JP6305186B2 - 多能性幹細胞から血液細胞または心筋細胞を製造する方法 - Google Patents
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Description
1.多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、細胞表面におけるCAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)の発現を指標として、血液細胞への分化能を有する細胞または心筋細胞への分化能を有する細胞を単離することを含む、多能性幹細胞から血液細胞または心筋細胞を製造する方法。
2.以下の工程を含む、前項1に記載の製造方法:
1)多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、CARlow/-細胞またはCARhigh細胞を単離する工程;
2)工程1)により単離されたCARlow/-細胞またはCARhigh細胞を培養する工程。
3.工程1)が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、CARlow/-またはCARhighであり、かつ、中胚葉マーカーを発現する細胞を単離する工程である、前項2に記載の製造方法。
4.中胚葉マーカーがFlk1またはKDRであり、中胚葉マーカーを発現する細胞がFlk1+細胞またはKDR+細胞である、前項3に記載の製造方法。
5.前項1〜4のいずれか1に記載の製造方法により得られた、血液細胞または心筋細胞を含む細胞集団。
6.多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団について、細胞表面におけるCARの発現を指標として細胞集団を単離する方法であって、CARlow/-細胞を血液細胞への分化能を有する細胞として選別する、または、CARhigh細胞を心筋細胞への分化能を有する細胞として選別する、細胞集団を単離する方法。
7.前項6の単離方法により得られた、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から選別された、CARlow/-である血液細胞分化誘導用細胞集団。
8.前項6の単離方法により得られた、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から選別された、CARhighである心筋細胞分化誘導用細胞集団。
1)多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、CARlow/-細胞またはCARhigh細胞を単離する工程。
2)工程1)により単離されたCARlow/-細胞またはCARhigh細胞を培養する工程。
マウスES細胞またはマウスiPS細胞を使用する場合、心筋細胞は、誘導した中胚葉細胞(CARhigh細胞)とOP9ストロマ細胞等の支持細胞(フィーダー細胞)との共培養法により製造可能である(FASEB J. 2005 Sep;19(11):1534-1536)。具体的には、血清を含む培地(MEMα(Sigma社製))にCARhigh細胞(好ましくはFlk1+CARhigh細胞)を懸濁し、OP9ストロマ細胞と共培養することにより製造可能である。
ヒトES細胞またはヒトiPS細胞を使用する場合、誘導した中胚葉細胞をゼラチンコートしたプレートへ播種し、CARhigh細胞(好ましくはKDR+CARhigh細胞)を、VEGFおよびbFGF等の液性因子を含む培地(Stempro34培地(Life Technologies社製)で培養することにより製造可能である(Nature. 2008 May 22;453(7194):524-528)。培地中の液性因子の適当な濃度は、多能性幹細胞の種類および使用量によるが、VEGFは1ng/ml〜50ng/ml、bFGFは1ng/ml〜50ng/mlであり得、好ましくは、VEGFは10 ng/ml、bFGFは10 ng/mlであることが適当である。
マウスES細胞はBRC6(理化学研究所バイオリソースセンター)、およびマウスiPS細胞は38C2(京都大学山中伸弥教授よりご供与;Nature. 2007 Jul 19;448(7151):313-317)を用いた。ヒトiPS細胞は、201B7(京都大学山中伸弥教授よりご供与:Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-872.)、Tic(JCRB細胞バンク:JCRB Number JCRB1331)を用いた。
マウスES細胞またはマウスiPS細胞の維持培養は市販のマウスES細胞培養用調整済み培地(Applied StemCell社製)を培養液として用い、マイトマイシンC処理したマウス胚由来線維芽細胞(MEF、Millipore社製)を支持細胞(フィーダー細胞)として用いて継代することにより実施した。また、ヒトiPS細胞の維持培養は市販の霊長類ES細胞用培地(ReproCell社製)にbFGFを混合したものを培養液として用い、マイトマイシンC処理したMEFをフィーダー細胞として用いて、継代することにより維持培養を実施した。
マウスES細胞、マウスiPS細胞については、Stem Cell Res. 2012 Mar;8(2):300-311に記載の方法に準じた。具体的には、まず細胞を0.25%トリプシン−EDTA溶液(Life Technologies社製)により単一細胞懸濁液を調製し、その後、3×103個のマウスES細胞、あるいは1×103個のマウスiPS細胞の単一細胞をLipidureコートした96ウェルプレート(Nunc社製)の1ウェルへ播種し、7日間培養することでEBを形成させた。培養液は血清、2-メルカプトエタノール(Nacalai Tesque社製)を含むDMEMを用いた。
分化誘導後の細胞をPBSで洗浄後、 マウスES細胞、マウスiPS細胞から作製したEB(培養7日目)については0.25% トリプシン-EDTA溶液で、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞(培養8日目)については、Cell dissociation buffer(Life Technologies社製)で37℃、二酸化炭素濃度5%で処理し、単一細胞懸濁液とした。単一細胞に解離しきれなかった細胞塊をメッシュで取り除いた後、CAR発現を指標とした細胞単離を行った。
ヒトiPS細胞の場合は、抗ヒトCAR抗体(Millipore社製)を作用させたあとに、ヒトCAR抗体を認識する2次抗体(蛍光標識済み)(BioLegend社製)で抗体染色を行った。
その後フローサイトメーター(FACS Aria、BD Bioscience社製)にて蛍光強度を測定して、CARlow/-細胞とCARhigh細胞を検出し、それぞれの細胞を単離した。フローサイトメーターによる解析結果を図1および図2に示す。なお、ネガティブコントロールとしては、抗CAR抗体を作用させずに、2次抗体のみを作用させた細胞を用いた。この細胞はCARでは染色されないので、この細胞の蛍光強度をバックグラウンドとした。抗CAR抗体と2次抗体を作用させた細胞の解析においては、ネガティブコントロールの細胞と同程度の蛍光強度を示す細胞集団をCARlow/-細胞として単離し、それより発現が高い細胞集団をCARhigh細胞として単離した。
マウスES細胞、マウスiPS細胞については、培養開始7日目の単離前の全EB細胞、ならびに培養開始7日目に、上記(2)の方法により単離したCARhigh細胞とCARlow/-細胞の単一細胞懸濁液をメチルセルロース培地を用いて10〜14日間培養し、形成された血液細胞コロニーの数と種類を調べることによりコロニーフォーミングアッセイ(コロニーアッセイ)を実施した。
ヒトiPS細胞については、培養開始8日目に、上記(2)の方法により単離したCARhigh細胞とCARlow/-細胞の単一細胞懸濁液をメチルセルロース培地を用いて10〜14日間培養し、形成された血液細胞コロニーの数と種類を調べることによりコロニーフォーミングアッセイ(コロニーアッセイ)を実施した。
実施例1にて単離したマウスES細胞、マウスiPS細胞由来のCARhigh細胞とCARlow/-細胞を、20%血清および50ng/mlマウスSCF(Peprotech社製)、50ng/ml ヒトFlt3L(Peprotech社製)、10ng/mL ヒトTPO(Peprotech社製)、5ng/ml マウスIL-3(R&D Systems社製)、5ng/ml ヒトIL-6(Peprotech社製)、50μM 2-メルカプトエタノール(Nacalai Tesque社製)を含むMEMα培地(Sigma社製)に再懸濁し、それぞれの細胞を1×104個ずつ、セミコンフルエントなOP9ストロマ細胞を支持細胞上で培養した。CARhigh細胞とCARlow/-細胞については、OP9ストロマ細胞と培養を開始した7日後に増殖した血液細胞数を計測した。
実施例1にて単離したヒトiPS細胞由来のCARhigh細胞とCARlow/-細胞を、実施例2と同様に血液細胞への分化誘導を行い、フローサイトメーター(LSRFortessa、BD Bioscience)を用いて白血球のマーカーであるCD45の発現を解析することで血液細胞への分化効率を評価した。培養には20%血清および50ng/ml マウスSCF、50ng/ml ヒトFlt3L、10ng/ml ヒトTPO、10ng/ml ヒトIL-3、10ng/ml ヒトIL-6、50μM 2-メルカプトエタノールを含むMEMα培地を用いた。
実施例1にて単離して単一細胞にしたCARlow/-細胞またはCARhigh細胞(マウスES細胞またはマウスiPS細胞由来)について、FLK1の発現を確認した。発現の確認は実施例1に記載のフローサイトメトリーとRT-PCRにより行った。なお、フローサイトメトリーでは1次抗体としてCARの抗体と同時にFlk1の抗体(e-Bioscience社)を用いた。また、Flk1+CARlow/-細胞、Flk1+CARhigh細胞を単離した。
実施例3において単離したFlk1+CARlow/-細胞、Flk1+CARhigh細胞について、実施例1と同様の手法によりコロニーアッセイと造血系転写因子(Scl、Runx1、Gata-1、Gata-2、Fli-1)の発現解析を行った。
実施例2の手法と同様にして、実施例3において単離したFlk1+CARhigh細胞とFlk1+CARlow/-細胞の血液細胞への分化誘導を行い、細胞数を計測した。
実施例1における造血系転写因子の発現解析と同様の手法により、実施例3において単離したFlk1+CARlow/-細胞について、心筋細胞関連遺伝子(Tbx5、Mesp1、Gata-4、Myl4、cTnT、aMHC)の発現解析を行った。
実施例3において単離したFlk1+CARhigh細胞ならびにFlk1+CARlow/-細胞を、20%血清と50μM 2-メルカプトエタノールを添加したMEMα培地中(Sigma社製)に再懸濁し、セミコンフルエントなOP9ストロマ細胞を支持細胞上で培養した。OP9ストロマ細胞と共培養を開始した7日後の細胞について、抗cTnT抗体(Fisher Scientific社製)を用いた免疫染色と心筋細胞関連遺伝子(Myl4、Myl7、aMHC、cTnT)についてRT-PCR法により発現解析を行うことで、心筋細胞への分化効率を評価した。
ヒトES細胞はKhES-3(京都大学中辻憲夫教授よりご供与:Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jul 7;345(3):926-932)を用いた。ヒトiPS細胞は、201B7(京都大学山中伸弥教授よりご供与:Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-872.)を用いた。
ヒトES細胞またはヒトiPS細胞の維持培養は市販の霊長類ES細胞用培地(ReproCell社製)にbFGFを混合したものを培養液として用い、マイトマイシンC処理したMEFをフィーダー細胞として用いて、継代することにより維持培養を実施した。
培養7日目の胚様体(EB)をPBSで洗浄後、 ヒトES細胞またはヒトiPS細胞から作製したEBについて、0.25%トリプシン-EDTA溶液(Life Technologies社製)で37℃、二酸化炭素濃度5%で処理し、単一細胞懸濁液とした。単一細胞に解離しきれなかった細胞塊をメッシュで取り除いた後、KDRとCARの発現を指標とした細胞単離を行った。
フローサイトメーターによる解析結果(培養7日目における中胚葉細胞(KDR+細胞)におけるCARの発現解析結果)を図17Bに示す。なお、ネガティブコントロールとしては、抗CAR抗体を作用させずに、2次抗体のみを作用させた細胞を用いた。この細胞はCARでは染色されないので、この細胞の蛍光強度をバックグラウンドとした。抗CAR抗体と2次抗体を作用させた細胞の解析においては、ネガティブコントロールの細胞と同程度の蛍光強度を示す細胞集団をCARlow/-細胞として単離し、それより発現が高い細胞集団をCARhigh細胞として単離した。
実施例8にて単離したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来のK+CARhigh細胞とK+CARlow/-細胞を、20%血清および50ng/mlマウスSCF(Peprotech社製)、50ng/ml ヒトFlt3L(Peprotech社製)、10ng/mL ヒトTPO(Peprotech社製)、5ng/ml マウスIL-3(R&D Systems社製)、5ng/ml ヒトIL-6(Peprotech社製)、50μM 2-メルカプトエタノール(Nacalai Tesque社製)を含むMEMα培地(Sigma社製)に再懸濁し、それぞれの細胞を1×104個ずつ、セミコンフルエントなOP9ストロマ細胞を支持細胞上で培養して、血液細胞への分化誘導を行った。分化誘導後、フローサイトメーター(LSRFortessa、BD Bioscience)を用いて白血球のマーカーであるCD45の発現を解析することで血液細胞への分化効率を評価した。
実施例8にて単離したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来のK+CARhigh細胞とK+CARlow/-細胞を、10 ng/mlヒトVEGF(Peprotech社製)と、10 ng/ml FGF2(片山化学社製)を含むStempro34培地に懸濁し、ゼラチンコートした培養皿に播種した。7日後の細胞について、抗cTnT抗体(Fisher Scientific社製)を用いた免疫染色により発現解析を行うことで、心筋細胞への分化効率を評価した。
Claims (8)
- 多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、細胞表面におけるCAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)の発現を指標として、血液細胞への分化能を有する細胞または心筋細胞への分化能を有する細胞を単離することを含む、多能性幹細胞から血液細胞または心筋細胞を製造する方法。
- 以下の工程を含む、請求項1に記載の製造方法:
1)多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、CARlow/-細胞またはCARhigh細胞を単離する工程;
2)工程1)により単離されたCARlow/-細胞またはCARhigh細胞を培養する工程。 - 工程1)が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から、CARlow/-またはCARhighであり、かつ、中胚葉マーカーを発現する細胞を単離する工程である、請求項2に記載の製造方法。
- 中胚葉マーカーがFlk1またはKDRであり、中胚葉マーカーを発現する細胞がFlk1+細胞またはKDR+細胞である、請求項3に記載の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1に記載の製造方法により得られた、血液細胞または心筋細胞を含む細胞集団。
- 多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団について、細胞表面におけるCARの発現を指標として細胞集団を単離する方法であって、CARlow/-細胞を血液細胞への分化能を有する細胞として選別する、または、CARhigh細胞を心筋細胞への分化能を有する細胞として選別する、細胞集団を単離する方法。
- 請求項6の単離方法により得られた、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から選別された、CARlow/-である血液細胞分化誘導用細胞集団。
- 請求項6の単離方法により得られた、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含む細胞集団から選別された、CARhighである心筋細胞分化誘導用細胞集団。
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