JP2022095796A - ヒト腸神経堤系統由来多能性幹細胞によって可能にされるヒルシュスプルング病における細胞ベースの処置および薬物発見 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年12月23日に出願された米国仮出願番号第62/387,468号に基づく優先権を主張しており、その内容は、その全体が参考として援用され、そしてそれに基づく優先権が主張される。
本願は、ASCII型式で電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2016年12月20日に作製された前記ASCIIコピーは、「0727340451Seqlist_ST25.txt」と命名され、1,162バイトのサイズである。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から誘導された腸神経堤系統細胞、および腸神経系疾患、例えばヒルシュスプルング病の細胞ベースの処置および薬物の発見のための腸神経堤系統細胞の使用に関する。
腸神経系(ENS)は、正常な胃腸管(GI)機能にとって非常に重要である。ENSは、30種を超える異なる神経伝達物質を発現する細胞を有し、脊髄のニューロン数を凌ぐニューロン数を有する、自律神経系の最大で最も多様な構成成分である1。ENSは、大部分が脳および脊髄からの入力とは独立に機能することができ、したがって、その自律性および複雑な細胞構築を前提として、「第2の脳」1と呼ばれている。ENS発生の欠損は、ヒルシュスプルング病(HD)を含む様々なヒト障害2の原因になる。HDは、GI管、特に遠位結腸に遊走するENS前駆細胞の発生不全によって引き起こされた衰弱性遺伝障害である3。ヒトENS系統の発生は、適切なモデル系が欠如しており、主要組織へのアクセスが制限されていることにより、まだ理解が深まっていない。
本開示の主題は、例えばin vitro分化によって、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から誘導された腸神経堤系統細胞に関する。
A31.前記分化細胞を1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含む、Aの前述の方法。
幹細胞集団を、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させる
ステップ、および
さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間接触させるステップ
の後に幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団を提供する。
(a)前述の分化ENS前駆体集団、
(b)前述の分化ENS前駆体集団を含む組成物、
(c)前述の腸ニューロン集団、および
(d)前述の腸ニューロン集団を含む組成物
の1つを投与するステップを含む、方法を提供する。
M1.
(a)(i)前記細胞集団、および(ii)試験化合物を提供するステップと、
(b)前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
(c)前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、Mの前述の方法。
(a)TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子、
(c)迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子、および
(d)1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間接触させるための指示を含む指示書
を含む、キットを提供する。
細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)が、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
細胞集団の約15%未満(例えば、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、幹細胞マーカー、CNSマーカー、脳神経堤(CNC)マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤(MNC)マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する、組成物。
細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)が、1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
細胞集団の約15%未満(例えば、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、CNSマーカー、脳神経堤(CNC)マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤(MNC)マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する、組成物。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞集団を、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間接触させて、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む、方法。
(項目2)
前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と約6日間接触させるステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約2日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約4日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記幹細胞集団が、それらと前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約11日目またはそれより後に、前記1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記幹細胞集団を、SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記幹細胞集団を、前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約4日間以内に、前記細胞集団を、前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約2日目に、前記細胞集団を、前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低減する、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、CHIR99021、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、FGFシグナル伝達の活性化因子、Wnt活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、FGFシグナル伝達の活性化因子、Wntシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子と接触させるステップを含む、項目16または17に記載の方法。
(項目19)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子が、レチノイン酸である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種と接触させるステップを含む、項目17に記載の方法。
(項目21)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種が、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子および1種または複数のWnt活性化因子である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記FGFシグナル伝達の活性化因子が、FGF2、FGF4、FGF7、およびFGF8からなる群から選択される、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記Wntシグナル伝達の活性化因子が、CHIR99021およびWNT3Aからなる群から選択される、項目21または22に記載の方法。
(項目24)
前記迷走神経堤パターン形成が、1種または複数の領域特異的ホメオボックス(HOX)遺伝子の発現によって特徴付けられる、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記1種または複数の領域特異的HOX遺伝子が、HOXB2、HOXB3、HOXB4、およびHOXB5からなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記1種または複数の腸神経堤系統マーカーが、PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5およびASCL1からなる群から選択される、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記分化細胞集団が、1種または複数のSOX10+神経堤系統マーカーをさらに発現する、項目1から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記SOX10+神経堤系統マーカーが、CD49Dである、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
さらに前記分化細胞を1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含む、項目1から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記分化細胞を前記腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な前記条件が、前記分化細胞を適切な細胞培養培地中で培養することを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへの腸神経堤(ENC)前駆体の成熟を増強する1種または複数の分子を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記腸ニューロンへのENC前駆体の成熟を増強する1種または複数の分子が、成長因子およびWnt活性化因子からなる群から選択される、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記成長因子が、FGFシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記適切な細胞培養培地が、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子およびWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子を含む、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記分化細胞が、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子および前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子を含む前記適切な細胞培養培地中で約4日間培養される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、FGF2、FGF4、FGF8、およびFGF7からなる群から選択される、項目35から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記1種または複数の腸ニューロンマーカーが、Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、サブスタンスP、VIP、NPY、GnRH、およびCGRPからなる群から選択される、項目31から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するin vitro分化細胞集団であって、
幹細胞集団を、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させるステップ、および
さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間接触させるステップ
の後に幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
(項目41)
前記細胞集団が、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と約6日間接触される、項目40に記載の分化細胞集団。
(項目42)
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に行われる、項目40または41に記載の分化細胞集団。
(項目43)
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約2日目に行われる、項目42に記載の分化細胞集団。
(項目44)
前記幹細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約4日目に行われる、項目43に記載の分化細胞集団。
(項目45)
前記幹細胞集団が、それらと前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触後、約11日目またはそれより後に、前記1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、項目40から44のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目46)
前記幹細胞集団が、SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触される、項目40から45のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目47)
前記幹細胞集団が、前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と同時に接触される、項目46に記載の分化細胞集団。
(項目48)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約4日間以内に行われる、項目40から47のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目49)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約2日目に行われる、項目48に記載の分化細胞集団。
(項目50)
前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触と同日に行われる、項目48に記載の分化細胞集団。
(項目51)
前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目40から50のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目52)
前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目47から51のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目53)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低減する、項目40から52のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目54)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、CHIR99021、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目40から53のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目55)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目40から54のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目56)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、FGFシグナル伝達の活性化因子、Wntシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目40から54のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目57)
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子と接触される、項目56に記載の分化細胞集団。
(項目58)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子が、レチノイン酸である、項目57に記載の分化細胞集団。
(項目59)
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種と接触される、項目56に記載の分化細胞集団。
(項目60)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種が、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子および1種または複数のWnt活性化因子である、項目59に記載の分化細胞集団。
(項目61)
前記FGFシグナル伝達の活性化因子が、FGF2、FGF4、FGF7、およびFGF8からなる群から選択される、項目56または60に記載の分化細胞集団。
(項目62)
前記Wntシグナル伝達の活性化因子が、CHIR99021およびWNT3Aからなる群から選択される、項目56または60に記載の分化細胞集団。
(項目63)
前記1種または複数の腸神経堤系統マーカーが、PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5およびASCL1からなる群から選択される、項目40から62のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目64)
前記迷走神経堤パターン形成が、1種または複数の領域特異的ホメオボックス(HOX)遺伝子の発現によって特徴付けられる、項目40から63のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目65)
前記1種または複数の領域特異的HOX遺伝子が、HOXB2、HOXB3、HOXB4、およびHOXB5からなる群から選択される、項目64に記載の分化細胞集団。
(項目66)
1種または複数のSOX10+神経堤系統マーカーをさらに発現する、項目40から65のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目67)
前記SOX10+神経堤系統マーカーが、CD49Dである、項目66に記載の分化細胞集団。
(項目68)
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、項目40から67のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目69)
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目40から67のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目70)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の分化細胞集団を含む、組成物。
(項目71)
1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞集団であって、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
(項目72)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で培養した後、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、項目71に記載の分化細胞集団。
(項目73)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で少なくとも約1日間培養した後、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、項目71または72に記載の分化細胞集団。
(項目74)
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへのENC前駆体の成熟を増強する1種または複数の分子を含む、項目73に記載の分化細胞集団。
(項目75)
前記腸ニューロンへのENC前駆体の成熟を増強する1種または複数の分子が、成長因子およびWnt活性化因子からなる群から選択される、項目74に記載の分化細胞集団。
(項目76)
前記成長因子が、FGFシグナル伝達の活性化因子、GDNF、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、項目75に記載の分化細胞集団。
(項目77)
前記適切な細胞培養培地が、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子およびWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子を含む、項目76に記載の分化細胞集団。
(項目78)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子および前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子を含む適切な細胞培養培地中で約4日間培養した後、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、項目77に記載の分化細胞集団。
(項目79)
前記適切な細胞培養培地が、GDNFおよびアスコルビン酸を含む、項目72から76のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目80)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団が、GDNFおよびアスコルビン酸を含む適切な細胞培養培地中で約10日間、約25日間、または約45日間培養した後、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、項目79に記載の分化細胞集団。
(項目81)
前記FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、FGF2、FGF4、FGF8、およびFGF7からなる群から選択される、項目76から78のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目82)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、CHIR99021およびWNT3Aからなる群から選択される、項目76から78のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目83)
前記1種または複数の腸ニューロンマーカーが、Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、サブスタンスP、VIP、NPY、GnRH、およびCGRPからなる群から選択される、項目71から82のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
(項目84)
1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目71から83のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、組成物。
(項目85)
対象の腸神経系障害を予防および/または処置する方法であって、腸神経系障害に罹患している対象に、有効量の、以下:
(a)1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団、
(b)項目70に記載の組成物、
(c)1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目71から83のいずれか一項に記載の細胞集団、および
(d)項目84に記載の組成物
の1つを投与するステップを含む、方法。
(項目86)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目85に記載の方法。
(項目87)
対象の腸神経系障害を予防および/または処置するための、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する、項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目88)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目87に記載の分化細胞集団。
(項目89)
腸神経系障害を予防および/または処置するための医薬の製造における、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
(項目90)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目89に記載の使用。
(項目91)
対象の腸神経系障害を予防および/または処置するための、項目70に記載の組成物。
(項目92)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目91に記載の組成物。
(項目93)
対象の腸神経系障害を予防および/または処置するための、1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する、項目71から83のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目94)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目93に記載の細胞集団。
(項目95)
腸神経系障害を予防および/または処置するための医薬の製造における、1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目71から83のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
(項目96)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目95に記載の使用。
(項目97)
対象の腸神経系障害を予防および/または処置するための、項目84に記載の組成物。
(項目98)
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目97に記載の組成物。
(項目99)
ヒルシュスプルング病、ヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥、および/または別の腸神経系障害を予防および/または処置するのに適した化合物を同定するin vitro方法であって、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団、1種または複数の腸神経のマーカーを発現する項目71から83のいずれか一項に記載の細胞集団、およびそれらの組合せから選択される細胞集団によって提示される少なくとも1つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、事前分化した幹細胞が、エンドセリン受容体B型(EDNRB)においてホモ接合性機能喪失変異を含む、方法。
(項目100)
(a)(i)前記細胞集団、および(ii)試験化合物を提供するステップと、
(b)前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
(c)前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記細胞集団が、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目40から69のいずれか一項に記載の細胞集団である、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記細胞集団が、前記試験化合物と少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、または少なくとも約24時間接触される、項目100または101に記載の方法。
(項目103)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
(a)TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子、
(c)迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子、および
(d)1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間接触させるための指示を含む指示書
を含む、キット。
(項目104)
前記指示書が、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と約6日間接触させるための指示を含む、項目103に記載のキット。
(項目105)
前記指示書が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目103または104に記載のキット。
(項目106)
前記指示書が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約2日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目105に記載のキット。
(項目107)
前記指示書が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約4日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目106に記載のキット。
(項目108)
SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を含む、項目103から107のいずれか一項に記載のキット。
(項目109)
前記指示書が、前記幹細胞集団を、前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と同時に接触させるための指示を含む、項目108に記載のキット。
(項目110)
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約4日間以内に、前記細胞集団を、前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目103から109のいずれか一項に記載のキット。
(項目111)
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約2日目に、前記細胞集団を、前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目110に記載のキット。
(項目112)
前記指示書が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるための指示を含む、項目110に記載のキット。
(項目113)
前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目103から112のいずれか一項に記載のキット。
(項目114)
前記SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目108から113のいずれか一項に記載のキット。
(項目115)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)を低減する、項目103から114のいずれか一項に記載のキット。
(項目116)
前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子が、CHIR99021、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目103から115のいずれか一項に記載のキット。
(項目117)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、FGFシグナル伝達の活性化因子、Wnt活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目103から116のいずれか一項に記載のキット。
(項目118)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子が、FGFシグナル伝達の活性化因子、Wntシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目103から116のいずれか一項に記載のキット。
(項目119)
迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子を含む、項目117に記載のキット。
(項目120)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種の分子が、レチノイン酸である、項目119に記載のキット。
(項目121)
迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種を含む、項目118に記載のキット。
(項目122)
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する2種またはそれよりも多い分子種が、FGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子およびWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子である、項目121に記載のキット。
(項目123)
前記FGFシグナル伝達の活性化因子が、FGF2、FGF4、FGF7、およびFGF8からなる群から選択される、項目122に記載のキット。
(項目124)
前記Wntシグナル伝達の活性化因子が、CHIR99021およびWNT3Aからなる群から選択される、項目122に記載のキット。
(項目125)
幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法であって、幹細胞集団を、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間、約2日間~約20日間の間、または約2日間~約6日間の間接触させて、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含み、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に行われる、方法。
(項目126)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約4日間以内に行われる、項目125に記載の方法。
(項目127)
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するin vitro分化細胞集団であって、幹細胞集団を、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させるステップ、さらに、前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間、約2日間~約20日間の間、または約2日間~約6日間の間接触させるステップの後に幹細胞集団から誘導され、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に行われる、分化細胞集団。
(項目128)
前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約4日間以内に行われる、項目127に記載の分化細胞集団。
(項目129)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、(a)TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子、(c)迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子、および(d)1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団と前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子との初期接触から約8日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と最初に接触させ、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子と、少なくとも約2日間、約2日間~約20日間の間、または約2日間~約6日間の間接触させるための指示を含む指示書を含む、キット。
(項目130)
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触から約4日間以内に、前記細胞集団を、前記Wntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目129に記載のキット。
(項目131)
in vitro分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約70%が、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
前記細胞集団の約15%未満が、幹細胞マーカー、CNSマーカー、脳神経堤(CNC)マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤(MNC)マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する、組成物。
(項目132)
前記腸神経堤系統マーカーが、PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5およびASCL1からなる群から選択される、項目131に記載の組成物。
(項目133)
前記幹細胞マーカーが、OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4およびSSEA3からなる群から選択される、項目131または132に記載の組成物。
(項目134)
前記CNSマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目131から133のいずれか一項に記載の組成物。
(項目135)
前記CNCマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目131から134のいずれか一項に記載の組成物。
(項目136)
前記MNCマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目131から135のいずれか一項に記載の組成物。
(項目137)
前記神経細胞マーカーが、TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、サブスタンスP、VIP、NPY、GnRH、およびCGRPからなる群から選択される、項目131から136のいずれか一項に記載の組成物。
(項目138)
前記間葉系前駆体マーカーが、SMA、ビメンチン、HLA-ABC、CD105、CD90およびCD73からなる群から選択される、項目131から137のいずれか一項に記載の組成物。
(項目139)
前記1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約1×104~約1×1010個の細胞集団を含む、項目131から138のいずれか一項に記載の組成物。
(項目140)
in vitro分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約70%が、1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
前記細胞集団の約15%未満が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、CNSマーカー、脳神経堤(CNC)マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤(MNC)マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する、組成物。
(項目141)
前記腸神経堤系統マーカーが、PAX3、EDNRB、RET、PHOX2A、PHOX2B、NTRK-3、HAND2、HOXB3、HOXB5およびASCL1からなる群から選択される、項目140に記載の組成物。
(項目142)
前記腸ニューロンマーカーが、Tuj1、MAP2、PHOX2A、PHOX2B、TRKC、ASCL1、HAND2、EDNRB、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、サブスタンスP、VIP、NPY、GnRH、およびCGRPからなる群から選択される、項目140または141に記載の組成物。
(項目143)
前記幹細胞マーカーが、OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4およびSSEA3からなる群から選択される、項目140から142のいずれか一項に記載の組成物。
(項目144)
前記CNSマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目140から143のいずれか一項に記載の組成物。
(項目145)
前記CNCマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目140から144のいずれか一項に記載の組成物。
(項目146)
前記MNCマーカーが、PAX6、NESTIN、ビメンチン、FOXG1、SOX2、TBR1、TBR2およびSOX1からなる群から選択される、項目140から145のいずれか一項に記載の組成物。
(項目147)
前記神経細胞マーカーが、TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、TRKC、5HT、GABA、NOS、SST、TH、CHAT、DBH、サブスタンスP、VIP、NPY、GnRH、およびCGRPからなる群から選択される、項目140から146のいずれか一項に記載の組成物。
(項目148)
前記間葉系前駆体マーカーが、SMA、ビメンチン、HLA-ABC、CD105、CD90およびCD73からなる群から選択される、項目140から147のいずれか一項に記載の組成物。
(項目149)
前記1種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する約1×105~約1×107個の細胞集団を含む、項目140から148のいずれか一項に記載の組成物。
(項目150)
ENS障害(例えば、HD)を予防および/または処置する方法であって、対象に有効量のβ-セクレターゼ(BACE)の阻害剤を投与するステップを含む、方法。
(項目151)
前記BACEの阻害剤が、BACE2の阻害剤、LY450139、LY2886721、LY2811376、ベルベセスタット(MK-8931)、およびAZD3839からなる群から選択される、項目150に記載の方法。
(項目152)
前記BACEの阻害剤が、BACE2の阻害剤である、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記BACE2の阻害剤が、BACE阻害剤IV(BACE阻害剤C3)である、項目151に記載の方法。
(項目154)
ENS障害(例えば、HD)を予防および/または処置する方法であって、対象に有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む、方法。
(項目155)
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンA、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびLY-450139からなる群から選択される、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンAである、項目155に記載の方法。
(項目157)
ENS障害を予防および/または処置するための、BACE阻害剤の使用。
(項目158)
ENS障害を予防および/または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用。
4.図面の簡単な説明
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から、in vitroで腸ニューロンにさらに誘導され得る、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞(腸神経系(ENS)前駆体)への分化を誘導するためのin vitro方法、このような方法によって生成された細胞(ENS前駆体および腸ニューロン)、およびこのような細胞を含む組成物に関する。また、ヒルシュスプルング病を予防および/または処置するため、ならびにヒルシュスプルング病を予防および/または処置するのに適した化合物をスクリーニングするための、このような細胞の使用を提供する。
5.1.定義
5.2.幹細胞を分化させる方法
5.3.分化細胞集団を含む組成物
5.4.腸神経系障害を予防および/または処置する方法
5.5.治療用化合物をスクリーニングする方法
5.6.キット
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
ある特定の実施形態では、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞(ENS前駆体)への幹細胞の分化を誘導するin vitro方法は、幹細胞集団(例えば、ヒト幹細胞)を、有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、ノーダル、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流エフェクターをブロックすることによって、それらのシグナル経路をブロックする。TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、それらの全体が参照によって組み込まれる、WO2011/149762、Chambers(2009年)、およびChambers(2012年)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。
ENS前駆体は、数十の別個の神経伝達物質およびホルモンを生成する多様なニューロンサブセットを生じるそれらの能力が独特である。ENS前駆体は、腸ニューロンにin vitroでさらに誘導/成熟され得る。腸ニューロンは、未成熟腸ニューロン、成熟腸ニューロン、またはそれらの組合せであり得る。分化ENS前駆体は、ENS前駆体を腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に付すことができる。
ある特定の実施形態では、前述の阻害剤、活性化因子および分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Knockout(登録商標)血清置換(「KSR」)培地、N2培地、およびEssential 8(登録商標)/Essential 6(登録商標)(「E8/E6」)培地、およびNeurobasal(NB)培地(例えば、N2およびB-27(登録商標)補充物を補充されたNB培地)が含まれるが、それらに限定されない。KSR培地、N2培地、E8/E6培地およびNB培地は、商業的に利用可能である。
分化ENS前駆体は、1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する。腸神経堤系統マーカーの非限定的な例として、対合ボックス3(PAX3)、エンドセリン受容体B型(EDNRB)ならびにret proto癌遺伝子(RET)、対合様ホメオボックス2A(PHOX2A)、対合様ホメオボックス2B(PHOX2B)、神経栄養チロシンキナーゼ受容体タイプ3(NTRK-3)、achaete-scute複合体ホモログ1(ASCL1)、心臓および神経堤の発現誘導体2(HAND2)、ホメオボックスB3(HOXB3)、ホメオボックスB5(HOXB5)が挙げられる。
本開示の主題は、本明細書に記載されるin vitro分化方法によって生成された分化腸神経堤系統細胞(または「ENS前駆体」)集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載されるin vitro分化腸神経堤系統細胞(または「ENS前駆体」)から成熟した腸ニューロン集団を含む組成物を提供する。
1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するin vitro分化細胞(「幹細胞由来の腸神経堤(NC)前駆体」または「ENS前駆体」とも呼ばれる)は、腸神経系障害(ENS)を予防および/または処置するために使用され得る。in vitro分化ENS前駆体から成熟した腸ニューロンは、ENSを予防および/または処置するためにも使用され得る。本開示の主題は、ENS障害を予防および/または処置する方法であって、ENS障害に罹患している対象に、有効量の、以下:
(a)本明細書に記載される分化した本開示の幹細胞由来の腸NC前駆体(ENS前駆体)集団、
(b)このような幹細胞由来の腸NC前駆体(ENS前駆体)を含む組成物、
(c)本明細書に記載される本開示の幹細胞由来の腸NC前駆体(ENS前駆体)から成熟した腸ニューロン集団、および
(d)このような腸ニューロンを含む組成物
の1つまたは複数を投与するステップを含む、方法を提供する。
本開示の幹細胞由来の腸NC前駆体および/または成熟腸ニューロンは、ENS障害(例えば、HD)をモデル化し、疾患関連遊走欠損を克服することができる候補化合物をスクリーニングするためのプラットフォームとして働くことができる。ENS障害(例えば、HD)を軽減する候補化合物の能力は、ENS障害(例えば、HD)を引き起こす遺伝変異によって引き起こされた生理的欠損または細胞の欠損を救済する候補化合物の能力をアッセイすることによって決定され得る。本発明者らによるHD関連遊走欠損の救済におけるペプスタチンAおよびBACE2阻害の同定は、薬物発見における本開示の幹細胞由来の腸NC前駆体の使用についての概念証明となる。実施例1を参照されたい。
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の活性化因子、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する1種または複数の分子、および1種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書を含む。
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
6.1 実施例1
要約
ヒト多能性幹細胞(hPSC)からのENS前駆細胞の効率的な誘導および単離ならびに多様な神経伝達物質表現型の機能的腸ニューロンへのそれらのさらなる分化が、本明細書で示される。in vitro由来ENS前駆体は、以下に説明するように、発達中のニワトリ胚における標的化遊走およびマウス成体結腸の広範なコロニー形成の能力を示した。移植したhPSC由来ENS前駆体は遊走し、HDのマウスモデル(EDNRBs-l/s-l)の結腸に生着し、疾患関連死亡率の救済を誘発した。最後に、EDNRB突然変異ENS前駆体を確立することにより、HD関連遊走欠陥のモデリングならびに新しい候補治療薬としてのペプスタチンAおよび他のBACE阻害剤の識別を可能にした。本明細書で説明する研究は、ヒトENS発達研究のためのhPSCベースのプラットフォームを確立し、かつHDの処置のための新規細胞および薬物ベースの戦略を確立した。
hESCおよびhiPSC系の、NC細胞への分化は、dual SMAD阻害11およびCHIR99021媒介GSK3b阻害を介するWNTシグナル伝達活性化5に基づいてなされた。迷走神経/腸NC(ENC)を、NC誘導の間のRAの存在下で誘導した。ENC前駆体をさらに、非粘着性プレートにおける簡易的(4日間)3D培養ステップによりニューロンに分化させた(細胞1×105個/cm2)。GDNFおよびAAを含有するN2培地中で神経分化を行った。脳およびメラニン形成細胞偏向NC前駆体5、RA誘導ENC前駆体ならびに分化したニューロンを、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、qRT-PCRおよびRNAシークエンシングを使用する全遺伝子発現分析により特徴付けた。ENC前駆体のin vivo遊走機能を、HH14ステージの発達中のニワトリ胚における移植により査定し、24~36時間後に分析した。in vitro連結性研究のために、hESCを、アクチビンAおよびBMP4曝露ならびにTGFβでの処理13後に、SMCに分化させた。機能的アッセイを、H9-SYN::ChR2-YFP hES細胞から発生したENC由来ニューロンを450nmの光パルス(4ms、2~10Hz、2~4mW)で刺激することにより行った。分化したENC前駆体の、初代マウス腸組織との機能的相互作用を、マウス初代腸オルガノイド単位16をヒトhESC-ENC前駆体と共に再凝集させ、続いてNOD-scid IL2Rガンマnull(NSG)マウスに移植することによる、in vivo結腸組織工学アプローチを使用して評価した。in vivo遊走および分化研究のために、ENC前駆体を、成体盲腸(NSGまたはEDNRBs-l/s-lマウス)に正所性移植した。結腸組織を、全組織標本蛍光および組織学分析のために、様々な時点で回収した。CRISPR/Casベースの標的化により確立したEDNRB-/- hESC系由来のENC前駆体を使用して、Prestwick Chemical Library(登録商標)のハイスループットスクリーニングを、96ウェルフォーマットにおけるスクラッチアッセイを使用して行った。用量応答曲線および機械的研究を、スクリーニングからの一次ヒットであるペプスタチンAについて行った。BACE-2のBACE阻害剤IVおよびsiRNA媒介ノックダウンを、CD49D+ ENC前駆体について行った。別様に記載のない限り、データは平均値+/-SEMとして表し、少なくとも3回の独立した実験から得た。表1は、図の各々についての実験の詳細の短い説明を示す。
hESC系H9(WA-09)および誘導体(SOX10::GFP;SYN::ChR2-YFP;SYN::YFP;PHOX2B:GFP;EF1::RFP EDNRB-/-)ならびに2つの独立したhiPSC系(健康および家族性自律神経失調症、センダイベース、OMSK(Cytotune))を、以前に説明するように11、hESC培地を含有するKSR(Life Technologies、10828-028)中のマウス胚線維芽細胞(MEF、Global Stem、Rockville、MD)上で維持した。細胞を、1ヶ月間隔でマイコプラズマ試験に供し、STRプロファイルして、研究の開始時の細胞の同一性を確認した。
hESCを、10nM FGF2(R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するhESC培地中のマトリゲル(BD Biosciences、354234)コーティング皿にプレーティングした(細胞105個/cm2)。分化を、LDN193189(100nM Stemgent、Cambridge、MA)およびSB431542(10μM、Tocris、Ellisville、MI)を含有するノックアウト血清置換(KSR)培地(KO DMEM+15% KSR、L-グルタミン(Life Technologies、25030-081)、NEAA(Life Technologies、11140-050))中で開始させた。KSR培地を、以前に説明するように11、4日目~10日目まで増大する量のN2培地で徐々に置き換えた。脳NC(CNC)誘導のために、細胞を、2日目~11日目までLDNおよびSBに加えて3uM CHIR99021(Tocris Bioscience、4423)で処理した。腸NC(ENC)分化は、6日目~11日目までのレチノイン酸(10μM)での追加の処理を含んだ。メラニン形成細胞コンピテントNC(MNC)を得るために、LDNを、6日目~11日目まで、BMP4(10nM-、R&D、314bp)およびEDN3(10nM、American Peptide company、88-5-10B)で置き換えた5。分化した細胞を、11日目でCD49Dについて分類した。CNS前駆体対照細胞を、以前に説明するように11、0日目~11日目までのLDNおよびSMでの処理により発生させた。本文書全体を通して、0日目は、培地がhESC培地からLDNおよびSB含有培地に替えられた日である。本文および図中の分化の日は、多能性ステージ(0日目)以来の日数を指す。
IFのために、細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)(Affymetrix-USB、19943)で20分間固定し、その後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Thermo Scientific、23209)および0.3% triton X-100(Sigma、T8787)を使用してブロックおよび透過処理した。細胞をその後、一次抗体溶液中で4℃(摂氏)にて一晩インキュベートし、発蛍光団コンジュゲート二次抗体で室温にて1時間染色し、染色した細胞をその後、DAPI(1ng/ml、Sigma、D9542-5MG)とインキュベートし、数回洗浄し、その後画像化した。フローサイトメトリー分析のために、製造業者の使用説明書に従って、細胞をAccutase(Innovative Cell Technologies、AT104)で分離し、BD Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience、554722)溶液を使用して固定および透過処理し、その後洗浄し、BD Perm/Wash緩衝液(BD Bioscience、554723)を使用してブロックおよび透過処理した。細胞をその後、一次(4で一晩)および二次(室温で30分間)抗体で染色し、flow Cytometer(Flowjoソフトウェア)を使用して分析した。一次抗体および作業希釈液のリストを、表2に示す。PHOX2A抗体は、J-F Brunet博士により寄贈された(ウサギ、1:800希釈)。
受精卵(Charles River飼育場から)を、注射前に、37で50時間インキュベートした。2×105個のCD49D分類RFP標識NC細胞を、体節2と6との間の領域を標的化して胚の迷走神経領域の体節間空間に注射した(HH14胚、20~25体節ステージ)。胚を36時間後に、全組織標本落射蛍光および組織学分析のために回収した。
RNAシークエンシングのために、全RNAを、RNeasy RNA精製キット(Qiagen、74106)を使用して抽出した。qRT-PCRアッセイのために、全RNA試料を、Superscript II逆転写酵素(Life Technologies、18064-014)を使用してcDNAに逆転写した。qRT-PCR反応を、QuantiTect SYBR Green PCRミックス(Qiagen、204148)を使用して設定した。各データ点は、3つの独立した生物学的繰返しを表す。
ENC細胞を、Ultra Low Attachment 6ウェル培養プレート(Fisher Scientific、3471)中の3Dスフェロイド(細胞500万個/ウェル)に凝集させ、CHIR(3uM、Tocris Bioscience、4423)およびFGF2(10nM、R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で培養した。4日間の懸濁培養後、スフェロイドを、GDNF(25ng/ml、Peprotech、450-10)およびアスコルビン酸(100uM、Sigma、A8960-5G)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中の、ポリオルニチン/ラミニン/フィブロネクチン(PO/LM/FN)コーティング皿(以前に説明するように38調製した)上にプレーティングした。ENC前駆体は、プレーティングしたスフェロイドから遊走し、1~2週間でニューロンに分化した。細胞を、分化25日目、40日目および60日目に免疫染色のために固定するか、または遺伝子発現分析のために回収した。
中胚葉の指定を、STEMPRO-34(Gibco、10639-011)培地中で行った。hESCを、アクチビンA処理(100ng/ml、R&D、338-AC-010)に24時間、続いてBMP4処理(10ng/ml、R&D、314-bp)に4日間供した13。細胞をその後、PDGF-BB(5ng/ml、Peprotech、100-14B)、TGFb3(5ng/ml、R&D systems、243-B3-200)および10% FBSでの処理によりSMC前駆細胞に分化させた。SMC前駆細胞は、10% FBSで補充したDMEM中で拡張可能であった。
SMC前駆細胞を、ENC由来ニューロンの添加3日前に、PO/LM/FNコーティング培養皿(以前に説明するように38調製した)上にプレーティングした。ニューロンを、分化30日目に(accutase、Innovative Cell Technologies、AT104を使用して)分離し、SMC単層培養物上にプレーティングした。培養物を、GDNF(25ng/ml、Peprotech、450-10)およびアスコルビン酸(100uM、Sigma、A8960-5G)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で維持した。機能的連結性を、共培養8~16週間で査定した。
SMCのみおよびSMC-ENC由来ニューロン共培養物を、共培養開始3ヶ月後に、塩化アセチルコリン(50μM、Sigma、A6625)、塩化カルバモイルコリン(10μM、Sigma、C4382)およびKCl(55mM、Fisher scientific、BP366-500)処理に供した。光遺伝学的刺激を、450nmのピグテールダイオードポンプ式固体レーザー(OEMレーザー、PSU-III LED、OEM Laser Systems,Inc)を使用して2~4mW/mm2の照度を達成して行った。パルス幅は4msであり、刺激周波数は2~10Hzの範囲であった。動きの定量のために、Metamorphソフトウェアを使用して、画像を積み重ね、高コントラストを有する領域を特定した(図8で黄色標識されている)。1フィールド当たり5つの代表的な高コントラスト領域の動きを自動的にトレースした(Metamorphソフトウェア)。データを、以前のフレームについて、xおよびy方向のピクセルでの動き(距離)としてキネトグラムで示す。動きの自動トレーシングはときには、2倍を超える動きの増大を有する培養物における最も強い動きを捕えなかった。それゆえ、これらのデータは、部分的に実際の動きを低く見積もっている場合がある。
以前に説明した方法を、TECの発生のために使用した16。簡単に説明すると、ドナー結腸組織を回収し、ディスパーゼ(Life Technologies、17105-041)およびコラゲナーゼ1型(Worthington社、CLS-1)を使用してオルガノイド単位に消化した。オルガノイド単位をその後、CD49D精製hESC由来ENC前駆体(分化15日目)と即座に(任意のin vitro培養物を伴わずに)混合し、ポリ-Lラクチド(PLLA)(Durect Corporation)を伴う2mmの長さの管の形状にした生分解性ポリグリコール酸スキャフォールド(2mmシート厚、60mg cm-3バルク密度;多孔性>95%、Concordia Fibers、Coventry RI)上に播種した。播種したスキャフォールドをその後、成体(>2ヶ月齢)NSGマウスの大網上に置き、かつその中に包んだ。移植の直前、これらのマウスを、350cGYで照射した。播種したスキャフォールドを、追加の4週間、網内で結腸様構造に分化させ、その後、それらを組織分析のために外科的に除去した。
全てのマウス手技は、NIHガイドラインに従って行い、現地の動物実験委員会(IACUC:Institutional Animal Care and Use Committee)、インスティテューショナルバイオセイフティ委員会(IBC:Institutional Biosafety Committee)および胚性幹細胞研究委員会(ESCRO:Embryonic Stem Cell Research Committee)により承認された。3~6週齢の雄のNSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウスまたは2~3週齢のEDNRBs-l/s-l(SSL/LeJ)マウス39(n=12、雄6匹、雌6匹)を、これらの研究に使用した。動物数は、ホモ接合のホストの入手可能性および処理対対照(EDNRBs-l/s-l)の間の大きな効果を検出するために、ならびに遊走挙動(NSG)の強固さを示すために十分な統計力に基づくものであった。動物を様々な処理パラダイム(NSGおよびEDNRBs-l/s-l)についてランダムに選択したが、各群(EDNRBs-l/s-l)内の雄/雌比の等しい分布を確実にした。動物を、手技全体を通してイソフルラン(1%)で麻酔し、腹部小切開を行い、腹壁筋系を持ち上げ、盲腸を露出し、外に出した。盲腸を湿潤に維持するために温かい生理食塩水を使用した。PBS中の70%マトリゲル(BD Biosciences、354234)中の20μlの細胞懸濁液(200~400万個のRFP+ CD49D精製hESC由来ENC前駆体)または20μlのPBS中の70%マトリゲルのみ(対照グラフト動物)を、27ゲージの針を使用して盲腸に(筋層を標的化して)ゆっくりと注射した。細胞注射のための担体としての70%マトリゲルの使用は、細胞が注射後に原位置に留まることを確実にし、かつ腹膜への逆流を防いだ。注射後、その針を引き抜き、注射部位の上にQチップを30秒間置いて出血を防いだ。盲腸を腹腔に戻し、腹壁を、4~0バイクリルおよび先細針を使用して結節縫合パターンで閉鎖し、皮膚を、滅菌創傷クリップを使用して閉鎖した。創傷閉鎖後、動物を床敷の上の紙上に置き、意識が回復するまで、好ましくは飲食するまで立ち会った。組織学分析のために、組織を移植後の様々な時点(2週間~4ヶ月の範囲)で回収した。EDNRBs-l/s-lマウスを、毎日のシクロスポリン注射(10mg/kg i.p.、Sigma、30024)により免疫抑制した。
回収した結腸試料を、4% PFA中で4℃にて一晩固定し、その後画像化した。画像化を、Maestro蛍光画像化システム(Biotechniques)を使用して行った。組織試料を、30%ショ糖(Fisher Scientific、BP220-1)溶液中で4℃にて2日間インキュベートし、その後、OCT(Fisher Scientific、NC9638938)中に包埋し、凍結切片にした。切片をその後、1% BSA(Thermo Scientific、23209)でブロックし、0.3% Triton X-100(Sigma、T8787)で透過処理した。切片をその後、一次抗体溶液で4℃にて一晩、および発蛍光団コンジュゲート二次抗体溶液で室温にて30分間染色した。染色した切片をその後、DAPI(1ng/ml、Sigma、D9542-5MG)とインキュベートし、数回洗浄した後、それらをVectashield Mounting Medium(vector、H1200)で封入し、蛍光顕微鏡(Olympus IX70)または共焦点顕微鏡(Zeiss SP5)を使用して画像化した。
マウスに、24番先端丸形給餌針を使用して、6%カーミン(Sigma、C1022-5G)、0.5%メチルセルロース(Sigma、274429-5G)および0.9
NaClを含有する0.3mlの染料溶液を胃管栄養で与えた。吐き戻しを防ぐために胃管栄養後、針を数秒間マウス食道内に保持した。1時間後、胃管栄養マウスについて糞便の色を10分毎にモニターした。各マウスについて、GI総通過時間は、胃管栄養時~赤い糞便が観察された時間であった。
二重ニッカーゼCRISPR/Cas9システム40を、EF1::RFP H9 hESCのEDNRB遺伝子座を標的化するために使用した。約20bp離れたPAM標的を有するコード配列を標的化するために、2つのガイドRNAを(CRISPR設計ツール、http://crispr.mit.edu/を使用して)設計した(qRNA1番標的特異的配列:AAGTCTGTGCGGACGCGCCCTGG[配列番号1]、RNA2番標的特異的配列:CCAGATCCGCGACAGGCCGCAGG[配列番号2])。細胞に、gRNA構築物およびGFP融合Cas9-D10Aニッカーゼをトランスフェクトした。GFP発現細胞を24時間後にFACS精製し、MEF上に低密度(細胞150個/cm2)でプレーティングした。コロニーを7日後に採取し、2回継代した後ゲノムDNAを単離し、スクリーニングした。EDNRB遺伝子の標的化領域をPCR増幅し(フォワードプライマー:ACGCCTTCTGGAGCAGGTAG[配列番号3]、リバースプライマー:GTCAGGCGGGAAGCCTCTCT[配列番号4])、Zero Blunt TOPOベクター(Invitrogen、450245)にクローニングした。両対立遺伝子(各hESCコロニーからの)が表され、シークエンスされることを確実にするために、10個の細菌クローン(各hESCクローンについて)をプラスミド精製および続くシークエンシングに選択した。二対立遺伝子ナンセンス突然変異を有するクローンを拡張させ、フォローアップアッセイのために分化させた。
ENC細胞を、PO/LM/FNコーティングした(以前に説明するように38調製した)96ウェルまたは48ウェル培養プレート上にプレーティングした(30,000/cm2)。24時間後、ピペット先端を使用して手作業で培養菌叢をスクラッチした。細胞に追加の24~48時間を与えて、スクラッチエリアに遊走させ、画像化および定量のために固定した。定量は、遊走期間後にスクラッチエリアに位置する核のパーセンテージに基づいてなされた。スクラッチエリアを、スクラッチング直後に固定した参照ウェルを使用して規定した。オープンソースデータ分析ソフトウェアKNIME41(http://knime.org)を使用して、他で詳述される42「Quantification in ROI」プラグインで、細胞の遊走を定量した。
増殖を定量するために、FACS精製ENC細胞を、CyQUANT NF細胞増殖アッセイキット(Life Technologies社、C35006)を使用して製造業者の使用説明書に従ってアッセイした。簡単に説明すると、標準を発生させるために、細胞を様々な密度でプレーティングし、蛍光DNA結合染料試薬を使用して染色した。総蛍光強度をその後、プレートリーダー(485nmで励起および530nmで発光検出)を使用して測定した。直線範囲を決定した後、CD49D+ WTおよびEDNRB-/- ENC前駆体をプレーティングし(細胞6000個/cm2)、0、24、48および72時間でアッセイした。アッセイ中、細胞を、CHIR(3uM、Tocris Bioscience、4423)およびFGF2(10nM、R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で培養した。
WTおよびEDNRB-/- ENC前駆体の生存能をモニターするために、細胞を、CytoTox 96細胞毒性アッセイキット(Promega、G1780)を使用してLDH活性についてアッセイした。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに30,000個/cm2でプレーティングした。上清および細胞溶解物を24時間後に回収し、プレートリーダー(490nm吸光度)を使用してLDH活性についてアッセイした。生存能を、溶解物のLDHシグナルを(溶解物+上清からの)LDHシグナルの合計で割ることにより計算した。アッセイ中、細胞を、CHIR(3μM、Tocris Bioscience、4423)およびFGF2(10nM、R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で培養した。
化学化合物スクリーニングを、Prestwick Chemical Library(登録商標)を使用して行った。ENC細胞を、96ウェルプレートにプレーティングし(30,000個/cm2)、化合物の添加24時間前に手作業でスクラッチした。細胞を2つの濃度の化合物(10μMおよび1μM)で処理した。プレートをプレート全体の画像化のために24時間後に固定した。化合物を、24時間でスクラッチの充填を促進するそれらの能力に基づいてスコア付けした。毒性効果(DAPI染色により査定される細胞数における劇的な低減に基づく)を示した化合物を0とスコア付けし、効果を有しない化合物を1とスコア付けし、中程度の効果を有する化合物を2とスコア付けし、強い効果を有する(スクラッチエリアの完全な充填をもたらした)化合物を3とスコア付けし、ヒット化合物として特定した。ヒットをさらに、再現性を確実にするために確証した。細胞を、用量応答分析のために様々な濃度の選択したヒット化合物(ペプスタチンA)で処理した。最適用量(最適応答および生存能に基づいて10μM)を、フォローアップ実験に使用した。前処理実験のために、細胞を、11日目でCD49D精製し、12日目~15日目までペプスタチンAで処理し、続いてNSGマウスの結腸壁に移植した。アッセイ中、細胞を、CHIR(3uM、Tocris Bioscience、4423)およびFGF2(10nM、R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で培養した。
BACE2を阻害するために、ENC前駆体を、1μM β-セクレターゼ阻害剤IV(CAS 797035-11-1 - Calbiochem)で処理した。BACE2をノックダウンするために、細胞を、accutase(Innovative Cell Technologies、AT104)を使用して分離し、siRNAプール(SMARTpool:ON-TARGETplus BACE2 siRNA、Dharmacon、L-003802-00-0005)または4つの異なる個々のsiRNA(Dharmacon、LQ-003802-00-0002 2nmol)を(リポフェクタミンRNAiMAX-Life Technologies、13778-150を使用して)逆トランスフェクトした。ノックダウンを、対照siRNAプール(ON-TARGETplus非標的化プール、Dharmacon、D-001810-10-05)に対する、BACE2 siRNAをトランスフェクトした細胞におけるBACE2 mRNAレベルのqRT-PCR測定により確認した。トランスフェクトした細胞を、プレーティング24時間後にスクラッチし、遊走定量のために48時間後に固定した。アッセイ中、細胞を、CHIR(3uM、Tocris Bioscience、4423)およびFGF2(10nM、R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含有するL-グルタミン(Gibco、25030-164)、N2(Stem Cell Technologies、07156)およびB27(Life Technologies、17504044)で補充したNeurobasal(NB)培地中で培養した。
データは、平均値±SEMとして示され、少なくとも3回の独立した実験から得た。繰返し(n)に基づくデータを、図の凡例および表1に示す。統計分析を、スチューデントt検定(2つの群を比較する)またはダネット検定によるANOVA(対照に対して多数の群を比較する)を使用して行った。生データの分布は、正規性について試験するために十分な数の繰返しを有するデータについての正常分布(コルモゴロフスミルノフ正規性検定)に近似した。ログランク(マンテル-コックス)検定を使用して生存分析を行った。一次ヒットについてのZスコアを、Z=(x-μ)/σとして計算した。xは、遊走スコア値であり、全てのヒット化合物について3である。μは平均遊走スコア値であり、σは全ての化合物およびDMSO対照についての標準偏差である(n=224)。
現在のNC分化プロトコール4、5は、HOX陰性(前部/脳の同一性を示す;脳NC(CNC))であるSOX10+ NC前駆体をもたらし、主に感覚ニューロンおよび侵害受容性ニューロンを生じる。対照的に、迷走神経NCの同一性(identity)は、HOXB38およびHOXB59を含む特異的な領域限定HOX遺伝子の発現により特徴付けられる。レチノイン酸(RA)は、以前に、例えば運動ニューロンの指定中に、CNS前駆体の領域の同一性を前部から、より尾部の宿命へとシフトするための外因性因子として使用されている10。本発明者らは、RAの添加がNC系統の領域の同一性を同様に方向付け、迷走神経マーカーの発現を誘導することができるかどうかを試験した(図1A)。RA曝露に際して、Sox10::GFP+ NC前駆体は、CNC条件に匹敵する収率で得られ、RA処理が全体的なNC誘導を妨害しないことを示した(図1B、図2B)。様々なhPSC系にわたる純粋なNC集団の単離を容易にするために、候補表面マーカースクリーニングを行い、CD49D(α4-インテグリン)を初期SOX10+ NC系統を確実に特徴付ける(図1Bb、図2A~2C)エピトープとして特定した。CD49Dを、追加のhPSC系(ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の両方)についてRAの存在下でのNC誘導を確証し、強固さを確認するためのマーカーとして使用した(図2D)。RAの存在下で得た、精製CD49D+ NC前駆体は、迷走神経の同一性8、9を示すHOXB2~B5を発現したが、より尾部のHOX転写産物、例えばHOXB9は発現しなかった(図1C)。迷走神経の同一性とさらに一致して、CD49D+、RA処理NC前駆体は、PAX3、EDNRBおよびRETを含む初期腸NC(ENC)系統3のマーカーを発現した(図1Dd、図2Eおよび2F)。ヒト腸NC発達についての発達データの不足のために、hESC由来腸NC前駆体における、脳NC(CNC)(RAなし)における、およびメラニン形成細胞偏向NC(MNC)における(図2A)、ならびに同等のステージのCNS前駆体11における全遺伝子発現プロファイルを規定するためにRNAseq分析を行った。教師なしクラスタリングおよび主構成成分分析は、全てのhPSC由来NC集団のトランスクリプトームをCNS系統細胞から確実に隔離し(図1E)、さらに様々なNCサブ系統に分類した(図1Eおよび1F)。CNS系統と比較してENCにおいて最も差次的に発現した遺伝子は、一般的なNCマーカー、例えばFOXD3またはTFAP2Aを含んだが、また、PAX3およびHOX遺伝子はENC系統に特異的に関連した(図1G)。また、CNCおよびMNCは、一般的なNCマーカーを多く含んだが、それぞれ、それらのNCサブタイプの同一性と適合する、高レベルのNEUROG1、ISL1またはMLANA、TYR、DCT発現を示した(図2Gおよび2H)。様々なNC系統の直接比較は、ヒト迷走神経NC/ENC系統の新規候補マーカーをもたらした(図1G)。NC系統の各々について上位200個の最も富化された転写産物のリストを、表3~5として示す。生のRNAseqデータは、GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/アクセス番号:GSE66148)で入手可能である。
この実施例で説明した研究は、ヒトESCから腸NC前駆体を誘導し、将来的に精製する効率的な戦略を説明する。モデル生物における研究と一致して1、3、hESC由来腸NCは、ENSに特徴的な広範囲の神経伝達物質表現型を生じることが示された。ENSにおけるかかる著しいニューロンサブタイプ多様性は、それぞれ、主にグルタミン酸作動性、カテコールアミン作動性またはコリン作動性ニューロンを発生する感覚、交感神経または副交感神経PNS系統から区別される。in vitroでのヒトENS発達をモデリングすることができれば、いかなる他のヒト細胞供給源からも現在利用可能でない技術である、規定されたヒト腸ニューロンサブタイプの大スケール生成が可能になるはずである。例えば、hPSC由来腸5HT-ニューロンは、CNS作用薬、例えばProzacのGI副作用をモデリングするためのツールとして働き得る33。
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