JP5777115B2 - 多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化誘導法 - Google Patents
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Description
本発明の他の態様は、BMP4およびVEGFを含むサイトカインを無血清培地へ添加する、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記中胚葉細胞を製造する方法は以下の工程を含む、前記方法を提供することである。
(1)BMP4を含む無血清培地で多能性幹細胞を培養する工程、および
(2)工程(1)で得られた細胞をVEGFを含む無血清培地で培養する工程。
本発明の他の態様は、工程(2)の無血清培地がさらにSCFを含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、工程(1)および(2)の無血清培地がさらにWnt3aを含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程(1)が4日間行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程(2)が2日間行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記培養は、Matrigel(商標)でコートされた培養器で行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、以下の工程を含む、前記方法を提供することである。
(i)BMP4のみの存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
(ii)BMP4およびWnt3aの存在下で多能性幹細胞を培養する工程、および
(iii)VEGFおよびWnt3aの存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
本発明の他の態様は、前記工程(i)が1日間行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程(ii)が3日間行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程(iii)が2日間行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、培地中のBMP4の濃度が10ng/mL〜40ng/mLである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、培地中のWnt3aの濃度が10ng/mL〜20ng/mLである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、培地中のVEGFの濃度が10ng/mL〜20ng/mLである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記中胚葉細胞が、KDR陽性およびCD34陽性細胞を含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、a) 請求項1に記載の方法で中胚葉細胞を製造する工程、および
b) 中胚葉細胞から造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球を製造する工程を含む、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球の製造方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程b)は工程a)で得られた中胚葉細胞を造血因子の存在下で培養することによって行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記造血因子が、SCF、TPO、EPO、IL-3、 Flt3-ligand、FP-6およびG-CSFからなる群より選ばれる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記造血因子が、SCF、TPO、IL-3、 Flt3-ligandおよびG-CSFである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記造血因子が、SCF、TPO、IL-3、FP-6およびEPOである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程(b)が9日以上の間行われる、前記方法を提供することである。
造する方法に関する。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウ
ス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹橋正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、ある特定の再プログラミング因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。再プログラム化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であれば良く、特に限定されないが、例えばOCT3/4、SOX2及びKLF4; OCT3/4、KLF4及びC-MYC; OCT3/4、SOX2、KLF4及びC-MYC; OCT3/4及びSOX2; OCT3/4、SOX2及びNANOG; OCT3/4、SOX2及びLIN28; OCT3/4及びKLF4などの組み合わせである。
害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA SmartpoolO(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば5’-azacytidine)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294
(Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤(例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA(R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461) (2009)等を使用することができる。
も包含される。具体的には、体細胞は、非限定的に、例えば(1)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)、(2)組織前駆細胞、(3)リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞などを包含する。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
本発明において、中胚葉とは、発生の過程で体腔およびそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管(血管内皮も含む)、血液(血液細胞も含む)、リンパ管や脾臓、腎臓および尿管、性腺(精巣、子宮、性腺上皮)をつくる能力を有した細胞から構成される胚葉を包含する。例えば、T(Brachyuryと同義)、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1およびSDF1のようなマーカーの発現により示される。好ましくは、TおよびKDRを発現する細胞である。本発明において、中胚葉細胞は他の細胞と分離される必要はない。中胚葉細胞は造血幹細胞や造血前駆細胞とともに含まれていてもよい。
製品番号S0192として購入できる。インスリン、トランスフェリンおよびセレニウムの混合物はSigma-Aldrich Corporationから ITS-X サプリメントとして購入できる。
(1)多能性幹細胞をBMP4を含む無血清培地で培養する、および
(2)(1)で得られた細胞をVEGFを含む無血清培地で培養する。
(i)多能性幹細胞をBMPの存在下、Wnt3aなしで培養する、
(ii) 工程(i) で得られた細胞をBMP4 とWnt3aの存在下で培養する、および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をVEGFとWnt3aの存在下で培養する。
の場合は、10 ng/mlから200 ng/mlであり、好ましくは、50 ng/mlである。G-CSFの場合は、20 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、50 ng/mlである。FP-6の場合は、20 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、50 ng/mlである。EPOの場合は、1 IU/mlから20 IU/mlであり、好ましくは、2.5 IU/mlである。
ヒトES細胞(KhES-1およびKhES-3)は、京都大学再生医科学研究所より受領し、従来の方法で培養した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006)。ヒトiPS細胞(253G1(G1)、253G4(G4)、207B6(B6)および207B7(B7))は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した(Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007およびNakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26:101-6, 2008)。
造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む中胚葉への分化誘導
図1Aに記載のStep AおよびStep Bのスキームにて、造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む中胚葉を作製した。詳細には、未分化状態に維持したKhES-3をGrowth factor-reduced Matrigel(BD Biosciences)コートディッシュ上で、Stemline II(S0192, Sigma) に ITS-X(Gibco)を添加した培地へ、20ng/mlのBMP4を加えた培地で1日間培養した後、さらに10ng/mlのWnt3aを加えた培地でさらに3日間培養した。続いて、Stemline II へ ITS-Xを添加した培地へ10ng/mlのWnt3aと10ng/mlのVEGFを加えた培地へ交換した後、2日間培養した。その結果、3日目もしくは4日目より中胚葉マーカーであるTおよびKDRならびに胚体内胚葉マーカーであるMixl1の発現が確認された(図1Bおよび図2)。またこの時、未分化マーカーであるOct3/4およびNanogの発現が消失することも確認された。
上記の方法で得られた中胚葉を骨髄系誘導因子カクテル(Cocktail A)(50 ng/mL SCF(R&D Systems)、5 ng/mL TPO(協和発酵キリン)、50 ng/mL IL-3(R&D Systems)、 50 ng/mL Flt3-ligand (R&D Systems)および50 ng/mL G-CSF(協和発酵キリン))または巨核芽球・赤芽球系誘導因子カクテル(Cocktail B)(50 ng/mL SCF, 5 ng/mL TPO, 50 ng/mL IL-3, 50 ng/mL FP-6(協和発酵キリン)および 2.5 IU/mL EPO(協和発酵キリン))を用いて、5日毎に培地を交換して、図1A に記載のStep Cのように分化誘導を行った。すると、8日目よりコロニーの外側に嚢状の構造物が出現した(図5)。続いて12日から15日目に、浮遊する血液様細胞を確認した。
単球性細胞系列であった(図6B )。一方、巨核芽球・赤芽球系誘導因子カクテルを用いた場合は、CD235(Glycophorin A)陽性および/またはCD45陽性の骨髄単球性細胞系列であった。これらの細胞系列への分化誘導は、ES細胞およびiPS細胞の細胞株の種類に関係なく、巨核芽球・赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導30日目では、いずれの細胞株を用いてもほぼ同様の結果であった(図7)。
巨核芽球・赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導により得られた浮遊した赤血球様細胞をメイ・ギムザ染色や免疫染色を用いて詳細に確認した(図8および図9)。15日間の分化誘導では、有核のε-グロビン陽性の細胞であった。一方、30日間の分化誘導では、明らかに形状が小さくなっており、一部脱核した細胞も見られた。この時、ε-グロビン陽性の細胞は減少し、γ-グロビンおよびβ-グロビン陽性細胞が出現した。さらに、45日間の分化誘導では、脱核された細胞が散見され、α-グロビンおよびβ-グロビン陽性細胞が出現した。以上より、本分化誘導法により、造血前駆細胞から赤血球へとの段階的な誘導が可能であった。
造血幹細胞および/または造血前駆細胞が、巨核芽球・赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導により得られていることをフローサイトメトリーでCD34およびCD117(c-Kit)の発現を確認した(図10)。分化誘導15日目では両マーカーを発現した細胞が多く、分化誘導25日目までこれら2つのマーカーが発現した細胞が存在していることから、未熟な造血系細胞が培養されたことが確認された。
造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む中胚葉への分化誘導
Growth factor-reduced Matrigelコートディッシュ上で2日間未分化状態を維持したKhES-1 またはKhES-3を、Stemline IIにITS-Xを添加しさらに20 ng/ml のBMP4を添加するこ
とによって調製された培地で、5%酸素条件で4日間培養した。その後、培地をStemline IIにITS-X、40 ng/ml VEGF および50ng SCFを加えた培地に交換し、細胞を5%酸素条件で2日間培養した。次いで、KDRおよびCD34陽性の細胞をフローサイトメトリーによって確認した(図14)。このようにして、本発明の分化誘導方法により、造血幹細胞および/または造血前駆細胞を含む中胚葉が誘導できることが確認できた。
上記方法で得られた中胚葉を、Stemline IIにITS-X、50ng SCF、50ng IL-3および50ng G-CSFを加えた培地を用い、該培地を4〜5日ごとに交換しながら分化誘導した。その結果、細胞は、9日後には、好中球に分化誘導された。
Claims (10)
- 以下の培養工程により、多能性幹細胞を異種細胞と共培養することなく培養して中胚葉細胞を得ることを特徴とする、中胚葉細胞の製造方法;
(1)BMP4を含み、Wnt3aを含まない無血清培地で多能性幹細胞を接着培養する工程、
(2)工程(1)で得られた細胞をBMP4およびWnt3aを含む無血清培地で接着培養する工程、および
(3)工程(2)で得られた細胞をVEGFおよびWnt3aを含む無血清培地で接着培養する工程。 - 前記接着培養は、Matrigel(商標)でコートされた培養器で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)が1日間行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(2)が3日間行われる、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(3)が2日間行われる、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記中胚葉細胞が、KDR陽性およびCD34陽性細胞を含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- a) 請求項1から6のいずれか1項に記載の方法で中胚葉細胞を製造する工程、および
b) a)の中胚葉細胞から造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球を製造する工程を含む、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球の製造方法。 - 前記工程b)は工程a)で得られた中胚葉細胞を造血因子の存在下で培養することによって行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記造血因子が、SCF、TPO、EPO、IL-3、 Flt3-ligand、FP-6およびG-CSFからなる群より選ばれる、請求項8に記載の方法。
- 前記工程(b)が9日以上の間行われる、請求項7から9のいずれか1項に記載の方法。
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