JP2019506861A - マイクロ流体装置における腸細胞の成長のためのシステム及び方法 - Google Patents

マイクロ流体装置における腸細胞の成長のためのシステム及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2019506861A
JP2019506861A JP2018540028A JP2018540028A JP2019506861A JP 2019506861 A JP2019506861 A JP 2019506861A JP 2018540028 A JP2018540028 A JP 2018540028A JP 2018540028 A JP2018540028 A JP 2018540028A JP 2019506861 A JP2019506861 A JP 2019506861A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
intestinal
ipsc
chip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2018540028A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019506861A5 (ja
Inventor
ロバート バレット
ロバート バレット
クライヴ スヴェンセン
クライヴ スヴェンセン
スティーブン アール． ターガン
スティーブン アール． ターガン
マイケル ワークマン
マイケル ワークマン
ドゥルーブ サレーン
ドゥルーブ サレーン
ウトラ ラジャマニ
ウトラ ラジャマニ
Original Assignee
シーダーズ−サイナイ メディカル センター
シーダーズ−サイナイ メディカル センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シーダーズ−サイナイ メディカル センター, シーダーズ−サイナイ メディカル センター filed Critical シーダーズ−サイナイ メディカル センター
Publication of JP2019506861A publication Critical patent/JP2019506861A/ja
Publication of JP2019506861A5 publication Critical patent/JP2019506861A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

臓器チップは、組織及び器官の生理学的機能をモデル化するために、マイクロメーターサイズのチャンバ内で生体細胞を培養するためのマイクロ流体装置である。これらの装置において作り出されたパターニング及び連続的な流体の流れは、生理学的に関連する特徴を有する腸細胞の培養と、細菌への持続的な曝露とを可能にする一方で、細胞生存率を維持し、それにより、炎症性腸疾患の研究を可能にしている。しかしながら、既存の腸細胞は、生理学的に関連するすべてのサブタイプを有しておらず、遺伝的変異のレパートリーも有しておらず、また、免疫細胞などの他の重要な細胞因子の研究を可能としない。ＩＢＤ患者特異的細胞を含むｉＰＳＣ由来の上皮の使用は、該疾患の多面的性質を捕捉することで、優れた疾患モデリングを可能にする。【選択図】図４０

Description

本発明は、細胞培養系とマイクロ流体系との組み合わせに関する。より具体的には、一実施形態において、本発明は、成熟し、及び／または腸細胞へと分化する幹細胞由来の細胞を播種したマイクロ流体チップに関する。一実施形態において、当該幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）であり、腸細胞は、前腸細胞である。幾つかの実施形態において、短期及び長期の下流効果について胎児発育の重要な期間を模倣する組織発生での臨界期の内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）の効果について、当該前腸チップを試験する。特に、発生途上の腸及び視床下部のニューロペプチダーゼニューロンに関する、慢性低用量ＥＤＣ曝露の有害作用及び機序を解明するために、誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）のための使用方法が提供され、そして、ＥＤＣへの子宮曝露を模倣するためのプラットフォームとして役立つ。そして、さらなる実施形態において、肥満者に関連するＥＤＣの効果を決定するために、肥満個体に由来するｉＰＳ細胞を、チップに播種する。
さらに、本発明は、腸オルガノイド（ｉＰＳＣ由来のオルガノイド）由来の細胞をマイクロ流体チップ上に供給するための方法及びシステムに関する。一実施形態において、さらなる細胞、例えば、誘導した神経細胞がチップに置かれる。幾つかの実施形態において、マイクロ流体腸管臓器チップは、ヒト胃腸障害、例えば、ＩＢＤなどを模倣する。
胎児発育の重大な時期において、人工物である内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）を高レベルでヒトに対して持続的に曝露すると、内分泌組織前駆細胞における代謝ホメオスタシスの長期的な破壊がもたらされ、これは、小児期の肥満に寄与し得る。具体的には、摂食行動の内分泌制御は、視床下部弓状核と胃腸管内分泌細胞、特に、胃との間の強調と伝達を必要とする。視床下部（ＨＴ）ニューロペプチド作用性ニューロンは、胃由来のガストリン及びグレリン、腸由来のペプチドＹＹを含む腸の一部から内分泌シグナルを受け、食欲促進または食欲不振の効果をもたらす。したがって、ＥＤＣなどの外的または環境的要因による発達中の異常は、腸−脳相互作用の機能不全において一定の役割を果たし、それにより、摂食障害及び肥満を引き起こし得る。
様々な発達段階のヒト胎児組織へ侵入するとは信じがたいことが大きな理由となり、ＥＤＣの早期曝露が摂食及び飢餓に関与する細胞の機能不全に及ぼす発達上の影響に関するデータは不十分である。この不足分を埋め合わせするために、本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を使用して、発達中の腸及び視床下部神経ペプチドニューロンに関する慢性低用量ＥＤＣ曝露の有害作用及び機序を解明し、子宮内でのＥＤＣ曝露を模倣するプラットフォームとして役立てる。これは、多能性幹細胞技術の、そのような最初の応用である。
細胞生存率に影響を及ぼさずに、低用量ＥＤＣは、内分泌的に活性なｉＦＧＥ及びｉＨＴＮにおけるＮＦ−κＢシグナル伝達を著しく撹乱した。結果的に、ＥＤＣ処置は、おそらくは、ミトコンドリア呼吸のＮＦ−κＢ媒介調節を介して、ミトコンドリアストレスが負荷された時のｉＦＧＥ及びｉＨＴＮにおける最大のミトコンドリア呼吸及び予備呼吸能を低下させ、ならびに、核（ＳＣＯ２、ＴＦＡＭ、ＰＯＬＲＭＴ）及びミトコンドリア（ＣｙｔＢ５）がコードした呼吸遺伝子の双方の発現も抑えた。ＮＦ−κＢ阻害剤であるＳＮ５０を用いた治療は、ＥＤＣが誘発した異常なＮＦ−κＢシグナル伝達を救済し、ミトコンドリア呼吸を改善した。この画期的な研究は、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）に基づいた環境化学物質による内分泌攪乱の機構的モデルに関する最初の報告であり、ＮＦ−κＢシグナル伝達及びミトコンドリア機能不全に対するＥＤＣの有害な影響を示している。これは、発達中のヒト内分泌系における肥満性ＥＤＣに対する信頼できるスクリーニングプラットフォームに向けた道を開くものである。
本発明は、ある量の分化した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、当該分化したｉＰＳＣを１つ以上の化合物と接触させること、分化したｉＰＳＣの１つ以上の特徴を測定することを含み、当該分化したｉＰＳＣの１つ以上の特徴の測定が、１つ以上の化合物の特徴を特定する、化合物スクリーニングの方法を提供する。一実施形態において、当該化合物スクリーニングは、内分泌攪乱をスクリーニングすることを含む。一実施形態において、当該１つ以上の化合物の特徴は、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）のリン酸化を誘導することを含む。一実施形態において、１つ以上の化合物の当該特徴は、ミトコンドリア呼吸の減少を含む。一実施形態において、１つ以上の化合物の前記特徴は、シトクロムＣオキシダーゼアセンブリタンパク質（ＳＣＯ２）、ＲＮＡポリメラーゼミトコンドリア（ＰＯＬＲＭＴ）、転写因子Ａ、ミトコンドリア（ＴＦＡＭ）、及びＣＹＴＢ５の１つ以上の発現の減少を含む。一実施形態において、前記分化したｉＰＳＣは、前腸上皮である。一実施形態において、前記分化したｉＰＳＣは、視床下部ニューロンである。
本発明は、誘導多能性幹細胞を分化させる方法であって、ある量の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、および、１つ以上の因子の存在下で培養することを含み、１つ以上の当該因子が、ｉＰＳＣを識別することができる、当該方法を提供する。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、胚体内胚葉へと分化する。一実施形態において、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約３日間である。一実施形態において、最初に、分化した当該ｉＰＳＣを無血清条件下で培養し、続いて、血清を添加する。一実施形態において、当該胚体内胚葉は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ（小分子）、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下でさらに培養されることで、前腸スフェロイドへと分化する。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約３日間である。一実施形態において、当該前腸スフェロイドは、コーティングされた表面上で培養されることで、前腸上皮へと分化する。一実施形態において、当該前腸スフェロイドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む１つ以上の因子の存在下でのさらなる培養によって、前腸上皮へと分化する。一実施形態において、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む１つ以上の因子の存在下でのさらなる当該培養は、約２０日間である。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、最初に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で培養する。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、神経外胚葉へと分化する。一実施形態において、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約２日間である。一実施形態において、当該神経外胚葉は、スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）、及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、腹側間脳へと分化する。一実施形態において、スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）、及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約５〜６日間である。一実施形態において、当該腹側間脳は、ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、成熟する。一実施形態において、ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約４〜５日間である。一実施形態において、当該成熟腹側間脳は、ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、成熟する。一実施形態において、ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下での当該培養は、約２０〜２７日間である。
内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）は、即時の損傷を引き起こすこと、あるいは、生体に対して有害であると考えられる変化、例えば、細胞機能、組織機能、生理学的機能、発生経路の１つ以上に対する即時の変化などを引き起こすことのいずれかによって、及び／または複雑な方法もしくは予期しない方法で長期間に及ぶ損傷を引き起こすことによって、初期組織発達に対して影響を及ぼすと、すなわち、初期組織発達の期間において有害であると、企図される。実施例１９では、これらの組織変化の幾つかについて論じる。
発明者らは、内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）への慢性的低用量曝露が、ヒトの内分泌腺組織の初期発生期間において有害であるとの仮説を立てた。さらに、発明者らは、そのような曝露が、永久的ミトコンドリア機能不全を伴う機能亢進性のＮＦ−κＢ及びＨＭＧタンパク質炎症促進性シグナル伝達を生じると仮定した。
クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、ヒトの腸の慢性炎症を伴う。粘膜損傷及び絨毛破壊は、腸内微生物、腸粘膜、及び免疫成分の間の複雑な相互作用によって引き起こされると考えられているＩＢＤの特徴である。ヒトの腸炎症性疾患におけるこれらの異なる要因の相対的寄与を研究することは、これらのパラメータの独立した制御を可能にする動物またはインビトロモデルが無いため、困難であった。その結果、ヒト腸炎症性疾患の既存のモデルは、静的培養での腸管上皮細胞単層の培養、または、無傷の外植されたヒト腸粘膜の生体外での維持のいずれかに依存している。腸の動的組織環境を考慮すると、これらの静的インビトロ法は、ヒトＩＢＤの病態生理学を忠実に再現できない。とりわけ、プレートで培養した腸管上皮細胞は、絨毛分化を起こしたり、粘液を産生したり、あるいは、正常な腸の様々な特異的細胞型を形成することができない。
臓器チップは、組織及び器官の生理学的機能をモデル化するために、マイクロメーターサイズのチャンバ内で生体細胞を培養するためのマイクロ流体装置である。チャンバを流れる連続的な灌流は、臓器特異的反応の研究のために、生理学的に関連するレベルの流体剪断応力、歪み、及び圧縮を含む物理的応力の組み込みを可能にする。大きな関心事は、対応する生理学的環境を複製でき、かつ、ＩＢＤ病態生理を反映する様式でそれらの複数の成分（微生物叢、粘膜、免疫成分）を動的に組み込むことができる「腸管チップ」を開発するために、かような製作技術を適合化させることにある。これらの目的のために、従来の試みでは、生理学的に関連するルーメン流及び蠕動様の機械的変形の存在下で培養したヒト腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）の利用に成功している。この方法は、増強されたバリア機能、薬物代謝シトクロムＰ４５０活性、及び頂端粘液分泌を有する、小腸の上皮細胞株の４つすべて（吸収、杯、腸内分泌、及びパネート）で裏打ちされた腸絨毛の形成を可能にする。
しかしながら、既存の方法での主たる問題点は、Ｃａｃｏ−２細胞などの癌株は、腸管上皮サブタイプを持たないことにある。したがって、様々な腸のサブタイプに対する細菌及び／または炎症性サイトカインの影響を決定することはできない。加えて、Ｃａｃｏ−２細胞は、ＩＢＤに関連すると現在では理解されている遺伝子変異のレパートリーを有しておらず、それによって、ＩＢＤ遺伝因子の応答をさらに評価する機会が制限されている。最後に、既存のモデルは、免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞）などの他の細胞型を組み込んで、疾患の病状におけるそれらの役割を調べることができない。したがって、これらの多面的な要素が忠実に組み込まれた、改善された腸管臓器チップモデルを確立することが、当該技術分野で待望されている。
このことを試験するために、「臓器チップ」マイクロ流体装置に播種された胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）を、ＥＤＣ汚染物質／混合物の慢性低用量処置（ＴＤＩ範囲）に曝露する。
一例として、幾つかの実施形態において、肥満個体由来のｉＰＳＣ株を、例えば、内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）汚染物質／混合物（例えば、トリブチルスズ（ＴＢＴ）、パーフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、及びビス（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）など）の慢性低用量処置（ＴＤＩ範囲）としての、ＥＤＣすなわち、オビーソゲンを含むがそれに限定されない化合物に対する応答についてのマイクロ流体チップでの試験において、使用した。試験は、発達中の細胞、すなわちｉＨＴＮ及びｉＦＧＥにおける推定の内分泌攪乱化学物質に対する曝露の有害な効果の兆候を決定することを、定量的プロテオミクスによる脱調節分泌タンパク質群を含むがそれに限定されない分析の例と共に含めることを企図する。例示的な結果を、実施例３２に記載する。
本発明は、組織化した構造を有する腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置の製造方法であって、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を単細胞に分離させること、および、当該単細胞を当該装置に加えることを含む、当該方法を提供する。一実施形態において、当該単細胞は、当該装置に加える前に、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。一実施形態において、当該単細胞を当該装置に加えることは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ２０２１９０、及びＡ８３−０１の１つ以上を含む培地での再懸濁を含む。一実施形態において、当該ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、分離の前に、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。一実施形態において、当該ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、リンパ芽球様Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）をリプログラミングしたものである。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、炎症性腸疾患及び／または病態に罹患した対象から得られたリプログラミングされた細胞である。
本発明は、組織化した構造を有する腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置の製造方法であって、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を単細胞に分離させること、および、当該単細胞を当該装置に加えることを含む、当該方法を提供する。一実施形態において、当該単細胞は、当該装置に加える前に、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。一実施形態において、当該単細胞を当該装置に加えることは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ２０２１９０、及びＡ８３−０１の１つ以上を含む培地での再懸濁を含む。一実施形態において、当該ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、分離の前に、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。一実施形態において、当該ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。一実施形態において、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）への当該誘導は、アクチビンＡ及びＷｎｔファミリーメンバー３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）の存在下で誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を培養することによる胚体内胚葉の生成、ＦＧＦと、Ｗｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下で胚体内胚葉を培養することによる後腸への分化、上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、マトリゲルでの上皮スフィアまたは上皮チューブの懸濁、ならびにＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下で培養することを含む。一実施形態において、当該装置は、絨毛を含む組織化した構造を含む。一実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株で裏打ちされる。一実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または、頂端粘液分泌を有する。
本発明は、腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置であって、当該集団は、組織化した構造を含む、当該装置を提供する。一実施形態において、当該組織化した構造は、絨毛を含む。一実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株で裏打ちされている。一実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または、頂端粘液分泌を有する。一実施形態において、当該腸細胞は、単細胞に分離されたヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）に由来し、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。一実施形態において、当該ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）は、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でｉＰＳＣを培養することによる胚体内胚葉の生成、ＦＧＦとＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下で胚体内胚葉を培養することによる後腸への分化、上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、マトリゲルでの上皮スフィアまたは上皮チューブの懸濁、ならびに、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下で培養すること、を含む方法によって、ｉＰＳＣから誘導される。
本明細書に記載するマイクロ流体腸管チップの使用は、ｉＰＳ由来の腸細胞の成熟を改善／増進させる。より具体的には、このようなチップの使用は、成熟の効率を改善し、例えば、ｉＰＳ細胞の前腸への分化は、シナプトフィジン（ＳＹＰ）陽性細胞などの細胞の数を増加させ、腸管上皮の質を改善させる。すなわち、上皮層は、上皮細胞が内包された指状突起へと折り畳まれ、上皮細胞の一部はｉＰＳＣ由来腸細胞を播種した時にヒトの腸の微絨毛を模倣するように、上皮及びピット様領域で裏打ちされた絨毛様構造を模倣するピット様領域によって分離される。さらに、これらの絨毛構造は、基底細胞が分裂し、絨毛の側面を上方に移動するにつれて、連続的に増殖する。さらに、上皮の襞は、非上皮腸細胞を含む。
さらに、このチップは、関連する非上皮細胞タイプの「完全な」セットが発達できる環境を提供する。これらの非上皮性腸細胞として、杯細胞、パネート細胞、内分泌細胞などがあるが、これらに限定されない。
本発明は、細胞及び組織のチップ上での分化／成熟を提供するものであって、当該組織として、腸組織、上皮などがあるが、これらに限定されない。本発明の開発の際に、本発明者らは、流動条件が、指様／絨毛様突起を形成する腸細胞の成熟及び／または分化を促進することを発見した。さらに、媒体の流れが、堅固な細胞間接合部の形成を促進することを発見し、幾つかの実施形態において、これらの堅固な細胞間接合部が、ＴＥＥＲ測定によって検出され、及び／または細胞透過性アッセイによって、細胞間接合部が検出されることを発見した。
ヒトｉＰＳ細胞株に由来する腸内腸管様組織（及び細胞）の使用に関する１つの制限は、生存可能で再現性のあるマイクロ流体腸切片を作製するためにこれらの細胞を特定の期間の間に使用する必要があることにある。しかしながら、本発明の開発の際に、同じヒト腸内細胞の複数のアリコート（すなわち、複製試料）を、これらの細胞を用いた最初の実験から長時間経過した後の実験において使用するための方法及び条件を開発した。あるいは、ヒトｉＰＳ細胞株に由来する腸内腸管様組織細胞は、使用前に、長期間マイクロ流体チップに貯蔵し得る。
本明細書において示したように、本発明者らは、チップ内で増殖した代表的な腸管上皮細胞としてのヒト腸Ｃａｃｏ−２細胞株が、マイクロ流体腸管臓器チップで増殖した腸管上皮の応答と比較して顕著に異なる、化合物に対する応答を示すことを発見した。したがって、これらのチップでの幹細胞由来の腸細胞の使用には、Ｃａｃｏ細胞の使用を超える（例えば、当該幹細胞由来の細胞は、インターフェロンガンマに対して適切な応答を示し、抗菌剤の細胞産生を行うなど）改善が認められる。特に、過去２０年間に使用された広範囲のＣａｃｏ−２細胞株は、元々はヒト結腸腺癌から得た細胞の亜集団、及び／またはクローンである。自発的に分化して、腸細胞／上皮層と同様の特徴を有する単層を形成する能力があることを一つの理由として、Ｃａｃｏ−２細胞株は、腸バリア及び腸管上皮細胞機能のモデルとして広く使用されている。しかしながら、本発明の開発の際に、マイクロ流体腸管チップは化合物に対して、Ｃａｃｏ−２細胞株よりも、「適切な」応答と考えられているヒト腸管上皮応答によく似た応答を示した（例えば、インターフェロンガンマ、抗菌剤の細胞産生などに対する適切な応答）。したがって、本明細書に記載するマイクロ流体腸管臓器チップの使用は、Ｃａｃｏ−２細胞株の使用よりも改善されている。さらに、原発性腸細胞は、マイクロ流体チップで増殖すると、Ｃａｃｏ２細胞よりもより自然な表現型をも示す。
本明細書に記載するマイクロ流体腸管チップの使用は、本明細書に記載するマイクロ流体チップを用いて、疾患をモデル化し得ることを示す。特に、ｉＰＳＣ由来腸細胞を含むマイクロ流体チップは、腸疾患、とりわけ、胃腸障害、炎症性腸障害、胃腸がん細胞、胃腸がん進行、胃腸腫瘍、ポリープ、胃腸管由来の細胞などのための疾患モデルとしての使用を企図する。幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞を産生する際に使用する細胞は、消化管内の小区画から大きな領域にまで至る慢性炎症を伴う一連の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病などを有する患者から取得し得る。したがって、ＩＢＤ患者由来の白血球は、個人化されたチップのためのｉＰＳ細胞を産生するために使用し得る。比較のために、ＩＢＤ患者の白血球を、ｉＰＳ細胞の作製に使用し得る。幾つかの実施形態において、細胞成分、微生物成分などは、健常者、ＩＢＤの症状を示す患者、液体試料、及び生検から直接に取得し得る。
本明細書に記載するマイクロ流体チップ及びシステムの使用、個人化された治療は、患者で使用する前に、当該チップで試験し得る。同じ病気と診断されたすべての患者が、同様に治療に応答するとは限らないことは、当該技術分野では周知である。したがって、治療を受ける同一人物の細胞を用いて当該チップで治療法を試験すると、その患者が、どのように応答するかを決定（例えば、予測）することが可能となる。同様に、診断検査を、疾患の性質を特定し、次いで、例えば、症状を軽減または解消し、または、障害または疾患を治癒するための、適切な治療法を決定するために実施し得る。
本明細書に記載するマイクロ流体腸管チップは、治療法をもたらす個人化された医薬品（例えば、個々の患者に由来するもの）での使用を企図しており、治療対象として、障害、疾患、及び癌（例えば、個々の患者に由来するもの）があるが、これらに限定されない。そのような使用として、個人化された成分、すなわち、免疫細胞などのｉＰＳ由来細胞型、または、便試料由来の細菌での使用があるが、これに限定されない。
さらに、個人化されたチップは、組織分析、例えば、ｉＰＳＣ由来の正常腸構造及び細胞を成長させる能力、及び試験する化合物、例えば、サイトカイン、薬物検査薬、治療薬などに対するｉＰＳＣ由来の腸細胞の応答の分析のために使用し得る。そのようなチップは、１つのタイプの患者由来細胞に限定されるものではなく、他の個人化された成分を有する成長過程にある個人化されたチップでの使用も企図されており、当該成分として、白血球細胞などの腸細胞を誘導するために使用される特定のｉＰＳ由来細胞タイプ、及び常在菌など、例えば、組織生検から取得または由来したもの、体液からの細胞回収物、腫瘍から単離したもの、患者の血液試料に由来する循環白血球細胞の集団から得たもの、応答を試験するため、または、治療での使用を試験するための遺伝的改変を受けた患者の細胞など、免疫細胞などのマイクロ流体腸管チップでの使用を企図する他のタイプの細胞、あるいは、個人化されたマイクロ流体臓器チップにある患者のｉＰＳＣ誘導腸細胞に対して加え得る、糞便試料から単離された微生物、例えば、細菌、真菌、ウイルスなど、微生物などの他のタイプの患者の試料などがあるが、これらに限定されない。実際のところ、個別化した腸管チップは、微生物、微生物などの遺伝子改変を受けた細胞など、当該患者に由来しない生物学的成分を、治療薬を試験に供するために、さらに含み得る。
個人化については上記の通りであるが、ある１人の患者のために開発された、個人化された療法を、別の患者を治療するために使用できる。一例として、ある１人の患者のために開発された治療法は、別の患者、例えば、一卵性双生児、兄弟、親、祖父母、親族など類似の遺伝的一致を有すると考えられる患者を治療するために使用し得る。
本明細書に記載するマイクロ流体腸管チップは、細胞または組織が改変され（例えば、新しい遺伝子、及び／またはタンパク質を発現し、遺伝子またはタンパク質を除去し、例えば、当該遺伝子またはタンパク質の発現が低下し）、次いで、改変された細胞または組織を、改変されていない同じ遺伝子型または表現型の対照細胞または組織と比較する、同系実験での使用を企図する。
同系細胞株とは、インビトロで特定の患者集団の遺伝的特徴をモデル化するために選択または操作された細胞の集団のことを指す。同系ヒト疾患モデルは、疾患生物学の研究、及び治療剤の試験に使用するための同系を提供するために遺伝的に適合した「正常細胞」を有する同系細胞株を含む。
したがって、一実施形態において、遺伝的特徴が一致するｉＰＳＣ、すなわち、クローンは、少なくとも２つの試料へと分離され、一方の試料は対照として使用され、該対照は、遺伝子操作して関心のある１つ以上の遺伝子の発現を改変させた、例えば、遺伝子の過剰発現により、すなわち、特異的または非特異的な、一過性または構成的発現ベクター、ノックイン遺伝子発現を使用することにより遺伝子発現を増大させた、または、過少発現するように、すなわち、サイレンシング構築物または遺伝子ノックアウトを（一過性または構成的発現ベクターにおいて）使用することにより、発現される遺伝子の量を減少させた、または、遺伝子編集された、すなわち、クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）媒介性遺伝子編集に供されたものなどの１つ以上の試料と比較される。しかしながら、一致した対照が存在する限りは、本明細書で示した限定を企図しない事例を理由にして、同系実験の実施手法に制限を課す意図はない。
したがって、一実施形態において、関心のある遺伝子をｉＰＳ細胞または誘導されたオルガノイド細胞のゲノムに挿入することを、この挿入による修飾を受けていない細胞の複製試料と比較するために行う。幾つかの実施形態において、発現レベルを変更する代わりに、遺伝子を細胞内で突然変異させることを、かような突然変異を持たない重複細胞試料と比較するために行う。幾つかの実施形態において、細胞は、マイクロ流体チップに播種する前に改変または突然変異される。他の実施形態において、マイクロチップに播種した後に細胞を改変または突然変異させる。幾つかの実施形態において、遺伝子を改変する代わりに、例えば、遺伝子治療などのために、細胞のゲノムに挿入されたＤＮＡから発現されたタンパク質が改変される。幾つかの実施形態において、例えば、遺伝子治療などのために、タンパク質を発現するための発現ＤＮＡベクターまたはＲＮＡを細胞に導入する。
一実施形態において、関心のある１つ以上の遺伝子に内因性突然変異を含むｉＰＳＣ由来腸細胞の供給源が、臓器チップに播種するための腸細胞の誘導に使用するために選択される。比較のために、例えば、対照となるｉＰＳＣの適合供給源を、関心のある１つ以上の遺伝子に同じ変異を持たない類似の遺伝的背景または同じ遺伝的背景を用いて選択し得る。
本明細書に記載するマイクロ流体腸管臓器チップは、肥満関連障害のモデル化での使用を企図しており、当該障害として、付加的な症状を伴わない肥満個体、及び前糖尿病、糖尿病、すなわち、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病などを含む症状をさらに示している肥満個体などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の開発の際に、正常肥満度指数（ＢＭＩ＜２５）及びＢＭＩ＞５０の超肥満（ＳＯ）と考えられる個体からｉＰＳＣ株を生成し、次いで、チップで試験した。これらの肥満ｉＰＳＣは、内分泌組織−胃腸（ＧＩ）オルガノイド及び視床下部（ＨＴ）ニューロペプチダーゼニューロンへの再分化であった。したがって、胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）を肥満モデル化マイクロ流体チップに播種するために使用した。実施例３１を参照されたい。これらの個体について、ｉＰＳＣ−内分泌細胞から異なる基準の全細胞プロテオームプロファイルを生成した。消化器オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）へのｉＰＳＣの分化は、「臓器チップ」マイクロ流体装置上に細胞を播種する前に行われた。
本明細書に記載するように、マイクロ流体臓器チップは、同一チップ上に、腸細胞と共にニューロンを含む。かようなニューロンとして、ｉＰＳ由来及び非由来（例えば、初代細胞）の双方があるが、これらのタイプの神経に限定されない。したがって、幾つかの実施形態において、生検から単離されたような初代神経細胞をチップに添加し得る。幾つかの実施形態において、ニューロン細胞は、チップに添加するために培養で増殖し得る。さらに、ｉＨＮを播種したチップの観察及び分析は、ニューロン細胞に囲まれた下方のチャネルでのルーメン領域の自発的発生を示した。
本明細書に記載するように、チップに播種する前に適切な細胞を選択することで、絨毛様構造及び種々の非上皮腸細胞を有する腸管上皮（内層）を模倣するチップが得られる。本発明の開発の際に、単細胞懸濁液への腸管様組織の解離に続いて、Ｅ−カドヘリン＋細胞をチップ頂端チャネルに播種するために、Ｅ−カドヘリン選択マーカーを用いて細胞を選別すると、指状の突起を有する腸細胞層をもたらし、そして、絨毛構造を有するインビボ腸管上皮層の折り畳みを模倣することを発見した。さらに、オルガノイド培養物から細胞を回収するための選択試薬の使用が、等価またはさらに良好な品質の上皮を提供する単細胞懸濁液を提供し、チップに播種できることが発見された。したがって、選択試薬の使用は、細胞選別ステップと置き換えることができる。
本発明は、一実施形態において、細胞を培養する方法であって、ａ）上面と底面とを含む膜を含む流体装置を提供すること、ｂ）ｉＰＳ由来細胞を、当該上面または下面に播種すること、及びｃ）当該播種された細胞を、当該播種された細胞を成熟及び／または腸細胞へと分化させることを助ける条件下で培養することを含む、当該方法を企図する。一実施形態において、当該腸細胞は、前腸の腸管上皮細胞、中腸の腸管上皮細胞、及び後腸の腸管上皮細胞からなる群から選択される。一実施形態において、播種された細胞は、パネート細胞、内分泌細胞、及び／または杯細胞へと分化する。好ましい実施形態では、播種された細胞を、流動条件下で培養する。本発明が、装置の厳密な構成、または、細胞の位置によって制限を受けることは、企図されていない。一実施形態において、ｉＰＳ誘導細胞を、当該上面に播種し、当該方法は、当該底面に第２のタイプの細胞を播種することをさらに含む。細胞を評価するために、様々な計測値が企図される。一実施形態において、当該腸細胞は、静的培養で培養した同じ腸細胞と比較して、より成熟した電気生理学的特徴を示す。一実施形態において、流動条件下の培養は、絨毛の形成をもたらす。一実施形態において、播種された細胞は、腸細胞、及び／またはそれらの前駆体が播種に好ましいことを確実にするために、（播種前に）細胞の全集団から選択される。このことを達成するために、播種された細胞は、一実施形態において、オルガノイドから誘導、選択、または、抽出される。一実施形態において、選択した細胞は、前腸前駆細胞、中腸前駆細胞、及び／または後腸前駆細胞を含む。オルガノイドの様々な哺乳動物源を企図するが、好ましい態様において、当該オルガノイドは、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する。本発明が、選択方法、抽出方法、または、誘導方法によって限定されることは、企図されていない。一実施形態において、バイオマーカーを用いて適切な前駆体を同定する。一実施形態において、当該播種された細胞は、選択試薬を用いて当該オルガノイドから選択される。本発明は、疾患をモデル化するために細胞を使用できることを企図する。一実施形態において、当該オルガノイドは、胃腸障害と診断されたヒト患者由来の誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、大腸炎と診断された患者に由来する。流動は、腸細胞の成熟及び分化を促進することができる。一実施形態において、流動条件は、剪断力を生成する流速で培養培地を流動させることを含む。一実施形態において、当該流動は、堅固な細胞間接合の形成を促進する。一実施形態において、当該方法は、堅固な細胞間接合部を検出することをさらに含む。このことは、多くの方法で行うことができる。一実施形態において、当該堅固な細胞間接合部は、ＴＥＥＲ測定によって検出される。一実施形態において、当該堅固な細胞間接合部は、細胞透過性アッセイによって検出される。
上記のように、当該装置は、いくつかの方法で構成することができる。一実施形態において、当該膜の当該上面は、第１のチャネルの底面を画定し、当該膜の当該底面は、第２のチャネルの上面を画定する。本発明が、腸細胞の使用に限定されることは企図しておらず、他の細胞及び薬剤を、腸細胞と共に使用することができる。一実施形態において、当該方法は、免疫細胞、サイトカイン、及び／または微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス）を、当該腸細胞と接触させることをさらに含む。一実施形態において、細菌を、当該腸細胞と接触させる。細菌（病原性のまたは正常なフローラのいずれか）を腸細胞と接触させることは、これらの細胞の相互作用の研究を可能にする。さらに、そのことは、薬物検査を可能にする。一実施形態において、当該方法は、当該細菌に対して候補抗菌剤を試験することをさらに含む。ウイルスを腸細胞と接触させることにより、ウイルスとこれらの細胞との相互作用の研究が可能になる。加えて、そのことは、薬物検査を可能にする。一実施形態において、当該方法は、候補抗ウイルス剤を試験することをさらに含む。
本発明は、腸細胞が適切なマーカーを発現することを企図する。一実施形態において、当該腸細胞は、マーカーであるＥ−カドヘリンを発現する。また、本発明は、腸細胞が、分子（例えば、サイトカイン、抗菌剤など）を分泌することも企図する。一実施形態において、本方法は、当該腸細胞による抗菌剤（または、サイトカイン）の産生を検出するステップをさらに含む。
本発明は、細胞を培養するための様々なプロトコールを企図する。本発明を、特定の培養期間に限定することは意図していない。一実施形態において、当該培養ステップｃ）は、少なくとも４日間、より一般的には７日間、または、１０日間、または、実に、１４日間、または、それ以上行われる。
本発明は、成熟及び分化を増強するために培地に因子を導入することを企図する。一実施形態において、当該培養培地は、１つ以上の増殖因子（例えば、ノギン、ＥＧＦなど）を含む。
流体装置は、いくつかの特徴を有し得る。一実施形態において、当該流体装置は、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをさらに含み、当該培地は、当該入口ポートから入り込み、そして、当該出口ポートから出される。
また、本発明は、一実施形態において、細胞を培養する方法であって、ａ）上面と底面とを含む膜を含むマイクロ流体装置を提供すること、ｂ）播種された細胞が生成されるように、当該上面に、幹細胞に由来するオルガノイド細胞を播種すること、ｃ）当該播種された細胞を、ある期間、培養培地の流れに曝露すること、及びｄ）当該播種された細胞を、当該オルガノイド細胞を成熟及び／または腸細胞へと分化させるような条件下で培養することを含む、当該方法を企図する。「腸細胞」は、いくつかの種類であることができる。一実施形態において、当該腸細胞は、前腸の腸管上皮細胞、中腸の腸管上皮細胞、及び後腸の腸管上皮細胞からなる群から選択される。当該マイクロ流体装置は、いくつかの設計／構成（例えば、１つのチャネル、２つのチャネル、３つ以上のチャネル）を有することができる。一実施形態において、当該マイクロ流体装置は、当該膜の当該上面と流体連絡する第１のマイクロ流体チャネルと、当該膜の当該底面と流体連絡する第２のマイクロ流体チャネルとを含み、当該第１及び第２のマイクロ流体チャネルの各々は、当該膜に対して平行な面を含み、かつ、各々が側壁を含む。本発明は、マイクロ流体装置内のただ一種類の細胞だけに限定されることを企図しておらず、（腸細胞に加えて）他の細胞型を用いることができる。一実施形態において、当該視床下部ニューロンが当該第２のマイクロ流体チャネルにある。これらの細胞の特定の位置に限定されないが、一実施形態において、当該視床下部ニューロンは、当該第２のマイクロ流体チャネルの平行面及び側壁で成長して、ルーメンを形成するようになる。ここでも、腸細胞（または、それらの前駆体）が、適切なバイオマーカーを発現することが望ましい。一実施形態において、当該腸細胞（または、それらの前駆体）は、マーカーであるＥ−カドヘリンを発現する。
細胞がマイクロ流体装置内で培養される際に、本発明は、透明な窓によって、装置を分析することによって、出口ポートから細胞（または、細胞生成物）を回収することによって、または、ひいては、装置の一部分を通して薄片にする（切断する、スライシングする、など）ことによって評価することができることを企図する。好ましい実施形態では、当該方法は、当該第１または第２のチャネルを薄片にして、（当該細胞を染色してまたは染色せずに、当該細胞を抗体反応させてまたはさせずに）当該細胞を視覚化するステップをさらに含む。
本発明は、細胞を培養するための様々なプロトコールを企図する。本発明は、特定の培養期間に限定することは意図していない。一実施形態において、培養ステップｃ）は、少なくとも４日間、より一般的には７日間、または、１０日間、または、さらに１４日間、またはそれ以上行われる。
上記のように、当該マイクロ流体装置は、いくつかの設計及び特徴を有し得る。一実施形態において、当該マイクロ流体装置は、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをさらに含み、当該培地は、当該入口ポートから入り込み、そして、当該出口ポートから出される。
当該オルガノイドをマイクロ流体装置に入れることができるが、最初に、細胞をオルガノイドから分離させて単細胞にすることが好ましい。さらに、所望の細胞を選択し、選別し（例えば、ＦＡＣＳを使用して）、抽出するか、さもなければ、当該オルガノイドから誘導することが、好ましい。一実施形態において、当該オルガノイド細胞は、オルガノイドから選択されたか、抽出されて、前腸前駆細胞、中腸前駆細胞、及び／または後腸前駆細胞を含む。一実施形態において、当該オルガノイドは、ヒト誘導多能性幹細胞から誘導される。一実施形態において、当該播種された細胞は、選択試薬を用いて当該オルガノイドから選択した。一実施形態において、当該播種された細胞は、選択試薬を用いて選択した後、ステップｂ）の前に、凍結され、貯蔵され、次いで、解凍された。貯蔵は、数日、数週間、数ヶ月、または、それ以上の期間が可能である。
当該マイクロ流体装置は、疾患を研究するために使用することができる。一実施形態において、当該オルガノイドは、胃腸障害と診断されたヒト患者由来の誘導多能性幹細胞に由来する。特定の障害に限定されることを意図するものではないが、一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、大腸炎と診断された患者に由来する。
様々な培養条件が、企図される。一実施形態において、当該培養培地は、１つ以上の増殖因子（例えば、ノギン、ＥＧＦなど）を含む。
別の実施形態において、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）ｉ）幹細胞由来オルガノイド細胞及びｉｉ）上面と底面とを含む膜を含むマイクロ流体装置を提供すること、ｂ）当該オルガノイド細胞を選択試薬に供して、選択した細胞を生成すること、ｃ）当該選択した細胞を凍結して貯蔵すること、ｄ）当該選択した細胞を、融解して、播種された細胞が作製されるように当該マイクロ流体装置の当該膜の当該上面に播種すること、ｅ）当該播種された細胞を、ある期間にわたって培養培地の流れに曝露すること、及びｆ）当該播種された細胞を、当該選択した細胞を成熟及び／または腸細胞へと分化させる条件下で培養することを含む、当該方法を企図する。一実施形態において、当該腸細胞は、前腸の腸管上皮細胞、中腸の腸管上皮細胞、及び後腸の腸管上皮細胞からなる群から選択される。様々な設計／構成が企図されるが、一実施形態において、当該マイクロ流体装置は、当該膜の当該上面と流体連絡する第１のマイクロ流体チャネルと、当該膜の当該底面と流体連絡する第２のマイクロ流体チャネルとを含み、当該第１及び第２のマイクロ流体チャネルの各々は、当該膜に対して平行な面を含み、かつ、各々が側壁を含む。この方法は、腸細胞だけを播種することに限定されることは意図していない。一実施形態において、当該視床下部ニューロンが当該第２のマイクロ流体チャネル内にある。これらの細胞の特定の位置に限定されないが、一実施形態において、当該視床下部ニューロンは、当該第２のマイクロ流体チャネルの平行面及び側壁上で成長して、ルーメンを形成するようになる。様々なバイオマーカーを評価することができる。一実施形態において、当該腸細胞は、マーカーであるＥ−カドヘリンを発現する。本発明は、特定の貯蔵量に限定されることは意図しておらず、数日、数週間、数ヶ月以上の貯蔵が可能である。一実施形態において、ステップｃ）での当該選択した細胞の当該貯蔵は、少なくとも１ヶ月間行われる。同様に、本発明は、いかなる厳密な培養期間に限定されることも、意図されていない。一実施形態において、ステップｆ）での当該培養は、少なくとも４日間、より一般的には７日間、または、１０日間、または、１４日間以上かけて実施される。当該マイクロ流体装置は、さらなる特徴を有することができる。例えば、一実施形態において、当該マイクロ流体装置は、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをさらに含み、当該培地は、当該入口ポートから入り込み、当該出口ポートから出される。
上記のように、本方法でのこの実施形態は、ｂ）前記オルガノイド細胞を選択試薬に供して、選択した細胞を生成することを、企図する。一実施形態において、当該選択した細胞は、前腸前駆細胞、中腸前駆細胞、及び／または後腸前駆細胞を含む。一実施形態において、当該オルガノイドは、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該オルガノイドは、胃腸障害と診断されたヒト患者に由来する誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、大腸炎と診断された患者に由来する。
さらに別の態様において、本発明は、ａ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）細胞へと分化させること、ならびに、ｂ）当該細胞を臓器チップマイクロ流体装置上に播種することを含む方法を企図する。一実施形態において、当該オルガノイドは、前腸前駆細胞、中腸前駆細胞、及び／または後腸前駆細胞を含む。一実施形態において、この方法は、ｃ）当該播種された細胞を、当該オルガノイド由来の当該播種された細胞を成熟及び／または腸細胞へと分化させることを助ける流動条件下で培養することを、さらに含む。一実施形態において、当該オルガノイドは、胃腸障害と診断されたヒト患者に由来する誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該誘導多能性幹細胞は、大腸炎と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該オルガノイドは、異常な肥満度指数を示すヒトに由来する誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該肥満指数は、５０より大きい。一実施形態において、細胞を、当該オルガノイドから選択し、凍結貯蔵し、次いで、ステップｂ）の前に解凍した。ここでも、様々なマイクロ流体装置の設計を企図する。一実施形態において、当該臓器チップマイクロ流体装置は、上面及び底面を含む膜を含み、当該オルガノイドに由来する細胞は、当該上面に播種され、当該ニューロンは、当該底面に播種される。一実施形態において、当該臓器チップマイクロ流体装置は、当該膜の当該上面と流体連絡する第１のマイクロ流体チャネルと、当該膜の当該底面と流体連絡する第２のマイクロ流体チャネルとを含み、当該第１及び第２のマイクロ流体チャネルの各々は、当該膜に対して平行な面を含み、かつ、各々が側壁を含む。一実施形態において、当該ニューロンは、当該第２の流体チャネルの平行面及び側壁に存在して、ルーメンを構成するようになる。
さらに別の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）マイクロ流体装置、ｉｉ）腸細胞、及びｉｉｉ）視床下部ニューロンを提供すること、ならびに、ｂ）当該細胞を当該マイクロ流体装置上に播種することを含む、方法を企図する。一実施形態において、当該腸細胞は、初代細胞である。別の実施形態において、当該腸細胞は、幹細胞に由来する（例えば、当該幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である）。一実施形態において、この方法は、ｃ）当該播種された細胞の成熟及び／または分化を助ける流動条件下で、当該播種された細胞を培養することを、さらに含む。
方法に加えて、本発明は、キット及びシステムを企図する。キットは、マイクロ流体装置及びオルガノイド細胞（新鮮なもの、または、凍結したもの）を、当該装置に対して細胞を播種する方法に関する指示書と共に提供することができる。システムには、いくつかの構成要素を含めることができる。例えば、一実施形態において、当該システムは、ａ）上面及び下面を含む膜を含む流体装置であって、当該上面が、一次腸細胞または幹細胞由来腸細胞を含み、当該マイクロ流体装置が、当該膜の当該上面と流体連絡する第１のマイクロ流体チャネルと、当該膜の当該底面と流体連絡する第２のマイクロ流体チャネルとを含む、当該流体装置、ならびに、ｂ）当該第１及び当該第２の流体チャネルと流体連絡する流体源を含み、それにより、当該細胞は、流速で流体に曝露される。このシステムは、１つのタイプの細胞だけに限定されることはない。一実施形態において、当該システムは、ｉＰＳＣ由来ニューロン（及び特に、視床下部ニューロンであるｉＰＳＣ由来ニューロン）をさらに含む。一実施形態において、幹細胞由来の腸細胞及びｉＰＳＣ由来の視床下部ニューロンは、同じ人物の幹細胞から生成される。別の実施形態において、幹細胞由来腸細胞及びｉＰＳＣ由来視床下部ニューロンは、異なる人々の幹細胞から生成される。一実施形態において、幹細胞由来腸細胞は、胃腸障害と診断されたヒト患者に由来する。一実施形態において、当該幹細胞由来腸細胞は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該幹細胞由来腸細胞は、大腸炎と診断された患者に由来する。一実施形態において、当該幹細胞由来腸細胞は、異常な肥満度指数を有するヒトに由来する。一実施形態において、当該肥満指数は、５０より大きい。
また、本発明は、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を単細胞へと分離させること、および当該装置に対して当該単細胞を加えることを含む、腸細胞をマイクロ流体装置に負荷する方法を企図する。当該装置は、いくつかの設計（例えば、１つ以上のチャネル、１つ以上の膜など）を有することができる。一実施形態において、当該単細胞は、当該装置に添加する前に、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。一実施形態において、当該単細胞を当該装置に加えることは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ２０２１９０、及びＡ８３−０１の１つ以上を含む培地での再懸濁を含む。一実施形態において、ＨＩＯは、分離の前に、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養される。一実施形態において、ＨＩＯは、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。一実施形態において、ｉＰＳＣは、リプログラミングしたリンパ芽球様Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）である。一実施形態において、当該ｉＰＳＣは、炎症性腸疾患及び／または病態に罹患している対象から得られたリプログラミングされた細胞である。一実施形態において、ｉＰＳＣからのＨＩＯの誘導は、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でｉＰＳＣを培養することによる胚体内胚葉の生成、ＦＧＦとＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下での胚体内胚葉の培養による後腸への分化、上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、ゲルマトリックス（例えば、マトリゲル）での上皮スフィアまたは上皮チューブの懸濁、ならびに１つ以上の増殖因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦ）の存在下での培養を含む。好ましい実施形態において、当該腸細胞は、絨毛を含む組織化した構造を形成する。一実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株で裏打ちされている。一実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または頂端粘液分泌を有する。
また、本発明は、腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置のような装置であって、当該集団が、組織化した構造を含む、当該装置を企図する。好ましい実施形態において、組織化した構造は、絨毛を含む。一実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株を伴うか、あるいは、それらで裏打ちされている。一実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または、頂端粘液分泌を有する。一実施形態において、当該腸細胞は、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）に由来しており、単細胞へと分離され、そして、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。一実施形態において、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でｉＰＳＣを培養することによって胚体内胚葉を生成すること、ＦＧＦとＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下で胚体内胚葉を培養して後腸へと分化させること、上皮スフィアまたは上皮チューブを回収すること、ゲルマトリックス（例えば、マトリゲル）にて上皮スフィアまたは上皮チューブを懸濁すること、ならびに、１つ以上の増殖因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦ）の存在下で培養することを含む方法によって、ＨＩＯは、ｉＰＳＣから誘導される。
定義
本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
本明細書での記載、及び添付の特許請求の範囲を通して使用されているように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上、明確に別様に定めない限りは、複数の言及を含む。また、本明細書での記載において使用されているように、「ｉｎ」の意味は、文脈上、明確に別様に定めない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。
本明細書において「腸」細胞に関して使用されている「胃腸の」（ＧＩ）または「胃腸管」または「腸」とは、ＧＩ管の任意の領域で認められる任意の細胞、及びＧＩ管に認められる細胞と類似の生物化学的特徴、及び／または構造的特徴を有する分化した細胞のことを指す。ＧＩの領域は、前腸、中腸、及び後腸の領域を含む。したがって、腸細胞は、前腸様、中腸様、及び後腸様の性質を有する分化した細胞を有するこれらの領域の各々から得ることができる。本発明は、ＧＩ管構造の一部となる細胞、例えば、胃腸細胞、小腸細胞、腸管上皮細胞、分泌細胞、内分泌細胞、神経細胞、筋細胞、間質細胞などを「腸細胞」とすることを企図する。
ルーメンという用語は、管状または中空構造の中央空洞などの内部開放空間を有する構造のことを指す。一例として、チューブを形成する細胞によって囲まれた内側の開放空間がある。チューブは、円形である必要はない。したがって、細胞が、マイクロ流体チャネルのすべての側面で増殖する場合、ルーメンが存在することができる。
例示的な実施形態を、参照した図面に示す。本明細書に開示する実施形態及び図面は、例示目的のものでしかなく、限定的であるとみなされないものとする。
ヒトｉＰＳＣは、ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及びレチノイン酸シグナル伝達の調節によって、内分泌的に活性な前腸スフェロイド（ｉＦＧＥ）へと分化する。（Ａ）例示的な前腸スフェロイド（ｉＦＧＥ）分化プロトコールの概略図。（Ｂ）前腸遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲは、本発明者らの２０日目のｉＦＧＥにおいて、０日目と比較して、有意に増加した（＊＊ｐ＜０．０１）ことを示し、ＮＤは、検出不可である。二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、０日目及び２０日目のｉＦＧＥにおける差異を決定した。（Ｃ）６日目及び２０日目のｉＦＧＥの明視野画像。（Ｄ）前腸上皮マーカーであるＥ−カドヘリン（ＣＤＨ１）、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ）、ならびに、内胚葉及び前腸前駆細胞Ｓｏｘ２及びＳｏｘ１７を示すパネル。（Ｅ）シナプトフィジン（ＳＹＰ）、ソマトスタチン、及びセロトニンなどの神経内分泌マーカーの発現を示すパネル、（Ｆ）グレリン、ペプチドＹＹ、及びガストリンなどの胃内分泌陽性細胞を示すパネル（上から下）。ここに示したデータは、独立した実験で、複数回分化した２つのｉＰＳＣ系の平均結果を表す。 機能的ニューロペプチダーゼ性視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）は、ＳＨＨの活性化、及びＷＮＴシグナル伝達の阻害によって、ｈｉＰＳＣ−神経上皮細胞から誘導することができる。（Ａ）例示的な視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）分化プロトコールの概略図。（Ｂ）視床下部及び弓状核特異的遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲは、０日目と比較して、４０日目の分化で、遺伝子発現が有意に増加していることを示している（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。ＮＤ：検出不可。０日目及び４０日目でのｉＨＴＮの差異を決定するために、二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。（Ｃ）ＥＬＩＳＡを用いて、細胞上清から測定した視床下部特異的神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）の測定（対応のあるｔ−検定を用いてｐ＜０．００１と決定した）。（Ｄ）ＥＬＩＳＡを用いて、細胞上清から測定した視床下部特異的α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の測定（対応のあるｔ−検定を用いて＊＊＊ｐ＜０．００１と決定した）。（Ｅ−Ｎ）パネルは、視床下部前駆細胞及びニューロペプチダーゼマーカーに対する免疫陽性を示す。（Ｏ）０日目及び４０日目における同じ電極からの経時的なニューロンのＭＥＡ読み取り値は、４０日目のニューロンにおけるニューロン発火の増大を示している。ここに示した画像とデータは、独立した実験で、複数回分化した２つのｉＰＳＣ系の平均結果を表す。 慢性低用量ＥＤＣ処置は、細胞生存率に影響を与えずに、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮにおけるＮＦ−κＢシグナル伝達を撹乱する。（Ａ）ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮに関して実施されたＥＤＣ処置及び分析の概略図。（Ｂ）ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮに関して実施された処置計画を示すＥＤＣ処置の概略図。（Ｃ）免疫細胞化学は、グレリン（緑）で同時染色したｉＦＧＥにおけるホスホｐ６５（赤色）（＊＊＊ｐ＜０．００１）の増加を示す。（Ｄ）免疫細胞化学は、シナプトフィジン（緑色）で同時染色したｉＨＴＮにおけるホスホｐ６５（赤色）（＊＊＊ｐ＜０．００１）の増加を明らかにしている。（Ｅ）代表的なウェスタンブロット及び数量的棒グラフは、ｉＦＧＥにおけるホスホｐ６５タンパク質レベルでの増加を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｆ）代表的なウェスタンブロット及び数量的棒グラフは、ｉＨＴＮ（ｎ＝４）におけるホスホｐ６５タンパク質レベルの増加を示す。＊＊ｐ＜０．０１。Ｇ及びＨ。ＭＴＴアッセイは、あらゆるＥＤＣ処置において、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮのいずれにおいても、細胞生存率に有意差を示さない。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。示すデータは、独立した実験で、ｎ＝３回の分化をした２つのｉＰＳＣ系の平均結果を表す。 ＥＤＣ処置は、古典的及び非古典的経路における増加を示す。（Ａ及びＤ）Ａ）ＮＦ−κＢ古典的及び非古典的経路の概略である。（Ｂ及びＥ）ｉＦＧＥにおけるｐ５０及びｐ５２レベルの増加を示す、代表的なウェスタンブロット及び数量的棒グラフ、＊＊＊ｐ＜０．００１、（Ｃ及びＦ）ｉＨＴＮにおけるｐ５０及びｐ５２レベルの増加を示す代表的なウェスタンブロット及び数量的棒グラフ（ｎ＝４）、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＥＤＣはミトコンドリア呼吸を攪乱することにより代謝活性に影響を及ぼす。（Ａ〜Ｂ）ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮのそれぞれにおける予備呼吸能の変化を表す数量的棒グラフを用いたミトコンドリア呼吸のシーホースアッセイ測定値、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＥＤＣは、ｉＦＧＥにおける核及びミトコンドリアでコードされた呼吸遺伝子の双方の発現を減少させる。ｉＦＧＥからのミトコンドリア呼吸に関与する核（ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ）及びミトコンドリア（ＣＹＴＢ５）がコードした遺伝子の相対正規化ＲＴ−ｑＰＣＲ発現（Ｃ〜Ｄ）。（Ｃ）核ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴによってコードされたミトコンドリア遺伝子のｍＲＮＡレベルを示すＲＴ−ｑＰＣＲ。（Ｄ）核がコードしたミトコンドリア遺伝子ＴＦＡＭ、及びミトコンドリアがコードした遺伝子ＣＹＢ５ＡのｍＲＮＡレベルも、ｉＦＧＥのＥＤＣ処置で減少した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ＝３、及びｉＨＴＮ（Ｅ〜Ｆ）。ＥＤＣ処置は、これらの遺伝子の発現を有意に減少させた＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＮＤ：検出不可。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＮＦ−κＢ阻害は、ヒト前腸上皮における、ＮＦ−κＢ経路活性化、及びミトコンドリア機能障害から細胞を救済する。（Ａ）免疫ブロットは、例示的なＮＦ−κＢｉ処理が、ホスホｐ６５、ｐ５０、及びｐ５２におけるＥＤＣ媒介性の増加を減少させることを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び３（媒体１、併用１、及び、ＮＦκＢｉ１）、及び２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び６（媒体２、併用２、及び、ＮＦκＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（Ｂ）ビヒクル処置（媒体）でのホスホｐ６５染色、ＥＤＣ併用処置（併用）で増加したホスホｐ６５（ＮＦ−κＢｉで減少）を示す免疫細胞化学、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）併用処置と比較した、ＮＦ−κＢｉ処置時の改善されたミトコンドリア呼吸を示すシーホースアッセイ、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）ＮＦ−κＢｉ処置で救済されるミトコンドリア呼吸遺伝子の、併用処置での減少を示すＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及びＣＹＴＢ５のＲＴ−ｑＰＣＲ発現レベル、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＮＦ−κＢ阻害は、ヒトの視床下部ニューロン培養におけるＮＦ−κＢ経路活性化、及び、ミトコンドリア機能障害から細胞を救済する。（Ａ）免疫ブロットは、例示的なＮＦ−κＢｉ処置が、ホスホｐ６５、ｐ５０、及びｐ５２におけるＥＤＣ媒介性の増加を減らすことを示す、＊ｐ＜０．０５。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び、３（媒体１、併用１、及び、ＮＦκＢｉ１）、及び２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び、６（媒体２、併用２、及び、ＮＦκＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（Ｂ）ビヒクル処理（媒体）でのホスホｐ６５染色、ＥＤＣ併用処置（併用）で増加したホスホｐ６５（ＮＦ−κＢｉで減少）を示す免疫細胞化学、＊＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）併用処置と比較した、ＮＦ−κＢｉ処置時の改善されたミトコンドリア呼吸を示すシーホースアッセイ、＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＮＦ−κＢｉ処置で救済されるミトコンドリア呼吸遺伝子の、併用処置での減少を示すＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及びＣＹＴＢ５のＲＴ−ｑＰＣＲ発現レベル、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＰＢＭＣ由来ｉＰＳＣの特徴付け。（Ａ）ｉＰＳＣのエピソームリプログラミング及び生成を示す概略図。（Ｂ）ＳＳＥＡ、ＯＣＴ４、ＴＲＡ−１−６０、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＯＸ２などの多能性表面マーカーに対して高いアルカリホスファターゼ活性と免疫陽性とを示す２つの対照株（８０ｉ対照、及び、２０１ｉ対照）由来のリプログラミングされたｉＰＳＣコロニーの明視野画像。（Ｃ）２つの対照株の遺伝子チップ、及びバイオインフォマティクスＰｌｕｒｉＴｅｓｔの特徴付け。（Ｄ）両細胞株の正常な表現型を示すＧバンド核型。（Ｅ）リプログラミングプラスミドのクリアランスを示している両方のｉＰＳＣ株のｑＰＣＲ。（Ｆ）２つのｉＰＳＣ株にＥＢＮＡ因子が存在しないことを示しているアガロースゲル電気泳動。 ＥＤＣ用量応答を決定するＭＴＴアッセイ。（Ａ）ＰＦＯＡ、（Ｃ）ＴＢＴ、及び（Ｅ）ＢＨＴの半対数用量に対する用量応答を示す例示的なグラフ。強調した用量を、この試験で使用している。長期間ＰＣＲ ＤＮＡ損傷アッセイとして、高用量の（Ｂ）ＰＦＯＡ、（Ｄ）ＴＢＴ、（Ｆ）ＢＨＴ、及び（Ｇ）Ｍｔ ＤＮＡアッセイを用いて治療を施したｉＨＴＮに関するＭＴＴアッセイの光学密度値を表す棒グラフであり、ＥＤＣ処置でミトコンドリアＤＮＡ病変の欠如を示していることを示している。注記：ＴＢＴ及び併用処置単独では、核ＨＰＲＴ及び平均核病変のわずかな増加が観察された。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎ＝３。 ｉＦＧＥ分化効率及び完全免疫ブロット。図３及び４に示したｉＦＧＥ免疫ブロットの元の画像。（ａ）ｉＦＧＥ培養におけるＥ−カドヘリン陽性細胞のＩＣＣ定量は、未治療とＥＤＣ処置との条件下で、上皮形成能に差異を示さない。（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。図４に示したｉＦＧＥ試料の完全免疫ブロット。 分化したｉＨＴＮにおける無傷のｐ５３タンパク質発現。ＥＤＣ処置は、ｉＨＴＮ分化効率及び完全ｉＨＴＮ免疫ブロットに影響しない。図３及び４に示したｉＨＴＮ免疫ブロットの元の画像。（ａ）２０１ｉ対照及び８０ｉ対照における全ｐ５３タンパク質の発現を示す４０日目のｉＨＴＮ。（ｂ）ｉＨＴＮ分化におけるＯＴＰ＋／ＴｕＪ１＋細胞の定量、（ｃ〜ｆ）図４に示したｉＨＴＮ免疫ブロットの元の画像。 均等ミトコンドリア質量の尺度としてのＣｏｘ ＩＶ濃度測定。使用する試料での負荷対照として、及び、ミトコンドリア質量の尺度として用いた等量のシトクロムＣオキシダーゼ４を明らかにする、Ｃｏｘ ＩＶ濃度測定を示す例示的なグラフ。使用する試料での負荷対照として、及び、ミトコンドリア質量の尺度として用いた（Ａ）ｉＦＧＥ、及び（Ｂ）ｉＨＴＮでの等量のシトクロムＣオキシダーゼ４を明らかする、Ｃｏｘ ＩＶ濃度測定。 均等ミトコンドリア質量の尺度としてのＣｏｘ ＩＶ濃度測定。ｉＦＧＥブロット、及び閾値に基づいた定量の元の画像。（ａ）ＥＤＣ処置した条件と比較した、ＮＦκＢｉ処理時のＥＲストレスマーカーの救済を示さないｉＦＧＥにおけるウェスタンブロット。（ｂ）図１８に示すｉＦＧＥブロットの元の画像。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び、３（媒体１、併用１、及びＮＦκＢｉ１）、及び２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び、６（媒体２、併用２、及びＮＦκＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（ｃ）特定のホスホｐ６５シグナルを測定するための閾値ツールを利用した、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓを用いるｉＦＧＥにおけるホスホＮＦ−κＢ ｐ６５の免疫細胞化学染色の定量。このパネルは、各処置における閾値処理後の画像を示している。ｎ＝３。 ｉＨＴＮブロット、及び閾値に基づいた定量の元の画像。（ａ）ＥＤＣ処置された条件と比較した、ＮＦ−κＢｉブロット処置におけるホスホｐ５３（Ｓｅｒ１５）レベルにおいて、救済が認められないことを例示的に示す免疫ブロット。＊ｐ＜０．０５。（ｂ）図１９に示すｉＨＴＮブロットの元の画像。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び３（媒体１、併用１、及びＮＦκＢｉ１）、及び、２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び６（媒体２、併用２、及びＮＦκＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（ｃ）特定のホスホｐ６５シグナルを測定するための閾値ツールを利用した、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓを用いるｉＨＴＮにおけるホスホＮＦ−κＢ ｐ６５の免疫細胞化学染色の定量。このパネルは、各処置における閾値処理後の画像を示している。ｎ＝３。 細胞生存率への影響を伴わないｉＦＧＥ及びｉＨＴＮにおける慢性低用量ＥＤＣ処置ＥＲストレス。（Ａ及びＢ）（Ａ）ｉＦＧＥ、及び、（Ｂ）ｉＨＴＮにおける、真正なＥＲストレス経路タンパク質、ＩＲＥ１、ＢｉＰ、及び、Ｅｒｏ１のレベルを示す代表的な免疫ブロット。負荷対照としてＣｏｘ ＩＶに正規化された各タンパク質免疫ブロットの各々についてのバンドのＩｍａｇｅＪに基づいた濃度測定法を用いた定量ヒストグラムを以下に示し、ビヒクル処理対照と比較した倍率変化として表した。ＥＤＣ曝露に応答してＩＲＥ１タンパク質は増加するが、ＢｉＰ及びＥｒｏ１レベルは、減少する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｅ及びｆ）ＭＴＴアッセイは、（ｅ）ｉＦＧＥ及び（ｆ）ｉＨＴＮの双方において、ＥＤＣ曝露を受けても細胞生存率に有意差を示さない。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示したデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。この情報は、図３を補足するものである。 ＥＤＣ処置は、ＮＦ−κＢ ｐ６５古典的及び非古典的経路において障害を起こす。（ａ）上部パネル。グレリン（緑）で同時染色したｉＦＧＥにおけるホスホｐ６５（赤）の増加を示す代表的な免疫細胞化学（ＩＣＣ）。下部パネル。シナプトフィジン（緑）で同時染色したｉＨＴＮでのホスホｐ６５（赤）の増加を示す代表的なＩＣＣ。（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ビヒクル対照処置ｉＦＧＥ（＊＊＊ｐ＜０．００１）、及び、ｉＨＴＮ（＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して、ＥＤＣ処置の各々におけるリン酸化ＮＦ−κＢ ｐ６５免疫陽性細胞における倍率変化によって表される、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの双方について、免疫陽性細胞のスコアリングと定量をした。（ｂ）ｉＦＧＥ、＊＊＊ｐ＜０．００１、及びｃ）ｉＨＴＮ、＊＊＊ｐ＜０．００１におけるリン酸化ｐ６５、全ｐ５０、及び、全ｐ５２レベルの増加を示す全細胞溶解物でのタンパク質レベルの代表的な免疫ブロット。各免疫ブロットの各々についてのバンドのＩｍａｇｅＪに基づいた濃度測定法を用いた定量ヒストグラムを以下に示し、ビヒクル処理対照と比較した倍率変化として表す。全ｐ６５、ｐ５０／１０５（古典的）及びｐ５２／ｐ１００（非古典的）に対するリン酸化ＮＦ−κＢ ｐ６５の比率を計算した。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。示す画像及びデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。この情報は、図４を補足するものである。 ＥＤＣは、代謝ストレスを誘発し、及び、内分泌調節を撹乱する。（ａ） ＥＤＣ曝露を受けると、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮ（＊＊＊ｐ＜０．００１）の双方におけるリン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の減少を例示する免疫ブロット、（ｂ）ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの予備呼吸能の変化を表すヒストグラムを用いたシーホースミトコンドリア呼吸測定値、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、（ｃ）ｉＨＴＮ由来のミトコンドリア呼吸に関与する、核（ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ）遺伝子及びミトコンドリアがコードした（ＣＹＢ５Ａ）遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ相対正規化発現。（ｄ）表に示す、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、ＣＹＢ５Ａ、ＴＰ５３、及びＲＥＬＡ遺伝子のＤＮＡに関するＮＦ−κＢ ｐ６５（ＲｅｌＡ）及びｐ５３転写因子の推定結合モチーフは、可能な結合部位の数、及び、転写開始部位からの距離を、７０％の信頼水準で示す。赤色のフォントＩＬ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ａは、それぞれ、ｐ６５及びｐ５３によって、プラスに調節される遺伝子であることが知られている。（ｅ）ＥＤＣ処置で減少するＡＴＰレベル（ＡＴＰ／ＡＤＰ比）の測定値、（ｆ）ＥＤＣ処置したｉＦＧＥにおけるＰＹＹレベルの減少を示す免疫ブロット。（ｇ）ｉＨＴＮのＥＤＣ処置による分泌の減少を示すα−ＭＳＨのＥＬＩＳＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３。ＮＤ：検出不可。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示したデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。この情報は、図５を補足するものである。 ＮＦ−κＢの遮断は、ＥＤＣ媒介代謝ストレス及び内分泌機能不全を救済する。例示的なＮＦ−κＢｉ処置が、（ａ）ｉＦＧＥ及び（ｂ）ｉＨＴＮにおけるホスホｐ６５、ｐ５０、及びｐ５２のＥＤＣ媒介性の増加を抑制することを示す免疫ブロット、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び３（媒体１、併用１、及びＮＦκＢｉ１）、及び、２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び６（媒体２、併用２、及びＮＦκＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（ｃ）ビヒクル処理（媒体）におけるリン酸化ｐ６５染色、ＥＤＣ併用処置（併用）でのホスホ−ｐ６５の増加（ＮＦ−κＢｉで減少）を示す免疫細胞化学、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｄ）ｉＨＴＮにおける、併用処置と比較した、ＮＦ−κＢｉ処置を行った時のミトコンドリア呼吸の改善を示すシーホースアッセイ、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｅ）併用処置で減少したミトコンドリア呼吸遺伝子を示しているＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣＹＢ５ＡのＲＴ−ｑＰＣＲ発現レベル（ＮＦ−κＢｉ処置によって救済された）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｆ）ＮＦ−κＢｉ処置を行った際のＡＴＰレベルの回復、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｇ）α−ＭＳＨ分泌レベルは、ＮＦ−κＢｉ処置を行った際の改善を示した、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｈ）ｉＦＧＥにおけるＰＹＹレベルの救済を示すウェスタンブロット、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示した画像及びデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。この情報は、図５及び６を補足するものである。 発達中の内分泌細胞におけるＥＤＣ媒介調節異常の提案モデル。発達中の多能性幹細胞由来内分泌組織におけるＥＤＣ媒介性調節不全の提案モデルを示す細胞の概略図。ＰＦＯＡ、ＴＢＴ及びＢＨＴなどのＥＤＣに曝露された場合の発達中の内分泌細胞は、ＩＲＥ１を増加させることによって小胞体（ＥＲ）ストレスを誘発し、Ｅｒｏ１及びＢｉＰのダウンレギュレーションを引き起こし、このことは、細胞内で折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）を誘導することが知られている。このことは、並行したＮＦ−κＢ（ｐ６５のリン酸化の増加）、及び、ｐ５３（Ｓｅｒ１５におけるｐ５３のリン酸化の減少）のシグナル伝達の撹乱をもたらす。その後の代謝ストレスは、核及びミトコンドリアでコードされた呼吸遺伝子の双方の転写の低下、欠陥のある最大呼吸及びミトコンドリア予備呼吸、ならびに細胞生物学的因子／ＡＴＰレベルの低下からなる。不健全なミトコンドリアとＥＲとの間の複雑なクロストークは、フィードバックループにおけるＥＲストレスへとさらにつながり、それによって、このメカニズムを悪化させ得る。全体として、低用量のＥＤＣへ慢性曝露する際の、異常折り畳みタンパク質の蓄積ならびにＡＴＰレベルの低下は、内分泌細胞における代謝ストレスを誘導し、それにより、腸及び脳の神経ペプチドの異常な産生及び分泌に起因して、内分泌調節に悪影響を与える。 ＮＦκＢ−ｐ６５（ＲＥＬＡ）及びＴＰ５３の推定上のＤＮＡ結合部位のバイオインフォマティクスによる決定。（ａ）ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、ＣＹＢ５Ａなどの関心のある遺伝子上の、ＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３結合モチーフの推定結合部位の数、及びＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＴＮＦ、ＩＬ６などのＮＦκＢ−ｐ６５（ＲＥＬＡ）によって調節される既知の各遺伝子、あるいは、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＰＥＲＰ、ＢＡＸなどのＴＰ５３によって調節される既知の各遺伝子の特定を示すチャート。（ｂ）関心のある遺伝子上のＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３のＤＮＡ結合モチーフの転写開始部位の上流の塩基対における最小距離の特定。ＨＯＸ遺伝子を、中性遺伝子、あるいは、文献であまり報告されていない、ＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３のいずれかによって制御される遺伝子として用いた。ヌクレオチドの配列保存の配列ロゴグラフィカル表現として表したＤＮＡ結合モチーフ。そこでは、ヌクレオチド文字の大きさが、バイオインフォマティクス分析で使用した（ｃ）ＮＦκＢ−ｐ６５及び（ｄ）ＴＰ５３についての配列でのその位置での当該文字の頻度を表す。 チップ上の胃（前腸）の最適化。例示的な前胃−胃分化プロトコールのための内胚葉からの例示的な３Ｄオルガノイド成熟を示す概略的な時系列図。ｉＦＧ−ＭＯ＝６日目のミニオルガノイド、Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別した６日目のミニオルガノイドを。Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別した６日目のミニオルガノイドを。ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓ＝解離した３４日目のオルガノイド。 ＩＣＣによるＤ３４ ｉＦＧ−Ｏ（オルガノイド）の特徴付け。チップに播種するために使用した細胞／組織の免疫細胞化学（ＩＣＣ）特徴付けのための例示的な免疫マーカーで染色した細胞及び組織の蛍光顕微鏡写真。マーカーの例、Ａ）Ｅ−カドヘリン（赤）、Ｂ）Ｓｏｘ２（緑）、Ｃ）Ｍｕｃ５ＡＣ（赤）、Ｄ）シナプトフィジン（赤）、Ｅ）セロトニン、Ｆ）ソマトスタチン（緑）、Ｇ）ガストリン（緑）、Ｈ）グレリン（赤）、Ｉ）ペプチドＹＹ（赤）。ＧとＨ中の挿入図は、小さなボックスで囲まれた拡大領域である。 チップに前腸を播種するために使用される細胞のための全体計画。アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下で漸増する胎児ウシ血清（ＦＢＳ）内での、及びそれに続く３日目以降に、ＣＨＩＲ、ＦＧＦ４、ＬＤＮ、及び、ＲＡを添加する、ｉＰＳＣの内胚葉誘導及び前腸分化を示す概略時系列図。ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓ＝解離した３４日目のオルガノイド。ｉＦＧ−ＭＯ＝６日目のミニオルガノイド。Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別した６日目のミニオルガノイド。Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別した６日目のミニオルガノイド。ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓ＝解離した３４日目のオルガノイド。 チップでの胃−視床下部の同時培養。マイクロチップの一実施形態の概略図。このチップは、上部チャネルにｉＦＧ−ＭＯ細胞が、下部チャネルにｉＨＴＮがあることを示している。目標：視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）の存在がチップにて同時培養できるかどうかを試験する。方法：頂端チャネルにｉＦＧ−ＭＯ、及び基底チャネルにｉＨＴＮを播種した。ｉＦＧ−ＭＯ（ｍｏ：ミニオルガノイド）を有する前腸の、誘導された視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）との同時培養。また、発明者らは、以前の一連の実験におけるｉＦＧ−ＭＯの過剰増殖のため、流速を、１０μｌ／時間にまで減速した。 蛍光マーカーの共焦点画像。チップの上部及び下部チャンネルにおいて、免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）チップの上部チャネル及び下部チャネルから発光する免疫蛍光を示す、すべての蛍光チャネル。Ｂ）頂端領域で観察されたＳｏｘ２蛍光。Ｃ）頂端領域で観察されたＥ−カドヘリン蛍光。Ｄ）基底領域で観察されたＴｕＪ１蛍光。流量（１０μｌ／時間）下の各チャネル及び領域（上部チャネル及び下部チャネルにおける例示的な細胞についての先の図面を参照されたい）におけるマーカーを示す画像。マーカーは非常に特異的であり、それぞれのチャネルにおいてのみ認められた。 流量（３０μｌ／時間）下の、２１日目のＩＦＧ−ＭＯの共焦点画像。免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）ＤＰＡＩ及びＳＯＸ２で染色した前腸前駆細胞。Ｂ）ＳＹＰで染色した内分泌細胞。及びＣ）Ｅ−カドヘリンで染色した上皮。 頂端チャネルに播種したｉＦＧ−ＭＯ。流量（１０μｌ／時間）。免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。３０μｌ／時間の流速で増殖した細胞と比較して、Ａ）より少数のＳｏｘ２＋及びＢ）より多数のＳＹＰ＋細胞。 前腸上皮の最適化。マイクロチップの一実施形態の例示的な概略図ならびに前腸及びオルガノイドの成熟のための概略的な時系列図。目標：本明細書に記載の選択試薬を用いた、より良好でより合理的な６日目のオルガノイドの選別により、前腸上皮の形成を最適化する。方法：選択試薬を用いてオルガノイドを選択することにより、ｉＦＧ−ＳＲを用いて頂端チャネルに播種。１０μｌ／時間にまで減速した流量を維持する。分化及び成熟を促進するために、培地のＥＧＦ濃度を徐々に低下させる。この時点で、６日目のオルガノイドの選別は、実験室で行われた幾つかの実験に基づいて良好な上皮を得るための重要なステップとなり、したがって、細胞クラスターを周囲の単層から効果的に分離する選択試薬を試み、そして、このことが、コロニー形成のための６日目のオルガノイドの選別を効果的なものにすると考えられる。 薬剤量の低下を示す例示的な実験時間図。成熟剤、例えば、ＥＧＦの減量下でのｉＦＧ−ＳＲ細胞を示す概略的時系列図。 チップに播種するために使用される組織の例示的な一般的特徴付け。免疫蛍光マーカー、例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１７、シナプトフィジン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、グレリン、及びペプチドＹＹで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。９６ウェルプレートにて、ＩＣＣによるＤ２０ ｉＦＧ−ＳＲ細胞の特徴付け（２Ｄ ２０日目）。 Ｅ−カドヘリンについて染色したｉＦＧ−ＳＲ及びｉＦＧ−ＭＯの比較タイルスキャン画像。Ｅ−カドヘリンの免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）ｉＦＧ−ＳＲ及びＢ）ｉＦＧ−ＭＯ。１０μｌ／時間の流速。 ＳＲと手で選別したＤ６Ｏとを比較するＥＬＩＳＡによるグレリン分泌。チップ上で増殖した細胞からのグレリン分泌物の例示的な棒グラフ。チップ培養の１５日目〜２２日目及び２３日目〜３０日目でのグレリン分泌（ｐｇ／細胞タンパク質のｍｇ）について、ｉＦＧ−ＳＲ（青棒）、及び、ｉＦＧ−ＭＯ（赤棒）の幾つかの例示的な培養物を比較した。 発明者の前腸系と陽性対照（ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌株）との比較。マイクロチップの一実施形態の例示的な概略図、ならびに選択試薬及び減量したＥＧＦを含む前腸及びオルガノイド成熟の概略時系列図。目標：ｉＦＧ−ＳＲとヒト胃癌（ＨＧＣ）（ＮＣＩ−Ｎ８７−上皮）株とを比較すること。方法：頂端チャネルにｉＦＧ−ＳＲまたはＨＧＣを播種した。減らした流量を、１０μｌ／時間に維持する。チップ上の２つの細胞型を、ＩＣＣとグレリン分泌物とで比較する。ＨＧＣ系は、最適な増殖培地で維持され、実験を通して変化はない。この時点で、６日目のオルガノイドの選別は、実験室で行われた幾つかの実験に基づいて良好な上皮を得るための重要なステップとなり、したがって、細胞クラスターを周囲の単層から効果的に分離する選択試薬を試み、このことが、コロニー形成のための６日目のオルガノイドの選別を効果的なものにすると考えられた。 ＨＧＣ及びｉＦＧ−ＳＲチップの流動条件。Ａ）ＨＧＣとＢ）ｉＦＧ−ＳＲ細胞との間のＳＯＸ２、ＳＹＰ、及び、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）の免疫蛍光染色を比較する流動条件下でのチップにおける細胞層の顕微鏡写真。 ＨＧＣ及びｉＦＧ−ＳＲ細胞層の比較タイルスキャン。チップ内の流動条件の有り及び無しで成長するｉＲＧ−ＳＲ及びＨＧＣを比較する細胞層の例示的な比較顕微鏡写真。流れは、ｉＦＧ−ＳＲではより良好に作用したが、ＨＧＣでは、そうではなかった。ｉＦＧ−ＳＲ上皮は、流動下よりも、無流動下の条件下で良好であると認められた。 ｉＦＧ−ＳＲの流動によるグレリン分泌の定常的な増加。流動チップの無いなかでの細胞に由来する少量と比較をした、流動チップ条件下におけるチップでの細胞のグレリン分泌のｉＦＧ−ＳＲ細胞産生を示す例示的な棒グラフ。 例示的な実験フローチャート及び設定。例示的なチップ、実験条件、及びアッセイの例を示す概略的な時系列図。ｉＰＳＣ由来胃オルガノイド及びｉＦＧ−ＭＯを、頂端チャネルに播種した。ｉＨＴＮは、機能的アッセイ及びイメージングのために基底チャネルに播種された。チップにおけるｉＨＴＮの増殖、及びＳｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及びＴｕＪ１などの前腸及び神経マーカーイメージング。無流動下及び流動下（流量１０μｌ／時間）の２連で培養した。 「臓器チップ」マイクロ流体装置の一実施形態。ｉＰＳＣから分化した胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）の静的トランスウェル培養と、「臓器チップ」マイクロ流体装置の流動条件下での培養との間の違いを例示する模式図。 前図の「臓器チップ」マイクロ流体装置を使用する例示的な結果。ｉＧＩＯ及びｉＨＴＮの臓器チップモデルを用いて、細胞の免疫染色の例示的な実験結果を提供する。Ａ）は、頂端（赤）チャネルと基底（青）チャネルを有するチップを示す。Ｂ）は、頂端チャネルで分化したｉＧＩＯを示す。Ｃ）は、Ｅ−カドヘリン＋（白）とＳｏｘ２＋前腸前駆細胞（緑）であるチップでのＧＩ上皮を示す。Ｄ）は、上皮（白）及びシナプトフィジン＋内分泌細胞（赤）を示すチップでのｉＧＩＯを示す。Ｅ）は、基底チャンネルにおけるｉＨＴＮを有する播種チップの共焦点３Ｄ画像であり（Ｔｕｊ−１、ニューロン特異的クラスＩＩＩβチューブリンを染色する）、一方で、Ｆ及びＧは、（それぞれ）頂端チャネルにおける、ＳＯＸ２＋（ＳＲＹ−Ｂｏｘ２）前腸及びＥ−カドヘリン＋上皮を示す。白の矢印は多孔質膜を指し、＊は、Ｅ−Ｆでの神経細胞に囲まれたルーメンを示す。 腸管チップ。多孔質膜によって分離された上部及び下部チャンバを示す小型マイクロ流体装置の一実施形態の例示的概略図を示す。矢印は、上部（青）及び下部（赤）の双方のチャネルにおける媒体の連続的な流れを表す。消化管の上皮は、上部チャネルの多孔質膜の上にある。真空チャンバは、チャネル領域の両側の外側に配置される。 腸管チップ。多孔質膜によって分離された上部及び下部チャンバを示す小型マイクロ流体装置の一実施形態の例示的概略図を示す。矢印は、上部（青）及び下部（赤）の双方のチャネルにおける媒体の連続的な流れを表す。消化管の上皮は、上部チャネルの多孔質膜の上にある。真空チャンバは、チャネル領域の両側の外側に配置される。 オルガノイドの例示的な顕微鏡写真を示す。腸オルガノイドを成長させ、そして、本明細書に記載するマイクロ流体チップの実施形態に使用した。 蛍光染色した腸オルガノイド細胞の顕微鏡写真を示す。Ａ）腸細胞、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、及び、脂肪酸結合タンパク質２（ＦＡＢＰ２）で染色した組織。Ｂ）杯細胞、ＣＤＸ２、及び、ムチン２（ＭＵＣ２）で染色した組織。Ｃ）パネート細胞、ＣＤＸ２、及び、リゾチームで染色した組織、及び、Ｄ）腸内分泌細胞、一般的には分泌小胞に位置する、ＣＤＸ２、及びクロマトグラニンＡ（副甲状腺分泌タンパク質１）で染色した組織。 マイクロ流体チップでのＩＰＳＣに由来するヒト腸管上皮細胞に対するＩＦＮγの効果を実証する例示的なグラフを示す。グラフは、電気抵抗（ＴＥＥＲ）の喪失、及びＩＦＮγで処置した上皮細胞間の接続の喪失を示す。Ａ）ＴＥＥＲは、ＩＦＮγ処置で経時的に減少したが、対照及びＴＮＦαで処置した細胞では、増加したＴＥＥＲを示した。Ｂ）ＦＩＴＣデキストリンを頂端チャネルに添加すると、透過係数と同様の損失を示し、Ｃ）ＩＦＮγで処置した細胞の基底層のＦＩＴＣデキストリンの量が（頂端層への添加後に）増加した。 例示的な「腸管チップ」技術を示す。Ａ）は、チップの概略図を示す。Ｂ及びＣ）は、「腸管チップ」の部品及び大きさを識別するオーバレイを有する写真を示す。Ｃ）は、さらに、膜の顕微鏡写真を示す。Ｄ）は、それぞれの表記の下に結果として生じる細胞の顕微鏡写真を伴う機械的歪みを持たないチップ、及び、機械的歪みを有するチップの概略図を示す。及び、Ｅ）は、印加圧力（ｋＰａ）に対する、基板の歪み（％）と細胞の歪み（％）とのグラフを示す。 「腸管チップ」のチャネルにおいて増殖する上皮細胞を示す。播種したチャネルの例は、Ａ）ＤＡＰＩ（核）、Ｂ）Ｅ−カドヘリンで蛍光染色し、２つの蛍光チャネルの重複をＣ）に示す。 マイクロ流体チップにおいて、６日間、静的条件下で培養した例示的な細胞を示す。細胞は、連続層を形成しない。 マイクロ流体チップにおいて、６日間、流動条件下で培養した例示的な細胞を示す。細胞は、連続層を形成する。 ＩＦＮγで処置したチップにおいて増殖させたＣａｃｏ−２上皮細胞と腸内腸管様組織との間での例示的遺伝子マーカーの相対発現のグラフを示す。発現は、ＩＦＮγ処理有り無しで、（ＧＡＤＰＨ）に対して正規化した：Ａ）ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１）。Ｂ）ＧＢＰ１（グアニル酸結合タンパク質１）。Ｃ）ＧＢＰ４（グアニル酸結合タンパク質４）。Ｄ）ＬＹＺ（リゾチーム）。Ｅ）ＰＬＡ２Ｇ２Ａ（ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＡ）。Ｆ）分泌された抗菌レクチン（ＲｅｇＩＩＩγ）。Ｇ）ＬＲＧ５（Ｇタンパク質結合受容体５を含むロイシンリッチリピート）。Ｈ）ＯＬＭ４（オルファクトメディン４）。及び、Ｉ）ＭＵＣ４（ムチン４）。 チップが１２日後にどのように認められるのかを表している代表的な画像を示す。チップに播種してから１２日後に、細胞は、チップの上部チャネルの端部の屈曲部を越えて延在する連続層とコンフルエントになった。 赤い線の軸に沿って切断した代表的な断面を示す。図５１に写真図を示し、以下の図に示す細胞の染色を示す。 マイクロ流体チップの横断面の（端部から見た）画像を示す。チップを通る切断軸の光学顕微鏡写真は、チップの上部チャネルの膜で成長する微絨毛様構造を有する腸細胞を示す。参考のため、膜、下部チャンネル、及び、真空チャンバを、画像内で識別する。 小型マイクロ流体装置の上部及び下部チャンバにおける媒体の連続的な流れに応答して、絨毛様構造を形成するヒト腸オルガノイドに由来する上皮細胞を示す例示的な顕微鏡写真を示す。二重染色は、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）（赤）及びＥ−カドヘリン（青）を示す。 染色された上皮細胞及び細胞質タンパク質を示す例示的な顕微鏡写真を提示する。三重免疫蛍光染色は、脂肪酸結合性タンパク質２（ＦＡＢＰ２）（緑）と比較して、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）（赤）及びＥ−カドヘリン（青）の存在を示す。 細胞質タンパク質に由来する上皮細胞、及び、細胞質タンパク質を示す例示的な顕微鏡写真を提示する。三重免疫蛍光染色は、ＺＯ−１（緑）と比較して、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）（赤）及びＥ−カドヘリン（青）の存在を示す。 チップに播種した後に撮影した例示的画像を示す。Ａ）７．５×１０ ６細胞／ｍｌ（４０μｌに３００Ｋ）。Ｂ）６．２５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２５０Ｋ）。Ｃ）５．０×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２００Ｋ）、Ｄ）３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）。及び、Ｅ）２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）。 チップに播種した後の非コンフルエント領域の例示的な拡大画像を示す。３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）で播種した腸管様組織細胞（図５５Ｄと比較した）。赤い円は、非コンフルエントな領域を示す。 従前の画像よりも数が少ない細胞をチップに播種した後の非コンフルエント領域の例示的な拡大画像を示す。腸管様組織細胞を、２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）で播種した（図５５Ｅと比較した）。赤い円は、非コンフルエントな領域を示す。 細胞増殖に関する培地試験のための例示的な概略の実験計画を示す。一部において、この計画は、完全な増殖因子を含む培地が、マイクロ流体チップにおいて腸内腸管様組織細胞を増殖させるために上部頂端（Ａ）及び下部基底（Ｂ）の双方のチャネルにおいて使用されるべきかどうか、を決定するためのものである。 上部（頂端）及び下部（基底）チャネルにおける培地処方を比較する、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な６日目の拡大画像を示す。培地の比較は、次のとおりである。Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｃ）完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。及び、Ｄ）ＧＦＲ（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。 上部（頂端）及び下部（基底）チャネルにおける培地処方を比較する、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な７日目の拡大画像を示す。培地の比較は、次のとおりである。Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）。及びＣ）完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。 微小絨毛様構造を誘導する２つの培地処方の間での増殖の差異を示す、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な拡大画像を示す。培地の比較は、Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）、及び、Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）である。 １２日間のインキュベーション後のマイクロ流体チップでの上皮及び非上皮サイズ依存性細胞のパーセンテージとして、腸内ｉＰＳ由来腸細胞の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。Ａ）矢印の平坦な端部にて輪郭が描かれているように、サイズゲーティングされた腸細胞を示す散布図は、Ｂ）２つの蛍光チャネルに関する、及び＊−蛍光ゲーティング領域におけるバックグラウンド（自己）蛍光強度を示す２色の蛍光ドットプロットへと向かう。各蛍光チャネル（＊−蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）のゲーティングされた領域での自己蛍光は、０．２１２％蛍光（＊−左上部）、及び０．００４％（＊−右下部）を示しており、プロットの左下部に集団を形成していることが認められた双方のチャネルに関して、細胞集団は、自動蛍光を放っている。Ｃ）上記のようにゲーティングされた細胞と、二次蛍光抗体だけ（バックグラウンドについての別の対照）とを予めインキュベートした細胞を示す散布図は、Ｄ）各チャネル（＊−蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）での高強度領域におけるバックグラウンド蛍光を測定するための、０．１４９％の蛍光（＊−左上部）、及び０．００％（＊−右下部）を示す２色の蛍光ドットプロットについてのものである。Ｅ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体（上皮細胞を識別するためのもの）で蛍光染色され、次いで、２色の蛍光ドットプロットに対してＡのようにサイズについてゲーティングした細胞は、８３．４％のＥｐＣＡＭ＋上皮細胞を示す（＊−左上部において蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）。及び、Ｆ）非上皮細胞で発現されたＩＩＩ型中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質であるビメンチンで蛍光染色され、次いで、２色の蛍光ドットプロットに対してＡのようにサイズについてゲーティングした細胞は、１５．６％のビメンチン＋非上皮細胞を示す（＊−左下部において蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）。 １２日間のインキュベーションを終えた後のマイクロ流体チップでの上皮細胞でない腸内ｉＰＳ由来腸細胞のサイズでゲーティングした集団の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。２つの蛍光プロットにゲーティングした集団のパーセンテージとして、以下の細胞を識別するための抗体で、細胞を蛍光染色した。Ａ）パネート細胞 ５．０３％（＊−右下部で輪郭が描かれる）。Ｂ）腸内分泌細胞 ０．１５３％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。Ｃ）杯細胞 ０．１３１％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。及び、Ｄ）腸細胞 １．０６％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。 １２日間のインキュベーション後のマイクロ流体チップでの上皮及び非上皮のサイズでゲーティングされた細胞のパーセンテージとして、腸内ｉＰＳ由来腸細胞の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。サイズでゲーティングされた細胞由来の腸細胞集団を、次いで、蛍光強度ドットプロットでゲーティングした。Ａ）ＥｐＣＡＭ一次抗体についてのアイソタイプ抗体対照と共にインキュベートした細胞は、０．８５５％のバックグランド蛍光を有する細胞を示す（＊−左上部で輪郭が描かれ／ゲーティングされる）。Ｂ）一次抗体を用いずに、二次抗体と共にインキュベートした細胞は、０．０６５％のバックグラウンド蛍光を有する（＊−右下部で輪郭が描かれ／ゲーティングされる）。Ｃ）腸細胞集団の７２％としてのＥｐＣＡＭ＋上皮細胞。Ｄ）ビメンチン＋非上皮細胞、腸細胞集団の２８．６％。 マイクロ流体チップ内の腸絨毛にてパルスチェイスした有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。Ｅ−カドヘリン（赤）を発現する上皮細胞、及び、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に、ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が示されている。Ａ）４時間パルスの後、次いで、Ｂ）７２時間のチェイス、及び、Ｃ）１２０時間のチェイスの後の標識細胞を示す。 腸管絨毛の基底部に位置し、次いで、上部絨毛構造内に移動してマイクロ流体チップ内で増殖するパルスチェイス分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に示される。ＥｄＵ標識（緑）した有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後に腸の微小絨毛の基底部に位置し、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。 マイクロ流体チップ内の腸絨毛にてパルスチェイスされた有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。Ｅ−カドヘリン（赤）を発現する上皮細胞、及び、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に、ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が示されている。ＥｄＵ標識（緑）した有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後に腸の微小絨毛の基底部に位置し、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。 図６１に示したような、マイクロ流体チップ内の腸絨毛でのＥｄＵ標識したパルスチェイスされた有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後、上皮または核染色を伴わず、腸の微小絨毛の基底部でより明瞭に示され、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。 ｉＰＳ細胞由来の腸内腸管様組織細胞の間での時系列比較の概略図を示す。一実施形態において、細胞は、Ａ）直接的に、または、Ｂ）凍結及び解凍後に使用される。双方の条件下で、チップは、上皮を含む絨毛（絨毛で覆われた）構造を有する。 ３つの異なる臓器チップのための３つのマイクロ流体チップが、基底チャネルを介して流体的に取り付けられた、三臓器回路の概略図を示す。参考のため、上部の頂端チャネルは、緑色の実線で示しており、一方で、下側の基底チャネルは、赤色の点線で示している。 ３つの異なる臓器チップのための３つのマイクロ流体チップが、部分的流体的に、すなわち、頂端または基底チャネルを介して取り付けられた、三臓器回路の概略図を示す。 ２つの異なる臓器チップのための２つのマイクロ流体チップが部分的流体的に取り付けられた、すなわち、頂端チャネルを介して取り付けられた、二臓器回路の概略図を示す。 胚性前腸−中腸−後腸領域と胃腸系の成熟領域との間の例示的な解剖学的関係の概略図を示す。矢印は、胃内の例示的な空洞／幽門領域を指し示している。 ｉＰＳＣ由来視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）。Ａ．様々な用量のインスリン、ＩＷＲ−ｅｎｄｏ、及び、レチノイン酸を用いるｉＨＴＮ分化のための併用スクリーニング。当該分化のために、４μｇ／ｍｌのインスリン、１０μＭのＩＷＲ−ｅｎｄｏ、及び、０．０１μＭのレチノイン酸の組み合わせを選択した。Ｂ．Ｎｋｘ２．１＋前駆体の定量値。Ｃ．ｉＨＴＮ分化の概略図。Ｄ．脳地図を用いた、ｉＨＴＮの組織及び細胞特異的発現分析（ＴＳＥＡ及びＣＳＥＡ）−ｉＨＴＮが、主に視床下部ニューロンからなることを示す、参照としての視床下部。 機能性ｉＨＴＮの特徴付け。Ａ．ＩＣＣを示すパネル、及び、Ｂは、ｉＨＴＮにおけるＨＴマーカーの定量。Ｃ．ＡＲＣのニューロンの遺伝子発現を示すｑＰＣＲ。Ｄ．グレリン及びレプチンシグナル伝達経路の調節を示すウェスタンブロット。Ｄ．ＮＰＹ及びＭＳＨの外因性ペプチド媒介性分泌。 超肥満のｉＨＴＮは、調節不全のホルモン応答経路の疾患シグネチャーを示す。Ａ．ｉＨＴＮにおける肥満遺伝子の発現を示す、Ｌｏｃｋｅ ｅｔ ａｌ．に基づいた散布図。Ｂ．Ｌｏｃｋｅ ｅｔ ａｌ．から同定された幾つかの遺伝子のｑＰＣＲに基づいた検証。Ｃ．幾つかの肥満関連経路の調節不全を示す、肥満 対 対照のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）。Ｄ．肥満 対 対照での外因性ペプチド処置に対するグレリン及びレプチン経路の調節不全を示すウェスタンブロット。対照及び肥満の、Ｅ．呼吸計測の追跡、ならびにＦ．予備呼吸能、及び、ＯＣＲ 対ＥＣＡＲ。Ｇ．外因性ペプチド処置の際の肥満での食欲促進ＮＰＹ分泌調節異常。 膜上での細胞の沈着、及びチャンバの両側にまたがる電極を介した電気的特徴の測定を含む、例示的なトランスウェル装置の概略図。 トランスウェルシステムにおける後腸細胞の図。絨毛を有する構造を含む高密度連続細胞の増殖が観察された。 トランスウェル装置で成長した後腸細胞。 トランスウェルにおける後腸細胞増殖のＴＥＥＲ測定。細胞は、対照と比較して、ＩＦＮγを添加した際のＴＥＥＲ測定値の増大を含む、ＩＦＮγ応答性を示した。 トランスウェルシステムで成長した後腸細胞は、腸のすべての特徴的な生理学的特徴を示す。 トランスウェルシステムで増殖した細胞に対するＩＦＮγ応答性を示す別の図。興味深いことに、ＩＦＮγの基礎投与は、経上皮抵抗を抑える。ＴＮＦαを添加しても、腸の透過性に変化を誘発しない。 ＩＦＮγの添加は、ＩＰＳＣ由来のヒト腸管上皮細胞において、デキストランＦＩＴＣの流出の増加を導く。腸管上皮は、このサイトカインに応答して、透過性が増している。 ＩＦＮγの添加は、ＩＰＳＣ由来のヒト腸管上皮細胞において、基底蓄積ＦＩＴＣデキストランを導く。
内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）の説明
胎児発育の重大な時期における高レベルの人工内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）へのヒトの持続的な曝露は、内分泌組織前駆細胞における代謝ホメオスタシスの長期的な撹乱をもたらし得るものであり、したがって、小児期の肥満に寄与し得る。ヒトの腸及び脳の内分泌組織におけるＥＤＣ誘発性発達異常を試験するための実行可能なプラットフォームは存在しない。したがって、本発明者らは、パーフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、トリブチルスズ（ＴＢＴ）、及び、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む、本発明者らの食料及び上水道を汚染する一般的なＥＤＣに対する低用量慢性曝露の効果を決定するためのプラットフォームを、２つのヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する内分泌組織、すなわち前腸上皮細胞（ｉＦＧＥ）及び神経ペプチド視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）を用いて開発した。
説明したように、内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）は、ホルモンシグナル伝達経路及び飢餓及び満腹のホルモン制御を標的とすることによって、正常な組織発生において破壊的な役割を果たすことが示されている広範な環境肥満症の群である。また、オビーソゲンは、カロリー貯蔵に有利なようにエネルギーバランスをシフトさせることによって基礎代謝速度を変化させ、それによって、肥満性表現型に寄与し得る。
これらのＥＤＣが母親から子宮内の子孫に継代的に曝露される可能性があるという事実には大きな危険がひそんでおり、これは、幹細胞発生の重要な期間の際の反復曝露を介したエピジェネティックな刷り込みなどの作用をもたらす可能性があり、例えば、間葉系幹細胞を脂肪細胞へと優先的に分化しやすくする。さらに、世代を越えて伝達されるＥＤＣは、少なくとも３世代のマウスに悪影響を与えることが示されている。オビーソゲンと発達異常との直接的な関連性を示すヒトの研究は多くはないが、環境化学物質が、早期の発達において有害な影響を及ぼし、子孫の生理機能に関して永続的な影響を及ぼし得る、という疫学的証拠がある。また、このことは、継代的現象であり、それによって、次世代においてさえも、効果みられ得る。さらに、肥満度指数、及び、肥満の増加は、妊娠中の母親の肥満の結果として、次世代に伝えられる。総合すると、環境化学物質及びヒトの幹に対するそれらの影響は、ヒト特異的発達スクリーニングプラットフォームで緊急に対処される必要がある。遍在する「肥満」の内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）は、以下の幾つかの実施例に記載される。ＥＤＣとして、フタル酸可塑剤、有機スズ、ペルフルオロ化合物、及び食品添加物などがあるが、これらに限定されない。曝露は、主に、胎児または早期の幹細胞発生の重要な期間において、ヒトの食物を介して行われる。
Ａ．化合物スクリーニング。
本明細書には、３つの異なるＥＤＣのそれぞれ、パーフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、トリブチルスズ（ＴＢＴ）、及びブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）と、それらの組み合わせによる効果が記載される。ＰＦＯＡは、フルオロポリマーにおける界面活性剤であることが知られており、いつまでも環境中に残留することが知られている。２００７年の調査では、米国の人口の約９８％が、血液中に検出可能なレベルのＰＦＯＡを保有しており、産業廃棄物、耐汚染性カーペット、ハウスダスト、水、及び、調理器具のコーティングを介して、それらの曝露を受ける可能性がある。有機スズであるＴＢＴは、生物の付着から船舶を保護するための塗料に用いられる防汚剤として使用されている。しかしながら、ハウスダストに存在することが、ヒトに対する曝露への主要な原因となっている。ＢＨＴは、一般的な食品添加物、パーソナルケア製品成分、及び、化粧品成分、農薬、プラスチック、及び、ゴムの成分である。しかしながら、これは、一般的に消費される朝食シリアル商品での抗酸化剤としても利用されている。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の使用は、腸及び視床下部神経肥大ニューロンの発達に対する慢性低用量ＥＤＣ曝露の有害作用と機序を解明し、そして、ＥＤＣへの子宮曝露を模倣するためのプラットフォームとして役立つ。
本明細書には、ある量の分化した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、分化したｉＰＳＣを１つ以上の化合物と接触させること、分化したｉＰＳＣの１つ以上の特性を測定することを含み、当該分化したｉＰＳＣの１つ以上の特性の測定が、１つ以上の化合物の特徴を特定する、化合物スクリーニングの方法が記載される。様々な実施形態において、化合物のスクリーニングは、内分泌攪乱をスクリーニングすることを含む。様々な実施形態において、１つ以上の化合物の特徴は、NＦ−κＢのリン酸化を誘導することを含む。様々な実施形態において、１つ以上の化合物の特徴は、ミトコンドリア呼吸の減少を含む。様々な実施形態において、１つ以上の化合物の特徴は、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣＹＴＢ５の１つ以上の発現の減少を含む。様々な実施形態において、当該分化したｉＰＳＣは、前腸上皮である。様々な実施形態において、当該分化したｉＰＳＣは、視床下部ニューロンである。
Ｂ．誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化。
本明細書には、ある量の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、及び、１つ以上の因子の存在下で培養することを含み、当該１つ以上の因子が、ｉＰＳＣを分化させることができる、誘導多能性幹細胞を分化させる方法がさらに記載される。
様々な実施形態において、当該ｉＰＳＣは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下で培養することによって、胚体内胚葉へと分化される。様々な実施形態において、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約３日間である。様々な実施形態において、当該分化したｉＰＳＣを、最初に、無血清条件下で培養し、続いて、血清を添加する。様々な実施形態において、胚体内胚葉は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下でさらに培養されることによって、前腸スフェロイドへと分化する。様々な実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約３日間である。様々な実施形態において、コーティングされた表面を培養することによって、前腸スフェロイドは前腸上皮へと分化する。様々な実施形態において、前腸スフェロイドは、１つ以上の因子の上皮増殖因子（ＥＧＦ）の存在下でさらに培養されることによって、前腸上皮へと分化する。様々な実施形態において、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む１つ以上の因子の存在下でのさらなる培養は、約２０日間である。様々な実施形態において、当該分化したｉＰＳＣは、前腸スフェロイドである。様々な実施形態において、当該前腸上皮は、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＧＫＮ１、ＰＧＡ５、ＴＡＳ１Ｒ３、及びＴＦＦ２の１つ以上を発現する。様々な実施形態において、当該前腸上皮は、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、ソマトスタチン、セロトニン、ガストリン、グレリン、及びペプチドＹＹの１つ以上を発現する。様々な実施形態において、当該前腸上皮は、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現しない。
様々な実施形態において、当該ｉＰＳＣを、最初に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で培養する。様々な実施形態において、当該ｉＰＳＣは、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、神経外胚葉へと分化する。様々な実施形態において、ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約２日間である。様々な実施形態において、当該神経外胚葉は、スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）、及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下で培養されることで、腹側間脳へと分化する。様々な実施形態において、スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）、及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約５〜６日間である。様々な実施形態において、腹側間脳を、ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下で培養することで成熟させる。様々な実施形態において、ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約４〜５日間である。様々な実施形態において、当該成熟腹側間脳は、ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下で培養することで、さらに成熟させる。様々な実施形態において、ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下での培養は、約２０〜２７日間である。様々な実施形態において、当該分化したｉＰＳＣは、視床下部ニューロンである。様々な実施形態において、当該視床下部ニューロンは、ＡｇＲＰ（アグーチ関連ペプチド）、ＭＣ４Ｒ（メラノコルチン４受容体）、Ｎｋｘ２．１、ＮＰＹ（神経ペプチドＹ）、及びＰＣＳＫ２（前駆タンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン２型）の１つ以上を発現する。
腸細胞及びマイクロ流体チップの説明
一実施形態において、本発明は、細胞を培養する方法であって、ａ）上面と底面を含む膜を含む流体装置を提供すること、ｂ）当該底面上に細胞を播種すること、及び、ｃ）当該播種された細胞を、腸オルガノイドの増殖を助ける条件下で培養することを含む、方法を企図する。一実施形態において、当該細胞は、胃腸系の障害と診断された患者の腸組織生検試料に由来する。一実施形態において、当該細胞は、胃腸系の障害と診断された患者由来の誘導多能性幹細胞に由来する。一実施形態において、当該患者は、ヒト患者である。一実施形態において、当該胃腸障害は、過敏性腸疾患である。一実施形態において、この方法は、当該細胞を当該上面に播種すること、及び、当該上面に播種された細胞を、当該少なくとも１つの腸管絨毛構造の成熟を助ける条件下で培養することを、さらに含む。一実施形態において、当該少なくとも１つの腸管絨毛構造は、腸オルガノイドルーメンに向かって分極化する。一実施形態において、当該少なくとも１つの腸管絨毛は、インビボの腸管絨毛と形態的に類似している。一実施形態において、当該腸管絨毛は、腸細胞型を含み、当該腸細胞型として、パネート細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及び、腸細胞などがあるが、これらに限定されない。一実施形態において、腸細胞型は免疫細胞化学によって確認される。一実施形態において、腸細胞型は、Ｉｇｒ５＋を含む。一実施形態において、パネート細胞は、抗菌剤を分泌する。一実施形態において、この方法は、ＳＴＡＴ１がリン酸化されるような条件下でＩＦＮγを腸オルガノイドに投与することを、さらに含む。一実施形態において、当該方法は、ＩＦＮγ応答遺伝子がアップレギュレートされるような条件下でＩＦＮγを腸オルガノイドに投与することを、さらに含む。一実施形態において、当該ＩＦＮγ応答遺伝子として、ＩＤＯ１、ＧＢＰ４及び／またはＧＢＰ５などがあるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＩＦＮγ投与は、腸管上皮サブタイプ特異的遺伝子をさらにアップレギュレートする。一実施形態において、腸管上皮サブタイプ特異的遺伝子として、ホスホリパーゼＡ２群２Ａ及び／またはＭｕｃ４があるが、これらに限定されない。一実施形態において、当該方法は、当該腸オルガノイドにおける遺伝子発現を測定することをさらに含む。一実施形態において、当該方法は、当該腸オルガノイドにおける抗菌分泌を測定することをさらに含む。一実施形態において、本方法は、腸のオルガノイド機能に関する作用因子の影響を評価することをさらに含み、当該作用因子として、管腔微生物、免疫細胞、及び／または、サイトカインなどがあるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの細胞集団が、胃腸系の障害と診断された患者に由来する腸管チップを企図する。本発明を、特定の胃腸障害に限定することは意図していないが、一実施形態において、当該障害は、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）である。本発明のメカニズムを理解する必要はないが、当該腸管チップモデルは、マイクロ流体技術とＩＰＳＣ由来ヒト腸オルガノイドとを組み合わせることによって、ＩＢＤにおける腸管上皮の役割の理解を促すものと考えられる。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、再発性粘膜傷害を特徴とし得る複雑な多発性疾患であると考えられている。それは、遺伝的に感受性の個体における管腔微生物に対する免疫応答の調節不全によって引き起こされると考えられている。数多くの証拠が、腸管上皮もまた役割を果たし得ることを示唆しているが、ＩＢＤにおける正確な役割は、適切なインビトロモデルが無いため不明な部分が多いままである。
腸オルガノイド技術の開発によって、当該技術分野における進展が認められるようになり、それにより、対照個体／ＩＢＤ患者由来のヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または生検試料から生成され得るようになった。しかしながら、ＩＢＤとの関連では、この技術を使用に供することは非常に難しい。ＨＩＯがルーメンに向かって分極することを考えると、腸の透過性または細菌と上皮の相互作用に関する研究は、困難で、かつ、専門的な設備を必要とするＨＩＯの内部にアクセスすることで進展する。加えて、上皮−免疫細胞相互作用に関する研究は、ＨＩＯがマトリックスに埋没しているので、なかなかはかどっていない。
本発明の幾つかの実施形態の１つの利点は、腸管チップ技術を提供することで、かような問題点を克服することにある。一実施形態において、ｉＰＳＣは、ＨＩＯを形成するように誘導され、そして、単細胞懸濁液に解離させた。次いで、これらの細胞を、多孔質可撓性膜によって分離された２つのチャンバからなる小型マイクロ流体装置（ＳＭＤ）に播種した。装置の上部及び下部の双方のチャンバ内での媒体の連続的な流れは、インビボで認められるものと同様の分極した絨毛様構造の自発的な形成をもたらした。これらの構造におけるパネート細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及び、腸細胞の存在は、免疫細胞化学的に確認され、その一方で、インサイチュハイブリダイゼーションは、ｌｇｒ５＋細胞の存在を明らかにした。パネート細胞からの抗菌剤の分泌は、ＥＬＩＳＡによって検出され、及び、下部チャネルへのＩＦＮγの投与は、ＳＴＡＴ１のリン酸化と、ＩＦＮγ応答遺伝子の顕著なアップレギュレーションとをもたらすものであり、当該ＩＦＮγ応答遺伝子として、ＩＤＯ１、ＧＢＰ４、及び／または、ＧＢＰ５などがあるが、これらに限定されない。興味深いことに、腸管上皮サブタイプに特異的な２つの遺伝子であるホスホリパーゼＡ２群２Ａ、及びＭｕｃ４も、アップレギュレートされた。Ｃａｃｏ２細胞と比較して、これらの上皮サブタイプに関連する遺伝子の対応するアップレギュレーションは存在しなかった。
一実施形態において、本発明は、ｉＰＳＣ由来腸管上皮をＳＭＤに組み込むことができ、遺伝子発現及び抗菌剤分泌の変化を測定することができるシステムを企図する。リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）由来のＨＩＯ世代に関する従前の実証は、ＮＩＤＤＫによって貯蔵された遺伝子型のＩＢＤ−ＬＣＬが、ＩＢＤに関連する遺伝的変異を含む腸管上皮を生成するために得ることが可能であることを予測している。発明のメカニズムを理解する必要はないが、腸管チップ技術は、これらの変異体が、腸組織の機能及び様々な管腔微生物及び／または免疫細胞／サイトカインに対する応答に及ぼされる影響の評価を可能にするものと考えられる。
本明細書では、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の腸管上皮を使用するマイクロ流体装置が記載される。この装置は、首尾よく絨毛の形成及び蠕動をもたらす培地の流動を可能にする。重要なことに、ｉＰＳＣ由来の上皮の使用は、ＩＢＤ患者由来の材料の生成を可能にし、それによって、遺伝的疾患の要因を再現する機会を提供する。さらに、原材料としてのｉＰＳＣの使用は、疾患の進行に対するそれらの寄与をさらに追求するために並行して研究することができる免疫細胞など、他の細胞型の産生をさらに可能にする。
説明したように、臓器チップは、連続的に灌流される、マイクロメーターサイズのチャンバ内で細胞を培養するためのマイクロ流体装置である。人工構造と生体材料との組み合わせは、組織及び臓器の生理学的機能のモデリングを可能にする。
マイクロ流体培養システムは、より生体適合性のある可撓性材料でシリコンチップにエッチングされたパターンを複製する手段である「ソフトリソグラフィ」によって作製されることが多い。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの液体ポリマーをエッチングされたシリコン基板上に注ぎ、それを重合させて光学的に透明なゴム様材料にする。これは、チップで培養される細胞の形状、位置、及び、機能を特定することを可能にする。あるいは、ＰＤＭＳモールドを反転させ、平坦で平滑な基板に等角的に密封することで、そのような中で直線状、中空状チャンバ、または、流体の灌流のための「マイクロ流体チャネル」などの空洞の形成を可能にする。そのようなＰＤＭＳ培養系は、光学的に透明であり、細胞応答の高分解能光学画像を可能にする。幾つかの例において、細胞の培養のための小型灌流バイオリアクターは、チャネルの表面を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子でコーティングすることによって作製される。細胞は、ＥＣＭ基質への捕捉及び付着のために、チャネルを通って導入することができる。さらなる詳細は、本明細書に参照により全内容を援用する、Ｂｈａｔｉａ ａｎｄ Ｉｎｇｂｅｒ，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｏｒｇａｎｓ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ．” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）８：７６０−７２に記載されている。
重要なことに、マイクロ流体チップは、３Ｄ静的培養またはバイオリアクターでは利用できない方法で、システムパラメータを制御する。これにより、幅広い生理学的現象の研究が可能になる。幾つかの例では、マイクロセンサーの統合により、微環境条件下での培養細胞の研究が可能になる。さらに、チップ内の流体の流れを制御することで、物理的及び化学的勾配の生成が可能となり、細胞移動、細胞内構造の分析、及び、細胞−細胞接合完全性の研究に利用することができる。そのような機械的応力の検出及び制御に加えて、細胞パターニングの制御は、生理学的組織及び相互作用の研究を可能にする。例えば、様々な細胞型を、別個の物理的空間に播種することができ、及び、上記の技術を使用して、腸の絨毛形状などの臓器様形態へと、マイクロモールド技術によって成形することができる。チップは、生体組織の複雑な機械的微小環境が、インビトロで再現されることを可能にする。周期的な機械的歪みを、柔軟な側部チャンバを使用して導入することができ、連続的でリズミカルな伸縮は、側方壁及び付着した中央膜を弛緩させる。この平行して導入される周期的な機械的変形及び流体剪断応力は、蠕動などの腸機能など、生体臓器での細胞への曝露を模倣する。
腸疾患を研究する状況において、ヒトの腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）は、生理学的に関連するルーメン流の存在下で培養し、そして、蠕動様の機械的変形を模倣する。Ｃａｃｏ−２細胞は、双方が細流の曝露されたマイクロ流体装置内の柔軟な多孔質ＥＣＭ被覆膜上で培養することができる。腸ルーメンでの機械的な力、及び、周期的な機械的歪みに類似して、これらの機械的な力は、生体の腸の蠕動様運動を模倣し、興味深いことに、小腸の絨毛の構造に似た円柱状上皮細胞により裏打ちされる３Ｄ波状組織化した構造への再組織化を促す。関連する特殊な機能として、機能的な基礎増殖細胞クリプトの再構築、小腸タイプの４つすべての細胞株（吸収、粘液分泌、腸内分泌、及び、パネート）の分化、高レベルのムチン分泌、及び、高抵抗性上皮バリアの形成がある。
重要なことに、流体の流れは、細胞生存能力を損なうことなく、腸管チップのルーメンに生きている共生細菌と共にヒト腸細胞を培養することを可能にする静的形式において、細菌の存在下で培養した腸細胞は、細菌の過剰増殖に基づいて生存することはできない。しかしながら、連続的な流れは、細胞生存率を維持しながら、長期間にわたって、細菌の持続的な曝露を可能にする。この方法は、微生物叢研究に、全く新しい道を開く。さらなる詳細は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１６）１１３：Ｅ７−Ｅ１５に記載されている。
臓器チップを用いたほとんどの研究は、確立された細胞株または初代細胞で実施されている。非常に興味深いことは、幹細胞、特に、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に方法と設計を適用することである。特に、疾患特異的細胞を含む患者由来の細胞の使用は、罹患した器官をモデル化する見込みを持つことを可能なものにする。腸疾患の関連で、ＩＢＤ患者由来のｉＰＳＣの使用は、ＩＢＤに関連する遺伝的変異のすべてのレパートリーの研究を可能にし、そうではなく、Ｃａｃｏ−２などの細胞の使用に制限される場合は可能とならない。さらに、細胞供給源としてのｉＰＳＣは、疾患の病理における潜在的な影響を調べるために、関心のある腸細胞のみならず、同じ個人／ＩＢＤ患者由来の対応する免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、及び、樹状細胞）の産生も可能にする。
本明細書では、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の腸管上皮を使用するマイクロ流体装置が記載される。この装置は、培地の流動を可能にし、首尾よく絨毛の形成及び蠕動をもたらす。重要なことに、ｉＰＳＣ由来の上皮の使用は、ＩＢＤ患者由来の材料の生成を可能にし、それによって、遺伝的疾患の要因を再現する機会を提供する。さらに、原材料としてのｉＰＳＣの使用は、免疫細胞などのその他の細胞型の産生をさらに可能にして、疾患の進行に対するそれらの寄与をさらに調べるための研究を並行して行うことができる。本発明の目的は、腸管上皮が、どのようにして、遺伝的特徴、他の免疫細胞型、ならびに炎症性サイトカイン及び細菌などの環境刺激によって影響を受けるかを最終的に理解することである。
Ａ．腸細胞を有するマイクロ流体装置。
本明細書では、腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置を製造するための方法を記載する。様々な実施形態において、当該方法は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の生成、及び、腸管上皮細胞をマイクロ流体装置へ播種することを含む。様々な実施形態において、当該マイクロ流体装置は、組織化した構造を有する腸細胞の集団を含み、ＨＩＯを単細胞に分離させすること、および当該単細胞を装置に加えることを含む。様々な実施形態において、当該単細胞は、装置に添加する前に、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。様々な実施形態において、当該単細胞を当該装置に添加することは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ２０２１９０、及び、Ａ８３−０１の１つ以上を含む培地での再懸濁を含む。様々な実施形態において、当該ＨＩＯは、分離の前に、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。様々な実施形態において、ＨＩＯは、ｉＰＳＣに由来する。様々な実施形態において、当該ｉＰＳＣは、リプログラミングされたリンパ芽球様Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）である。様々な実施形態において、当該ｉＰＳＣは、炎症性腸疾患及び／または病態に罹患した対象から得られたリプログラミングされた細胞である。様々な実施形態において、ｉＰＳＣからのＨＩＯの誘導は、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でのｉＰＳＣの培養による胚体内胚葉の生成、ＦＧＦとＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下での胚体内胚葉の培養による後腸への分化、上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、マトリゲルでの上皮スフィアまたは上皮チューブの懸濁、ならびにＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下での培養を含む。様々な実施形態において、当該組織化した構造は、絨毛を含む。様々な実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株により裏打ちされている。様々な実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または頂端粘液分泌を有する。
Ｂ．ｉＰＳＣ由来のヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の生成。
様々な実施形態において、この方法は、ｉＰＳＣからＨＩＯの生成を含み、当該生成は、ｉＰＳＣから胚体内胚葉、上皮構造、及びオルガノイドへの分化を含む。様々な実施形態において、胚体内胚葉の誘導は、１日、２日、３日、４日、またはそれ以上の日数にわたって、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ＡとともにｉＰＳＣを培養すること、及び、ＦＢＳの濃度を時間とともに増加させることを含む。様々な実施形態において、胚体内胚葉の誘導は、アクチビンＡ（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３Ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）とともに、１日、２日、３日、４日、または、それ以上の日数にわたってｉＰＳＣの培養すること、及びＦＢＳの濃度を時間とともに（１日目、２日目、及び、３日目に、それぞれ、０％、０．２％、及び２％）増加させることを含む。例えば、胚体内胚葉の誘導は、アクチビンＡ（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３Ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）とともに、１日、２日、３日、４日、または、それ以上の日数にわたってｉＰＳＣを培養すること、及びＦＢＳの濃度を時間とともに（１日目、２日目、及び、３日目に、それぞれ、０％、０．２％、及び２％）増加させることを含む。様々な実施形態において、アクチビンＡの濃度は、約０〜２５ｎｇ／ｍｌ、約２５〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５０〜７５ｎｇ／ｍｌ、約１００〜１２５ｎｇ／ｍｌ、約１２５〜１５０ｎｇ／ｍｌを含む。様々な実施形態において、Ｗｎｔ３Ａの濃度は、〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約２５〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５０〜７５ｎｇ／ｍｌ、約１００〜１２５ｎｇ／ｍｌ、約１２５〜１５０ｎｇ／ｍｌを含む。様々な実施形態において、ＦＢＳの経時的な濃度は、第１日目、第２日目、及び、第３日目に、それぞれ、約０％〜０．２％、約０．２％〜０．５％、約０．５％〜１％、約１％〜２％、及び、２％超である。様々な実施形態において、後腸の形成は、ＦＢＳ及びＦＧＦ４とともに改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培地で、１日間、２日間、３日間、４日間、または、それ以上の日数にわたって胚体内胚葉細胞を培養することを含む。様々な実施形態において、後腸の形成は、１日間、２日間、３日間、４日間、または、それ以上の日数にわたって、胚体内胚葉細胞を、０％〜０．２％、約０．２％〜０．５％、約０．５％〜１％、約１％〜約２％、及び、２％以上の濃度のＦＢＳ、及び約５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１００〜２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＦＧＦ４を含む培地において培養することを含む。例えば、後腸の形成は、２％ＦＢＳ及びＦＧＦ４（５００ｎｇ／ｍｌ）とともに改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培地で、１日間、２日間、３日間、４日間、または、それ以上の日数にわたる胚体内胚葉細胞の培養を含むことができる。様々な実施形態において、Ｗｎｔ３Ａ、ＣＨＩＲ９９０２１、またはその双方が加えられる。様々な実施形態において、Ｗｎｔ３Ａの濃度は、約１００〜２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌを含み、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、約０．５〜１μＭ、約１〜１．５μＭ、約１．５〜２μＭ、または２μＭ、またはそれ以上が添加される。例えば、Ｗｎｔ３Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、または、その双方が添加される。様々な実施形態において、約３〜４日後に、この方法は、遊離懸濁上皮スフィア、及び、緩慢に付着した上皮チューブを含むオルガノイドの単離を含む。様々な実施形態において、当該単離されたオルガノイドは、マトリゲルに懸濁され、次いで、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、ＥＧＦ、及び、Ｂ２７を含有する腸培地に重層される。様々な実施形態において、当該単離されたオルガノイドは、マトリゲルに懸濁され、次いで、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、ＥＧＦ、及び、Ｂ２７を含有する腸培地に重層される。様々な実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、約０．５〜１μＭ、約１〜１．５μＭ、約１．５〜２μＭ、または２μＭであり、ノギンの濃度は、約５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１００〜２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌ以上であり、ＥＧＦの濃度は、約５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１００〜２５０ｎｇ／ｍｌ、約２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌであり、ならびにＢ２７の濃度は、約０．２５Ｘ〜０．５Ｘ、約０．５〜１Ｘ、約１Ｘ〜２Ｘ、または２Ｘ以上である。例えば、当該培地は、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＢ２７（１Ｘ）を含有する。様々な実施形態において、ＨＩＯは、その後、７〜１０日毎に継代される。様々な実施形態において、腸組織の集団は、腸臓器の特徴を含んだ組織化された集団である。様々な実施形態において、腸細胞は、絨毛へと組織化される。様々な実施形態において、当該絨毛は、小腸の４つすべての上皮細胞株（吸収、粘液分泌、腸内分泌、及び、パネート）で裏打ちされている。様々な実施形態において、当該腸細胞の集団は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または、頂端粘液分泌を有する。
Ｃ．腸細胞集団は、組織化した構造を含む。
本明細書では、腸細胞の集団を含むマイクロ流体装置であって、当該集団が、組織化した構造を含む当該装置を記載する。様々な実施形態において、当該組織化した構造は、絨毛を含む。様々な実施形態において、当該絨毛は、吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及びパネート細胞からなる群から選択される１つ以上の上皮細胞株で裏打ちされている。様々な実施形態において、当該組織化した構造は、バリア機能、シトクロムＰ４５０活性、及び／または頂端粘液分泌を有する。様々な実施形態において、当該腸細胞は、ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）に由来しており、単細胞に分離され、及び、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製される。様々な実施形態において、当該ＨＩＯは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でのｉＰＳＣの培養による胚体内胚葉の生成、ＦＧＦと、Ｗｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかとの存在下での胚体内胚葉の培養による後腸への分化、上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、マトリゲルにおける上皮スフィアまたは上皮チューブの懸濁、ならびに、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下での培養を含む方法によって、ｉＰＳＣから誘導される。
誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の作成の説明
A節には、体細胞源由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成することに関する方法の実施形態が記載されており、当該体細胞源として、白血球源があるがこれに限定されず、また、Ｂ節には、リンパ芽球Ｂ細胞の形態の例示的な白血球源に由来するｉＰＳＣを生成するためのかような使用の例が記載されている。リンパ芽球Ｂ細胞は、ｉＰＳＣを作製するための当初の供給源物質として使用するのに望ましい白血球の一種であり、以下のＡ節を含む本明細書に記載する方法によって、その後にリプログラミングされる。これらの白血球由来ｉＰＳＣは、後に、他の細胞型に分化し、当該細胞型として、腸細胞、視床下部ニューロン、内皮細胞などがあるが、これらに限定されない。したがって、以下のＢ節及び本明細書に記載の例示的な原材料を用いて、以下のＡ節及び本明細書に記載の原材料を操作する技術は、本明細書に記載のマイクロ流体チップと共に使用するために記載された様々な分化細胞を幅広く生成することができる。
Ａ．体細胞源からの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成。
また、本明細書では、ある量の細胞を提供すること、ある量のリプログラミング因子を細胞に送達すること、リプログラミング培地で、少なくとも４日間、細胞を培養することを含む、誘導多能性幹細胞を生成するための効率的な方法が記載されており、当該リプログラミング因子を送達及び培養することで、誘導多能性幹細胞が生成される。ある特定の実施形態において、当該細胞は、初代培養細胞である。他の実施形態において、当該細胞は、血液細胞（ＢＣ）である。ある特定の実施形態において、当該血液細胞は、Ｔ細胞である。他の実施形態において、当該血液細胞は、非Ｔ細胞である。他の実施形態において、当該細胞は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む単核細胞（ＭＮＣ）である。他の実施形態において、当該細胞は、原発性顆粒球、単球、及びＢリンパ球である。
特定の実施形態において、当該リプログラミング因子は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ラージＴ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）、及び、ｐ５３を標的とするショートヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）である。他の実施形態において、これらのリプログラミング因子は、ｐＥＰ４ Ｅ０２Ｓ ＥＴ２Ｋ、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ、及びｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１を含むベクターの組み合わせでコードされる。これは、例えば、約０．５〜１．０μｇのＰＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３、０．５〜１．０μｇのｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、０．５〜１．０μｇのｐＣＸＬＥ−ＵＬ、約０．２５〜０．７５μｇのｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１、及び０．５〜１．０μｇのｐＥＰ４ Ｅ０２Ｓ ＥＴ２Ｋを使用することを含む。これは、例えば、０．８３μｇのｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３、０．８３μｇのｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、０．８３μｇのｐＣＸＬＥ−ＵＬ、０．５μｇのｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１、及び０．８３μｇのｐＥＰ４ Ｅ０２Ｓ ＥＴ２Ｋを使用することを含み、ＳＶ４０ＬＴ（ｐＥＰ４ Ｅ０２Ｓ ＥＴ２Ｋでコードされたもの）とＥＢＮＡ−１（ｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１でコードされたもの）との化学量論比は、末梢血単核球を含む血液の非Ｔ細胞成分の当該リプログラミングを助ける。様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）培地である。様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、ｂＦＧＦを含む。様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、Ｅ７培地である。様々な実施形態において、当該リプログラミングＥ７培地は、Ｌ−アスコルビン酸、トランスフェリン、重炭酸ナトリウム、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、及び／またはｂＦＧＦを含む。異なる実施形態において、当該リプログラミング培地は、少なくとも１つの化学誘導小分子を含む。ある特定の他の実施形態において、当該リプログラミング培地は、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＨＡ−１００、及びＡ−８３−０１を含む。他の実施形態において、当該リプログラミング培地での血球の培養は、４〜３０日間である。
様々な実施形態において、当該ＢＣ−ｉＰＳＣは、細胞株として連続継代することができる。様々な実施形態において、当該ＢＣ−ｉＰＳＣは、ゲノム安定性を有する。ゲノム安定性は、当該技術分野で公知の様々な技術によって確かめることができる。例えば、Ｇバンド核型決定は、ゲノム安定性を欠いた異常細胞を特定することができ、異常細胞は約１０％またはそれ以上のモザイクを有するか、または、約５、６、７、８、９、１０Ｍｂ超の平衡転座を有する。あるいは、ゲノム安定性は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）マイクロアレイを用いて測定することができ、例えば、線維芽細胞などの非血液細胞源由来のｉＰＳＣに対してＢＣ−ｉＰＳＣを比較する。ゲノム安定性は、コピー数変異体（ＣＮＶ）、重複／欠失、及び、不均衡転座を含むことができる。様々な実施形態において、ＢＣ−ｉＰＳＣは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０Ｍｂを超えない平均サイズの増幅及び欠失を示す。様々な実施形態において、ＢＣ−ｉＰＳＣは、約２０〜３０Ｍｂを超えない平均サイズの増幅及び欠失を示す。様々な実施形態において、ＢＣ−ｉＰＳＣは、約３０〜４０Ｍｂを超えない平均サイズの増幅及び欠失を示す。様々な実施形態において、ＢＣ−ｉＰＳＣは、約４０〜５０Ｍｂを超えない増幅及び欠失の平均サイズを示す。様々な実施形態において、ＢＣ−ｉＰＳＣにおいて取得された新規の増幅及び欠失の平均数は、約５、４、３、２、または、１未満である。例えば、ｆｉｂ−ｉＰＳＣにおける新規の増幅及び欠失は、ＰＢＭＣ−ｉＰＳＣよりも少なくとも２倍大きい。様々な実施形態において、当該方法は、細胞株として連続的に継代した場合に、４〜８、９〜１３、１３〜１７、１７〜２１、２１〜２５、または、２９以上の回数の継代にわたって、約２０％、１５％、１０％、５％またはそれ未満の異常核型を集合的に示すｉＰＳＣ細胞株を産生する。
異なる実施形態において、リプログラミング因子は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ＬＴ、ｓｈＲＮＡ−ｐ５３、ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｆｂｘ−１５、Ｕｔｆ−１、Ｔｅｒｔ、またはｍｉＲ□２９１□３ｐ、ｍｉＲ□２９４、もしくはｍｉＲ□２９５などのＭｉｒ−２９０クラスターマイクロＲＮＡなどの１つ以上を含むこともできる。異なる実施形態において、当該リプログラミング因子は、ベクターによってコードされる。異なる実施形態において、当該ベクターは、例えば、非統合エピソームベクター、ミニサークルベクター、プラスミド、レトロウイルス（統合及び非統合）、及び／または、当業者に周知の他の遺伝要素とすることができる。異なる実施形態において、当該リプログラミング因子は、１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１由来ベクターによってコードされる。異なる実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のリプログラミング因子をコードし、及び、ベクターの組み合わせを、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ＬＴ、ｓｈＲＮＡ−ｐ５３、ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｆｂｘ−１５、Ｕｔｆ−１、ＴｅｒｔまたはｍｉＲ□２９１□３ｐ、ｍｉＲ□２９４、もしくはｍｉＲ□２９５などのＭｉｒ−２９０クラスターマイクロＲＮＡなどの１つ以上を誘導するために一緒に使用することができる。例えば、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１は、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、ｐＥＰ４ ＥＯ２Ｓ Ｔ２Ｋ、及び、ｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１などの複数のリプログラミング因子のベクター組合せをコードすることができるエピソームベクターである。
他の実施形態において、当該リプログラミング因子は、とりわけ、核形成、形質転換、形質導入、電気融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合などの当該技術分野で周知の技術によって送達される。他の実施形態において、当該リプログラミング因子は、ＲＮＡ、線状ＤＮＡ、ペプチド、または、タンパク質、または、多能性幹細胞の細胞抽出物として提供される。ある特定の実施形態において、当該細胞は、当該リプログラミング因子の送達の前に、酪酸ナトリウムで処理される。他の実施形態において、当該細胞は、さらなる培養の前に、組織培養表面で、１日、２日、３日、４日以上の日数でインキュベートされる。これには、例えば、マトリゲルで被覆した組織培養表面でのインキュベーションを含むことができる。他の実施形態において、当該リプログラミング条件には、大気の２１％Ｏ２未満にあたる、５％Ｏ２などの標準酸素条件の適用を含む。
様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）培地である。様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、ｂＦＧＦを含む。様々な実施形態において、当該リプログラミング培地は、Ｅ７培地である。様々な実施形態において、当該リプログラミングＥ７培地は、Ｌ−アスコルビン酸、トランスフェリン、重炭酸ナトリウム、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、及び／またはｂＦＧＦを含む。異なる実施形態において、当該リプログラミング培地は、少なくとも１つの化学誘導小分子を含む。異なる実施形態において、当該少なくとも１つの化学誘導小分子は、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＨＡ−１００、Ａ−８３−０１、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ＳＢ４３１５４２、Ｙ−２７６３２、または、チアゾビビン（「Ｔｚｖ」）を含む。異なる実施形態において、リプログラミング培地でのＢＣの培養は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、３０日間にわたる。
リプログラミングの効率は、当業者が容易に理解し得る数多くの技術の１つによって容易に確認される。例えば、効率は、リプログラミング因子の完全なセットを受けるドナー細胞の数と、生成されるリプログラミングされたコロニーの数との間の比率によって表現することができる。リプログラミング因子を受けるドナー細胞の数を測定することは、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子が、リプログラミング因子をコードするベクターに含まれる場合には、直接的に測定することができる。あるいは、代用体としてのレポーター遺伝子をコードするベクターをトランスフェクトして、リプログラミング因子ベクターを送達する対の試料における送達効率を測定することによって、送達効率の間接的測定を提供することができる。さらに、生成したリプログラミングされたコロニーの数は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性クローン、転写因子ＯｃｔまたはＮａｎｏｇの内因性発現を有するコロニー、またはＴｒａ−１−６０のような表面マーカーの抗体染色などの１つ以上の胚性幹細胞様多能性特徴の出現を観察することで測定することができる。別の例において、効率は、誘導多能性幹細胞の生成の動態によって表現することができる。例えば、効率は、細胞株として連続的に継代した場合に、４〜８、９〜１３、１３〜１７、１７〜２１、２１〜２５、もしくは２９、またはそれ以上の回数の継代にわたって、約２０％、１５％、１０％、５％またはそれ未満の異常核型を集合的に示すｉＰＳＣ細胞株を産生する方法などで、正常核型の細胞株を産生することを含むことができる。
Ｂ．リンパ芽球様Ｂ細胞由来誘導性多能性幹細胞（「ＬＣＬ−ｉＰＳＣ」）の生成
「ＬＣＬ−ｉＰＳＣ」は、上記A節に記載の技術を用いて生成される。
本明細書では、リンパ芽球様Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞（「ＬＣＬ−ｉＰＳＣ」）の組成物を記載する。ある特定の実施形態において、Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞の組成物は、ある量のリンパ球（ＬＣ）を提供し、ある量のリプログラミング因子をＬＣに送達し、ＬＣをリプログラミング培地で少なくとも７日間培養し、及び、ＬＣを誘導培地で少なくとも１０日間さらに培養することによって生成した細胞を含み、当該リプログラミング因子を送達すること、培養すること、及び、さらに培養することで、リンパ球誘導多能性幹細胞が生成される。ある特定の実施形態において、当該リプログラミング因子は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ラージＴ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）、及びｐ５３を標的とするショートヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）である。他の実施形態において、これらのリプログラミング因子は、ｐＥＰ４ Ｅ０２Ｓ ＥＴ２Ｋ、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、及びｐＣＸＬＥ−ｈＵＬなどのベクターの組み合わせでコードされる。ある特定の他の実施形態において、当該リプログラミング培地は、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＨＡ−１００、及びＡ−８３−０１を含む。他の実施形態において、リプログラミング培地での当該ＬＣの培養は、８〜１４日間であり、誘導培地でのＬＣのさらなる培養は、１〜１２日間である。
異なる実施形態において、リプログラミング因子は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ＬＴ、ｓｈＲＮＡ−ｐ５３、ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｆｂｘ−１５、Ｕｔｆ−１、Ｔｅｒｔ、またはｍｉＲ□２９１□３ｐ、ｍｉＲ□２９４、もしくはｍｉＲ□２９５などのＭｉｒ−２９０クラスターマイクロＲＮＡなどの１つ以上を含むこともできる。異なる実施形態において、当該リプログラミング因子は、ベクターによってコードされる。異なる実施形態において、当該ベクターは、例えば、非統合エピソームベクター、ミニサークルベクター、プラスミド、レトロウイルス（統合及び非統合）、及び／または、当業者に周知の他の遺伝要素とすることができる。異なる実施形態において、当該リプログラミング因子は、１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１由来ベクターによってコードされる。異なる実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のリプログラミング因子をコードし、ベクターの組み合わせを、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ＬＴ、ｓｈＲＮＡ−ｐ５３、ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｆｂｘ−１５、Ｕｔｆ−１、Ｔｅｒｔ、またはｍｉＲ□２９１□３ｐ、ｍｉＲ□２９４、もしくはｍｉＲ□２９５などのＭｉｒ−２９０クラスターマイクロＲＮＡなどの１つ以上を誘導するために一緒に使用することができる。例えば、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１は、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、及び、ｐＥＰ４ ＥＯ２Ｓ Ｔ２Ｋなどの複数のリプログラミング因子のベクター組合せをコードすることができるエピソームベクターである。
他の実施形態において、当該リプログラミング因子は、とりわけ、核形成、形質転換、形質導入、電気融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合などの当該技術分野で周知の技術によって送達される。他の実施形態において、当該リプログラミング因子は、ＲＮＡ、線状ＤＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質、または、多能性幹細胞の細胞抽出物として提供される。
異なる実施形態において、当該リプログラミング培地は、少なくとも１つの化学誘導小分子を含む。異なる実施形態において、当該少なくとも１つの化学誘導小分子は、ＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ＨＡ−１００、Ａ−８３−０１、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ＳＢ４３１５４２、Ｙ−２７６３２、または、チアゾビビン（「Ｔｚｖ」）を含む。異なる実施形態において、リプログラミング培地でのＬＣの培養は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または、１６日間にわたる。異なる実施形態において、リプログラミング培地でのＬＣの培養は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または、１６日間にわたる。異なる実施形態において、誘導培地でのＬＣの培養は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または、３０日間にわたる。
ある特定の実施形態において、当該ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、対象から以前に単離されたリンパ芽球様Ｂ細胞に由来しており、例えば、対象から血液試料を採取する。他の実施形態において、当該ＬＣは、疾患突然変異を有する対象から単離される。例えば、常染色体優性、劣性、性交連鎖などの任意の個数の突然変異を有する対象は、当該突然変異を有するＬＣＬ−ｉＰＳＣを生成するＬＣの供給源として役立つ。他の実施形態において、当該疾患の変異は、神経変性疾患、障害、及び／または病態に関連している。他の実施形態において、当該疾患の変異は、炎症性腸疾患、障害、及び／または病態に関連している。
これには、例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患及び／または病態に罹患している患者が含まれる。したがって、一実施形態において、ｉＰＳＣは、患者、例えば、ＩＢＤを有する患者の細胞からリプログラミングされ、すなわち、患者から誘導され、オルガノイドに形質転換され、次いで、チップ上にＩＢＤを生成するためにマイクロ流体チップに単細胞懸濁液として播種するものである。リンパ芽球様Ｂ細胞株からｉＰＳＣ（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）に至るまで、そして、腸オルガノイドからチップ上のＩＢＤに至るまで進行の概要を参照されたい。
しかしながら、マイクロ流体チップで使用される腸細胞を、ＩＢＤ患者由来の細胞供給源に限定することは企図しておらず、実際のところ、腸オルガノイドの提供において使用するためのｉＰＳＣの提供において使用するための白血球または他の細胞の供給源として、潰瘍性大腸炎及びクローン病を有する患者／対象を含むが、これらに限られない。
様々な実施形態において、当該ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、多能性幹細胞の特徴を有する。多能性幹細胞の幾つかの例示的な特徴として、当業者によって認識及び理解されたその他の特徴のうち、とりわけ、インビトロまたはインビボのいずれかで免疫不全動物に注入した場合での３つすべての胚葉層（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の細胞への分化、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ４などの多能性マーカーの発現、高レベルのアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）発現、培養での無期限増殖が挙げられる。
他の実施形態は、上記の方法によって生成した、ある量のリンパ球由来誘導多能性幹細胞、及び、医薬として許容される担体を含む医薬組成物を含む。
実験
本明細書において引用する全ての文献は、あたかも完全に記載が盛り込まれているかのように、その全内容を参照により援用する。特に断りがない限り、本明細書において使用する技術用語、及び、科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５，２０１２）、Ｈｏｒｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００８）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００６）、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ‘ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２０１３）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２８，２０１２）、及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２０１２）は、本出願において使用した数多くの用語に関する一般的な説明を、当業者に対して提供する。抗体を調製する方法に関する参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ，２０１３）、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６ Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６年１２月）、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８ Ｍａｒ ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。
当業者であれば、本発明の実施において使用することができ得る、本明細書に記載する方法及び材料と類似する、または、同等の数多くの方法及び材料を認識するであろう。実際のところ、本発明は、本明細書に記載する方法及び材料に限定することは、全く意図していない。
実施例１
研究計画
発達中の腸管及び視床下部神経肥大ニューロンに対する慢性低用量ＥＤＣ曝露の有害効果と機序とを解明するためのヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の使用が本明細書において記載され、これは、ＥＤＣに対する子宮内曝露を模倣するためのプラットフォームとして役立つ。このようなスクリーニングプラットフォームは、ヒトの発達モデルを忠実に模倣するだけでなく、スクリーニングされた化合物によって撹乱させる可能性のある発達の手がかりに関する貴重な考察も提供することができる。
実施例２
前腸スフェロイド細胞分化（ｉＦＧＥ）
分化のために、ｉＰＳＣを、アクターゼで処理し、及び、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含むＥ８培地中、１ウェルあたり１００万個の密度で６ウェルのマトリゲル被覆ディッシュに播種した。翌日に、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）及びＷｎｔ３Ａ（１日目のみ２５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に、３日間、曝露することで、ｉＰＳＣを胚体内胚葉へと分化させた。この３日間、当該細胞を、０％、０．２％、及び、２％の漸増濃度の規定ＦＢＳ（ｄＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）に曝露した。胚体内胚葉誘導の後に、２％ｄＦＢＳ、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ、Ｃａｙｍａｎ）、ＦＧＦ４（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＬＤＮ（２μＭ、Ｃａｙｍａｎ）、及びレチノイン酸（２μＭ、Ｃａｙｍａｎ）を含む改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で、次の３日間、培養することで、それら細胞を、前腸スフェロイドを形成するように指示した。その結果、半懸濁スフェロイドとなり、次いで、それらを選択的に採取し、そして、さらなる成熟及び実験のためにマトリゲル被覆実験プレートに移した。採取した前腸スフェロイドを成熟させるために、Ｎ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン／抗真菌薬、及び、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を有する改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地で、それらを培養した。必要に応じて、培地を２〜３日毎に交換し、及び、スフェロイドを、２０日目まで上皮単層に発生させた。
実施例３
視床下部ニューロン分化（ｉＨＴＮ）
ｉＨＴＮへの分化のために、ｉＰＳＣをアクターゼで処理し、単一細胞として、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含むＥ８培地中、１ウェルあたり約１００万個の細胞密度で、６ウェルのマトリゲル被覆ディッシュに播種した。翌日に、ｉＨＴＮ分化を、ＬＤＮ１９３１８９（１μＭ、Ｃａｙｍａｎ）、及び、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ）を用いた二重ＳＭＡＤ阻害による神経外胚葉分化によって開始し、及び、この処理を、４８時間行う。これに続き、３日目から８日目で、スムーズンドアゴニストＳＡＧ（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）とプルモルファミン（ＰＭＮ、１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）とによるソニックヘッジホッグ活性化及びＩＷＲ−ｅｎｄｏ（１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ）を用いたＷｎｔシグナル伝達阻害によって、腹側間脳へ細胞を向かわせ、２日毎に定期的に培地を交換した。９日目から１３日目に、当該細胞を、腹側化剤レチノイン酸（０．１μＭ、Ｃａｙｍａｎ）の存在下で、ＤＡＰＴ（１０μＭ、Ｃａｙｍａｎ）を用いて、徐々に細胞周期から逸脱させる。１４日目に、細胞を、アクターゼで処理し、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有する成熟培地の存在下で、ラミニン被覆プレート上に再移植し、そして、４０日目まで維持した。
実施例４
ＥＤＣ処置
本発明者らは、３つの異なるＥＤＣ、すなわち、パーフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）（２．５μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリブチルスズ（ＴＢＴ）（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（１０ｎＭ、Ｃａｙｍａｎ）を、個別に、及び、組み合わせて使用した。したがって、本発明者らは、６つの処置群、すなわち、ビヒクル対照（媒体）、ＰＦＯＡ、ＴＢＴ、ＢＨＴ、及び、併用処置を行った。ＥＤＣのｉＦＧＥ処置は、上記のように分化を行い、最後の１２日間の分化の間、すなわち、８日目〜２０日目に、ＥＤＣ処置を加えて実施した。同様に、上で詳述したプロトコール、及び最後の１２日間の分化、すなわち、２８日目〜４０日目のＥＤＣ処置を行ってｉＨＴＮを分化させた。ＮＦκＢｉ（ＳＮ５０）を用いる救済実験のために、ＥＤＣ処置をする前に、当該細胞を、最初に、ＮＦκＢｉに対して２４時間曝露した。続いて、当該細胞を、ＮＦκＢｉとともに併用処置で処置を行った。ＮＦκＢｉ処置は、併用ＥＤＣ処置条件と組み合わせただけであることに留意すべきである。
実施例５
免疫蛍光
免疫蛍光に供された細胞を、最初に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて、２０分間、固定し、及び、続いて、ＰＢＳで洗浄した。５％ロバ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と０．２％トリトンＸ−１００（Ｂｉｏ−ｒａｄ）とを含むＰＢＳで、短くとも２時間、細胞をブロッキングした後に、当該細胞を、適切な濃度の関連する一次抗体の組み合わせ（１：２５０）により、４℃で、一晩、インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いて十分に洗浄をした後に、当該細胞を、適切な種特異的アレクサフルオル結合二次抗体の組み合わせで、４５分間（１：５００）処理する。ヘキスト染色を用いて核を標識し、及び、当該細胞を、次いで、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用する適切な蛍光フィルターを用いて細胞を可視化した。
実施例６
免疫ブロット
細胞ペレットを回収し、そして、溶解し（哺乳動物ＰＥＲ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＋１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、タンパク質を定量した後に、試料を調製した。本発明者らは、ポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル）のレーンあたり約１５μｇのタンパク質を負荷した。ゲルが一旦溶解したら、それらを、ニトロセルロース膜上に移し、続いて、５％乳溶液で、短くとも２時間かけてブロックした。この後に、一次抗体で膜を処理する一段階ｉ−Ｂｉｎｄプロセス、洗浄、そして、二次抗体ステップ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が続いた。本発明者らは、ＬｉＣｏｒ（登録商標）ＩＲＤｙｅ二次抗体（６８０及び８００波長の赤外染料）を使用し、ＬｉＣｏｒ ＯＤｙｓｓｅｙ ＣＬｘ撮像装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ）において、バンドの検出を行った。
実施例７
定量的ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを単離し、まず、ＲＮＡ（２μｇ）をＤＮａｓｅ処理し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、オリゴ（ｄＴ）でｃＤＮＡに逆転写した。各遺伝子に特異的なプライマー配列を用いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３連で、反応を行った。各ＰＣＲサイクルは、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間→５８℃で６０秒間を、５０サイクル行い、及び、７２℃で５分間であった。対象となる遺伝子を、ミトコンドリア遺伝子についてのＲＰＬ１３Ａまたは１６ｓｒＲＮＡのいずれかに対して正規化した。
実施例８
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイによって、細胞生存率を評価した。１ウェルあたり１００μｌの培地に１０，０００個の細胞の密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種した。アッセイ当日に、新鮮な培地（１００μｌ）を加え、１０μｌのＭＴＴ溶液を、培地（１２ｍＭのストックＭＴＴ溶液）に加えて、３７℃で、４時間インキュベートした。各ウェルに５０μｌのＤＭＳＯを添加して反応を停止させた。バックグラウンドを差し引くために、細胞を含まない陰性対照を含めた。自動マルチウェル分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、吸光度値を、５４０ｎｍで読み取った。
実施例９
代謝表現型解析及びシーホース呼吸計測アッセイ
シーホースＸＦｅ２４細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ミトコンドリアストレス試験を行い、細胞内の酸素消費率（ＯＣＲ）のリアルタイム測定値を得た。ＥＤＣで処置をした、または処置していないｉＦＧＥ及びｉＨＴＮを、２４ウェルシーホース培養プレートに、１０，０００〜１５，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。ＯＣＲの分析のために、細胞を、シーホース基本培地で再構成し、測定を行う前に、非ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、１時間、静置した。化学試薬（Ｓｉｇｍａ）は、以下の最終濃度のものを用いた。１μＭオリゴマイシン−ＡＴＰ合成酵素阻害剤、１μＭ（ＦＣＣＰ）シアン化カルボニル４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン−脱共役剤、及び、０．５μＭアンチマイシンＡ−シトクロムＣ還元酵素阻害剤と０．５μＭロテノンの混合物−複合体Ｉ阻害剤。結果を、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定されたタンパク質濃度に対して正規化した。
実施例１０
統計分析
すべてのデータを、平均±標準偏差または標準誤差として表している。ｐ＜０．０５を、有意とみなした。すべての統計解析は、スチューデントの対応のあるｔ検定、または、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、及び、多重比較のためのニューマン−コイルス事後検定を用いて、グラフパッドプリズムで行った。
実施例１１
一次及び二次抗体
免疫細胞化学染色。一次。α−ＭＳＨ、ウサギ、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｈ−４３−０１、１：２５０。β−カテニン、ウサギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ７１９９、１：５００。ＣＡＲＴ、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１８０６８、１：２５０。ＣＰＥ、ヤギ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ３５８７、１：２５０。Ｅ−カドヘリン、ヤギ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ６４８、１：２５０。ＧＡＢＡ、ウサギ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２０２５、１：２５０。ガストリン、ウサギ、Ｄａｋｏ、Ａ０５６８０１−２、１：２５０。グレリン、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１０３６８、１：２５０。ＮＦ−κＢ（ホスホ Ｓｅｒ−３１１）、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１６６７４８、１：２５０。ＮＰ−ＩＩ、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ２７０９３、１：２５０。ＮＰＹ、ウサギ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９６０８、１：２５０。ＯＴＰ、ウサギ、Ｇｅｎｅｔｅｘ、ＧＴＸ１１９６０１、１：２５０。ペプチドＹＹ、ウサギ、Ａｂｃａｍ、ａｂ２２６６３、１：２５０。セロトニン、ウサギ、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、２００８０、１：２５０。ソマトスタチン、ウサギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１３０９９、１：２５０。Ｓｏｘ１７、マウス、Ｎｏｖｕｓ、４７９９６，１：２５０。Ｓｏｘ２、ウサギ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０９−００２４、１：５００。シナプトフィジン、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１７７５０、１：２５０。ＴＨ、マウス、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、２２９４１、１：２５０。二次（１：２００）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ロバ抗ウサギ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ ロバ抗マウス、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４ ロバ抗マウス、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８ ロバ抗ヤギ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７ ロバ抗ヤギ。
免疫ブロット法。ＣＯＸ ＩＶ、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４８５０、１：２０００。ＮＦ−κＢ ｐ６５（ホスホ Ｓｅｒ−３１１）、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ１６６７４８，１：１０００。ＮＦ−κＢ ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８２４２，１：１０００。ＮＦ−κＢ１（ｐ１０５／ｐ５０）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１２５４０、１：１０００。ＮＦ−κＢ２（ｐ１００／ｐ５２）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４８８２，１：１０００。ホスホｐ５３（Ｓｅｒ１５）、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２８４Ｔ、１：５００。ｐ５３、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２８２Ｔ、１：５００。ＩＲＥ１α、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３２９４、１：５００。Ｅｒｏ１、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３２６４、１：５００。ＢｉＰ、ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１７７、１：５００。
二次（１：２０００）。ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ロバ抗ウサギ、Ｌｉ−Ｃｏｒ、９２６−３２２１３。ＩＲＤｙｅ ６８０ＬＴ、ロバ抗マウス、Ｌｉ−Ｃｏｒ、９２６−６８０２２。
実施例１２
プライマー配列：
Figure 2019506861
Figure 2019506861
実施例１３
末梢血単核細胞を多能性に対してエピソーム的にリプログラミングする。
ｉＰＳＣに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の非取り込みリプログラミングを、本発明者らの研究室で公表したプロトコールと同様のエピソーム（ＯｒｉＰ／ＥＢＮＡ１）プラスミドに基づいた方法を用いて行った。これには、エピソームに発現する７つのリプログラミング因子である、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、非形質転換Ｌ−ＭＹＣ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）、及びｐ５３に対するｓｈＲＮＡ（図Ｓ１Ａ）の核トランスフェクションを含んでいた。このプロトコールは、２７〜３２日後に機械的に単離して増殖することができる血液由来の非取り込みｉＰＳＣクローンを首尾よく生成した（図Ｓ１Ａ）。この研究で使用した独立したドナー由来のｉＰＳＣ株（８０ｉ対照 Ｔｎ２、及び、２０１ｉ対照 ＮＴｎ４）の代表的な画像は、図Ｓ１Ｂの明視野画像で示されるように、核と細胞質の比が高い密着したコロニーなど、多能性幹細胞の典型的な特徴を示した。また、堅固なアルカリホスファターゼ活性を示し、核（ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２）及び表面（ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６０）多能性タンパク質の強い発現を示した（図Ｓ１Ｂ）。生成したＰＢＭＣ−ｉＰＳＣは、高い多能性と低い新規性スコアとを示して（図Ｓ１Ｃ）ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイにも合格し、また、Ｇ−バンド核型スプレッド（図Ｓ１Ｄ及びＥ）に示したように、正常な細胞遺伝的状態を維持している。
実施例１４
ヒトｉＰＳＣは、ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及び、レチノイン酸シグナル伝達の調節によって内分泌的に活性な前腸上皮（ｉＦＧＥ）へと分化する
胃のオルガノイドを成熟させるために３Ｄマトリゲルバブルを使用したＷｅｌｌｓのグループによって以前に発表された３Ｄ胃オルガノイド分化に基づいて、本発明者らは、内分泌機能を有する胃上皮の２Ｄ単層を生成するために彼らのプロトコールの変法を用いた。内分泌細胞タイプを含む前腸腔上皮へのｉＰＳＣの特定化は、（１）アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａが媒介した胚体内胚葉の特定化、（２）ＢＭＰシグナル伝達の抑制と、ＷＮＴ（ＣＨＩＲ）、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、及び、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化とを同時に行うこと、及び、（３）高濃度の表皮成長因子（ＥＧＦ）での前腸上皮を含有する内分泌細胞の最終生成（図１Ａ）、による段階的方法で首尾よく達成できた。胚体内胚葉を誘導した後、ｉＰＳＣの６日後に、腸管様オルガノイド構造が、内胚葉単層から出現する。腸管オルガノイドを再播種すると、接着性の上皮様細胞層が、ｉＰＳＣの７日後から２０日後まで一貫して出現する（図１Ｂ）。関連する胃／前腸特異的遺伝子の発現をモニターすることによって、２０日目のｉＰＳＣ由来の前腸上皮（ｉＦＧＥ）の特徴付けを確認した。ＳＯＸ２（前腸前駆細胞）、ＰＤＸ１（前腸腔）、ＧＫＮ１（ガストロカイン１、胃粘膜）、ＰＧＡ５（消化酵素）、ＴＡＳ１Ｒ３（前腸における味覚受容体）、及び、ＴＦＦ２（トレフォイル因子２、胃粘膜の安定分泌タンパク質）遺伝子が、２０日目の接着性ｉＦＧＥにおいて観察された（図１Ｃ）。ｉＦＧＥは後腸特異的ＣＤＸ２の発現を示さなかったことに留意することが重要である（図１Ｃ）。上皮細胞表面に特異的なタンパク質を評価すると、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）とＣＴＮＮＢ（β−カテニン）とが形成されたｉＦＧＥのシートとして、多角形の石畳の形をした細胞の表面に規則的に観察された（図１Ｄ）。内胚葉及び前腸前駆細胞特異的転写因子であるＳｏｘ１７及びＳｏｘ２は、それぞれ、ｉＦＧＥの前腸の識別を確認する（図１Ｄ）。重要なことに、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、ソマトスタチン、及び、セロトニンなどの内分泌的に活性な前腸に存在することが知られている神経内分泌マーカーが、２０日目に、ｉＦＧＥによって発現された（図１Ｅ）。とりわけ、ｉＦＧＥは、ガストリン（Ｇ細胞）、グレリン（壁細胞）、及び、幾つかのペプチドＹＹ（粘膜）細胞などの胃特異的ホルモン発現腸内分泌細胞に対しても免疫陽性であった（図１Ｆ）。
実施例１５
機能的ニューロペプチダーゼ性視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）は、ＳＨＨの活性化及びＷＮＴシグナル伝達の阻害によって、ｈｉＰＳＣ−神経上皮から得ることができる。
指定したパターン形成と、ｉＰＳＣの二重ＳＭＡＤ阻害（ＳＭＡＤｉ）小分子処置で神経上皮を特定化した後に、当該ｉＨＴＮを生成した。続いて、早期ＷＮＴ阻害、及び、ＳＨＨ活性化は、視床下部及び弓形核が存在する、腹側間脳が同一の前脳細胞タイプを特定化した（図２Ａ）。４０日までに前脳前駆細胞と分化ニューロンの終末成熟を同期させると、ＡｇＲＰ（アグーチ関連ペプチド、食欲促進神経ペプチド）、ＭＣ４Ｒ（メラノコルチン４受容体、摂食及び代謝の調節）、Ｎｋｘ２．１（腹側間脳マーカー）、ＮＰＹ（神経ペプチドＹ、ＡｇＲＰで同時発現した食欲促進神経ペプチド）、及びＰＣＳＫ２（前駆タンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン２型、神経内分泌遺伝子）などの視床下部及び神経肥大遺伝子の発現を増加した（図２Ｂ）。不可欠な視床下部神経ペプチドＮＰＹ及びα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の分泌は、ＥＬＩＳＡを用いて確認され、そして、その結果は、４０日目のｉＨＴＮにおいて両神経ペプチドが有意に高いレベルにあることを明らかにした（図２Ｃ及びＤ）。免疫蛍光染色は、ＯＴＰ（ホメオボックスタンパク質オーソペディア、図２Ｅ）、α−ＭＳＨ（図２Ｆ）、ＮＰＹ（図２Ｇ）、ＳＳＴ（ソマトスタチン、図２Ｈ）、ＧＡＢＡ（図２Ｉ）、ＣＰＥ（カルボキシペプチダーゼＥ、図２Ｊ）、ＣＡＲＴ（コカイン−、及び、アンフェタミン−調節転写産物、図２Ｋ）、ＮＰ−ＩＩ（ニューロフィジンＩＩ／アルギニンバソプレシン、図２Ｌ）、５−ＨＴ（セロトニン、図２Ｍ）、及び、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ、図２Ｎ）などの幾つかの神経内分泌及び視床下部弓状核特異的タンパク質を発現するニューロンを示した。多電極アレイ（ＭＥＡ）プラットフォームを用いた電気生理学的測定は、０日目の無活動と比較して、４０日目のニューロンでは自発的活動電位と反復的発光との規則的な一連の流れを示し、したがって、真正なニューロンの識別とｉＨＴＮの電気的成熟とを確認している（図２Ｏ）。
実施例１６
慢性低用量ＥＤＣ処置は、細胞の生存率に影響を与えずに、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮでのＮＦ−κＢシグナル伝達を攪乱する。
本発明者らは、ｉＰＳＣ−内分泌細胞培養の分化を首尾よく終えた後に、１２日間の処置パラダイムにわたって、低用量のＥＤＣを用いて、これらの組織を攪乱することにした。ＥＤＣ処置の最適濃度は、分化したｉＰＳＣ−内分泌培養物（図Ｓ２）において、１０％の細胞生存率の喪失さえも観察された用量に満たない対数濃度または半対数濃度として決定した。加えて、ヒトの許容可能な１日摂取量（ＴＤＩ）を把握するために文献検索を利用し、細胞生存率に対する化合物の各々の範囲の効果を実施し、そして、ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ、２．５μＭ）、トリブチルスズ（ＴＢＴ、１０ｎＭ）、及び、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、１０ｎＭ）を、複数のＥＤＣに対して同時に環境曝露を行うのと類似の併用処置パラダイムとともに与えた（図Ｓ２）。発達中のｉＰＳＣ由来の内分泌組織のＥＤＣで処理すると、ｉＦＧＥ細胞においてリン酸化ＮＦ−κＢ ｐ６５免疫陽性細胞数の有意な増加が、ｉＨＴＮにおいて、１．３５〜１．５倍（図３Ｃ）、及び、１．２〜１．３倍（図３D）（ｐ＜０．００１）で認められた。これらの培養物の免疫ブロットは、ＮＦ−κＢ ｐ６５リン酸化レベルが、ＥＤＣ処置ｉＦＧＥ（図３Ｅ）（ｐ＜０．００１）、及びｉＨＴＮ（図３Ｆ）（ｐ＜０．０１）において有意に上昇することを確認した。ＥＤＣの添加と、その結果として表れるＮＦ−κＢホスホ−ｐ６５の増加が、細胞生存率または一般的な細胞傷害性におけるＥＤＣ誘導性喪失の結果ではないことを確認するために、ＥＤＣ処置、及び、ビヒクル処置ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮに対していＭＴＴ細胞生存率アッセイを実施した。これらの処置ではＥＤＣは、双方のｉＰＳＣ由来組織型において、細胞生存率に対して有意の影響を及ぼさないことが認められた（図３Ｇ及びＨ）。
ＮＦκＢ ｐ６５のリン酸化は、その活性化プロセスの一部であり、血液細胞での有害な前炎症性活性化経路に関連することがよく知られている。ｐ５０を用いた二量体化及び核への移行のためには、リン酸化が必要とされる。ＥＤＣ処置でｐ６５（ＲｅｌＡ）活性化が観察されたので、活性型ｐ５０形態と不活性ｐ１０５（ＮＦκＢ１）サブユニットとの比率を決定することによって、古典的ＮＦ−κＢ経路の活性化を評価した。リン酸化したｐ６５サブユニットとのｐ５０の二量体化、及び、その後のＩκＢαのプロテアソーム分解は、ｐ６５−ｐ５０二量体の一般的な核転位をもたらし、その結果、κＢ依存性遺伝子の転写調節をもたらす（図４Ａ）。個別の、及び、組み合わせのＥＤＣ処置では、ｐ５０レベルは、その前駆体ｐ１０５のレベルよりも高く（図４Ｂ）、このことは、ＥＤＣ処置したｉＰＳＣ−内分泌培養における古典的経路の活性化を示す。興味深いことに、ｉＦＧＥとｉＨＴＮの双方が、ｐ５０／ｐ１０５においてＥＤＣ媒介的増大を示しており、ｉＦＧＥは、２〜３倍の増加（ｐ＜０．００１）を示し（図４Ｂ）、一方で、ｉＨＴＮは、１．５〜２倍の増加を示した（ｐ＜０．００１）（図４Ｅ）。非古典的ＮＦ−κＢ経路の関与／活性化を決定するための同様の方法において、本発明者らは、ｐ１００のｐ５２に対するタンパク質発現の比率を測定した。簡潔に言えば、非古典的ＮＦκＢ経路は、ＲｅｌＢ及びｐ５２の二量体化を含んでおり、したがって、ｐ５２の量の測定は、この経路において可能な活性化の測定法を提供する（図４Ｄ）。同様に、本発明者らは、ｉＦＧＥ（１．４〜２倍、ｐ＜０．００１）及びｉＨＴＮ（１．５〜２．５倍、ｐ＜０．００１）の双方において、ＥＤＣの処置でｐ５２／ｐｌ００の比率の有意な増加も観察した（図４Ｆ）。したがって、本発明者らは、初めて、ＥＤＣが、ＮＦ−κＢ経路を著しく撹乱させることによって、ヒト内分泌細胞を発生させる作用を媒介することを実証したのである。
実施例１７
ミトコンドリア呼吸を撹乱することによって、ＥＤＣは代謝活性に作用する。
本発明者らの１つの目的は、慢性ＥＤＣ撹乱がヒト内分泌組織における代謝活性及び呼吸に影響するかを決定することを目的としていたので、本発明者らは、ＮＦ−κＢのリン酸化が、この現象にどのように寄与もし得るかをを調べた。興味深いことに、関連する核及びミトコンドリアにコードされた呼吸遺伝子の転写を直接的及び間接的に制御することによってＮＦ−κＢシグナル伝達がミトコンドリア機能に影響を及ぼすという、癌生物学における幾つかの証拠がある。まず、本発明者らは、ＸＦｅ２４ Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒで、ミトコンドリアストレス試験を行うことで、ミトコンドリア呼吸機能に対するＥＤＣの効果を決定した。本発明者らは、ｉＦＧＥにおいて、ＢＨＴ（ｐ＜０．０５）の添加、及び、ＰＦＯＡ、ＴＢＴ、及び、ＢＨＴの併用処置（ｐ＜０．０１）を行うことで、最大呼吸が減少し、また、予備呼吸能の４０〜５０％が減少する結果となったことを確認した（図５Ａ）。ｉＨＴＮにおいて同様の効果を示され、ＴＢＴ、ＢＨＴ、及び、併用処置で処置すると、最大呼吸、及び、予備呼吸能において４０〜５０％の減少を示した（図５Ｂ）。ミトコンドリア質量に対する処置の効果は、全ての処置期間においてＣＯＸ ＩＶ（内部ミトコンドリア膜酵素）レベルが変化しなかったので、除外した（図Ｓ５）。
本発明者らは、ミトコンドリア機能において、この障害を有する可能性のある転写調節を推測するために、ＳＣＯ２（シトクロムＣオキシダーゼ２）、ＰＯＬＲＭＴ（ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ）、ＴＦＡＭ（転写因子Ａ、ミトコンドリア）、及び、ミトコンドリアでコードされたＣＹＴＢ５（シトクロムＢ５）など、核でコードされた重要なミトコンドリア呼吸遺伝子の遺伝子発現レベルを調べた。ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣＹＴＢ５などの重要な呼吸遺伝子は、個々のＥＤＣ処置の結果として、ダウンレギュレーションされ、組み合わせ処置が、ｍＲＮＡレベルを最も顕著に減少させた（図５Ｃ〜Ｆ）ので、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの双方が、ＥＤＣ処置による有意な影響を受けた。
実施例１８
ＮＦ−κＢ阻害は、経路活性化及びミトコンドリア障害から細胞を救済する。
ｉＰＳＣ−内分泌細胞の発達において、ＥＤＣ曝露に起因する有害なＮＦ−κＢ経路撹乱とミトコンドリア機能不全効果とが顕著であることを考慮して、本発明者らは、これらの表現型が、ＮＦ−κＢ経路の活性化を単に遮断することによって、ことによると救済できるかを調べた。したがって、本発明者らは、細胞透過性阻害ペプチドであるＮＦ−κＢ阻害剤（ＮＦκＢｉ）ＳＮ５０を使用して、これが有害な併用ＥＤＣ処置で処置されたｉＰＳＣ−内分泌培養における従前の表現型を救済し得るかどうかを決定した。ＳＮ５０ペプチドは、ＮＦ−κＢ調節遺伝子の核誘導を阻害することが知られている。本発明者らは、ｉＦＧＥにおけるＥＤＣとＮＦ−κＢｉとの同時処置が行われ次第に、ホスホ−ｐ６５、古典的（ｐ５０／ｐ１０５）、及び、非古典的（ｐ５２／ｐ１００）経路の全体的な減少が、ビヒクル対照のレベルにまでほぼ回帰すことを見出した（ｐ＜０．００１）。ＮＦ−κＢｉは、ｐ５０だけに特異的な阻害効果を示すのではなく、併用処置だけの場合と比較して、活性化されたｐ６５、ｐ５０、及び、ｐ５２レベルに関する一般的な阻害効果よりも大きい効果を示した（図６Ａ）。免疫陽性ｐＮＦ−κＢ細胞が、ビヒクル対照レベルに近づくように減少した時にも、ＳＮ５０ ＮＦκＢｉ処置のこの救済効果は確認された（図６Ｂ）。特に、ＮＦ−κＢｉ処置は、併用ＥＤＣ処置した細胞のミトコンドリア予備呼吸能も有意に改善した（図６Ｃ）。最も興味深い発見は、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣＹＴＢ５などのミトコンドリア機能に関与するタンパク質の転写調節が、ＥＤＣ併用処置と比較して、ＮＦκＢｉ処置ですべて回復したことである（図６Ｄ）。これらの結果は、ＮＦ−κＢｉ処置が併用ＥＤＣ処置媒介効果を有意に逆転させたｉＨＴＮにおいて再現している（図７）。ＮＦ−κＢ経路撹乱と重篤なミトコンドリア機能障害とを関連付けるこの新規な発見は、特に、内分泌攪乱の状況において、いずれの系においても示されていない。
実施例１９
考察
「環境オビーソゲン」仮説によれば、内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）として知られている広範囲の環境汚染物質のサブセットは、ホルモンシグナル伝達経路を標的とし、正常組織の発達を妨げ、そして、身体の恒常性の制御を妨害する。子宮内または幼少期の幹細胞発生の重要な期間に、主にヒトの食物を介して、有機スズ、ペルフルオロケミカル、及び、食品添加物などの遍在する「オビーソゲン」ＥＤＣを繰り返し曝露すると、遺伝的に素因がある個体の正常な代謝制御が永久に改変され、人生の後半に肥満になる。注目すべきは、これらのＥＤＣが、本発明者らの日常環境に存在し続けており、健康被害を引き起こし続けているという事実である。最近の文献は、ＥＰＡ（環境保護庁）の勧告に従ってＰＦＯＡの使用を段階的に廃止する努力をしているにもかかわらず、テネシー川から供給された飲料水にＰＦＯＡが含まれていたことを報告していた。同様に、シリアルの添加物としてＢＨＴを排除する努力がなされており、主要なブランドは、ＢＨＴをシリアル用添加物から首尾よく除去した。これらＥＤＣへの日々の曝露が、我々に対して内分泌撹乱とそれに関連する影響を与え続けているとすれば、これらＥＤＣの影響は、もっと詳細に研究される必要がある。
追跡可能な遺伝的原因から生じる肥満の幾つかの具体的な例を除いて、数多くの生物学的及び行動学的因子は、エネルギーバランスの変化に影響を与える。遺伝的基礎は、広範に研究されており、また、ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）は、多くの肥満関連遺伝子座を同定している。しかしながら、動物モデルでは、これらの内のわずかなしか解明または検証できていない。本発明者らのヒト遺伝子プールが、小児期における肥満の急激な進展として迅速に変化しなかったと仮定すると、個体の遺伝的背景と相互作用する現代の化学環が、肥満のリスクを高め、かつ、肥満の重症度を変える駆動機構であり得る。ヒト組織の発達における内分泌機能を妨害する普遍的なＥＤＣの徴候を予測する、より良好なバイオマーカー及びメカニズムは、遺伝子−環境相互作用をプローブするための適切なヒト細胞モデルが欠けているので、少なくとも部分的には欠如したままである。本発明者らは、多能性幹細胞を用いて、これらのギャップに対処することを決定し、ここで、本発明者らは、ヒトｉＰＳＣ−内分泌細胞に対する低用量ＥＤＣの慢性的な曝露が、過活動性ＮＦ−κＢシグナル伝達とミトコンドリア機能不全とを介した初期内分泌組織発生において有害であり、また、肥満及び２型糖尿病などの代謝性疾患に寄与すると考えた。
発達プログラミング期間での代謝変化は、近年、大きな関心を集めている。妊娠中の個体における肥満が蔓延するにしたがい、胎児の発達プログラミングは、臓器形成及び組織発生、代謝及び代謝障害に対する子孫の体質における、変化の対象となり得る。本発明者らの現在の研究において、本発明者らは、発達中の細胞、すなわち、ｉＨＴＮ及びｉＦＧＥにおける推定上の内分泌攪乱化学物質への曝露の有害な影響を調べる。本発明者らのインビトロデータは、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの双方におけるＥＤＣ処置が、リン酸化されたｐ６５の増加をもたらすことを明らかにしている。ｐ６５／ＲｅｌＡは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）または他の感染因子などのサイトカインによって刺激されることが知られている標準的な古典的ＮＦκＢ経路の一部であり、ｐ６５：ｐ５０二量体に至るそのユビキチン化を介してＩκＢの分解に依存しており、それにより、この経路を活性化する。一般に、このＮＦκＢ経路は、がん生物学及び腫瘍進行において研究がかなりされているが、発達プログラミング及び代謝におけるその役割に関しては、ほとんど知られていない。しかしながら、低用量ＥＤＣの存在下で、本発明者らは、内分泌組織、ｉＨＴＮ、及び、ｉＦＧＥにおけるｐ６５のリン酸化の増加を観察したことは注目に値する。ＮＦκＢのこの有害撹乱は、神経組織におけるＥＤＣの長期間の残留と長期間の効果を示唆しており、また、神経内分泌、及び、食物摂取経路、ならびに、脳の発達に関連し得る。哺乳類の胃及び脳に関するＥＤＣの長期的かつ直接的な発達の影響を確認するために、動物モデルまたはヒト細胞のいずれかにおける、さらなる研究が必要とされている。
同様に、本発明者らは、ＥＤＣ処置により、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの双方において、ｐ１０５からｐ５０ならびにｐ１００からｐ５２への進行が促されたことを見出した。このことは、ＥＤＣを用いた古典的経路及び非古典的経路の活性化をＥＤＣが示しているので、興味深い発見であった。幾多の研究が、ｐ６５／ＲｅｌＡが、ｐ１０５及びｐ１００プロモーターの双方のトランス活性化に関与し得ることを示唆している。したがって、ＲｅｌＡは、ＮＦκＢの古典的及び非古典的経路に共通する活性化因子であり得る。ＮＦ−κＢは、上記したタンパク質を通じてクロストークを介してミトコンドリア機能に影響を及ぼすことが指摘されている。
本発明者らが、ＥＤＣの存在下で、ｉＨＴＮ及びｉＦＧＥにおけるミトコンドリア呼吸能力の差異を見出したとき、この研究の興味深い態様の１つが明らかになった。しかしながら、本発明者らは、ミトコンドリア呼吸能に関する各ＥＤＣの影響の程度が、様々であることを見出した。ｉＦＧＥでは、ＢＨＴ及び併用処置のみが、予備呼吸能を有意に低下させたが、ｉＨＴＮ、ＴＢＴ、ＢＨＴ、及び、併用処置では、予備呼吸能の有意な障害をもたらした。両方の細胞型におけるＰＦＯＡ処理は、効果を示さなかった。ミトコンドリアの予備呼吸能の障害は、基礎呼吸数の増加、プロトン漏れの増加、または、ミトコンドリアの最大呼吸能の低下のいずれかで説明できる。ミトコンドリア機能に関与する遺伝子の転写の差異にミトコンドリア機能の障害が説明できるかどうかを試験するために、本発明者らは、ミトコンドリア機能に関与する４つのタンパク質、すなわち、ａ）ＳＣＯ２（シトクロムｃオキシダーゼのサブユニット）、ｂ）ＰＯＬＲＭＴ（ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ）、ｃ）そのすべてを核がコードしているＴＦＡＭ（転写因子Ａ、ミトコンドリア）、及び、ｄ）ミトコンドリアがコードしているＣｙｔＢ５（シトクロムＢ５）のｍＲＮＡレベルを測定した。
ｉＨＴＮとｉＦＧＥの双方においてＥＤＣ処置を行うと、これらすべての遺伝子がダウンレギュレーションされていたことは興味深いことであった。このことは、ＥＤＣの存在下でのミトコンドリア機能の障害を説明するかもしれない。ＮＦκＢが、核及びミトコンドリア遺伝子発現の双方に影響を及ぼしてＡＴＰ産生を調節する可能性のある機構を提案している者もいる。彼らは、ＮＦκＢ ＲｅｌＡと特定の転写因子との間のクロストークが、ＴＦＡＭ及びＰＯＬＲＭＴなどの核にコードされたミトコンドリアタンパク質の発現を調節することを提案している。さらに、彼らは、ＲｅｌＡが、ミトコンドリアに直接転座し、そして、ミトコンドリア遺伝子発現を抑制し、それによって、酸化的リン酸化のダウンレギュレーションに寄与することを示唆している。ある研究は、ＲｅｌＡノックダウンが、ＰＯＬＲＭＴとミトコンドリアゲノムのＤループとの結合の増加、シトクロムＢ ｍＲＮＡレベルの増加、及び、ＡＴＰ産生の増加をもたらすことを報告した。これらをまとめると、これらの知見は、ＲｅｌＡを増加させると、シトクロムＢ５ ｍＲＮＡレベルが低下する、という本発明者らのデータを裏付けている。加えて、ＲｅｌＡが活性化され次第に、ミトコンドリア呼吸の減少、及び、ＰＯＬＲＭＴ ｍＲＮＡレベルの減少を認めた本発明者らの観察を考慮すれば、本発明者らのＥＤＣ処置細胞におけるＡＴＰ産生も弱まり得るものと考えられる。
ＮＦκＢの抑制が、これらの作用を逆転するかどうか、およびミトコンドリア機能の障害が、ＮＦκＢ経路の活性化と関連するかを明らかにする試みにおいて、本発明者らは、ＮＦκＢ阻害剤、ＳＮ５０（ＮＦκＢｉ）を使用した。これは、細胞透過性ペプチドであって、当初は、ｐ５０を阻害することが知られていたが、その後になって、ＳＮ５０は、ｐ５０に特異的であるだけでなく、他のＮＦκＢ転写因子にも影響を及ぼし得ることがわかってきた。このことに符合して、ＮＦκＢｉ処置は、ホスホｐ６５、ｐ５０、ならびに、ｐ５２のＥＤＣ媒介による増加を顕著に減少させた。本発明者らは、ＮＦκＢをミトコンドリア機能に関連させることで、ＮＦκＢｉ処置が、ミトコンドリアの予備呼吸能ならびにＮＦκＢ標的遺伝子のＥＤＣ媒介による減少を回復させることも見出した。
ＲｅｌＡの関与は、ミトコンドリア呼吸に影響する重要な役割を有するようである。ある特定の研究は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるグルコース飢餓の間、ＲｅｌＡは、酸化的リン酸化を活性化し、解糖を減少させることを示した。この研究に基づいて、非飢餓の期間は、解糖系スイッチがエネルギー源として解糖に有利に作用し、したがって、本発明者らは、酸化的リン酸化の増加を観察しないものと仮定することが無難であり得る。しかしながら、本発明者らは、ミトコンドリア呼吸率の減少、及び、ミトコンドリア呼吸に関与する遺伝子、例えば、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣｙｔＢ５の減少を認識する。ＲｅｌＡは、酸化的リン酸化を抑制する活性化において状況的であると広く認識されており、したがって、細胞環境及び基質レベルが、酸化的リン酸化におけるＲｅｌＡの状況を決定するに際して、重要な役割を果たし得る。本発明者らの研究では、ＥＤＣによる活性化された際のＲｅｌＡは、その核標的に直接作用して、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、及び、ＴＦＡＭなどの遺伝子が関係する抑制を介してミトコンドリア呼吸を抑制する。
幾つもの研究で、ミトコンドリアゲノムへのＲｅｌＡの動員が指摘されており、及び、そのＣ末端の翻訳領域は、ｍｔＤＮＡへのＰＯＬＲＭＴの結合を抑制する。ミトコンドリアでコードされる遺伝子であるＣｙｔＢ５もまた、ＮＦκＢによって調節されることが以前に示されている。これらを総合すると、その一部を図５〜７、９、１２〜１３、１７〜１９に示した本発明者らのデータは、ＮＦκＢの活性化が、ミトコンドリア呼吸を抑制する役割を果たすことを示唆している。この効果の機能的及び発達的推測をさらに探求する必要がある。例えば、脂肪組織における効果を観察することを目的とした研究は、エネルギー恒常性を定義する際のＥＤＣ化合物のさらなる役割になり得る。ＥＤＣ処置したｉＦＧＥ及びｉＨＴＮ及び脂肪細胞に対するプロテオミクス分析はまた、検出可能なペプチド前駆体のすべてのフラグメントイオンの解明を可能にし、それにより、調節不全タンパク質の同定を補助するであろう。
実施例２０
さらなる研究
様々な薬物／化合物／汚染物質の胎児発達に関する影響は、先天性欠損や発達障害を回避し、次世代の生活の質を向上させるために、速やかに対処する必要がある、手段となっている。地球規模の汚染レベルが絶えず増加しているため、有害な環境汚染物質や有害物質への曝露の必然的危険度も高まっている。系内でのこれらの有毒物質の影響に関する明確な示唆を提供する一貫した薬物スクリーニングプラットフォームが必要である。
特に、当該胎児組織に関するこれら化合物の影響は、発達過程の胎児組織が、曝露を受けた生体異物と戦うに十分に発達した生体異物代謝または免疫系を持っていないので、なおさらに有害である。しかし、様々な薬物や化合物への潜在的に有害な曝露を研究するためにヒトの胎児発育過程でのそのような細胞を得ることは、ほぼ全く起こりそうにない。しかしながら、本発明は、ｈｉＰＳＣを用いて関心のある対象の組織（この場合、内分泌組織）の指令分化を行い、そして、これらの組織の初期発生に関する毒性物質の影響を研究することで、そのギャップを埋めるものである。薬物スクリーニングプラットフォームとしての本発明は、環境汚染物質（ＥＤＣ）のみならず、多数の処方薬物、乱用薬物、ならびに発達過程の組織への影響が未知の幾つかの他の化合物の効果を評価するために使用することができる。
過去に、幾つかの薬物スクリーニング及び毒性試験が行われてきた。これらの薬物スクリーニング法は、インビボでの毒性スクリーニングのためのラットまたはマウスモデルまたは小動物モデルの使用、または、薬物効果を試験するためのインビトロでのヒトがん細胞株の使用のいずれかを含む。薬物スクリーニングのラットモデルまたはマウスモデルの使用には、動物系がヒト系と異なる点、ヒト系には存在し得ない薬物の効果をマスクする可能性のある特定の応答に対する動物自身の適応などの幾つかの注意点がある。同じことが、線虫−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、または、魚類−Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏの使用を含む薬物検査及びスクリーニングの小動物モデルにも当てはまる。これらの方法は、より関連性の高い系で試験し、及び、集団データに基づいて結論に至る可能性のある標的と経路を特定する手段としてのみ使用することができる。
同様に、薬物スクリーニングのためのがん株モデルは重要なプラットフォームとなっているが、これらの株は、腫瘍そのものの遺伝的及びエピジェネティック的特徴を有するため、がんの治療のための薬物応答の研究に対してより適切であると考えることができる。したがって、インビトロでヒト系を表すことができ、かつ、化合物の開発効果をスクリーニングするという柔軟性を提供する忠実なモデルが必要であり、本発明は、それを行うことが可能なプラットフォームを提供する。
現在採用されている薬物スクリーニングのための幾つかのプラットフォームを考慮すると、特に、発達段階にあるヒトのシステムを忠実に模倣し得る薬物スクリーニング方法の必要性が依然として残っている。スクリーニングのための現在のモデルは、数多くの化学物質の内分泌攪乱をスクリーニングするためのマウスモデルまたは腫瘍／不死化細胞株を使用している。
正常な成人ヒト細胞を多分化能期に戻すｈｉＰＳ細胞の使用によって、及び、関心のあるほぼすべての組織／細胞型にへ誘導される能力を与えることによって、本明細書に開示した技術は、ヒト（胎児または幼児）の重要な発達段階での様々な化合物／薬物／毒性物質の効果をスクリーニングするための新規なプラットフォームを提供する。重要なことに、ｈｉＰＳＣは、また、個体から数多くの関連する、かつ、異なる内分泌様組織を作製できる正常な前駆細胞を提供し、無制限に供給する。次いで、これらの細胞は、毒性の予測及び化学物質の安全性のためのスクリーニングに使用することができる。
そのようなスクリーニングプラットフォームは、ヒトの発達モデルを忠実に模倣するだけでなく、スクリーニングした化合物によって撹乱され得る発達の手がかりに関して貴重な知識を提供することができる。以下の実施例は、薬物スクリーニング、及び、試験薬剤に対する細胞の応答のためのモデルを提供するための設計、そして、例示的な材料、方法、及び、データを提供する。
実施例２１
追加の研究
本実施例は、ＥＤＣ媒介調節不全に関連する例示的な結果を記載する。
実施例４の一部に記載したような、ＥＤＣ効果に関する、追加の実験。
図３の一部に示したように、情報に加えて、細胞生存率への影響を伴わない、ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮにおける慢性低用量ＥＤＣ処置ＥＲストレス。
図１５（ａ）ｉＦＧＥ、及び（ｂ）ｉＨＴＮに示すように、真正なＥＲストレス経路タンパク質、ＩＲＥ１、ＢｉＰ及びＥｒｏ１及びＣｏｘ ＩＶのレベルを示す代表的な免疫ブロットである。負荷対照としてＣｏｘ ＩＶに正規化された各タンパク質免疫ブロットの各々についてのバンドのＩｍａｇｅＪに基づいた濃度測定法を用いた定量ヒストグラムを以下に示し、ビヒクル処理対照と比較した倍率変化として表す。ＲＥ１タンパク質はＥＤＣ曝露に応答して増加するが、ＢｉＰ及びＥｒｏ１レベルは減少する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示すデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。
図４の一部に示したように、ＥＤＣ処置は、ＮＦ−κＢ ｐ６５古典的経路及び非古典的経路の障害を引き起こす。
図１６に示すように、慢性低用量ＥＤＣ処置は、ＮＦ−κＢシグナル伝達を攪乱する。（ａ）上部パネル。グレリン（緑）で同時染色したｉＦＧＥにおけるホスホｐ６５（赤）の増加を示す代表的な免疫細胞化学（ＩＣＣ）。下部パネル。シナプトフィジン（緑）で同時染色したｉＨＴＮでのホスホｐ６５（赤）の増加を示す代表的な免疫細胞化学（ＩＣＣ）（＊＊＊ｐ＜０．００１）。ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの双方について、免疫陽性細胞のスコアリングと定量をし、それは、ビヒクル対照処置ｉＦＧＥ（＊＊＊ｐ＜０．００１）、及び、ｉＨＴＮ（＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して、ＥＤＣ処置の各々におけるリン酸化ＮＦ−κＢ ｐ６５免疫陽性細胞における倍率変化によって表される。（ｂ）ｉＦＧＥ、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び、（ｃ）ｉＨＴＮ、＊＊＊ｐ＜０．００１におけるリン酸化ｐ６５、全ｐ５０、及び、全ｐ５２レベルの増加を示している全細胞溶解物でのタンパク質レベルの代表的な免疫ブロット。各免疫ブロットの各々についてのバンドのＩｍａｇｅＪに基づいた濃度測定法を用いた定量ヒストグラムを以下に示し、そして、ビヒクル処理対照と比較した倍率変化として表す。全ｐ６５、ｐ５０／１０５（古典的）、及び、ｐ５２／ｐ１００（非古典的）に対するリン酸化ＮＦ−κＢ ｐ６５の比率を計算した。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示した画像及びデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。
図５で部分的に示したように、図１７では、ＥＤＣは、代謝ストレスを誘発し、及び、内分泌調節を撹乱する。（ａ）ＥＤＣ曝露を受けると、ｉＦＧＥ、及び、ｉＨＴＮ（＊＊＊ｐ＜０．００１）の双方におけるリン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の減少を例示する免疫ブロット、（ｂ）ｉＦＧＥ及びｉＨＴＮの予備呼吸能の変化を表すヒストグラムを用いたシーホースミトコンドリア呼吸測定値、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、（ｃ）ｉＨＴＮ由来のミトコンドリア呼吸に関与する、核（ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ）遺伝子、及び、ミトコンドリアがコードした（ＣＹＢ５Ａ）遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ相対正規化発現。（ｄ）表に示す、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、ＣＹＢ５Ａ、ＴＰ５３及びＲＥＬＡ遺伝子のＤＮＡに関するＮＦ−κＢ ｐ６５（ＲｅｌＡ）及びｐ５３転写因子の推定結合モチーフは、可能な結合部位の数、及び、転写開始部位からの距離を、７０％の信頼水準で示す。赤色のフォントＩＬ１Ａ及びＣＤＫＮ１Ａは、それぞれ、ｐ６５及びｐ５３によって、プラスに調節される遺伝子であることが知られいる。（ｅ）ＥＤＣ処置で減少するＡＴＰレベル（ＡＴＰ／ＡＤＰ比）の測定値、（ｆ）ＥＤＣ処置したｉＦＧＥにおけるＰＹＹレベルの減少を示す免疫ブロット。（ｇ）ｉＨＴＮのＥＤＣ処置による分泌の減少を示すα−ＭＳＨのＥＬＩＳＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３。ＮＤ：検出不可。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示したデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。
図６及び７で部分的に示したように，図１８では、ＮＦ−κＢのブロッキングは、ＥＤＣ媒介代謝ストレス、及び、内分泌機能不全を救済する。より具体的には、例示的なＮＦ−κＢｉ処置が、（ａ）ｉＦＧＥ、及び、（ｂ）ｉＨＴＮにおけるホスホｐ６５、ｐ５０、及び、ｐ５２、のＥＤＣ媒介性の増加を抑制することを示す免疫ブロット、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。２つの異なる細胞株を、８０ｉ対照に属するレーン１、２、及び、３（媒体１、併用１、及びＮＦ−κＢｉ１）、及び、２０１ｉ対照からのレーン４、５、及び、６（媒体２、併用２、及びＮＦ−κＢｉ２）の６つのレーンに負荷した。（ｃ）ビヒクル処理（媒体）におけるリン酸化ｐ６５染色が、ＥＤＣ併用処置（併用）でホスホ−ｐ６５を増加させた（ＮＦ−κＢｉでは減少させる）ことを示す免疫細胞化学、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｄ）ｉＨＴＮにおける併用処置と比較して、ＮＦ−κＢｉ処置を行った時のミトコンドリア呼吸の改善を示すシーホースアッセイ、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｅ）併用処置で減少した（ＮＦ−κＢｉ処置によって救済される）ミトコンドリア呼吸遺伝子を示すＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及び、ＣＹＢ５ＡのＲＴ−ｑＰＣＲ発現レベル、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｆ）ＮＦ−κＢｉ処置を行った際のＡＴＰレベルの回復、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｇ）α−ＭＳＨ分泌レベルは、ＮＦ−κＢｉ処置を行った際の改善を示した、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｈ）ｉＦＧＥにおけるＰＹＹレベルの救済を示すウェスタンブロット、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべての統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ここに示した画像及びデータは、独立した実験で、ｎ＝３回で分化した、２つのｉＰＳＣ株の平均結果を表す。
図１９は、多能性幹細胞由来内分泌組織の発達におけるＥＤＣ媒介性調節不全の提案モデルを示す細胞の概略図を示す。ＰＦＯＡ、ＴＢＴ、及び、ＢＨＴなどのＥＤＣに曝露された場合の発達中の内分泌細胞は、ＩＲＥ１を増加させることによって小胞体（ＥＲ）ストレスを誘発し、Ｅｒｏ１及びＢｉＰのダウンレギュレーションを引き起こし、このことは、細胞内で折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）を誘導することが知られている。このことは、並行してＮＦ−κＢ（ｐ６５のリン酸化の増加）及びｐ５３（Ｓｅｒ１５におけるｐ５３のリン酸化の減少）のシグナル伝達の撹乱をもたらす。その後の代謝ストレスは、核及びミトコンドリアでコードされた呼吸遺伝子の双方の転写の低下、欠陥のある最大呼吸、及び、ミトコンドリア予備呼吸、及び細胞生物学的因子／ＡＴＰレベルの低下からなる。不健全なミトコンドリアとＥＲとの間の複雑なクロストークは、フィードバックループにおけるＥＲストレスへとさらにつながり、それによって、このメカニズムを悪化させ得る。全体として、ミスフォールドタンパク質の蓄積ならびに低用量のＥＤＣへ慢性曝露する際のＡＴＰレベルの低下は、内分泌細胞における代謝ストレスを誘導し、それにより、腸及び脳の神経ペプチドの異常な産生及び分泌が故に、内分泌調節に悪影響を与える。
実施例２２
バイオインフォマティクス
ＮＦκＢ−ｐ６５（ＲＥＬＡ）及びＴＰ５３の推定上のＤＮＡ結合部位のバイオインフォマティクス決定を図２０に示す。（ａ）ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、ＣＹＢ５Ａなどの関心のある遺伝子上の、ＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３結合モチーフの推定結合部位の数、及びＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＴＮＦ、ＩＬ６などのＮＦκＢ−ｐ６５（ＲＥＬＡ）によって調節される既知の各遺伝子、あるいは、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＰＥＲＰ、ＢＡＸなどのＴＰ５３によって調節される既知の各遺伝子の特定を示すチャート。（ｂ）関心のある遺伝子上のＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３のＤＮＡ結合モチーフの転写開始部位の上流の塩基対における最短距離の特定。ＨＯＸ遺伝子を、中性遺伝子、あるいは、文献であまり報告されていない、ＮＦκＢ−ｐ６５及びＴＰ５３のいずれかによって制御される遺伝子として用いた。ヌクレオチドの配列保存の配列ロゴグラフィカル表現として表したＤＮＡ結合モチーフ。そこではヌクレオチド文字の大きさが、バイオインフォマティクス分析で使用した（ｃ）ＮＦκＢ−ｐ６５及び（ｄ）ＴＰ５３についての配列でのその位置での当該文字の頻度を表す。
実施例２３
胃（前腸）マイクロ流体チップの開発
本実施例では、部分的に、試験薬剤及び薬剤の発生効果のためのヒトモデルとして使用する、前腸／胃チップを開発するための例示的な材料、細胞、及び、方法を記載する。他の実施形態において、前腸細胞由来の誘導胃細胞が、薬剤及び薬物を試験するために使用される。
したがって、内胚葉を前腸細胞へと分化させ、そこから胃細胞へとさらに分化させるために、本明細書において、胃細胞分化プロトコールを開発した。図２１は、チップで使用する細胞を誘導するための例示的な胃（前腸）最適化プロトコールを示す。内胚葉からの例示的な前胃−胃分化プロトコールの例示的な３Ｄオルガノイド成熟を示す概略的な時系列図。例えば、細胞は、ｉＦＧ−Ｏ＝ｉＰＳＣ由来の前腸オルガノイドであり、ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓ＝３４日目の解離したオルガノイドであり、ｉＦＧ−ＭＯ＝６日目のミニオルガノイドであり、Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別する６日目のミニオルガノイドである。
最初の最適化実験のために、３４日目のオルガノイドを解離して、チップで使用するために単細胞にした。しかしながら、解離は、細胞にとって厳しいものであり、発明者らは、チップで良好な細胞生存を得ることはできなかった。したがって、他の細胞を試験した。図２２は、ＩＣＣによるＤ３４ ｉＦＧ−Ｏの例示的な特徴付けを示す。チップに播種するために使用した細胞／組織の特徴付けのための免疫マーカーで染色した細胞及び組織の蛍光顕微鏡写真。マーカーの例として、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ２、Ｍｕｃ５ＡＣ、シナプトフィジン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、グレリン、ペプチドＹＹが挙げられる。これらの顕微鏡写真で染色された組織は、Ｄ３４を示しており、また、これらは、誘導したオルガノイドである。
したがって、別の実施形態において、本発明の開発の際に、６日目の細胞を、３４日間、３Ｄマトリゲルバブルにプレーティングして、前腸オルガノイドを得る。これらは、単層に解離され、そして、ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓとしてチップにプレーティングする。別の実施形態において、２Ｄ培養物のＤ６Ｏ（６日目のオルガノイド）を、さらなる時間をかけて、２０日目まで培養する。次いで、２０日目に、培養物を、上皮細胞、例えば、Ｅｐｉ−ｉＦＧについて２Ｄで流動選別する。別の実施形態において、ｉＦＧ−ＭＯを得るために、６日目の細胞を、６日間のミニオルガノイドとして直接播種する。図２３は、チップに前腸を播種するために使用される細胞のための例示的な全体計画を示す。アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下で胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を漸増する期間内でのｉＰＳＣの内胚葉誘導及び前腸分化と、それに続く３日目以降のＣＨＩＲ、ＦＧＦ４、ＬＤＮ、及び、ＲＡの添加を示す概略的時系列図である。ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓ＝３４日目の解離したオルガノイド。ｉＦＧ−ＭＯ＝６日目のミニオルガノイド。Ｅｐｉ−ｉＦＧ＝２０日目に選別する６日目のミニオルガノイドである。流動選別した上皮細胞を用いることは、チップ上の前腸の挙動を観察するためのより合理化した方法であると発明者らは考える。発明者らは、３Ｄ解離オルガノイド細胞を、ｉＦＧ−Ｏ−ｄｉｓｓと命名し、第６日目のミニオルガノイドを、ｉＦＧ−ＭＯと命名し、そして、選別した細胞を、Ｅｐｉ−ｉＦＧと命名した。
細胞型及びＥＣＭの最適化のために、６日目の全スフェロイドを、チップに播種するために用いた。幾つかのタイプの試験の後に、ＥＣＭコーティングのための最適ＥＣＭ条件、ラミニン：フィブロネクチン＝１：１を、前腸細胞を成長させるためのチップのために選択した。６日目のスフェロイドについて、適用した３０μｌの流速は、無流動チップと比較して、より多数のＳＹＰ陽性細胞を示した。
しかしながら、３０μ１の流動は、オルガノイドを過剰に成長させる原因となった。また、多数のＳｏｘ２＋細胞が存在しており、これは、細胞が、（発明者らは、成熟した細胞型を必要としているので）所望の成熟度ではなく、前駆細胞段階に止まっていたことを示す。
したがって、本実施例での追加の実験結果は、過度の細胞増殖を制御するために、流量を１０μｌにまで減らすことで、さらなる微調整とすることを示している。
図２４は、チップでの例示的な胃−視床下部の同時培養を示す。マイクロチップの一実施形態の概略図。このチップは、上部チャネルにｉＦＧ−ＭＯ細胞が、下部チャネルにｉＨＴＮがあることを示している。目標：視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）が存在を、チップで同時培養できるかどうかを試験する。方法：頂端チャネルにｉＦＧ−ＭＯ、及び、基底チャネルにｉＨＴＮを播種した。ｉＦＧ−ＭＯ（ｍｏ：ミニオルガノイド）を有する前腸の、誘導された視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）との同時培養。また、発明者らは、以前の一連の実験におけるｉＦＧ−ＭＯの過剰増殖のため、流速を、１０μｌ／時間にまで減速した。
図２５は、蛍光マーカーの例示的な共焦点顕微鏡画像を示す。チップの上部及び下部チャンネルにおいて、免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）チップの上部チャネル及び下部チャネルから発光する免疫蛍光を示す、すべての蛍光チャネル。Ｂ）頂端領域で観察されたＳｏｘ２蛍光。Ｃ）頂端領域で観察されたＥ−カドヘリン蛍光。Ｄ）基底領域で観察されたＴｕＪ１蛍光。流量（１０μｌ／時間）下での各チャネル及び領域（上部チャネル及び下部チャネルにおける例示的な細胞についての先の図面を参照されたい）におけるマーカーを示す画像。マーカーは非常に特異的であり、また、それぞれのチャネルにおいてのみ認められた。
本実施例は、無流動条件と流動条件（３０μｌ／時間の流量）とを比較する例示的なチップの構成を説明する。チップの構成：ｉＰＳＣ由来の胃オルガノイド、及び、ｉＦＧ−ＭＯを、頂端チャネルに播種した。機能的アッセイ及びイメージングのために基底チャンネルに細胞を播種しなかった。モニターされる条件として、ラミニン／フィブロネクチンに関する播種効率のための機能的アッセイ及びイメージング、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及び内分泌細胞、例えばシナプトフィジンなどの前腸マーカーのためのイメージングがあるが、これらに限定されない。
流動下でのｉＦＧ−ＭＯ増殖の結果。流動は、依然として、多くの細胞増殖をもたらした。成熟段階（Ｓｏｘ２＋）よりも多くの細胞が、前駆段階で維持された。無流動ｉＦＧ−ＭＯと比較してＳｏｘ２＋は少なく、連続的な上皮が認められない。流動下でのｉＨＴＮ成長の結果。細胞は、流動条件下では、形態学的に良好に見えなかった。比較的に正常な形態を示した無流動ｉＨＴＮと比較する。
図２６は、流動（３０μｌ／時間）下での２１日目のＩＦＧ−ＭＯの共焦点画像を示す。免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）ＤＰＡＩ及びＳＯＸ２で染色した前腸前駆細胞。Ｂ）ＳＹＰで染色した内分泌細胞。及びＣ）Ｅ−カドヘリンで染色した上皮。図２７は、頂端チャネルに播種したｉＦＧ−ＭＯである。流量（１０μｌ／時間）。免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。３０μｌ／時間の流速で増殖した細胞と比較して、Ａ）より少数のＳｏｘ２＋、及びＢ）より多数のＳＹＰ＋細胞。結果は、１０μｌ／時間の流動条件下の頂端チャネルでのｉＦＧ−ＭＯ細胞が、上皮被覆率が優れていることを示す（連続層の代わりに斑点状であるが、無流動比較チップと比べて、ＳＹＰ＋細胞がわずかに多く、そして、Ｓｏｘ２＋細胞が多くなる）。この流動条件下で増殖させた細胞は、無流動細胞と比較して、過剰な細胞増殖を示した。
したがって、依然として、前腸オルガノイドが所望した以上に過剰に成長したので、すなわち、余分なＳｏｘ２＋細胞の成長が認められたので、以下に、及び、本明細書に記載するように、さらなる実験を行った。
実施例２４
成熟した前腸細胞とホルモン作用
幾つかの実施形態において、成熟に対するＥＧＦレベルの変化の影響について成熟前腸細胞を試験したが、その理由の一部は、流動下のＳＹＰ＋細胞の数が比較的少ないためである。特に、１０μｌの流動（前出の実施例を参照されたい）とともに、ＥＧＦレベルは、１００ｎｇ／ｍｌから、当初は、２ｎｇ／ｍｌまで徐々に減少し、中間のある段階では、１０ｎｇ／ｍｌに減少した。図３０を参照されたい。部分的に、これが内分泌細胞種への成熟を、より良好にしたかを確認するために、これを行った。この条件は、実際に、流動条件下では、より少数のＳｏｘ２＋細胞と、より多数のＳＹＰ＋細胞を示した。しかし、発明者らは、上皮の完全な被覆を得ておらず、むしろ斑点状のものでしかなかった。
この時点で、６日目のオルガノイドの選別は、実験室で行った幾つかの実験に基づいて、良好な上皮を得るための重要なステップとなり、したがって、発明者らは、細胞クラスターを周囲の単層から効果的に分離して、プレーティングを行うために６日目のオルガノイドを取り出す効果的な方法であるように思われた選択試薬を試みた。
したがって、幾つかの実施形態において、６日目のオルガノイドの取り出しを簡素化した。チップ内の他の細胞型を少なくして、より多くの上皮を得るために、発明者らは、最適化、例えば、オルガノイドの選別ステップを、手動採取の代わりに選択試薬を使用するなど、変更を加えた。選択試薬を使用するこの試みにおいて、前腸細胞は、連続上皮を形成した。
例示的な選択試薬、例えば、神経ロゼットの選択的脱離のための、酵素を含まない試薬であるＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｒｏｓｅｔｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．カタログ＃０５８３２を、本明細書において使用した。
図２８は、例示的な前腸上皮の最適化を示す。前腸及びオルガノイドの成熟のための概略的な時系列図を伴う、マイクロチップの一実施形態の例示的な概略図である。目標：選択試薬を用いて、より良好でより合理的な６日目のオルガノイドの選別により、前腸上皮の形成を最適化する。方法：頂端チャネルが、選択試薬を用いてオルガノイドを選択することにより、ｉＦＧ−ＳＲを用いて播種される。１０μｌ／時間にまで減速した流量を維持した。分化及び成熟を促進するために、培地のＥＧＦ濃度を徐々に低くした。
図２９は、薬剤量の減量を示す例示的な実験時間図を示す。成熟剤、例えば、ＥＧＦの減量下でのｉＦＧ−ＳＲ細胞を示す概略的時系列図。
本実施例は、無流動条件と流動条件、例えば、流動運動下で増殖させたｉＦＧ−ＭＯ細胞に対して比較したｉＦＧ−ＳＲ細胞についての（流速１０μｌ／時間）とを比較する例示的なチップの設定を説明する。
チップの設定：ｉＰＳＣ由来の胃オルガノイド、ｉＦＧ−ＭＯまたはｉＦＧ−ＳＲ細胞を頂端チャネルに播種した。機能的アッセイ及びイメージングのために基底チャンネルに細胞を播種しなかった。モニターされる条件として、ＥＬＩＳＡを用いてホルモン分泌レベル（グレリン）を測定することに加えて、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及び、シナプトフィジンなどの前腸マーカー及び内分泌マーカーのための機能的アッセイ及びイメージングがあるが、これらに限定されない。
図３０は、チップに播種するために使用される組織の例示的な一般的特徴付けを示す。免疫蛍光マーカー、例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１７、シナプトフィジン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、グレリン、及び、ペプチドＹＹで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。９６ウェルプレートにて、ＩＣＣによるＤ２０ ｉＦＧ−ＳＲ細胞の特徴付け（２Ｄ ２０日目）。
図３１は、Ｅ−カドヘリンについて染色したｉＦＧ−ＳＲ及びｉＦＧ−ＭＯの比較タイルスキャン画像を示す。Ｅ−カドヘリンについての免疫蛍光マーカーで染色したチップでの細胞の例示的な免疫蛍光顕微鏡写真。Ａ）ｉＦＧ−ＳＲ及びＢ）ｉＦＧ−ＭＯ。１０μｌ／時間の流速。
図３２は、ＳＲと手で選別したＤ６オルガノイド（Ｏ）を比較するＥＬＩＳＡアッセイによる例示的なグレリン分泌を示す。チップ培養の１５〜２２日目及び２３〜３０日目のグレリン分泌（ｐｇ／ｍｇ細胞タンパク質）について、ｉＦＧ−ＳＲ（青棒）、及び、ｉＦＧ−ＭＯ（赤棒）の幾つかの例示的な培養物を比較した。
選択試薬を使用するこの試みにおいて、ｉＦＧ−ＳＲは、連続上皮を形成した。ｉＦＧ−ＳＲ流動条件は、ｉＦＧ−ＭＯ（流動）及びｉＦＧ−ＳＲ（流動運動無し）と比較して、多くのＳＹＰ＋細胞を示した。また、発明者らは、これらの胃細胞により分泌されたグレリンの検出可能なレベルを観察したが、これは流動成長条件下で経時的に増加した。
実施例２５
ホルモン効果とがん
発明者らは、発明者らのオルガノイド（Ｏ）の分泌能を比較するための陽性対照として、ヒト胃癌細胞株を使用した。発明者らは、染色（ＳＹＰ）及びＥＬＩＳＡ（グレリン）の双方で認められた内分泌細胞を得た。発明者らは、ＥＧＦレベルを制御することによって、増殖を制御することができた。また、発明者らは、ＥＧＦレベルを制御することによって、内分泌細胞の成熟を増加させることもできた。ｉＦＧ−ＳＲのグレリン分泌レベルは、ＨＧＣ分泌レベルに匹敵することが観察された。
本実施例は、例示的なチップの設定と、無流動条件と流動条件との間の比較、例えば、ｉＦＧ−ＳＲ細胞とＨＧＣ細胞との比較（流速＝１０μｌ／時間）を説明する。
ｉＦＧ−ＳＲ細胞の場合、成長条件として、以下を含んだ。１日目、ｉＦＧ−ＳＲの播種。３日目、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで、１０μｌ／時間を使用して、チップにて流動運動を開始する。第１１日目：ＥＧＦを、１０ｎｇ／ｍｌに減らす。１４日目、ＥＧＦを２ｎｇ／ｍｌにまで、さらに減らす。２１日目、実験を止める。
ＨＧＣの場合、成長条件として、以下を含んだ。１日目、ＨＧＣの播種。３日目、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで、１０μｌ／時間で、チップにて流動運動を開始する。２１日目：実験を止める。
チップの設定：ｉＦＧ−ＳＲまたはＨＧＣを、頂端チャネルに播種した。機能的アッセイ及びイメージングのために基底チャンネルに細胞を播種しなかった。モニターされる条件として、ＥＬＩＳＡを用いてホルモン分泌レベル（グレリン）を測定することに加えて、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及びシナプトフィジン（ＳＹＮ）などの前腸マーカー及び内分泌マーカーのための機能的アッセイ及びイメージングが含まれたが、これらに限定されない。図３３は、マイクロチップの一実施形態の例示的な概略図を、選択試薬及び減量したＥＧＦを含む前腸及びオルガノイド成熟の概略時系列図とともに示す。この例示的実験において、培養の設定方法が、本明細書に記載する前腸系と陽性対照（ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌株）との比較について記載される。目標：ｉＦＧ−ＳＲとヒト胃癌（ＨＧＣ）（ＮＣＩ−Ｎ８７−上皮）株とを比較すること。方法：頂端チャネルにｉＦＧ−ＳＲまたはＨＧＣを播種する。減らした流量を、１０μｌ／時間に維持する。チップ上の２つの細胞型を、ＩＣＣとグレリン分泌物とで比較する。ＨＧＣ系は、最適な増殖培地で維持され、実験を通して変化はない。
この時点で、６日目のオルガノイドの選別は、実験室で行われた幾つかの実験に基づいて良好な上皮を得るための重要なステップとなり、したがって、発明者らは、細胞クラスターを周囲の単層から効果的に分離し、プレーティングを行うために６日目のオルガノイドを採取する効果的な方法であると考えられた選択試薬を試みた。本明細書及び上を参照されたい。
図３４は、Ａ）ＨＧＣとＢ）ｉＦＧ−ＳＲ細胞との間のＳＯＸ２、ＳＹＰ、及び、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）の免疫蛍光染色を比較する細胞層の顕微鏡写真として、ＨＧＣ及びｉＦＧ−ＳＲチップに関する例示的な流動条件効果を示す。図３５は、チップでの流動条件有り及び無しで成長するｉＲＧ−ＳＲ及びＨＧＣを比較する細胞層の例示的な比較顕微鏡写真として、ＨＧＣ及びｉＦＧ−ＳＲ細胞層の比較タイルスキャンを示す。流れは、ｉＦＧ−ＳＲではより良好に作用したが、ＨＧＣではそうではなかった。ｉＦＧ−ＳＲ上皮は、流動運動下よりも、無流動の条件下で良好であると認められた。
図３６は、ｉＦＧ−ＳＲチップにおける流動運動でのグレリン分泌の例示的な安定増加を、無流動チップにおけるｉＦＧ−ＳＲ細胞からの少量の分泌と比較して示す。
したがって、発明者らは、ＩＣＣ（ＳＹＰ）及びＥＬＩＳＡ（グレリン）の双方によって認められるように内分泌細胞を得た。発明者らは、ＥＧＦレベルを制御することによって、増殖を制御することができた。さらに、発明者らは、ＥＧＦレベルを制御することによって、内分泌細胞の成熟を増加させることもできた。
実施例２６
例示的実験フローチャート及び設定
本実施例は、例示的なチップの設定と、無流動条件下と流動条件下例えば、（１０μｌ／時間の流速）との間の比較を説明する。チップの設定：ｉＰＳＣ由来の胃オルガノイド及びｉＦＧ−ＭＯを、頂端チャネルに播種した。機能的アッセイ及びイメージングのために、基底チャネルにｉＨＴＮを播種した。モニターされる条件として、チップにおけるｉＨＴＮの成長、ならびにＳｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及びＴｕＪ１などの前腸マーカー及び神経マーカーのためのイメージングがあるが、これらに限定されない。図３７、例示的な実験フローチャート及び設定、を参照されたい。例示的なチップ、実験条件、及びアッセイの例を示す概略的な時系列図。ｉＰＳＣ由来胃オルガノイド及びｉＦＧ−ＭＯを、頂端チャネルに播種した。ｉＨＴＮを、機能的アッセイ、及び、イメージングのために基底チャネルに播種した。チップにおけるｉＨＴＮの成長、ならびにＳｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、及びＴｕＪ１などの前腸マーカー及び神経マーカーのイメージング。無流動及び流動（１０μｌ／時間の流量）条件で、２連で培養した。
実施例２７
リンパ芽球細胞株の一般的なｉＰＳＣリプログラミングプロトコール
疾患モデリングは、患者に特異的な幹細胞を使用して疾患の特徴を再現し、発生の特徴を観察し得るので、大きな利益を得ることができる。ｉＰＳＣ生成のための重要な資源として、世界中に様々な保存施設が存在しているリンパ芽球細胞株がある。これらの供給源からリプログラミングのために改良がされた方法は、最初に、プラスミドの組み合わせを用いた標的宿主細胞の核形成、それに続く２日間のインキュベーション、３〜５日目に、毎日、リプログラミング培地（古い培地は吸引しない）の添加、６日目に、リプログラミング培地の（吸引による）交換、７日目〜９日目の各日に、毎日、リプログラミング培地の（古い培地は吸引しない）添加、１０日目に、リプログラミング培地の（吸引による）交換、１０日目〜１６日目の隔日での、リプログラミング培地の（古い培地は吸引しない）添加として記載することができる。早ければ１１日目にも小さなコロニーが出現し、１７日目までには、相当数のコロニーが視認できるようになる。漸進的に増量する無血清完全培地、ｍＴｅＳＲ１、への培地交換は、１８〜２０日目に行われる。２４日目までに、リプログラムされたコロニーは容易に明らとなり、確認のための生存細胞イメージングのために抗体染色し得る。２５〜２９日目を通して、追加のコロニーを、サブクローニングのために単離し得る。３０日目までに、先に単離したコロニーが付着し始め、正常なｉＰＳＣ形態を示し、及び、保存するか、または、連続して細胞株として継代することができる。記載した技術を用いて、本発明者らは、少なくとも１０％の変換効率を達成することができ、このことは、既存のリプログラミング研究と比較して、少なくとも３〜８倍の改善を示す。さらなる詳細は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４５３２を参照されたい。当該出願は、本明細書にその全内容を参照することにより援用する
実施例２８
ｉＰＳＣからの三次元腸オルガノイド及び腸管上皮細胞
胚体内胚葉の形成を誘導するために、すべてのｉＰＳＣを、高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、ＦＢＳの濃度を経時的に高めながら（１日目、２日目、及び、３日目に、それぞれ、０％、０．２％、及び、２％で）培養をした。内胚葉分化の初日に、Ｗｎｔ３Ａ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）も加えた。後腸形成を誘導するために、細胞を、Ｗｎｔ３Ａ及びＦＧＦ４（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と併せて、２％ＦＢＳを含む改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養をした。３〜４日後、浮遊性の上皮スフィア、及び、緩やかに付着した上皮チューブが見えてくるようになり、そして、回収を行った。その後、これらの上皮構造を、Ｒ−スポンジン−１、ノギン、ＥＧＦ（それぞれ、５００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、及び、１００ｎｇ／ｍｌ、すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するマトリゲルに懸濁し、次に、Ｒ−スポンジン−１、ノギン、ＥＧＦ（それぞれ、５００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、及び、１００ｎｇ／ｍｌ、すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び、Ｂ２７（１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する腸用培地に重層した。その後、オルガノイドを、７〜１０日ごとに継代した。
実施例２９
腸管上皮細胞のマイクロ流体装置への播種
腸管上皮細胞をマイクロ流体装置に播種するために、ＨＩＯをまず解離させ、次に、蛍光活性化細胞選別を用いて腸管上皮細胞を得た。選別の２４時間前に、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を、ＨＩＯ培養培地に添加した。その翌日に、ＨＩＯをマトリゲルから除去し、続いて、オルガノイドが、単細胞懸濁液に完全に解離するまで、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、２０〜４０分間、インキュベートした。次いで、これらの細胞を、３０マイクロメートルのフィルターに通し、そして、ＣＤ３２６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、３０分間、染色した。次いで、細胞をＣＤ３２６について、陽性選別をした。細胞を回収し、そして、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＢ２０２１９０（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、及び、Ａ８３−０１（５００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を含有する腸の培地で、５×１０６／ｍｌの密度に再懸濁した。死滅した／付着していない細胞を、３〜６時間後に、装置に通して培地を洗い流すことで除去し、及び、流動を、８〜２４時間後に、６０μｌ／時間の速度で開始した。
実施例３０
腸管上皮細胞のマイクロ流体装置への播種
ｉＰＳＣ由来の腸管上皮を、マイクロ流体装置に播種し、続いて、腸管上皮サブタイプの特徴付けを行う。経上皮抵抗性及びデキストランＦＩＴＣ流出による透過性の検査を含む機能的アッセイは、基礎的条件下、または、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）及び／または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）などの炎症性サイトカインへの応答のいずれかで評価する。また、様々な腸管上皮サブタイプを調節し得る薬物候補を調べて、そのようなサブタイプが、実際に調節され得るかどうかを評価する。このようなアッセイを確立した後、遺伝的に定義された炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者由来のＩＰＳＣが生成され、腸オルガノイドに分化させ、解離し、その後にマイクロ流体装置に播種され、ＩＢＤに関連する遺伝的変異の機能的結果を評価する。
実施例３１
肥満モデル
本実施例（及び、次の実施例）は、肥満モデルに関連する細胞に関する。非統合ｉＰＳＣ株は、正常肥満度指数（ＢＭＩ＜２５）、及び、ＢＭＩ＞５０の超肥満（ＳＯ）を示す個体から生成した。内分泌組織−胃腸（ＧＩ）オルガノイド及び視床下部（ＨＴ）ニューロペプチダーゼニューロンへのｉＰＳＣ再分化の実現可能性を示した。ｉＰＳＣ−内分泌細胞から、異なる基準の全細胞プロテオームプロファイルを生成した。ｉＰＳＣの胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）への分化は、「臓器チップ」マイクロ流体装置に細胞を播種する前に行った。使用を企図する例示的なマイクロ流体装置を図３８に示し、チップでｉＧＩＯ及びｉＨＴＮを使用する例示的な結果を図３９に示す。
実施例３２
ＥＤＣを用いたマイクロ流体「臓器チップ」装置の慢性低用量処置
発明者らは、内分泌攪乱化学物質（ＥＤＣ）に対する慢性の低用量曝露は、初期のヒト内分泌組織発生期間において有害であり、その結果、永続的なミトコンドリア機能障害を伴った過反応性のＮＦ−κＢ及びＨＭＧタンパク質前炎症性シグナル伝達をもたらすとの仮説をたてた。このことを試験するために、「臓器チップ」マイクロ流体装置（実施例３１）に播種した胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）及び視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）を、ＥＤＣ汚染物質／混合物（トリブチルスズ（ＴＢＴ）、パーフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、及び、ビス（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）の慢性低用量処置（ＴＤＩ範囲））に曝露する。調節不全分泌タンパク質群を、定量的プロテオミクスによって特定する。
実施例３３
単細胞懸濁液が播種されたマイクロ流体「臓器チップ」装置
一実施形態において、ｉＰＳＣは、ＨＩＯを形成するように指示され、続いて、単細胞懸濁液に解離された。次いで、これらの細胞を、多孔質可撓性膜によって分離された２つのチャンバからなる、小型マイクロ流体装置（ＳＭＤ）に播種した。図４０を、参照されたい。
これらの構造でのパネート細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、及び、腸細胞の存在は、免疫細胞化学によって確認され、一方で、インサイチュハイブリダイゼーションは、ｌｇｒ５＋細胞の存在を明らかにした。
パネート細胞からの抗菌剤の分泌は、ＥＬＩＳＡによって検出され、ＩＦＮγの下部チャンネルへの投与は、ＳＴＡＴ１のリン酸化と、ＩＦＮγ応答遺伝子の有意なアップレギュレーションとをもたらし、当該ＩＦＮγ応答遺伝子として、ＩＤＯ１、ＧＢＰ４、及び／または、ＧＢＰ５が挙げられるが、これらに限定されない。興味深いことに、腸管上皮サブタイプに特異的な２つの遺伝子であるホスホリパーゼＡ２グループ２Ａ及びＭｕｃ４もまた、アップレギュレートされた。Ｃａｃｏ２細胞と比較して、これらの上皮サブタイプに関連する遺伝子の対応するアップレギュレーションは存在しなかった。
実施例３４
トランスウェル培養装置と比較したマイクロ流体「臓器チップ」装置
ｉＧＩＯ及びｉＨＴＮを、ダイナミックフローマイクロ流体装置、図３８Ａ、及び、静的トランスウェル装置、図３８Ｂの双方に播種した。例示的な図３８は、ダイナミックフロー臓器チップ（ダイナミックフローＯｏＣ）、及び、静的トランスウェル培養として、ｉＧＩＯ（頂端）、及び、ｉＨＴＮ（基底）のＥＤＣ撹乱のための例示的な播種を示している。これらのシステムは、例示的化合物も用いて（＋／−（対照））を試験し、当該化合物として、ＴＮＦ−αやＥＤＣが含まれるが、これらに限定されない。ダイナミックフローＯｏＣ：ＰＤＭＳ膜は、７μｍの孔を有する。頂端チャネルの高さは、１ｍｍであり、基底チャネルの高さは、０．２ｍｍである。
媒体の流れの違いに加えて、これらの装置は、細胞の向きが逆になっている。例えば、フローマイクロ流体装置においてｉＧＩＯ及びｉＨＴＮ細胞は、化合物を試験するために使用される培養装置において、それぞれ、頂端及び基底である。しかしながら、静的なトランスウェルでは、これらの細胞は、逆に、ｉＧＩＯ（基底）及びｉＨＴＮ（頂端）となっている。
図３８：「臓器チップ」マイクロ流体装置の一実施形態。ｉＰＳＣから分化した胃腸オルガノイド（ｉＧＩＯ）、及び、視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）の静的トランスウェル培養と、「臓器チップ」マイクロ流体装置の流動条件下での培養との間の違いを例示する模式図。
図３９：前図の「臓器チップ」マイクロ流体装置を使用する例示的な結果。ｉＧＩＯ及びｉＨＴＮの臓器チップモデルを用いて、細胞の免疫染色の例示的な実験結果を提供する。Ａ）は、頂端（赤）チャネルと基底（青）チャネルを有するチップを示す。Ｂ）は、頂端チャネルで分化したｉＧＩＯの顕微鏡写真を示す。Ｃ）は、Ｅ−カドヘリン＋（白）とＳｏｘ２＋前腸前駆細胞（緑）であるチップでのＧＩ上皮を示す。Ｄ）は、Ｅ−カドヘリン＋（白）、及び、シナプトフィジン＋（ＳＹＮ）内分泌細胞（赤）を示すチップでのｉＧＩＯを示す。Ｅ）は、基底チャンネル（オレンジ色のＴｕＪ１＋）においてｉＨＴＮを播種されたチップの共焦点３Ｄ画像であり、一方で、Ｆ及びＧは、（それぞれ）頂端チャネルにおける、Ｓｏｘ２＋前腸、及び、Ｅ−カドヘリン＋上皮を示す。白の矢印は多孔質膜を指し、＊は、Ｅ−Ｆでの神経細胞に囲まれたルーメンを示す。
図４０は、多孔質膜によって分離された上部及び下部チャンバを示す小型マイクロ流体装置の一実施形態の例示的概略図を示す。矢印は、上部（青）及び下部（赤）の双方のチャネルにおける媒体の連続的な流れを表す。真空チャンバは、チャネル領域の両側の外側に配置される。
実施例３５
マイクロ流体培養における上皮細胞
ＩＰＳＣ由来のヒト腸管上皮細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで処置をした。ＩＦＮγの基礎投与は、ＩＰＳＣ由来のヒト腸管上皮細胞における経上皮抵抗性の低下と、デキストランＦＩＴＣの流出の増加とをもたらす。基本的に、このことは、このサイトカインに応答して腸管上皮がより透過性であることを意味している。ＴＮＦαの添加は、腸の透過性に変化を誘発しない。
ＩＦＮγ処置は、図４３Ａのグラフに示されるように、経時的に経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の喪失をもたらした。対照（未処置）及びＴＮＦα処置細胞は、対照に匹敵して時間の経過とともにＴＥＥＲの増加を示した（図４３Ａ）。ｎ＝４。同様に、ＦＩＴＣデキストリンが頂端チャネルに添加された場合、ＩＮＦγ処置は、浸透率係数（図４３Ｂ）及び、基底層における蓄積を増加させた（図４３Ｃ）。ＴＮＦα処置細胞及び対照細胞は、ＦＩＴＣデキストランの同等の見かけの透過係数及び基底での蓄積を示した。
図４３：マイクロ流体チップでのＩＰＳＣに由来するヒト腸管上皮細胞に対するＩＦＮγ効果を実証する例示的なグラフを示す。グラフは、電気抵抗（ＴＥＥＲ）の喪失、及びＩＦＮγで処置した上皮細胞間の接続の喪失を示す。Ａ）ＴＥＥＲは、ＩＦＮγ処置で経時的に減少したが、対照及びＴＮＦαで処置した細胞では、増加したＴＥＥＲを示した。Ｂ）ＦＩＴＣデキストリンを頂端チャネルに添加すると、透過係数と同様の損失を示し、Ｃ）ＩＦＮγで処置した細胞の基底層のＦＩＴＣデキストリンの量が（頂端層への添加後に）増加した。
実施例３６
マイクロ流体「臓器チップ」装置における使用のために開発された三次元オルガノイドシステム
発明者らは、例えば、図４１に示すように、腸内で一般的に認められる全ての細胞型を有する腸オルガノイドを成長させた。例として、個々の細胞を、図４２Ａ〜Ｄの顕微鏡写真に蛍光染色して示している。これらは、栄養吸収に関与する腸細胞、粘液産生に関与する杯細胞、抗菌剤産生に関与するパネート細胞、及び、ホルモン産生に関与する腸内分泌細胞を含む。
さらに、三次元オルガノイド系の増殖は、宿主側でのサイトカインの分析、上皮サブタイプの分析、透過性、ペプチドの頂端投与、細菌相互作用、及び免疫細胞との同時培養における使用を企図する。
図４２は、蛍光染色した腸オルガノイド細胞の顕微鏡写真を示す。Ａ）腸細胞、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）及び脂肪酸結合タンパク質２（ＦＡＢＰ２）で染色した組織。Ｂ）杯細胞、ＣＤＸ２及びムチン２（ＭＵＣ２）で染色した組織。Ｃ）パネート細胞、ＣＤＸ２及びリゾチームで染色した組織、及び、Ｄ）腸内分泌細胞、一般的には分泌小胞に位置する、ＣＤＸ２及びクロマトグラニンＡ（副甲状腺分泌タンパク質１）で染色した組織。
実施例３７
マイクロ流体「臓器チップ」装置
例示的な概略図及びマイクロ流体チップで増殖する細胞を、図４４Ａ〜Ｅに示す。Ａ）チップの概略図を示す。Ｂ及びＣ）は、「腸管チップ」の部分及びサイズを識別するオーバレイの写真を示す。Ｃ）は、さらに、膜の顕微鏡写真を示す。Ｄ）は、機械的歪みを持たないチップ、及び、機械的歪みを有するチップの、それぞれの表記の下に結果として生じる細胞の顕微鏡写真を伴った概略図を示す。及びＥ）は、印加圧力（ｋＰａ）に対する、基板の歪み（％）と細胞の歪み（％）とのグラフを示す。
播種されたチャネルの例を、蛍光的に染色して、細胞を示した。染色の例を、図４５Ａ）ＤＡＰＩ（核）、図４５Ｂ）Ｅ−カドヘリンに示しており、図４５Ｃ）では２つの蛍光チャネルの重複を示す。
培地流動が有る、及び、無い培養での細胞の比較は、流動の条件が、流動無しで増殖した細胞とは異なり、細胞の連続的な被覆を生じることを示している。図４６は、静的条件下で６日間培養した細胞を示し、図４７は、６日間流動条件下で培養した細胞を示す。
図４４は、例示的な「腸管チップ」技術を示す。Ａ）は、チップの概略図を示す。Ｂ及びＣ）は、「腸管チップ」の部分及び大きさを識別するオーバレイを有する写真を示す。Ｃ）は、さらに、膜の顕微鏡写真を示す。Ｄ）は、機械的歪みを持たないチップ、及び、機械的歪みを有するチップの、それぞれの表記の下に結果として生じる細胞の顕微鏡写真を伴なった概略図を示す。及びＥ）は、印加圧力（ｋＰａ）に対する、基板の歪み（％）と細胞の歪み（％）とのグラフを示す。
図４５は、「腸管チップ」のチャネルにおいて増殖する上皮細胞を示す。播種されたチャネルの例は、Ａ）ＤＡＰＩ（４‘、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＤＮＡのＡＴリッチ領域に対して強力に結合する蛍光染色剤）（核）、Ｂ）Ｅ−カドヘリンで蛍光染色したものであり、Ｃ）に２つの蛍光チャネルの重複を示す。
図４６は、マイクロ流体チップにおいて、６日間、静的条件下で培養した例示的な細胞を示す。細胞は、連続層を形成しない。
図４７は、マイクロ流体チップにおいて、６日間、流動条件下で培養した例示的な細胞を示す。細胞は、連続層を形成する。
実施例３８
Ｃａｃｏ−２上皮細胞は、マイクロ流体「臓器チップ」装置で増殖した場合、腸管様組織とは異なる。
チップで成長したＣａｃｏ−２上皮細胞は、チップで成長した腸管様組織が示すのと同じＩＦＮγに対する応答を示さない。実際、ＩＦＮγで処置した腸管様組織細胞と、ＩＦＮγを有する及びＩＦＮγを有さないＣａｃｏ−２上皮細胞との相対発現を比較するマーカーのパネルは、試験した各遺伝子マーカーに対して異なる応答を示した。図４８は、ＩＦＮγ処置をした、及びＩＦＮγ処置をしないグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）に対して正規化した遺伝子マーカーの相対的な例示的発現のグラフを示す。Ａ）ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１）。Ｂ）ＧＢＰ１（グアニル酸結合タンパク質１）。Ｃ）ＧＢＰ４（グアニル酸結合タンパク質４）。Ｄ）ＬＹＺ（リゾチーム）。Ｅ）ＰＬＡ２Ｇ２Ａ（ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＡ）。Ｆ）分泌された抗菌レクチン（ＲｅｇＩＩＩγ）。Ｇ）ＬＲＧ５（Ｇタンパク質結合受容体５を含むロイシンリッチリピート）。Ｈ）ＯＬＭ４（オルファクトメディン４）。及びＩ）ＭＵＣ４（ムチン４）。
さらに、図４８Ｃに示すように、ＩＦＮγを有する、及びＩＦＮγを有さないマイクロ流体腸管チップ細胞は、Ｃａｃｏ２細胞でのＩＦＮγ処置の有無にかかわらず、抗菌性に優れたレクチン（ＲｅｇＩＩＩγ）を示す。
実施例３９
マイクロ流体「臓器チップ」装置における分極した腸の絨毛様構造の自発的形成
ヒト腸オルガノイド由来の腸管上皮細胞を、本明細書に記載するようにマイクロ流体チップで増殖させた。チップに播種してから１２日後、細胞は、チップの上部チャネル端部の屈曲部を越えて延在する連続層とコンフルエントになった。図４９を、参照されたい。
次いで、同様の平面における生検切断での組織学的断面図と同様に、チップ及び細胞を端部から見た図５０の赤線で表されるように、チップ装置を断面で切断した。チップを通る切断軸の光学顕微鏡写真は、チップの上部チャネルの膜上で成長する微絨毛様構造を有する腸細胞を示す。参考のため、膜、下部チャネル、及び、真空チャンバを、図５１に示す。
細胞型の同定のために、図５０における赤線で示したように、細胞をマーカーで蛍光染色し、そして、断面に視覚化した。
驚くべきことに、上部チャネルと下部チャネルの双方において培地の連続的な流動下で増殖した細胞は、インビボで認められるものと類似する分極した腸の絨毛様構造（例えば、細胞の頂端及び基底領域）の自発的形成をもたらした。
図５２は、小型マイクロ流体装置の上部及び下部チャンバにおける媒体の連続的な流れに応答して、絨毛様構造を形成するヒト腸オルガノイドに由来する上皮細胞を示す例示的な顕微鏡写真を示す。
細胞をさらに特定するために、横断面の免疫蛍光染色を行った。横断面の二重免疫蛍光染色は、尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）（赤）及びＥ−カドヘリン（青色）を示す。一般的に核において認められる腸遺伝子発現のタンパク質レギュレーターである尾状型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、及び隣接する上皮細胞に付随する付着接合部の主要成分であるＥ−カドヘリンタンパク質に加えて、腸マーカーのための染色として、腸細胞で認められる細胞質脂肪酸トランスポーター遺伝子である腸タイプ脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ２）、及び、細胞間密着結合の細胞質膜表面に位置するタンパク質である密着帯１（別名、密着結合タンパク質１（ＴＪＰ１））が含まれた。三重免疫蛍光染色は、ＦＡＢＰ２（緑）と比較して、ＣＤＸ２（赤）、及び、Ｅ−カドヘリン（青）の存在を示す、図５３、棒線＝１００ミクロン。他の三重免疫蛍光染色は、ＺＯ−１（緑）と比較して、ＣＤＸ２（赤）、及び、Ｅ−カドヘリン（青）の存在を示す、図５４。
したがって、ヒト腸管様組織からマイクロ流体チップにおいて流れ下で成長した腸細胞は、ヒト腸組織を模倣する腸の三次元構造を示す。一部では、ＣＤＸ２で染色した核が、微小絨毛様構造に折り畳まれた上皮細胞の層を示唆する微小絨毛が観察される。
ヒトの腸管上皮細胞と同様に、これらの細胞は、細胞外頂端領域と基底領域との間にバリアを形成する細胞外付着物を有するという特徴を示す。例えば、２つの細胞の境界は、一般的には、各細胞の全周囲に融合されることがよくあり、密着結合または密着帯（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）（ｚｏｎｕｌａとは、帯を意味するラテン語である）として知られる接合部のような連続帯を形成する。他のタイプの接合部として、付着接合部がある。ＺＯ−１に加えて、Ｅ−カドヘリンの存在と、バリア機能を表すＴＥＥＲ値を示している生理学的データは、流体マイクロチップで成長した腸細胞が、ヒト腸内層をモデル化する、という観察を裏付けている。
実施例４０
マイクロ流体チップの細胞播種密度
本実施例は、腸内腸管様組織の単細胞懸濁液中の異なる量の細胞を使用するチップの播種の例示的な結果を示す。少なくとも５つの異なるチップに、４０μｌの液体あたり様々な細胞の量を播種した。インキュベーションの６日目である図５５D及びEは、濃度３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）、及び、Ｅ）２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）を播種したマイクロ流体チップで増殖した腸細胞の画像であり、インキュベーションの７日目である図５６Cでは、十分な細胞を播種しなかった。また、マイクロ流体チップの膜の頂部で成長する細胞の高拡大画像も、これらの細胞数で、コンフルエントな被覆率に至らないことを裏付けた。例えば、図５６は、３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）が、コンフルエントな被覆率を提供するには不十分であることを示している。赤で示した例示的な被覆されていない領域を参照されたい。図５７は、２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）が、コンフルエントな被覆率を提供するには不十分であることを示している、赤で示した幾つかの例示的な被覆されていない領域を参照されたい。対照的に、７．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに３００Ｋ）、６．２５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２５０Ｋ）、５．０×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２００Ｋ）は、コンフルエントな細胞の層を提供するのに十分な細胞であった。
細胞の量は、７．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに３００Ｋ）〜２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）の範囲であった。図５５Ａ〜Ｃを参照されたい。コンフルエントな被覆率は、種々の細胞から、チップあたりで、少なくとも３００Ｋ〜少なくとも２００Ｋ弱、及び、少なくとも１５０Ｋ超で得た。１５０Ｋ〜１００Ｋの範囲では、非コンフルエントな被覆率が観察された。図５５Ｄ及び５５Ｅでの非コンフルエントな被覆率についての赤丸の領域を参照されたい。
一実施形態において、本明細書に開示するマイクロ流体チップは、播種されたチャネルのコンフルエントな被覆率を提供するために、単細胞懸濁液として、チャネルあたり特定された数の腸内細胞を播種する。一実施形態において、腸管様組織細胞の単細胞懸濁液は、チップあたりで、１５０Ｋ超〜３００Ｋ以上の範囲である。
図５５は、チップに播種した後に撮影した例示的画像を示す。Ａ）７．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに３００Ｋ）。Ｂ）６．２５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２５０Ｋ）。Ｃ）５．０×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに２００Ｋ）、Ｄ）３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）。及び、Ｅ）２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）。
図５６は、チップに播種した後の非コンフルエント領域の例示的な拡大画像を示す。３．７５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１５０Ｋ）を播種した腸管様組織細胞（図５５Ｄと比較）。赤い円は、非コンフルエントな領域の輪郭を示す。
図５７は、前の画像よりも少ない細胞をチップに播種した後の非コンフルエント領域の例示的な拡大画像を示す。腸管様組織細胞を、２．５×１０６細胞／ｍｌ（４０μｌに１００Ｋ）で播種した（図５５Ｅと比較）。赤い円は、非コンフルエントな領域の輪郭を示す。
実施例４１
マイクロ流体腸オルガノイドチップの頂端及び基底チャネルに使用するための培地製剤を特定する。
チップに播種するために使用する前のオルガノイドの最適な培養時間、例えば、チップに播種するオルガノイドの齢を特定し、上部チャネルのオルガノイド単細胞懸濁播種密度の範囲を確立し、３０μｌ／時間の流速（両方のチャネルにおける）が、絨毛様構造の自発的形成を誘導することを発見した後に、マイクロ流体チップの上部チャネルの生存可能な細胞被覆率をもたらす培地処方を特定するために培地組成を試験した。一部には、所望の細胞増殖及び特徴付けのために、増殖因子を含有する培地が、上部及び下部の双方のチャネルに必要であるかどうかを評価することが一つの目標であった。例示的な培地処方物を、本実施例において後述する。
完全培地での腸オルガノイド細胞の単細胞懸濁液を、マイクロチップの頂端チャネルに播種し、次いで、３７℃で、４時間、インキュベートして、その後３０μｌ／時間の流速を、本明細書に記載され、図５８の例示的な概略的実験デザインに示した培地と一緒に、上部頂端チャネル及び下部基底チャネルに適用した。少なくとも４つの組み合わせで、少なくとも２つのタイプの培地を、上部頂端（Ａ）チャネル及び下部基底（Ｂ）チャネルで試験した。完全（Ａ）／完全（Ｂ）。ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｃ）完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。Ｄ）ＧＦＲ（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。
例示的な完全（完全）培地。改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコの改変イーグル培地／ハムのＦ−１２）、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（抗生物質）（１Ｘ）、ＣＨＩＲ９９０２１（アミノピリミジン誘導体、別名、６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ］エチルアミノ］ピリジン−３−カルボニトリル）（２ｍＭ）、ノギン（糖タンパク質、ヒト組換え体）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（表皮成長因子、ヒト組換え体）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及び、Ｂ２７（無血清サプリメント）（１Ｘ）。
例示的な増殖因子減量（ＧＦＲ）培地。増殖因子減量培地とは、以下のものである。改良ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（１Ｘ）及びＢ２７（無血清サプリメント）（１Ｘ）。
図５９Ｃに示すように、培養の６日目に、完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）で増殖させた場合に、腸細胞の島が、コンフルエント層を形成しないことが観察され、図５９ＤのＧＦＲ（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）では、膜の被覆率がさらに小さくなっていた。これに対し、図５９Ａ及び５９Ｂに示すように、膜を覆う細胞のコンフルエントな被覆率が、完全（Ａ）／完全（Ｂ）、ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）、それぞれを用いて得られる。培養日の延長と比較して、完全（Ａ）／完全（Ｂ）及びＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）の双方の使用は、図６０Ａ及び６０Ｂそれぞれのように、膜の完全な被覆率を達成した一方で、図６０Ｃの完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）で示したチップは、膜の不完全な被覆率を有する腸の島を引き続き示している。完全（Ａ）／完全（Ｂ）とＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）との直接比較は、６日目及び７日目に、双方ともに、コンフルエントな被覆率と絨毯様構造を示したが、絨毛様構造の密度は、図５９Ａ対図５９Ｂ、及び、図６０Ａ対図６０Ｂの双方において、ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）と比較して、完全（Ａ）／完全（Ｂ）でより高い密度が認められた。
この成長の差異は、図６１に示された画像のために使用した成長条件下でより顕著であり、図６１Ａにおける完全（Ａ）／完全（Ｂ）の使用は、図６１Ｂにおいて示すＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）の使用より明らかに優れている。したがって、双方のチャネルにおける増殖因子の全セットを含む完全培地は、本発明のマイクロ流体チップにおいて使用される腸内腸管様組織細胞の優れた成長及び維持をもたらす。
したがって、一実施形態において、マイクロ流体チップの上部（頂端）及び下部（基底）チャネルの双方に使用される完全培地を、本明細書において開示する。完全培地の使用は、コンフルエントな被覆率と、上部チャネルの膜の頂端表面を覆う絨毛様構造とを提供するオルガノイド細胞の成長をもたらす。
図５８は、細胞増殖に関する培地試験のための例示的な概略の実験計画を示す。一部において、この計画は、完全な増殖因子を含む培地が、マイクロ流体チップにおいて腸内腸管様組織細胞を増殖させるために上部頂端（Ａ）及び下部基底（Ｂ）の双方のチャネルにおいて使用されるべきかどうか、を決定するためのものである。
図５９は、上部（頂端）及び下部（基底）チャネルにおける培地処方を比較する、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な６日目の拡大画像を示す。培地の比較は次のとおりである。Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｃ）完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。及び、Ｄ）ＧＦＲ（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。
図６０は、上部（頂端）及び下部（基底）チャネルにおける培地処方を比較する、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な７日目の拡大画像を示す。培地の比較は次のとおりである。Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）。Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）。及びＣ）完全（Ａ）／ＧＦＲ（Ｂ）。
図６１は、微小絨毛様構造を誘導する２つの培地処方の間での増殖の差異を示す、チップで増殖する腸内腸管様組織細胞の例示的な拡大画像を示す。培地の比較は、Ａ）完全（Ａ）／完全（Ｂ）、及び、Ｂ）ＧＦＲ（Ａ）／完全（Ｂ）である。
実施例４２
マイクロ流体腸オルガノイドチップにおいて成長する腸細胞のフローサイトメトリー分析
本実施例は、本明細書に記載するマイクロ流体チップで増殖する、ｉＰＳＣ腸管様組織由来の腸細胞集団のパーセンテージの例示的な結果を示す。マイクロ流体チップで増殖する細胞の大部分は、上皮細胞である（例示的には、８３．４％及び７２％の細胞集団）。さらに、非上皮細胞集団は、例示的な集団において、腸細胞の１５．６％及び２８．６％として特定された。さらに、パネート細胞（５．０３％）、腸内分泌細胞（０．１５３％）、杯細胞（０．１３１％）、及び、腸細胞（１．０６％）などの腸小細胞集団においても、特異的な非上皮細胞タイプが検出された。
簡潔には、フローサイトメトリー分析のために、腸細胞をチップ膜から除去し、細胞集団の蛍光抗体染色及びフローサイトメトリー分析のための単細胞懸濁液を提供するために処理を行った。細胞集団は、蛍光分析のために集団へとゲーティングするための散布図での前方散乱、すなわち、ＦＣＳによって識別された。
腸管上皮細胞は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする一次抗体で特定し、一方で、非上皮細胞は、非上皮細胞において発現するＩＩＩ型中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質であるビメンチンで識別した。パネート細胞、腸内分泌細胞、杯細胞、及び腸細胞は、これらの細胞型のそれぞれに特異的な抗体を用いて識別した。
蛍光分子と直接にコンジュゲートされていない一次抗体は、当該一次抗体に結合することができる二次蛍光抗体を用いて間接的に検出した。幾つかの抗体は、それらのＦｃ領域と細胞とのバックグラウンド結合を有し、そのため、当該抗体のバックグラウンド蛍光結合を検出するために、アイソタイプ対照が行われた。加えて、ある特定の蛍光チャネルで分析された場合に、細胞は、様々な量の自己蛍光を示し、そのため、細胞の自己蛍光の一部を使用して、蛍光強度ゲート（すなわち、蛍光ドットプロットで示される輪郭）を設定する。
図６２は、１２日間のインキュベーション後のマイクロ流体チップでの上皮及び非上皮サイズ依存性細胞のパーセンテージとして、腸内ｉＰＳ由来腸細胞の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。Ａ）矢印の平坦な端部にて輪郭が描かれているように、サイズゲーティングされた腸細胞を示す散布図は、Ｂ）２つの蛍光チャネルに関する、及び＊−蛍光ゲーティング領域におけるバックグラウンド（自己）蛍光強度を示す２色の蛍光ドットプロットへと向かう。各蛍光チャネル（＊−蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）のゲーティングされた領域での自己蛍光は、０．２１２％蛍光（＊−左上部）、及び０．００４％（＊−右下部）を示しており、プロットの左下部に集団を形成していることが認められた双方のチャネルに関して、細胞集団は、自動蛍光を放っている。Ｃ）上記のようにゲーティングされた細胞と、二次蛍光抗体だけ（バックグラウンドについての別の対照）とを予めインキュベートした細胞を示す散布図は、Ｄ）各チャネル（＊−蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）での高強度領域におけるバックグラウンド蛍光を測定するための、０．１４９％の蛍光（＊−左上部）、及び０．００％（＊−右下部）を示す２色の蛍光ドットプロットについてのものである。Ｅ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体（上皮細胞を識別するためのもの）で蛍光染色され、次いで、２色の蛍光ドットプロットに対してＡのようにサイズについてゲーティングした細胞は、８３．４％のＥｐＣＡＭ＋上皮細胞を示す（＊−左上部において蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）。及び、Ｆ）非上皮細胞で発現されたＩＩＩ型中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質であるビメンチンで蛍光染色され、次いで、２色の蛍光ドットプロットに対してＡのようにサイズについてゲーティングした細胞は、１５．６％のビメンチン＋非上皮細胞を示す（＊−左下部において蛍光ゲーティングについて輪郭が描かれる）。
図６３は、１２日間のインキュベーションを終えた後のマイクロ流体チップでの上皮細胞でない腸内ｉＰＳ由来腸細胞のサイズでゲーティングした集団の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。２つの蛍光プロットにゲーティングした集団のパーセンテージとして、以下の細胞を識別するための抗体で、細胞を蛍光染色した。Ａ）パネート細胞 ５．０３％（＊−右下部で輪郭が描かれる）。Ｂ）腸内分泌細胞 ０．１５３％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。Ｃ）杯細胞 ０．１３１％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。及び、Ｄ）腸細胞 １．０６％（＊−右下部で輪郭が描かれ／蛍光的にゲーティングされる）。
図６４は、１２日間のインキュベーション後のマイクロ流体チップでの上皮及び非上皮のサイズでゲーティングされた細胞のパーセンテージとして、腸内ｉＰＳ由来腸細胞の例示的なフローサイトメトリードットプロットを示す。サイズでゲーティングされた細胞由来の腸細胞集団を、次いで、蛍光強度ドットプロットでゲーティングした。Ａ）ＥｐＣＡＭ一次抗体についてのアイソタイプ抗体対照と共にインキュベートした細胞は、０．８５５％のバックグランド蛍光を有する細胞を示す（＊−左上部で輪郭が描かれ／ゲーティングされる）。Ｂ）一次抗体を用いずに、二次抗体と共にインキュベートした細胞は、０．０６５％のバックグラウンド蛍光を有する（＊−右下部で輪郭が描かれ／ゲーティングされる）。Ｃ）腸細胞集団の７２％としてのＥｐＣＡＭ＋上皮細胞。Ｄ）ビメンチン＋非上皮細胞、腸細胞集団の２８．６％。
実施例４３
分裂細胞は、腸の絨毛の下部に位置する−パルスチェイス実験。
本実施例は、分裂細胞が、マイクロ流体腸管チップにおいて、主に、腸の絨毛の下部に位置していることを実証する。
一例として、分裂細胞のＤＮＡを検出するための一般的なパルスチェイス実験では、細胞は、複製時にＤＮＡに取り込むことができる標識化合物と共にインキュベートされる。標識化合物の例として、ある特定のチミジン（一般的には、放射性のもの）、または、チミジン類似体（標識を含むか、または、標識の標的となることができるもの）が、パルス要素であるＳ期の有糸分裂活性細胞において新たに合成されたＤＮＡに組み込まれる標識として使用される。選択したポイントで、標識化合物を、培地から洗い流し、そして、場合によっては、組織内の細胞の移動、及び／または、配置の後に、細胞の宿命に従うべく、様々な時間をかけて培養インキュベーションを行って、非標識化合物と置き換える。
分裂細胞の核内の標識を検出、及び／または、追跡するために、幾つかの放射性及び非放射性の方法が使用されるが、本明細書で使用した方法は、チミジン類似体ＥｄＵ（５−エチニル−２‘−デオキシウリジン）を取り込んでいる。ＥｄＵの取り込みは、組織に効率よく浸透するのに十分に小さいアジド色素との反応によって検出する。ＥｄＵの視覚化は迅速であり、また、一般的には、その後の抗体染色を妨げない。
したがって、一実施形態において、ＥｄＵを、２時間または４時間にわたってパルスした。この期間の後、ＥｄＵを（標識を含む培地を洗い流すことにより）除去し、このことは、分裂細胞がＤＮＡにさらに取り込まれることはなく、また、当該実験のチェイス部が、そこから始まることを意味している。したがって、幾つかの実施形態において、チェイスインキュベーション時間は、２４、７２、または、１２０時間、すなわち、ＥｄＵの初期パルスの後に細胞の培養を行った時間であった。
本明細書に示す図面において、当該実験のパルス要素の後に、大部分の分裂細胞は、基底部に位置する。当該実験のパルス部の間、異なる時点にて、これらの標識された細胞は、絨毛構造の上部に認められ、したがって、これらの基底細胞は、次いで、当該絨毛の側面の上方に、かつ、頂部に向かって移動する。
図６５は、マイクロ流体チップ内の腸絨毛にてパルスチェイスした有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。Ｅ−カドヘリン（赤）を発現する上皮細胞、及び、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に、ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が示されている。Ａ）４時間パルスの後、次いで、Ｂ）７２時間のチェイス、及び、Ｃ）１２０時間のチェイスの後の標識細胞を示す。
図６６は、腸管絨毛の基底部に位置し、次いで、上部絨毛構造内に移動してマイクロ流体チップ内で増殖するパルスチェイス分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に示される。ＥｄＵ標識（緑）した有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後に腸の微小絨毛の基底部に位置し、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。
図６７は、マイクロ流体チップ内の腸絨毛にてパルスチェイスされた有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。Ｅ−カドヘリン（赤）を発現する上皮細胞、及び、ＤＡＰＩ（青）で染色した核とは対照的に、ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞が示されている。ＥｄＵ標識（緑）した有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後に腸の微小絨毛の基底部に位置し、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。
図６８は、図６１に示したような、マイクロ流体チップ内の腸絨毛でのＥｄＵ標識したパルスチェイスされた有糸分裂／分裂細胞の例示的な蛍光顕微鏡写真を示す。ＥｄＵ標識した（緑）有糸分裂／分裂細胞は、Ａ）２時間のパルスの後、上皮または核染色を伴わない腸の微小絨毛の基底部でより明瞭に示され、次いで、標識した細胞は、Ｂ）２４時間のチェイス、及び、Ｃ）７２時間のチェイスの後に絨毛構造に位置する。
実施例４４
経時的多重実験での使用のためにｉＰＳ細胞を凍結する。
ヒトｉＰＳ細胞株由来の腸内腸管様組織細胞の使用に関する一つの制約は、これらの細胞を、生存可能で再現性のあるマイクロ流体腸管チップを作製するために、ある特定の期間に使用する必要があることである。しかしながら、本発明の開発の際に、これらの細胞を用いた最初の実験から長時間離間した実験において、同じヒト腸内腸管様組織細胞の複数のアリコート（すなわち、複製試料）を使用するための方法及び条件が開発された。あるいは、ヒトｉＰＳ細胞株に由来する腸内腸管様組織細胞は、マイクロ流体チップで使用する前に長期間貯蔵し得る。
例示的な直接的な使用方法として、ｉＰＳ細胞（すなわち、ヒトｉＰＳＣ）を、３６〜３７日間培養し、その後、２７〜２８日間にわたって腸オルガノイド細胞に分化させる。次いで、オルガノイド細胞を、単細胞懸濁液へと解離させ、次いで、マイクロ流体チップに播種するために、サブ集団を選択する。選択の種類として、流動選別、例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳのいずれかによるＥｐＣＡＭ＋細胞のための流動選別、または、代わりに、本明細書に記載する単細胞懸濁液へと所望の細胞を分離させるために、オルガノイド細胞培養物に添加された選択試薬の使用による選択をし得る。参考のため、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）は、様々な細胞集団をそれらの表面分子に応じて分離する方法のことを指す。
単細胞懸濁液を提供するために使用される選択方法にかかわらず、これらの単細胞懸濁液は、マイクロ流体チップの頂端チャネルを播種するために直接に使用される。流動条件下で７〜１４日間培養した後に、チップは、本明細書に記載するように、上皮を含む絨毛を有する、図６９Ａを参照されたい。
例示的な凍結方法として、ｉＰＳ細胞を培養し、及び、腸オルガノイド細胞に分化させ、次いで、上記のように選択する。細胞の所望のサブ集団のために細胞を選択した後に、それらを、無菌低温バイアル／チューブ内のＣｒｙｏｓｔｏｒに再懸濁する。Ｃｒｙｏｓｔｏｒとは、規定の凍結保存培地であり、例として、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５に、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％ＤＭＡＳＯを含有し、または、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２に、２％ＤＭＳＯを含有する、無血清で、動物成分を含まず、かつ、規定の凍結保存培地であり、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓから入手したものがある。腸内ｉＰＳ細胞を含有する低温バイアルを凍結し、次いで、液体窒素タンクに貯蔵する。解凍をして、先に凍結した腸オルガノイド細胞を、チップへの播種のために使用すると、絨毛を含有する上皮を産生するために７〜１４日間という同じ時間枠という結果となった。図６９Ｂを参照されたい。例示的な結果として、６６％の生存（すなわち、生存細胞）が解凍時に観察された。さらに、これらの解凍された細胞は、成長が良好な生存可能な培養物を産生するトランスウェルにも置かれた（播種された）。
図６９は、ｉＰＳ細胞由来の腸内腸管様組織細胞の間での時系列比較の概略図を示す。一実施形態において、細胞は、Ａ）直接的に、または、Ｂ）凍結及び解凍後に使用される。双方の条件下で、チップは、上皮を含む絨毛（絨毛で覆われた）構造を含む。
実施例４５
臓器チップ設計の変形
マイクロ流体臓器チップの設計の追加の実施形態を、図６５〜図６７に示しており、そこでは、複数の臓器のためのマイクロ流体チップが、流体的に取り付けられている。
図７０は、３つの異なる臓器チップのための３つのマイクロ流体チップが、基底チャネルを介して流体的に取り付けられた、三臓器回路の概略図を示す。
図７１は、３つの異なる臓器チップのための３つのマイクロ流体チップが、部分的流体的に、すなわち、頂端または基底チャネルを介して取り付けられた、三臓器回路の概略図を示す。
図７２は、２つの異なる臓器チップのための２つのマイクロ流体チップが部分的流体的に取り付けられた、二臓器回路の概略図を示す。
参考のために、上部頂端チャネルは、緑色の実線で示しており、下部基底チャネルは、赤色の破線で示している。
実施例４６
超肥満ｉＰＳＣ由来視床下部ニューロンは、調節不全の神経内分泌応答経路を有する。
視床下部の弓状核（ＡＲＣ）でのニューロンは、飢餓や満腹などの摂食行動を調節する。それらは、胃腸管、膵臓、及び、脂肪組織からのホルモンシグナルに応答した神経ペプチドの分泌によって、生理学的代謝プロセスを制御する。この応答の調節不全は、肥満などの代謝性疾患における細胞病態生理学の中心にある。本研究において、発明者らは、多能性幹細胞からヒトの視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）を分化させるためのロバスト法を記載し、（ａ）摂食行動を制御する重要な外因性ホルモンを有するｉＨＴＮを撹乱させ、（ｂ）超肥満個体（ＢＭＩ＞５０）に由来するｉＨＴＮと、健常な正常対照（ＢＭＩ＜２５）に由来するｉＨＴＮとを比較することにより、代謝性疾患をモデル化することにおいて、それらの機能的有用性を実証する。
上記の概念を適用して、本発明者らは、ｉＰＳＣからの視床下部ニューロン（ｉＨＴＮ）の誘導及び特徴付けを追求した（バイオインフォマティクス、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、ｑＰＣＲ、免疫ブロット法、電気生理学、及び、呼吸法）。これは、ｉＨＴＮに対する外因性摂食行動関連ホルモンの効果／応答の測定をさらに含む（シーホース、ウェスタンブロット、及び、ＥＬＩＳＡ）。最後に、本発明者らは、対照の個体と比較して、超肥満個体に由来するｉＨＴＮにおける肥満の疾患徴候の保持を決定する（バイオインフォマティクス、ｑＰＣＲ、シーホース、ＥＬＩＳＡ、及び、ウェスタンブロット）。図７４〜７６に示したように、ｉＰＳＣからの内分泌応答性ｉＨＴＮの生成は、ニューロペプチダーゼ性ニューロンの患者特異的インビトロ産生のための道を開く。遺伝子編集の助けを借りて、ｉＨＴＮは、遺伝的代謝疾患について補正をすることもでき、患者特異的ニューロペプチダーゼニューロンを用いる、治療可能性を提供する。
上記の様々な方法及び技術は、本発明を実施するためのいくつかの方法を提供する。当然のことながら、ここに記載したすべての目的または利点が、必ずしも、本明細書に記載する特定の実施形態にしたがって達成し得るものでないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書で教示または示唆し得る他の目的または利点を必ず達成しなくとも、本明細書で教示した利点または利点のグループを達成または最適化する方法で実施できることを認識するであろう。様々な有利かつ不利な選択肢を、本明細書に記載している。幾つかの好ましい実施形態は、特に、１つの、別の、または、幾つかの有利な特徴を含むが、他のものは、特に、一つの、別の、または、幾つかの不都合な特徴を排除するが、さらに他のものは、特に、一つの、別の、または、幾つかの有利な特徴を取り込むことで、現存する不都合な特徴を軽減することを理解されたい。
さらに、当業者であれば、異なる実施形態から様々な特徴が適用可能であることを認識するであろう。同様に、当業者であれば、上記の様々な要素、特徴、及びステップ、ならびに、そのような要素、特徴、またはステップのそれぞれについての他の公知の均等物を、組み合わせ、適合させて、本明細書に記載の原理にしたがって、方法を実施することができる。様々な要素、特徴、及びステップの中で、幾つかのものは、具体的に使用されることとなり、他の幾つかのものは、多様な実施形態で具体的に除外されることとなる。
本発明は、ある特定の実施形態及び実施例の文脈に沿って開示しているが、当業者であれば、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替的な実施形態及び／または使用、ならびに、それらの改変形態及び等価物にまで及ぶことを理解するであろう。
本発明の実施形態では、数多くの変形及び代替の要素が開示されている。さらに別の変形及び代替の要素は、当業者に明白となるであろう。これらの変形には、限定することなく、リンパ芽球様細胞の供給源、それに由来する多能性幹細胞、リンパ芽球様細胞からの多能性幹細胞の誘導に関する技術及び組成物、分化技術及び組成物、そのような細胞に関連するバイオマーカー、及び本発明の教示を通じて作成された製品の特定の用途がある。本発明の様々な実施形態は、これらの変形または要素のあらゆるものを具体的に使用し、または、除外し得る。
幾つかの実施形態において、本発明のある特定の実施形態を記載及び特許請求するために用いる、成分の量を表す数字、濃度、反応条件などの特性を表す数値は、場合によっては、用語「約」でもって、修飾されるものと理解されたい。したがって、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される説明及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態において得ることが求められる所望の特性に応じて変化可能な近似値である。幾つかの実施形態において、当該数値パラメータは、報告される有効数字の数と、通常の丸め技術を適用して解釈されるべきである。本発明の幾つかの実施形態の広範な範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるが、特定の実施例に示された数値は、実施可能な限り正確に報告される。本発明の幾つかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値において認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。
本明細書における数値の範囲の記載は、その範囲内に属する別個の数値の各々を個別に示すための簡便な方法を意図したものに過ぎない。特に断りが無い限り、別個の数値は、個別に本明細書に記載されるかのように、本明細書の一部を構成するものとして援用する。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書において特に断りがなく、あるいは、本発明の説明と明らかに矛盾をしていない限りは、いかなる適切な順序でも実施することができる。本明細書に記載のある特定の実施形態に関して示される、あらゆる、及び、すべての実施例、あるいは、例示的用語（例えば、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をさらに詳細に説明するためのものに他ならず、特許請求されていない限りは、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されていない要素が、本発明を実施する上で必須であることを示すものではない。
本明細書で開示した本発明の代替要素、または、実施形態のグループ分けは、限定として解釈すべきではない。各グループのメンバーは、個別で、または、当該グループの他の要素、または、本明細書に記載する他の要素とのあらゆる組み合わせで参照することができ、特許請求することができる。利便性、及び／または、特許性の理由から、グループの１つ以上のメンバーを、グループに含めること、あるいは、グループから削除することができる。そのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、当該グループは改変されたものを含み、したがって、添付した特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすとみなされる。
本発明の好適な実施態様が、本発明を実施するために本発明者らが知得している最良の形態をも含めて、本明細書に記載されている。それら好適な実施態様に対する変形は、本明細書を読む当業者に自明となるであろう。当業者であれば、そのような変形を適切に使用できるものであり、及び、本明細書に具体的に記載された以外の発明の実施が実施可能である。
さらに、本明細書を通して、特許及び刊行物に対して数多くの参照を行った。上記の引用文献及び印刷物の各々は、個別にその全内容を本明細書に援用する。
本明細書に開示した本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するためのものであることを理解されたい。使用し得るその他の改変も、本発明の範囲内とすることができる。したがって、例示目的であって、限定を目的とせずに、本発明の代替構成を、本明細書の教示にしたがって利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、図示及び説明されたものに、厳密に限定されない。
本明細書に開示した本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するためのものであることを理解されたい。使用し得るその他の改変も、本発明の範囲内とすることができる。したがって、例示目的であって、限定を目的とせずに、本発明の代替構成を、本明細書の教示にしたがって利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、図示及び説明されたものに、厳密に限定されない。

Claims (40)

  1. 腸細胞を生成する方法であって、
    アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でのｉＰＳＣの培養による胚体内胚葉の生成、
    ＦＧＦ４、及びＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかの存在下での胚体内胚葉の培養による後腸への分化、
    上皮スフィアまたは上皮チューブの回収、
    上皮スフィアまたは上皮チューブのマトリゲルでの懸濁、ならびに
    ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下で培養して腸細胞を生成すること
    を含む、前記方法。
  2. 前記ｉＰＳＣが、リプログラミングされたリンパ芽球様Ｂ細胞由来の誘導多能性幹細胞（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｉＰＳＣが、炎症性腸疾患及び／または炎症性腸病態に罹患している対象から得たリプログラミングされた細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａの存在下でのｉＰＳＣの培養が、約３〜４日間である、請求項１に記載の方法。
  5. ＦＧＦ４、及びＷｎｔ３ＡまたはＣＨＩＲ９９０２１のいずれかの存在下での胚体内胚葉の培養が、約１〜４日間である、請求項１に記載の方法。
  6. ＣＨＩＲ９９０２１、ノギン、及びＥＧＦの存在下での培養が、約１８〜２１日間の期間である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記腸細胞を単細胞に分離させ、ＣＤ３２６＋発現に基づいて精製する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記腸細胞を、分離の前に、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記単細胞が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ２０２１９０、及びＡ８３−０１の１つ以上を含む培地で再懸濁される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記腸細胞が、装置に播種される、請求項１に記載の方法。
  11. 請求項１に記載の方法によって製造された腸細胞を含む組成物。
  12. 請求項１に記載の方法によって製造された腸細胞を含むオルガノイド。
  13. 絨毛を含む組織化した構造を含む、請求項１２に記載のオルガノイド。
  14. 誘導多能性幹細胞を分化させる方法であって、
    ある量の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、及び
    １つ以上の因子の存在下で培養すること
    を含み、
    該１つ以上の因子が、ｉＰＳＣを分化させることができる、前記方法。
  15. アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下で培養することにより、前記ｉＰＳＣを胚体内胚葉へと分化させる、請求項１４に記載の方法。
  16. アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約３日間である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記分化するｉＰＳＣが、最初に、血清を含まない条件下で培養され、続いて、血清が添加される、請求項１６に記載の方法。
  18. ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下でさらに培養することにより、胚体内胚葉を前腸スフェロイドへと分化させる、請求項１５に記載の方法。
  19. ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ（ＦＧＦ４）、ＬＤＮ、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約３日間である、請求項１８に記載の方法。
  20. コーティングされた表面上で培養することにより、前記前腸スフェロイドを前腸上皮へと分化させる、請求項１８に記載の方法。
  21. 表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む１つ以上の因子の存在下でのさらなる培養によって、前記前腸スフェロイドを前腸上皮へと分化させる、請求項１８に記載の方法。
  22. 表皮成長因子（ＥＧＦ）を含む１つ以上の因子の存在下での前記さらなる培養が、約２０日間である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ｉＰＳＣを、最初に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で培養する、請求項１４に記載の方法。
  24. ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下で培養することにより、前記ｉＰＳＣを神経外胚葉へと分化させる、請求項２３に記載の方法。
  25. ＬＤＮ１９３１８９及びＳＢ４３１５４２を含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約２日間である、請求項２４に記載の方法。
  26. スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下で培養することにより、前記神経外胚葉を腹側間脳へと分化させる、請求項２４に記載の方法。
  27. スムーズンドアゴニストＳＡＧ、プルモルファミン（ＰＭＮ）、及びＩＷＲ−ｅｎｄｏを含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約５〜６日間である、請求項２６に記載の方法。
  28. ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下で培養することにより、腹側間脳を成熟させる、請求項２６に記載の方法。
  29. ＤＡＰＴ、レチノイン酸（ＲＡ）を含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約４〜５日間である、請求項２８に記載の方法。
  30. ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下で培養することにより、前記成熟腹側間脳をさらに成熟させる、請求項２９に記載の方法。
  31. ＢＤＮＦを含む１つ以上の因子の存在下での培養が、約２０〜２７日間である、請求項３０に記載の方法。
  32. 請求項１４に記載の方法によって製造された前腸細胞を含む、分化したｉＰＳＣの組成物。
  33. 請求項１４に記載の方法によって製造された視床下部ニューロンを含む、分化したｉＰＳＣの組成物。
  34. 化合物スクリーニングの方法であって、
    ある量の分化した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、
    該分化したｉＰＳＣを、１つ以上の化合物と接触させること、
    該分化したｉＰＳＣの１つ以上の特性を測定すること
    を含み、
    該分化したｉＰＳＣの該１つ以上の特性の測定が、該１つ以上の化合物の特徴を特定する、前記方法。
  35. 化合物スクリーニングが、内分泌攪乱についてのスクリーニングを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記１つ以上の化合物の特徴が、ＮＦ−ｋＢのリン酸化を誘導することを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記１つ以上の化合物の特徴が、ミトコンドリア呼吸の減少を含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記１つ以上の化合物の特徴が、ＳＣＯ２、ＰＯＬＲＭＴ、ＴＦＡＭ、及びＣＹＴＢ５の１つ以上の発現の減少を含む、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記分化したｉＰＳＣが、前腸上皮である、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記分化したｉＰＳＣが、視床下部ニューロンである、請求項３４に記載の方法。
JP2018540028A 2016-02-01 2017-02-01 マイクロ流体装置における腸細胞の成長のためのシステム及び方法 Pending JP2019506861A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662289521P 2016-02-01 2016-02-01
US62/289,521 2016-02-01
US201662332849P 2016-05-06 2016-05-06
US62/332,849 2016-05-06
US201662354040P 2016-06-23 2016-06-23
US62/354,040 2016-06-23
US201662437314P 2016-12-21 2016-12-21
US62/437,314 2016-12-21
PCT/US2017/016098 WO2017136479A1 (en) 2016-02-01 2017-02-01 Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019506861A true JP2019506861A (ja) 2019-03-14
JP2019506861A5 JP2019506861A5 (ja) 2019-04-25

Family

ID=59500254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018540028A Pending JP2019506861A (ja) 2016-02-01 2017-02-01 マイクロ流体装置における腸細胞の成長のためのシステム及び方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US11473061B2 (ja)
EP (2) EP3411472A4 (ja)
JP (1) JP2019506861A (ja)
AU (3) AU2017213795A1 (ja)
CA (2) CA3013357A1 (ja)
GB (1) GB2564582B (ja)
WO (2) WO2017136462A2 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022025269A1 (ja) * 2020-07-30 2022-02-03 国立研究開発法人理化学研究所 膀胱オルガノイド及びその製造方法
US11414648B2 (en) 2017-03-24 2022-08-16 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium
US11473061B2 (en) 2016-02-01 2022-10-18 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
US11913022B2 (en) 2017-01-25 2024-02-27 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
WO2024053406A1 (ja) * 2022-09-09 2024-03-14 国立大学法人大阪大学 小腸上皮様細胞及びその作製方法
US11981918B2 (en) 2018-04-06 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
US10174289B2 (en) 2014-05-28 2019-01-08 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
WO2016061464A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
CN109415685B (zh) 2016-05-05 2023-07-04 儿童医院医疗中心 用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物
AU2017326179B2 (en) 2016-09-13 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods relating to intestinal organ-on-a-chip
KR102558606B1 (ko) 2016-12-05 2023-07-26 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 결장 유사장기 및 이를 제조 및 사용하는 방법
WO2018213773A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells
CA3076500A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 EMULATE, Inc. Rheologically biomimetic fluid surrogate
CN107828655A (zh) * 2017-11-15 2018-03-23 大连理工大学 一种微流控芯片及其应用
ES2921049T3 (es) * 2017-12-22 2022-08-17 Tissuse Gmbh Chips de múltiples órganos novedosos que establecen la diferenciación de células derivadas de iPSC en equivalentes de órganos
WO2019168932A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Albert Li Isolated intestinal mucosa and uses thereof
GB2612702B (en) * 2018-05-09 2024-04-10 Emulate Inc Host-biome interactions
WO2019222870A1 (zh) * 2018-05-21 2019-11-28 深圳华大生命科学研究院 一种仿生肠道器官芯片及其制备方法和应用
KR20210040107A (ko) * 2018-07-26 2021-04-12 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 간-담도-췌장 조직 및 이를 제조하는 방법
US11859214B1 (en) 2018-08-17 2024-01-02 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Automated system for simulating the human lower gastrointestinal tract
US20220220448A1 (en) * 2019-05-15 2022-07-14 The Cleveland Clinic Foundation Induced human colitic organoids
AU2020283390A1 (en) 2019-05-28 2021-12-23 Duke University Methods and apparatuses for patient-derived micro-organospheres
AU2020283048A1 (en) * 2019-05-31 2021-12-23 Children's Hospital Medical Center Shaped organoid compositions and methods of making same
US20210003559A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for Assessing a Compound Interacting with a Target on Epithelial Cells
US20230314412A1 (en) * 2020-03-21 2023-10-05 Florica Therapeutics, Inc. Neuronal diencephalon stem cells, preparation and uses for treatment and prevention of hormonal disorders and other diseases
EP4179331A2 (en) * 2020-07-09 2023-05-17 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Methods of determining cancer therapy
GB202109913D0 (en) * 2021-07-09 2021-08-25 Stichting Hubrecht Organoid Tech Organoid-derived monolayers and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014171434A (ja) * 2013-03-08 2014-09-22 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 胃組織細胞の作製方法
WO2014159356A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for epithelial stem cell expansion and culture
JP2015504676A (ja) * 2012-01-13 2015-02-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
WO2015188131A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Cedars-Sinai Medical Center A novel and efficient method for reprogramming immortalized lymphoblastoid cell lines to induced pluripotent stem cells

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5610281A (en) 1994-05-03 1997-03-11 Brigham & Women's Hospital, Inc. Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
WO2002038190A2 (en) 2000-10-27 2002-05-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Non-isotopic detection of osteoblastic activity in vivo using modified bisphosphonates
EP1385938A1 (en) 2001-04-23 2004-02-04 Nsgene A/S Method and culture medium for producing neural cells expressing tyrosine hydroxylase
US20080004332A1 (en) 2002-03-07 2008-01-03 Alkon Daniel L Methods for alzheimer's disease treatment and cognitive enhancement
WO2005034624A2 (en) 2003-05-21 2005-04-21 The General Hospital Corporation Microfabricated compositions and processes for engineering tissues containing multiple cell types
AU2004269361B2 (en) 2003-08-29 2010-05-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells
DE102004061947A1 (de) * 2004-12-22 2006-07-06 Ccs Cell Culture Service Gmbh Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen
US20070077649A1 (en) 2005-09-06 2007-04-05 Sammak Paul J Transplantable cell growth niche and related compositions and methods
US8492150B2 (en) 2006-02-03 2013-07-23 President And Fellows Of Harvard College Engineered cell growth on polymeric films and biotechnological applications thereof
US20080044847A1 (en) 2006-06-23 2008-02-21 Shusta Eric V Blood-Brain Barrier Model
KR100790880B1 (ko) * 2006-07-05 2008-01-02 삼성전자주식회사 자성 비드가 결합되어 있는 소수성 다공성 중합체가 벽면에결합되어 있는 마이크로채널 또는 마이크로챔버를포함하는 미세유동장치 및 그를 이용하는 방법
WO2008118421A1 (en) 2007-03-23 2008-10-02 California Stem Cell, Inc. Human late stage motor neuron progenitor cells and methods of making and using same
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
JP2009247276A (ja) 2008-04-04 2009-10-29 Erii Kk 生体供給用、生体移植用、生体添加用、生体投与用の解凍器官若しくは組織または解凍細胞群とその製造方法及びそれらに用いる過冷却液並びに製造装置
CA2730928C (en) 2008-07-16 2023-06-20 Children's Medical Center Corporation Organ mimic device with microchannels and methods of use and manufacturing thereof
AU2015204375A1 (en) 2008-07-16 2015-08-06 Children's Medical Center Corporation Organ mimic device with microchannels and methods of use and manufacturing thereof
WO2010096496A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2010108005A2 (en) 2009-03-18 2010-09-23 University Of Georgia Research Foundation Novel neural progenitors from pluripotent stem cells, methods of producing same and use to produce neural cells
WO2010115052A2 (en) 2009-04-03 2010-10-07 The Mclean Hospital Corporation Induced pluripotent stem cells
WO2011017030A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Neuraltus Pharmaceuticals, Inc. Treatment of macrophage-related disorders
US9708582B2 (en) * 2009-10-13 2017-07-18 Stemcell Technologies Inc. Method of differentiating stem cells
JP5808349B2 (ja) 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
US9719068B2 (en) * 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
KR20130101557A (ko) * 2010-11-02 2013-09-13 고꾸리쯔다이가꾸호오진 구마모또 다이가꾸 장세포의 제조 방법
ES2764117T3 (es) 2010-12-13 2020-06-02 Theradep Tech Inc Dispositivos médicos implantables
US20120211373A1 (en) 2011-02-22 2012-08-23 The Regents Of The University Of Michigan Microfluidic system for measuring cell barrier function
SG192931A1 (en) * 2011-02-28 2013-09-30 Harvard College Cell culture system
WO2012122405A2 (en) 2011-03-08 2012-09-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Screening assays using stem cells and stem cell-derived neurons from mouse models of alzheimer's disease
MX349658B (es) 2011-06-09 2017-08-08 Hoffmann La Roche Metodo para la diferenciacion de las celulas madre pluripotentes en celulas de lecho vascular.
WO2012177997A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 The General Hospital Corporation Treatment of proteinopathies
ES2741969T3 (es) * 2011-10-31 2020-02-12 Riken Método para el cultivo de células madre
US10821079B2 (en) 2011-11-13 2020-11-03 Cognitive Research Enterprises, Inc. PKC activators and combinations thereof
US9725687B2 (en) 2011-12-09 2017-08-08 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
US9149806B2 (en) 2012-01-10 2015-10-06 Biopico Systems Inc Microfluidic devices and methods for cell sorting, cell culture and cells based diagnostics and therapeutics
US9532997B2 (en) * 2012-04-03 2017-01-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for promoting intestinal stem cell function
KR101200049B1 (ko) 2012-05-14 2012-11-13 한국원자력연구원 테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 단량체 또는 올리고머 활용 생리활성분자를 이용한 프로브의 제조방법 및 이를 포함하는 영상제 조성물
AU2013274197A1 (en) 2012-06-13 2015-01-22 Stemgent, Inc. Methods of preparing pluripotent stem cells
US9513280B2 (en) 2012-08-28 2016-12-06 University Of Utah Research Foundation Microfluidic biological barrier model and associated method
GB201216796D0 (en) 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
US20140134732A1 (en) 2012-11-14 2014-05-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified Compositions and Methods for Generating Neural Stem Cells From Human Pluripotent Stem Cells
US9932559B2 (en) 2012-11-16 2018-04-03 The Johns Hopkins University Platform for creating an artificial blood brain barrier
US10160950B2 (en) 2013-03-01 2018-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of maintaining, expanding and differentiating neuronal subtype specific progenitors
US10266807B2 (en) 2013-04-03 2019-04-23 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
ES2721635T3 (es) 2013-04-19 2019-08-02 Cedars Sinai Medical Center Generación de imágenes de biomarcadores para el diagnóstico del dolor de espalda
AU2014256876B2 (en) * 2013-04-26 2020-11-12 Cornell, University Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
KR102361924B1 (ko) 2013-06-11 2022-02-14 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
WO2015020234A1 (ja) 2013-08-06 2015-02-12 武田薬品工業株式会社 ドパミン神経細胞の製造方法
GB201317869D0 (en) * 2013-10-09 2013-11-20 Cambridge Entpr Ltd In vitro production of foregut stem cells
WO2015057261A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods of generating intermediate mesoderm cells from human pluripotent stem cells
EP3083940A4 (en) 2013-12-20 2017-08-23 President and Fellows of Harvard College Low shear microfluidic devices and methods of use and manufacturing thereof
GB2545287A (en) 2013-12-20 2017-06-14 Harvard College Organomimetic devices and methods of use and manufacturing thereof
WO2015126528A1 (en) 2014-02-18 2015-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Biophysically sorted osteoprogenitors from culture expanded bone marrow derived mesenchymal stromal cells (mscs)
ES2939807T3 (es) 2014-03-21 2023-04-27 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Producción de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo y métodos para su utilización
CA2944314C (en) 2014-03-31 2023-09-19 Brigham And Women's Hospital, Inc. Systems and methods for biomimetic fluid processing
WO2015163823A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Agency For Science, Technology And Research Methods of cellular reprogramming
AU2015259573B2 (en) 2014-05-16 2021-03-18 Janssen Biotech, Inc. Use of small molecules to enhance MAFA expression in pancreatic endocrine cells
WO2015181253A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Neural progenitor cell population
US10174289B2 (en) * 2014-05-28 2019-01-08 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
WO2016061464A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
JP6746499B2 (ja) 2014-10-24 2020-08-26 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法
US20170363616A1 (en) 2014-11-25 2017-12-21 Los Alamos National Security, Llc Patterned neuromuscular junctions and methods of use
JP5777127B1 (ja) 2014-12-09 2015-09-09 公立大学法人横浜市立大学 原始腸内胚葉細胞及びその作製方法
CN107438669B (zh) 2015-04-09 2022-09-27 拜奥拉米那公司 用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物
EP3294290A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Alkon, Daniel, L. Treatment of neurodegenerative conditions using pkc activators after determining the presence of the apoe4 allele
WO2017035119A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 National University Of Singapore Blood brain barrier model in a 3d co-culture microfluidic system
US20180057788A1 (en) 2016-08-29 2018-03-01 EMULATE, Inc. Development of spinal cord on a microfluidic chip
US20170226478A1 (en) 2015-10-19 2017-08-10 EMULATE, Inc. Neuromuscular Junction: NMJ-ON-CHIP
JP2018533940A (ja) 2015-10-19 2018-11-22 エミュレイト， インコーポレイテッド 血液脳関門のマイクロ流体モデル
US20180306780A1 (en) 2015-10-29 2018-10-25 The Regents Of The University Of California Astrocyte differentiation protocol
CN115927199A (zh) 2015-11-04 2023-04-07 菲特治疗公司 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
US20190018000A1 (en) 2016-01-12 2019-01-17 Cedars-Sinai Medical Center A method of non destructive monitoring of biological processes in microfluidic tissue culture systems
AU2017213795A1 (en) 2016-02-01 2018-08-16 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
CA3013077A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 President And Fellows Of Harvard College Improved blood-brain barrier endothelial cells derived from pluripotent stem cells for blood-brain barrier models
WO2017152081A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 New York Stem Cell Foundation, Inc. Microglia derived from pluripotent stem cells and methods of making and using the same
US10214724B2 (en) 2016-04-05 2019-02-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells
CN109153970A (zh) 2016-05-17 2019-01-04 新加坡科技研究局 人类干细胞衍生的内皮细胞、内皮-肝细胞共培养系统以及其用途
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US20190359924A1 (en) 2016-08-29 2019-11-28 EMULATE, Inc. Development of spinal cord on a microfluidic chip
SG11201908359UA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Emulate Inc Neuromuscular junction: nmj-on-chip
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
GB2575574B (en) 2017-03-14 2022-08-17 Cedars Sinai Medical Center Neuromuscular junction
WO2018213773A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells
WO2019183597A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Methods of use of islet cells
US11981918B2 (en) 2018-04-06 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
EP3775161A4 (en) 2018-04-06 2022-04-06 Cedars-Sinai Medical Center NEURODEGENERATIVE DISEASE MODELS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENTIC STEM CELLS ON A MICROFLUIDIC CHIP
WO2019212691A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Cedars-Sinai Medical Center Diagnostic and drug screening for molecular signatures of early onset sporadic parkinson's disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015504676A (ja) * 2012-01-13 2015-02-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 単離ヒト肺前駆細胞およびその使用
JP2014171434A (ja) * 2013-03-08 2014-09-22 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 胃組織細胞の作製方法
WO2014159356A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for epithelial stem cell expansion and culture
WO2015188131A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Cedars-Sinai Medical Center A novel and efficient method for reprogramming immortalized lymphoblastoid cell lines to induced pluripotent stem cells

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11473061B2 (en) 2016-02-01 2022-10-18 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
US11913022B2 (en) 2017-01-25 2024-02-27 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
US11414648B2 (en) 2017-03-24 2022-08-16 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium
US11981918B2 (en) 2018-04-06 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
WO2022025269A1 (ja) * 2020-07-30 2022-02-03 国立研究開発法人理化学研究所 膀胱オルガノイド及びその製造方法
WO2024053406A1 (ja) * 2022-09-09 2024-03-14 国立大学法人大阪大学 小腸上皮様細胞及びその作製方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3411472A4 (en) 2020-01-22
WO2017136462A3 (en) 2017-09-14
EP3411470A4 (en) 2019-10-09
WO2017136479A1 (en) 2017-08-10
CA3013357A1 (en) 2017-08-10
WO2017136462A2 (en) 2017-08-10
US20220282221A1 (en) 2022-09-08
GB201814294D0 (en) 2018-10-17
US20190031992A1 (en) 2019-01-31
GB2564582B (en) 2021-09-22
AU2017214468A1 (en) 2018-09-13
CA3013337A1 (en) 2017-08-10
EP3411472A1 (en) 2018-12-12
AU2017213795A1 (en) 2018-08-16
AU2017214468B2 (en) 2020-09-17
US11952592B2 (en) 2024-04-09
GB2564582A (en) 2019-01-16
US11326149B2 (en) 2022-05-10
US20190153395A1 (en) 2019-05-23
EP3411470A2 (en) 2018-12-12
CA3013337C (en) 2023-05-09
AU2020289787A1 (en) 2021-01-21
US11473061B2 (en) 2022-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11952592B2 (en) Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
CN110382012B (zh) 肝类器官疾病模型以及其制备和使用方法
Barker Adult intestinal stem cells: critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration
US20210208131A1 (en) Immune cell organoid co-cultures
JP2022095796A (ja) ヒト腸神経堤系統由来多能性幹細胞によって可能にされるヒルシュスプルング病における細胞ベースの処置および薬物発見
Clarke et al. The adult mouse dentate gyrus contains populations of committed progenitor cells that are distinct from subependymal zone neural stem cells
Seaberg et al. Intrinsic differences distinguish transiently neurogenic progenitors from neural stem cells in the early postnatal brain
JP2018518938A (ja) 神経変性疾患の処置における使用のための幹細胞由来のドパミン作用性細胞を生成するための方法および組成物
US20210189349A1 (en) Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same
US20220401493A1 (en) Isolation of fusion-competent myoblasts and therapeutic applications thereof related to muscular dystrophy
JP2022132249A (ja) 多能性幹細胞の中腸内胚葉細胞への分化
Nadkarni et al. Functional enterospheres derived in vitro from human pluripotent stem cells
Torreggiani et al. Protocol for the long‐term culture of human primary keratinocytes from the normal colorectal mucosa
Nishikawa et al. Migration and differentiation of transplanted enteric neural crest-derived cells in murine model of Hirschsprung’s disease
Martín-Ibáñez et al. Insights in spatio-temporal characterization of human fetal neural stem cells
Loret et al. Preliminary characterization of jejunocyte and colonocyte cell lines isolated by enzymatic digestion from adult and young cattle
Millan et al. Pituitary stem cells: past, present, and future perspectives
Pérez Millán et al. Pituitary stem cells: past, present and future perspectives
WO2024059208A2 (en) Compositions and methods for obtaining suspension human intestinal organoids having a serosal mesothelial layer
WO2022256830A1 (en) Systems and methods for cellular lumen formation and cellular differentiation
Sharma Lineage commitment and specification of progenitors of the caudal mesoderm
CN114317398A (zh) Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用
Frith Delineating the signals in anterior-posterior patterning of hPSC derived neural crest cells
Gracz Intrinsic and extrinsic regulation of potency in the intestinal stem cell niche
Seaberg Mammalian brain development: The role of distinct neural stem and progenitor cells from embryonic neural induction to adult neurogenesis.

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180829

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190212

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200128

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210301

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210308

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210601

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210830

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220131