CN115247152B

CN115247152B - 制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法及培养长期再生造血干细胞的方法

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Publication number: CN115247152B
Application number: CN202211147842.0A
Authority: CN
Inventors: 杜如龙; 于蕾; 黄雯静; 武雪宁; 顾雨春; 吴理达
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: WO2024060485A1; CN115247152A

Abstract

本文提供了制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法、培养长期再生造血干细胞的方法，包括：1)提供造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物；2)将所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物置于造血内皮特化及内皮‑造血转换培养基中培养；以及3)让所述造血中胚层细胞表达或过表达转录因子OCT4。本文还提供了在培养基中培养长期再生造血干细胞或培养包括长期再生造血干细胞的细胞培养物的方法，包括让所述长期再生造血干细胞表达细胞因子OCT4。

Description

制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法及培养长期再生造血干细胞的方法

技术领域

本文涉及细胞技术领域，具体涉及制备造血干细胞或造血干祖细胞及培养长期再生造血干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells，HSC)是一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，其可以分化为所有的血细胞和血小板。造血干细胞可以通过细胞移植来治疗相关的血液疾病，包括白血病和淋巴瘤等；同时其可以在体外分化为各类血细胞和血小板，用于临床治疗和研究。目前造血干细胞主要从机体中分离获取，但由于其含量极少，且体外无法长期培养等缺点严重制约了造血干细胞的临床研究和应用。多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSC)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESC)、诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)及扩展多能干细胞(Extended Pluripotent Stem Cells，EPSC)和全能干细胞(Totipotent Stem Cells，TPSC)等；其可以诱导分化为造血干细胞，为造血干细胞的移植和临床应用提供了新的选择和途径。然而，目前的诱导分化方法仅能获得分化潜能受限且无法长期自我更新的造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells，HPC)，而无法获得具有长期造血功能的造血干细胞(long-term HSC)，且目前的分化方法存在很多的缺陷，主要包括诱导效率低下、分化周期长、分化流程复杂及分化培养基中含有动物源成分等，这些缺陷严重地限制了造血干细胞的临床研究和应用。

发明内容

一方面，本文提供了制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法，包括：

1) 提供造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物；

2) 将所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物置于造血内皮特化及内皮-造血转换培养基中培养；以及

3) 让所述造血中胚层细胞表达转录因子OCT4。

在一些实施方案中，步骤3)为让所述造血中胚层细胞过表达转录因子OCT4。

在一些实施方案中，在步骤2)进行3天后进行步骤3)。

在一些实施方案中，步骤3)进行至少4天。

在一些实施方案中，步骤3)在步骤2)培养的第4-7天、第4-10天、或第7-10天进行。

在一些实施方案中，所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基含有VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4。

在一些实施方案中，所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基为补加有VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4的STEMdiff™ APEL™2培养基。

在一些实施方案中，所述造血中胚层细胞包括外源引入的转录因子OCT4的编码核酸序列。

在一些实施方案中，所述编码核酸序列可操作地与诱导型启动子连接；

在一些实施方案中，所述诱导型启动子为四环素诱导型启动子；

在一些实施方案中，所述造血中胚层细胞还包括外源引入的rtTA编码核酸序列。

在一些实施方案中，所述编码核酸序列整合在所述造血中胚层细胞的基因组中。

在一些实施方案中，步骤3)通过向所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基中添加四环素或强力霉素来让所述造血中胚层细胞表达转录因子OCT4。

在一些实施方案中，所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物为通过让中胚层细胞或包括中胚层细胞细胞培养物在造血中胚层特化培养基中培养而获得。

在一些实施方案中，让所述中胚层细胞或所述包括中胚层细胞细胞培养物在所述造血中胚层特化培养基中培养2天而获得所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物。

在一些实施方案中，所述造血中胚层特化培养基含有VEGF和bFGF。

在一些实施方案中，所述造血中胚层特化培养基为补加有VEGF和bFGF的STEMdiff™ APEL™2培养基。

在一些实施方案中，所述中胚层细胞或包括中胚层细胞的细胞培养物为通过对多能干细胞(PSC)进行中胚层诱导而获得；优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞(iPSC)；更优选地，所述多能干细胞为人诱导多能干细胞(hiPSC)。

在一些实施方案中，所述多能干细胞包括外源引入的转录因子OCT4的编码核酸序列。优选地，所述引入通过慢病毒载体进行。

在一些实施方案中，所述造血中胚层细胞为KDR⁺和PDGFRα^-。

在一些实施方案中，所述造血干细胞为CD34⁺CD45RA^-CD90⁺EPCR⁺。

在一些实施方案中，所述造血干细胞为长期再生造血干细胞。

在一些实施方案中，所述长期再生造血干细胞为CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺。

在一些实施方案中，所述造血干祖细胞为CD34⁺和CD45⁺。

在一些实施方案中，所述中胚层细胞为Braychury⁺。

另一方面，本文提供了在培养基中培养长期再生造血干细胞或培养包括长期再生造血干细胞的细胞培养物的方法，包括让所述长期再生造血干细胞表达或过表达细胞因子OCT4。

在一些实施方案中，所述细胞因子OCT4的表达或过表达在培养所述长期再生造血干细胞或包括长期再生造血干细胞的细胞培养物的第1-3天进行。

在一些实施方案中，所述细胞因子OCT4的表达或过表达通过如下方式之一进行：

1) 向所述培养基中添加细胞因子OCT4表达激活剂；以及

2) 向所述长期再生造血干细胞或其前体细胞中引入外源的转录因子OCT4的编码核酸序列。

在一些实施方案中，所述细胞因子OCT4表达激活剂为OAC1。

在一些实施方案中，所述转录因子OCT4的编码核酸序列可操作地与诱导型启动子连接。

在一些实施方案中，所述诱导型启动子为四环素诱导型启动子

在一些实施方案中，所述长期再生造血干细胞或其前体细胞还包括外源引入的rtTA编码核酸序列。

有益效果

本发明建立了一种无血清分化体系和易于操作的分化流程，通过阶段特异性地调控与造血干细胞发育相关的关键信号通路并通过Tet-on四环素诱导表达系统阶段特异性地诱导与造血干细胞发育进程相关的核心转录因子OCT4的表达，在体外实现了由人多能干细胞向CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的高效分化。同时我们发现，在短期的体外扩增培养中，过表达OCT4促进CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的增殖。该研究扩展了体外人多能干细胞向造血干细胞分化的方法，并可能为未来的临床应用和研究提供新的造血干细胞来源。

附图说明

图1 人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)向造血干细胞分化的一个具体实施例的流程图。人多能干细胞向造血细胞分化流程，主要包括单层细胞形成、中胚层诱导、造血中胚层特化、造血内皮特化及内皮-造血转换。

Day-1-0单细胞形成使用TeSR-E8培养基，细胞密度为8000个/cm²，添加10 µM Y-27632；

Day0-1中胚层诱导培养基，含有9 µM CHIR99021(CHIR)；

Day1-3造血中胚层特化培养基，含有添加20 ng/mL VEGF和20 ng/mL bFGF；

Day3-6造血内皮特化及内皮-造血转换培养基，含有20 ng/mL VEGF、20 ng/mLbFGF、50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt-3L 和10 ng/mL BMP4。其中在Day3进行细胞传代，细胞接种密度为2×10⁴个/cm²，额外添加10 µM Y-27632，24小时后更换培养基，去除Y-27632。

Day6-12造血内皮特化及造血内皮-造血转换培养基，含有20 ng/mL VEGF、20ng/mL bFGF、50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt-3L 、10 ng/mLBMP4和5 µg/mL Doxycycline (DOX)，其中DOX诱导OCT4过表达。此后，每两天更换一次新鲜含DOX的造血内皮特化及内皮-造血转换培养基，直至Day12。

图2 过表达OCT4促进长期再生造血干细胞的生成。(A) qRT-PCR分析DOX处理 hiPS-001-5-OCT4细胞系3天后OCT4基因转录水平诱导表达的情况。-代表不添加DOX；+代表添加DOX；DOX代表5

g/mL doxycycline。(B) 分化的第6天流式分析D3-6添加5

g/mL doxycycline诱导CD34⁺KDR⁺造血内皮细胞的分化效率。Control代表对照组，不添加DOX；D3- 6代表分化第3~6天添加5

g/mL doxycycline。(C) 分化的第9天流式分析不同时间窗口添加5

g/mL doxycycline诱导CD34⁺CD45⁺造血细胞的分化效率。Control代表对照组，不添加DOX；D3-9代表分化第3-9天添加5

g/mL doxycycline；D6-9代表分化第6-9天添加5

g/mL doxycycline。(D-G)分化的第12天流式分析不同时间窗口添加5

g/mL doxycycline 诱导CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的分化效率。Control代表对照组，不添加 doxycycline；D3-12代表分化第3~12天添加5

g/mL doxycycline；D6-9代表分化第6~9天添加5

g/mL doxycycline；D6-12代表分化第6~12天添加5

g/mL doxycycline；D9-12代表分化第9~12天添加5

g/mL doxycycline；其中，D图和E图是不同批次实验，处理时间窗口有部分重叠，主要是为了找到最佳的作用时间窗口，F图反应的是D图的折线图； G图反应的是E图的折线图。

图3 过表达OCT4维持长期再生造血干细胞的体外培养。(A) 体外扩增培养第3天流式分析添加5

g/mL doxycycline对CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞维持的影响。D0代表起始细胞；Control代表对照组，不添加DOX；DOX代表添加5

g/mL doxycycline。(B) 体外扩增培养第3天后分析细胞扩增倍数、流式分析添加5

g/mL doxycycline对CD34⁺CD90⁺EPCR⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞比例及细胞绝对数的影响。D0 代表起始细胞；D3-Control代表对照组，不添加DOX；D3-DOX代表添加5

g/mL doxycycline。

图4 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)传代前细胞形态图(Day-1)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞传代前细胞汇合度约70%~80%；细胞克隆边缘光滑，未见明显分化的细胞，细胞排列紧密、立体感较好。

图5 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化前细胞形态图(Day0)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化前细胞形成较小的克隆。

图6 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化中胚层细胞形态图(Day1)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化中胚层细胞，经过中胚层诱导后细胞克隆边缘明显收缩。

图7 人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化中胚层标志物流式检测结果(Day1)。通过细胞流式分析，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化中胚层细胞标志物T (Braychury)表达情况。具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测。注意：中胚层诱导后细胞克隆应发生边缘收缩的变化，流式检测中胚层标志物T (Braychury)诱导效率应达到90%以上。

图8 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血中胚层细胞形态图(Day3)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化为造血中胚层细胞形态图，经过造血中胚层诱导后细胞快速增殖，细胞呈间质样细胞形态，细胞为多边形，排列相对疏松。

图9人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血中胚层标志物流式检测结果(Day3)。通过细胞流式分析，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化中胚层细胞标志物KDR和PDGFRα表达情况。具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测。注意：造血中胚层诱导阶段，细胞将会出现快速扩散增殖的现象。相较于紧实的克隆，细胞变得相对疏松。流式检测造血中胚层KDR⁺PDGFRα^-细胞比例应该在70%以上。细胞传代接种密度控制在1×10⁴个/cm²~4×10⁴个/cm²。

图10 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血内皮细胞形态图(Day4)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化为造血内皮细胞，细胞经过再传代后，细胞密度较低，细胞尚为间质样细胞形态，呈多边形。

图11不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血内皮细胞形态图(Day6)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化为造血内皮细胞形态图，细胞快速增殖，生成较多的造血内皮细胞，细胞排列紧密，呈短梭形，具有明显的核仁。

图12 人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血内皮细胞标志物流式检测结果(Day6)。通过细胞流式分析，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144表达情况。具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测。注意：造血内皮阶段，细胞由间质样细胞逐渐变为造血内皮样细胞，细胞呈短梭形，细胞排列紧密，具有明显的细胞核仁。流式检测造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144，CD34⁺KDR⁺细胞比例应不低于15%，且CD34⁺KDR⁺细胞中CD144⁺细胞比例应不低于30%。

图13 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血干祖细胞形态图(Day9)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化为造血干祖细胞形态图，造血内皮细胞迁移聚形成造血中心，开始出现少量非贴壁、圆形的造血干祖细胞。

图14 人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血内皮细胞标志物流式检测结果(Day9)。通过细胞流式分析，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144表达情况。

图15 不同放大倍数下人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血干细胞形态图(Day12)。普通光学显微镜观察，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化造血干细胞，形成大量非贴壁、圆形的造血干祖细胞。

图16 人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)诱导分化造血干细胞标志物流式检测结果(Day12)。通过细胞流式分析，人多能干细胞(hiPS-001-5-OCT4)细胞诱导分化长期再生造血干细胞胞标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3表达情况。具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测。注意：检测时可以使用移液枪反复冲洗细胞，保证绝大多数非贴壁的圆形细胞被收集。

图17 集落形成单元实验（CFU，Colony-Forming Unit Assays）验证造血干细胞体外分化潜能的结果图。本实施例4中hiPS001-5-OCT4诱导分化获得的造血干细胞置于甲基纤维素培养基培养14天后形成多谱系祖细胞（CFU-GEMM）、粒细胞（CFU-G）、巨噬细胞（CFU-M）、粒细胞/巨噬细胞（CFU-GM）、红细胞（B/C-FUE）集落单元的明场图。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。

术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。

“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。当使用“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。

“干细胞”指未分化或未充分分化的细胞，其一方面能够自我复制(self-renewing)，即产生更多的与其自身相同的细胞，另一方面是能够分化为两种或更多种成熟细胞类型。根据干细胞的来源，可以将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cell)。胚胎干细胞可来自早期动物胚胎，例如胚泡(即早期胚胎)的内细胞团，具有分化为身体每种细胞类型的能力(全能性)。成体干细胞存在于成体的各种器官和组织中，具有分化并替换其所在组织的细胞的能力(多能性)。造血干细胞(HSC)就属于成体干细胞，存在于骨髓中，具有分化为各种血液细胞的能力。造血干细胞(HSC)能够产生髓系和淋巴系祖细胞二者，进而产生髓系细胞(如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、红细胞、血小板等)和淋巴系细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞等)。干细胞的自我复制和分化为多种或特定细胞类型的能力使得其成为细胞替代疗法的核心。

“诱导多能干细胞(iPSC)”指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞(如成纤维细胞)获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4；Sox基因家族的某些成员(例如Soxl、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-Catenin、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-cadherin，或其任何组合。目前已经可以从市场上购得用于制备iPSC的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的iPSC。hiPSC指从人体细胞诱导获得的iPSC。一个具体实例中，所用的hiPSC是按照中国专利公开CN113462638A中描述的方法(例如采用重编程因子组合OCT4、SOX2、E6和E7)制备，在此通过引用将该专利文献全文并入本文。

“中胚层细胞”指在三胚层动物的胚胎发育过程中，在原肠胚末期处在外胚层和内胚层之间的细胞层。中胚层细胞可发育为躯体的真皮、肌肉、骨骼及其他结缔组织和循环系统，包括心脏、血管、骨髓、淋巴结、淋巴管等；体腔末、内脏的浆膜和系膜，以及内脏中结缔组织、血管和平滑肌等；肾脏、输尿道、生殖腺(不包括生殖细胞)、生殖管、肾上腺的皮质部等。在本文中，中胚层细胞指诱导多能干细胞(iPSC)在中胚层诱导培养基中培养后所产生的具有中胚层细胞标志物(如Braychury)的细胞。相应地，将iPSC诱导培养成中胚层细胞的过程称为“中胚层诱导(mesoderm induction)”。本领域已知从诱导多能干细胞(iPSC)产生中胚层细胞的方法，例如已经有商业化的中胚层诱导培养基，例如STEMdiff™中胚层诱导培养基；另外，中国专利公开CN 111321110 A描述了从iPSC诱导产生中胚层细胞的方法，中国专利公开CN106867961A描述了用于从iPSC诱导产生中胚层细胞的培养基和方法，在此通过引用将这些专利文献引入本文。在本文提供的一个具体实例中，通过让单层贴壁的iPSC在中胚层诱导培养基中培养1天(约24小时)获得中胚层细胞。可预期地，该中胚层诱导阶段可以更长，例如，1.5天、2天、3天等，只要能获得所需的中胚层细胞即可。本文还提供了造血中胚层细胞的细胞形态图(图6)。

“造血中胚层特化”在本文中指将中胚层细胞诱导分化为“造血中胚层细胞”的过程。“造血中胚层细胞”可以认为是造血内皮细胞的前体细胞，其细胞标志物为KDR⁺PDGFRα^-。在本文的一个实例中，可以将中胚层细胞在添加了VEGF和bFGF的中胚层诱导培养基(本文中也称为造血中胚层特化培养基)中继续培养2天左右并检测细胞标志物表达情况而获得造血中胚层细胞。本文还提供了造血中胚层细胞的细胞形态图(图8)。

“造血内皮特化”在本文中指将造血中胚层细胞诱导分化为“造血内皮细胞(hemogenic endothelium cell)的过程。目前，研究者已认为体内造血干细胞是源自造血内皮细胞(例如，参见Hou S, et al. Cell Res (2020), 30, 376-392)。在本文的一个实例中，可以将造血中胚层细胞继续在添加了VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4的中胚层诱导培养基(当用于制备造血内皮细胞时，本文中也称其为造血内皮特化培养基；当用于制备造血干细胞时，本文也称其为造血内皮特化及内皮-造血转换培养基)中继续培养数天(例如3至12天或更多天，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天等)而获得造血内皮细胞。标志物CD34、KDR和CD144可用于对造血内皮细胞进行分离或鉴定。本文还提供了造血内皮细胞的细胞形态图(图10和图11)。

“内皮-造血转换”在本文中指造血内皮细胞向造血干细胞或造血干祖细胞转化的过程。该过程最终可产生具有治疗应用的造血干细胞，包括长期再生造血干细胞(LT-HSC)。可通过细胞标志物如CD34、CD45、CD90、CD45RA、EPCR或ITGA3等来分离或鉴定造血干细胞或造血干祖细胞。例如，在一个具体实例中，本文通过标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3来鉴定长期再生造血干细胞。在一些实施方案中，通过CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3^-来表征短期再生造血干细胞(ST-HSC)，其在小鼠体内可维持3-6个月。在一些实施方案中，通过CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺表征长期再生造血干细胞(LT-HSC)。ITGA3是体外扩增的人类长期再生造血干细胞的功能标志物。例如Tomellini等通过实验证明ITGA3 是维持体内长期干细胞活性所必需的，ITGA3 表达在功能上是脐血(CB) 细胞长期植入所必需的，ITGA3 是 CB 样本中培养的HSC 的可靠标志物，提高了预期 HSC 鉴定的准确性，并能够在扩展的 CB 培养中区分 ST-HSC 和多能 LT-HSC (Tomellini, et al. Integrin-α3 Is a Functional Marker of ExVivo Expanded Human Long-Term Hematopoietic Stem Cells. Cell Rep. 2019;28(4):1063-1073)。

“启动子”是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。启动子(promoter)的实例包括但不限于CMV、EF1A、CAG、CBh、SFFV启动子。

“诱导型启动子”指其，除启动子序列外，还包括至少一个转录调控序列，在特定转录因子与该转录调控序列结合后，可启动或促进该启动子转录其下游DNA序列。该转录调控序列与该启动子可以是或不是天然存在于同一基因的转录调控序列中，分别可以称为天然诱导型启动子或人工诱导型启动子。在本文提供的具体实例中，采用了四环素诱导型启动子(人工诱导型启动子)，其例如包括CMV启动子(minimal CMV promotor, PminCMV)和Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)。在DOX (Doxycycline)存在时，反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator，rtTA)与DOX结合后可结合TRE，使PminCMV活化从而促进基因表达；DOX不存在时，rtTA不与TRE结合，PminCMV自身不能启动基因表达。因此，在细胞中同时表达rtTA时(可通过使用另外的表达载体，或者使用已经整合有rtTA编码序列的宿主细胞)可通过是否添加DOX来控制该诱导型启动子的活性。本领域技术人员可理解，除了四环素诱导型启动子外，也可以采用其他诱导表达系统来实现本发明的目的，例如蜕皮素诱导系统、Cumate、雷帕霉素系统等其他本领域常用的表达系统。

“可操作地与诱导型启动子连接”指调控序列诱导型启动子与其调控对象的连接方式使得调控序列诱导型启动子能够对其调控对象发挥作用。例如，启动子可操作地与目的基因连接指启动子可驱动目的基因从准确起始位点的开始转录。

术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的蛋白的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个：复制起点、一或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目的蛋白的载体。用于目的蛋白在细胞中瞬时表达通常可采用质粒载体，而用于在细胞中稳定表达可采用病毒载体，如慢病毒载体。

提及蛋白的编码核酸序列时，“表达”指该编码核酸序列的转录和/或翻译。表达可以为基础水平的，即特定细胞中特定基因的通常表达水平。表达也可以是超水平的，即过表达，所产生的mRNA或蛋白的量通常为基础水平的数倍，例如5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。向宿主细胞(如干细胞)中引入外源核酸序列(包括编码目的蛋白的核酸序列的表达盒)是使得能够在对应宿主细胞中实现目的蛋白的过表达的一种方式。在该表达盒中设置强启动子或可诱导的强启动子可进一步增强表达水平。

本发明的一个方面在于提供了制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法，包括先构建可诱导表达转录因子OCT4的iPSC，并且在所述iPSC向造血干细胞诱导过程(尤其是内皮-造血转换过程)中诱导该转录因子表达，从而增加造血干细胞或造血干祖细胞的产量或产率(图1)。本发明人发现，在特定的时间段诱导该转录因子的表达，可以显著提高培养物中造血干细胞或造血干祖细胞的比例(或产量)。在一个具体实施方案中，在从造血内皮特化开始的第4天至第7天(对应于图1中的Day6-Day9，简写为D6-9)诱导转录因子OCT4的表达(即向培养基中添加DOX)。在另一个实施方案中，在从造血内皮特化开始的第4天至第10天(对应于图1中的Day6-Day12)诱导该转录因子的表达。在另一个实施方案中，在从造血内皮特化开始的第7天至第10天(对应于图1中的Day9-Day12)诱导该转录因子的表达。在另一个具体实施方案中，在从造血内皮特化开始的第4天起(对应于图1中的Day6)起诱导上述转录因子的表达。造血干细胞(包括造血干祖细胞或长期再生造血干细胞)的产生可通过细胞形态观察和/或检测细胞标志物来鉴定。在一些实施方案中，该方法包括：1) 提供造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物； 2) 将所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物置于造血内皮特化及内皮-造血转换培养基中培养；以及3) 让所述造血中胚层细胞表达转录因子OCT4。需要指出的是，步骤3)并非需要在步骤2)之后进行，而是在步骤2)的培养过程中进行。

本发明的另一个方面在于提供了在培养基中培养长期再生造血干细胞或包括长期再生造血干细胞的细胞培养物的方法，其包括让所述长期再生造血干细胞表达或过表达细胞因子OCT4。本发明人发现，表达细胞因子OCT4可促进CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的增殖。

关于细胞因子OCT4的表达或过表达，预期本领域技术人员可以采用其他方式来实现与本文实施例中采用的DOX诱导表达类似的效果。这些其他方式包括，例如，向细胞中引入OCT4质粒载体导致OCT4的短期表达；通过添加OCT4表达的激活剂，例如OAC1，等，这些经改动的实施方案也包括在本发明的范围内。

本文中提到的各种细胞如中胚层细胞、造血中胚层细胞、造血干细胞等可通过细胞形态观察和/或检测细胞标志物来鉴定。例如可以在造血内皮特化第2天(对应于图1中的Day4)进行细胞形态观察和标志物检测。在本文中，提及进行细胞形态观察或者标志物检测时，对应的时间如Day4通常指该天开始时，也可以是该天对培养细胞进行特定处理(如接种、改变培养基等)之前。本领域技术人员可以理解，对于造血内皮特化和/或内皮-造血转换需要耗时数天的培养过程，几个小时或十几个小时的培养时间差异通常不会导致细胞形态或标志物出现明显变化。

在本文提供的具体实施例中，详细描述了从iPSC起直至获得造血干细胞的整个过程(图1)，尤其是在诱导获得造血中胚层细胞后并未分离纯化出造血中胚层细胞或造血内皮细胞，而是仅通过改变培养基的成分(以及添加DOX)来获得最终的造血干细胞(包括长期再生造血干细胞)。在这个过程中研究了不同时段添加DOX对造血内皮细胞生成和造血干细胞生成的影响。本领域技术人员显然可以基于本文公开的技术方案自中胚层细胞或造血中胚层细胞开始制备造血内皮细胞，或者自中胚层细胞、造血中胚层细胞或造血内皮细胞开始制备造血干细胞，但只要其中采用了在对应时间诱导上述转录因子的表达，则这些经改动的技术方案也应包括在本发明的范围内。

本发明人建立了一种无血清分化体系和易于操作的分化流程，通过阶段特异性地调控与造血干细胞发育相关的关键信号通路并通过Tet-on四环素诱导表达系统阶段特异性地诱导与造血干细胞发育进程相关的核心转录因子OCT4的表达，在体外实现了由人多能干细胞向CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的高效分化。本发明人还发现在体外扩增培养中，过表达OCT4促进CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的增殖。

以下通过具体实施例来详细描述本发明。

试剂与实验方法。

试剂。

本文中提及的部分试剂信息如表1所示。

表1 试剂信息

。

实验方法。

流式检测细胞表面标志物。

1. FACS检测所需试剂和抗体。

(1) 清洗试剂：Buffer A(PBS+4% FBS)。

(2) 直标一抗： FITC anti-human CD34 antibody，APC anti-human KDRantibody，PE anti-human PDGFRα antibody，PE anti-human CD144 antibody，APC anti-human ITGA3 antibody，PE anti-human EPCR antibody，PerCP/Cyanine5.5 anti-humanCD90 antibody。

2. 待测样品的准备。

1) 配制TrypLE工作液：吸取适量 DPBS至新的15 mL离心管中，按照1：1加入相应体积的TrypLE原液，混匀后即为工作液，37℃水浴锅预热10分钟。

2) 从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1分钟(洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30~45秒再行吸出)。

3) 加TrypLE工作液(6孔培养板板每孔加入1 mL TrypLE工作液)，使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2~5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。

4) 轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积Buffer A终止消化，细胞计数后取1×10⁶细胞。(悬浮细胞不需要细胞消化步骤，直接收取悬浮细胞进行后续操作)。

5) 配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量Buffer A重悬，200 g离心5分钟，弃上清。

6) 用Buffer A清洗细胞2次，每次3 mL Buffer A，200 g离心5分钟，弃上清。

7) 孵育直标一抗：用100 µL Buffer A重悬细胞后，每管加入1 test直标一抗，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。

8) 用Buffer A清洗细胞3次，每次3 mL Buffer A，200 g离心5分钟，弃上清。

9) 每管加入200 µL DPBS重悬细胞，并经70 µm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至96孔培养板中，置于4℃避光保存，等待上机检测。

注：

诱导分化的第3天检测造血中胚层细胞标志物KDR和PDGFRα；

诱导分化的第6天和第9天检测造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144；

诱导分化的第9天和第12天检测造血干祖细胞标志物CD34和CD45；

诱导分化的第12天检测长期再生造血干细胞标志物CD34、CD90、CD45RA、EPCR和ITGA3。

流式检测细胞核内标志物。

1. FACS检测所需试剂和抗体。

(1) 清洗试剂：Buffer A(PBS+4% FBS)。

(2)打孔试剂：Buffer B(PBS+4% FBS+0.4% Triton X-100)。

(3)固定试剂：PBS+4%多聚甲醛。

(4)直标一抗： Human/Mouse Brachyury Alexa Fluor® 488-conjugatedAntibody等。

2. 待测样品的准备。

4) 轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积Buffer A终止消化，细胞计数后取1×10⁶细胞。

5) 配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，每管加0.5 mL PBS+4%多聚甲醛，轻弹离心管，使细胞悬浮在多聚甲醛溶液中，对细胞进行固定，4℃固定15分钟后，200 g离心5分钟，弃上清。

6) 用Buffer B清洗细胞3次，Buffer B中含有0.4% Triton X-100，可对细胞膜进行打孔，每次3 mL Buffer B，200 g离心5分钟，弃上清。

7) 孵育直标一抗：用100 µL Buffer B重悬细胞后，每管加入1 test直标一抗，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。

注：诱导分化的第1天检测中胚层细胞标志物Brachyury(T)。

流式上机检测。

1)开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑。

2) 设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。

3) 待机器变为Ready状态后，清洗机器。

4) 首先通过同型对照样品，设置FSC和SSC的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置Gate，进入下一步分析。

5) 根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。

6) 检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。

实施例1细胞稳系hiPS-001-5-OCT4的构建。

为了探究过表达OCT4对造血干细胞的诱导分化、扩增培养及干性维持的影响，我们利用慢病毒构建了DOX条件性诱导OCT4表达的细胞稳系hiPS-001-5-OCT4 (hiPS-001-5 为发明人制备的诱导多能干细胞，制备方法参见CN113462638A)。构建该细胞系使用了以下 2种表达载体：TetO-FUW-OCT4-EF1α-NeoR和pLenti-EF1a-rtTA-IRES-PuroR，其分别携带一种药筛抗性基因。我们利用500

g/mL G418和1

g/mL Puromycin对转染病毒72小时后的细胞进行药筛并获得稳转细胞系hiPS-001-5-OCT4。然后，我们对获得的稳转细胞系hiPS- 001-5-OCT4进行鉴定，实验结果显示，目的基因整合到基因组DNA中，同时DOX可以诱导插入基因OCT4的转录表达(图2的A图)。

实施例2 OCT4表达促进长期再生造血干细胞的生成。

OCT4是多能干细胞的关键转录细胞因子，结合SOX2、NANOG等维持细胞的多能性和细胞的自我更新(Babaie et al., 2007; Greco et al., 2007; Zhou et al., 2007)。OCT4结合SOX2、NANOG、c-MYC或Lin28可以将成纤维细胞重编程为多能干细胞(Takahashiet al., 2007; Yu et al., 2007)。有研究表明，组蛋白去乙酰化抑制剂Valproic acid(VPA)促进脐血CD34⁺和CD34⁺CD90⁺细胞的体外扩增，并导致细胞上调表达多能干细胞基因OCT4、Nanog、SOX2、ZIC3等，而利用siRNA敲低OCT4、Nanog、SOX2、ZIC3基因抑制VPA对脐血CD34⁺和CD34⁺CD90⁺细胞的体外扩增效应(Chaurasia et al., 2014)。通过小分子化合物OCT4-activating compound 1(OAC1)可以激活细胞内源性OCT4的表达，并促进脐血源CD34⁺造血干祖细胞的扩增 (Huang et al., 2016)。另有研究报道，结合相关细胞因子处理，过表达OCT4能够将成纤维细胞重编程为CD45⁺造血细胞，表明OCT4在造血细胞命运决定中扮演着重要的角色(Szabo et al., 2010)。然而长时间或高水平地过表达OCT4则抑制ESCs的造血分化(Camara-Clayette et al., 2006)。

为了研究阶段特异性表达OCT4对造血干细胞分化的影响，我们在诱导分化的不同时间窗口加入DOX诱导OCT4基因的表达。分化第6天的流式结果分析显示，Control对照组CD34⁺KDR⁺造血内皮细胞的诱导效率为47.46%；而在分化的第3~6天添加DOX的实验组，CD34⁺KDR⁺造血内皮细胞的诱导效率降低至11.98%。上述实验结果表明，早期过表达OCT4不利于造血内皮细胞的诱导分化(图2的B图)。为了检测过表达OCT4对造血细胞诱导分化的影响，我们检测了CD34⁺CD45⁺造血细胞的表达情况。分化的第9天的流式结果显示，D3-9和D6-9添加DOX导致CD34⁺细胞分化效率降低，但明显提高CD45⁺细胞的生成，且D6-9处理DOX明显提高CD34⁺CD45⁺造血细胞的诱导效率(图2的C图)。上述实验结果表明，过表达OCT4促进了CD45⁺造血细胞的生成。我们进一步分析了过表达OCT4对长期再生造血干细胞生成的影响。分化的第12天的流式结果显示，D6-9、D6-12和D9-12处理DOX提高CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的分化效率，且较佳的DOX处理时间窗口为D9-12 (图2的 D图-G图)。

上述实验结果表明，过早的激活OCT4抑制CD34⁺KDR⁺造血内皮细胞的分化，但分化晚期激活OCT4促进CD34⁺CD45⁺造血细胞的生成，并促进造血细胞表达长期再生造血干细胞的关键标志物基因CD34、EPCR、CD90和ITGA3。

实施例3 OCT4表达促进长期再生造血干细胞的维持。

相关研究表明，小分子化合物OAC1激活OCT4可以促进CD34⁺造血干祖细胞的体外扩增培养(Huang et al., 2016)。敲低OCT4抑制VPA对脐血CD34⁺和CD34⁺CD90⁺细胞的体外扩增效应 (Chaurasia et al., 2014)。上述研究提示我们激活OCT4可能是造血干祖细胞体外维持培养的重要因素。为了实现体外造血干细胞的扩增和干性维持，我们测试了DOX诱导OCT4基因过表达对造血干细胞培养的影响。此处的Day0起始细胞为造血干祖细胞，基于图1的分化流程于Day12获取的细胞即为造血干祖细胞（但D9-12不需要诱导OCT4表达），然后再以此时获得细胞为新的实验的开始。实验结果显示，经过3天的体外扩增培养后，细胞的数量出现明显的增加，尽管相对于对照组，DOX处理导致细胞增殖的倍数降低，但提高了CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的比例。进一步的分析表明，DOX处理增加了CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的绝对细胞数量，而对照组CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的绝对细胞数量出现明显减少(图3的 A图-B图)。

上述实验结果表明，在短期的体外扩增培养中，过表达OCT4促进CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺长期再生造血干细胞的增殖。

实施例4 人多能干细胞诱导造血干细胞的分化过程。

单层贴壁细胞形成。

实验操作：Day-1。

1) 取适量的TrypLE工作液，置于37℃水浴锅预热10分钟。

2) 根据传代所需的培养基量，配制含10 μM Y-27632的TeSR-E8培养基，每毫升TeSR-E8培养基加1 μL Y-27632(10 mM)储存液。37℃水浴锅预热10分钟。

3) 从培养箱取出待传代的hiPSC-001-5-OCT4细胞(细胞汇合度70%~80%)(细胞形态见图4)，吸弃原培养基，并用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1分钟(洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30~45秒再行吸出)。

4) 加TrypLE工作液后(六孔板加约1 mL TrypLE工作液，T25瓶加约2 mL TrypLE工作液)，使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2~5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。

5) 轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积的消化终止液终止消化。

6) 配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量含10 μM Y-27632的TeSR-E8培养基重悬，细胞计数后，调整至合适的细胞密度。

7) 取出Matrigel包被好的培养板/瓶，去除剩余包被液，用DPBS清洗一次。将混合均匀的细胞悬液按照8000个/cm²的密度，接种于包被的培养板/瓶中，标记传代日期、细胞类型和细胞代数等信息。将培养板/瓶置于37℃、5%CO₂培养箱内静置培养。记为Day-1。

注意：细胞接种密度控制在8000-10000个/cm²，接种后不要晃动培养板/瓶，防止细胞聚集在培养板/皿中央。

中内胚层诱导(Mesoderm Induction)。

实验操作：Day0。

1) 取适量的中胚层诱导培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟。

2) 单层贴壁细胞形成24小时后，从培养箱取出待分化的细胞(细胞形态见图5)，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1分钟(洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30~45秒再行吸出)。

3) 添加中胚层诱导培养基，然后置于37℃，5% CO₂培养箱中静置培养24 小时(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

造血中胚层特化(hematopoietic mesoderm specification) 。

实验操作：Day1。

1) 取配制适量的造血中胚层特化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟。

2) 中胚层诱导24小时后，从培养箱取分化的细胞(细胞形态见图6，中胚层标志物流式检测结果见图7)，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1分钟(洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30~45秒再行吸出)。

3) 添加造血中胚层特化培养基，然后置于37℃，5% CO₂培养箱中静置培养48 小时(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

造血内皮特化(hemogenic endothelium specification)及内皮-造血转换(endothelial-to-hematopoietic transition, ETH)：Day3。

实验操作：Day3。

1) 取配制适量的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟。

2) 取适量的TrypLE工作液，置于37℃水浴锅预热10分钟。

3) 造血中胚层特化48 h后，从培养箱取分化的细胞(细胞形态见图8，造血中胚层标志物流式检测结果见图9)，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍(每次DPBS用量不少于原培养基用量)，每次1分钟(洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30~45秒再行吸出)。

4) 加TrypLE工作液(6孔培养板板每孔加入1 mL TrypLE工作液)，使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2~5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。

5) 轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积终止消化液终止消化。

6) 配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量含10 μM Y-27632的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬，细胞计数后，调整至合适的细胞密度。

7) 取出matrigel包被好的培养板/瓶，去除剩余包被液，用DPBS清洗一次。将混合均匀的细胞悬液接种于包被的培养板/瓶中，接种密度为2×10⁴个/cm²，标记传代日期、细胞类型和细胞代数等信息，然后置于37℃、5% CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2mL培养液)。

实验操作：Day4。

2) 从培养箱取分化的细胞(细胞形态见图10)，吸弃原培养液，更换新鲜的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5%CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

实验操作：Day6。

1) 取配制适量的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，置于37℃水浴锅预热10分钟。

2) 从培养箱取分化的细胞(细胞形态见图11，造血内皮细胞标志物流式检测结果见图12)，吸弃原培养液，更换新鲜的含5 µg/mL Doxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5%CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

实验操作：Day8。

2) 从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，更换新鲜的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5% CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。记为Day8。

3) Day9，从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，更换新鲜的含5 µg/mLDoxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，然后置于37℃、5% CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

4) 在Day9观测细胞形态并通过流式检测造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144表达情况，具体检测方法详见实验方法部分的细胞流式检测。结果分别显示在图13和图14中。

注意：造血内皮阶段，造血内皮细胞迁移形成造血中心，且出现少量的悬浮细胞。流式检测造血内皮细胞标志物CD34、KDR和CD144，CD34⁺KDR⁺细胞比例应不低于30%，且CD34⁺KDR⁺细胞中CD144⁺细胞比例应不低于80%。

实验操作：Day10。

2) 从培养箱取分化的细胞，收集原培养液至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量的含5 µg/mLDoxycycline的造血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬。

3) 将重悬后的细胞重新接种到培养板/瓶中，然后置于37℃、5% CO₂培养箱内静置培养(6孔培养板每孔加入2 mL培养液)。

实验操作：Day12。

从培养箱取分化的细胞(细胞形态和长期再生造血干细胞胞标志物CD34、CD90、EPCR和ITGA3的流式检测结果分别显示在图15和图16中)，收集原培养液至15 mL离心管中，配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，将获得的造血干细胞用于后续实验或冻存。

实施例5 造血干细胞分化潜能的验证。

集落形成单元实验（CFU，Colony-Forming Unit Assays）验证造血干细胞体外分化潜能。

将本实施例4中hiPS001-5-OCT4诱导分化获得的造血干细胞，置于甲基纤维素培养基培养14天后，能够成功形成多谱系祖细胞（CFU-GEMM）、粒细胞（CFU-G）、巨噬细胞（CFU-M）、粒细胞/巨噬细胞（CFU-GM）、红细胞（B/C-FUE）集落单元（图17）。

Claims

1.制备造血干细胞或造血干祖细胞的方法，其特征在于，包括：

3) 让所述造血中胚层细胞表达转录因子OCT4；

其中步骤3)在步骤2)培养的第7-10天进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤 3)为让所述造血中胚层细胞过表达转录因子OCT4。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基含有VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基为补加有VEGF、bFGF、SCF、IL-3、TPO、Flt-3L和BMP4的STEMdiff™ APEL™2培养基。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述造血中胚层细胞包括外源引入的转录因子OCT4的编码核酸序列；

所述编码核酸序列可操作地与诱导型启动子连接；

所述诱导型启动子为四环素诱导型启动子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述造血中胚层细胞还包括外源引入的rtTA编码核酸序列；所述编码核酸序列整合在所述造血中胚层细胞的基因组中。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)通过向所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基中添加四环素或强力霉素来让所述造血中胚层细胞表达转录因子OCT4。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中步骤3)通过向所述造血内皮特化及内皮-造血转换培养基中添加四环素或强力霉素来让所述造血中胚层细胞过表达转录因子OCT4。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物为通过让中胚层细胞或包括中胚层细胞的细胞培养物在造血中胚层特化培养基中培养而获得。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，让所述中胚层细胞或所述包括中胚层细胞的细胞培养物在所述造血中胚层特化培养基中培养2天而获得所述造血中胚层细胞或包括造血中胚层细胞的细胞培养物。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述造血中胚层特化培养基含有VEGF和bFGF。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述造血中胚层特化培养基为补加有VEGF和bFGF的STEMdiff™ APEL™2培养基。

13.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中：

所述造血中胚层细胞为KDR⁺和PDGFRα^-；

所述造血干细胞为CD34⁺CD45RA^-CD90⁺EPCR⁺；

所述造血干祖细胞为CD34⁺和CD45⁺。

14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述造血干细胞为长期再生造血干细胞，所述长期再生造血干细胞为CD34⁺EPCR⁺CD90⁺ITGA3⁺。