JP7000311B2 - 血球分化能の高い中胚葉誘導方法 - Google Patents
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Description
[1]多能性幹細胞と骨形成タンパク質4(bone morphogenetic protein;BMP4)又はCHIRとを3日間以上接触させる工程を含む、中胚葉誘導方法。
[2]多能性幹細胞が更にアクチビンAと接触される、[1]に記載の方法。
[3]前記中胚葉がCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞と、VEGF、bFGF及びTGFβ阻害剤とを接触させる工程を更に含む、[1]~3のいずれか1に記載の方法。
[5]前記接触工程が無血清条件及び/又はフィーダーフリーで実施される、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法であって、[1]~[5]のいずれかに記載の方法で誘導された中胚葉を巨核球細胞に分化誘導する工程を含む、方法。
[7][6]に記載の方法で製造された巨核球から血小板を製造する方法。
[8][7]に記載の方法で製造された血小板を含有する血小板製剤。
[9][7]に記載の方法で製造された血小板を被験者に移植又は輸血する方法。
本発明に係る中胚葉系細胞の製造方法は、多能性幹細胞とBMP4又はCHIRとを3日間接触させる工程を含む。本明細書で使用する場合、「中胚葉」又は「中胚葉系細胞」とはCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞を意味する。また、本発明により誘導される中胚葉は、CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞の中でも、血球分化能の高い細胞である(図14)。
本発明に係る巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法は、上記の方法で製造された中胚葉系細胞から巨核球細胞へと分化誘導する工程を含む。
本発明に係る血小板の製造方法は、上記製造方法で製造された培養物を用いることを特徴とする。より具体的な態様において、本発明に係る血小板の製造方法は、上述の方法で得られた巨核球、巨核球前駆細胞、及び/又は巨核球細胞株を培養し、培養物から血小板を回収する工程を含む。
本発明に係る血小板の移植又は輸血方法は、上記の方法で製造された血小板を被験者に移植又は輸血する工程を含む。本発明の方法に従い製造された血小板は、常用の方法で調製される血小板と同様の方法で輸血可能なものであり、当業者であれば適宜被験者に投与することができる。
ヒトES細胞KhES3株は京都大学末盛博文博士より、ヒトES細胞H1株は、京都大学中畑龍俊博士より提供頂いたものを使用した。実験に用いたICRマウスは日本SLCより購入した。動物実験に関しては、東京大学及び京都大学の規定に従って行った。ヒトES細胞の使用は所定の講習会を受講し、東京大学での使用計画書「ヒト胚性幹細胞からの造血幹細胞および分化血液細胞の誘導」、及び、京都大学iPS細胞研究所での使用計画書「ヒトES細胞からの血球・神経分化に関する研究」に則って行った。
60 mm dishでは2 mL / dish, 100 mm dishでは4 mL / dishのゼラチン液を入れ、全体に分布するようにディッシュを揺らし、37℃で1時間以上インキュベートしコーティングした。
コーティングする6-well plate, 60 mm dishとピペット類は4℃に予め冷やしておいた。4℃で保存してある50倍希釈マトリゲル液を冷えたまま、6-well plateでは2 mL / well, 60 mm dishでは3 mL / dishで添加し、37℃で1時間以上インキュベートしコーティングした。
マウス胎仔線維芽細胞は、ICRマウスE12.5の胎仔を用いて樹立した。妊娠12日目のマウスを安楽死させ、無菌的に子宮を取り出し、用手的に胎仔を胎盤などから分離した。頭部と腹部内蔵を用手的に取り除き、鋏を用いて細かくした。0.05% Trypsin EDTA 1mL / 匹を添加して細胞培養用のフラスコに入れ、室温下に磁気スターラーバーで300 rpmで20分間撹拌し、細胞を分離した。MEF培地を2倍量添加して反応を止め、50mLの遠沈管に移し、400g, 10分遠心分離した後に上清を除去した。ペレットを1匹あたり10 mLのDMEM + 10%FBS + L-glutamine培地を用いて懸濁し、1匹分の細胞を1枚の100 mm dishに播種し、10% CO2, 37.0℃でインキュベートした(day0)。day1に培地を全交換した。day2で細胞を0.05% Trypsin EDTAを用いて剥離し回収、1枚の100mm dishから1.2枚の150 mm dishの計算で継代・拡大培養した。day4に細胞を回収し、4x106cells / tubeでTCプロテクターを用いて-80℃に凍結保存した。
C3H10T1/2細胞はサブコンフルエント時に1枚から8-10枚へ拡大するように希釈し維持継代した。継代は3-4日毎に行い、培地交換は1日おきに行った。
OP9-DL1細胞はサブコンフルエント時に1枚から8-10枚へ拡大するように希釈し維持継代した。継代は3-4日毎に行い、培地交換は1日おきに行った。用いるときは、ゼラチンコートしておいた6-well plateに播種して培養継続し、コンフルエントとしたものを用いた。
培地はKSR培地を用いた。培養中は毎日培地交換を行った。継代はTK溶液を用いて行った。培養上清を吸引除去後、TK溶液を1 mL / dishで添加し、37℃で5分インキュベートした。上清を吸引除去し、KSR培地を3-4 mL添加。タッピングによって底面からコロニーをある程度剥離した。ピペットマン(p1000)によるピペッティングである程度コロニーを細かく砕き、必要量を新しいMEFを播種したディッシュ上に播種した。継代翌日に培地交換し、以後毎日培地交換を行った。
培地はStemFit培地を用いた。1日おきに培地交換を行った。継代時はPBSで2回洗浄した後、TrypLE selectを1 mL / dishで添加して3分 37℃で反応させ、p1000 ピペットマンでピペッティングして15 mL遠沈管に回収した。MEF培地で反応を止め、遠心し上清除去した後にStemFitを1-2 mL添加して懸濁し、細胞カウントした。播種時は、3x104 - 1x105 cells / 60 mm dishで継代し、細胞死を防ぐために培地にY27632を10 mMで添加した。
MEFで維持培養していたヒトES細胞を、継代時と同様にコロニーのままディッシュ底面から剥がし、前日に用意しておいた不活化C3H10T1/2ディッシュに播種した。細胞数カウント出来ないためおおよそになるが、5 x 104-2 x 105 cells / 10cm dishとなるようにした。培地は血球分化用培地にVEGFを終濃度20 ng / mLとなるように添加したものを用いた。必要に応じて、0.05% Trypsin EDTAを用いてシングルセルで回収し、細胞数カウントを行い、Y27632 10 mMとなるように添加してシングルセルのまま分化させた。
マトリゲルで維持培養していたhPSCを、継代時と同様にシングルセルでディッシュから剥がして回収し、マトリゲルコートした60 mm dishに播種した。培地は、CDMまたはStemFit培地にActivinA 50 ng / mL, BMP4 50 ng / mL, CHIR99021 3 mM, NOGGIN 125 ng / mL, DKK-1 100 ng / mL, XAV939 2.5 mMを必要に応じて添加し、day2で同様の組成で培地交換を行った。Day0-2のみ細胞死を抑制するためY27632 10 mMを添加した。
day4で回収した細胞を2x106 cells / 100 mm EZSPHERE dish (AGCテクノグラス)で播種した。血球分化用培地にVEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL, SB431542 10 mM, ヘパリン 10単位 / mLを添加したものを用いた。day7に形成されたスフェロイドをピペッティングで遠沈管に回収し、遠心分離・上清除去後に血球分化用培地で懸濁し、1枚から1-3枚の拡大倍率でPrimeSurface 90 mm dish (住友ベークライト)上に継代した。培地にはVEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL,ヘパリン 10単位 / mLを添加した。以後day10, 12に同組成で培地交換を行った。Day14で、プレート内の細胞全てをピペッティングで撹拌し、40 mmのセルストレーナーを通して50mL遠沈管に回収した。遠心後に上清除去し、血球分化用培地で懸濁して細胞数カウントした。
day4で回収した細胞を抗体で反応させた後に、FACSAriaIIを用いてマトリゲルコートした6-wellに3x104 cell / wellで直接ソーティングした。Wellはマトリゲル液を除去した後に、血球分化用培地 + VEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL, SB431542 10 mM, ヘパリン 10単位 / mL + Y27632 10 mMを添加したものを2 mL / wellで予め入れておいた。
誘導したday14の血球を用いて、各血球種への分化誘導を行った。巨核球誘導では、C3H10T1/2細胞を播種した6-well plateに血球1x105 cells / wellで播種。培地は血球分化用培地を用い、SCF 50 ng / mL, TPO 50 ng / mLを添加した。7日間培養した後に回収し、フローサイトメトリーで解析を行った。
誘導したday14の血球を用いて、コロニー形成能を測定した。Methocult H4434 classic 4 mLに対して血球5x104-1x105個を混和し、60 mm dishに播種した後14日間、37℃ 5% CO2環境下で培養し、形成されたコロニーを顕微鏡下に観察した。
シングルセルの状態の細胞を必要量用意し、蛍光ラベルされた抗体を、細胞数に合わせた量を必要に応じて組み合わせて用いた。抗体を必要量添加後に30分以上4℃でインキュベートして反応させた。その後にSMで希釈し、遠心、上清除去し、必要量のSMPIで懸濁して解析した。解析時にはhPSC由来の細胞とフィーダー細胞が混在している場合は、FSC, SSCのゲート、及びhPSCに発現させたGFPによって分離した。
回収対象の細胞をRNeasyまたはmiRNeasy (QIAGEN)を用いて、使用説明書に準じてRNAを回収した。RNAはPrimeScript2 (TAKARA Bio)またはReverTraAce (TOYOBO)を用いて、使用説明書に準じてcDNA合成した。
2xMasterMix 10 mL / sample
Probe (10 mM) 0.4 mL / sample
Fwd Primer (10 mM) 0.4 mL / sample
Rev Primer (10 mM) 0.4 mL / sample
Template cDNA 1 mL / sample
H2O 7.8 mL / sample
Total 20 mL / sample
1st step (1 cycle) 95℃ 10 minutes
2nd step (40 cycle) 95℃ 10 seconds
60℃ 30 seconds
(https://lifescience.roche.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?tab=Assay+Design+Center&identifier=Universal+Probe+Library&langId=-1))
Affymetrix社製のGeneChipを用いた。解析にはGeneSpring 13.0を用いた。GeneChip(登録商標) WT PLUS Reagent Kitを用いてサンプルRNAを解析した。使用説明書に準じてサンプル調製した。Gene Ontology解析はDAVIDを用いて行った。
hPSCからの血球分化系は細胞表面マーカーを用いて各段階を追跡できる
hPSCから血球までの分化過程は、中胚葉、血球血管前駆細胞を経て血球になることが想定されている。以前に報告された方法(Takayama, N. et al. Blood 111, 5298-5306 (2008))を用いて、この過程を細胞表面マーカーでトレースできるかをヒトES細胞株のKhES3を用いて検証した。
既存の系で十分な分化誘導効率が得られているかどうかを検証するために、Day4のCD56+APJ+細胞とDay10のCD43+細胞の、分化した細胞全体に対する割合を測定した。その結果、初期のステップでは既にCD56+APJ+細胞は20-40%程度の割合(図3A,B)で誘導可能であった。つまり、フィーダー細胞との共培養のみで十分に中胚葉誘導が獲得できることを示唆した。一方でCD43+細胞は全体の数%に留まっており、非常に低効率であることも分かった(図3C,D)。即ち、中期以降のステップにおいては中胚葉を十分に血球に誘導できていないことが示唆された。本研究の目的のためには中胚葉からの血球分化誘導効率はある程度は高い必要があり、改善すべきであると考えられた。
次に、各ステップ段階ごとに機能する個別の重要なシグナル因子を調べることとした。まず初期のステップに関して検証した。
次に中期ステップについて検証した。既存の系ではday10でのCD43+細胞の出現率は1%未満と低効率であった(図3C,D)。血球への誘導効率が低いことは、中胚葉の血球産生能を評価するためには不都合である。具体的には、血球産生能が高い細胞も低い細胞も、血球になる効率が悪いためにどちらも低いと評価してしまう可能性が排除しきれないということである。
初期ステップと中期ステップにおいて重要な因子が複数見つかり、中胚葉の血球分化ポテンシャルを評価する系を立ち上げる準備が出来た。しかし、今までの解析から、day4では半数近くがCD56+APJ+以外の細胞であり、その後も培養環境の中で共存していることから、パラクライン作用などの何らかの作用によって血球分化が影響を受ける可能性が考えられた。CD56+APJ+細胞の割合は試行毎にばらつきがあり(図 7D)、影響が有る可能性は排除する必要があると考えられた。
今までの結果から、各ステップに必要な因子を図8Aに示した。多能性幹細胞から血球までの経路に中胚葉の段階があること、この中胚葉の誘導に必要と考えられる因子群が3つあること、中胚葉の血球産生能を評価できる系が出来上がったことが示された。これらを組み合わせることで、目的である多能性幹細胞から血球までの経路、特に血球の元になる中胚葉が多能性幹細胞からどのように生じるのかを検討する準備が整った。
AB, ACで誘導したCD56+APJ+細胞には血球分化ポテンシャルが備わっており、ABCで誘導したCD56+APJ+細胞からは失われていた。この原因を探るために、それぞれの細胞の遺伝子発現パターンをKhES3を用いて調べた。分化させた細胞からRNAを回収し、遺伝子発現アレイによって解析した結果を図10に示す。図10AにhPSCとday4 AB, AC, ABC間で変動した遺伝子群を用いてクラスタリング解析をした結果を示す。Day0 hPSCと比較して、Day4 AB, AC, ABC間は非常によく似た発現パターンを示した。各比較間の共通部分を解析したVenn図を図10Bに示す。全ての条件に共通していた遺伝子を詳細に見ると、day4細胞では多能性に関連する遺伝子群の発現低下が認められるのと同時に、中胚葉系に特徴的な遺伝子群の発現上昇と、Epithelial-Mesenchymal transition (EMT)関連遺伝子の発現上昇が確認できた。よって、AB, AC, ABC条件で誘導したday4 CD56+APJ+細胞は典型的な中胚葉系細胞の特徴を有していることが分かった。
ABとACの条件で誘導した血球は良く似た遺伝子発現パターンを示したが若干の差も認めた。この差が2つの条件で誘導した血球の機能に影響を及ぼしているかどうかを検証するために、得られたday14の血球前駆細胞をさらに分化させることとした。具体的には、血球前駆細胞の標準的な機能アッセイであるコロニー形成能アッセイ、in vitroで赤芽球・巨核球・T細胞に分化させるアッセイを行った。結果を図11に示した。
ABとACの2つの条件で誘導した血球を、各細胞への分化効率を指標とした比較したところ、有意な差を認めなかった。以上より、得られた血球は機能的に近いと考えられた。
分化初期過程に焦点を当てることで複数の経路の存在を見出した
本研究では、ヒト発生過程を研究するためにhPSCを用いて血球分化系譜を解析した。その結果、既報の複数の論文が示唆しているような単一の発生系譜でなく、主要な液性因子が必須であることは再確認されたものの、その組み合わせによって複数の発生系譜を経て、血液細胞が生み出されていることが初めて明らかにされた。またその制御方法は、液性因子の濃度勾配(グラジエント)による緻密なコントロールに依存していることが強く示唆された。
既存の血球分化プロトコールでは、様々な組み合わせ、様々な方法が用いられていた。特に、EB法では細胞間相互作用がより強く働くため、個々の細胞一つ一つを分離させてコントロールすることが困難であると考えられた。その点では、2次元培養かつ疎な条件下での実験は、一つ一つの細胞の制御をより正確なものとし、増殖因子や阻害剤の作用を均一化することにより安定した評価系の確立に貢献した。細胞間相互作用自体がランダムに血球分化ポテンシャルを持つ中胚葉の誘導を達成する可能性があり、これがプロトコールの冗長性、非統一性に影響していたと考えられる。
本研究の特異的な点は、2種類のシグナルが入ることで血球になる一方、3種類のシグナルが入ることで血球への運命決定を抑制しているということである。既存のプロトコール(Takayama, N. et al. Blood 111, 5298-5306 (2008))では、day10 CD43+細胞は分化由来細胞のうちの1%未満しか存在せず、その他の細胞は全て別の系統に分化しており、分化誘導系の効率が大変低い事が明らかになった(図3D)。day4のCD56+APJ+細胞は再構築後の分化系では最大60%以上が血球になる能力を示していたことから(図4E)、既存のプロトコールには中期~後期のシグナルに問題があると結論付けられた。プロトコールの改善は、VEGF, bFGF, TGFβ阻害によって確立できた。VEGFやbFGFは血管内皮細胞の増殖を促す因子として知られている。Hemangioblastはニワトリの胚の観察から提唱された概念であり、血球と血管の共通前駆細胞として定義されている。ES細胞の系ではBlast colony forming cell (BL-CFC)として呼ばれる。BL-CFCの誘導にはbFGFが必須とされる。また、bFGFはVEGFR2の発現を誘導するとされている(Murakami, M. et al. The Journal of clinical investigation 121, 2668-2678 (2011))。これらのことから、中胚葉からHemangioblastへの特異性獲得、specificationにはこれらが作用していることが予想される。また、TGFβのデータは過去の文献と一貫性がある結果となった(図3C)(Evseenko, D. et al.P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010);Wang, C. et al.Cell Res 22, 194-207 (2012))。TGFβのシグナルは、ALK5を介した場合は血球産生を抑制する一方で、ALK1を介した場合は血球産生が亢進し、これにEndoglinが関与しているという報告がある(Zhang, L. et al. Blood 118, 88-97 (2011))。SB431542はALK5阻害効果を示すため、血球産生の抑制が解除された結果になったと考えられた。
hPSCから血球を誘導するに当たり、研究者の究極の目標となっているのは造血幹細胞の誘導である。全ての血球に分化可能な造血幹細胞は、造血器疾患を主とした様々な疾患の治療に用いられており、応用可能性は極めて広い。
Claims (5)
- 1)多能性幹細胞とアクチビンA及び骨形成タンパク質4(bone morphogenetic protein;BMP4)とを、CHIR-99021、CHIR-98014及び塩基性線維芽細胞増殖因子(Basic fibroblast growth factor;bFGF)の不在下で3日間以上接触させるか、又は2)多能性幹細胞とアクチビンA並びにCHIR-99021及び/又はCHIR-98014とを、BMP4及びbFGFの不在下で3日間以上接触させる第一の工程と、
第一の工程を経ることにより得られるCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞と、VEGF、bFGF及びTGFβ阻害剤とを接触させる第二の工程と、
を含む、血球分化能の高い中胚葉を製造する方法。 - 第二の工程が血清を含む条件で実施される、請求項1に記載の方法。
- 第一及び第二の工程がフィーダーフリーで実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- 巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法であって、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法で製造された血球分化能の高い中胚葉を巨核球細胞に分化誘導する工程を含む、方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の方法で製造された血球分化能の高い中胚葉を巨核球細胞に分化誘導する工程と、
前記工程で得られた巨核球、巨核球前駆細胞、及び/又は巨核球細胞株を培養し、培養物から血小板を回収する工程と、
を含む、血小板を製造する方法。
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