4, CD107a, CD116, CD324, CD123, CD49f, CD200, CD71, CD172a, CD21, CD184, CD263, CD221, Notch 4, MSC, CD97, CD319, CD69, CD338, 포도플라닌, CD111, CD304, CD326, CD257, CD100, CD32, CD253, CD79b, CD33, CD83, GARP, CD183, CD357, CD31, CD165, CD102, CD146, CD49c, CD13, CD58, 인테그린 α9β1, CD51, CD10, CD202b, CD141, CD49a, CD9, CD201, CD47, CD262, CD109, CD39, CD317, CD143, 인테그린 β5, CD105, CD155, SSEA-4 및 CD 93으로부터 선택된 적어도 하나의 마커에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 항체 조성물을 제공하되; 상기 마커는 확정적 조혈 내피세포를 동정하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 항체 조성물은 CD93에 특이적인 항체를 포함하되; CD93에 특이적인 항체에 접합된 세포는 CD34+, CD43-, CD73-, CXCR4- 및 CD73-CXCR4- 표현형 중 하나 이상을 가진다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기를 포함하는 만능 줄기세포 분화에서 확정적 조혈 내피세포를 동정하는 방법을 제공한다: (i) 분화를 겪는 세포 집단을 얻는 단계; (ii) 세포 집단에 CD93에 특이적인 항체를 도입하는 단계; 및 (iii) 1% 미만의 CD93 발현 수준을 갖는 세포 집단을 동정하는 단계. 일부 실시형태에서, 분화를 겪는 세포 집단은 CD34+ 또는 CD34+CD43- 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 분화를 겪는 세포 집단으로부터 CD34+ 세포를 단리시키는 단계; 또는 분화를 겪는 세포 집단으로부터 CD34+CD43- 세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
추가로, 확정적 HE 세포를 얻기 위해, Wnt 경로 작용제를 포함하는 배지에서 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포 유래 중배엽을 배양시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법이 제공된다. Wnt 경로 활성자의 존재 하에 확정적 HE를 얻는 단계는 세포 집단에서 HE 수 및 백분율을 증가시키며; HE 분화 효능을 개선시키고; 그리고/또는 Wnt 경로 활성자가 없는 배양에 비해 HE 세포질을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 배지는 추가로 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 만능 줄기세포-유래 확정적 HE에 보유된 상기 기재한 바와 같은 하나 이상의 유전자 각인을 포함한다.
본 발명의 특정 양상은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물에 대해 도출된다. 본 발명의 일부 양상은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함하는 약제학적 조성물에 대해 도출된다.
또한 하기 단계를 포함하는 항원-특이적 유도 만능 줄기세포(iPSC) 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법이 또한 제공된다: (i) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응- 특이적인 선택된 공급원으로부터 1차 항원 특이적 T 세포를 단리시키는 단계; (ii) 만능 줄기세포를 얻기 위해, 1차 항원-특이적 T 세포를 재프로그래밍하는 단계; 및 (iii) 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계. 일부 실시형태에서, 분화를 지시하는 단계는 (i) 중배엽 세포를 얻기 위해, 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 배상체를 형성하는 일 없이 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF, 및 WNT 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 1차 항원 특이적 T 세포는: (i) 1차 항원 특이적 T 세포를 종양 세포, 비형질전환 세포, 수지상 세포, 흉선 상피 세포, 내피세포 또는 인공 항원 제시 세포, 혈장 입자 또는 관심 대상의 관심 대상 발현 항원(들)의 펩타이드 발현 항원(들)과 공동 배양시키는 단계; 또는 관심 대상의 항원(들)에 특이적인 T 세포 수용체-특이적 결합제를 이용하여 1차 항원 특이적 T 세포를 분류하는 단계에 의해 풍부하게 된다. 일부 실시형태에서, 세포의 활력을 되찾기 위해 1차 항원 특이적 T 세포 또는 풍부화된 1차 항원 특이적 T 세포는 전사 인자 또는 소분자를 이용하여 조절될 수 있다.
본 발명의 특정 양상은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물에 대해 도출된다. 본 발명의 일부 양상은 본 명세서에 기재된 방법 및 약제학적으로 허용 가능한 배지에 의해 생성된 항원-특이적 iPSC 또는 유도체 조혈 계통 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 대해 도출된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 항원-특이적 만능 줄기세포는 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통한 하나 이상의 유전자 변형된 양상을 포함하는 유전자 각인을 포함하기 위해 재프로그래밍 동안에 또는 후에 추가로 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 2차 또는 3차 항원 특이성을 전달하는 세포 표면 단백질; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 대한 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 조혈 계통 세포 유형 특이적이고, 이렇게 해서 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89로부터 선택된 표면 수용체에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 조혈 계통 세포에 대해 보편적이다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 조혈 계통 세포 유형 독립적이며, 매칭되는 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 조혈 계통 세포와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 포함된 에피토프에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체의 공자극 도메인은 정형(conotical) 또는 이형(non-conotical) 세포 활성화 및/또는 효과기 세포 기능 향상을 위한 전체 또는 부분적 IL2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 보편적 관여자는 종양 세포의 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적이고, 종양 세포의 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적이다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 iPSC 유래 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포(HE) 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 및/또는 호중구를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양상은 유도 만능 줄기세포 및 이의 유도체 세포의 클론성을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 일반적 방법은 유도 만능 줄기세포(iPSC)를 얻기 위해, 성숙 공급원 T 또는 B 세포를 재프로그래밍하는 단계; 및 iPSC 또는 이로부터 유래된 조혈 계통 세포에서, iPSC를 생성하기 위해 성숙 T 또는 B 세포에 포함된 것과 동일한 특정 V(D)J 재조합의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 성숙 공급원 T 또는 B 세포와 동일한 V(D)J 재조합을 포함하는 iPSC 또는 조혈 계통 세포를 단리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 공급원 세포를 프로그래밍하기 전에 재프로그래밍을 위한 성숙 공급원 T 또는 B 세포를 얻는 단계; 및 성숙 공급원 T 또는 B 세포에 특이적인 면역글로불린(Ig) 또는 T 세포 수용체(TCR)에 포함된 V(D)J 재조합을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 세포 요법에서 요법을 위해 입양 세포를 받는 대상체로부터 혈액, 조직 또는 종양 생검의 샘플을 얻는 단계, 샘플에서 효과기 세포를 단리시키는 단계; 및 효과기 세포에서 V(D)J 재조합을 결정하는 단계를 포함하는, 생체내 입양 세포를 추적하는 방법을 제공하되; 입양 세포는 성숙 공급원 T 또는 B 세포로부터 재프로그래밍된 만능 줄기세포로부터 유래되고; 성숙 공급원 T 또는 B 세포는 특정 V(D)J 재조합을 포함하며; 성숙 공급원 T 또는 B 세포와 동일한 V(D)J 재조합의 존재는 입양 세포 귀소, 지속성 및/또는 확장을 나타낸다.
또한 약제학적으로 허용 가능한 배지, 및 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포를 포함하는, 상기 방법을 이용하여 생성된 항원-특이적 조혈 계통 세포 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 T 조절 세포(Treg), 중앙 기억 T 세포(Tcm), 줄기세포 기억(Tscm) 및/또는 효과기 기억 T 세포(Tem)를 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 세포는 적응 NK 세포를 포함한다. 추가로 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도가 제공되되, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 가진다.
요약하면, 본 발명은 만능 줄기세포로부터 배상체를 생성하는 일 없이 단일층에서 만능 줄기세포의 직접적인 분화를 가능하게 함으로써, 중배엽 세포, 확정적 HE 및 확정적 HSC(이들로부터의 다른 조혈 계통 세포는 매우 고수준의 효율을 갖는 확장성 있고, 신뢰 가능한 방식으로 얻을 수 있음)의 분화 및 확장을 달성하는 방법 및 조성물을 제공한다.
도 1은 유도 만능 줄기세포(iPSC)의 확정적 조혈 내피세포(iHE) 및 다능성 전구체(iMPP)로의 조혈 분화를 위한 다단계 배양 과정을 위한 개략적 다이어그램을 도시한 도면. 비트로넥틴(Vitronectin)을 대신해서 매트리겔(Matrigel)(상표명)을 갖는 배양물은 완전히 한정되도록 전환될 수 있다는 것을 주목한다.
도 2는 유도 만능 줄기세포의 T 세포 전구체(ipro-T) 및 완전히 분화된 T (iT) 세포로의 조혈 분화를 위한 다단계 배양 과정에 대한 개략적 다이어그램을 도시한 도면. 비트로넥틴을 대신해서 매트리겔(상표명)을 갖는 배양물은 완전히 한정되도록 전환될 수 있다는 것을 주목한다.
도 3은 유도 만능 줄기세포의 NK 세포 전구체(ipro-NK) 및 완전히 분화된 NK(iNK) 세포의 조혈 분화에 대한 다단계 배양 과정에 대한 개략적 다이어그램을 도시한 도면. 비트로넥틴을 대신해서 매트리겔(상표명)을 갖는 배양물은 완전히 한정되도록 전환될 수 있다는 것을 주목한다.
도 4a 내지 도 4c는 10일 시간 과정에 걸쳐 iHE의 출현 및 iPSC 분화마다 iCD34 및 iHE 세포의 산출을 도시하는 유세포 뷴석 프로파일을 도시한 도면. 계산은 대표적인 배양물(최적화된 배양물은 아님)의 스냅 샷에 기반한다.
도 5a 내지 도 5d는 제10일에 HE의 산출을 개선시키기 위해 밀도 및 성장 인자 적정을 플레이팅하는 것을 포함하는 프로토콜에 대한 변형을 도시한 도면. a) 제0일에 플레이팅 밀도는 제10일에 HE 집단에 영향을 미친다. b) 제2일 내지 제6일에 BMP4의 농도는 제10일에 HE 집단에 영향을 미친다. c) 제3.75일에 CHIR의 농도는 제10일에 HE 집단에 영향을 미친다. d) 제6일에 플레이팅 밀도는 제10일에 HE 집단에 영향을 미친다.
도 6a 내지 도 6b는 제10일 HE가 다능성이며 Notch 신호전달 경로에 의존하는 확정적 조혈작용을 나타낸다는 것을 나타냄. a) 출현하는 CD45 조혈 세포의 유세포 분석 프로파일에 따른 제7일 MPP 분석에 대한 형태적 변화. b) iPSC-유래 CD34+ 세포는 iMPP 분석 동안 Notch-의존적인 확정적 CD45+ 세포를 생성한다.
도 7a 내지 도 7b는 iHE 및 iMPP 조혈 전구의 생성에 대한 저산소 조건 하의 분화 효과를 도시한 도면. a) 저산소에서 단일층 분화는 제10일에 iCD34 양성 세포 및 iHE 세포의 백분율을 둘 다 증가시킨다. b) 저산소 조건 하에 생성된 제10일 iCD34+ HE 세포는 iMPP 분석에서 추가로 분화될 수 있다.
도 8A 내지 도 8D는 분류된 제10일 iCD34 세포가 냉동 보존되고 pan-조혈 및 림프구 퍼텐셜을 유지하는 능력을 도시한 도면. A) 냉동 보존된 제10일 iCD34 세포는 생존할 수 있으며, 해동하였을 때 새로운 iCD34+ 세포와 유사한 표현형을 나타낼 수 있다. B) 해동 직후 냉동 보존된 제10일의 분류된 CD34+ 세포의 생존도. C) 냉동 보존된 제10일의 분류된 iCD34+ 세포는 생존할 수 있고, iMPP 분석 동안 CD45+ 조혈 세포를 생성할 수 있다. D) 냉동 보존된 제10일의 분류된 iCD34+ 세포는 생존할 수 있고, iT 및 iNK 림프구 전구체를 생성할 수 있다.
도 9a 내지 도 9b는 제10일 분화 배양물이 HE 퍼텐셜의 상실 없이 주위 온도에서 밤새 적재될 수 있다는 것을 도시한 도면. a) 제7일의 배양물은 인큐베이터에서 유지되거나(대조군) 또는 밤새 적재 다음에 다음의 추가 2일 동안 인큐베이터 내로 재도입을 위해 처리되었다. 이어서, 배양물을 제10일에 iCD34 및 iHE 세포의 존재에 대해 둘 다 분석하였다. 밤새 적재한 배양물에서, T-플라스크는 70% 베이스와 함께 30% 배양 배지 또는 100% 배양 배지를 수용하였다. b) 세포 수에 대한 계산.
도 10A 내지 도 10c는 CD45+ CD56- 개폐 전략을 이용하여 hiPSC로부터 유래된 초기 CD34+CD7+ T 세포 전구체 및 성숙 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트를 도시한 도면. A) 초기 T 세포 계통 마커는 CD34+/CD7+에 의해 나타낸 바와 같은 ipro-T 세포의 존재를 표시한다. B) 성숙 T 세포 마커는 CD4+ 또는 CD8+ 세포에 의해 나타내는 바와 같은 성숙 T 세포의 존재를 표시한다. c) ipro-T 세포를 생기게 하기 위한 제대혈로부터의 CD34 양성 세포와 iCD34 양성 세포의 tHE 퍼텐셜을 비교하는 제5일의 T 세포 분화.
도 11a 내지 도 11c는 CD45+ 개폐 전략을 이용하여 hiPSC로부터 유래된 초기 CD56+CD7+CD161+ NK 세포 전구체 및 성숙 CD56+CD16+CD8+ NK 세포 서브세트를 도시한 도면. a) 초기 NK 계통 마커는 CD7 및 CD56에 의해 나타내는 바와 같은 ipro-NK 세포의 존재를 표시한다. b) 성숙 NK 계통 마커는 CD57, CD16, CD94 및 CD56에 의해 나타내는 바와 같은 성숙 NK 세포의 존재를 표시한다. c) ipro-NK 세포를 생기게 하기 위해 제대혈로부터의 CD34 양성 세포와 iCD34 양성 세포의 tHE 퍼텐셜을 비교하는 제5일 NK 세포 분화.
도 12a 내지 도 12c는 단일층 hiPSC 조혈 분화 플랫폼이 EB 형성 동안 보이지 않은 확장성 있는 확장 전략을 허용한다는 것을 도시한 도면. a. 배상체를 형성하기 위해 hiPSC를 응집시키고, CD34 및 43 발현에 대한 분석 전에 14일 동안 분화시켰다. b. hiPSC를 단일층으로서 파종하고, CD34, CD43, CXCR4 및 CD73에 대한 분석 전에 8일 동안 분화시켰다. c. CD34 양성 세포를 계수화하고, 단일층과 EB 매개 조혈 분화 둘 다를 위해 시간에 따라 플롯팅하였다.
도 13은 기성품의 iNK 및 iT 세포의 생성을 위한 단일층 hiPSC 조혈 분화 플랫폼의 확장성 있는 확장 전략을 위한 개략적 다이어그램을 도시한 도면. 계산은 대표적인 배양물의 스냅샷에 기반하며, 최적화된 배양물에는 기반하지 않는다.
도 14는 hiPSC-유래 CD34 양성 세포가 CD3+ T 세포 생존의 억제에 의한 면역-조절 특성을 가진다는 것을 도시한 도면.
도 15는 CD45+CD56- 개폐 전략을 이용하는 HE 단리 30일 후에 hiPSC로부터 유래된 성숙 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트를 도시한 도면.
도 16은 피더-기반 현탁 배양물이 iCD34-유래 NK 세포의 성숙을 지지한다는 것을 도시한 도면.
도 17은 iCD34-유래 iNK은 말초 혈액 NK 세포와 유사한 방식으로 전염증 사이토카인을 분비하는 사이토카인 자극에 반응한다는 것을 도시한 도면.
도 18은 제대혈 CD34 양성 세포로부터 유래된 프로-NK 세포의 무 기질(stromal-free) 분화가 CD45+ 개폐 전략을 이용하는 통상적인 기질 기반 분화 플랫폼보다 더 빠르다는 것을 도시한 도면.
도 19는 NK 세포에 대한 iPSC-유래 iCD34+ 세포의 무 기질 분화를 도시한 도면. 플레이트 결합 DLL4는 CD56+CD7+CD161+ NK 세포 전구체의 분화를 지원한다(그러나 CD11b+ 골수성 세포는 아님).
도 20은 T 세포에 대한 UCB CD34+ 세포의 무 기질 분화를 도시한 도면.
도 21은 T 세포에 대한 iPSC-유래 iCD34+ 세포의 무 기질 분화를 도시한 도면.
도 22는 hiPSC-유래 iCD34+ 세포의 생착을 도시한 도면.
도 23A 내지 도 23B는 iPSC-유래 NK 세포가 전염증 사이토카인을 분비하도록 세포 자극에 반응하고, 말초 혈액 및 탯줄 혈액 NK 세포와 비슷한 세포독성 기능을 가진다는 것을 도시한 도면. A. iPSC-유래(iNK) 또는 말초 혈액 유래(pbNK) NK 세포는 비자극이거나(US) 또는 4시간 동안 피더 세포와 1:1 비로 자극하였고, 이어서, 수집하고 나서, CD45, CD56 및 TNF-알파에 대해 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. B. 세포독성 기능 iNK 또는 탯줄 혈액 유래(CBNK) 세포를 1:1, 3:1 및 10:1의 효과기:표적 비로 90시간 동안 2시간마다 평가하였다.
도 24는 FTV106와 함께 형질도입한 T 세포로부터 유래된 iPSC에서 CAR (FTV106)의 PCR 분석에 의한 T 세포 공급원의 동일한 유전자 각인을 보유하는 iPSC로의 CAR-T 세포의 재프로그래밍(TiPSC)을 도시한 도면.
도 25는 3개의 별개의 분류의 대표적인 결과를 도시하는, CD34+CD43- 개폐 전략을 이용하는 hiPSC-유래 CD34+ 세포의 세포 표면 항체 선별, 및 hiPSC-유래 CD34+ 항체 선별의 흐름도를 도시한 도면. 클래스 I 마커는 hiPSC-유래 CD34+ 세포 상에서 1% 미만의 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다. 클래스 II 마커는 CD34+ 세포 상에서 1 내지 99%의 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다. 클래스 III 마커는 CD34+ 세포 상에서 99% 초과의 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다.
도 26은 항-인간 항체가 hiPSC-유래 CD34+ 세포 상의 세포 표면 단백질 발현에 대한 분석에 포함된다는 것을 도시한 도면.
도 27은 CD34+ 집단 내의 CD93 마커의 발현; 및 CD34+ 세포의 CD34+CD93- 및 CD34+CD93+ 분획에서의 CXCR4 및 CD73 발현을 나타내는 도면.
도 28A 내지 도 28B는 CD34+ 집단의 확정적 조혈 퍼텐셜이 CD93- 분획에 존재한다는 것을 나타내는 도면. A. CD34+CD93- 집단으로부터의 iNK 세포 분화의 10일 후에, CD45+ 조혈 세포 및 CD45+CD7+ 림프구 전구체의 절대 수를 평가하였다. B. iNK 분화의 추가 10일 후에, CD56 및 NKp30 마커의 발현에 의한 iNK 세포의 존재에 대해 배양물을 평가하였다.
도 29A 내지 도 29B는 WNT 신호전달의 조정이 iCD34 세포의 산출물을 개선시킨다는 것을 도시한 도면. A. 제6일 세포 배양물은 GSK3 저해제 CHIR99021, Wnt 작용제 또는 IWP2, WNT 저해제의 존재 하에 분화되었다. B. CHIR99021은 표현형 CD34+CD43-CD93- HE의 수 및 백분율을 증가시켰다.
도 30A 내지 도 30B는 WNT 신호전달의 조정이 iCD34 세포로부터의 pan 조혈 및 림프구 산출물을 개선시킨다는 것을 나타내는 도면. A. CHIR99021은 조정된 HE로부터의 CD45+ 세포의 생성을 증가시켰다. B. CHIR99021은 조정된 HE로부터의 NK 전구 세포의 생성을 증가시켰다.
도 31은 iPSC에서 B2-마이크로글로불린(B2M)의 결여가 HLA 클래스 I 유전자의 발현 결여를 초래하였다는 것을 도시한 도면.
도 32A 내지 도 32D는 HLA 클래스 I 널(null) iPSC가 iCD34 HE로 분화하고, pan-조혈 및 림프구 전구체로 추가로 분화될 수 있다는 것을 도시한 도면. A. HE를 생성하기 위해 B2M-/- iPSC 및 야생형 iPSC가 10일 동안 분화되었다. B. B2M-/- iPSC는 야생형 대조군과 유사한 빈도로 CD34+ HE로 분화할 수 있다. C. B2M-/- HE는 야생형 HE와 유사한 효율로 CD45+ pan-조혈 전구체를 생성할 수 있다. D. B2M-/- iPSC-유래 HE 세포는 야생형 HE와 유사한 효율로 iNK 전구 세포를 생성할 수 있다.
도 33은 B2M-/- iPSC로부터 분화된 CD34+CD43- HE가 HLA 클래스 I 널을 보유한다는 것을 나타내는 도면.
도 34a 내지 도 34b는 iPSC 상의 HLA 클래스 I의 조정이 면역-적격 수용자에서 iPSC의 지속성을 증가시킨다는 것을 도시한 도면. a. 형질도입된 HLA-변형 iPSC는 세포 표면 상의 HLA-E를 발현시키고, 만능 표현형을 유지한다. b. 야생형 iPSC에 비해 증가된 지속성을 나타내는 B2M-/-HLAE iPSC에 의한 주사 후 72시간에 기형종의 생체내 루시페린 영상화.
도 35는 HLA-E 발현이 B2M-/- HLA-E iPSC로부터의 D10(CD34+CD43- HE 세포)과 D17(CD45+ pan-조혈 전구) 분화 세포에서 보유된다는 것을 나타내는 도면.
도 36A 내지 도 36C는 HLA 클래스 I 조정된 iPSC가 기능성 CD34+ HE를 생성할 수 있다는 것을 나타내는 도면. A. B2M-/- HLA-E iPSC가 야생형 대조군과 유사한 빈도로 CD34+ HE로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. B. B2M-/- HLA-E iPSC가 야생형 대조군과 비슷한 수로 CD34+ HE로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. c. B2M-/- HLA-E HE는 야생형 HE와 유사한 효율로 CD45+ pan-조혈 전구체를 생성할 수 있다.
도 37a 내지 도 37b는 고친화도 CD16 수용체 및 41BBL 공자극 분자를 발현시키기 위해 유전자 조작된 iPSC가 iCD34 세포로의 분화 내내 발현을 유지한다는 것을 나타낸 도면. a. 제0일 비분화 세포 b. 제10일 분화 세포.
도 38a 내지 도 38b는 CAR에 대한 공동 식별자로서 CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 및 절단된 LNGFR 세포 표면 마커를 발현시키도록 유전자 조작된 iPSC가 iCD34 세포로의 분화를 통한 발현을 보유한다는 것을 나타내는 도면. a. 제0일 비분화 세포 b. 제10일 분화 세포.
도 39는 내인성 TCR 프로모터에 의해 유도된 CAR의 세포 유형 특이적 발현, 및 CAR의 좌위 특이적 삽입에 기인하는 TCR의 발현 및 기능 넉아웃을 나타내는 도면.
도 40A 내지 도 40B는 암 및 다른 질환 표적 세포를 전체 효과기 레퍼토리와 관여시키기 위한 기성품 표적화 전략을 나타내는 도면. A. 특정 표적 세포를 인식하는 관여자에 결합될 수 있는 각각의 계통 특이적 촉발 분자를 갖는 iPSC로부터 유래된 조혈 효과기 세포의 도시. B. 모든 유래된 조혈 세포 상에서 편재하여 발현된 보편적 관여자(특정 항-에피토프 관여를 포함하는 특정 및 계통 독립적 촉발 분자)를 조작하는 것의 도시.
도 41은 HACD16 수용체를 발현시키기 위해 유전자 조작된 iPSC가 제20일의 iNK 세포로의 분화를 통한 발현을 보유한다는 것을 나타내는 도면.
본 발명은 일반적으로 확정적 조혈 세포 운명에 대해 줄기세포를 분화시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 다단계 분화 플랫폼을 제공하되, 확정적 조혈 표현형을 추정하기 위해, 확정적 조혈 내피세포로부터 T 세포, B 세포, NKT 세포 및 NK 세포를 포함하는 완전히 분화된 조혈 세포까지의 범위에 있는 다양한 발생 단계에서의 iPSC 또는 iPSC-유래 세포가 유도될 수 있다. 즉, 본 발명은 확정적 조혈 운명을 추정하는 데 더 민감한 세포, 예를 들어, CD34+ 확정적 조혈 줄기세포를 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 대안적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 EB 또는 응집물의 형성을 회피함으로써 확장성 있는 방식으로 미경험 iPSC로부터 확정적 조혈 내피세포(HE)를 생성한다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다. 단수의 용어는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약"또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 많이 변하는 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관해 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 더 높은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호 호환적으로 사용되고, 조성물, 예컨대 세포 집단 또는 배양 배지를 기재하기 위해 사용될 때, 특정된 물질 또는 그의 공급원이 없는, 예컨대 구체화된 물질 또는 그의 공급원이 95% 없는, 96% 없는, 97% 없는, 98% 없는, 99% 없거나, 또는 통상적인 수단에 의해 측정하여 검출 불가능한 조성물을 지칭한다. 조성물 중의 특정 성분 또는 물질이 "없는" 또는 "본질적으로 없는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성물 중에 포함되지 않거나, 또는 (2) 기능적으로 비활성이지만, 저농도인 조성물 중에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 조성물의 특정 물질 또는 그의 공급원의 부재를 지칭할 때, 용어 "의 부재"에 유사한 의미가 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "적용 가능한"은 한 가지 이상의 표준 방법에 의해 용이하게 검출 가능한 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다. 용어 "비-적용 가능한" 및 "적용 가능하지 않은" 및 동의어는 표준 방법에 의해 용이하게 검출 가능하지 않거나 또는 검출 불가능한 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위 또는 사건을 지칭한다. 일 실시형태에서, 사건은 그것이 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 이하의 시간에 일어난다면, 적용 가능하지 않다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소의 포함을 나타내지만, 단계들 또는 요소들의 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 그룹의 제외를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "포함하다(include)", "가지다(has)", "함유한다(contain)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다.
"이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것은 무엇이든 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소가 선택적이지는 않고, 그들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 제공될 수도 있고 제공되지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 언급할 필요는 없다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체밖"은 일반적으로 유기체 밖, 예컨대 바람직하게는 천연 조건의 최소 변형을 갖는 유기체 밖의 인공 환경에서의 살아있는 조직 내 또는 살아있는 조직 상에서 행해지는 실험 또는 측정에서 일어나는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체밖" 절차는 유기체로부터 취해지고, 보통 멸균 조건 하에 실험 장치에서, 그리고 전형적으로 환경에 따라서 몇 시간 동안 또는 약 24시간까지(48시간 또는 72시간 또는 그 이상을 포함))배양되는 살아있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고, 냉동될 수 있고, 이후에 생체밖 처리를 위해 해동될 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠보다 더 길게 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"가 (특정 실시형태에서, 이 용어가 생체밖과 상호호환적으로 사용될 수는 있지만) 되는 것으로 고려된다.
용여 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 일어나는 활동을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "원시선"은 3개지 배엽(중배엽, 내배엽 및 외배엽)의 낭배형성 또는 형성의 시작을 표시하는 초기 배아 구조를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중배엽"은 초기 배형성 동안 나타나고, 순환계, 근육, 심장, 진피, 골격 및 기타 지지 및 결합 조직의 혈액 세포를 포함하는 다양한 전문화된 세포 유형이 생기게 하는 3가지 배엽 중 하나를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "확정적 조혈 내피세포"(HE) 또는 "만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포"(iHE)는 내피세포에서 조혈로의 이행(endothelial-to-hematopoietic transition)으로 불리는 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생기게 하는 내피세포의 서브세트를 지칭한다.　배아 내 조혈 세포의 발생은 혈액모세포에서 확정적 조혈 내피세포 및 조혈 전구체까지 측판 중배엽으로부터 순차적으로 진행된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "조혈 줄기세포" 또는 "확정적 조혈 줄기세포"는 T 세포, 자연 살해 세포 및 B 세포를 포함하는 성숙 골수성 세포와 림프구 세포 유형 둘 다에 대해 생길 수 있는 CD34+ 줄기세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 세포 효능의 증가" 또는 "발생 효능의 증가"는 세포의 효능을 증가시키거나 또는 세포를 덜 분화된 상태로 분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효능을 갖는 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포에 비해 더 발생된 가소성을 가진다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포보다 덜 분화된 상태의 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화"는 비전문화된("관련되지 않은") 또는 덜 전문화된 세포가 전문화된 세포, 예를 들어, 혈액 세포 또는 근육 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도 세포는 세포 계통 내에서 더 전문화된("전념된(committed)") 위치 상에서 취해진 것이다. 용어 "전념된"은 분화 과정에 적용될 때, 정상 환경 하에서 그것이 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 서브세트로 분화를 계속할 수 있는 지점으로 분화 경로에서 진행하고, 정상 환경 하에서 상이하나 세포 유형으로 분화하거나 또는 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아가는 지점까지 분화 경로에서 진행되는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화 마커 유전자" 또는 "분화 유전자"는 발현이 세포, 예컨대 만능 세포 내에서 생기는 세포 분화를 나타내는 유전자를 지칭한다. 분화 마커 유전자는 다음의 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증), ZIC1, GATA1, GATA2, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, PAX5, RBPJ, RUNX1, STAT1 및 STAT3.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "분화 마커 유전자 프로파일" 또는 "분화 유전자 프로파일", "분화 유전자 발현 프로파일,""분화 유전자 발현 서명,""분화 유전자 발현 패널", "분화 유전자 패널" 또는 "분화 유전자 서명"은 복수의 분화 마커 유전자의 발현 또는 발현 수준을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "효능"은 세포에 접근 가능한 모든 발생 선택사항(즉, 발생 효능)의 합계를 지칭한다. 세포 효능의 연속체는 전분화능 세포, 만능 세포, 다능성 세포, 협능 세포, 단능 세포 및 말기 분화 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능성"은 신체 또는 체세포의 모든 계통(즉, 배아 적합)을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 각각 3가지의 배층(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터의 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기세포 유형이다. 만능성은 완전한 유기체를 더 원시적으로 발생되게 할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능 세포(예를 들어, 원외배엽 줄기세포 또는 EpiSC), 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기세포)가 생기게 할 수 있는 더 만능의 세포의 범위에 있는 발생 효능의 연속체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유도 만능 줄기세포" 또는 iPSC는 줄기세포가 유도 또는 변화된, 즉, 모두 3가지의 배아 또는 진피층(중배엽, 내배엽 및 외배엽)으로 분화할 수 있는 세포로 재프로그래밍된 분화된 성인, 신생아 또는 태아 세포로부터 생성된다는 것을 의미한다. 생성된 iPSC는 그들이 천연에서 발견되기 때문에 세포를 지칭하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 iPSC는 게놈 조작된 iPSC, 또는 우선적 공여자 또는 환자의 면역 세포로부터 재프로그래밍된 iPSC를 포함하고, 따라서 독특한 유전자 각인은 iPSC 및/또는 유래된 림프구 효과기 세포에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 각인"은 공급원 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전적 또는 후성적 정보를 지칭하고, 공급원 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC-유래 조혈 계통 세포에서 보유 가능하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "공급원 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비만능 세포이고, 공급원 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다. 공급원 세포 유래 iPSC, 및 그것으로부터의 분화 세포는 때때로 내용에 따라서 "유래 세포"로 총괄적으로 불린다. 우선적 치료 속성을 부여하는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 유전자 각인(들)은 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 선택된 공급원 세포의 재프로그래밍을 통해 또는 게놈 편집을 이용하여 유전자 변형된 양상을 iPSC에 도입하는 것을 통해 iPSC 내에 혼입된다. 구체적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 내용으로부터 얻은 공급원 세포의 양상에서, 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전자 각인은 동정되든 아니든 근본적인 분자 사건과 상관없이 선택된 공급원 세포의 유도체 세포 상에서 통과된 보유 가능한 표현형, 즉, 우선적 치료 속성을 나타내는 임의의 내용 특이적인 유전적 또는 후성적 변형을 포함할 수 있다. 공여자-, 질환- 또는 치료 반응- 특이적 공급원 세포는 iPSC에서 보유 가능한 유전자 각인 및 유래된 조혈 계통 세포를 포함할 수 있으며, 이 유전자 각인은, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 사전 배열된 단일 특이성 TCR; 추적할 수 있는 그리고 바람직한 유전적 다형성, 예를 들어, 선택된 공여자에서 고친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 대한 동형접합성; 및 사전 결정된 HLA 필요, 즉, 증가된 집단을 갖는 단상형을 나타내는 선택된 HLA-매칭된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 우선적 치료적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료 속성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "향상된 치료적 특성"은 동일한 일반적 세포 유형의 전형적 면역 세포에 비해 향상된 세포의 치료적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "치료적 특성"을 갖는 NK 세포는 전형적, 비변형 및/또는 천연 유래 NK 세포에 비해 향상된, 개선된 그리고/또는 증가된 치료적 특성을 가질 것이다. 면역 세포의 치료적 특성은 세포 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 면역 세포의 치료적 특성은 또한 항원 표적화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 의해 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "관여자"는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 및 종양 세포 사이에 연결을 형성할 수 있고; 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 관여자의 예는 이중 특이성 T 세포 관여자(BiTE), 이중 특이성 살해 세포 관여자(BiKE), 삼중 특이성 살해 세포 관여자 또는 다중 특이성 살해 세포 관여자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표면 촉발 수용체"는 면역 반응, 예를 들어, 세포독성 반응을 촉발시키거나 또는 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 촉발 수용체는 조작될 수 있고, 효과기 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 효과기 세포의 자연적 수용체 및 세포 유형과 독립적인 효과기 세포와 특정 표적 세포 예를 들어, 종양 세포 사이의 이중- 또는 다중-특이적 항체 맞물림을 용이하게 한다. 이 접근을 사용하여, 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성할 수 있고, 이어서, 이러한 iPSC를 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 분화시킬 수 있다. "보편적"은 표면 촉발 수용체가 세포 유형과 상관 없이 임의의 효과기 세포에서 발현되고, 활성화시킬 수 있으며, 보편적 수용체를 발현시키는 모든 효과기 세포는 관여자의 종양 결합 특이성과 상관없이 표면 촉발 수용체에 의해 인식될 수 있는 동일한 에피토프를 갖는 관여자에 결합되거나 또는 연결될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 표적화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 표적화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 이렇게 해서, 하나 또는 다중 효과기 세포 유형은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정 유형을 사멸시키기 위해 그리고 일부 다른 경우에 2 이상의 유형의 종양을 사멸시키기 위해 관려될 수 있다. 표면 촉발 수용체는 일반적으로 효과기 세포 활성화를 위한 공자극 도메인 및 관여자의 에피토프에 특이적인 항-에피토프를 포함한다. 이중 특이성 관여자는 한 말단 상에서 표면 촉발 수용체의 항-에피토프에 특이적이고, 다른 말단 상에서 종양 항원에 특이적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "안전 스위치 단백질"은 세포 요법의 퍼텐셜 독성 또는 다른 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작 단백질을 지칭한다. 일부 상황에서, 안전 스위치 단백질 발현은 안전 스위치 단백질을 그의 게놈으로 암호화하는 유전자 내에 영구적으로 혼입된 이식 조작 세포에 대한 안전 문제를 처리하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자-매개 번역 후 활성화 및 조직-특이적 및/또는 일시적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 수 있다. 안전 스위치는 세포자멸사의 저해, 단백질 합성의 저해, DNA 복제, 성장 저지, 전사 및 전사 후 유전적 조절 및/또는 항체-매개 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 예에서, 안전 스위치 단백질은 활성화될 때 치료 세포의 세포자멸사 및/또는 세포사를 촉발시키는 외인성 분자, 예를 들어, 프로드러그에 의해 활성화된다. 안전한 스위치 단백질의 예는, 자살 유전자, 예컨대 카스파제 9, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미나제, B-세포 CD20, 수정된 EGFR, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이 전략에서, 유해 사건이 있는 경우에 투여되는 프로드러그는 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고, 형질도입 세포를 사멸시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드"는 유기체에 대한 생물학적 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질은 질환에 대한 치유하는 근치적 또는 고식적 특성을 가지며, 질환의 중증도를 개선시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 반전시키거나 또는 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 예방적 특성을 가지며, 질환의 개시를 방지하기 위해 또는 그것이 생길 때 이러한 질환 또는 병리적 병태의 중증도를 줄이기 위해 사용된다. 약제학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 활성인 단편을 포함한다. 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적으로 활성인 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 용어 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 치료적 이점을 제공하기 위해 협력적으로 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 형질도입을 조절하거나, 이에 참여하거나, 저해하거나, 활성화시키거나, 감소시키거나 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 형질도입은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발시키는 경로를 따라서 단백질 복합체의 동원에 의한 화학적 변형의 형태로 분자 신호의 전달을 지칭한다. 신호 형질도입 경로는 당업계에 잘 공지되어 있고, G 단백질 결합 수용체 신호전달, 타이로신 키나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드-개폐 이온 통로 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP-의존적 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 양상"은 i) 독특한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 관련된 항원 특이성, ii) 단클론성 항체 또는 이중특이성 관여자와 관련된 관여자 특이성, iii) 형질전환 세포의 표적화, iv) 암 줄기세포의 표적화, 및 v) 특정 항원 또는 표면 분자의 부재 하에서의 다른 표적화 전략을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진시키기 위해 세포 내에 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드"는 유기체에 대한 생물학적 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드의 예는 항체 또는 이의 단편, 성장 인자, 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 형질도입을 조절하거나, 이에 참여하거나, 저해하거나, 활성화시키거나, 감소시키거나 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 형질도입은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발시키는 경로를 따라서 단백질 복합체의 동원에 의한 화학적 변형의 형태로 분자 신호의 전달을 지칭한다. 신호 형질도입 경로는 당업계에 잘 공지되어 있고, G 단백질 결합 수용체 신호전달, 타이로신 키나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨게이트 신호전달, 리간드-개폐 이온 통로 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP-의존적 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적"은 비특이적 또는 비선택적 결합과 대조적으로 표적 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 관여자의 능력을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "입양 세포 요법"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 형질도입 전에 생체밖에서 확장된 유전자 변형된 또는 변형되지 않은 T 또는 B 세포로서 동정된 자가 또는 동종이계 림프구의 형질도입에 관한 세포 기반 면역요법을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료적으로 충분한 양"은 그의 의미 내에서 비독성이지만 충분하고 그리고/또는 유효한 양의 특정 치료적 및/또는 약제학적 조성물을 포함하며, 목적으로 하는 치료 효과를 제공하는 것을 언급한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반적 건강상태, 환자의 연령 및 병기 및 병태의 중증도와 같은 인자에 따라서 대상체에 따라 다를 것이다. 특정 실시형태에서, 치료적으로 충분한 양은 치료 중인 대상체의 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선시키고/시키거나, 감소시키고/시키거나 좋아지게 하는데 충분하고/하거나 효과적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 천연 유래 만능 줄기세포를 지칭한다. 배아 줄기세포는 만능성이며, 3가지의 1차 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도체로의 발생 동안 생기게 한다. 그들은 배아외막 또는 태반에 기여하지 않으며, 즉, 전능성이 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다능성 줄기세포"는 하나 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)(그러나 3가지 모두는 아님)의 세포로 분화하는 발생 퍼텐셜을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"로 지칭될 수 있다. 다능성 세포는 당업계에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 성체 줄기세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 주어진 계통에서 다수 유형의 세포(그러나 다른 계통의 세포는 아님)를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 다수의 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 뉴런을 형성할 수 없다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능성보다 더 적은 발생 퍼텐셜 정도를 갖는 세포 상태를 지칭한다.
만능 줄기세포의 분화는 배양 시스템의 변화, 예컨대 배양 배지 또는 세포의 물리적 상태에서 자극제의 변화를 필요로 한다. 가장 통상적인 전략은 계통-특이적 분화를 개시하기 위해 통상적이고 중요한 중간체로서 배상체(EB)의 형성을 이용한다. EB는 그들의 3차원 면적 내에서 수많은 계통을 생기게 하기 때문에 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정, 전형적으로 몇 시간 내지 며칠을 통해, 단순한 EB(예를 들어, 응집된 만능 줄기세포는 분화하도록 유발됨)는 성숙을 계속하고, 그들이 추가로 분화를 계속하도록 진행되는 시간, 전형적으로 며칠 내지 몇 주에 낭포성 EB로 발생된다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기세포가 서로 근접하게 함으로써 EB 형성이 개시되며, 전형적으로 이는 만능 세포가 액적 중의 침전을 허용하는 단계, 세포를 "U"형 바닥 웰-플레이트 내로 또는 기계적 교반에 의해 침전시키는 단계를 포함하는 몇몇 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진시키기 위해, 만능 줄기세포 응집물은 추가적인 분화 신호가 필요한데, 만능성 배양물 유지 배지 내에 유지된 응집물이 적절한 EB를 형성하지 않기 때문이다. 이렇게 해서, 만능 줄기세포 응집물은 선택 계통에 대한 유발 신호를 제공하는 분화 배지로 전달될 필요가 있다. 만능 줄기세포의 EB-기반 배양물은 전형적으로 EB 세포 클러스터 내에서 보통의 증식을 갖는 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)의 생성을 초래한다. 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 증명되었지만, 그러나 EB는 3차원 구조에서 세포의 환경으로부터의 분화 신호에 대한관 일치되지 않는 노출 때문에 가변성 분화 상태로 이종성 세포가 생기게 한다. 추가로, EB는 생성 및 유지하는 데 힘이 든다. 게다가, EB를 통한 세포 분화는 보통 세포 확장을 수반하는데, 이는 또한 낮은 분화 효율에 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 별개인 "응집물 형성"은 만능 줄기세포 유래 세포의 집단을 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집물-기반 만능 줄기세포 확장 동안, 배양물 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집물의 크기를 증가시켜 더 큰 응집물을 형성하고, 이들 응집물은 배양물 내의 세포 증식을 유지시키기 위해 그리고 세포 수를 증가시키기 위해 더 작은 응집물로 일상적으로 기계적으로 또는 효소적으로 해리될 수 있다. EB 배양물과 별개로, 유지 배양물 중의 응집물 내에서 배양된 세포는 만능성 마커를 유지한다. 만능 줄기세포 응집물은 분화를 유도하기 위한 추가적인 분화 신호를 필요로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉, "형성"을 통한 분화와 별개인 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단일층 분화, 본 명세서에 개시된 이점 중에서, 분화 개시를 위한 EB 형성에 대한 필요를 회피한다. 단일층 배양은 배아 발생, 예컨대 EB 형성을 모방하지 않기 때문에, 특정 계통에 대한 분화는 EB에서의 모두 3가지 배엽 분화에 비해 최소인 것으로 여겨진다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기세포 형태; (ii) 비제한적 자기-재생을 위한 tHE 퍼텐셜; (iii) SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 만능 줄기세포 마커의 발현; (iv) 모두 3가지의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력; (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배상체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
2가지 유형의 만능성이 이전에 기재되었다: 후기 배반포의 원외배엽 줄기세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "전이성" 상태, 및 초기/이식전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "미경험" 또는 "기저" 상태. 만능성 상태는 둘 다 상기 기재한 바와 같은 특징을 나타내지만, 미경험 또는 기저 상태는 추가로 다음을 나타낸다: (i) 여성 세포에서 X-염색체의 사전-비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일-세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존; (iii) DNA 메틸화에서의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억제 염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 만능 세포의 프라이밍된 상태에 비해 분화 마커의 감소된 발현. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현되며, 이어서 얻어진 만능 세포로부터 침묵되거나 제거된 세포 프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍-상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에서, 외인성 이식유전자 발현이 유지되지 않는 한 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 남아있되, 기저 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "만능 줄기세포 형태"는 배아 줄기세포의 고전적 형태 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비, 핵소체의 주목할 만한 존재 및 전형적인 세포내 간격과 함께 형상이 둥글고 작은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형의 지지체에 대한 성장 인자 및 영양소를 제공하기 때문에 제2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는 제2 유형의 세포와 함께 공동배양되는 한 가지 유형의 세포를 기재하는 용어이다. 피더 세포는 그들의 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 선택적으로 유래된다. 예를 들어, 줄기세포를 포함하는 특정 유형의 인간 세포는 마우스 배아 섬유아세포, 또는 불멸 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양물에 의해 지지될 수 있다. 피더 세포는 그들이 지지하는 세포보다 더 커지는 것을 방지하기 위해 방사선 조사 또는 항-유사분열제, 예컨대 미토마이신에 의한 처리에 의해 다른 세포와 함께 공동배양시킬 때 전형적으로 비활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 앞서 언급한 것으로 제한하는 일 없이, 한 가지의 특정 피더 세포 유형은 인간 피더, 예컨대 인간 피부 섬유아세포일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 특정 계통에 대한 만능성, 직접적 분화를 유지하기 위해 그리고 전문화된 세포 유형, 예컨대 효과기 세포로의 성숙을 촉진시키기 위해 부분적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "무 피더"(FF) 환경은 피더 또는 기질 세포가 본질적으로 없고, 그리고/또는 피더 세포의 배양에 의해 사전 조건화되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 조건화된" 배지는 피더 세포가 시간 기간 동안, 예컨대 적어도 1일 동안 배지 내에서 배양된 후에 채취된 배지를 지칭한다. 사전 조건화된 배지는 배지에서 배양된 피더 세포에 의해 분화된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 다수의 매개체 물질을 함유한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는, 인간 환자, 가축 또는 다른 집에서 기르는 동물을 지칭한다.
"만능 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 만능 인자는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 만능 인자는, 예를 들어, 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 제제를 포함한다.
"부착"은 용기에 부착되는 세포, 예를 들어 적절한 배양 배지의 존재 하에 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에 부착하는 세포를 지칭한다. 세포의 특정 부류는 그들이 세포 배양 용기에 부착되지 않는 한, 지속되지 않거나 또는 배양물 중에서 성장하지 않는다. 세포의 특정 부류("비-부착 세포")는 부착 없이 배양물 중에서 유지되고/되거나 증식할 수 있다.　
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양물 배지", "배양물 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충물" 및 "배지 보충물"은 세포 배양물을 배양하는 영양 조성물을 지칭한다.
"배양하다" 또는 "유지하다"는, 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱)세포 배양물 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 밖에서 세포를 지속하고/하거나, 증식(성장)시키고/시키거나 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지하는"은 세포를 증식시키고/시키거나 지속시키는 데 도움이 되는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 서로로부터, 예컨대 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리에 의해 효소적으로 또는 기계적으로 해리될 수 있다. 또 다른 대안의 실시형태에서, 부착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 따라서 해리는 세포외 기질(ECM) 및 기질(예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 파괴하는 것 또는 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "림프구" 및 "T 세포"는 상호 호환적으로 사용되고, 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예를 들어, Jurkat, SupT1 등, 또는 포유류로부터 얻은 T 세포일 수 있다. T 세포는 또한 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다. T 세포는 CD3+ 세포일 수 있다. T 세포는 T 세포의 임의의 유형일 수 있고, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 및 Th2 세포), CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 백혈구(PBL), 종양 침윤성 림프구(TIL), 기억 T 세포, 미경험 T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포(γδT 세포) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 추가적이 유형의 헬퍼 T 세포는 Th3(Treg), Th17, Th9 또는 Tfh 세포와 같은 세포를 포함한다. 추가적인 유형의 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포(Tcm 세포), 줄기세포 기억(Tscm 세포) 및 효과기 기억 T 세포(Tem 세포 및 TEMRA 세포)와 같은 세포를 포함한다. T 세포는 또한 유전자 조작된 T 세포, 예컨대 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키도록 변형된 T 세포를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "미경험 T 세포" 또는 Tn은 활성화 또는 기억 T 세포와 달리, 말초 내에서 그들의 동족 항원과 만나지 않는 성숙 T 세포를 지칭한다. 미경험 T 세포는 통상적으로 L-셀렉틴 (CD62L)의 표면 발현; 활성화 마커 CD25, CD44 또는 CD69의 부재; 및 기억 CD45RO 아이소폼의 부재를 특징으로 한다. 그들은 또한 서브유닛 IL-7 수용체-α, CD127, 및 공통-γ쇄, CD132로 이루어진 기능성 IL-7 수용체를 발현시킨다. 미경험 상태에서, T 세포는 항상성 생존 메커니즘에 대한 공통-감마 쇄 사이토카인 IL-7 및 IL-15를 필요로 하는 정지성(quiescent) 및 비분화성이 되는 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중앙 기억 T 세포"또는 Tcm는 더 낮은 발현 또는 세포자멸사 전 신호전달 유전자, 예를 들어, Bid, Bnip3 및 Bad를 가지고, 2차 림프구 기관에 대한 수송과 관련된 유전자의 더 높은 발현을 갖는 T 세포의 하위그룹 또는 하위집단을 지칭하는데, 이 유전자는 효과기 기억 T 세포, 또는 Tc메 비교하여 CD62L, CXCR3, CCR7을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "기억 T 세포" 또는 "줄기세포 기억 T 세포" 또는 Tscm는 Tcm, Tem 및 Teff(효과기 T 세포)를 자기 재생하고, 생성할 수 있으며, CD27 및 림프구 귀소 분자, 예컨대 CCR7 및 CD62L(장기간 면역을 매개하는 데 중요한 특성이 있음)을 발현시키는 T 세포의 하위 그룹 또는 하위 집단을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체(CD3)의 부재에 의해 나타나는 말초 혈액 림프구의 서브세트를 지칭한다. 본 명세서에 제공된 바와 같은, NK 세포는 또한 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "적응 NK 세포" 및 "기억 NK 세포"는 상호 호환 가능하며, NKG2C 및 CD57, 및 선택적으로, CD16을 발현시키지만, 다음의 PLZF, SYK, FceR 및 EAT-2 중 하나의 발현은 결여하는 표현형으로 CD3- 및 CD56+인 NK 세포의 서브세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CD56+ NK 세포의 단리된 하위집단은 CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR 리간드, NKp30, NKp40, NKp46, 활성화 및 저해 KIR, NKG2A 및 DNAM-1의 발현을 포함한다. CD56+는 어두운 또는 밝은 발현일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NKT 세포" 또는 "자연 살해 T 세포"는 T 세포 수용체(TCR)를 발현시키는 CD1d-제한 T 세포를 지칭한다. 통상적인 주조직적합성(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 검출하는 통상적인 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d, 비-고전적 MHC 분자에 의해 제시된 지질 항원을 인식한다. 2가지 유형의 NKT 세포가 현재 인식된다. 비변이체 또는 I형 NKT 세포는 제한된 범위의 β 쇄(인간에서의 Vβ11)와 관련된 매우 제한된 TCR 레퍼토리 - 정규 α-쇄(인간에서의 Vα24-Jα18)를 발현시킨다. 비정규 또는 비변이체가 아닌 II형 NKT 세포로 불리는 NKT 세포의 제2 집단은 더 이종성의 TCR αβ 용법을 나타낸다. I형 NKT 세포는 현재 면역요법에 적합한 것으로 고려된다. 적응 또는 비변이체(I형) NKT 세포는 다음의 마커, TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, αGalCer, CD161 및 CD56 중 적어도 하나 이상의 발현에 의해 동정될 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은, NKT 세포는 또한 줄기세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "B 림프구" 또는 "B 세포"는 상호 호환적으로 사용되고, T 세포 수용체(CD3)의 부재 하에서 면역글로불린 중쇄 및 경쇄(BCR, Ig), CD19 또는 CD20을 포함하는 B 세포 수용체의 발현에 의해 나타나는 림프구의 서브세트를 지칭한다. 본 명세서에서 제공되는 B 세포는 또한 지시된 분화를 통해 줄기 또는 전구 세포로부터 유래될 수 있다. B 세포는 B 세포의 임의의 서브타입을 포함하고, 프로-B 세포, 프레-B 세포, 미경험 B 세포, B-1 B 세포, B-2 B 세포, 변연대 B 세포, 여포성 B 세포, 기억 B 세포, 형질모세포 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다.
B. 개요
본 발명은 일반적으로 미경험 만능 세포를 비-만능 세포 또는 부분적으로 분화된 세포(중배엽 세포, 확정적 조혈 내피세포, 확정적 조혈 줄기 또는 전구 세포, CD34+ 세포, 다능성 전구체(MPP)(호중구 전구체를 포함하는 골수로 분화할 수 있음), T 세포 전구체, NK 세포 전구체를 포함함); 또는 완전히 분화된 최종 조혈 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, NKT 세포 또는 NK 세포로 분화하는 다단계 과정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개시된 방법에서 사용되는 조성물; 및 개시된 방법을 이용하여 생성된 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포에 관한 것이다.
당업계에서 사용되는 방법과 대조적으로, 본 발명은 iPSC 분화에서 EB의 형성을 회피하였다. 제공된 바와 같이, iPSC로부터 유래된 조혈 계통 세포는 만능성의 무 TGFβ 배양 배지 내 클론 iPSC 세포를 파종하여 만능성의 그들의 기저 또는 미경험 상태를 유지함으로써, EB 형성 없이 단일층 형식에서 클론의 iPSC를 분화시킴으로써, 그리고 분화의 초기 및 중간 단계에서 작은 화학물질, 성장인자 및 사이토카인의 적절한 조합을 적용하는 단계별 전략을 이용함으로써 얻어졌다. 이렇게 해서, 본 발명은 iPSC로부터의 EB 형성을 필요로 하는 일 없이 즉시 분화를 위해 확장된 클론 iPSC를 단일층 형태로 부착 배양물에 직접적인 전달을 가능하게 한다.
따라서 본 발명은 SB431532를 포함하는 TGFβ 수용체/ALK 저해제를 이용하는 일 없이 고효율로 줄기세포를 확정적 조혈작용 및 기능성 조혈 계통으로 분화시킬 수 있는 배양 플랫폼을 제공한다. 더 나아가, 이전의 연구와 달리, 본 발명은 또한 iPSC로부터의 EB 또는 응집물 중간체에 대한 필요 없이 단일층 배양물에서 iPSC의 직접적인 분화를 지지하는 무 피더, 무 혈청 조건을 이용하는 배양 플랫폼을 제공한다.
C. 배양 플랫폼
만능 세포를 배양시키기 위한 현재의 방법은 피더 세포를 갖고, 소 태아 혈청을 함유하는 사전 조건화시킨 피더 세포 또는 배지에 크게 의존하며; 그러나, 이러한 환경은 임상 및 치료적 용도를 위해 세포를 생성하는 데 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 이러한 이종-오염된 환경에서 배양된 세포는 일반적으로 인간 세포 이식에 적합하지 않은 것으로 고려되는데, 동물 성분에 대한 노출은 면역 거부 및 치료되는 환자에 대한 동정되지 않은 병원균의 전염의 심각한 위험이 존재하며, 동물 레트로바이러스를 잠재적으로 재활성화시킬 수 있기 때문이다. 무 동물 배양 배지, 예컨대 본 명세서에 상정된 무 피더 환경을 이용하는 배양 시스템은 임상-등급 세포주, 특히 hESC, hiPSC 및 만능 줄기세포 유래 HSC, T, B, NKT 또는 NK 세포주의 제조를 용이하게 한다.
특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 인간 피더 세포가 본질적으로 없고, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 케라틴 세포 및 배아 줄기세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 피더 세포에 의해 사전 조건화되지 않는다. 무 피더 세포 배양 배지는 만능 세포의 배양, 세포의 재프로그래밍, 단일-세포 배양물, 해리, 및 만능 세포의 계대, 만능 세포의 세포 분류, 기저 상태 만능 세포의 생성, 기저 상태 만능성의 유지, 만능 세포 분화의 유도에서 사용하는 데 적합하다. 특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 만능성을 유도하기 위해, 재프로그래밍의 효율을 개선시키기 위해, 세포 효능을 증가시키거나 또는 유지하기 위해, 그리고/또는 분화를 유도하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 추가적으로 사이토카인 및 bFGF를 포함하는 성장 인자가 실질적으로 없다.
본 발명의 일부 양상에서, 상기 기재한 iPSC 분화의 단계 중 하나 이상은 무 피더 조건 하에 수행될 수 있다. 이러한 무 피더 조건은 단일층 배양물 및 현탁액 배양물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 형태일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 만능 세포의 중배엽 세포로의 분화는 단일층 무 피더 조건 하에 수행된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 중배엽 세포의 확정적 조혈 내피세포로의 분화가 단일층 무 피더 조건 하에 수행된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포의 조혈 줄기세포로의 분화는 단일층 무 피더 조건 하에 수행된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 확정적 조혈 줄기세포의 다능성 전구체, T 세포 전구체 또는 NK 세포 전구체로의 분화는 현탁액 무 피더 조건 하에 또는 단일층 무 피더 조건 다음에 현탁액 무 피더 조건 하에서 수행된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, T 세포 전구체의 완전히 분화된 T 세포, 또는 NK 세포 전구체의 완전히 분화된 NK 세포로의 분화는 현탁액 무 피더 조건 하에 또는 단일층 무 피더 다음에 현탁액 무 피더 조건 하에 수행된다.
임의의 적합한 용기 또는 세포 배양물 컨테이너는 기저 배지 내 세포 배양물 및/또는 세포 배양물 보충물에 대한 지지체로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러나 부착-촉진 매트릭스/기질(예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, RGD-함유 폴리펩타이드, 젤라틴 등)이 있는 배양물 용기의 표면 코팅은 세포의 부착을 촉진시키고, 특정 실시형태에서 본 명세서에 개시된 세포 배양물 배지 및 보충물의 효과를 향상시킬 수 있다. 세포를 배양 및 계대시키기 위한 적합한 기질은 당업계에 공지되어 있고, 비트로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 오스테오폰틴, 트롬보스폰딘, 천연 유래 세포주-생성 기질의 혼합물, 예컨대 매트리겔(Matrigel)(상표명)과 합성 또는 인공 표면, 예컨대 폴리아민 단일층 및 카복시-말단 단일층을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 무 피더 조건을 제공하는 것은 매트릭스-코팅면 상에서 세포를 배양시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 매트리겔(Matrigel)(상표명) 또는 비트로넥틴을 포함하는 매트릭스/기질을 포함한다. 배양물의 일부 실시형태에서, 매트리겔(상표명)이 사용되며, 따라서 배양물은 완전히 한정된다.
본 발명의 일부 양상에서, 상기 기재한 분화 단계 중 하나 이상은 무 혈청 조건 하에서 수행될 수 있다. 세포 부착 및/또는 유도에 적합한 상업적으로 입수 가능한 무 혈청 배지의 예는 mTeSR(상표명)1, TeSR(상표명)2 또는 스템스팬(StemSpan)(상표명), 스템 셀 테크놀로지즈사(Stem Cell Technologies)(캐나다 밴쿠어에 소재), 레프로셀(ReproCELL)(매사추세츠주 보스톤에 소재)로부터의 영장류 ES/iPS 세포 배지, 인비트로젠사(Invitrogen)(캘리포니아주 칼스베드에 소재)로부터의 스템프로(StemPro)(등록상표)-34, 인비트로젠사로부터의 스템프로(등록상표) hESC SFM 및 론자사(Lonza)(스위스 바젤에 소재)로부터의 X-VIVO(상표명)를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 배양 플랫폼의 배지 중 하나 이상은 무 피더 환경이며, 선택적으로 사이토카인 및/또는 성장 인자가 실질적으로 없다. 다른 실시형태에서, 세포 배양물 배지는 보충물, 예컨대 혈청, 추출물, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 등을 함유한다. 일반적으로, 배양 플랫폼은 단계 특이적 무 피더, 무 혈청 배지 중 하나 이상을 포함하고, 이들 각각은 추가로 다음 중 하나 이상을 포함한다: 영양소/추출물, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 및 배지 첨가제. 적합한 영양소/추출물은, 예를 들어, DMEM/F-12(둘베코 변형 이글 배지/영양소 혼합물 F-12)(이는 다수의 상이한 포유류 세포 성장을 지지하기 위해 널리 사용되는 기저 배지임); KOSR(넉아웃 혈청 대체); L-glut; NEAA(비필수 아미노산)를 포함할 수 있다. 다른 배지 첨가제는 MTG, ITS, βME, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 배양 배지는 다음의 사이토카인 또는 성장 인자 중 하나 이상을 포함한다: 표피 성장 인자(EGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 백혈병 저해 인자(LIF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2), 케라틴세포 성장 인자(KGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 골 형성 단백질(BMP4), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 트랜스페린, 다양한 인터류킨(예컨대, IL-1 내지 IL-18), 다양한 집락 자극 인자(예컨대 과립구/대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)), 다양한 인터페론(예컨대 IFN-γ) 및 줄기세포, 예컨대 줄기세포 인자(SCF) 및 에리스로포이에틴(EPO)에 대해 효과를 갖는 다른 사이토카인. 이들 사이토카인은, 예를 들어 R&D 시스템즈(미네소타주 미네아폴리스에 소재)로부터 상업적으로 얻을 수 있고, 천연 또는 재조합일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 본 발명의 배양 배지는 골 형성 단백질(BMP4), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 조혈 성장 인자(예를 들어, SCF, GMCSF, GCSF, EPO, IL3, TPO, EPO), Fms-관련 타이로신 키나제 3 리간드(Flt3L) 중 하나 이상; 및 백혈병 저해 인자(LIF), IL3, IL6, IL7, IL11, IL15로부터의 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 인자/미토겐 및 사이토카인은 경험적으로 또는 확립된 사이토카인 기술에 의해 가이드되는 바와 같이 결정되는 농도에서 단계 및/또는 세포 유형 특이적이다.
일반적으로, 유도된 만능 세포를 분화하기 위한 기법은 폴리뉴클레오타이드-, 폴리펩타이드- 및/또는 소분자-기반 접근을 이용하여 직접적으로 또는 간접적으로 특정 세포 경로의 조정을 수반한다. 세포의 발생 효능은, 예를 들어, 세포를 하나 이상의 조절자와 접촉시킴으로써 조절될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "접촉시키는"은 하나 이상의 인자(예를 들어, 소분자, 단백질, 펩타이드 등)의 존재 하에 세포를 배양시키는 단계를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 세포 분화를 유도하기 위해 1종 이상의 제제와 접촉된다. 이러한 접촉은, 예를 들어, 시험관내 배양 동안 세포에 1종 이상의 제제를 도입함으로써 생길 수 있다. 따라서, 접촉은 영양 세포 배양 배지에서 세포에 1종 이상의 제제를 도입함으로써 생길 수 있다. 세포는 목적으로 하는 분화 표현형을 달성하기 위해 세포에 충분한 기간 동안 1종 이상의 제제를 포함하는 배양 배지에 유지될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, "접촉"은 1종 이상의 인자가 벡터를 통해 세포 내에 도입될 때 생긴다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 갖는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입된다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 배양 플랫폼의 단계 특이적 무 피더, 무 혈청 배지 중 하나 이상은 하나 이상의 소분자를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 세포 배양 배지를 포함하고, TGFβ 수용체 또는 ALK5 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 TGFβ액티빈 신호전달 경로의 소분자 저해제를 포함하지 않거나, 또는 없다.
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 감소된 자발적 분화를 갖고 그리고/또는 달성된 기저 상태 만능성을 갖는 산업적 또는 임상적 등급의 만능 세포의 동질 집단을 이용함으로써 수많은 이점을 제공한다. 일 실시형태에서, 동질 iPSC는 GSK-3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 조성물 중에서 유지되며; 그리고 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "동질"은 세포 집단을 지칭하되, 각각의 세포는 집단 내 다른 세포와 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 일 실시형태에서, 세포는 각각의 세포가 본 명세서에 상정된 것과 동일한 만능성 마커, 예를 들어, SSEA4 및 TRA1-81 중 하나 이상을 발현시킨다면, 집단 내 다른 세포와 동일하다. 일 실시형태에서, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상의 세포가 집단 내 다른 세포와 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다면, 집단은 동질이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서의 확정적 조혈 내피세포를 통한 조혈 세포 계통을 생성하기 위한 배양 플랫폼의 세포 배양물 배지는 TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제 및 ALK5 저해제를 포함하는 TGFβ액티빈 신호전달 경로의 저해제를 포함하지 않거나, 또는 본질적으로 없다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 미경험 hiPSC를 유지하기 위한 파종 배지를 포함하는데, 이 배지는 GSK-3 저해제, MEK 저해제 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함한다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 TGFβR/ALK5 저해제가 재프로그래밍의 효율을 증가시키지만, 이들 저해제는 만능 세포 집단의 장기간 유지, 품질 및 동질성과 대응한다는 것을 발견하였다. 즉, TGFβ경로 신호전달의 저해가 세포의 재프로그래밍 효율을 개선시켰지만, 이 저해로부터의 경감이 시험관내 배양 시스템에서, 특히 무 피더 세포 및 단일 세포, 감소된 자발적 분화를 갖는 균일한 만능성 집단, 및 "기저" 또는 "미경험" 상태에 남아있는 것이 바람직한 경우 효소 계대를 이용하는 시스템에서 마능 세포 집단의 후속적 유지에 기여한다. 계대수를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않고 측정한 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "장기간"은 종종 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50회 이상의 계대를 의미한다. 정의되는 바와 같은 "계대"는 세포가 목적으로 하는 정도로 증식될 때 다중 세포 배양물 표면 또는 용기 내로 다시 분할되고 플레이팅하는 작업을 지칭한다. 추가로, 본 명세서에 개시하는 바와 같이, GSK3 저해제 및 MEK 저해제 및 선택적으로 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβR/ALK5 저해제는 없는 배지에서 전이성 만능 세포를 배양시키는 것은 이행 만능 세포가 감소된 자발적 분화를 달성하고/하거나 기저 상태 만능성을 달성하게 한다.
iPSC의 기저 또는 미경험 만능성을 달성하는 것은 또한 EB 중간체를 형성하는 일 없이 iPSC를 분화시킴으로써 조혈 계통 세포를 얻는 데 중요하다. 추가로, 확정적 HE로의 미경험 iPSC 분화 효율은 또한 EB 및 이의 응집물을 형성하는 일 없이 단일층 배양의 사용에 의해 크게 영향받는다. 일부 실시형태에서, 배양 플랫폼은 ROCK 저해제를 포함하고, TGFβR/ALK5 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없는 배지를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 배양 플랫폼은 GSK3 저해제를 포함하지만, TGFβR/ALK5 저해제가 없는 배지를 포함하는데, 이 배지는 본 명세서에 제공된 배양 플랫폼을 이용하여 확정적 HE 및/또는 확정적 HSC 세포의 생성을 촉진시킨다.
1. TGFβ 수용체/ ALK 저해제
TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5) 저해제는 TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5)의 발현을 억제하는 우성 음성 변이체에 대한 그리고 안티센스 핵산에 대한 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 TGFβ 수용체/ALK 저해제는 SB431542(예를 들어, 문헌[Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)] 참조); A-83-01, 또한 3-(6-메틸-2-피리딘일)-N-페닐-4-(4-퀴놀린일)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드로서 알려짐(예를 들어, 문헌[Tojo, et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005)] 및, 예를 들어, 토크리스 바이오사이언시즈사(Tocris Bioscience)로부터 상업적으로 입수 가능); 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘; Wnt3a/BIO(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 달톤(Dalton) 등의 WO2008/094597 참조); GW788388(-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-yl}-N-(테트라하이드로-2H- 피란-4-일)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)] 참조); SM16(예를 들어, 문헌[Suzuki, et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)] 참조); IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)]); GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예를 들어, 문헌[de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)]); SB-505124(2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드)(예를 들어, 문헌[DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)]); 및 피리미딘 유도체(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 스티에플(Stiefl) 등의, WO2008/006583에 열거된 것)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가로, "ALK5 저해제"는 비-특이적 키나제 저해제를 포함하는 것으로 의도되지 않지만, "ALK5 저해제"는 ALK5에 추가로 ALK4 및/또는 ALK7을 저해하는 저해제, 예를 들어, SB-431542를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 문헌[Inman, et al., J, Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002)] 참조. 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도하는 일 없이, ALK5 저해제는 간충직의 상피 전환/이행(MET) 과정에 대해 영향을 미치는 것으로 여겨진다. TGFβ액티빈 경로는 상피의 간충직 이행(EMT)에 대한 유발자이다. 따라서, TGFβ액티빈 경로를 저해하는 것은 MET(즉, 재프로그래밍) 과정을 용이하게 할 수 있다.
ALK5를 저해하는 효과를 나타내는 데이터를 고려하여, TGFβ액티빈 경로의 저해는 ALK5를 저해하는 것과 유사한 효과를 가질 것으로 여겨진다. 따라서, TGFβ액티빈 경로의 (예를 들어, 상류 또는 하류의) 임의의 저해제는 본 명세서의 각각의 단락에서 기재되는 ALK5 저해제와 조합하여, 또는 대신에 사용될 수 있다. 예시적인 TGFβ액티빈 경로 저해제는 TGFβ 수용체 저해제, SMAD 2/3 인산화 저해제, SMAD 2/3과 SMAD 4의 상호작용의 저해제, 및 SMAD 6 및 SMAD 7의 활성자/작용제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 나아가, 이하에 기재하는 범주는 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 당업자는 화합물이 경로 내의 하나 이상의 지점에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 화합물이 한정된 범주 중 하나 초과에서 작용할 수 있다는 것을 알 것이다.
TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제는 TGFβ 수용체의 우성 음성 변이체 및 이 수용체를 표적화하는 siRNA 또는 안티센스 핵산에 대한 항체를 포함할 수 있다. TGFβ 수용체 저해제의 구체적 예는 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드(SB-505124); 레르델리무맙(CAT-152); 메텔리무맙(CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; 글리벡; 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(모린(Morin)); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGFβ 수용체를 표적화하는 안티센스 형질감염 종양 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); 및 Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)] 참조).
SMAD 2/3 인산화의 저해제는 SMAD2 또는 SMAD3의 우성 음성 변이체 및 이를 표적화하는 안티센스 핵산에 대한 항체를 포함할 수 있다. 저해제의 구체적 예는 PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; 및 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(모린)을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Wrzesinski, 상기 참조; Kaminska, 상기 참조; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007)]; 및 Kataoka, et al., 유럽 특허 제1992360호, 본 명세서에 참고로 포함됨)
SMAD 2/3 및 SMAD4의 상호작용 저해제는 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4의 우성 음성 변이체 및 이를 표적화하는 안티센스 핵산에 대한 항체를 포함할 수 있다. SMAD 2/3 및 SMAD4의 저해제의 구체적 예는 Trx-SARA, Trx-xFoxH1b 및 Trx-Lef1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) 및 Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006)] 참조)
SMAD 6 및 SMAD 7의 활성자/작용제는 SMAD 6 또는 SMAD 7의 우성 음성 변이체 및 이를 표적화하는 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 저해제의 구체적 예는 Smad7-as PTO-올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. (예를 들어, 미야조노(Miyazono) 등의 미국 특허 제6534476호 및 스테인브레쳐(Steinbrecher) 등의 미국 특허 제2005119203호, 둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨).
2. WNT 경로 작용제
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "신호-촉진제", "경로 활성자", "경로 활성화제" 또는 "경로 작용제"는 Wntl, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wntl0b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 및 Wnt16 중 하나 이상의 작용제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Wnt 신호전달 경로의 작용제를 지칭한다. Wnt 경로 작용제는 다음의 폴리펩타이드 또는 이의 단편 중 하나 이상을 추가로 포함하지만 이것으로 제한되지 않는다: Dkk 폴리펩타이드, 크레센트(crescent) 폴리펩타이드, 케르베로스(cerberus) 폴리펩타이드, 악신(axin) 폴리펩타이드, Frzb 폴리펩타이드, T-세포 인자 폴리펩타이드, 또는 우성 음성 헝클어진(disheveled) 폴리펩타이드.
Wnt 경로 작용제의 비제한적 예는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: Wnt 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 활성화된 Wnt 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 활성화된 Wnt 수용체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Wnt/β신호전달을 촉진시키는 작은 유기 분자, Wnt 길항제의 발현 또는 활성을 저해하는 작은 유기 분자, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 라이보자임, RNAi 작제물, siRNA, 또는 Wnt 길항제의 발현을 저해하는 shRNA, Wnt 길항제에 결합하고, 활성을 저해하는 항체, β-카테닌 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, β-카테닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Lef-1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 및 Lef-1 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
Wnt 경로 작용제는 GSK3 저해제, 예를 들어, 우성 음성 GSK-3, GSK3α 또는 GSK3 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 우성 음성 GSK-3, GSK3α, 또는 GSK3 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3에 결합하고, 이의 발현 또는 활성을 저해하는 작은 유기 분자, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3에 결합하고, 이의 발현 및/또는 활성을 저해하는 RNAi 작제물, siRNA 또는 shRNA, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3에 결합하고, 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3에 결합하고 이의 발현 및/또는 활성을 저해하는 항체, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3에 결합하고, 이의 발현을 저해하는 리보자임, 및 GSK-3 저해에 대한 효과와 유사하게 β-카테닌 표적 유전자를 활성화시키는 임의의 GSK-3-독립적 시약을 추가로 포함한다.
3. GSK3 저해제
GSK3 저해제는 본 명세서에서 상정된 조성물에서 사용하는 데 적합한 특정 예시적 Wnt 경로 작용제이며, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 GSK3 저해제는 GSK3α/β발현 및/또는 GSK3α/β활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 GSK3 저해제의 예시적인 예는 항-GSK3 항체, 우성 음성 GSK3 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 GSK3을 표적화하는 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 GSK3 저해제는 켄파울론, 1-아자켄파울론, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418, CT 99021, CT 20026, SB216763, AR-A014418, 리튬, TDZD-8, BIO, BIO-아세톡심, (5-메틸-1H-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민, 피리도카바졸-사이클로펜아다이엔일루테늄 복합체, TDZD-8 4-벤질-2-메틸-1,2,4- 티아다이아졸리딘-3,5-다이온, 2-티오(3-요오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]- 옥사다이아졸, OTDZT, 알파-4-다이브로모아세토페논, AR-AO 144-18, 3-(1-(3-하이드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온, TWS119 피롤로피리미딘 화합물, L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 또는 그의 미리스토일화된 형태, 2-클로로-1-(4,5-다이브로모-티오펜-2-일)-에탄온, GF109203X, RO318220, TDZD-8, TIBPO 및 OTDZT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 예시적인 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021, BIO 또는 켄파울론이다.
바람직한 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이다.
다른 실시형태에서, GSK3 저해제는 BRD0705이다.
4. ERK /MEK 저해제
본 명세서에 상정된 조성물 중에서 사용하는 데 적합한 ERK/MEK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 ERK/MEK 저해제는 MEK 또는 ERK 발현 및/또는 MEK 또는 ERK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 MEK/ERK 저해제의 예시적인 예는 항-MEK 또는 항-ERK 항체, 우성 음성 MEK 또는 ERK 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 MEK 또는 ERK를 표적화하는 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 ERK/MEK 저해제는 PD0325901, PD98059, UO126, SL327, ARRY- 162, PD184161, PD184352, 수니티닙, 소라페닙, 반데타닙, 파조파닙, 악시티닙, GSKl 120212, ARRY-438162, RO5126766, XL518, AZD8330, RDEAl 19, AZD6244, FR180204 및 PTK787을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
추가적인 예시적 MEK/ERK 저해제는 국제 특허 출원 공개 WO 99/01426, WO 02/06213, WO 03/077914, WO 05/051301 및 WO2007/044084에 개시된 해당 화합물을 포함한다.
MEK/ERK 저해제의 추가적인 예시적 예는 다음의 화합물을 포함한다: 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2,3-다이하이드록시-프로폭시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-피란-2-일-메틸)-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 1-[6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일]-2-하이드록시-에탄온, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-퓨란-2-일-메틸)-3H-벤조이미다졸-5-카복실산 (2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-플루오로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(2,4-다이클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산 (2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산 (2-하이드록시-에톡시)-아마이드(본 명세서에서 이후에 MEK 저해제 1로서 지칭됨), 2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로피리딘-3-카복스아마이드(본 명세서에서 이후에 MEK 저해제 2로 지칭됨), 4-(4-브로모-2-플루오로페닐아미노)-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로피리다진-3-카복스아마이드 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
바람직한 실시형태에서, MEK/ERK 저해제는 PD98059이다.
5. ROCK 저해제
Rho 관련 키나제(ROCK)는 Rho 키나제(이의 3가지 아이소폼(RhoA, RhoB 및 RhoC)이 존재함)의 하류의 효과기로 작용하는 세린/트레오닌 키나제이다. 본 명세서에 상정된 조성물 중에서 사용하는 데 적합한 ROCK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 ROCK 저해제는 ROCK 발현 및/또는 ROCK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 ROCK 저해제의 예시적 예는 항-ROCK 항체, 우성 음성 ROCK 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 ROCK를 표적화하는 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 상정된 예시적인 ROCK 저해제: 티아조비빈, Y27632, Fasudil, AR122-86, Y27632 H-1152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, 하이드록시l-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트라이클로로페닐)유레아, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, 및 (R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아마이드, 및 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제8,044,201호에 개시된 ROCK 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈, Y27632 또는 피르인테그린이다.
바람직한 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
본 명세서에 상정된 조성물 및 세포 배양물 배지 내 소분자의 양은 다를 수 있고, 사용되는 특정 분자 및 조합물, 배지에서 배양 중인 세포의 유형 및 특정 적용을 포함하는 특정 배양 조건에 따라 최적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 소분자는 만능성을 유도하거나, 재프로그래밍 효율을 개선시키거나, 세포 효능을 증가 또는 유지하거나, 또는 기전 상태 만능성을 유도 또는 유지하는 데 충분한 농도로 조성물 중에 존재한다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명과 함께 사용하기 위한 Notch 활성자에 관한 것이다. Notch는 Notch1을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 Notch　수용체 패밀리의 모든 구성원을 포함한다. Notch 활성자는 Notch　수용체의 작용제를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. Notch 작용제는 Notch　수용체에 결합할 것이고, 마찬가지로, 예를 들어, Notch의 세포내 도메인이 절단되고, 핵 내로 전위되게 야기하기 위해 Notch　수용체와 관련된 신호전달 사건을 개시하거나 또는 매개한다. Notch 활성자는 Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 및 DLL-4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Notch 활성자는 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 유럽 특허 제2606884호, 미국 특허 제6689744호 및 미국 특허 제5780300호에 개시된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드 중 하나 이상은 가용성 펩타이드로서 도입되거나, 또는 고체 물질 상에 고정될 수 있다. 고체 물질은 폴리스타이렌 플레이트 또는 비드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. Notch 리간드 고정을 위한 비드는 아가로스 비드, 자기 비드 및 라텍스 비드일 수 있다. 일 실시형태에서, Notch 리간드 펩타이드는 비드에 접합/고정된다. 다른 실시형태에서, Notch 리간드 펩타이드는 폴리스타이렌 플레이트 표면에 접합/고정된다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드의 고정은 비공유적이다. 일부 실시형태에서, Notch 리간드 펩타이드는 세포에 의해 제시된다.
본 발명의 또 다른 양상은 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된 다음의 간행물에 개시된 해당 제제를 포함하는 BMP 경로 활성자에 관한 것이다: WO 2014011540, WO 2014062138 및 WO 2005117994. 본 발명과 함께 사용하기 위한 BMP 경로 활성자는 BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2 및 BMP-4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 하나의 비제한적 실시형태에서, BMP 경로 활성자는 BMP-4이다. BMP는 형질전환 성장 인자-베타 슈퍼패밀리의 구성원인 다기능성 사이토카인이다. 골형성 단백질(BMP) 수용체는 Smad의 활성화를 통해 BMP 신호전달을 매개한다. BBMP 리간드는 BMP 수용체 BMPRI 및 BMPRII에 결합한다. BMPRII가 인산화된 후, 다음에 BMPRI를 활성화시킨다. 인산화된 BMPRI는 순차적으로 수용체-활성화 Smad 단백질(R-Smad)을 인산화시키는데, 이는 통상적인 매개체-Smad(co-Smad)와 결합하고, 그들이 유전자 발현을 조절한 경우에, 핵에 유입된다. 일 실시형태에서, BMP 경로 활성자는 BMP4이다.
본 발명은 iPSC로부터 분화된 확정적 HSC를 통해 또는 iPSC로부터 분화된 확정적 조혈 내피세포를 통해 iPSC로부터 조혈 계통 세포를 얻기 위한 조성물을 제공하며, 각각의 접근은 목적으로 하는 세포 분화를 위한 iPSC로부터의 EB 형성이 결여된다.
6. hiPSC 분화 플랫폼
I. iCD34 플랫폼
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포를 이용하여 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 확정적 조혈 내피세포는 확정적 HSC, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 및/또는 B 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 모든 조혈 세포를 생기게 하는 능력을 갖는 확정적 조혈작용과 관련된 조혈 세포 집단이다.
일 실시형태에서, iPSC를 포함하는 만능 줄기세포를 이용하여 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위한 배양 플랫폼은 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 파종 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 파종 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일 실시형태에서, 본 발명의 파종 배양 배지에서 소분자의 l조합은 운명 유지 배지(Fate Maintenance Medium: FMM)로서 표 9에 나타낸다. 배지 성분은 표 1에 나타낸 농도 범위 내의 양으로 배지 중에서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위해, 사용되는 iPSC는 운명 재프로그래밍 배지(Fate Reprogramming Medium: FRM)를 이용하여 생성된 세포주이고, iPSC 세포주의 기저 또는 미경험 상태를 확립하고 지속하기 위해 FMM에서 추가로 유지되는데, 이는 본 명세서에 개시된 단계 특이적 분화에 적합하다. 이렇게 얻어진 기저 상태 또는 미경험 iPSC는 냉동보존될 수 있다. 본 발명에서, 보존된 iPSC 세포주 또는 클론 iPSC는 확정적 조혈 내피세포로의 후속적 분화를 위해 FMM에서 파종될 수 있다.
Figure pct00001
본 발명의 일 양상은 iPSC를 포함하는 만능 줄기세포로부터의 중배엽 분화 및 확장을 위한 배양 배지를 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일 실시형태에서, 배양 배지는 표 2에 나타낸 바와 같이 조합하여 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF, 및 소분자를 포함하는 CD34 기본 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 세포외 기질 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 2에 나타낸 바와 같은 농도 범위로 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 매트리겔(상표명)의 비트로넥틴으로의 대체에 의해 완전히 한정된다.
미경험 iPSC로부터 중배엽을 얻기 위한 iCD34-A 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비 필수 아미노산
아스아스코르브산 (1-250ng/㎖)
MTG (10-2500μM)
BMP4 (0.05-15ng/㎖)
매트리겔(상표명) 또는 비트로넥틴과 조합한 무 피더
일 실시형태에서, 만능 줄기세포로부터 중배엽 분화 및 확장을 위한 상기 배양 배지는 0.2 내지 50ng의 bFGF를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 양상은 iPSC를 포함하는 만능 줄기세포로부터 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위한 배양 배지를 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일 실시형태에서, 배양 배지는 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함한다. 일 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일 실시형태에서, GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지는 확정적 HE 퍼텐셜을 달성하기 위해 중배엽 세포 특정화(cell specification) 다음에만 적용된다. 일 실시형태에서 BMP 활성자, GSK3 저해제 및 bFGF를 포함하는 배양 배지는 표 3에 나타낸 바와 같이 조합하여 소분자를 포함하는 CD34 기보노 배지를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 배양 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 세포외 기질 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 11에 나타낸 바와 같은 농도 범위에서 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 매트리겔(상표명)의 비트로넥틴으로의 대체에 의해 완전히 한정된다.
확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위한 iCD34-B 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비필수 아미노산
아스코르브산(1-250ng/㎖)
MTG(10-2500μM)
BMP4 (0.05-15ng/㎖)
bFGF (0.2-50ng/㎖)
CHIR99012 (0.04-10μM)
매트리겔(상표명) 또는 비트로넥틴과 조합한 무 피더
본 발명의 일 양상은 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위한 배양 배지를 제공한다. 일 실시형태에서, 배양 배지는 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일 실시형태에서, 배양 배지는 표 4에 나타낸 바와 같이 조합하여 VEGF, bFGF, SCF, IL6, IL11 및 ROCK 저해제 및 소분자를 포함하는 CD34 기본 배지를 포함한다. 일 실시형태에서, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지는 Wnt 경로 활성자, IGF 및 EPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 중배엽 세포로부터 확정적 HE를 생성하기 위한 배양 배지는 ROCK 저해제, Wnt 경로 활성자, VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11, 및 IGF 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 CHIR99021이다. 일 실시형태에서 VEGF, bFGF, SCF, IL6, IL11 및 ROCK 저해제를 포함하는 배양 배지는 Wnt 경로 활성자, TGFβ 수용체/ALK 저해제, IGF1 및 EPO 중 하나 이상이 없다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 4에 나타낸 바와 같은 농도 범위로 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다.
중배엽으로부터의 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위한 iCD34-C 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비 필수 아미노산
아스코르브산(1-250ng/㎖)
MTG (10-2500μM)
VEGF (0.2-50ng/㎖)
bFGF (0.1-25ng/㎖)
SCF (1-250ng/㎖)
IL6 (0.2-50ng/㎖)
IL11 (0.2-50ng/㎖)
Y27632 (0.2-50μM)
매트리겔(상표명) 또는 비트로넥틴과 조합한 무 피더
본 발명의 일 양상은 확정적 조혈 내피세포로부터 다능성 전구체(MPP) 세포를 얻기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. MPP는 호중구 전구체를 포함하는 골수성으로 추가로 분화될 수 있다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼 (i) BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배양 배지로서, 배양 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-HSC로 분화시키는 데 적합한, 상기 배양 배지를 포함한다(표 5). 다른 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포를 프레-HSC로 분화시키기 위한 배양 배지를 포함하는 배양 플랫폼은 추가로 (ii) BMP 활성자, TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11을 포함하는 배양 배지로서, 배양 배지는 ROCK 저해제가 없고, 프레-HSC를 다능성 전구체로 분화시키는 데 적합한, 배양 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서 ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 5에 나타낸 바와 같은 농도 범위에서 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다.
확정적 HE로부터 다능성 전구체를 얻기 위한 iMPP-A 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비필수 아미노산
아스코르브산 (1-250ng/㎖)
MTG (10-2500μM)
VEGF (0.2-50ng/㎖)
bFGF (0.2-25ng/㎖)
SCF (1-250ng/㎖)
Flt3L (0.5-150ng/㎖)
IL6 (0.2-50ng/㎖)
IL11 (0.2-50ng/㎖)
Y27632 (0.2-50μM)* 프레-HSC를 다능성 전구체로 분화시킬 때 포함되지 않음
BMP4 (0.5-150ng/㎖)
TPO (0.5-150ng/㎖)
IL3 (0.5-150ng/㎖)
GMCSF (0.1-25ng/㎖)
EPO (0.02-5ng/㎖)
매트리겔(상표명)또는 비트로넥틴과 조합한 무 피더
II. iNK/iT 플랫폼S
본 발명의 일 양상은 확정적 조혈 내피세포로부터 T 세포 전구체 또는 T-세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배지; 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-T 세포 전구체(프레-iproT)로 분화시키는 데 적합함; 및/또는 (ii) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고, 프레-T 세포 전구체를 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화시키는 데 적합하다(표 6). 일부 실시형태에서, 확정적 HE를 프레-iproT로 분화시키기 위한 배지는 ROCK 저해제, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7을 포함하고; BMP 활성자는 없다. 일부 실시형태에서, 프레-iproT를 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화시키는 배지는 SCF, Flt3L 및 IL7을 포함한다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서 ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 6에 나타낸 바와 같은 농도 범위로 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다.
확정적 HE로부터 프레-T 세포 전구체를 얻기 위한 iTC-A2 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비필수 아미노산
아스코르브산 (1-250ng/㎖)
MTG (10-2500μM)
Flt3L (0.2-50ng/㎖)
IL7 (0.2-50ng/㎖)
SCF (1-250ng/㎖)
TPO (0.2-50ng/㎖)
*: T 세포 전구체 또는 T 세포에 대한 프레-T 전구체를 얻기 위한 iTC-B2에 포함되지 않음 BMP4 (0.5-150ng/㎖)*
VEGF (0.2-50ng/㎖)*
bFGF (0.1-25ng/㎖)*
Y27632 (0.2-50μM)*
무 피더, 현탁액 또는 단일층
본 발명의 일 양상은 확정적 조혈 내피세포로부터 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-NK 세포 전구체(프레-iproNK)로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지; 및 (ii) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고, 프레-NK 세포 전구체를 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로 분화시키기에 적합한, 상기 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 확정적 HE를 프레-iproNK로 분화시키는 배지는 ROCK 저해제, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15를 포함하고; BMP 활성자가 없다. 일부 실시형태에서, 프레-iproNK를 NK 전구 또는 NK 세포로 분화시키는 배지는 SCF, Flt3L 및 IL15를 포함한다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서의 배양 배지는 표 7에 나타낸 바와 같은 농도 범위에서 소분자, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다.
확정적 HE에 대해 프레-NK 세포 전구체를 얻기 위한 iNK-A2 배양 배지
iCD34 기본 배지 스템프로 34
글루타민
비필수 아미노산
아스코르브산 (1-250ng/㎖)
MTG (10-2500μM)
SCF (1-250ng/㎖)
Flt3L (0.2-50ng/㎖)
TPO (0.1-25ng/㎖)
IL7 (0.2-50ng/㎖)
IL15 (0.4-100ng/㎖)
IL3 (0.1-25ng/㎖)
*: NK 전구체 또는 NK 세포에 대한 프레-NK 전구체를 얻기 위한 iNK-B2에 포함되지 않음 VEGF (0.2-50ng/㎖)*
bFGF (0.1-25ng/㎖)*
BMP4 (0.5-150ng/㎖)*
Y27632 (0.2-50μM)*
무 피더, 현탁액, 단일층
본 발명의 다른 양상은 (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하고, VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없는 배지로서, 이 배지는 프레-T 세포 전구체를 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지; (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, 확정적 조혈 내피세포를 프레-T 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한 BMP 활성자를 포함하는 배지; (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하고, 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포 분화 및 확장에 적합한 배양 배지; (iv) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 데 적합한 배양 배지; (v) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하고, iPSC로부터 중배엽 세포를 생성하고 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; 및 (vi) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없으며, 미경험 iPSC를 파종 및 확장하는 데 적합한 배양 배지 중 하나 이상을 포함하는, T 세포 전구체 또는 T 세포를 얻기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다.
일 실시형태에서, T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (i) SCF, Flt3L, 및 IL7을 포함하고, VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나, 또는 본질적으로 없으며, 프레-T 세포 전구체를 T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화시키는 데 적합한 배지를 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지(i)를 포함하는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하고; 확정적 조혈 내피세포를 프레-T 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한 배지를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지 (i) 및 (ii)를 포함하는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 배양 배지를 추가로 포함하되, 상기 조성물은 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 분화 및 확장에 적합하다. 또 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (iv) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 중배엽 세포 내 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 데 적합한, 배양 배지를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii), (iii) 및 (iv)를 포함하는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (v) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하고, iPSC로부터 중배엽 세포를 생성 및 확장시키는 데 적합한 배양 배지를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii), (iii), (iv) 및 (v)를 포함하는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (vi) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없고, 미경험 iPSC를 파종 및 확장시키는 데 적합한 배양 배지를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Notch 인자는 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼에서 사용된다. 일부 실시형태에서, Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 및 DLL-4를 포함하는 Notch 인자는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나, 또는 본질적으로 없고, 프레-NK 세포 전구체를 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지; (ii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배지로서, 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-NK 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지; (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 배양 배지로서; 상기 조성물은 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 분화 및 확장에 적합한, 상기 배양 배지; (iv) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 데 적합한, 배양 배지; (v) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하고, iPSC로부터 중배엽 세포를 생성 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지; (vi) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없고, 미경험 iPSC를 파종 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지 중 하나 이상을 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 얻기 위한 배양 플랫폼을 제공한다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, NK 성숙은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 인공 항원 중 하나 이상을 이용하여 수행되고, 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포 형태로 도입된다.
일 실시형태에서, NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (i) 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지로서, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나, 또는 본질적으로 없고, 프레-NK 세포 전구체를 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, NK 성숙은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 인공 항원 중 하나 이상을 이용하여 수행되고, 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 다른 실시형태에서, 배지 (i)을 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (ii) ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배지로서, 상기 배지는 확정적 조혈 내피세포를 프레-NK 세포 전구체로 분화시키는 데 적합한, 상기 배지를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지 (i) 및 (ii)를 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (iii) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배양 배지를 추가로 포함하되; 상기 조성물은 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 분화 및 확장에 적합하다. 또 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 (iv) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하고, 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 데 적합한 배양 배지를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii), (iii) 및 (iv)를 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 추가로 (v) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하고, iPSC로부터 중배엽 세포를 생성 및 확장시키는 데 적합한 배양배지를 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지 (i), (ii), (iii), (iv) 및 (v)를 포함하는 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 추가로 (vi) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없으며, 미경험 iPSC를 파종 및 확장시키는 데 적합한, 배양 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다.
본 발명의 일 양상은 (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는, 중배엽 세포로부터의 확정적 조혈 내피세포 분화 및 확장을 위한 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는, 중배엽 세포 내 확정적 조혈 퍼텐셜을 얻기 위한 배양 배지; (iii) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 미경험 iPSC로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키기 위한 배양 배지; 및 (iv) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 미경험 iPSC 파종 및 확장 배양물 중 하나 이상을 포함하는, 확정적 조혈 내피세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공하며, 파종 배양물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없다. 일부 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다.
일 실시형태에서, 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위한 배양 플랫폼은 (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 배양 배지를 포함하되; 상기 배양 배지는 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장시키는 데 적합하다. 일 실시형태에서, 배양 배지 (i)을 포함하는 배양 플랫폼은 (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지를 더 포함하되, 배양 배지 (ii)는 중배엽 세포 내 확정적 조혈 퍼텐셜을 얻는 데 적합하다. 다른 실시형태에서, 배양 배지 (i) 및 (ii)를 포함하는 배양 플랫폼은 (iii) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배양 배지를 더 포함하되, 배양 배지 (iii)은 미경험 iPSC로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 데 적합하다. 또 다른 실시형태에서, 배양 배지 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 배양 플랫폼은 추가로 (iv) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배양 배지를 포함하고, 배양 배지 (v)는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없되, 배양 배지 (v)는 미경험 iPSC를 파종 및 확장시키는 데 적합하다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다.
본 발명의 일 양상은 (i) ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는, 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포를 분화 및 확장시키기 위한 배양 배지로서, 확정적 조혈 내피세포는 CD34+ 확정적 조혈 내피세포를 포함하는, 상기 배양 배지; (ii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는, 중배엽 세포에서 확정적 조혈 퍼텐셜을 얻기 위한 배양 배지; (iii) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는, 미경험 iPSC로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키기 위한 배양 배지; 및 (iv) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배양물을 파종하거나 또는 확장시키는 미경험 iPSC 중 하나 이상을 포함하는, CD34+ 확정적 조혈 내피세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공하며, 파종 배양물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4이다.
본 발명의 일 양상은 (i) BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는, 미경험 iPSC로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키기 위한 배양 배지; 및 (ii) MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배양물을 파종 또는 확장시키는 미경험 iPSC 중 하나 이상을 포함하는, 중배엽 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼을 제공하며, 파종 배양물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 모든 상기 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012 또는 BIO이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99012이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자는 BMP4. 일부 실시형태에서, 중배엽 세포를 생성하기 위한 배양 플랫폼은 추가로 (iii) BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지를 포함할 수 있되, 배양 배지는 중배엽 세포에서 확정적 조혈 퍼텐셜을 얻기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없다.
C. 확정적 조혈 내피세포, 다능성 전구체, T 세포 또는 NK 세포 전구체, T 세포 및/또는 NK 세포를 얻기 위한 방법
본 발명은 하나 이상의 배양 배지를 포함하는 다단계화된 배양 플랫폼을 이용하여 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 무 피더 조건에 적합하다. 상기 방법은 또한 단일층 배양에 적합하고, 따라서 당업계에 공지된 방법에 비해 만능 줄기세포 분화에 대한 순서에서 EB 형성 또는 응집물을 필요로 하지 않는다. 상기 방법은 제공된 바와 같이 생성하며, 동시에, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE), CD34+ HE(iCD34)(다능성 전구 세포(iMPP)로 추가로 분화될 수 있음), 자연 살해 세포 전구체(ipro-NK), T 세포 전구체(ipro-T), 성숙 NK 세포(iNK) 및 T 세포(iT)를 확장시킨다. 본 발명의 추가적인 양상은 또한 만능 줄기세포-유래 CD34+, HE, HSC 및/또는 MPP로부터 분화된 골수성 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단일층 배양에서 만능 세포로부터 조혈 계통 세포를 분화 및 확장시키는 방법을 제공하되, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포가 얻어지고, 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하는 일 없이 확장되며, 이어서, BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자와 접촉되어 만능 줄기세포로부터 배상체를 형성하는 일 없이 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 확장된 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 얻는다. bFGF, 및 선택적으로, ROCK 저해제 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속적 접촉에 의해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 확정적 HE 세포로 분화되고, 이는 또한 분화 동안 확장된다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위해, 제공된 방법은 EB-매개 만능 줄기세포 분화보다 우수한데, EB 형성이 세포 확장을 야기하지 않으며, 단일층 배양을 허용하지 않고, 힘이 들며, 효율이 낮다. 추가적으로, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법을 이용하는 단일층 배양이 생체내 장기간 조혈 자기-재생, 재구성 및 생착을 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포를 야기한다는 것을 개시한다.
이하에 상술하는 바와 같이, 본 발명은 확정적 조혈 내피세포를 얻는 것을 통해 만능 세포로부터 조혈 계통 세포를 얻는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 분화를 위해 EB를 형성하는 일 없이 만능 세포로부터 조혈 계통 세포 분화를 지시하는 방법을 제공한다.
I. iCD34 플랫폼
1. 확정적 iHE의 유도 및 확장
본 발명의 일 양상은 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하기 위해 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 단계로 시작하되, 만능 줄기세포는 파종 및 확장된다. 이어서, 만능 줄기세포는 중배엽 세포로 분화되는데, 이는 이 단계에서 확장된다. 이어서, 확장된 중배엽 집단은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 집단으로 분화되고, 이어서, 확정적 조혈 내피세포로 분화 및 확장된다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 본 발명은 추가로 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 단계, 및 확정적 iHE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻고, 이어서, iHE로 분화되는 단계를 포함하는, 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성 및 확장시키는 방법을 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 확정적 iHE로 분화시키는 단계를 포함하는 확정적 조혈 내피세포를 생성 및 확장시키는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법은 EB 형성 없이 최적화된 단일층 iCD34 배양 플랫폼을 이용하고, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포로부터 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포로부터 중배엽 진단을 분화 및 확장시키는 단계; (2) 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽 세포에서 확정적 HE 퍼텐셜을 얻기 위해 중배엽 진단을 분화 및 확장시키는 단계; (3) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 확정적 HE 세포로 분화 및 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD93-을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지와 세포를 접촉시키는 단계는 단지 확정적 HE 퍼텐셜을 달성하기 위해 중배엽 세포 특정화 후이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 파종된 iPSC, 및/또는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 만능 세포를 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포를 파종하는 단계를 포함하되, 만능 줄기세포는 확장한다.
파종된 만능 줄기세포로부터 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 단계; (2) 중배엽 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 iHE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 단계; (3) 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 iHE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터의 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93를 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34 양성을 이용하여 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 파종된 iPSC 및/또는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리 하는 단계를 포함한다.
만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 조혈 내피세포(iHE)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 중배엽 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻는 단계; (2) 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93를 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
만능 줄기세포-유래 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포(iHE) 퍼텐셜을 얻는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계를 포함하되, 중배엽 세포는 확장한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 포함한다.
2. 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포의 유도 및 확장
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 생성하기 위해 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 만능 줄기세포를 파종시키는 것으로 시작한다. 이어서, 파종된 만능 줄기세포는 중배엽으로 발생되고, 추가로 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화된다. 대안적으로, 본 발명은 파종된 만능 줄기세포를 중배엽으로 분화시키는 단계, 및, 이어서, 중배엽을 확정적 조혈 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 만능 줄기세포-유래 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 본 명세서에 개시된 방법은 최적화된 iCD34 배양 플랫폼을 이용하는데, 이는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포로부터 유래된 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 단계; 및 (2) 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 만능 줄기세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 세포를 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포를 파종하는 단계를 포함한다.
만능 줄기세포-유래 중배엽으로부터 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
3. 만능 줄기세포로부터의 중배엽의 유도 및 확장
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포-유래 중배엽을 생성하기 위해 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 단계에 의해 시작하되, 만능 줄기세포는 파종되고, 이어서, 파종된 세포는 제2 단계에서 중배엽으로 분화된다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 본 명세서에 개시된 방법은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없는 최적화된 iCD34 배양 플랫폼을 이용한다.
만능 세포로부터 만능 줄기세포-유래 중배엽을 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 파종된 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 iPSC를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 iPSC를 파종 및 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
4. Deriving 조혈 다능성 전구체(iMPP)
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체(iMPP)를 생성하기 위한 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 만능 줄기세포를 파종시키는 것으로 시작한다. 파종된 세포는 중배엽 세포로 확장 및 분화된다. 중배엽은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 확장 및 분화되고, 후속적으로 확정적 조혈 내피세포로 확장 및 분화된다. 확정적 HE 세포는 프레-HSC로 확장 및 분화되고, 이어서, 호중구 전구를 포함하는 골수성 세포로 분화할 수 있는 다능성 전구체로 확장 및 분화된다. 대안적으로, 본 발명은 파종된 만능 세포를 중배엽으로 분화시키는 단계, 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키고, 이어서, 중배엽 세포를 확정적 iHE로 분화시키고, 이어서, iMPP로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체(iMPP)를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 만능 줄기세포-유래 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키고, 이어서 중배엽 세포를 확정적 iHE로 분화시키고, 이어서, iMPP로 분화시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기세포-유래 iMPP를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 확정적 iHE로 분화시키고, 이어서 iMPP로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 iMPP를 생성하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 만능 줄기세포-유래 iHE를 iMPP로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 iMPP를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 본 명세서에 개시된 방법은 EB 형성 없이 최적화된 단일층 iCD34 배양 플랫폼을 이용하는데, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포로부터 조혈작용 다능성 전구체(iMPP)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키기 위해, 만능 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; (2) 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻기 위해 중배엽 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; (3) 세포를 ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키기 위해 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시키는 단계; 및 (4) HE 세포를 BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, ROCK 저해제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 iMPP로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 MEKi, GSKi, 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-HSC 세포를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-HSC를 iMPP로 분화시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 ROCK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 만능 줄기세포, 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다.
만능 줄기세포-유래 중배엽으로부터 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체(iMPP)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 중배엽 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 단계; (2) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계; (3) HE 세포를 BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, ROCK 저해제를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 iMPP로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-HSC 세포를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-HSC를 iMPP로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 ROCK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체(iMPP)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, ROCK 저해제, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계; 및 (2) HE 세포를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, ROCK 저해제를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 iMPP로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제 및1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-HSC 세포를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-HSC를 iMPP로 분화시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 ROCK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
만능 줄기세포-유래 확정적 HE 세포로부터 만능 줄기세포-유래 다능성 전구체(iMPP)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, ROCK 저해제를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 iMPP로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-HSC로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-HSC 세포를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-HSC를 iMPP로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 ROCK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
5. 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체( ipro -T) 또는 T 세포― iCD34 플랫폼 및 iT 플랫폼을 얻는 단계
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 만능 줄기세포-유래 T 세포를 생성하기 위한 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 만능 줄기세포에 의해 시작하며, 이로부터의 중배엽 세포는 분화 및 확장된다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 이어서, 중배엽은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화된다. 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 후속적으로 확정적 조혈 내피세포로 분화되고, 동시에 배지에서 확장된다. 이어서, 확정적 HE 세포는 프레-iproT로 분화되고, 이어서, T 세포 전구체(프로-T)로 분화되는데, 이는 동일한 배지에서 연속적으로 T 세포로 분화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 파종된 만능 줄기세포를 중배엽으로 분화시키는 단계, 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키고, 이어서, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 iHE로 분화시키며, 이어서, T 세포 전구체 또는 T 세포로 분화되는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 만능 줄기세포-유래 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키고, 이어서 iHE로 분화되고, 이어서, ipro-T 또는 T 세포로 분화되는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 iHE로 분화시키고, 이어서, ipro-T 또는 T 세포로 분화되는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체 또는 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 만능 줄기세포 -유래 iHE를 ipro-T 또는 T 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 본 명세서에 개시된 방법은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없는 최적화된 iCD34 배양 플랫폼을 이용한다. 일부 실시형태에서, Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 및 DLL-4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Notch 인자는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다.
만능 줄기세포로부터 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포(iT)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 파종된 만능 줄기세포를 중배엽으로 분화시키는 단계; (2) 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계; (3) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 확정적 HE 세포로 분화시키는 단계, 및 (4) HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproT 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproT를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 Notch 인자를 갖는 만능 줄기세포 -유래 프로-T를 포함한다. 일부 실시형태에서, Notch 인자는 Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 또는 DLL-4이다. 일부 실시형태에서, DLL-1 및 -4는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드, 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 만능 줄기세포, 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포 -유래 중배엽으로부터 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계; (2) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 확정적 HE 세포로 분화시키는 단계, 및 (3) HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproT 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproT를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 Notch 인자를 갖는 만능 줄기세포-유래 프로-T를 포함한다. 일부 실시형태에서, Notch 인자는 Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 또는 DLL-4이다. 일부 실시형태에서, DLL-1 및 -4는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드, 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포(iT)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 확정적 HE 세포로 분화시키는 단계; 및 (2) HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproT를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproT 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproT를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 더 포함하고, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 Notch 인자를 갖는 만능 줄기세포-유래 프로-T를 포함한다. 일부 실시형태에서, Notch 인자는 Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 또는 DLL-4이다. 일부 실시형태에서, DLL-1 및 -4는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드, 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포-유래 HE 세포로부터 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T) 또는 T 세포(iT)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-T 또는 T로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproT로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproT 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproT를 ipro-T 또는 iT로 분화시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나, 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 Notch 인자를 갖는 만능 줄기세포-유래 프로-T를 포함한다. 일부 실시형태에서, Notch 인자는 Jag1, Jag2, DLL-1, DLL-3 또는 DLL-4이다. 일부 실시형태에서, DLL-1 및 -4는 가용성 펩타이드, 비드에 접합된 펩타이드, 표면에 접합된 펩타이드, 또는 세포에 의해 제시되는 펩타이드로서 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능 줄기세포-유래 HE 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
6. 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포-iCD34 플랫폼 및 iNK 플랫폼을 얻는 단계
본 발명의 일 양상은 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포(iNK)를 생성하기 위해 최적화된 다단계 과정을 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 일부 실시형태에서 파종되는 만능 줄기세포에 의해 시작한다. 만능 줄기세포는 중배엽 세포로 발생되는데, 이는 확장되고, 후속적으로 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화된다. 이어서, 확정적 조혈 내피세포는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 분화 및 확장된다. HE 세포는 프레-iproNK로 분화될 수 있고, 이어서 NK 세포 전구체(프로-NK)로 분화될 수 있으며, 동일한 배지에서 NK 세포로 연속적으로 분화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 파종된 만능 줄기세포를 중배엽으로 분화시키는 단계, 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키고, 이어서, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 iHE로 분화시키고, 이어서, NK 세포 전구체로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 만능 줄기세포-유래 중배엽을 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로 분화시키는 단계, 이어서, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 iHE로 분화시키고, 이어서, ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 iHE로 분화시키고, 이어서 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체 또는 iNK를 생성하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 만능 줄기세포-유래 iHE를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함하는 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 전구체를 얻기 위한 배양 플랫폼은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 프로-NK 세포를 하나 이상의 인공 항원과 접촉시킴으로써 NK 세포를 유도하는 것을 포함하되, 인공 항원은 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 본 명세서에 개시된 방법은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없는 최적화된 iCD34 배양 플랫폼을 이용한다.
파종된 iPSC로부터 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포(iNK)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포를 분화 및 확장시키는 단계; (2) 중배엽 세포를 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽 세포에서 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 얻는 단계; (3) 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계; 및 (4) HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, IL15, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproNK 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproNK를 프로-iNK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, NK 세포 전구체를 얻기 위한 배양 플랫폼은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 프로-NK 세포를 하나 이상의 인공 항원과 접촉시킴으로써 NK 세포를 유도하는 것을 포함하되, 인공 항원은 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 만능 세포를 MEKi, GSKi 및 ROCKi를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 미경험 만능 세포를 파종 및 확장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 iPSC, 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93를 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포-유래 중배엽으로부터 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포(iNK)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 중배엽을 BMP 활성자, Wnt 경로 활성자 및 bFGF를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 중배엽을 분화시키는 단계; (2) 확정적 HE 세포를 얻기 위해, 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 분화시키는 단계; 및 (3) ipro-NK 또는 iNK를 얻기 위해, HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, IL15, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproNK 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproNK를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, NK 세포 전구체를 얻기 위한 배양 플랫폼은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 프로-NK 세포를 하나 이상의 인공 항원과 접촉시킴으로써 NK 세포를 유도하는 단계를 포함하되, 인공 항원은 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포(iNK)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 (1) 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 분화 및 확장시키는 단계; 및 (2) HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, IL15, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 포함하는 상기 방법은 프레-iproNK 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproNK를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, NK 세포 전구체를 얻기 위한 배양 플랫폼은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 프로-NK 세포를 하나 이상의 인공 항원과 접촉시킴으로써 NK 세포를 유도하는 단계를 포함하되, 인공 항원은 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 만능 줄기세포, 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
만능 줄기세포-유래 HE 세포로부터 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK) 또는 NK 세포(iNK)를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로, VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 HE 세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, IL15, VEGF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 확정적 HE 세포를 프레-iproNK로 분화시키는 단계를 포함하는 방법은 프레-iproNK 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 배지와 접촉시킴으로써 프레-iproNK를 ipro-NK 또는 iNK로 분화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 배지는 VEGF, bFGF, BMP 활성자, 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없거나 또는 본질적으로 없다. 일부 실시형태에서, NK 세포 전구체를 얻기 위한 배양 플랫폼은 NK 성장, 발생 및 성숙을 자극하기 위해 ipro-NK 세포를 하나 이상의 인공 항원과 접촉시킴으로써 NK 세포를 유도하는 단계를 포함하되, 인공 항원은 비드 접합, 혈장막 입자 및/또는 항원 제시 세포의 형태로 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 파종된 만능 줄기세포, 중배엽, 및/또는 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법으로부터 얻은 iHE 세포는 CD34를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 이용하여 얻어진 iHE 세포를 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 BMP 활성자는 BMP4이다. 일부 실시형태에서, Wnt 경로 활성자는 GSK3 저해제이다. 일부 실시형태에서, ROCK 저해제는 Y27632 또는 티아조비빈이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서의 배지는 TGFβ 수용체 저해제가 없거나 또는 본질적으로 없다.
상기에 비추어, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼에 의해 제공되는 이점 중 하나는 만능 줄기세포 분화를 위한 EB 형성 없이 배양, 계대 및 해리시키는 단일 만능 세포의 향상된 생존도 및 생존이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 게놈 조작된다. 일부 실시형태에서, iPSC는 특정 공여자 또는 환자의 면역 세포로부터 재프로그래밍된다. 단일 세포 내로, 예컨대 단일 세포 현탁액 내로의 세포의 해리는 효소적 또는 기계적 수단에 의해 달성될 수 있다. 단일 세포 내로 세포의 해리를 허용하는 당업계에 공지된 임의의 효소적 제제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 해리제는 트립신/EDTA, TrypLE-셀렉트, 콜라게나제 IV 및 디스파제로부터 선택된다. 킬레이터, 예컨대 EDTA, 아쿠타제 또는 아쿠막스(AccuMax)는 또한 본 명세서에 상정된 방법에 따라 세포를 해리함에 있어서 단독으로 또는 효소적 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 해리 제제는 단일 세포에 대한 해리를 용이하게 하기 위해 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS 중에 용해될 수 있다. 해리 동안 그리고 해리 후에 세포의 생존을 향상시키기 위해, 일부 실시형태에서, 생존 촉진 물질, 예를 들어, 1종 이상의 성장 인자, 세포사 및 세포자멸사에 수반된 세포 경로의 저해제 또는 조건화 배지가 첨가된다. 일 실시형태에서, 생존 촉진 물질은 티아조비빈을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 ROCK 저해제이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 유전자 각인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 유전자 각인은 (i) 비-만능 세포의 iPSC로의 재프로그래밍 동안에 또는 후에 만능 세포의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻어진 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하되, 만능 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되며, iPSC는 공급원 치료적 속성을 보유하는데, 이는 또한 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 포함된다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 관여자의 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 보편적, 즉, 임의의 효과기 세포 유형과 양립 가능하며, 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 효과기 세포는 그의 세포 유형과 상관 없이 동일한 이중- 또는 다중-특이적 관여자와 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자의 에피토프에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 보편적 표면 촉발 수용체의 공자극 도메인은 정규 또는 비정규 세포 활성화 및 효과기 세포 기능 향상을 위해 IL2를 포함한다. 또한 일부 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상에 관한 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 관여자는 세포 유형 특이적이며, 즉, 관여자는 특정 면역 세포 유형에 결합하고/하거나 이를 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 관여자는 세포 유형 독립적이고, 즉, 관여자는 다중 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 또는 호중구에 결합하고/하거나 이를 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 B2M 널, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 널, TIM3 널, TAP1 널, TAP2 널, 타파신 널, NLRC5 널, PD1 널, RFKANK 널, CITTA 널, RFX5 널 및 RFXAP 널 중 하나 이상을 포함한다. 변형된 HLA 클래스 I 및/또는 II를 갖는 이들 세포는 면역 검출에 대해 증가된 내성을 가지고, 따라서, 개선된 생체내 지속성을 제공한다. 게다가, 이러한 세포는 입양 세포 요법에서 HLA 매칭에 대한 필요를 회피할 수 있으며, 따라서 보편적, 기성품의 치료 요법의 공급원을 제공한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CAR, TCR, CD137 또는 CD80 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 세포는 개선된 면역 효과기 능력을 가진다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 이중- 또는 다중-특이적 관여자와의 결합을 위한 표면 촉발 수용체를 포함한다. 이러한 세포는 개선된 종양 표적화 특이성을 가진다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 항원 특이적이다.
세포 배양물 및 배지 수집에서의 기법은 문헌[Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148, 1997; K. Kitano, Biotechnology 17:73, 1991; Curr. Opin. Biotechnol. 2:375, 1991; Birch et al., Bioprocess Technol. 19:251, 1990; "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); "Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); "Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); "Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., al., 1993)]에 기재되어 있다. 줄기세포의 분화는 문헌[Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; 및 Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998]에서 검토한다.
본 발명에서, 특정 특징을 갖는 세포 집단을 풍부화하기 위한 전력은 방법의 다양한 단계에서 제공된다. 일 실시형태에서, 세포 집단으로부터 만능 줄기세포를 풍부화하는 방법은 집단에서 세포를 해리시키고, 세포를 재현탁시킴으로써 단일 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함한다. 해리된 세포는 세포를 유지하거나 또는 세포 분류를 수행하기 위한 임의의 적합한 용액 또는 배지에서 재현탁될 수 있다. 특정 실시형태에서, 만능성 단일 세포 현탁액은 GSK3 저해제, MEK 저해제 및 Rock 저해제를 함유하고, TFGβ저해제를 결여한다. 특정 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고, MEK 저해제는 PD0325901이고/이거나 Rock 저해제는 티아조비빈이다.
특정 실시형태에서, 세포의 집단은 만능 세포를 양성으로 선택하도록 분류되고/되거나 집단은 비-재프로그래밍 또는 비-만능 세포가 고갈되고, 이에 의해 만능 세포가 풍부한 세포의 집단을 얻는다. 일 실시형태에서, 단일 세포 현탁은 제조되고, 이어서, 예를 들어, 적절한 항체를 이용하여 만능성 마커를 염색하는 것과 같이 단일 세포가 분류를 위해 준비된다. 세포는 세포를 분류하는 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 자기 비드 또는 유세포 분석(FACS) 분류에 의해 분류될 수 있다.
세포는 SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, SSEA1 (Mouse), CD30, SSEA5, CD90 및/또는 CD50의 발현을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 하나 이상의 만능성 마커 또는 세포 분화를 나타내는 마커에 기반하여 분류될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 만능성 또는 분화의 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개의 마커에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4의 발현에 기반하여, 그리고 특정 실시형태에서 TRA1-81 및/또는 TRA1-60과 조합한 SSEA4의 발현에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 또는 TRA1-60 및/또는 CD30 발현에 기반하여 분류된다. 일 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 및 CD30에 기반하여 분류된다. 다른 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-60 및 CD30에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 분화의 하나 이상의 표면 마커를 이용하는 세포 분류는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7, 및 만능성 마커, 예컨대 SSEA4, TRA1-81 및/또는 CD30을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 겪는 세포의 집단 또는 만능 세포 집단은 분화 세포가 고갈된다. 일 실시형태에서, 만능 세포 또는 재프로그래밍하도록 유도된 세포의 집단은 분화 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 세포가 고갈될 수 있다. 분화하는 세포의 세포 표면 마커의 예시적인 예는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, CD13은 분화하는 세포의 표면 마커로서 사용된다.
다른 실시형태에서, 세포의 집단은 목적으로 하는 계통으로 분화하도록 유도되고, 분화하는 또는 분화 세포의 풍부한 집단을 얻기 위해 만능 세포가 고갈된다. 일부 실시형태에서, 분화 세포의 집단은 특정 계통으로 분화하도록 유도된 ESC 또는 iPSC와 같은 세포의 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 집단은 상기 기재한 음성 세포 분류 기법("패닝(panning)"), 예컨대 만능성의 마커에 기반하여 자기 비드 또는 FAC에 따른 집단에서 세포를 분류하는 것을 이용하여 만능 세포가 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화 세포를 포함하는 세포의 집단은 만능성 마커를 이용하여 FACs에 의해 분류되고, 만능성 마커를 발현시키는 세포가 고갈된 분획이 얻어진다. 다른 실시형태에서, 세포의 집단은 만능성 마커가 고갈된 분획을 얻기 위해 분화 마커, 예컨대 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 계통 특이적 마커에 기반하여 FAC에 의해 분류된다. 본 발명의 일부 특정 실시형태에서, CD13은 분화 세포의 표면 마커로서 사용된다.
D. 본 명세서에 제공된 방법 및 플랫폼으로부터 생성된 세포 집단 및 세포주
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 후에 배양된 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 35, 40, 42 또는 45일, 또는 그 사이의 임의의 일수 동안 분화하도록 유도된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래미이 후에 배양된 세포는 약 1 내지 42일, 2 내지 40일, 2 내지 35일, 2 내지 20일, 2 내지 10일, 4 내지 30일, 약 4 내지 24일, 약 6 내지 22일, 또는 약 8 내지 약 12일 동안 유도된다. 일부 실시형태에서, 세포는 iPSC를 포함하는 만능 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 미경험 iPSC이다. 일 실시형태에서, 풍부화는 상대적으로 단시간에 세포 콜로니를 분화시키는 클론 만능 줄기세포-유래를 얻음으로써, 다양한 단게에서 만능 줄기세포-유래 분화 세포를 생성하는 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 풍부화는 CD34 발현 HE 세포, CD34 발현 HSC 세포, T 또는 NK 세포 전구체 및 T 또는 NK 세포를 유도함으로써, 각각의 세포 집단을 생성하는 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 풍부화는 분화 단계/세포 유형을 나타내는 세포 발현 특이적인 특징적 마커(들)를 동정하고 얻기 위해 세포 집단을 분류하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34, CD43, CD73, CXCR4, 및/또는 CD93을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD43 음성을 사용한다. 일부 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD73 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성 및 CXCR4 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성, CD43 음성 및 CD93 음성을 사용한다. 일부 다른 실시형태에서, 분류는 CD34 양성 및 CD93 음성을 사용한다. 추가적인 풍부화 기법은 목적으로 하는 세포 유형의 풍부한 집단을 얻기 위해 목적으로 하지 않는 세포 유형을 나타내는 세포 발현 마커의 고갈을 포함한다.
이렇게 해서, 본 발명의 일 양상은 (i) 만능 줄기세포-유래 CD34+ HE 세포(iCD34)(여기서, iCD34 세포는 다능성 전구 세포로 분화하는 능력을 가지고, iCD34 세포는 CD34+CD43-임); (ii) 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE)(여기서, iHE 세포주 또는 클론 세포는 CD34+, 및 CD93-, CXCR4-, CD73- 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나임); (iii) 만능 줄기세포-유래 다능성 전구 세포(iMPP)(여기서, iMPP 세포는 CD34+CD45+임); (v) 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체(ipro-T)(여기서, T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+임); (iv) 만능 줄기세포-유래 T 세포(iT)(여기서, T 세포는 CD45+CD4+CD3+ 또는 CD45+CD8+CD3+임); (vi) 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체(ipro-NK)(여기서, NK 세포 전구체는 CD45+CD56+CD7+CD3-임); 및 (vii) 만능 줄기세포-유래 NK 세포(iNK)(여기서, NK 세포는 CD45+CD56+NKp46+임) 중 하나 이상의 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물, 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포는 냉동보존될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물, 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 초과 동안(그러나 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주 이상은 아님) 주위 저장 조건을 받을 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 만능 줄기세포 유래된 (i) CD34+ HE 세포(iCD34), 및 iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; (ii) 확정적 조혈 내피세포(iHE), 및 iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; (iii) 확정적 HSC, 및 iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; (iv) 다능성 전구 세포(iMPP) 및 iMPP-A; (v) T 세포 전구체(ipro-T), 및 iTC-A2 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; (vi) T 세포(iTC) 및 iTC-B2; (vii) NK 세포 전구체(ipro-NK), 및 iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; 및/또는 (viii) NK 세포(iNK) 및 iNK-B2 중 하나 이상을 포함하는 혼합물을 제공하되; 여기서
a. iCD34-C는 ROCK 저해제, 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, IGF, 및 EPO, 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하고; TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없으며;
b. iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하며;
c. iTC-A2는 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
d. iTC-B2는 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하되; 조성물은 VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고;
e. iNK-A2는 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하며, 그리고
f. iNK-B2는 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다.
E. iPSC 유래 면역 세포의 치료적 용도
본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단을 포함하는 조성물을 제공하되, 면역 세포는 세포 기반 입양 요법에 적합하다. 일 실시형태에서, 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 면역 세포는 개선된 치료적 퍼텐셜을 위해 생체밖에서 추가로 조정된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 미경험 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 I형 NKT 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비의 적응 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 HSC 세포, T 세포 또는 NK 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 HSC 세포, T 세포, 또는 NK 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연 발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 효과기 세포에서 바람직한 치료적 속성을 전달하는 유전자 각인을 포함하는데, 이 유전자 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 유지되고, 기능성이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 유전자 각인은 (i) 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍한 동안에 또는 후에 만능 세포 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 양상 ; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하되, 상기 만능 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 공급원 치료적 속성을 보유하는데, 이는 또한 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 포함된다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 관여자와의 결합을 위한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다.
또한 일부 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상에 관한 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 B2M 널, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 널, TIM3 널, TAP1 널, TAP2 널, 타파신 널, NLRC5 널, PD1 널, RFKANK 널, CITTA 널, RFX5 널 및 RFXAP 널 중 하나 이상을 포함한다. 변형된 HLA 클래스 I 및/또는 II을 갖는 이들 세포는 면역 검출에 대한 증가된 내성을 가지며, 따라서 개선된 생체내 지속성을 제공한다. 게다가, 이러한 세포는 입양 세포 요법에서 HLA 매칭에 대한 필요를 회피할 수 있고, 따라서, 보편적, 기성품의 치료 요법의 공급원을 제공한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CAR, TCR, CD137 또는 CD80 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 세포는 개선된 효과기 능력을 가진다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 항원 특이적이다.
다양한 질환은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 본 발명의 면역 세포를 도입함으로써 개선될 수 있다. 질환의 예는 원형 탈모증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근육염, 당뇨병(1형), 일부 형태의 소아 특발성 관절염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 일부 형태의 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근육염, 원발성 담즙성 간병변, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 낭창, 일부 형태의 갑상선염, 일부 형태의 포도막염, 백반증, 다발혈관염 육아종증(베게너 육아종증)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 자가면역 장애; 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 및 골수 이형성 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액학적 악성 종양; 뇌, 전립선, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 머리, 목, 위, 자궁경부, 직장, 후두 또는 식도의 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 고형 종양; 및 HIV-(인간 면역결핍 바이러스), RSV-(호흡기 세포융합 바이러스), EBV-(엡스타인-바르 바이러스), CMV-(거대세포바이러스), 아데노바이러스- 및 BK 폴리오마 바이러스-관련 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 감염을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 대상체에게 본 명세서에 기재된 임의의 세포를 포함하는 조성물을 투여함으로써 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 목적으로 하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기여하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료"는 포유류에서 질환의 임의의 치료를 아우르며, 질환의 성향이 있을 수 있지만, 아직 그것이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 방지하는 것; 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 또는 질환을 없애는 것, 즉, 질환의 질환의 퇴보를 야기하는 것을 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 개시 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시키는 경우 진행 중인 질환의 치료는 특정 관심 대상을 가진다.
특정 실시형태에서, 대상체는 세포 요법에 의해 치료되고/되거나, 개선되고/되거나 좋아질 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 가진다. 일부 실시형태는 세포 요법이 필요하며, 이에 의해 세포 요법, 예를 들어, 세포 물질이 대상체에 투여되는 요법은 손상, 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상의 중증도를 치료하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 좋아지게 하고/하거나 감소시킬 수 있는, 대상체가 손상, 질환 또는 병태를 갖는 대상체이다. 특정 실시형태는 세포 요법이 필요한 대상체가 골수 또는 줄기세포 이식을 위한 후보, 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받은 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어, 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양이 있거나 또는 발생할 위험에 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 상정한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 조혈 계통 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공하되, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 배지를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 CD34 HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 생성된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도를 제공하되, 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 가진다.
단리된 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는 약제학적 조성물, 예컨대 세포 요법이 필요한 대상체를 치료하기 위해 약 95% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 만능 줄기세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 포함하되, 집단은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 미만의 iPSC 유래 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가진다. 일부 실시형태에서 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 초과의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 60% 내지 70%, 약 70% 내지 80%, 약 80% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 또는 약 95% 내지 약 100%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 약 0.1%, 약 1%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
당업자는 자가와 동종이계 면역 세포가 둘 다 세포 요법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 자가 세포 요법은 감소된 감염, GvHD에 대한 낮은 확률 및 빠른 면역 재구성을 가질 수 있다. 동종이계 세포 요법은 면역 매개 이식편대 숙주반응(GVM) 효과 및 낮은 재발률을 가질 수 있다. 세포 요법이 필요한 환자 또는 대상체의 특정 병태에 기반하여, 당업자는 투여할 특정 유형의 요법을 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 자가이다. 자가 이식에 대해, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 완전하게 또는 부분적으로 HLA-매칭된다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 HLA-매칭되지 않는다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 0.5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 10 x 105개의 세포, 적어도 0.5 x 106개의 세포, 적어도 0.75 x 106개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 1.25 x 106개의 세포, 적어도 1.5 x 106개의 세포, 적어도 1.75 x 106개의 세포, 적어도 2 x 106개의 세포, 적어도 2.5 x 106개의 세포, 적어도 3 x 106개의 세포, 적어도 4 x 106개의 세포, 적어도 5 x 106개의 세포, 적어도 10 x 106개의 세포, 적어도 15 x 106개의 세포, 적어도 20 x 106개의 세포, 적어도 25 x 106개의 세포 또는 적어도 30 x 106개의 세포이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 0.1 x 105개의 세포 내지 약 10 x 105개의 세포; 약 0.5 x 106개의 세포 내지 약 5 x 106개의 세포; 약 1 x 106개의 세포 내지 약 3 x 106개의 세포; 약 1.5 x 106개의 세포 내지 약 2.5 x 106개의 세포; 또는 약 2 x 106개의 세포 내지 약 2.5 x 106개의 세포이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포 내지 약 3 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 5 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포 또는 약 20 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포이다.
일부 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포; 약 1.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포, 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 30 x 106개의 세포, 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 20 x 106개의 세포 또는 약 2.0 x 106개의 세포 내지 약 10 x 106개의 세포이다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 약 1 x 106개의 세포, 약 2 x 106개의 세포, 약 5 x 106개의 세포, 약 7 x 106개의 세포, 약 10 x 106개의 세포, 약 15 x 106개의 세포, 약 17 x 106개의 세포, 약 20 x 106개의 세포, 약 25 x 106개의 세포 또는 약 30 x 106개의 세포이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분적 또는 단일 제대혈 중의 면역 세포의 수이거나, 또는 적어도 0.1 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.5 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 1 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 5 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 10 x 105개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 0.75 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.25 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 1.75 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 2 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 2.5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 3 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 4 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 5 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 10 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 15 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 20 x 106개의 세포/체중(㎏), 적어도 25 x 106개의 세포/체중(㎏), 또는 적어도 30 x 106개의 세포/체중(㎏)이다.
본 발명에 의해 제공된 유래된 조혈 계통 세포는 투여 전에 생체밖 또는 시험관내에서 확장되는 일 없이 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 개선된 치료적 퍼텐셜을 갖는 면역 세포를 얻기 위해, 1종 이상의 제제를 이용하여 생체밖에서 조정되고, 처리된다. 유래된 조혈 계통 세포의 조정된 집단은 치료제(들)를 제거하기 위해 세척될 수 있고, 개선된 집단은 시험관내 집단의 추가적인 확장 없이 환자에게 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 1종 이상의 제제를 이용하여 T 림프구의 단리된 집단 또는 하위집단을 조정하기 전에 확장된 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 TCR, CAR 또는 다른 단백질을 발현시키기 위해 재조합적으로 생성될 수 있다.
재조합 TCR 또는 CAR을 발현시키는 유전자 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대해, 세포의 유전자 변형 전이든 또는 후이든, 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 6,534,055호; 6,905,680호; 6,692,964호; 5,858,358호; 6,887,466호; 6,905,681호; 7,144,575호; 7,067,318호; 7,172,869호; 7,232,566호; 7,175,843호; 5,883,223호; 6,905,874호; 6,797,514호; 6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 방법을 이용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있을 수 있거나 또는 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형성)에 또는 별개의 표면(즉, "트랜스" 형성)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합될 수 있고, 다른 제제는 용액 중에 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 신호는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 제제는 둘 다 용액 중에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 세포 발현 Fc 수용체 또는 본 발명에서 T 림프구를 활성화 및 확장시킴에 있어서 사용하기 위해 상정되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 간행물 제20040101519호 및 제20060034810호에 개시된 것과 같은 제제에 결합하는 다른 결합제와 같이 표면에 가교된다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균일 수 있고, 인간 환자에 대한 투여에 적합하거나 바로 투여될 수 있다(즉, 임의의 추가적인 가공 없이 투여될 수 있다). 일부 실시형태에서, 치료 조성물은 환자에게 바로 주입된다. 바로 투여할 수 있는 세포 기반 조성물은 조성물이 대상체에 대한 이식 또는 투여 전에 임의의 추가적인 치료 또는 조작을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다.
환자에 대한 투여에 적합한 멸균의, 치료적으로 허용 가능한 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 배지, 예를 들어, 세포 배양 배지), 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 투여 중인 특정 조성물에 의해서 뿐만 아니라 치료 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 투여된다. 따라서, 본 발명의 치료 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985]을 참조하며, 이의 개시내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨).
특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 갖는 치료적 세포 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지를 가진다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료 조성물은 장용 또는 비경구 투여 방법에 의해 별개로 또는 목적으로 하는 치료 목적을 달성하기 위해 다른 적합한 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 이를 치료 중인 인간 대상체에 대한 투여에 적합하게 제공하기 위해 충분히 고순도를 가지고, 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 추가로 치료 조성물의 안정성을 유지하거나 또는 증가시켜야 한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 본 발명의 치료 조성물의 다른 성분과 조합될 때, 목적으로 하는 규모, 점조도 등을 제공하기 위해 생각해 둔 계획된 투여 방식에 따라 선택된다. 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 결합제(예를 들어, 전호화 메이즈 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등), 충전제(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 인산수소칼슘 등), 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탈크, 실리카, 콜로이드 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아르산염, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 등), 붕해제(예를 들어, 전분, 글리콜산나트륨 전분 등), 또는 습윤제(예를 들어, 라우릴 황산나트륨 등)일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물에 대한 다른 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이러한 담체 용액은 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 완충제는 화학물질 구성이 PH의 상당한 변화 없이 산 또는 염기를 중화시키는 용액 또는 액체를 지칭한다. 본 발명에 의해 생각되는 완충제의 예는 둘베코 인산염 완충 식염수(PBS), 링거 용액, 수 중 5% 덱스트로스(D5W), 정상/생리 식염수(0.9% NaCl)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이들 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 치료 조성물의 PH를 약 3 내지 약 10으로 유지하는 데 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이렇게 해서, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량에 따라 약 5%만큼일 수 있다. 전해질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 염화나트륨 및 염화칼륨은 또한 치료 조성물 중에 포함될 수 있다. 일 양상에서, 치료 조성물의 PH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료 조성물의 PH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 상기 PH 범위 중 하나의 PH를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 PH가 약 7이다. 대안적으로, 치료 조성물은 PH 범위가 약 6.8 내지 약 7.4이다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 PH가 약 7.4이다.
본 발명의 멸균 조성물은 비독성 약제학적으로 허용 가능한 배지 중의 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 현탁액은 세포가 고체 지지체에 부착되지 않는 비부착 조건을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에 유지된 세포는 교반될 수 있고, 지지체, 예컨대 배양 접시에 부착되지 않는다.
현탁액은 미세하게 나누어진 종이 다른 종과 조합되는 분산물(혼합물)이며, 전자는 매우 미세하게 나누어지고, 혼합되어서, 그것은 빠르게 침강하지 않는다. 현탁액은 용액을 포함하는 액체 배지와 같은 비히클을 이용하여 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 치료 조성물은 줄기 및/또는 전구 세포가 허용 가능한 액체 배지 또는 용액, 예를 들어, 식염수 또는 무 혈청 배지 내에서 분산되며, 고체 지지체에 부착되지 않는 현탁액이다. 매일의 생활에서, 가장 통상적인 현탁액은 액체 물 중의 고체 현탁액이다. 허용 가능한 희석제 중에서, 예를 들어, 사용될 수 있는 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, 등장성 염화나트륨(식염수) 용액 및 무혈청 세포 배양 배지이다. 일부 실시형태에서, 고장성 용액은 현탁액을 제조하는 데 사용된다. 추가로, 멸균의 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 비경구 적용을 위해, 특히 적합한 비히클은 용액, 바람직하게는 유성 또는 수성 용액뿐만 아니라 현탁액, 에멀전 또는 이식물로 이루어진다. 수성 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시형태에서, 주입 용액은 대상체 조직에 대해 등장성이다. 일부 실시형태에서, 주입 용액은 대상체 조직에 대해 고장성이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및 본 발명의 바로 투여할 수 있는 약제학적 조성물을 포함하는 다른 성분은 치료 조성물이 임상 요법에서 사용되도록 허용할 미국 약제 등급 시약으로부터 유래된다. 전형적으로, 임의의 배지, 용액 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 이들 마무리 시약은 당업계의 통상적인 방식, 예컨대 멸균 필터에서 멸균되고, 사용 전에 다양한 목적으로 하지 않는 오염물질, 예컨대 마이코플라스마, 내독소, 또는 바이러스 오염물질에 대해 시험된다. 일 실시형태에서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 인간 또는 동물 유래의 천연 단백질이 실질적으로 없고, 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 세포 집단을 저장하는 데 적합하다. 약제학적 조성물은 인간 환자에게 투여되도록 의도되고, 따라서, 세포 배양물 성분, 예컨대 소 혈청 알부민, 말 혈청, 및 소태아 혈청이 실질적으로 없다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지, 특히 본 발명의 조성물 및/또는 배양물의 용도를 부분적으로 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 유지, 성장 및/또는 건강상태를 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무 혈청 및/또는 무 피더 배지이다.
약제학적 조성물은 유래된 조혈 계통 세포의 조정된 단리 집단을 저장하는 데 적합한 무 혈청 배지를 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 무 혈청 배지는 무 동물이고, 선택적으로 무 단백질일 수 있다. 선택적으로 배지는 생약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 무 동물 배지는 성분이 비동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무 동물 배지 중의 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻어진다. 대조적으로 무 단백질 배지는 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다.
당업자는 배지의 상기 예가 예시적이며 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지 제형을 어떤 방법으로 제한하지 않는다는 것과 당업계에 공지되어 있고 입수 가능한 다수의 적합한 배지가 있다는 것을 인식할 것이다.
약제학적 조성물은 마이코플라즘, 내독소, 및 미생물 오염물질이 실질적으로 없다. 특정 실시형태에서, 치료 조성물은 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.1 또는 0.05㎍/㎖ 미만의 소 혈청 알부민을 함유한다.
마이코플라스마 및 미생물 오여물질에 대해, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 없는"은 당업자에게 공지된 일반적으로 허용되는 시험에 대한 부정적 판독을 의미한다. 예를 들어, 마이코플라스마 오염물질은 브로스 배지에서 치료 조성물의 샘플을 다시 배양시킴으로써 결정되고, 적절한 양성 및 음성 대조군에 의해 37℃에서 제1일, 제3일, 제7일 및 제14일에 한천 플레이트를 거쳐서 분산된다. 샘플 외관은 양성 및 음성 대조군에 대해 현미경에 의해 100x로 비교된다. 추가적으로, 지표 세포 배양물의 접종은 3 및 5일 동안 인큐베이션되고, DNA-결합 형광 색소를 이용하여 형광현미경에 의해 마이코플라스마의 존재에 대해 600 x에서 시험된다. 한천 및/또는 브로스 배지 절차 및 지표 세포 배양 절차가 마이코플라스마 오염의 증거를 나타내지 않는다면 샘플은 충분한 것으로 고려된다.
유기 용매 또는 적합한 유기 용매는 일반적으로 용액을 생성하는, 고체, 액체 또는 기체 용질을 용해시키는 탄소 함유 액체 또는 기체에 관한 것이다. 적합한 유기 용매는 포유류 세포에 대한 생체밖 투여 또는 포유류 세포와 함께 인큐베이션하는 데 적절한 것이고, 또한 예컨대 인큐베이션 또는 투여 시간 동안 선택된 농도에서 생체밖 조건(예를 들어, 세포 배양물) 하에서 또는 생체내에서 최소 독성 또는 다른 저해 효과를 가짐으로써 대상체에 대한 생체에 투여에 적절하게 될 수 있다. 적합한 유기 용매는 또한 본 명세서에 기재된 제제의 저장 안정성 및 조작에 적절하여야 한다.
적합한 유기 용매의 예는 다이메틸 설폭사이드(DMSO), N,N-다이메틸폼아마이드(DMF), 다이메톡시에탄(DME) 및 다이메틸아세트아마이드(이들의 혼합물 또는 조합물을 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물 또는 유기 용매는 메틸 아세테이트가 실질적으로 없는데, 이는 조성물 또는 용매 중에 미량, 바람직하게는 검출 불가능한 양(예를 들어, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC) 등으로 측정) 메틸 아세테이트만이 있어야 한다는 것을 의미한다.
내독소가 없는 용기 또는 조성물은 용기 또는 조성물이 기껏해야 미량의(즉, 대상체에 대해 유해한 생리적 효과를 갖지 않는 양) 내독소, 또는 검출 불가능한 양의 내독소를 함유한다는 것을 의미한다. "내독소가 실질적으로 없는" 세포는 세포의 용량 당 내독소가 FDA에 의해 생물학에 대해 허용되는 것(1일당 5 EU/㎏ 체중의 총 내독소이며, 평균 70㎏인 사람에 대해 세포의 총 용량 당 350 EU임)보다 더 적다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 무 내독소 용기 및/또는 조성물은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 무 내독소이다. 내독소는 그램 양성 박테리아, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에서 발견될 수 있지만, 내독소는 특정 박테리아, 전형적으로 그램 음성 박테리아와 관련된 독소이다. 대부분의 우세한 내독소는 다양한 그램 음성 박테리아의 외막에서 발견되는 지질다당류(LPS) 또는 지질올리고당(LOS)인데, 이는 이들 박테리아가 질환을 야기하는 능력에서 중심 병원성 특징을 나타낸다. 인간에서 소량의 내독소는 다른 유해한 생리적 효과 중에서도 발열, 혈압 저하, 및 염증 및 응고의 활성화를 생성할 수 있다. 따라서, 종종 약물 제품 용기로부터 대부분의 또는 모든 미량의 내독소를 제거하는 것이 바람직할 수 있는데, 소량조차도 인간에서 유해한 효과를 야기할 수 있기 때문이다. 내독소는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 용기로부터 제거될 수 있으며, 예를 들어, 용기는 무 내독소 물을 이용하여 HEPA 여과된 세척 장비에서 세정될 수 있고, 250℃에서 발열원이 제거되며, 그리고 클래스 100/10 클린룸 내에 위치된 HEPA 여과 워크스테이션에서 깨끗하게 포장된다(예를 들어, 클래스 100 클린룸은 1입방피트의 공기 중에서 1/2 마이크론보다 더 큰 100개 이하의 입자를 함유한다).
실시예
다음의 실시예는 예시의 방법에 의해, 그리고 제한의 방법에 의하지 않고 제공한다.
실시예 1- hiPSC 생성 및 유지
ROCK, MEK, GSK3 경로 및 TGFβ 수용체 저해제를 함유하는 재프로그래밍 배지의 존재 하에 OCT4/SOX2/LargeT, OCT4/SOX2 또는 OCT4/SOX2/NANOG/LargeT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다양한 인자 조합물을 이용하여 섬유아세포 및 혈액 세포를 포함하는 체세포를 만능성 상태로 재프로그래밍되도록 유도하였다(Valamehr et al. Sci Rep. 2012; 2: 213). 유도 14일 후에, 재프로그래밍 집단은 ROCK, GSK3 및 MEK 경로 저해제, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 백혈병 저해 인자(LIF)를 함유하는 유지 배지로 전환시켰다(Valamehr et al. Stem Cell Reports 2014, 2(3): 366-381). 유지 배지에서 세포를 무한적으로 유지시켰다.
유도 대략 3주 후에, 재프로그래밍 집단을 96-웰 플레이트의 개개 웰로 분류하였다. 선택한 클론을 특성규명하고, 분화 연구를 위해 미경험 hiPSC를 나타내는 완전히 재프로그래밍된 클론을 선택하였다(Valamehr et al. Stem Cell Reports 2014, 2(3): 366-381). 분화의 유지 동안 그리고 분화 후 분화되지 않은 세포의 백분율을 결정하기 위해, SSEA4, TRA181 및 CD30의 공동 표면 발현에 대해 유세포 분석을 수행하였다.
체세포의 재프로그래밍 동안 또는 재프로그래밍 후에, 예를 들어 전문이 참고로 포함된 미국 특허 출원 제62/251,032호 및 제62/337,258호에 개시된 방법을 이용하여 게놈 조작된 iPSC를 또한 생성할 수 있다.
추가로, 암을 포함하는 다양한 질환을 치료하는 데 기여하는 독특한 속성을 갖도록 그리고/또는 동일한 독특한 속성을 갖는 림프구 효과기 세포로 분화할 수 있도록, 우선적 공여자 또는 환자의 면역계 세포, 예컨대 T 세포를 포함하는 선택된 체세포로부터 재프로그래밍된 hiPSC를 얻었다.
실시예 2 - iCD34 배양 플랫폼을 이용하는 조혈 분화 및 생착 퍼텐셜을 갖는 HE 집단의 동정
iCD34 플랫폼은 조혈 계통 세포분화에 대해 최적화된 시스템이다. 조혈 계통으로 분화를 계시하기 위해, hiPSC를 유지 배지에서 제0일에 단일층으로서 파종하고, 약 24시간 동안 부착 및 확장되도록 허용하였다. 이 시점에, 유지 배지를 제거하고, 제1일에 유지 인자 없이 기본 배지로 대체하였다. 배양 배지를 iCD34-A 로 전환함으로써 대략 제2일에 조혈 분화를 개시하였다(도 1 참조). 도 1에 도시한 바와 같이, 배양 배지를 제3일에 성장 인자 bFGF로 보충하고, 후속적으로 분화 동안 iCD34-B 배지로 전환하였다. 단일층이 단일 세포로 해리되는 시점인 대략 제5일 내지 제6일까지 단일층을 유지시키고, 대략 제10일에 분화까지 iCD34-C 배지에서 저밀도 단일층으로서 파종하였다. 대략 제2일의 조혈 분화의 개시로부터 대략 제10일의 분화까지 낮은 산소 분압(2 내지 10% O2)을 유지하였다.
배양 과정 동안, 조혈 계통으로의 지시된 분화를 단일층의 단일 세포로의 해리 및 CD34, 및 선택적으로, CD43, CD45, CXCR4, CD73 및/또는 CD93의 표면 마커 발현에 대한 분석에 의해 모니터링하였다(도 4a). 대략 제8일의 분화에서, HE를 나타내는 세포 집단의 외관을 세포 표면 발현 서명 CD34+에 의해 관찰하였다. CD43-CXCR4-CD73-을 또한 CD34+ 세포에서 관찰하였다. 대략 제10일까지 CD34+ 집단을 유지하였다(도 4a). 제10일에(이는 대략 제9일까지 단축되거나 또는 대략 제12일까지 연장될 수 있음), 세포는 단일 세포로 해리되었고, 추가 분석 및 기능성 평가를 위해 BD FACS Aria를 이용하여 FACS에 의해 CD34+ HE 집단을 분류하였다. 도 4a는 예시적인 조혈 산출 능력을 나타낸다: 단일 iPSC의 모든 입력에 대해, 463개의 총 CD34+ 세포 및 41개의 CD34+CD43-CXCR4-CD73- 세포가 생성되었는데, 이는 적어도 2.5%의 확정적 HE 세포의 전환율을 보여준다(도 4a).
hiPSC-유래 iHE의 생착 퍼텐셜을 입증하기 위해, 제10일 CD34+ 세포를 분류하였고, 상기 기재한 바와 같이 7일 동안 iMPP 분석에서 배양시켰다. 배양물에서 총 17일 후에(10일의 iCD34 + 7일의 iMPP), 안구뒤 주사를 통해 대략 400,000개의 세포를 NSG 내로 주사하였다. 대조군으로서 별개의 마우스 내로 200,000개의 제대혈 CD34+ 세포를 주사하였다. 도 22는 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD45 마커를 발현시키는 세포의 존재에 의해 알 수 있는 바와 같이 생착된 CD34 양성 세포의 5주 재구성을 보여준다.
실시예 3 - 소분자, 사이토카인 및 플레이팅 밀도 조성에 의한 HE 생성의 최적화
분화의 대략 10일 후에 hiPSC로부터 HE의 효율적인 생성을 최적화하기 위해, 몇몇 매개변수를 시험하였다. 매트리겔(상표명)-코팅된 6개의 웰 배양물 접시 상에서 hiPSC의 수를 7.5x104개/웰로부터 1.5x105개/웰로 증가시키는 플레이팅에 의해 그리고 이어서, 대략 제10일에 CD34+ HE 집단의 생성을 분석함으로써, 제0일에 분화의 단일층의 최적 플레이팅 밀도를 평가하였다. 도 5a는 세포 플레이팅 밀도를 증가시키는 것이 CD34+ 세포의 총 백분율을 증가시키지만, CXCR4-CD73- HE 하위집단을 감소시킨다는 것을 보여준다. 이런 감소에도 불구하고, 단일층 분화의 10일 후에 hiPSC의 HE로의 가장 높은 전환율은 1.5x105개/웰에서 시험한 가장 높은 플레이팅 밀도에서 였다(도 4c).
HE의 생성에 대한 조혈 분화의 초기 단계 동안 BMP4 조정의 농도의 효과를 분화의 대략 제2일 내지 대략 제6일에 0ng/㎖ 내지 30ng/㎖ 범위의 BMP4 농도를 증가시키면서 배양물을 처리하는 것에 의해 평가하였다. 제10일에 HE의 생성을 CD34+ HE 집단의 검출에 의해 평가하였다. 도 5b는 제2일 내지 제6일에 BMP4 농도를 증가시키는 것이 약 3 ng/㎖의 최적의 농도를 나타내는 역치 BMP4 농도 미만의 제10일에 HE 집단을 증가시켰다는 것을 보여준다.
Wnt 경로 활성자 CHIR99021은 hiPSC로부터의 확정적 조혈 프로그램의 유도를 초래한다. 대략 제3.75일 내지 대략 제6일에 CHIR 농도를 증가시키면서 배양물을 처리함으로써 조혈 분화 프로토콜의 유도기 동안 CHIR의 조정 효과를 평가하였다. 도 5c는 CHIR99021의 농도 증가가 CD34+ 세포의 총 백분율을 증가시키지만, CHIR99021의 최적 농도가 대략 1uM인 HE 하위집단의 백분율을 감소시킨다는 것을 보여준다.
지시된 분화 프로토콜의 제6일에, 단일층 배양물은 단일 세포로 해리되고, HE로의 추가 분화를 위해 단일층으로서 재플레이팅하였다. 제6일에 플레이팅 밀도는 1.5x105 내지 7.4x104개의 감소되는 세포 농도가 HE 집단의 백분율을 증가시키는 것으로 도 5d에서 보여주는 바와 같이 HE의 생성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
실시예 4 - Notch-의존적 조혈작용 및 MPP 분화에 의한 HE의 조혈 퍼텐셜의 결정
hiPSC-유래 확정적 집단 HE의 조혈 퍼텐셜을 입증하기 위해, FACS를 이용하여 세포를 분류하고, 도 1의 다능성 전구체 분석(iMPP)에서 기재한 바와 같이 CD45+ 조혈 전구체를 생성하기 위해 내피세포가 조혈 이행을 겪는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 대략 30,000개의 CD34+ HE 세포를 iMPP-A 배지에서 단일층으로서 플레이팅하였고, 6 내지 8일 동안 추가로 배양시켰다. 도 6a는 둥근 조혈 세포의 출현에 의한 단일층 배양물의 표현형 변경을 도시하며, 유세포분석 염색은 6 내지 8일 배양 기간에 걸쳐 CD45+의 존재를 동정한다.
지시된 분화 프로토콜의 제10일에 생성된 HE 집단이 확정적 HE를 나타내는지의 여부를 평가하기 위해, CD34+ HE 분류 세포는 7 내지 9일 iMPP 분석의 지속기간 동안 Notch 경로 저해제 감마 세크레타제 저해제(SI)로 처리하였다. 새로운 SI를 2일마다 iMPP-A 배양 배지에 첨가하였다. 약 8일 후에, 단일층 배양물을 CD45+ 조혈 세포의 출현에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. 비히클 대조군에 비해, SI-처리 배양물에서 상당히 더 적은 CD45+ 세포가 보였는데, 이는 Notch 신호전달 경로에 대한 의존도 및 그에 따른 확정적 HE의 존재를 입증한다(도 6b).
실시예 5 - 산소 조건의 조작을 통한 HE 및 iMPP 생성의 최적화
산소 환경이 확정적 HE 및 iMPP 조혈 전구의 생성에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해, 놀목식(normoxic)(21% O2) 또는 저산소성(5% O2) 조건 하에서 도 1에 기재한 바와 같이 hiPSC를 분화시켰다. 분화의 대략 제10일에, 단일층을 계수화하고, CD34+ HE 집단의 존재에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, 저산소 조건 하의 분화는 생성된 CD34+ HE 양의 증가를 초래하였다. 저산소 조건 하에 생성된 HE가 CD45+ 조혈 전구체를 생성하는 tHE 퍼텐셜을 보유한다는 것을 확인하기 위해, CD34+ 세포를 놀목식 및 혈정 산소 감소 분화 조건으로부터 FACS에 의해 단리시켰고, iMPP 분석에 의해 평가하였다. 조건 둘 다 하에서 생성된 HE는 동등한 iMPP 퍼텐셜을 갖는데, 이는 저산소 조건 하에서 조혈 분화가 확정적 HE의 산출을 증가시킨다는 것을 나타낸다(도 7b)
실시예 6 - 제8일 분화 배양물 및 HE의 냉동보존
직접적 분화 프로토콜의 대략 제10일에, 전체 배양물을 해리시켜 10% DMSO를 보충한 제8일 배지에서 냉동보존 후 조혈 퍼텐셜을 유지하는 그들의 능력을 평가하였다. 해동시킨 세포를 재현탁시키고, 후속적으로 유동 분석 전에 7일 동안 도 1에 기재한 바와 같이 iMPP-A 배지에서 배양시켰다. 도 8A에서 알 수 있는 바와 같이, 냉동 보존된 제10일 세포는 냉동/해동 과정에 생존하였고, CD45+ 세포의 존재에 의해 알 수 있는 바와 같이 비냉동 대조군과 비슷한 조혈 퍼텐셜을 가졌다.
분류된 CD34+ 세포를 냉동 보존 후 조혈 퍼텐셜을 유지하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 저산소 조건 하에서 생성된 제10일의 iCD34를 단리시키고, 도 1에 기재한 바와 같은 iMPP 분석에 직접 플레이팅하거나 7일 동안 iMPP-A 배지에서 냉동 보존시키고, 이어서, 해동시키고, iMPP 분석에서 플레이팅하였다. 도 8에 나타내는 바와 같이, 냉동 보존된 제10일 iCD34 세포는 생존할 수 있고, 해동시켰을 때 새로운 iCD34+ 세포와 유사한 표현형을 나타낸다(도 8A). 해동 직후 냉동 보존된 제10일의 분류된 CD34+ 세포의 생존도는 70%이다(도 8B). 또한 냉동보존된 제10일의 분류된 iCD34+ 세포는 생존할 수 있고, iMPP 분석 동안 CD45+ 조혈 세포를 생성하며(도 8C), iT 및 iNK 림프구 전구체를 생성할 수 있다는 것을 나타낸다(도 8D). 이 냉동보존 과정을 제6일 내지 제12일의 중간체 세포에 또는 가이딩된 분화 동안 다른 하류의 세포에 적용 가능한데, 이 세포는 iHSC, iMPP, 프레-iproT, 프레-iproNK, ipro-T, ipro-NK, T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 B 세포를 포함한다.
실시예 7 - 밤새 수송 후에 제8일 분화 배양물의 회수
6개의 웰 플레이트로부터의 제6일 분화 배양물을 200,000개 세포/플라스크의 파종 밀도로 25개 배양물 플라스크에 계대시켰고, 이어서, 제8일에 배지를 완전히 충전시키고, 밤새 스티로폼 박스에서 유지하여 냉동보존에 대한 필요 없이 새로운 세포를 직접적으로 수송하는 것의 실현 가능성을 평가하였다. 처음에 37℃ 수욕에서 유지시킨 차가운 팩을 또한 스티로폼 박스에 첨가하여 가능한 오래 37℃ 온도에서 보존하였다. 2개의 배지 조성물을 37℃ 인큐베이터에서 유지한 대조군 플라스크와 함께 시험하였다: 제8일에 이용한 30% 농도의 사이토카인 및 몰포겐이 있는 플라스크 및 100% 농도의 플라스크. 제9일에, 박스로부터 플라스크를 제거하였고, 배지를 10㎖의 8일 배지로 대체하면서, 새로운 뚜껑을 플라스크 상에 두고, CD34+ HE 집단의 존재에 대해 제10일에 유세포 분석 동안 처리하기 전에 회수하도록 허용하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, HE의 전체적인 산출물은 모든 조건 간에 비슷하였는데, 이는 HE 세포를 전달하기 위한 유효한 수단으로서 제8일의 새로운 밤샘 수송의 실현 가능성을 입증한다. 이 새로운 수송 및 조작 과정은 가이딩된 분화 동안 얻어진 다른 중간체 세포의 분화 능력에 영향을 미치지 않으며, 이 세포는 iHSC, iMPP, 프레-iproT, 프레-iproNK, ipro-T, 및 ipro-NK를 포함한다. 새로운 수송은 또한 iPSC 유래 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포에 적용 가능하다.
실시예 8 - DLL4-발현 기질 세포를 이용하는 HE의 성숙 T 및 NK 림프구 계통으로의 분화의 지속
분류된 CD34+ HE 세포를 T 및 NK 림프구 계통으로 추가로 분화시켰다. 분류 시 T 세포에 특이적인, ROCK 저해제, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7을 포함하는 iTC-A2 무 혈청 분화 배지 내 낮은 부착 조직 배양물에 HE 세포를 옮겼다(도 2). 5일 후에, SCF, Flt3L 및 IL7을 함유하는 iTC-B2 분화 배지 내 DLL4-발현 기질 세포를 함유하는 부착 배양물에 세포를 옮겨서 T 세포 분화를 완료하였다. 대략 10일의 배양 후에(HE 단리 후), 세포 표면 마커 CD34 및 CD7의 공동발현에 의한 T 세포 전구체의 생성에 대해 세포 배양물을 평가하였다. 대략 15 내지 20일 동안 추가 분화 후에, 이들 CD34+CD7+ T 세포 전구체는 CD4 및 CD8의 발현에 의해 알 수 있는 바와 같이 성숙 T 세포와 별개의 집단이 생기게 하였다. 도 10은 공동 배양물에서 생긴 CD45+CD56- 집단의 분석에 의해 초기 T 세포 전구체(도 10A) 및 성숙 T 세포(도 10B) 서브세트가 생기게 하는 제10일 HE 집단의 시험관내 분화 능력을 도시한다. 도 15는 배양의 대략 30일 후에(HE 단리 후) 공동 배양물에서 생긴 CD45+CD56- 집단의 분석에 의해 성숙 T 세포 서브세트를 생기게 하는 제10일 HE 집단의 시험관내 분화 능력을 도시한다.
분류 시 NK 세포에 특이적인, SCF, TPO, Flt3L, IL3, IL15 및 IL7을 함유하는 iNK-A2 무 혈청 분화 배지 내 낮은 부착 조직 배양물 상에서 HE 세포를 배양시켰다(도 3). 5일 후에, 세포를 SCF, IL3, IL15, Flt3L 및 IL7을 함유하는 iNK-B2 분화 배지 내 DLL4-발현 기질 세포를 함유하는 부착 배양물에 옮겨서 NK 세포 분화를 완료하였다. 배양의 대략 10 내지 15일 후에(HE 단리 후), 세포 배양물을 배양의 추가적인 10 내지 15일 후에 NK 세포 전구체 다음에 성숙 NK 서브세트의 생성에 대해 평가하였다. CD56 및 CD161(NKR-P1A)은, 초기 NK 세포 발생 다음에 이후의 성숙 NK 세포 서브세트 상에서 CD16, KIR, CD8 및 NKG2D(CD314)의 발현 동안 발현될 제1 세포 표면 마커이다. 도 11은 공동 배양물에서 생성되는 CD45+ 집단의 분석에 의해 초기 NK 세포 전구체 및 성숙 NK 세포 서브세트가 생기게 하는 제10일 HE 집단의 시험관내 분화 능력을 도시한다.
NK 세포 전구체의 성숙을 향상시키기 위한 대안의 방법은 현탁액 배양물 중에서 피더 세포와의 공동 배양이다. 제20일 iNK 세포를 배양물 중에서 추가 12일 동안 SCF, IL15, Flt3L 및 IL7을 함유하는 iNK-B2 배지에서 DLL4-기질 세포 배양물로부터 피더-기반 현탁액 배양물로부터 전달하였다. 도 16은 말초 혈액-유래 NK 세포에 비해 기질 및 피더-기반 공동 배양물에서 생성된 CD45+ 집단의 분석에 의해 피더 현탁액 배양물을 이용하는 성숙 NK 세포 서브세트가 생기게 하는 제10일 HE 집단의 시험관내 분화 능력을 도시한다. hiPSC-유래 CD34+ 세포는 20일 동안 NK 세포 계통으로 분화되었고, 이어서, 추가 성숙을 위해 현탁액 배양물에 두었다. 성숙 NK 계통 마커는 CD56, CD122, NKp30, CD94, CD16, NKG2D 및 KIR로 나타내는 성숙 NK 세포의 존재를 동정한다.
실시예 9 - 단일층 hiPSC 조혈 분화 플랫폼은 고도로 확장성 있는 확장 전략을 허용한다
도 1 내지 도 3에 기재한 바와 같은 한정된 무 혈청 및 무 피더 배양물에서 단일층으로서 파종되고, 조혈 세포로 분화되는 hiPSC를 조혈 분화를 개시하기 위한 배상체를 형성하는 응집물 중의 hiPSC 설정과 비교하였다(Kennedy et al., Cell Reports 2012:1722-1735). 배양물 설 정 둘 다 초기 시작 번호로서 100,000개의 hiPSC를 사용하였다. 조혈 분화 과정 동안, 각각의 시스템의 확장 퍼텐셜을 입증하기 위해 세포수 및 표현형 평가를 일상적으로 수행하였다. 도 12로 나타내는 바와 같이, 분화의 제6일까지, CD34 양성 세포가 검출되지 않은 EB 형식에 비해, 상당한 수의 CD34 양성 세포가 단일층 배양물에서 검출되었다(2백만개 이상의 CD34+ 세포). 분화의 제8일에, 단일층 형식은 대략 2백 4십만개의 세포를 생성한 반면, 출발 물질로서 거의 동일한 수의 iPSC에도 불구하고, EB 형식에서 대략 100,000개의 CD34 양성 세포만이 검출되었는데, 대략 24배의 차이를 나타낸다. 추가로, 평가 시간으로서, 단일층 형식은 확정적 조혈작용을 제시하는 CD34+CD43- 세포만을 생성하였지만, EB 형식은 원시적 조혈작용을 제시하는 대다수의 CD34+CD43+ 세포를 생성하였다(Kennedy et al., 2012). 도 13은 기성품의 iNK 및 iT 세포의 생성을 위해 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일층 hiPSC 조혈 분화 플랫폼의 확장성 있는 확장을 추가로 도시한다. 본 명세서에 제공된 만능 세포 클론 확장 플랫폼은 기성품의 확장성(예를 들어, 단일 만능 세포 클론으로부터 치료적 용량의 약 1백만개의 바이알까지)을 추가로 보장하는데, 각각은 치료적 기능인 106개 이하의 NK 또는 T 세포를 가진다. 개시된 바와 같은 클론 확장은 추가로 광범위한 균질성을 추가로 제공하며, 따라서 제품 점조도, 품질 관리 및 품질 보증을 보장한다. 일부 실시형태에서, 단일 만능 세포 클론은 목적으로 하는 유전자 각인(들)을 함유하는데, 이는 재프로그래밍 동안에 또는 후에 유전자 조작을 통해 얻어지거나, 또는 만능 세포가 본래 유래된 공여자-특이적 공급원 세포로부터 보유된다.
실시예 10 - 활성화된 T 세포의 확장을 억제함에 있어서 iCD34+ 세포의 면역조절 특성
hiPSC-유래 CD34 양성 세포(iCD34; CD34+CD43-)의 면역-조절 능력을 결정하기 위해, 제10일의 CD34 분류 세포를 1:1 비로 iMPP-A 배지 내 활성화된 말초 혈액-유래 CD3-발현 T 세포와 함께 공동 배양시켰다. 37℃에서 5일 인큐베이션 후에, 공동 배양물을 계수화 비드와 혼합하였고, 각각의 샘플에서 T 세포의 절대 수를 결정하기 위해 유세포 분석을 통해 분석하였다. 도 14는 공동 배양물을 CD3+ T 세포 단독을 함유하는 배양물과 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이 hiPSC-유래 CD34+ 세포의 면역 조절 퍼텐셜을 도시한다. hiPSC-유래 CD34+ 세포와 함께 공동 배양시킨 CD3+T 세포는 세포 생존이 감소된 반면, 배양물 내 CD34+ 세포의 총 수는 영향받지 않았다(도 14).
실시예 11 - 사이토카인 방출 및 탈과림화에 의해 알수 있는 바와 같은 사이토카인-유도 활성화에 의한 iNK 세포 기능의 결정
hiPSC-유래 성숙 iNK 세포의 기능성을 입증하기 위해, 제20일(HE 단리 후에) iNK 세포를 SCF, IL15, IL7 및 Flt3L을 함유하는 iNK-B2 배지에서 추가 10일 동안 피더-기반 현탁액 배양물에 옮겼다. 10일의 추가적인 배양 후에, iNK 세포를 IL12 및 IL18로 자극하여 iNK 세포 활성화를 유도하였다. iCD34-유래 iNK는 사이토카인 자극에 반응하였고, 말초 혈액 NK 세포와 유사한 방식으로 전염증 사이토카인을 분비하였다. 도 17은 동일한 기질 및 피더 현탁액 공동 배양물 및 말초 혈액-유래 NK 세포를 이용하여 생성된 제대혈-유래 NK 세포에 비해, CD107A(탈과립화를 나타내는 세포 표면 마커)의 발현 및 CD45+CD56+ 개폐 전략에 기반한 인터페론 감마에 대한 세포내 염색에 의해 알 수 있는 바와 같이 iNK 세포의 활성화를 도시한다.
실시예 12 - T 및 NK 세포를 생성하기 위한 무 피더 분화 배양물의 확립
무 기질 세포를 포함하는 무 피더 분화 플랫폼을 이용하여 제대혈-유래 및 hiPSC-유래 iT 및 iNK 전구의 생성을 위해 상기 T 및 NK 림프구 분화 플랫폼을 추가로 최적화시켰다.
DLL4 단백질 또는 대조군 단백질을 함유하는 배양 플레이트에서 SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL15 및 IL7을 함유하는 iNK-A2 무 혈청 분화 배지 내에 NK 세포에 특이적인, 풍부화된 제대혈 CD34+ 세포를 플레이팅하였다. 5일 후에, iNK-B2 배지를 유지하여 NK 세포 분화를 완료하였다. 배양의 대략 10 내지 15일 후에, 배양물을 NK 세포 전구체의 생성 및 골수성 세포의 부재에 대해 평가하였다. CD56, CD7 및 CD161은 NK 세포 발생 동안 발현될 제1 세포 표면 마커이다. CD11b 및 CD14는 골수성 세포 서브세트 상에서 발현되는 세포 표면 마커이다. 도 18은 제대혈 CD34+ 세포의 NK 세포로의 무 기질 분화를 도시한다. 플레이트-결합 DLL4는 기질 기반 배양물 및 무 기질 대조군 배양물에 비해 CD56+CD7+CD161+ NK 세포 전구체의 더 빠르고 효율적인 분화를 지지한다는 것과, 제대혈 CD34+ 세포는 CD45+ 개폐 전략을 이용하여 기질 기반 분화 플랫폼과 유사한 방식으로 (표현형에 대해) DLL4-발현 무 기질 분화 플랫폼에서 조기 NK 세포 전구체(프로-NK)가 생기게 하는 시험관내 능력을 가진다는 것을 나타내었다. 초기 NK 계통 마커는 CD56, CD7 및 CD161에 의해 나타낸 ipro-NK 세포의 존재 및 골수성 마커 CD11b 및 CD14의 부재를 동정한다.
무 기질 분화 플랫폼에서 iNK 세포 전구체를 생기게 하는 데 hiPSC-유래 HE 세포의 능력을 입증하기 위해, 제10일 CD34+ iHE 분류 세포를 DLL4 단백질 또는 대조군 단백질을 함유하는 배양물 내 iNK-A2 배지에서 배양시켰다. 이어서, hiPSC-유래 CD34+ 세포를 20일 동안 NK 세포 계통으로 분화시키고, 이어서, 추가 성숙을 위해 현탁액 배양물 중에 두었다. 도 19는 CD45+ 개폐 전략을 이용하여 CD56, CD161 및 CD94의 발현에 의해 알 수 있는 바와 같이 iNK 세포 전구체를 생기게 하는 hiPSC-유래 iHE의 능력을 도시한다. 플레이트 결합된 DLL4는 CD56+CD7+CD161+ NK 세포 전구체의 분화를 지지하였지만, CD11b+ 골수성 세포는 지지하지 않는다. 5일 후, iNK-B2 배지를 유지시켜 NK 세포 분화를 완료하였다. 성숙 NK 세포의 존재를 동정하기 위한 마커는 CD56, CD122, NKp30, CD94, CD16, NKG2D 및 KIR을 포함한다.
T 세포에 특이적인, 제대혈로부터의 풍부화된 CD34+ 세포를 DLL4 단백질 또는 대조군 단백질을 함유하는 배양물 중의 iT-A2 배지에서 플레이팅하였다. 5일 후, T 세포 전구체(proT)의 생성을 위해 iT-B2 배지를 유지시켰다. 배양의 대략 10 내지 15일 후에, 세포 표면 마커 CD34 및 CD7의 공동 발현에 의한 T 세포 전구체의 생성에 대해 배양물을 평가하였다. 도 20은 CD45+ 개폐 전략을 이용하는 DLL4-발현 무 기질 분화 플랫폼에서 T 세포 전구체를 생기게 하는 CD34+ 제대혈 세포의 능력을 도시한다. 제대혈 CD34 양성 세포로부터 유래된 proT 세포의 무 기질 분화 플랫폼은 CD45+ CD56-개폐 전략을 이용하는 기질 기반 분화 플랫폼보다 더 빠른 것으로 나타났다. 초기 T 계통 마커는 CD34, CD5 및 CD7에 의해 나타내는 바와 같이 proT 세포의 존재를 동정한다.
무 기질 플랫폼에서 iT 세포를 생기게 하는 hiPSC-유래 HE 세포의 능력을 입증하기 위해, 제10일 CD34+ iHE 분류 세포를 DLL4 단백질 또는 대조군 단백질을 함유하는 배양물 중의 iT-A2 배지에서 배양시켰다. 도 21은 CD45 및 CD7의 발현에 의해 알 수 있는 바와 같이 iT 전구체를 생기게 하는 hiPSC-유래 iHE의 능력을 도시한다.
실시예 13 - 전염증 사이토카인을 분비하고, 말초 혈액 및 제대혈 NK 세포와 비슷한 세포독성을 갖도록 iPSC-유래 iNK는 세포 자극에 반응한다
iPSC-유래(iNK) 또는 말초 혈액 유래(pbNK) NK 세포를 비자극(US)이거나 또는 4시간 동안 피더 세포와 1:1 비로 자극하였다. 항-CD107a 항체(바이오레전드(Biolegend))에 접합된 골지스탑(Golgistop)(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 및 알렉사-플루오르(Alexa-Fluor) 647을 공동 배양 기간 동안 포함시켰다. 4시간 후에, 세포를 수집하고 나서, CD45, CD56, 및 TNF-알파에 대해 염색하고, 유세포분석에 의해 분석하였다(도 23A). 세포독성 기능을 평가하기 위해, iNK 또는 탯줄 혈액 유래(CBNK) 세포를 90시간 동안 1:1, 3:1 및 10:1의 효과기:표적 비로 CFSE--표지된 표적 세포와 함께 공동배양시켰다. 표적 세포의 정량화를 인쿠사이트 줌(Incucyte ZOOM) 세포 분석 시스템과 함께 2시간마다 분석하였다(도 23B). 본 명세서에 제공된 플랫폼을 이용하여 iPSC(iNK)로부터 유래된 NK 세포는 TNFα를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 전염증 사이토카인을 분비하기 위한 세포 자극에 반응하며, 말초 혈액 및 탯줄 혈액 NK 세포와 비슷한 세포독성 기능을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 14 - iPSC 유래 T 세포 전구체는 흉선을 재활성화시키며, 생체내 T 세포를 재구성한다
hiPSC-유래 ipro-T 세포는 기능성 T 세포 전구체로서 면역 손상 NSG 수용자 마우스의 흉선으로 귀소하고, 군집화하며, 분화될 수 있는 것으로 나타난다. 제10일(CD34+ HE 단리 후) CD34+CD7+ ipro-T 세포를 FACS에 의해 단리시키고, 신생아(출생후 2일 내지 5일) NSG 마우스에 간내로 주사하였다. 주사 8주 후에, 마우스를 유세포 분석에 의해 인간 CD45+CD4-CD8- 이중 음성(DN), CD45+CD4+CD8+ 이중 양성(DP), CD45+CD4+CD8- 또는 CD45+CD4-CD8+ 단일 양성(SP) T 세포 서브세트의 발현에 의한 흉선 생착에 대해 분석한다. 추가적으로, 단일 양성 T 세포를 TCR, CD3, CD27 및 CCR7의 발현에 대해 평가하여 그들의 미경험 및 성숙 상태를 평가하였다. 항-CD3/CD28 자극 후 CD25 활성화 마커 발현의 증식 능력 및 상향 조절을 모니터링함으로써 성숙 단일 양성 T 세포의 기능성을 평가한다.
흉선 재활성화를 야기하는 흉선 환경의 생성 및 개선을 초래할 수 있는 흉선세포와 흉선 상피 세포(TEC) 사이의 중요한 상호 작용이 있다. 제10일 CD34+CD7+ hiPSC-유래 ipro-T 세포를 흉선 기능에 대한 그들의 효과에 대해 평가한다. 상기와 같이, FACS 분류 ipro-T 세포를 신생아NSG 수용자 마우스에 간내로 주사한다. 주사 후 8 내지 10주에 항-사이토케라틴 5(K5) 및 항-사이토케라틴 8(K8)로 염색함으로써 대조군(비주사) 또는 프로-T-주사 마우스의 흉선 상에서 면역 조직학적 분석을 수행하여 흉선 피질, 수질 및 정해진 피질수질 경계의 형성을 동정한다. ipro-T 세포의 부재 하에서, 존재하는 상피 세포의 붕괴된 구조가 예상된다. 추가적으로, 림프구 전구체의 흉선으로의 동원에 필요한 중요한 TEC-유래 케모카인인 CC19, CCL21 및 CCL25의 발현을 평가한다. 마지막으로, TEC 성숙에 영향을 미치는 상호작용인 ipro-T 세포 상에서 RANK 리간드(RANKL; 핵 인자 카파-리간드의 수용체 활성자) 및 TEC 상의 RANK의 발현은 흉선 재활성화의 증가를 나타낸다.
실시예 15 - iPSC 유래 iT 세포는 세포 자극에 반응하며, 성숙 T 세포로서 VDJ 재조합을 제시한다
hiPSC-유래 iT 세포의 기능성을 입증하기 위해, 제35일(CD34+ HE 단리 후) iT 세포를 세포 추적자 바이올렛(Cell Tracker Violet)으로 처리하여 세포 증식을 모니터링하고, 이어서, 7일 동안 항-CD3/CD28 비드로 자극하여 iT 세포 활성화 및 증식을 유도한다. iCD34-유래 iT 세포는 탯줄 혈액-유래 및 말초 혈액 T 세포와 유사한 방식으로 CD3/CD28 자극에 반응한다. iT 세포의 활성화는 CD25 및 CD62L(활성화를 나타내는 표면 마커)의 발현 및 CD45+CD3+ 개폐 전략에 기반한 인터페론 감마에 대한 세포내 염색으로 나타낸다. iT의 활성화는 세포 분할 동안 세포 추적자 바이올렛의 고갈에 의해 알 수 있는 바와 같이 증식을 초래한다.
hiPSC-유래 iT 세포 발생 정도를 추가로 특성 규명하기 위해, 제35일 iT 세포를 T 세포 수용체 좌위의 재조합에 대해 분석한다. CD3+ 분류된 제35일 iT 세포로부터의 게놈 DNA를 TCR Db2-Jb2 재배열의 존재에 대해 분석하였는데, 이는 내인성 T 세포 수용체 좌위의 재배열을 나타낸다. 다클론성 Db2-Jb2 재배열을 나타내는 다중 PCR 산물은 탯줄 혈액 CD34+ HSC로부터 유래된 T 세포에서 관찰된 것과 유사하다.
실시예 16 - 확정적 조혈 내피세포의 신규한 마커에 대한 세포 표면 항체 선별
세포 마커는 세포를 동정하고 분류하는 것을 돕는 모노그램으로서 작용한다. 대부분의 마커는 세포 혈장막 내의 분자 또는 항원이다. 다수의 표면 마커는 특정 항체에 의해 인식되는 그들의 분화 클러스터(CD)에 의해 분류된다. 일반적으로, 마커의 특정 조합은 상이한 세포 유형에 대해 독특하다.
중배엽 유래 내피세포를 통한 만능 줄기세포의 시험관내 분화 동안, 이종성 내피세포는 동맥, 정맥, 및 조혈 운명을 획득하며, 표현형적으로 그리고 기능적으로 전문화된 각각의 서브타입 내피세포를 형성한다. 이들 세포 서브타입은 가까운 공간 및 시간 내에 형성되고, 현재 세포 마커의 결여를 위한 유전자 발현 프로파일링을 통해 주로 구별된다. 조혈 세포는 내피-조혈 이행(EHT)을 통한 조혈 내피세포(HE)로서 알려진 내피세포의 독특한 집단으로부터 생긴다. EHT는 내피 특징을 갖는 세포가 조혈 형태 및 표현형을 점진적으로 획득하는 연속적 과정을 나타낸다. HE 세포 서브타입에 특이적인 마커를 동정하는 것은 후속적 조혈 세포 분화를 위한 목적으로 하는 품질 및 순도를 갖는 초기 세포 집단을 단리하는 것의 효율을 크게 개선시킬 것이다. 따라서, 모든 이들 상이한 세포 계통을 식별하기 위한 추가적인 퍼텐셜적으로 독특한 마커가 요망된다.
조혈 세포를 생기게 하는 능력을 갖는 CD34+ 및 HE 세포의 풍부화에 대한 추가적인 마커를 동정하기 위해, hiPSC를 단일층으로서 파종하고, 플랫폼을 이용하는 방법 및 조성물, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 조혈 세포로 분화시켰다.
hiPSC 분화의 제10일에, CD34+ 세포에 특이적인, CD34+CD43- 세포를 항-인간 항체로 염색하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 25). 분석에 포함된 항-인간 항체를 도 26에 열거한다. 도 25에서 나타내는 바와 같이, 클래스 I 마커는 hiPSC-유래 CD34+ 세포 상에서 1% 미만의 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다. 클래스 II 마커는 CD34+ 세포 상에서 1% 내지 99% 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다. 클래스 III 마커는 CD34+ 세포 상에서 99% 초과의 발현을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다. iCD34+ 집단 내 마커의 발현 수준은 도 26에서 보여준다. 클래스 II 마커는 조혈 퍼텐셜을 갖는 iCD34+ 세포 상에서 발현될 수 있는 세포 표면 단백질을 동정한다.
이 분석에서, 마커는 선택 집단에서 적어도 1% 발현을 나타낸다면, 양성이 되는 것으로 고려한다. 마커는 선택 잡단 상에서 1% 미만의 발현을 나타낸다면 음성이 되는 것으로 고려된다. 양성 마커의 발현 수준은 또한 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 기반하여 정량화 또는 범주화될 수 있다. 이는 log 규모의 값으로 도시한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 높음 또는 밝음으로 고려되는 마커는 MFI가 약 104 내지 105일 것이다. 중간체 또는 중간으로 고려되는 마커는 MFI가 약 102 내지 104일 것이다. 낮음 또는 어두움으로 고려되는 마커는 MFI가 약 101 내지 102일 것이다.
클래스 II의 마커 후보 중에서, CD34+CD43- 집단 내의 CD93 마커의 발현을 도 27에 나타낸다. CD34+CD93- 및 CD34+CD93+ 집단을 단리시키고 나서, 후속적으로 CXCR4 및 CD73의 발현에 대해 분석하였다. CD34+CD93- 집단은 관심 대상의 확정적 HE 세포 집단을 나타내는 대다수의 CXCR4-CD73- 집단을 함유하는 것으로 결정되었다. 그러나 CD93의 뮤린 상동체의 발현은 이것이 없을 때보다 초기 림프조혈 전구체의 퍼텐셜 마커가 되는 것으로 이전에 동정되었다(Yamane T et al, PNAS, 2009; 106(22): 8953-8958).
CD93 발현 또는 이의 결여로 나타내는 확정적 조혈 퍼텐셜을 추가로 결정하기 위해, 제10일 CD34+CD43-CD93- 및 CD34+CD43-CD93+ 분획을 FACS에 의해 단리시키고, 본 명세서에 개시한 바와 같은 iNK 분화 배양물인 iNK-A2 및 iNK-B2에서 플레이팅하였다. 분화 10일 후에, CD45+ 조혈 세포 및 CD45+CD7+ 림프구 전구체의 절대 수를 평가하였다(도 28A). iNK 분화의 추가 10일 후에, CD56 및 NKp30 마커의 발현에 의해 iNK 세포의 존재에 대해 배양물을 평가하였다. CD34+ 집단의 확정적 조혈 퍼텐셜은 CD93- 분획에서 풍부한 것으로 나타났다(도 28B). 이렇게 해서, CD34+CD93- 세포는 조혈 세포에 대한 iPSC 관련 분화의 초기 단계에서 확정적 HE 집단을 나타내고; CD93의 발현은 HE 하위집단을 동정하기 위한 CD73, 또는 CD73/CXCR4의 대리 마커로서 사용할 수 있다.
iPSC 분화의 제10일에 CD34+ 집단에 존재하는 CD34+CD93- 세포 분획의 백분율에 기반하여, 본 발명자들은 제10일에 또는 더 조기에 CD34+ 집단에서 확정적 HE의 백분율이 대략 30% 이하가 된다는 것을 추정하였다. 이렇게 해서, 제10일 CD34+ 집단을 이용하는 본 명세서의 선별에서 발현의 약 1% 내지 약 30%를 갖는 양성 또는 음성 중 하나인 마커는 또한 확정적 HE 하위집단을 동정하는 데 유용할 것이다(도 26). 이렇게 해서, CD34+ 집단 내 확정적 HE를 동정하기 위한 양성 마커는 CCR10, CD164, CD95, CD144, CD166, 림포톡신 β 수용체, CD252, CD55, CD40, CD46, CD340, CD119, CD106, CD66a/c/e, CD49d, CD45RB, DLL4, CD107a, CD116, CD324, CD123, CD49f, CD200, CD71, CD172a, CD21, CD184, CD263, CD221, Notch 4, MSC, CD97, CD319, CD69, CD338, 포도플라닌, CD111, CD304, CD326, CD257, CD100, CD32, CD253, CD79b, CD33, CD83, GARP, CD183, 및 CD357을 포함한다. 대안적으로, CD34+ 집단 내 확정적 HE를 동정하기 위해 CD93과 유사한 추가적인 음성 마커는 CD31, CD165, CD102, CD146, CD49c, CD13, CD58, 인테그린 α9β1, CD51, CD10, CD202b, CD141, CD49a, CD9, CD201, CD47, CD262, CD109, CD39, CD317, CD143, 인테그린 β5, CD105, CD155 및 SSEA-4를 포함한다.
실시예 17 - WNT 신호전달의 조정은 iPSC 유래 iCD34의 산출 및 효능을 개선시킨다(확정적 HE)
지정된 분화의 10일 후에 hiPSC로부터 확정적 HE의 효율적인 생성을 최적화하기 위해, WNT 신호전달 경로의 조정 효과를 시험하였다. 분화 제6일에, 세포 배양물을 GSK3 저해제 CHIR99021, Wnt 작용제, 또는 IWP2, WNT 저해제의 존재 하에 분화시켰다(도 29A). CD34+CD43-CD93- HE의 생성을 제10일에 분석하였다. 도 29B는 IWP2에 의해 WNT 경로를 저해하는 것은 유세포분석에 의해 알 수 있는 바와 같이 제10일에 표현형 HE의 백분율에 영향을 미치지 않았지만, 그러나, 그것은 HE 세포수의 전반적인 감소를 야기하였다는 것을 보여준다(도 29B). 대조적으로, CHIR99021에 의한 WNT 경로의 활성화는 CD34+CD43- 세포 백분율의 약간의 감소를 초래하였으며, 이는 표현형 CD34+CD43-CD93- HE의 수 및 백분율을 대략 2 내지 3배 증가시켰을 뿐만 아니라, HE 세포질을 개선시켰고, 즉, 총 HE 세포수를 증가시키고, 그 결과 HE 증식을 증가시켰다.
WNT 조정된 HE의 효능을 결정하기 위해, 비처리, IWP2- 및 CHIR99021-처리 HE의 pan-조혈 및 림프구 퍼텐셜을 각각 평가하였다. 제10일 CD34+CD43- 세포를 FACS에 의해 단리시키고, 본 명세서에 제공하는 바와 같이 MPP 분화 및 iNK 분화 배양물에서 플레이팅하였다. 도 30A는 MPP 분화의 7일 후에, CHIR99021 조정된 HE가 약 5 내지 6배의 CD45+ 세포의 증가된 존재에 의해 나타내는 바와 같이 증가된 조혈 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 30B는 iNK 분화의 20일 후에, CHIR99021 처리된 HE가 약 5 내지 6배의 CD56+CD7+ NK 전구 세포의 증가된 존재에 의해 나타내는 바와 같이 증가된 림프구를 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 18 - 면역 요법에 대한 향상된 특성을 갖는 조혈 세포를 생성하기 위한 유전자 변형 또는 공여자 속성을 갖는 iPSC
다양한 질환을 치료하는 데 있어서 우선적인 독특한 속성은 면역계의 세포, 예컨대 T 세포를 포함하는 선택된-공여자 유래 세포로부터 유래될 수 있다. 공여자 속성은 분화된 자손을 통해 계대될 수 있는 유전자 각인을 포함하고, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포; 추적할 수 있는 그리고 바람직한 유전자 다형성, 예를 들어, 선택된 공여자에서 고친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 대한 동형 접합체; 및 사전결정된 HLA 필요, 즉, 증가된 집단 적용범위를 갖는 단산형을 나타내는 선택된 HLA-매칭 공여자 세포로부터의 사전배열된 단일특이성 TCR을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 세포 요법 동안, 새로운 또는 향상된 치료 특성을 갖는 유전자 변형된 세포는 개선된 질환 결과에 바람직하다. 그러나, iPSC 또는 이의 공급 세포의 수준에서 존재하는 임의의 공여자 속성 또는 유전자 조작된 양상이 이질적 집단에서 유전자 침묵, mRNA 분해, 유전자 돌연변이, 부적절한 단백질 수송 및 절단, 감소된 분화 퍼텐셜, 및 억제된 세포 성장의 범위에 있는 임의의 다수의 이유 때문에 iPSC로부터 유래된 분화 세포에서 유지되고 기능성을 보유할 수 있는지의 여부는 분명하지 않았다. 개시된 바와 같은 본 발명의 분화 플랫폼 및 조성물을 이용하여 관련된 분화를 통해 공급원 특이적 체세포로부터, 또는 유전자 편집으로부터 유래된 iPSC에 의해 보유되는 유전자 각인을 포함하는 iPSC-유래 효과기 세포를 생성하는 방법을 본 명세서에서 입증한다. 이들 분화 세포는 iPSC 또는 그들의 본래의 공급된 모 집단에 존재하는 유전자 각인에 보유되는 것으로 나타나며, 증식 및 생존을 위한 향상된 능력에 의해 더 재활성화된다. 더 나아가, 유도 만능 줄기세포 형태로 존재할 때, 목적으로 하는 속성을 갖는 우선적 공급 세포는 확장 가능한 순수/클론 집단에서 무기한으로 유지될 수 있고, 재현성 및 개선된 효능을 갖는 T, NK, NKT, CD34, T 전구체 및 NK 전구 세포를 포함하는 선택된 효과기 세포 유형으로 용이하게 분화될 수 있다.
또한 본 발명에 의해 제공되는 분화 플랫폼으로부터 유래된 효과기 세포의 일부 목적으로 하는 속성, 예를 들어, 생체내 세포 지속성은 또한 환자의 면역 세포에 의해 인속되거나 또는 파괴되는 일 없이 동종이계 이식물에서 상기 세포가 사용되도록 허용하는 소분자 조정을 통해 얻어질 수 있다는 것이 본 명세서에서 도시된다.
본 명세서에 제공된 분화 방법과 관련하여, 우선적 세포 공급물(공여자-, 환자-, 질환- 또는 질환-특이적)의 공지된 및 독특한 각인된 특징(들)은 또한 다양한 분화 단계에서 재프로그래밍된 iPSC 및 중간체 세포의 클론성 또는 클론 검출 마커로서 작용할 뿐만 아니라 선택된 각인 마커를 이용하여 시험관내에서 또는 생체 내에서 추적된다. 이들 마커는 DNA 재배열, 예컨대 VDJ 재조합 및/또는 이식 유전자 삽입 부위 중 하나 이상을 포함한다.
1. HLA 클래스 I 널 iPSC는 iCD34 HE로 분화되고, pan-조혈 및 림프구 전구체로 추가로 분화될 수 있다
iPSC-유래 효과기 림프구의 면역-내성 및 지속성을 개선시키기 위해, the effect of HLA 클래스 I 결실의 효과를 시험하였다. iPSC에서 B2-마이크로글로불린(B2M)의 결실은 도 31에서 알 수 있는 바와 같이 HLA 클래스 I(HLA-A, B 및 C) 의 발현 결여를 초래하였다. 본 발명자들은 B2M-/- iPSC 계통이 T 세포 매개 사멸을 피할 수 있지만, NK 세포 인식을 유도하지 않았다는 것을 이전에 나타내었는데, 이는 시험관내 그리고 생체내 둘 다에서 개선된 지속성을 갖는 보편적으로 공여자/수용자 적합성인 hiPSC 클론 계통을 나타낸다(데이터 미제시).
이어서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 분화 플랫폼 및 방법을 이용하여 iPSC의 분화 능력에 대한 B2M 결실 효과를 평가하였다. B2M-/- iPSC 및 야생형 iPSC를 10일 동안 분화시켜 HE를 생성하였고, 유세포 분석에 의해 CD34+CD43- HE 세포의 발현에 대해 분석하였다. 도 32A 및 도 32B는 B2M-/- iPSC가 야생형 대조군과 유사한 빈도로 CD34+ HE로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 33은 B2M-/- iPSC로부터 분화된 CD34+CD43- HE가 HLA 클래스 I 널을 보유한다는 것을 나타낸다.
B2M-/- iPSC-유래 HE의 조혈 퍼텐셜을 입증하기 위해, FACS를 이용하여 세포를 분류하고, 도 1의 다능성 전구체 분석(iMPP)에서 기재하는 바와 같이 CD45+ 조혈 전구체를 생성하기 위해 내피세포가 조혈 이행을 겪는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 도 32C은 B2M-/- HE는 야생형 HE와 유사한 효율로 CD45+ pan-조혈 전구체를 생성할 수 있다는 것을 도시한다.
마지막으로, B2M-/- iPSC-유래 HE의 림프구 퍼텐셜을 평가하였다. FACS 분류 CD34+CD43- HE 세포는 도 3에 기재한 바와 같이 NK 세포 전구체로 추가로 분화되었다. 분화의 대략 10일 후에, CD45+ 개폐 전략에 기반하여 유세포 분석을 이용하여 CD56 및 CD7의 발현에 의해 NK 전구 세포의 존재에 대해 배양물을 평가하였다(도 32D). B2M-/- iPSC-유래 HE는 야생형 iPSC-유래 HE와 비교할 때 iNK 전구 세포를 생성하는 동등한 능력을 갖는 것으로 나타났다.
본 실시예는 iPSC의 분화 퍼텐셜이 게놈 편집을 통해 그의 보유된 유전자 각인에 의해 영향받지 않는다는 것, 본 명세서에 개시된 분화 플랫폼이 유전자 각인 없이 iPSC와 비슷한 수준에서 유전자 각인된 iPSC를 분화시킬 수 있다는 것, 및 iPSC의 유전자 각인이 그의 분화 세포에 보유된다는 것을 도시한다.
2. iPSC 상에서 HLA 클래스 I의 조정 및 면역-적격 수용자에서 iPSC 및 이의 유도체 세포의 지속성을 증가시키기 위해 조정된 iPSC의 분화
HLA 클래스 I 변형된 iPSC(B2M-/- iPSC 또는 HLA I-변형된 iPSC)의 면역 내성 및 지속성을 추가로 개선시키기 위해, HLA-E/B2M 융합 단백질을 함유하는 렌티바이러스를 이용하여 B2M-/- iPSC를 형질도입하였다. 형질도입된 HLA I-변형된 iPSC(B2M-/- HLA-E iPSC)의 품질(즉, 만능성 상태)을 만능성 마커 TRA-181 및 SSEA4뿐만 아니라 HLA-E의 발현에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. 도 34a는 형질도입된 HLA I-변형 iPSC가 세포 표면 상에서 HLA-E를 발현시키고, 만능성 표현형을 유지한다는 것을 나타낸다.
형질도입된 HLA I-변형 iPSC가 생체내에서 증가된 지속성을 갖는지의 여부를 결정하기 위해, 루시페린 처리된 야생형 및 B2M-/- HLA-E iPSC를 기형종 분석에서 면역-적격 C57BL/6 수용자의 맞은편 옆구리에 피하로 주사하였다. 발생 기형종을 시각화하기 위해 루시페린 주사와 함께 IVIS 영상화에 의해 마우스를 매일 분석하였다. 도 34b는 주사 후 72-시간에 B2M-/-HLA-E iPSC는 야생형 iPSC에 비해 약 6배의 증가된 정량적 지속성을 나타낸다는 것을 보여준다. B2M-/-HLA-E iPSC 기형종에 의한 증가된 루시페린 영상화를 도시하는 3마리의 대표적인 마우스를 또한 도 34b에서 제공한다.
조정된 HLA I-변형 iPSC의 분화 능력을 평가하기 위해, B2M-/- HLA-E 및 야생형 iPSC를 10일 동안 분화시켜 HE를 생성하였고, 유세포 분석에 의해 CD34+CD43- HE 세포의 발현에 대해 분석하였다. 도 35는 B2M-/- HLA-E iPSC로부터의 제10일(CD34+CD43- HE 세포)과 제17일(iMPP 분석에서 생성된 CD45+ pan-조혈 전구체) 분화 세포 둘 다에서 HLA-E 발현이 보유된다는 것을 나타낸다. 도 36A 및 도 36B는 B2M-/- HLA-E iPSC가 야생형 대조군과 유사한 빈도로 CD34+ HE로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. B2M-/- HLA-E iPSC-유래 HE의 조혈 퍼텐셜을 입증하기 위해, FACS를 이용하여 세포를 분류하였고, 도 1에서 다능성 전구체 분석(iMPP)에서 기재한 바와 같은 CD45+ 조혈 전구체를 생성하기 위해 내피세포의 조혈 이행을 겪는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 도 36C는 B2M-/- HLA-E HE가 야생형 HE와 유사한 효율로 CD45+ pan-조혈 전구체를 생성할 수 있다는 것을 도시한다. 이렇게 해서, B2M-/- HLA-E에 의해 전달된 면역 내성은 동일한 유전자 각인을 갖는 iPSC로부터 분화된 유도체 세포에서 보유된다. B2M-/- HLA-E를 포함하는 HE 세포는 증가된 지속성을 갖는 것으로 나타난다. HLA-G를 HLA-E 대신 사용할 때 지속성의 유사한 개선이 관찰되었다. 추가적으로, 절단을 피하기 위한 HLA-E 또는 HLA-G의 변형된 형태는 HLA 클래스 I 변형된 iPSC의 생체내 지속성을 추가로 향상시키도록 적용된다.
3. 표적화된 외인성 분자의 발현 및/또는 내인성 유전자의 변형을 통해 향상된 특성을 갖는 iPSC 및 유도체 세포의 생성
본 발명의 분화 플랫폼을 통해 얻은 유도체 림프구를 이용하는 면역 요법에서 바람직한 특성을 향상시키기 위해 iPSC 수준에서 변형 또는 조정된 분자를 사용할 수 있다. 이들 분자는 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질을 포함할 수 있다. B2M/HLA-I 및 HLA-E/G에 추가로, 바람직한 특성에 기여하는 표적화된 분자는 추가로 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 결합하기 위한 CD16 수용체 및 41BBL 공자극 분자, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR(키메라 항원 수용체), TCR(T 세포 수용체), TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5, RFXAP, 및 표면 촉발 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 구체적으로는, iPSC에서 표적화된 분자의 유전자 변형은 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5, RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; 이중- 또는 다중-특이적 관여자와 결합하기 위한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다. 표적화된 분자의 증가된 또는 감소된 발현은 영구적, 일시적, 시간적 또는 유도성일 수 있고, 내인성 또는 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
iPSC-유래 림프구 효과기 세포를 최적화하기 위해, 목적으로 하는 양상은 당업계에 공지된 다양한 전달 방법을 이용하여 iPSC 내로 도입될 수 있다. 이 예시적 설명에서, iPSC는 향상된 세포독성을 갖는 iPSC 및 유도체 세포를 생성하기 위해 비 절단성 고친화도 CD16 수용체 (HACD16) 및 41BBL 공자극 분자를 함유하는 렌티바이러스에 의해 형질도입되었다. 도 37a는 유세포분석에 의한 렌티바이러스 형질도입 후 iPSC의 표면 상에서 HACD16 및 41BBL 의 효율적인 발현을 입증한다. 도 37b는 본 명세서에 제공된 플랫폼을 이용하는 분화의 10일 후, HACD16의 발현 및 41BBL 발현이 유지되고, CD34+ HE 세포를 생성하는 iPSC의 능력을 동요시키지 않는다는 것을 보여준다. 추가로, 도 41은 HACD16의 발현이 유지되고, CD45+ 개폐 전략을 이용하여 제10일 CD56+ iNK 세포를 생성하는 iPSC의 능력을 동요시키지 않는다는 것을 보여준다.
T, NK, NKT 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하는 iPSC-유래 효과기 세포의 세포독성은 효과기 세포를 표적화된 종양 세포로 재지시할 수 있는 이중- 또는 다중 특이성 관여자와 결합함으로써 추가로 향상될 수 있다. 일반적으로, 이중- 또는 다중-특이성 맞물림의 개념은 효과기 세포의 표면에서 종양-관련 항원 및 활성화 수용체를 동시에 표적화하는 이중- 또는 다중-특이적 항체를 이용하여 특정 종양 세포에 대한 효과기 세포의 재표적화에 중점을 둔다. 이런 이중특이성 결합은 또한 효과기 세포 기능을 자극하여, 효과적인 효과기 세포 할성화 및 궁극적으로는 종양 세포 파괴를 야기한다. 효과기 세포 활성화 및 종양 세포 사멸은 효과기 및 표적 세포가 이중특이성 관여자에 의해 가교될 때에만 생기기 때문에, 이는 안전한 제어 메커니즘을 제공한다. 더 나아가, 이 표적화 관여자를 통해, 주조직적합성 복합체(MHC)-제한 활성화는 우회된다.
이중특이성 관여자 매개 효과기 세포 재표적화는 효과기 세포의 측면 상에서 표면 수용체의 결합을 수반한다. 자연적으로 존재하는 표면 수용체는 각각 T 세포, NKT 세포, NK 세포, 대식세포 및 호중구 상에서 발현된 CD3, FcgRIII(CD16), FcgRI(CD64) 및 FcaR(CD89)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(도 39A). 추가적으로, 조작된 표면 촉발 수용체는 재표적화 관여자 결합의 목적을 위해 효과기 세포 표면 상에서 발현하도록 도입될 수 있다. 유전자 조작된 표면 촉발 수용체는 그들의 천연 수용체 및 세포 유형과 독립적으로 효과기 세포와 특정 표적 세포 사이의 이중- 또는 다중-특이적 항체 맞물림을 용이하게 한다. 이 접근을 이용하여, 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성할 수 있고, 이어서, 이러한 iPSC는 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 다양한 효과기 세포 유형의 집단으로 분화된다. 세포 요법 동안, 하나 이상의 효과기 세포 유형이 사용될 수 있으며, 이들 모두는 하나 이상의 종양 세포를 표적화하기 위해 보편적 표면 촉발 수용체(도 39B)를 통해 동일한 이중- 또는 다중-특이적 관여자와 결합할 수 있다. 보편적 촉발 수용체는 미국 특허 출원 제62/366,503호에 기재된 방법을 이용하는 게놈 편집을 통해 iPSC에 도입될 수 있다. 일반적으로, 조작된 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프, 및 공자극 도메인을 포함한다. 표면 촉발 수용체의 항-에피토프는 말단 상에서 매칭 에피토프를 갖는 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 갖는 수용체를 발현시키는 임의의 효과기 세포의 결합을 지시한다. 다른 말단 상에서 관여자의 표적화 특이성은 사멸을 위해 특정 항원을 갖는 종양 세포의 하나 이상의 유형에 결합된 효과기 세포를 보낸다. 보편적 표면 촉발 수용체에 대해, 일 예에서, 효과기 세포 유형과 상관없이 정규 또는 비정규 세포 활성화를 달성하기 위해 그리고/또는 효과기 세포 기능을 향상시키기 위해 공자극 도메인은 IL2 단백질 또는 이의 부분을 포함할 수 있다.
종양 세포의 한 측면 상에서, 이중특이성 관여자 결합을 위해 사용될 수 있는 확립된 종양-관련 항원은 혈액학적 악성 종양의 CD19, CD20 또는 CD30; 고형 종양에 대한 EGFR(표피 성장 인자 수용체), HER2/ERBB2/neu(인간 표피 성장 인자 수용체 2), EPCAM(상피 세포 부착 분자), EphA2(에리스로포이에틴-생성 간세포 암종 A2) 및 CEA(암태아항원)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 표면 이중특이성 항체/관여자는 추가적인 특징, 예컨대 이중특이성 맞물림 및 결합을 향상시키기 위한 바이오틴일화된 단백질(들), 장기간 표면 제시를 위한 표면막 앵커 도메인(들), 이중특이성 상호작용 시 신호전달을 향상시키기 위한 공자극 도메인(들), 및 또는 관여자의 유도성 또는 일시적 발현 제어를 위한 스위치를 벗어난 메커니즘을 추가로 포함할 수 있다.
이중- 또는 다중-특이적 관여자에 의해 인식 가능한 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포 및 호중구를 포함하는, 상이한 유형의 iPSC 유래 효과기 세포는 종양 표적에 특이적인 관여자의 결합 시 하나 이상의 액체 및 고형 종양을 표적화하기 위한 암 면역 요법에서 개개로 또는 조합하여 적용될 수 있다.
4. CAR을 보유하는 CAR-T 유래 iPSC의 분화
키메라 항원 수용체(CAR)는 면역 효과기 세포, 예컨대 T 또는 NK 세포 상에 특이성을 적용하기 위해 작용하는 조작된 막관통 수용체이다. CAR은 항원 인식을 제공하기 위한 단클론성 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFV) 및 면역 효과기 세포에 활성화 신호를 제공하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 조합으로 전형적으로 이루어진 융합 단백질이다. CAR-면역 효과기 세포로서 강한 보편적 암 면역요법으로서의 큰 잠재력을 보유하는 CAR은 임의의 종양 관련 항원을 인식하도록 조작될 수 있고, 따라서 HLA 매칭에 대한 필요없이 종양 세포에 대해서만 조작된 면역 효과기 세포를 표적화한다.
본 발명자들은 공급원 세포의 동일한 유전자 각인, 즉, 동일한 키메라 항원 수용체를 보유하는 iPSC로 CAR-T 세포의 재프로그래밍을 나타내었다(도 24). CAR에 대한 공동 식별자로서 CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 및 절단된 LNGFR 세포 표면 마커를 발현시키도록 조작된 iPSC 유전자는 iCD34 세포로의 분화를 통한 발현을 보유한다(도 38). 따라서, 현재 개시된 분화 플랫폼, 방법 및 조성물을 이용하여, 목적으로 하는 유전자 각인을 갖는 iPSC는 iPSC 및 이의 공급원 면역 세포에 포함된 동일한 유전자 각인을 보유하는 다양한 면역 세포 유형으로 분화될 수 있다.
또한 본 명세서에서 내인성 TCR 좌위에서 CDR을 포함하는 iPSC로부터 분화된 유도성 T 세포가 제공된다. CAR의 좌위 특이적 삽입은 T 세포 수준에서 달성되었는데, 이는 후속적으로 CAR의 표적화된 삽입을 포함하는 iPSC로 재프로그래밍된다. 대안적으로, CAR의 좌위 특이적 삽입은 iPSC 수준에서 일어날 수 있다. 하나의 발현성 TCR 좌위만이 있기 때문에, 발현성인 CAR 삽입의 복제수는 좌위 특이적 삽입을 통한 제어 하에 있다. 추가로, CAR은 TCR의 불변 영역 내에 삽입된다. TCR 불변 영역의 절단은 TCR 넉아웃을 야기하는데, 이는 세포 요법에서 HLA 매칭 필요를 제거한다. 게다가, CAR 발현은 TCR 내인성 프로모터에 의해 제어되고, 따라서 TCR과 동일한 수준에 그리고 동일한 발생 단계에 있다. 내인성 TCR을 모방하는 제어된 CAR 발현은 iPSC 분화 과정 동안 분화 효능에 대한 잠재적인 영향을 피한다. 도 40은 모체 계통에서 TCR 발현에 비해 비슷한 수준으로 CAR의 발현, 및 조작된 세포주에서 TCR의 발현과 기능 둘 다의 제거를 나타낸다. 이어서, 발현된 T 세포는 iPSC로 재프로그래밍되고, 후속적으로 TCR 널인 T 세포를 발현시키는 CAR로 분화된다.
5. 공여자-, 질환-, 또는 병태- 특이적 유전자 각인을 함유하는 iPSC를 이용하는 향상된 특성을 갖는 효과기 림프 세포의 생성
iPSC의 게놈 편집을 통한 유전자 각인의 가이딩된 통합 이외에, 특정 공여자, 질환, 또는 병태(예컨대 치료 반응성)로부터 면역 세포 내에 존재하는 유전자 각인은 현재 개시된 분화 플랫폼을 고려하여 iPSC-기반 세포 요법에서 또한 이용될 수 있다. 선택된 공급원으로부터 유래된 면역 세포, 예컨대 T 세포 내 특정 유전자 각인은 다양한 질환을 치료함에 있어서 우선적인 독특한 속성으로 번역된다. 이들 우선적 속성은 독특한 항원 표적화 수용체 발현; 독특한 HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유전자 각인된 면역 세포는 바람직한 공급원으로부터 수집될 수 있고, 예를 들어 PCT/US2011/065900에 개시된 방법을 이용하여 유도 만능 줄기세포, 바람직하게는 기저 상태 만능성으로 재프로그래밍된다.
이렇게 해서, 또한 본 명세서에서 유도 만능 줄기세포(iPSC), 전구체 T 세포 또는 특정 공여자 또는 환자의 항원-특이적 T 림프구로부터 재활성화된 T 세포를 생성하는 접근, 방법 및 효용이 제공된다. 공여자는 질환 병태를 갖는 건강체일 수 있거나, 또는 치료에 민감하거나 또는 내성이 있을 수 있다. 예를 들어, 프로그래밍된/조절된/조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로 처리하고, 결과로서 질환 제거를 경험한 환자는 공여자 특이적 각인에 의해 전달되는 질환 부담을 제거하는 데 그의 이점에 기인하여 질환 제거를 통해 상기 T 세포의 효과적인 하위집단을 자연적으로 선택 및 확장하는 것으로 예상된다. 질환 제거 후에 공여자로부터 이들 T 세포를 얻음으로써 그리고 그들을 iPSC로 재프로그램밍함으로써, 바람직한 질환 제거 관련 각인을 갖는 제한되지 않은 양의 T 세포가 생성될 수 있다.
공여자 또는 환자-유래 T-세포 공급원료 세포 집단과 관련된 항원 특이성은 iPSC 유도, 탈분화, 및 후속적 분화 동안 유지된다. 이러한 유도체 세포는 안전성, 효능, 지속성 또는 특이성을 향상시키도록 추가로 변형될 수 있다.
상기 방법을 수행하기 위해, 1차 항원 특이적 T 세포는 선택된 공여자로부터 처음 단리된다. 공여자는 질환 병태를 갖는 건강체일 수 있거나, 또는 치료에 대해 민감하거나 또는 내성이 있을 수 있다. 이어서, 단리된 1차 항원-특이적 세포는 선택적으로, 항원-특이적 T 세포가 관심 대상의 세포-발현 항원을 인식하지 않는 T 세포보다 더 빠르게 증식하도록 허용적인 배양 배지에서 다클론성 T 세포를 관심 대상의 항원(들)을 발현시키는 종양 세포 또는 관심 대상의 항원(들)을 보유하는 비-형질전환 세포와 함께 공동 배양시킴으로써 풍부화될 수 있다. 단리된 1차 항원-특이적 세포는 항원-특이적 T 세포가 관심 대상의 세포-발현 항원을 인식하지 않는 T 세포보다 더 빠르게 증식하도록, 허용적 배지 내 다클론성 T 세포를 수지상 세포, 흉선 상피 세포, 내피세포 또는 인공 항원 제시 세포 또는 혈장 입자 또는 관심 대상의 항원(들)을 발현 또는 암호화하는 펩타이드와 함께 공동배양시킴으로써 풍부화될 수 있다. 단리된 1차 항원-특이적 세포는 또한 T 세포 수용체-특이적 스트렙타머, 또는 T 세포 수용체-특이적 융합 펩타이드 또는 항체 또는 다른 거대분자 결합제를 사용하는 면역형광 또는 면역자기 분류 방법에 의해 풍부화될 수 있다. 일 예에서, T 세포 수용체-특이적 스트렙타머는 암정소항원 (CT) 항원을 표적화한다. 추가적으로, 단리된 1차 항원-특이적 세포는 전사 인자 및 소분자를 포함하는 1종 이상의 제제를 이용하여 조정되거나 또는 재활성화될 수 있다.
다음에, 유도 만능 줄기세포(iPSC)는, 예를 들어 PCT/US2011/065900에서 개시된 방법을 이용하여 단리된 및/또는 풍부화된 1차 항원-특이적 T 세포로부터 바람직하게는 기저 상태 만능성으로 생성된다. 1차 항원-특이적 T 세포로부터 유래된 iPSC는 영구적, 일시적, 시간 제약적 또는 유도성일 수 있는 이식유전자(들)의 유도를 통해 안전성, 효능 및 지속성에 관한 2차 또는 3차 항원 특이성, 또는 활성화 또는 저해 양상을 포함하도록 유전자 편집될 수 있다.
이어서, 유전자 편집이 있는 또는 유전자 편집이 없는 iPSC는 배양, 확장되고, 본 분화 플랫폼, 방법 및 조성물을 이용하여 iPSC 유래 항원-특이적 T 세포의 집단으로 분화된다. iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 특히 TSCM, TCM, 및/또는 조절 T 세포를 포함하는 서브세트를 포함한다. 바람직하게는, iPSC 유도 또는 탈분화 동안뿐만 아니라 후속적 분화 동안 공여자 또는 환자-유래 1차 항원-특이적 T 세포와 관련된 항원-특이성이 유지되고, 보유된다.
iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 iPSC 또는 iPSC-유래 T 세포 수준에서 안전성, 효능, 지속성 또는 특이성을 향상시키도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 이식유전자의 발현에 의해 증가된다. 또는, iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 하나 이상의 사이토카인 수용체를 암호화하는 이식유전자의 발현에 의해 증가된다. 추가로, iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 지속성, 세포 투약 필요, 또는 안전성 스위치에 기여하는 이식유전자의 발현에 의해 증가된다. 대안적으로, iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 CD137 또는 CD80을 포함하는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 이식유전자의 발현에 의해 증가된다. iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 인간 백혈구 항원의 발현에서의 결실, 삽입 또는 감소에 의해 증가된다. iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 PD1, LAG3 및 TIM3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 관문 분자의 발현에서의 결실, 감소에 의해 증가된다. iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 CD3, CD8 및/또는 CD4를 발현시킴으로써 증가된다. iPSC 유래 항원-특이적 T 세포 내 적절한 분자의 변형된 발현은 영구적, 일시적, 시간 제약적 또는 유도성일 수 있다.
유전적 향상이 있는 또는 없는 상기 iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 자가면역 장애, 혈액학적 악성 종양, 고형 종양, 암 또는 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 입양 세포 전달에 적합하다. 혈액학적 악성 종양 또는 고형 종양을 치료하는 목적을 위해, iPSC 유래 항원-특이적 T 세포는 항-종양제 또는 조혈 줄기세포 이식 절차를 수반하는 추가적인 치료 전에, 동안에 또는 후에 전달될 수 있다.
6. iPSC 및 이의 유도체 세포의 클론성 또는 클론 검출의 마커로서 작용하는 유전자 각인
유도된 만능 줄기세포(iPSC)-기반 요법은 다양한 질환으로 고통 받는 환자에 대한 유효한 치료 선택으로서의 견인력을 얻는다. 그러나, iPSC-기반 요법을 생성하고 이용하는 임상적 실현 가능성은 iPSC 및 이의 유도체 세포의 이종성 특성을 고려하여 이러한 제품의 점조도 및 안전성 문제를 아직 처리하지 않았다. 현재 사용되는 방법은 단일 세포 분류 및 클로닝, 제한적 희석에 의한 클로닝을 포함하는데, 이들 모두는, 특히 주어진 집단에서 이질성이 크다면, 힘들고, 비효율적이며 종종 성공적이지 않을 수 있다. 본 명세서에서 현재 개시된 분화 플랫폼, 방법 및 조성물을 이용하여 수행되는 임의의 중간 분화 단계에서 보유 가능한 유전자 각인(들)을 이용하여 iPSC-유래 세포 집단의 클론성을 특성규명하는 신규한 기법이 제공된다.
T 및 B 림프구는 V(D)J 재조합 때문에 그들이 특이적이고 비가역적인 게놈 서열 변경을 겪는 정상 성숙 동안, 이 과정이 또한 체세포 재배열로서 알려진다는 점에서 포유류 세포 집단에 독특하다. 이는 T 및 B 세포 성숙의 초기 단계 동안 발생 림프구에서만 생기는 유전자 재조합의 독특한 메커니즘이다. 상기 과정은 각각 B 세포 및 T 세포 상에서 발견되는 항체/면역글로불린(Ig) 및 T 세포 수용체(TCR)의 고도로 다양한 레퍼토리를 초래한다. V(D)J 재조합은 1차 림프구 기관(B 세포에 대해 골수 및 T 세포에 대해 흉선)에서 생기고, 거의 무작위 방식으로 가변(V), 결합(J), 및 일부 경우에, 다양성(D) 유전자 세그먼트를 재배열한다. 상기 과정은 박테리아, 바이러스, 기생충 및 벌레를 포함하는 거의 모든 병원균뿐만 아니라 암에서 보이는 "변경된 자기 세포"로부터의 항원의 인식을 허용하는 Ig 및 TCR의 항원-결합 영역에서 신규한 아미노산 서열을 궁극적으로 초래한다. 알파/ 베타 TCR 수용체의 독특한 다양성은 과량의 2E7 별개의 조합이 되는 것으로 추정되며, 면역글로불린 다양성은 과량의 1E11 별개의 조합이 되는 것으로 추정된다.
B 및 T 세포 성숙 동안 생기는 유전자 재배열의 영구성을 고려하여, 이러한 세포로부터 유래된 iPSC 집단은 개개 시작 림프구에 대해 독특한 Ig 및 TCR 서열을 포함하는 iPSC를 포함할 것이다. 따라서 성숙 림프구로부터 iPSC 유래의 추정적 클론 집단 내 특정 TCR 또는 Ig 유전자의 서열분석 또는 상동성 비교에 의해, 집단이 실제로 클론성인지 아닌지의 여부가 결정될 수 있다. 유사하게, 본 플랫폼 및 방법을 이용하여 각인된 iPSC를 분화시킨 후에, iPSC 유래 분화 세포의 보유된 체세포 재배열의 유전자 서열분석 또는 상동성 비교에 의해 분화된 자손의 클론성을 또한 평가할 수 있다. 동정된 체세포 재배열은 또한 요법 효능 및 조절 순응도와 관련이 있는 일관성 및 안전성 문제를 처기 하는 대응하는 평가를 만들기 위해 독특한 유전자 재조합 서명을 위해 환자 혈액, 조직 또는 종양 생검을 샘플링 및 분석함으로써, 그리고 출발 T 세포 집단, 유래된 iPSC 및 iPSC 분화 세포 유형에서 체세포 재배열에 해당 서명을 매칭시킴으로써 생체내 입양 세포 귀소, 지속성 및 확장을 추적하는 데 사용할 수 있다.
당업자는 본 명세서에 기술된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 실시형태를 대표하고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 다양한 치환 및 변형은 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 본 개시내용에 행해질 수 있음은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 본 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 예에서 본 명세서에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것은 다른 2개의 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 도시되고 기술된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 개시내용의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시형태 및 선택적인 특징에 의해거 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변경은 당업자에 의해서 분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (141)

  1. 향상된 치료적 특성을 갖는 조혈 계통 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 얻는 단계;
    b) iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계로서, 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 상기 분화를 지시하는 단계:
    (i) 중배엽 세포를 얻기 위해, iPSC를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 확정적(definitive) 조혈 내피세포(hemogenic endothelium: HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 상기 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF 및 WNT 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 상기 중배엽 세포는 조혈 계통 세포를 제공할 수 있는, 상기 접촉시키는 단계를 포함하되,
    중배엽 세포 및 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 배상체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 얻어지고;
    상기 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포를 포함하며; 그리고
    상기 조혈 계통 세포는 상기 iPSC에 포함된 상기 유전자 각인(genetic imprint)을 보유하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC를 얻는 단계는 하기 단계들을 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법:
    a) 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안에 또는 후에 게놈 편집에 의해 iPSC에 하나 이상의 유전자 각인을 도입하는 단계로서, 상기 유전자 각인은 상기 iPSC의 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 도입된 하나 이상의 유전자 변형된 양상을 포함하는, 상기 하나 이상의 유전자 각인을 도입하는 단계; 또는
    b) 하기 i 내지 iii에 의해 하나 이상의 유전자 각인을 iPSC에 도입하는 단계;
    i. 공여자-, 질환- 또는 치료 반응- 특이적인 공급원 특이적 면역 세포를 얻는 단계로서, 상기 면역 세포는 보유할 수 있는 치료적 속성을 제공하는, 상기 면역 세포를 얻는 단계; 및
    ii. 상기 공급원 특이적 면역 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 단계; 및 선택적으로
    iii. 상기 공급원 특이적 면역 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안에 또는 후에 유전자 편집에 의해 추가적인 유전자 각인을 iPSC에 도입하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신(Tapasin), NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 관여자(engager)에 대한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 상기 조혈 계통 세포에 대해 보편적인, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 상기 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적이고, 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 공급원 특이적 면역 세포의 상기 치료적 속성은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계는, 확정적 HE 세포를 얻기 위해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 상기 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 프레-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, TPO, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 프레-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단계 b) 전에, 상기 세포를 파종 및 확장시키기 위해 상기 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  16. 향상된 치료적 특성을 갖는 조혈 계통 세포로서, 상기 조혈 계통 세포가 유래된 만능 줄기세포에 포함된 유전자 각인을 포함하되, 상기 만능 줄기세포의 상기 유전자 각인은,
    a) 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 동안에 또는 후에 상기 만능 세포의 상기 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는
    b) 공여자-, 질환-, 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하되, 상기 만능 세포는 상기 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍된, 조혈 계통 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 상기 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포.
  18. 제16항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 대한 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 조혈 계통 세포에 대해 보편적인, 조혈 계통 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 조혈 계통 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 조혈 계통 세포.
  22. 제18항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 조혈 계통 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포.
  24. 제16항에 있어서, 상기 공급원 특이적 면역 세포의 상기 치료적 속성은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함하는, 조혈 계통 세포.
  25. 제16항에 있어서, 상기 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 또는 호중구를 포함하는, 조혈 계통 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 T 세포는 T 조절 세포(Treg), 중앙 기억 T 세포(Tcm), 줄기세포 기억(Tscm) 및/또는 효과기 기억 T 세포(Tem)를 포함하는, 조혈 계통 세포.
  27. 제25항에 있어서, 상기 NK 세포는 적응 NK 세포를 포함하는, 조혈 계통 세포.
  28. 제16항 내지 제27항의 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물.
  29. 제16항 내지 제27항의 조혈 계통 세포 중 하나 이상 및 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 조혈 계통 세포의 표면 수용체에 대해 하나 이상의 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는,
    a) 조혈 계통 세포 유형 특이적이되, 상기 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89를 포함하는 표면 수용체에 특이적이거나; 또는
    b) 조혈 계통 세포 유형 독립적이되, 상기 조혈 계통 세포는 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하고, 상기 관여자는 상기 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적인, 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 제31항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  36. 입양 세포(adoptive cell) 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료적 용도로서, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 갖는, 치료적 용도.
  37. 세포 요법이 필요한 대상체의 치료 방법으로서,
    유도 만능 줄기세포(iPSC) 분화로부터 유래된 치료적으로 충분한 수의 T 세포 전구체를 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 대상체는
    (i) 골수 또는 줄기세포 이식을 위한 후보이거나, 또는 상기 대상체는 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받았거나;
    (ii) 골수 제거 또는 비-골수소멸성 화학요법 또는 방사선 요법을 받았거나;
    (iii) 조혈계의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나;
    (iv) 고형 종양을 갖거나; 또는
    (v) 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖되;
    상기 투여된 T 세포 전구체는 흉선을 재활성화하고, 생체내 T 세포를 재구성하는, 치료 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하되, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 그것으로부터 유래된 상기 T 전구체에 보유되는, 치료 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 유전자 각인은 분화를 위한 상기 iPSC의 상기 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환에 의해 얻어지는 하나 이상의 유전자 변형된 양상을 포함하는, 치료 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 유전자 각인은 공여자, 질환 또는 치료 반응에 특이적인 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍된 상기 iPSC에 보유되는, 치료 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 또는 상기 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 치료 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 대한 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함하는, 치료 방법.
  44. 제37항에 있어서,
    이중- 또는 다중-특이적 관여자를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는,
    a) 효과기 세포 유형 특이적이고, 상기 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89를 포함하는 표면 수용체에 특이적이거나; 또는
    b) 효과기 세포 유형 독립적이고, 상기 관여자는 상기 T-전구 세포 및 그로부터 유래된 T 세포에 포함된 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적인, 치료 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 치료 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 치료 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 치료 방법.
  49. 제39항에 있어서, 상기 공급원 특이적 면역 세포로부터의 상기 유전자 각인은 (i) 항원 표적화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 표적에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상을 포함하는, 치료 방법.
  50. 항체 조성물로서, CCR10, CD164, CD95, CD144, CD166, 림포톡신 β 수용체, CD252, CD55, CD40, CD46, CD340, CD119, CD106, CD66a/c/e, CD49d, CD45RB, DLL4, CD107a, CD116, CD324, CD123, CD49f, CD200, CD71, CD172a, CD21, CD184, CD263, CD221, Notch 4, MSC, CD97, CD319, CD69, CD338, 포도플라닌, CD111, CD304, CD326, CD257, CD100, CD32, CD253, CD79b, CD33, CD83, GARP, CD183, CD357, CD31, CD165, CD102, CD146, CD49c, CD13, CD58, 인테그린 α9β1, CD51, CD10, CD202b, CD141, CD49a, CD9, CD201, CD47, CD262, CD109, CD39, CD317, CD143, 인테그린 β5, CD105, CD155, SSEA-4 및 CD 93으로부터 선택된 적어도 하나의 마커에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하되; 상기 마커는 확정적 조혈 내피세포를 동정하기 위한 것인, 항체 조성물.
  51. 제50항에 있어서, CD93에 특이적인 항체를 포함하되; CD93에 특이적인 상기 항체와 접합된 세포는 CD34+, CD43-, CD73-, CXCR4- 및 CD73-CXCR4- 표현형 중 하나 이상을 갖는, 항체 조성물.
  52. 만능 줄기세포 분화에서 확정적 조혈 내피세포를 동정하는 방법으로서,
    (i) 분화를 겪는 세포 집단을 얻는 단계;
    (ii) CD93에 특이적인 항체에 상기 세포 집단을 도입하는 단계; 및
    (iii) 1% 미만의 CD93 발현 수준을 갖는 상기 세포 집단을 동정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기세포 분화에서 확정적 조혈 내피세포를 동정하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 단계 (i)은
    분화를 겪는 세포 집단으로부터 상기 CD34+ 세포를 단리시키는 단계; 또는
    분화를 겪는 세포 집단으로부터 상기 CD34+CD43- 세포를 단리시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포 분화에서 확정적 조혈 내피세포를 동정하는 방법.
  54. 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법으로서,
    확정적 HE 세포를 얻기 위해, Wnt 경로 작용제를 포함하는 배지에서 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포 유래 중배엽 세포를 배양시키는 단계를 포함하되;
    상기 얻어진 확정적 HE 세포는 상기 Wnt 경로 활성자 없이 배양하는 것에 비해,
    (i) 세포 집단에서 수 및 백분율이 증가되고/되거나
    (ii) 분화에서 증가된 효능을 갖고/갖거나;
    (iii) HE 세포성이 개선된,
    만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 배지는 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 더 포함하는, 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 만능 줄기세포 만능 줄기세포는 iPSC인, 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 상기 만능 줄기세포-유래 확정적 HE에서 유지된, 만능 줄기세포 유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  59. 항원-특이적 유도 만능 줄기세포(iPSC) 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 공여자-, 질환-, 또는 치료 반응- 특이적인 선택된 공급원으로부터 1차 항원 특이적 T 세포를 단리시키는 단계;
    b) 만능 줄기세포를 얻기 위해, 상기 1차 항원-특이적 T 세포를 재프로그래밍하는 단계; 및
    c) 단계 b)의 상기 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계로서,
    (i) 중배엽 세포를 얻기 위해, 상기 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 상기 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF, 및 WNT 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 분화를 지시하는 단계를 포함하되;
    중배엽 세포 및 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 배상체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 얻어지는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 1차 항원 특이적 T 세포를 단리시키는 단계는 관심 대상의 항원(들)을 인식하는 풍부화된 1차 항원 특이적 T 세포를 얻기 위해, 하기 단계들에 의해 상기 1차 항원 특이적 T 세포를 풍부화시키는 단계를 더 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법:
    (i) 상기 1차 항원 특이적 T 세포를 관심 대상의 항원(들)을 발현시키는 종양 세포 또는 관심 대상의 상기 세포-발현된 항원을 인식하는 항원-특이적 T 세포의 더 빠른 증식을 가능하게 하는 관심 대상의 항원(들)을 발현시키는 비-형질전환 세포와 공동 배양시키는 단계;
    (ii) 상기 1차 항원 특이적 T 세포를 수지상 세포, 흉선 상피 세포, 내피세포 또는 인공 항원 제시 세포, 혈장 입자 또는 관심 대상의 펩타이드 발현 항원(들)과 공동 배양시키는 단계; 또는
    (iii) 관심 대상의 항원(들)에 특이적인 T 세포 수용체-특이적 결합제를 이용하여 상기 1차 항원 특이적 T 세포를 분류하는 단계.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 세포를 재활성화하기 위해 전사 인자 또는 소분자를 이용하여 상기 1차 항원 특이적 T 세포 또는 풍부화된 1차 항원 특이적 T 세포를 조정하는 단계를 더 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  62. 제59항에 있어서, 단계 b)는,
    재프로그래밍 동안에 또는 후에 유전자 편집에 의해 상기 만능 줄기세포에 하나 이상의 유전자 각임을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 유전자 각인은 상기 만능 줄기세포의 상기 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻어진 하나 이상의 유전자 변형된 양상을 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 표적화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 표적 후보; 2차 또는 3차 항원 특이성을 전달하는 세포 표면 단백질; 또는 상기 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP의 결실 또는 감소된 발현; (ii) HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, 또는 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 대한 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 표면 촉발 수용체는 T, NK, NKT, 대식세포 및 호중구를 포함하는 상기 조혈 계통 세포에 대해 보편적인, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  68. 제64항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중 특이성 관여자는 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포 또는 호중구를 포함하는, 항원-특이적 유도 만능 줄기세포 및 유도체 조혈 계통 세포를 생성하는 방법.
  71. 제59항 내지 제70항의 방법을 이용하는 항원-특이적 유도 만능 줄기세포(iPSC) 또는 유도체 조혈 계통 세포.
  72. 제71항의 항원-특이적 유도 만능 줄기세포(iPSC) 또는 유도체 조혈 계통 세포를 포함하는 조성물.
  73. 제71항의 유도 만능 줄기세포(iPSC) 또는 유도체 조혈 계통 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함하는, 약제학적 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 조혈 계통 세포의 표면 수용체와 결합하기 위한 하나 이상의 이중- 또는 다중-특이적 관여자를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는
    a) 조혈 계통 세포 유형 특이적이되, 상기 관여자는 CD3, CD16, CD64 또는 CD89를 포함하는 표면 수용체에 특이적이거나; 또는
    b) 조혈 계통 세포 유형 독립적이되, 상기 조혈 계통 세포는 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하고, 상기 관여자는 상기 보편적 표면 촉발 수용체에 특이적인, 약제학적 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 보편적 표면 촉발 수용체는 항-에피토프 및 공자극 도메인을 포함하되, 상기 항-에피토프는 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자에 특이적인, 약제학적 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 IL2를 포함하는, 약제학적 조성물.
  78. 제75항에 있어서, 상기 이중- 또는 다중-특이적 관여자는 종양 세포의 상기 표면 상의 하나 이상의 종양-특이적 항원에 특이적인, 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD30, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2 및 CEA 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  80. 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료적 용도로서, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 갖는, 치료적 용도.
  81. 유도 만능 줄기세포 및 이의 유도체 세포의 클론성을 결정하기 위한 방법으로서,
    a) 유도 만능 줄기세포(iPSC)를 얻기 위해, 성숙 공급원 T 또는 B 세포를 재프로그래밍하는 단계; 및 선택적으로,
    b) 단계 a)의 상기 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 단계;
    및
    c) 상기 iPSC 또는 상기 조혈 계통 세포에서, 상기 iPSC 및 조혈 계통 세포를 생성하기 위해 상기 성숙 공급원 T 또는 B 세포에 포함된 것과 동일한 특정 V(D)J 재조합의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 유도 만능 줄기세포 및 이의 유도체 세포의 클론성을 결정하기 위한 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    iPSC 또는 조혈 계통 세포가 유래된 상기 성숙 공급원 T 또는 B 세포와 동일한 V(D)J 재조합을 포함하는 iPSC 또는 조혈 계통 세포를 단리시키는 단계를 더 포함하는, 유도 만능 줄기세포 및 이의 유도체 세포의 클론성을 결정하기 위한 방법.
  83. 제81항에 있어서,
    재프로그래밍을 위한 성숙 공급원 T 또는 B 세포를 얻는 단계; 및
    상기 성숙 공급원 T 또는 B 세포에 특이적인 면역글로불린(Ig) 또는 T 세포 수용체(TCR)에 포함된 V(D)J 재조합을 결정하는 단계를 더 포함하는, 유도 만능 줄기세포 및 이의 유도체 세포의 클론성을 결정하기 위한 방법.
  84. 세포 요법에서 생체내 입양 세포를 추적하는 방법으로서,
    요법을 위해 입양 세포를 받는 대상체로부터 혈액, 조직 또는 종양 생검의 샘플을 얻는 단계로서, 상기 입양 세포는 성숙 공급원 T 또는 B 세포로부터 재프로그래밍된 만능 줄기세포로부터 유래되되, 상기 성숙 공급원 T 또는 B 세포는 특정 V(D)J 재조합을 포함하는, 상기 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플에서 효과기 세포를 단리시키는 단계;
    상기 효과기 세포에서 상기 V(D)J 재조합을 결정하는 단계를 포함하되,
    상기 성숙 공급원 T 또는 B 세포와 동일한 V(D)J 재조합의 존재는 입양 세포 귀소, 지속성 및/또는 확장을 나타내는, 세포 요법에서 생체내 입양 세포를 추적하는 방법.
  85. 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법으로서, (i) 중배엽 세포를 얻기 위해, 상기 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 얻기 위해, 상기 중배엽 세포를 BMP 경로 활성자, bFGF, 및 WNT 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 상기 중배엽 세포는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프레-T 세포 전구 세포, 프레-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 B 세포를 포함하는 조혈 계통 세포를 제공할 수 있고; 중배엽 세포 및 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포는 배상체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 얻어지는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 확정적 HE 세포를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제, 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자, IGF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  88. 제86항에 있어서, 프레-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO 및 IL7으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  89. 제86항에 있어서, 프레-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 얻기 위해, 상기 확정적 HE 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성자, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  90. 제85항에 있어서, 단계 (i) 전에, 세포를 파종 및 확장시키기 위해, 상기 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  91. 제85항에 있어서, 상기 만능 줄기세포, 상기 중배엽 세포, 및/또는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 상기 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포를 처리하는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  92. 제85항에 있어서, 조혈 계통 세포로의 상기 만능 줄기세포 분화는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없거나, 또는 본질적으로 없는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  93. 제85항에 있어서, 조혈 계통 세포로의 상기 만능 줄기세포 분화는 무 피더(feeder-free) 조건 하에서인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  94. 제85항에 있어서, 조혈 계통 세포로의 상기 만능 줄기세포 분화는 무 기질(stromal-free) 하에서인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  95. 제85항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 유도 만능 줄기세포(iPSC)를 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 분화된 상기 조혈 계통 세포에서 보유되는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  98. 제85항에 있어서, 조혈 계통 세포는 확정적 조혈 내피세포, 조혈 다능성 전구 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포; B 세포, 대식세포 및 호중구 중 하나 이상을 포함하는, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  99. 제85항에 있어서, 상기 WNT 경로 활성자는 GSK3 저해제인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 GSK3 저해제는 CHIR99021인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  101. 제85항에 있어서, 상기 BMP 경로 활성자는 BMP4인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  102. 제86항에 있어서, 상기 ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y-27632인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  103. 제86항에 있어서, 상기 ROCK 저해제는 Y-27632인, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 지시하는 방법.
  104. 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법으로서,
    만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체 또는 T 세포를 얻기 위해, 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는, 상기 접촉시키는 단계를 포함하되,
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 프레-T 세포 전구체는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지고,
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포는 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자, IGF, 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지며; 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지며, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고, 그리고
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시킴으로써 얻어지는, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  105. 제104항에 있어서,
    상기 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  106. 제104항에 있어서, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 것은 (i) 배상체를 생성하는 단계의 결여; (ii) 단일층 배양 하에서; (iii) 무 피더 조건 하에서; 및/또는 (iv) 무 기질 조건 하에서인, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  107. 제104항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 iPSC인, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, 상기 iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 그로부터 유래된 T 계통 세포에서 보유된, 만능 줄기세포-유래 T 계통 세포를 생성하는 방법.
  110. 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법으로서,
    만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체 또는 NK 세포를 얻기 위해, 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체를 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없고;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 프레-NK 세포 전구체는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지며;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포는 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자, IGF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지고, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없으며;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지고, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고; 그리고
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시킴으로써 얻어지는, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 및/또는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 확정적 조혈 내피세포를 처리하는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  112. 제110항에 있어서, 상기 세포를 파종 및 확장시키기 위해 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  113. 제110항에 있어서, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 것은 (i) 배상체를 생성하는 단계의 결여; (ii) 단일층 배양 하에서; (iii) 무 피더 조건 하에서; 및/또는 (iv) 무 기질 조건 하에서인, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  114. 제110항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 iPSC인, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, 상기 iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 유래된 NK 계통 세포에서 보유된, 만능 줄기세포-유래 NK 계통 세포를 생성하는 방법.
  117. 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법으로서,
    만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 얻기 위해, 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성자, IGF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지며, 상기 조성물은 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고; 그리고
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시키는 단계에 의해 얻어지는, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  118. 제117항에 있어서,
    상기 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해, 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  119. 제117항 및 제118항에 있어서, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 및/또는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 확정적 조혈 내피세포를 처리하는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  120. 제117항에 있어서, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 것은 (i) 배상체를 생성하는 단계의 결여; (ii) 단일층 배양 하에서; (iii) 무 피더 조건 하에서; 및/또는 (iv) 무 기질 조건 하에서인, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  121. 제117항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 iPSC인, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 유래된 상기 확정적 조혈 내피세포에서 보유된, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 생성하는 방법.
  124. 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법으로서,
    만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 얻기 위해, 만능 줄기세포-유래 프레-HSC를 BMP 활성자, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 ROCK 저해제가 없고;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 프레-HSC는 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포를 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지며;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해 상기 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포는 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 확정적 HE 퍼텐셜을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없으며;
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해, 상기 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 얻어지되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고; 그리고
    세포 분화 및 확장을 허용하기 위해 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로 bFGF와 접촉시키시킴으로서 얻어지는, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  125. 제124항에 있어서,
    상기 만능 줄기세포를 파종 및 확장시키기 위해, 만능 줄기세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 조성물은 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  126. 제124항 및 제125항에 있어서, 파종된 만능 줄기세포, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포, 확정적 조혈 내피세포 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 및/또는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 분압 하에서 확정적 조혈 내피세포를 처리하는 단계를 더 포함하는, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 것은 (i) 배상체를 생성하는 단계의 결여; (ii) 단일층 배양 하에서; (iii) 무 피더 조건 하에서; 및/또는 (iv) 무 기질 조건 하에서인, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  128. 제126항에 있어서, 상기 만능 줄기세포는 iPSC인, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 iPSC로부터 유래된 다능성 전구체에서 보유된, 만능 줄기세포-유래 조혈 다능성 전구체를 생성하는 방법.
  131. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 생성된 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 이용하여 입양 세포 요법을 촉진시키는 방법으로서, 상기 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포는:
    (i) 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE)로서, 상기 iHE 세포주 또는 클론 세포는 CD34+, 및 CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73- 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나인, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피;
    (ii) 상기 iMPP 세포가 CD34+CD45+인, 만능 줄기세포-유래 다능성 전구 세포;
    (iii) T 세포 전구체가 CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+인, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체;
    (iv) T 세포가 CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+인, 만능 줄기세포-유래 T 세포;
    (v) NK 세포 전구체가 CD3-CD45+CD56+CD7+인, 만능 줄기세포 유래 NK 세포 전구체;
    (vi) NK 세포가 CD3-CD45+CD56+이고, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 추가로 정해지는, 만능 줄기세포-유래 NK 세포;
    (vii) NKT 세포가 CD45+Vα24Jα18+CD3+인, 만능 줄기세포-유래 NKT; 및
    (viii) B 세포가 CD45+CD19+인, 만능 줄기세포-유래 B 세포
    로부터 선택되는, 입양 세포 요법을 촉진시키는 방법.
  132. 제131항에 있어서, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 생성된 상기 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포는 상기 세포 집단, 세포주 또는 클론 세포가 유래된 상기 만능 세포에 포함된 유전자 각인을 포함하는, 입양 세포 요법을 촉진시키는 방법.
  133. 조성물로서,
    (a) 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는, 배양 배지; 및
    (b) 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법으로부터 생성된 하나 이상의 세포 집단:
    (i) iHE 세포가 CD34+, 및 CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73-, 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나인, 만능 줄기세포-유래 확정적 조혈 내피세포(iHE);
    (ii) iHSC가 CD34+CD45+인, 만능 줄기세포-유래 확정적 HSC;
    (iii) iMPP 세포가 CD34+CD45+인, 만능 줄기세포-유래 다능성 전구 세포;
    (iv) T 세포 전구체가 CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+인, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체;
    (v) T 세포가 CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+인, 만능 줄기세포-유래 T 세포;
    (vi) NK 세포 전구체가 CD45+CD56+CD7+인, 만능 줄기세포-유래 NK 세포 전구체; 및
    (vii) NK 세포가 CD3-CD45+CD56+이고, 및 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+로 추가로 나타내는, 만능 줄기세포-유래 NK 세포,
    (viii) NKT 세포가 CD45+Vα24Jα18+CD3+인, 만능 줄기세포-유래 NKT 세포; 및
    (ix) B 세포가 CD45+CD19+인, 만능 줄기세포-유래 B 세포
    를 포함하는, 조성물.
  134. 제133항에 있어서, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법으로부터 생성된 하나 이상의 세포 집단은 상기 하나 이상의 세포 집단이 유래된 상기 만능 세포에 포함된 유전자 각인을 포함하는, 조성물.
  135. 만능 줄기세포-유래 조혈 계통 세포 및
    (i) CD34+ HE 세포(iCD34), 및 iCD34-C, iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지;
    (ii) 확정적 조혈 내피세포(iHE), 및 iCD34-C, iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지;
    (iii) 확정적 HSC, 및 iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지;
    (iv) 다능성 전구 세포(iMPP), 및 iMPP-A;
    (v) T 세포 전구체(ipro-T), 및 iTC-A2, 및 iTC-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지;
    (vi) T 세포(iTC), 및 iTC-B2;
    (vii) NK 세포 전구체(ipro-NK), 및 iNK-A2, 및 iNK-B2로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지; 및 (viii) NK 세포(iNK), 및 iNK-B2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배양 배지를 포함하되,
    iCD34-C는 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하고;
    iMPP-A는 BMP 활성자, ROCK 저해제, 및 1종 이상의 성장 인자 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하며;
    iTC-A2는 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고;
    iTC-B2는 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하며;
    iNK-A2는 ROCK 저해제; 1종 이상의 성장 인자 및 VEGF, 및 bFGF SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하고, 그리고
    iNK-B2는 1종 이상의 성장 인자 및 SCF, Flt3L, IL3, IL7 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는, 조성물.
  136. 제135항에 있어서, iCD34-C는 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없고/없거나; iTC-A2 및 iNK-A2는 BMP 활성자가 없고/었거나; iTC-B2 및 iNK-B2는 VEGF, bFGF, BMP 활성자 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는, 조성물.
  137. 제135항에 있어서, 상기 만능 줄기세포 만능 줄기세포는 iPSC인, 조성물.
  138. 제137항에 있어서, 상기 iPSC는 미경험 iPSC이고/이거나, iPSC는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는, 조성물.
  139. 제138항에 있어서, 상기 iPSC에 포함된 상기 하나 이상의 유전자 각인은 상기 만능 줄기세포-유래 조혈 계통 세포에서 보유되는, 조성물.
  140. 제85항 내지 제130항 중 어느 한 항에 의해 제조된 만능 세포 유래 조혈 계통 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함하는 약제학적 조성물.
  141. 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 제140항의 약제학적 조성물의 치료적 용도로서, 상기 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 암 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스, 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 갖는, 치료적 용도.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021096218A1 (ko) * 2019-11-13 2021-05-20 연세대학교 산학협력단 혈관 내피세포 순수 분리 방법, 혈관 내피세포 특성 유지 배지 및 이를 포함하는 배양 방법
WO2022169297A1 (ko) * 2021-02-05 2022-08-11 의료법인 성광의료재단 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법
WO2022169300A1 (ko) * 2021-02-05 2022-08-11 의료법인 성광의료재단 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법
WO2023038436A1 (ko) * 2021-09-10 2023-03-16 의료법인 성광의료재단 전분화능 줄기세포 유래 조혈모세포 제조방법 및 상기 제조된 조혈모세포를 이용한 인간화 마우스 모델 제작방법
KR20230173249A (ko) 2022-06-16 2023-12-27 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) Dusp6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도
WO2024101919A1 (ko) * 2022-11-10 2024-05-16 의료법인 성광의료재단 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6800859B2 (ja) 2015-01-26 2020-12-16 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 造血細胞分化を誘導するための方法および組成物
EA201792414A1 (ru) 2015-05-04 2018-06-29 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Антитела против cd166, активируемые антитела против cd166 и способы их применения
EP3324982A4 (en) 2015-07-21 2019-01-09 The Children's Medical Center Corporation HEMATOPOIETIC STEM CELLS EXPRESSING PD-L1 AND USES
AU2016348342B2 (en) * 2015-11-04 2023-07-06 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
PT3371314T (pt) 2015-11-04 2023-08-31 Fate Therapeutics Inc Modificação genómica de células pluripotentes
US11413309B2 (en) 2016-01-20 2022-08-16 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
JP2019506861A (ja) 2016-02-01 2019-03-14 シーダーズ−サイナイ メディカル センター マイクロ流体装置における腸細胞の成長のためのシステム及び方法
EP3443075B1 (en) * 2016-04-15 2022-09-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
CA3035660A1 (en) 2016-09-06 2018-03-15 The Children's Medical Center Corporation Immune cells derived from induced pluripotent stem cell
WO2018106595A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2018140647A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
WO2018147801A1 (en) * 2017-02-07 2018-08-16 Agency For Science, Technology And Research Methods and kits for generating mimetic innate immune cells from pluripotent stem cells
JP2020507349A (ja) 2017-02-09 2020-03-12 インダプタ セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたナチュラルキラー（ｎｋ）細胞ならびにその組成物および方法
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
TW201834669A (zh) * 2017-03-15 2018-10-01 美商歐卡生物系統公司 用於造血幹細胞移植的組合物及方法
US11414648B2 (en) 2017-03-24 2022-08-16 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium
EA201992483A1 (ru) * 2017-04-26 2020-03-06 Киото Юниверсити Маркер гемопоэтических клеток-предшественников
JP2020531045A (ja) 2017-07-14 2020-11-05 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｃｄ１６６抗体およびその使用
AU2018313167A1 (en) * 2017-08-08 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor mediated cell targeting
KR102167548B1 (ko) * 2017-09-21 2020-10-19 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
US11879137B2 (en) 2017-09-22 2024-01-23 The Children's Medical Center Corporation Treatment of type 1 diabetes and autoimmune diseases or disorders
CA3077344A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regents Of The University Of Minnesota Methods of making, expanding, and using a human progenitor t cell
MX2020005701A (es) 2017-12-22 2020-10-28 Fate Therapeutics Inc Células efectoras inmunitarias potenciadas y usos de las mismas.
US20200399602A1 (en) * 2018-01-18 2020-12-24 Agency For Science, Technology And Research Method for Differentiation of Human Pluripotent Stem Cell Lines in Suspension Culture
WO2019195800A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Cedars-Sinai Medical Center Novel differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
US20210033628A1 (en) * 2018-04-30 2021-02-04 Cedars-Sinai Medical Center Diagnostic and drug screening for molecular signatures of early onset sporadic parkinson's disease
US20210238550A1 (en) * 2018-07-31 2021-08-05 Thyas Co. Ltd. METHOD FOR PRODUCING REGENERATED T CELL POPULATION VIA iPS CELLS
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
CN109266618B (zh) * 2018-10-18 2021-04-23 赛元生物科技(杭州)有限公司 能够靶向肿瘤细胞的巨噬细胞及其制备方法
KR20210129105A (ko) 2019-02-15 2021-10-27 에디타스 메디신, 인코포레이티드 면역치료법을 위한 변형된 자연 살해(nk) 세포
KR20220004126A (ko) * 2019-04-26 2022-01-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 유도 다능성 줄기 세포로부터 생체내에서 기능적이고 환자-특이적인 흉선 조직의 생성
WO2020227677A1 (en) * 2019-05-09 2020-11-12 Figene, Llc Fibroblast generated patient-specific vaccines
CN110106144B (zh) * 2019-05-17 2021-10-08 苏州大学 一种诱导造血干细胞向前t系细胞分化的方法和试剂盒
CN114390914A (zh) * 2019-08-05 2022-04-22 诺沃库勒有限责任公司 通过抑制il11活性增加癌细胞对肿瘤治疗场(ttfield)的敏感性
GB201911953D0 (en) * 2019-08-20 2019-10-02 Adaptimmune Ltd T cell production fram RAG inacivated iPSCs
GB201911957D0 (en) * 2019-08-20 2019-10-02 Adaptimmune Ltd Methods of producing haemogenic progenitor cells from pluripotent stem cells
BR112022003083A2 (pt) * 2019-08-20 2022-08-02 Adaptimmune Ltd Meio de cultura para indução hematopoiética
EP4041759A4 (en) * 2019-10-07 2023-12-20 Fate Therapeutics, Inc. IMPROVED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR IMMUNE EFFECTOR CELL CULTURE AND USE THEREOF
US20240131156A1 (en) * 2019-10-17 2024-04-25 Fate Therapeutics, Inc. Enhanced chimeric antigen receptor for immune effector cell engineering and use thereof
AU2020381537A1 (en) * 2019-11-14 2022-06-09 Amgen Inc. Hematopoietic precursor cell production
AR121455A1 (es) * 2020-02-28 2022-06-08 Millennium Pharm Inc Método para producir linfocitos citolíticos naturales a partir de citoblastos pluripotentes
WO2021173458A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Purdue Research Foundation Generating aorta-gonad-mesonephros-like hematopoietic cells from human pluripotent stem cells under a defined condition
WO2021207251A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Generating populations of human blood and blood vessel progenitors from pluripotent stem cells
AU2021259612A1 (en) * 2020-04-21 2022-11-10 Intima Bioscience, Inc. Cellular vaccine platform and methods of use
CN111808812B (zh) * 2020-08-31 2020-12-15 首都医科大学附属北京友谊医院 一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法
US20240026295A1 (en) * 2020-09-24 2024-01-25 Edigene (Guangzhou) Inc. Use of compound for improving transplantation efficiency of human hematopoietic stem cells
CN112119977B (zh) * 2020-10-15 2021-10-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Cd317诱导的抑郁和记忆损伤的小鼠模型的构建方法及其应用
WO2022093749A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 Editas Medicine, Inc. Methods of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (adcc) using modified natural killer (nk) cells
CN114525257A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Tim-3阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
EP4251741A1 (en) 2020-11-30 2023-10-04 CRISPR Therapeutics AG Gene-edited natural killer cells
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
US11473060B2 (en) 2020-12-30 2022-10-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells
GB202102297D0 (en) * 2021-02-18 2021-04-07 Adaptimmune Ltd Methods of Producing Haemogenic Endothelial Cells from Pluripotent Stem Cells
CN112831461B (zh) * 2021-02-26 2023-08-08 澳门大学 一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物
WO2022226337A1 (en) * 2021-04-22 2022-10-27 Artec Biotech, Inc. Method for producing hematopoietic cells from stem cells using vascular organoids
AU2022272317A1 (en) * 2021-05-14 2023-11-30 Appia Bio, Inc. Production of engineered t cells from stem cells
AU2022292988A1 (en) * 2021-06-15 2024-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing natural killer cells from pluripotent stem cells
WO2023019213A1 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Simcere Innovation, Inc. Three-dimensional culturing of pluripotent stem cells to produce hematopoietic stem cells
EP4388082A1 (en) * 2021-08-19 2024-06-26 Cedars-Sinai Medical Center Ipsc-derived immune cells in prophylaxis and treatment of age-associated and neurodegenerative diseases
CN113801846B (zh) * 2021-09-22 2024-06-04 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法
WO2023138680A1 (zh) * 2022-01-20 2023-07-27 科济生物医药（上海）有限公司 诱导细胞分化的方法
CN114350608B (zh) * 2022-01-27 2024-05-28 昭泰英基生物医药（香港）有限公司 一种诱导t细胞重编程为类nk细胞的组合物及其应用
CN114702591B (zh) * 2022-05-17 2022-09-23 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 成体细胞衍生的类器官制备技术
CN114774365B (zh) * 2022-06-16 2022-08-23 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用
WO2023246820A1 (zh) * 2022-06-20 2023-12-28 上海优替济生生物医药有限公司 体外诱导干细胞样记忆细胞的化合物及其应用
WO2023247722A1 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Fondazione Telethon Ets Method for isolating hemogenic endothelial cells
CN114958771B (zh) * 2022-06-27 2023-12-05 广东康盾创新产业集团股份公司 一种ipsc-car-nk细胞的制备方法
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024036105A2 (en) * 2022-08-11 2024-02-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Method for generating cells of the t cell lineage with engineering broadly reactive human notch ligand
WO2024059070A1 (en) * 2022-09-13 2024-03-21 R.P. Scherer Technologies, Llc Method of differentiation of pluripotent stem cells to hematopoietic precursor and stem cells
WO2024059584A1 (en) * 2022-09-14 2024-03-21 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
CN116445408B (zh) * 2023-05-22 2024-02-02 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 LSD1抑制剂在促进iPSC向HSC分化和HSC干性维持中的应用
CN116574672B (zh) * 2023-07-11 2023-10-20 北京北启生物医药有限公司 一种诱导化学诱导多能干细胞向生血内皮细胞分化的培养基及方法
CN117050940B (zh) * 2023-10-11 2024-01-26 苏州艾凯利元生物科技有限公司 一种制备自然杀伤细胞的方法
CN117106714B (zh) * 2023-10-11 2024-01-26 苏州艾凯利元生物科技有限公司 一种制备b细胞的方法
CN117050941B (zh) * 2023-10-11 2024-01-26 苏州艾凯利元生物科技有限公司 一种制备自然杀伤细胞的方法

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US5780300A (en) 1995-09-29 1998-07-14 Yale University Manipulation of non-terminally differentiated cells using the notch pathway
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
DE69839444D1 (de) 1997-06-13 2008-06-19 Ludwig Inst Cancer Res Smad 6 und dessen anwendungen
PT993439E (pt) 1997-07-01 2004-12-31 Warner Lambert Co Derivados de acido 4-bromo ou 4-iodofenilaminobenzidroxamico e sua utilizacao como inibidores de mek
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
DE60130435T2 (de) 2000-02-24 2009-07-23 Invitrogen Corp., Carlsbad Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen
CN1219753C (zh) 2000-07-19 2005-09-21 沃尼尔·朗伯公司 4－碘苯氨基苯氧肟酸的氧合酯
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US6689744B2 (en) 2000-09-22 2004-02-10 Genentech, Inc. Notch receptor agonists and uses
US7399633B2 (en) 2000-10-27 2008-07-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for immortalizing cells
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
SI1456380T1 (sl) 2001-11-02 2012-11-30 Giuliani Int Ltd Smad inhibitorji za zdravljenje cns bolezni
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
HUE025767T2 (en) 2002-03-13 2016-05-30 Array Biopharma Inc N3-alkylated benzimidazole derivatives as MEK inhibitors
US7575925B2 (en) 2002-12-10 2009-08-18 Sunnybrook Health Sciences Centre Cell preparations comprising cells of the T cell lineage and methods of making and using them
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2004293019B2 (en) 2003-11-19 2010-10-28 Array Biopharma Inc. Bicyclic inhibitors of MEK and methods of use thereof
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP2295588B1 (en) 2004-05-27 2018-03-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses thefor
US20070036769A9 (en) 2004-06-03 2007-02-15 Linheng Li BMP pathway methods and compositions
ES2405785T3 (es) 2005-05-18 2013-06-03 Array Biopharma Inc. Inhibidores heterocíclicos de MEK y métodos de uso de los mismos
WO2007088651A1 (ja) 2006-02-01 2007-08-09 The University Of Tokyo ＴＧＦ－βシグナル阻害剤と抗腫瘍剤の組み合せ使用
WO2007112084A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Children's Medical Center Corporation Method to modulate hematopoietic stem cell growth
JP4960450B2 (ja) 2006-07-14 2012-06-27 ノバルティス アーゲー Ａｌｋ−５阻害剤としてのピリミジン誘導体
KR20090115142A (ko) 2007-01-30 2009-11-04 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 초기 중배엽 세포，내배엽 및 중배엽 계통의 생성에 유용한 중내배엽 세포의 안정한 집단 및 다능성 유주 세포（ｍｍｃ）
EP2141997B1 (en) 2007-03-30 2012-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
WO2009097140A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods for off -the -shelf tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors
WO2009104825A1 (en) * 2008-02-18 2009-08-27 Kaist Method for inducing the defferentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
CA2745266C (en) 2008-12-03 2018-04-10 Yue Xu Stem cell cultures
US8993343B2 (en) * 2009-01-28 2015-03-31 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology CD93 or use of soluble fragment thereof
EP2398897B1 (en) * 2009-02-20 2017-06-28 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for the differentiation of stem cells
WO2010099539A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Cellular Dynamics International, Inc. Differentiation of pluripotent cells
AU2010235161B2 (en) 2009-04-09 2015-01-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
MX337982B (es) 2009-10-16 2016-03-30 Scripps Research Inst Induccion de celulas pluripotentes.
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
US9206394B2 (en) 2010-02-03 2015-12-08 The University Of Tokyo Method for reconstructing immune function using pluripotent stem cells
JPWO2011096482A1 (ja) 2010-02-03 2013-06-13 国立大学法人 東京大学 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法
WO2011115308A1 (en) * 2010-03-18 2011-09-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into mesodermal cells
WO2011159726A2 (en) 2010-06-14 2011-12-22 The Scripps Research Institute Reprogramming of cells to a new fate
ES2670842T3 (es) 2010-06-15 2018-06-01 Cellular Dynamics International, Inc. Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de pequeños volúmenes de sangre periférica
US8945868B2 (en) 2010-07-21 2015-02-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a HLA locus
BR112013002811A8 (pt) 2010-08-05 2020-01-28 Wisconsin Alumni Res Found meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano
CN106214701B (zh) 2010-08-12 2020-09-25 菲特治疗公司 改进的造血干细胞和祖细胞疗法
US9181529B2 (en) 2010-10-19 2015-11-10 Cellular Dynamics International, Inc. Titration of differentiation medium components
CA2822638C (en) 2010-12-22 2021-02-16 Fate Therapeutics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of ipscs
US8700106B2 (en) 2011-03-09 2014-04-15 Universal Electronics Inc. System and method for provision of infrared signalling in smart phone devices
CN102732483B (zh) * 2011-03-31 2014-12-03 北京大学 造血祖细胞的制备方法及其专用培养基
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2013009825A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for cell reprogramming and genome engineering
JP5872041B2 (ja) * 2011-08-16 2016-03-01 サムスン ライフ パブリック ウェルフェア ファンデーション 幹細胞由来微小胞を含む神経生成促進用組成物
AU2012298997B2 (en) * 2011-08-23 2018-10-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Angiohematopoietic progenitor cells
CN102329769B (zh) * 2011-09-28 2013-07-31 浙江大学 一种获得造血干细胞的方法
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
AU2012324017A1 (en) 2011-11-21 2013-06-06 University Health Network Population of hematopoietic progenitors and methods of enriching stem cells therefor
AU2012321088B8 (en) 2011-12-02 2016-12-15 Fate Therapeutics, Inc. Enhanced stem cell composition
US9428732B2 (en) * 2011-12-05 2016-08-30 Primorigen Biosciences, Inc. Compositions and methods for differentiating pluripotent stem cells into primitive blood cells and uses thereof
AU2012347534B2 (en) 2011-12-08 2018-01-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for enhanced generation of hematopoietic stem/progenitor cells
EP2606884A1 (en) 2011-12-21 2013-06-26 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Inhibitors of notch signaling pathway and use thereof in treatment of cancers
BR112014020625A2 (pt) * 2012-02-24 2017-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res polinucleotídeo, polipeptídeo, composição, célula e célula tronco editada por genoma
WO2013158292A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Hla class ii deficient cells, hla class i deficient cells capable of expressing hla class ii proteins, and uses thereof
DK2839013T3 (da) 2012-04-18 2020-09-14 Univ Leland Stanford Junior Ikke-disruptiv-gen-targetering
EP2841563B1 (en) 2012-04-24 2019-06-12 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
JP6164746B2 (ja) * 2012-05-22 2017-07-19 国立大学法人 東京大学 抗原特異的ｔ細胞の製造方法
IN2014DN10991A (ko) 2012-05-25 2015-09-25 Cellectis
WO2014011540A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Emory University Bone morphogenetic protein pathway activation, compositions for ossification, and methods related thereto
AU2013327136A1 (en) 2012-10-02 2015-04-16 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
WO2014062138A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Agency For Science, Technology And Research Methods of differentiating stem cells into one or more cell lineages
US9382531B2 (en) * 2012-10-22 2016-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Induction of hemogenic endothelium from pluripotent stem cells
US9255250B2 (en) 2012-12-05 2016-02-09 Sangamo Bioscience, Inc. Isolated mouse or human cell having an exogenous transgene in an endogenous albumin gene
EP2934555B1 (en) * 2012-12-21 2021-09-22 Astellas Institute for Regenerative Medicine Methods for production of platelets from pluripotent stem cells
AU2014248651B2 (en) * 2013-03-13 2019-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for hematoendothelial differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions
MX2015013104A (es) 2013-03-15 2016-06-16 Sloan Kettering Inst Cancer Composiciones y métodos para la inmunoterapia.
US9943545B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
PT2981607T (pt) 2013-04-03 2020-11-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Geração eficaz de células t direcionadas a tumores, derivadas de células estaminais pluripotentes
JP2016522679A (ja) * 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
US9381210B2 (en) * 2013-04-15 2016-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Induced pluripotent stem cell model of chronic myeloid leukemia revealed olfactomedin 4 as a novel therapeutic target in leukemia stem cells
WO2014200030A1 (ja) * 2013-06-12 2014-12-18 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の選別方法および血球への分化誘導方法
CN103361310B (zh) * 2013-06-25 2015-09-23 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 培养基、试剂盒及其用途
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US9932607B2 (en) 2013-11-15 2018-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Site-specific integration of transgenes into human cells
AU2015227184B2 (en) 2014-03-04 2021-05-20 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
EP4227318A1 (en) 2014-03-28 2023-08-16 Regents of the University of Minnesota Polypeptides, cells, and methods involving engineered cd16
CN103937743B (zh) * 2014-04-27 2017-12-01 浙江大学 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法
JP6800859B2 (ja) 2015-01-26 2020-12-16 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 造血細胞分化を誘導するための方法および組成物
AU2016211688A1 (en) 2015-01-26 2017-08-10 Fate Therapeutics, Inc. Cells with increased immuno-regulatory properties and methods for their use and manufacture
CN104745529B (zh) * 2015-03-13 2019-03-05 华南生物医药研究院 瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用
US20170020922A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
EP3359184B1 (en) 2015-10-05 2020-05-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene
PT3371314T (pt) 2015-11-04 2023-08-31 Fate Therapeutics Inc Modificação genómica de células pluripotentes
AU2016348342B2 (en) * 2015-11-04 2023-07-06 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
JP7000311B2 (ja) * 2016-03-23 2022-02-04 国立大学法人京都大学 血球分化能の高い中胚葉誘導方法
EP3443075B1 (en) 2016-04-15 2022-09-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021096218A1 (ko) * 2019-11-13 2021-05-20 연세대학교 산학협력단 혈관 내피세포 순수 분리 방법, 혈관 내피세포 특성 유지 배지 및 이를 포함하는 배양 방법
WO2022169297A1 (ko) * 2021-02-05 2022-08-11 의료법인 성광의료재단 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법
WO2022169300A1 (ko) * 2021-02-05 2022-08-11 의료법인 성광의료재단 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포를 이용한 유전자 편집된 세포의 제조방법
WO2023038436A1 (ko) * 2021-09-10 2023-03-16 의료법인 성광의료재단 전분화능 줄기세포 유래 조혈모세포 제조방법 및 상기 제조된 조혈모세포를 이용한 인간화 마우스 모델 제작방법
KR20230173249A (ko) 2022-06-16 2023-12-27 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) Dusp6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도
WO2024101919A1 (ko) * 2022-11-10 2024-05-16 의료법인 성광의료재단 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법

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