TWI579379B

TWI579379B - 藉由調節ｍｉｒ－１２４來將幹細胞分化的方法

Info

Publication number: TWI579379B
Application number: TW103117136A
Authority: TW
Inventors: 李昭男; 李東穎; 李育達
Original assignee: 加速生物科學有限公司
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2017-04-21
Also published as: TW201542818A

Description

藉由調節MIR-124來將幹細胞分化的方法

本發明是有關於藉由調節miR-124來將幹細胞分化的方法。

在囊胚形成(gastrulation)期間，外胚層細胞(epiblast cells)生成原條中內胚層(primitive streak mesendoderm)，繼而3個胚層(germ layers)[包括定型內胚層(definitive endoderm,DE)]。DE分化成原始內胚層(primitive endoderm)，腹側與背側胰芽(ventral and dorsal pancreatic buds)由此發育成胰臟(pancreas)。前驅的人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cell,hES cell)研究已激起經由DE特化來產生葡萄糖-感測的與胰島素-分泌的β-細胞以供治療第1型糖尿病(type 1 diabetes)之願景。然而，當前的hES細胞研究途徑是耗時與複雜的。

發明概要

全部公開案、專利案以及專利申請案在此以參考相同範圍而被併入，如同各個個別的公開案、專利案或專利申請案被特定地以及個別地指明要被併入以作為參考資料。如果此處的一術語與一被併入的參考資料中的一術語之間發生一衝突，此處的術語支配。

於本發明的此概要中所提供的發明具體例僅被意欲為例示性以及提供此處所揭露的選擇性具體例的一概述。本發明的概要，是例示性以及選擇性的，未限制任何申請專利範圍的範疇，未提供此處所揭露或所預期的發明具體例的全部範疇，以及不應被解讀為限制或束縛此揭露內容或任何所請求的發明具體例的範疇。

在許多方面中的一者，此處所提供的是一種將一哺乳動物滋養層幹細胞(mammalian trophoblast stem cell)分化的分法，其包含有：調節miR-124以誘導該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為一經分化的細胞。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞(human trophoblast stem cell,hTS cell)。在一個實例中，此處的哺乳動物滋養層幹細胞是來自於一嚙齒類(rodent)(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，該經分化的細胞是一祖細胞(progenitor cell)，例如，一胰臟祖細胞(pancreatic progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一內胚層、中胚層或外胚層祖細胞(endodermal,mesodermal,or ectodermal progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一定型內胚層祖細胞(definitive endoderm progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰臟內胚層祖細胞(pancreatic endoderm progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一多潛能祖細胞(multipotent progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一寡潛能祖細胞(oligopotent progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一單潛能、雙潛能或三潛能祖細胞(monopotent,bipotent,or tripotent progenitor cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一內分泌、外分泌或導管祖細胞(endocrine,exocrine,or duct progenitor cell)，例如，一內分泌祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一β-細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰島素-生成細胞(insulin-producing cell)。一或多種經分化的細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。在某些具體例中，該調節活化miR-124(the modulating activates miR-124)。在一個實例中，該調節於一定型內胚層階段時空地(例如，介於大約1小時至大約8小時之間)活化miR-124。在一個實例中，該調節提高miR-124表現。在一個實例中，該調節去活化miR-124。在一個實例中，該調節減少miR-124表現。在一個實例中，該調節包含有令該該哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種試劑[例如，蛋白質或類固醇激素(steroid hormone)]接觸。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一生長因子(growth factor)，例如，一纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)。在一個實例中，該 FGF是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10。在一個實例中，該一或多種試劑包含有FGF2[鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)]。在一個實例中，此處的bFGF的濃度沒有大於大約100ng/mL(例如，從大約1至大約100ng/mL)。在一個實例中，此處的bFGF的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100ng/mL。在一個實例中，此處的bFGF的濃度是大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在一個實例中，該一或多種試劑進一步包含有一抗氧化劑(antioxidant)或還原劑(reducing agent)，例如，2-巰乙醇(2-mercaptoethanol)。在一個實例中，2-巰乙醇的濃度沒有大於大約10mmol/L，例如，從大約0.1至大約10mmol/L。在一個實例中，2-巰乙醇的濃度是大約從0.1至1、1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9或9至10mmol/L。在一個實例中，2-巰乙醇的濃度是大約0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在一個實例中，該一或多種試劑進一步包含有一維生素(vitamin)，例如，菸鹼醯胺(nicotinamide)。在一個實例中，菸鹼醯胺的濃度沒有大於大約100mmol/L，例如，從大約1至大約100mmol/L。在一個實例中，菸鹼醯胺的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50 、50至60、50至70、80至90或90至100mmol/L。在一個實例中，菸鹼醯胺的濃度是大約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一個實例中，該調節包含有令該哺乳動物滋養層幹細胞與bFGF、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺接觸。在一個實例中，該一或多種試劑調控cAMP反應要素結合蛋白1(cAMP responsive element binding protein 1,CREB1)的活性或表現位準。在一個實例中，該一或多種試劑調控CREB1磷酸化。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一維生素代謝物(vitamin metabolite)，例如，視黃酸(retinoic acid)。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一CREB1-結合蛋白質(CREB1-binding protein)。在一個實例中，該一或多種試劑調控一或多種因子(其包含有mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3 β)。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一外源性miR-124前驅物(exogenous miR-124 precursor)或一外源性抗-miR-124(exogenous anti-miR-124)。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被轉染以該外源性miR-124前驅物或該外源性抗-miR-124。在一個實例中，miR-124的啟動子之順-調控要素(cis-regulatory element,CRE)TGACGTCA被調節。在一個實例中，該miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e。在一個實例中，該miR-124是miR-124a，例如，智慧人miR-124a(homo sapiens miR-124a,hsa-miR-124a)。在一個實例中，該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或它的一片段。在一個實例中，該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段。在一個實例中，該miR-124包含有一選自於表1以及表2中的序列或它的一片段。在一個實例中，在該調節開始之後的一天內該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為該經分化的細胞。

在一個方面，此處所提供的是一或多種從此處的一或多種方法中所分離出的經分化的細胞。在一個實例中，該經分離的經分化之細胞具有一正常的核型(karyotype)。在一個實例中，該經分離的經分化之細胞具有一或多種免疫-豁免的特性(immune-privileged characteristics)，例如，低的或缺少的CD33表現和/或CD133表現。此處所揭露的一或多種經分離的經分化之細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在另一個方面，此處所提供的是一種經分離的祖細胞，其表現一或多種轉錄因子(包含有Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ptf1a、Nkx6.1或它的任何組合)。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一經誘導的多潛能幹細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是衍生自一哺乳動物滋養層幹細胞，例如，一hTS細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一內胚層、中胚層或外胚層祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一定型內胚層祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰臟內胚層祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一多潛能祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一寡潛能祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一單潛能、雙潛能或三潛能祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一內分泌、外分泌或導管祖細胞，例如，一內分泌祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一β-細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰島素-生成細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是來自於嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一人類細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一正常的核型。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一或多種免疫-豁免的特性，例如，低的或缺少的CD33表現和/或CD133表現。此處所揭露的一經分離的祖細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在另一個方面，此處所提供的是一種經分離的祖細胞，其表現β滋養因子(betatrophin)、β滋養因子mRNA、C-胜肽(C-peptide)或胰島素，其中該經分離的祖細胞是分化自一哺乳動物滋養層幹細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是來自於嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一人類細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一正常的核型。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一或多種免疫-豁免的特性，例如，低的或缺少的CD33表現和/或CD133表現。此處所揭露的一或多種經分離的祖細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在一個實例中，此處的一經分離的祖細胞是一胰島素-生成細胞。此處的一或多種經分離的祖細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在一個實例中，此處的一經分化的細胞是一胰島素-生成細胞。此處的一或多種經分化的細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在一個方面，此處所提供的是一種篩選一供用於治療或預防一疾病之物質的方法，其包含有：(a)令此處的至少一經分離的祖細胞與該物質接觸；以及(b)偵測在該經分離的祖細胞中至少一轉錄本或蛋白質的位準上的一改變。在一個實例中，當相較於一沒有被接觸以該物質之對應的經分離的祖細胞，在該經分離的祖細胞中至少一轉錄本或蛋白質的位準減少。在一個實例中，當相較於一沒有被接觸以該物質之對應的經分離的祖細胞，在該經分離的祖細胞中至少一轉錄本或蛋白質的位準增加。在一個實例中，該疾病是一胰島素疾病(insulin disorder)。在一個實例中，該疾病是糖尿病(diabetes)，例如，第一型糖尿病(Type 1 diabetes)或第二型糖尿病(Type 2 diabetes)。

在一個方面，此處所提供的是一種篩選一具有細胞毒性(cellular toxicity)或用於調節一細胞之物質的方法，該方法包含有：(a)令此處的至少一經分離的祖細胞與該物質接觸；(b)偵測在該經分離的祖細胞中起因於與該物質接觸之一表現型和/或代謝的改變；以及(c)建立該改變與細胞毒性或調節的相關性。在一個實例中，該細胞是一胰島素-生成細胞。在一個實例中，該物質是一藥物。在一個實例中，該物質是一化學品。在一個實例中，該物質是一抗體或它的片段。在一個實例中，該物質被添加至該培養基中。在一個實例中，該方法包含有測定該物質在該經分離的祖細胞的生長上的效用。在一個實例中，該方法包含有偵測該物質是否影響由該經分離的祖細胞的一標記或受體的表現。在某些具體例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。

在一個方面，此處所提供的是一種治療或預防在一需要它的哺乳動物中的一疾病的方法，其包含有將此處的一經分離的祖細胞投藥至需要它的哺乳動物。在一個實例中，該經分離的祖細胞是經免疫豁免的。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有低位準的CD33表現和/或CD133表現。在一個實例中，該投藥包含有注射(injecting)、植入(implanting)或外科手術(surgical operation)。在一個實例中，該疾病是一胰島素疾病。在一個實例中，該疾病是糖尿病，例如，第一型糖尿病或第二型糖尿病。在一個實例中，該需要它的哺乳動物是一小鼠、大鼠、豬、狗、猴子、紅毛猩猩、人猿或人類。在一個實例中，該需要它的哺乳動物具有一或多種與糖尿病有關聯的症狀[例如，多尿症(polyuria)(頻繁的排尿)、多渴症(polydipsia)(增加的口渴)、多食症(polyphagia)(增加的飢餓)、體重減少(weight loss)、視覺模糊(blurred vision)、瘙癢(itchiness)、周圍神經系病(peripheral neuropathy)、復發性陰道感染(recurrent vaginal infections)、疲勞(fatigue)、傷口或瘡的癒合慢(slow healing of wounds or sores)，以及它們的任何組合。在某些具體例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。

在一個方面，此處所提供的是一種生產胰島素的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種用來活化miR-124的試劑接觸，藉此產生一對葡萄糖刺激反應而分泌胰島素的經分離的祖細胞。在另一個方面，此處所提供的是一種生產β滋養因子蛋白質和/或β滋養因子mRNA的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種用來活化miR-124的試劑接觸，藉此產生一生產β滋養因子蛋白質和/或β滋養因子mRNA的胰臟祖細胞。在一個實例中，該β滋養因子蛋白質或β滋養因子mRNA是在誘導之後的大約12-28小時之間(例如，在誘導之後的大約12-16、16-20、20-24或24-28小時)被生產。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞生產C-胜肽和/或胰島素。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於嚙齒類、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或人猿。在某些具體例中，此處的一嚙齒類是一小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠。在某些具體例中，此處的一人猿是黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩。在某些具體例中，該miR-124是在一定型內胚層階段被時空地(例如，在定型內胚層階段的大約1小時至大約8小時之間)活化。在某些具體例中，該miR-124的表現被提高。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一蛋白質或類固醇激素，例如，一生長因子。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一FGF，例如，FGF1、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10。在某些具體例中，bFGF沒有大於大約100ng/mL，例如，從大約1至大約100ng/mL。在某些具體例中，此處所使用的bFGF的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100ng/mL。在某些具體例中，此處所使用的bFGF的濃度是大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在某些具體例中，bFGF是大約10ng/mL。在某些具體例中，該一或多種試劑進一步包含有一抗氧化劑或還原劑，例如，2-巰乙醇。在某些具體例中，該一或多種試劑進一步包含有一維生素，例如，菸鹼醯胺。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被接觸以bFGF、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺。在某些具體例中，2-巰乙醇的濃度沒有大於大約10mmol/L，例如，從大約0.1至大約10mmol/L。在某些具體例中，2-巰乙醇的濃度是大約從0.1至1、1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9或9至10mmol/L。在某些具體例中，2-巰乙醇的濃度是大約0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在某些具體例中，2-巰乙醇是大約1mmol/L。在某些具體例中，菸鹼醯胺的濃度沒有大於大約100mmol/L，例如，從大約1至大約100mmol/L。在某些具體例中，菸鹼醯胺的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100mmol/L。在某些具體例中，菸鹼醯胺的濃度是大約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在某些具體例中，菸鹼醯胺是大約10mmol/L。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被接觸以一或多種試劑來調控cAMP反應要素結合蛋白1(CREB1)的活性或表現位準，例如，CREB1磷酸化。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一維生素代謝物，例如，視黃酸。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一CREB1-結合蛋白質。在某些具體例中，該一或多種試劑調控一或多種選自於下列所構成的群組中之因子：mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2以及GSK3 β。在某些具體例中，此處的miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e，例如，miR-124a。在某些具體例中，該miR-124a是智慧人miR-124a(hsa-miR-124a)，例如，hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段。在某些具體例中，該miR-124包含有一選自於表1以及表2中的序列或它的一片段。

發明的詳細說明

一或多種發明具體例的細節被描述於隨文檢附的圖式、申請專利範圍以及本發明的說明中。除非被明確地排除，本發明所揭露與所預期的發明具體例的其他特徵、目的以及優點可被組合以任何其他具體例。

術語“調節(modulate)”以及“調節(modulation)”意指在細胞活性(例如，細胞生長或分化)上直接或間接地誘導或誘發、一增加或一減少、一刺激、抑制、干擾或阻斷，例如：誘導或誘發一哺乳動物滋養層幹細胞成為一經分化的細胞(例如，一胰臟祖細胞)。

術語“試劑(agent)”意指一供用於細胞生長與分化(例如，一哺乳動物滋養層幹細胞的分化)的化合物，例如，一生物分子或一化學品。試劑的實例包括，但不限於：生長因子[例如，纖維母細胞生長因子(FGF)]、抗氧化劑/還原劑(例如，2-巰乙醇)、維生素(例如，菸鹼醯胺)與它們的代謝物(例如，視黃酸)、核酸[例如，RNA或DNA(例如微RNA)]、激素、胜肽以及蛋白質(例如，CREB1-結合蛋白質)。生長因子的實例可包括FGF1、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9以及FGF10。更多抗氧化劑的實例可包括2-巰乙醇(2-ME)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)以及三(2-羧乙基)膦 [tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP]。維生素的實例可包括維生素A、維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9或B12、維生素C、維生素D、維生素E以及維生素K。在某些具體例中，此處的一試劑調節cAMP反應要素結合蛋白1(CREB1)的活性或表現位準(例如，CREB1磷酸化)。在某些具體例中，此處的一試劑活化miR124。在某些具體例中，此處的一試劑調節一或多種轉錄因子，例如，mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3 β。

術語“藥物(drug)”被意欲包括具有用於治療性和/或診斷性和/或預防性目的之效用的化合物，例如，治療性、診斷性或預防性化合物。治療性化合物(therapeutic compound)包括，例如：抗生素(antibiotics)、抗病毒劑(antivirals)、抗真菌劑(antifungals)、抗-血管生成劑(anti-angiogenics)、鎮痛劑(analgesics)、麻醉劑(anesthetics)、抗-發炎劑(anti-inflammatory agents)[包括類固醇的與非-類固醇的抗-發炎劑(non-steroidal anti-inflammatories,NSAIDs)]、皮質類固醇(corticosteroids)、抗組織胺(antihistamines)、散瞳劑(mydriatics)、抗贅生劑(antineoplastics)、免疫抑制劑(immunosuppressive agents)、抗-過敏劑(anti-allergic agents)、基質金屬蛋白酶抑制劑(metalloproteinase inhibitors)、基質金屬蛋白酶的組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)、抑制劑或拮抗劑(antagonists)或內感受器(intraceptors)、受體拮抗劑(receptor antagonists)、RNA適合體(RNA aptamers)、抗體或它的片段、羥胺酸(hydroxamic acids)以及大環抗-琥珀酸異羥肟酸衍生物(macrocyclic anti-succinate hydroxamate derivatives)、核酸(nucleic acids)、質體(plasmids)、siRNAs、疫苗、DNA結合(小凹槽)化合物[DNA binding(minor groove)compounds]、激素、維生素、蛋白質、胜肽、多肽以及似-胜肽治療劑(peptide-like therapeutic agents)。診斷性化合物包括，例如：染劑(dyes)、對比劑(contrast agents)、螢光劑(fluorescent agents)、放射性同位素(radioisotopes)(例如，P-32、Tc-99、F-18、I-131)以及類似之物，它們在疾病、病況、症候群或它們的症狀之診斷上是有用的。在一疾病、病況、症候群或症狀的檢測之前而被投藥的一治療性化合物是一預防性化合物。

如此處所使用的，除非另外有所指明，開放式術語，諸如“含有(contain)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(including)”以及類似者意指“包含有(comprising)”。

此處的某些具體例預期數值範圍。當一數值範圍被提供時，該範圍包括範圍端點。數值範圍包括全部數值以及在其內的子範圍，有如明確地被寫出。

如此處所使用的，術語“大約(about)”意指±15%。例如，術語“大約10”包括8.5至11.5。

除非另外被明確地說明，如此處所使用的，冠詞“一個(a)”或“一個(an)”意指一或多個。

一“載體(vector)”意指一在導入至一適當的宿主細胞後致使此處所描述的一細胞的一修飾之重組型DNA或RNA建構物，諸如一質體、一噬菌體、重組型病毒或其他載體。對於本領域中具有通常知識者而言適當的表現載體是被熟知的並且包括那些在真核和/或原核細胞中是可複製者，以及那些維持游離基因態者或那些合併至宿主細胞基因體中者。

載體的構築可使用下面所描述的技術而被完成，例如：有如在Sambrook et al.,1989中所描述的。在某些具體例中，經分離的質體或DNA片段是呈欲產生質體的形式而被切斷、被裁剪以及被重接合。若需要，確認所構築的質體中的序列正確之分析是使用任何適合的方法而被執行。適合用於構築表現載體、製備活體外轉錄本、導入DNA至宿主細胞中，以及執行關於評估基因表現與功能的分析之的方法是被知曉的。基因存在、擴增和/或表現是使用一被適當地標記的探針(它可基於此處所提供的一序列)而在一樣品中被直接地測量，例如，藉由傳統的南方墨點分析、北方墨點分析以定量mRNA的轉錄、點漬法(dot blotting)(DNA或RNA分析)或原位雜交法(in situ hybridization)。

如此處所使用的，諸如“轉染(transfection)”、“轉形(transformation)”以及類似者的術語被意欲表示將呈可作用的形式之核酸傳遞至一細胞或生物體中。該等術語包括各種不同之將核酸傳遞至細胞中的方法，包括利用CaPO₄的轉染、電穿孔(electroporation)、病毒轉導(viral transduction)、脂轉染(lipofection)、使用脂質體遞送和/或其他輸送載體(delivery vehicles)。

細胞可藉由親和性技術或藉由細胞分類(cell sorting)[諸如螢光-活化的細胞分類(fluorescence-activated cell sorting)]而被分類，其中它們被標記以一適合的標記，諸如一被綴合至，例如，一反訊息核酸分子或一免疫球蛋白或其部分之螢光團(fluorophore)，或一內生性螢光蛋白質(intrinsically fluorescent protein)，諸如綠螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)或它的變異體。如此處所使用的，“分類(sorting)”意指至少部分的將一第一細胞類型從一第二細胞類型中物理性分離出。

術語“治療(treating)”、“治療(treatment)”以及類似者可意指獲得一所欲的藥理學的和/或生理學的效用，例如，一關於一疾病的部分或完整的治癒和/或逆轉一可歸因於該疾病的副作用和/或穩定該疾病和/或延緩該疾病的進展和/或造成該疾病的復原。

將幹細胞投藥(例如，移植)至需要治療的區域可藉由下列方式而被達成，例如而不作為限制：在手術期間的局部滴注(local infusion)、藉由注射(injection)、用一導管(catheter)或用一植入物(implant)，該植入物是一有孔的、無孔的或膠性材料，包括膜[諸如矽膠膜(silastic membranes)]或纖維。

將一組成物“移植”至一哺乳動物中可意指將該組成物導入至該哺乳動物的身體中。被導入的組成物是“移植物(transplant)”，以及該哺乳動物是“接受者(recipient)”。該移植物以及該接受者可為同源的(syngeneic)、同種異體的(allogeneic)或異種的(xenogeneic)。再者，該移植可為一自體移植(autologous transplantation)。

一“有效量(effective amount)”可為一足夠去達成所欲目的之治療劑的一數量。例如，一去增加hTS細胞的數目之因子的一有效量是一足以致使一幹細胞數目上的增加的數量(可視情況而在活體內或活體外)。一組成物去治療或改善一神經退化疾病(neurodegenerative disease)或病況的一有效量是一足以減少或移除該神經退化疾病或病況的症狀之組成物的數量。一被給予的治療劑的有效量將會隨著下列因子而改變，諸如試劑的性質、投藥途徑、接受治療劑的動物的大小與物種，以及投藥的目的。

2-巰乙醇(亦即β-巰乙醇、BME、2BME、2-ME或β-met)是具有化學式HOCH₂CH₂SH的化學化合物。

菸鹼醯胺[亦被知曉為菸鹼醯胺(niacinamide)以及菸鹼酸醯胺(nicotinic acid amide)]是菸鹼酸[維生素B₃/菸酸(niacin)]的胺化物。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於一嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩)或人類。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物是一嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩)或人類。

在某些具體例中，在胚胎發生(embryogenesis)中，胰臟發育需要定型內胚層(DE)的一關鍵衍生作用以供進一步分化。微RNAs(miRs)在許多層級下作用，透過分化過程控制細胞轉變的時序。在本發明的許多方面中的一者是為了將哺乳動物滋養層幹細胞經由由miR-124所驅使的DE特化而分化成為胰臟祖細胞而使用FGF(例如，bFGF)。本發明的另一個方面是為了在胰臟分化期間經由miR-124的調節之β細胞增生而提升β滋養因子。本發明的另一個方面是提供從哺乳動物滋養層幹細胞中所分化的胰島素-分泌的胰臟祖細胞。

在某些具體例中，在哺乳動物滋養層幹細胞中，FGF(例如，bFGF)有效地在一天內誘導經由定型內胚層(DE)形成而朝向胰島素-分泌的胰臟祖細胞的分化。

在某些具體例中，FGF(例如，bFGF)經由FGFR1/PI3K/Akt/CREB1途徑活化微RNA(miR)-124的時空升高以執行2功能：(1)抑制Smad4以及隨後抑制Mixl1以供DE形成；以及(2)抑制Cdx2以及依序地經由自動調控反饋迴路來相互活化Oct4以供DE調控。接著，DE透過原腸管(primitive gut tube)的轉變分化成為多潛能胰臟祖細胞。在分化期間，各個階段-特異性的細胞歷程(cellular process)主要地藉由一唯一多潛能轉錄因子而被調控。

在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞-衍生的胰臟祖細胞是葡萄糖-敏感的(glucose-sensitive)，在活體外和/或活體內分泌免疫反應性C-胜肽以及胰島素。

在某些具體例中，FGF(例如，bFGF)誘導有效地促使在哺乳動物滋養層幹細胞中指引胰臟祖細胞分化的miRNA-124a之活化。

在某些具體例中，此處的哺乳動物滋養層幹細胞是用於帶有糖尿病的患者中之細胞-基礎的治療(cell-based therapy)以及用於藥物毒性篩選(drug toxicity screening)之可再生的幹細胞來源。

在某些具體例中，FGF(例如，bFGF)能夠有效地將哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)分化成為胰臟祖細胞，提供有如幹細胞在生成胰島素-分泌的胰臟祖細胞上之可再生的來源以供第一型DM病患中的細胞-基礎的治療之證據。

在某些具體例中，哺乳動物滋養層幹細胞提供關於胰臟疾病-關聯性藥物篩選的主要優勢，因為：(1)它們易於產生於多-井盤(multi-well plate)中的評估所需之足夠的數目；(2)細胞基因型與表現型是穩定的；(3)胰臟分化與增生是由DE的特化所賦予特徵以及所說明；(4)由單一誘導物以及簡單的培養基所造成的條件促進毒性篩選的評估；以及(5)去完成胰島素-分泌的β-細胞分化之非常短的時間(例如一天)在經濟上滿足需求。

在一個實例中，以10ng/mL纖維母細胞生長因子(例如，bFGF)處理哺乳動物滋養層幹細胞產生大約10% 之成群的胰島素-生成細胞，表現胰臟祖細胞關聯性標記以及蘭氏小島(islet of Langerhans)的組分。在細胞歷程期間，miRNA-124有效地抑制Cdx2以及Smad4與它的下游效應子Mixl1，指引DE的形成以及分化朝向胰臟祖細胞。該些細胞能夠分泌葡萄糖-刺激的胰島素。

在某些具體例中，FGF(例如，bFGF)經由RTK活化PI3K/Akt途徑以磷酸化CREB1。CREB1-p短暫地標靶miR-124的啟動子。在一個實例中，miR-124以下面2種方式作用：(a)抑制Smad4以及Mixil1以供DE形成；以及(b)抑制Cdx2並且依序地去活化Oct4以供DE調控。在一個實例中，FGF(例如，bFGF)在哺乳動物滋養層幹細胞中誘導媒介中內胚層、DE以及原腸管的細胞歷程以在一天中形成功能性胰臟祖細胞。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞(hTS細胞)。

miR-124a亦被知曉為miR-124a、mir-124a、微RNA-124a、miRNA-124a、miR-124、mir-124、微RNA-124或miRNA-124。

關於miR-124，興趣的編碼序列包括，但不限於：編碼miR-124的前驅物的序列，例如，其中該等編碼序列的樣品被報導於miRBase資料庫中，被寄放與被保存於具有來自於BBSRC的資金之曼徹斯特大學的生命科學系(Faculty of Life Sciences at the University of Manchester)中。如所欲的，一所給予的載體可包括一單一編碼序列或該編碼序列的多重重複(multiple repeats)。

miR-124a的前驅物亦可於miRBase資料庫中被發現，例如：hsa-mir-124-1 MI0000443 AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG(序列辨識編號：3)hsa-mir-124-2 MI0000444 AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGCCUACGGCUGCACUUGAA(序列辨識編號：144)hsa-mir-124-3 MI0000445 UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC(序列辨識編號：145)。

此處的一miR-124的核酸序列可包括任何miR-124家族成員的核酸序列之一片段或一全長，例如，來自於在現有圖式、表1以及表2中的那些者；例如，有如在蒼蠅(MI0000373)、線蟲(nematode worms)(MI0000302)、小鼠(MI0000150)以及人類(MI0000443)中所鑑定者，或來自於那些在miRBase：英國曼徹斯特大學的微RNA資料庫中所發現者。在一個實例中，一抗-miR-124可具有一任何互補於miR-124的序列之序列，例如miRZIP124。在一個實例中，抗-miR-124是使用miRZip^TM慢病毒-基礎的微RNA弱化方法(lentiviral-based microRNA knockdown method)(例如，由System Biosciences所生產的)而被製備。

哺乳動物滋養層幹細胞

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞不是來自於靈長類，例如，猴子、人猿、人類。在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於靈長類，例如，猴子、人猿、人類。在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是人類的或人類化的。

此處的一哺乳動物滋養層幹細胞可被誘導以供分化成為一或多種類的經分化的細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一祖細胞，例如，一胰臟祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一內胚層、中胚層或外胚層祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰臟內胚層祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一多潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一寡潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一單潛能、雙潛能或三潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一內分泌、外分泌或導管祖細胞，例如，一內分泌祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一β-細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰島素-生成細胞。一或多種經分化的細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在一個方面，此處所提供的是一或多種從此處的一或多種方法中所分離出的經分化的細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一人類細胞。在一個實例中，該經分化的細胞具有一正常的核型。在一個實例中，該經分化的細胞具有一或多種免疫-豁免的特性，例如，低的或缺少的CD33表現和/或CD133表現。此處所揭露的一或多種經分離的經分化之細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在另一個方面，此處所提供的是一種經分離的祖細胞，其表現β滋養因子、β滋養因子mRNA、C-胜肽以及胰島素，其中該經分離的祖細胞是分化自一哺乳動物滋養層幹細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是來自於嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞是一人類細胞。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一正常的核型。在一個實例中，該經分離的祖細胞具有一或多種免疫-豁免的特性，例如，低的或缺少的CD33表現和/或CD133表現。此處所揭露的一或多種經分離的祖細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

人類滋養層幹細胞(hTS細胞)

在婦女中人類輸卵管(human fallopian tube)是受精的位址以及子宮外孕(ectopic pregnancies)的常見位址，其中有數種生物事件發生，諸如內細胞群(inner cell mass,ICM)與滋養外胚層(trophectoderm)之間的區別以及具有主要的表觀遺傳改變(epigenetic changes)之從全潛能性(totipotency)轉換至多能性。這些觀察提供有關輸卵管在著床前的階段作為一供用於獲得囊胚-關聯性幹細胞(blastocyst-associated stem cells)的棲位儲存處(niche reservoir)的支持。在工業化國家中，子宮外孕佔全部懷孕的1至2%並且在開發中國家中是高更多的。假如在人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cells,hES cells)以及胎腦組織(fetal brain tissue)的可利用性上的不足，此處所描述的是衍生自子宮外孕的人類滋養層細胞(hTS細胞)作為一針對幾乎不可利用的hES細胞的替代以供生成祖細胞的用途。

在某些具體例中，該等衍生自子宮外孕的hTS細胞不涉及一人類胚胎的破壞。在另一個實例中，該等衍生自子宮外孕的hTS細胞不涉及一可活性人類胚胎的破壞。在另一個實例中，該等hTS細胞是衍生自與非可活性子宮外孕有關聯的滋養層組織。在另一個實例中，該子宮外孕不能被挽救。在另一個實例中，該子宮外孕將不會致使一可活的人類胚胎。在另一個實例中，該子宮外孕威脅母親的生命。在另一個實例中，該子宮外孕是輸卵管的(tubal)、腹的(abdominal)、卵巢的(ovarian)或子宮頸的(cervical)。

在囊胚發育(blastocyst development)的期間，ICM本身接觸或它所衍生的可擴散的“誘導物(inducer)”會引起一在極性滋養外胚層中之高速率的細胞增生(cell proliferation)，而導致在整個囊胚期朝向壁區域(mural region)的細胞移動並且甚至在ICM與滋養外胚層的區別之後會持續。覆蓋ICM的壁滋養外胚層細胞能夠保留ICM的一“細胞記憶(cell memory)”。通常地，在著床的起始階段，與ICM相對的壁細胞由於來自子宮內膜(uterine endometrium)的機械性限制而停止分裂。然而，沒有該等限制存在於輸卵管中，這致使極性滋養外胚層細胞的持續分裂而在一子宮外孕的停滯的囊胚中形成胚外外胚層(extraembryonic ectoderm,ExE)。在某些具體例中，ExE-衍生的TS細胞是呈一增生狀態而存在歷時至少一為4-天的時間，這取決於ICM-分泌的纖維母細胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)與它的受體纖維母細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,Fgfr2)的相互作用。在另一個實例中，ExE-衍生的TS細胞是呈一增生狀態而存在歷時至少一為1-天、至少一為2-天、至少一為3-天、至少一為4-天、至少一為5-天、至少一為6-天、至少一為7-天、至少一為8-天、至少一為9-天、至少一為10-天、至少一為11-天、至少一為12-天、至少一為13-天、至少一為14-天、至少一為15-天、至少一為16-天、至少一為17-天、至少一為18-天、至少一為19-天、至少一為20-天的時間。直到臨床介入發生，這些細胞歷程在著床前的胚胎中可以產生一無限數目的hTS細胞，該等細胞保留來自於ICM的細胞記憶，這藉由ICM-相關的基因的表現而被反映。

此處所提供的一個方面是使用Affymetrix^TM平台以提問GeneChip Human Genome U133 plus 2.0 GeneChip有關一在hTS細胞與PDMS細胞之間的總體基因比較，而描述hTS細胞與胎盤衍生的間質幹(PDMS)細胞[placenta derived mesenchymal stem(PDMS)cell]之間的區別。在某些具體例中，該等hTS細胞展現出比在PDMS細胞中的基因表現少大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約35%、大約40%、大約45%、大約50%、大約55%、大約60%、大約65%、大約70%或大約75%的基因表現。在另一個實例中，該等hTS細胞展現出總共2,140個基因(倍數變化>2倍)，它要比在PDMS細胞中所具者少大約40%(3,730個基因)。在某些具體例中，hTS細胞的基因強度分布展現出一與在PDMS細胞中所具者有區別的均質型(homogenous pattern)。在另一個實例中，該等hTS細胞代表在一著床前的階段的一種滋胚內層(cytotrophoblast)的不同群組，而使得它們具有內細胞群(ICM)和/或滋養外胚層的分子肖像(molecular portraits)。在另一個實例中，該等hTS細胞展現出相似於hES細胞所具者的多能性以及自我-更新的特性。

獲得與分離哺乳動物滋養層幹細胞的方法

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可被分離自臍帶(umbilical cord)、羊水(amniotic fluid)、羊膜(amniotic membrane)、花頓氏膠(Wharton’s jelly)、絨毛膜絨毛(chorionic villi)、胎盤(placenta)或子宮外孕。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可被分離自羊膜穿刺生物檢體(amniocentesis biopsies)或分離自羊水。在一個實例中，羊膜穿刺可為一於懷孕期間被用來獲得一圍繞胎兒的羊水的少量樣品之過程。在一個實例中，一羊膜穿刺可被提供給懷孕第15與第20週之間且處於關於染色體異常(chromosome abnormalities)之經增加的風險中的婦女，例如：在分娩時年齡超過35歲的婦女，或那些曾具有一表示一關於一染色體異常或神經管缺陷(neural tube defect)的經增加的風險之異常母親血清(血液)篩檢測試者。在一個實例中，一針(例如，一長的、細的、中空的針)可以超音波指引來穿過你的腹部至子宮以及羊膜囊(amniotic sac)中而被使用。一預定數量(例如，一盎司)的羊水可被吸取至一注射器(syringe)中。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可於著床前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD){例如，與生殖治療(reproductive therapies)[諸如體外受精(in vitro fertilization,IVF)]結合}期間從分裂球生物檢體(blastomere biopsy)中被獲得。在一個實例中，此處的細胞可藉由用於一囊胚的生物檢體之方法而被產生，其中剩餘的囊胚被著床並且致使一懷孕以及之後致使一活胎，例如，透明層(zona pellucida)從囊胚中被移除以及接著該囊胚被切片檢查。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可從產前絨毛取樣術(chorionic villus sampling,CVS)中被獲得。在一個實例中，CVS可為一產前測試，它涉及從胎盤中取一組織的樣品來測試關於染色體異常以及特定的其他基因問題。在一個實例中，CVS可在懷孕的第10與第12週之間被執行。在一個實例中，CVS操作程序是經子宮頸的，例如：一導管被插入通過子宮頸至胎盤中以獲得組織樣品。在一個實例中，CVS操作程序是經腹部的，例如：一針被插入通過腹部以及子宮至胎盤中以獲得組織樣品。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在足月的懷孕之後從胎盤生物檢體中被獲得。在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在一陰道生產(vaginal delivery)或一剖腹生產(cesarean section delivery)之後從一胎盤中被分離出。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可從第一孕期絨毛取樣術(例如，8⁺³至12⁺⁰週胎齡)或來自於剖腹生產的全期胎盤(term placenta)中被分離出。絨毛膜組織可從羊膜中被分離出、被切碎和/或被酵素分解(例如，使用0.05%胰蛋白酶EDTA，例如，歷時20分鐘)。細胞隨後被離心(例如，在1500rpm下，例如，歷時5分鐘)、被計數和/或被重塗盤(例如，10⁴細胞/cm²)於一培養基[例如，杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)+10%胎牛血清(fetal bovine serum)]中。在一個實例中，經分離的細胞可為塑膠貼附的(plastic adherent)。在一個實例中，該等細胞可在第4-8代傳代物(passage)下被使用。

在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可依據下列操作程序而從全期(例如，妊娠的38-40週)胎盤中被分離出。臍帶血被允許從胎盤(它接著小心地被切開)中排出。所得到的組織切片被清洗數次[例如，在磷酸緩衝的鹽水溶液(phosphate-buffered saline)中]以及接著被切碎(例如，機械性地)以及被酵素分解(例如，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA)。均質物隨後藉由離心而被沉澱以及被散浮於完全培養基(complete medium)(例如，補充有10%胎牛血清、100U/mL盤尼西林和/或100g/mL鏈黴素的杜貝可氏改良的依格氏培養基)中。細胞培養物被維持於一適合的條件(例如，37℃伴隨一水-飽和的空氣以及5% CO₂)下。培養基定期地被置換，例如每週一至二次。當細胞達到一所欲程度的匯聚時(例如，超過80%匯聚)，它們被恢復，例如，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA，以及在一稀釋(例如，1：3)下被重塗盤。

在另一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)可在分娩之後依據一如下的操作程序而從人類胎盤中被分離出。絨毛膜是藉由剝開羊膜而從羊膜中被分離出。蛻膜的組織在被切成小片(例如，2×2cm²)之前被敲碎(例如，機械性地)以及被清洗(例如，在杜貝可氏磷酸緩衝的鹽水溶液中)。絨毛膜被切成小片以及被提供至一酵素(例如，0.5%胰蛋白酶-EDTA，歷時例如5分鐘)中，繼而以膠原酶I(collagenase I)(例如，在0.3%下於37℃培養箱中歷時20至30分鐘)來分解。被賦予移動性的細胞接著被收集以及通過一細胞過濾器(cell strainer)(例如，100μm)。經過濾的細胞是藉由離心(例如，在2,500rpm下，歷時例如5分鐘)而被收集。細胞被重新散浮於一培養基(例如，補充有10%胎牛血清和/或1%盤尼西林-鏈黴素的α-改良的最小必需培養基)中，以及在一適合的條件(例如，於37℃下和/或5% CO₂)下被培養於一容器(例如，T25培養瓶)中。培養基定期地被置換(例如，每3天)，直到絨毛膜MSCs達到一所欲程度的匯聚(例如，70%匯聚)。

在另一個實例中，此處所提供的亦是一種用於獲得哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)的方法，其包含有：(a)在一子宮外孕的輸卵管之處獲得一胚胎(例如，妊娠的4-6、5-7或6-8週)；以及(b)從該胚胎的絨毛滋養層(villous trophoblast)中獲得幹細胞。在某些具體例中，一胚胎可從一未破裂的子宮外孕中被獲得。在某些具體例中，該未破裂的子宮外孕可於少於受精後第6週的階段中。絨毛滋養層可包含有滋養發生層(cytotrophoblastic layer)。

在另一個實例中，胚胎絨毛膜絨毛可從帶有子宮外孕的婦女(例如，胎齡：5-7週)中之輸卵管的未破裂的著床前胚胎中被獲得。微小的絨毛組織可在一適合的培養基(例如，無血清α-MEM)中被徹底地切碎以及在顯微鏡下被鑑別，繼而胰蛋白酶化(例如，使用0.025%胰蛋白酶/EDTA)歷時一段時間(例如，15分鐘)以及藉由添加一培養基(例如，含有10% FBS的α-MEM)以終止反應。貼附的細胞可在一適合的條件(例如，在條件α-MEM、10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素中，在37℃下，在5% CO₂中)下被獲得與被培養。在傳代2代之後，藉由一商業套組(例如，Dako,Carpinteria,CA)所測量的hCG的位準會變成偵測不到。

哺乳動物滋養層幹細胞的分化的方法

在許多方面中的一者，此處所提供的是一種將一哺乳動物滋養層幹細胞分化的方法，其包含有：調節miR-124以誘導該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為一經分化的細胞。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞(hTS cell)。在一個實例中，該經分化的細胞是一多潛能幹細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一祖細胞(例如，一胰臟祖細胞)。在一個實例中，該經分化的細胞是一內胚層、中胚層或外胚層祖細胞(例如，一定型內胚層祖細胞)。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰臟內胚層祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一多潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一寡潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一單潛能、雙潛能或三潛能祖細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一內分泌、外分泌或導管祖細胞(例如，一內分泌祖細胞)。在一個實例中，該經分化的細胞是一β-細胞。在一個實例中，該經分化的細胞是一胰島素-生成細胞。一或多種經分化的細胞可被使用於此處所揭露的任何方法中。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於一嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。

在某些具體例中，該調節活化miR-124。在一個實例中，該調節於一定型內胚層階段時空地(例如，介於大約1小時至大約8小時之間)活化miR-124。在一個實例中，該調節提高miR-124表現。在一個實例中，該調節去活化miR-124。在一個實例中，該調節減少miR-124表現。在一個實例中，該調節包含有令該該哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種試劑(例如，蛋白質或類固醇激素)接觸。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一生長因子[例如，一纖維母細胞生長因子(FGF)]。在一個實例中，該FGF是一或多種FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10。在一個實例中，該一或多種試劑包含有FGF2[鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)]。在一個實例中，該調節包含有令該哺乳動物滋養層幹細胞與沒有大於大約200ng/mL的FGF(例如，bFGF)(例如，從100至200ng/mL)接觸。在一個實例中，該調節包含有令該哺乳動物滋養層幹細胞與沒有大於大約100ng/mL的FGF(例如，bFGF)(例如，從大約0.1至1ng/mL)，或從大約1至大約100ng/mL的FGF(例如，bFGF)接觸。在一個實例中，此處所使用的FGF(例如，bFGF)的濃度是大約從0.1至1、1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100ng/mL。在一個實例中，此處所使用的FGF(例如，bFGF)的濃度是大約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在一個實例中，該一或多種試劑進一步包含有一抗氧化劑或還原劑，例如，2-巰乙醇。在一個實例中，該一或多種試劑進一步包含有一維生素，例如，菸鹼醯胺。在一個實例中，該調節包含有令該哺乳動物滋養層幹細胞與FGF(例如，bFGF)、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺接觸。在一個實例中，抗氧化劑/還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度沒有大於大約10mmol/L(例如，從大約0.1至大約10mmol/L)。在一個實例中，抗氧化劑/還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約從0.1至1、1至2、2至3、3至4、 4至5、5至6、6至7、7至8、8至9或9至10mmol/L。在一個實例中，抗氧化劑/還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在一個實例中，抗氧化劑/還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約1mmol/L。在一個實例中，菸鹼醯胺的濃度沒有大於大約100mmol/L(例如，從大約1至大約100mmol/L)。在一個實例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100mmol/L。在一個實例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一個實例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約10mmol/L。

在一個實例中，該調節包含有令該哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種試劑接觸以調控cAMP反應要素結合蛋白1(CREB1)的活性或表現位準。在一個實例中，該一或多種試劑調控CREB1磷酸化。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一維生素代謝物，例如，視黃酸。在一個實例中，該一或多種試劑包含有一CREB1-結合蛋白質。在一個實例中，該一或多種試劑調控一或多種因子(其包含有mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3 β)。

在一個實例中，該一或多種試劑包含有一外源性miR-124前驅物或一外源性抗-miR-124。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被轉染以該外源性miR-124前驅物或該外源性抗-miR-124。在一個實例中，miR-124的啟動子之順-調控要素(CRE)TGACGTCA被調節。

在某些具體例中，該miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e。在一個實例中，該miR-124是miR-124a[例如，智慧人miR-124a(hsa-miR-124a)]。在一個實例中，該miR-124a是hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或它的一片段。在一個實例中，該miR-124a是hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段。在一個實例中，該miR-124包含有一選自於表1、表2以及圖式中的序列或它的一片段。

在一個實例中，在該調節開始之後的一天內該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為該經分化的細胞。

在某些具體例中，哺乳動物滋養層幹細胞的分化的誘導包含有在足以誘導分化的條件(例如，12、24、48、76或96小時)下將一未經分化的哺乳動物滋養層幹細胞培養於一包含有一生長因子(例如，bFGF)的培養基中。該培養基可進一步包含有血清(例如，FBS)、碳水化合物(例如，葡萄糖)、抗氧化劑/還原劑(例如，β-巰乙醇)和/或維生素(例如，菸鹼醯胺)。經分化的細胞的產量被測量，例如：胰島素⁺/Ngn3⁺細胞或胰島素⁺/升糖素⁺細胞作為關於胰臟祖細胞的指標。在一個實例中，FBS以及胰島素位準在FGF(例如，bFGF)誘導期間是正相關的(例如，有如藉由西方墨點分析所表示的)。

在某些具體例中，關於細胞誘導(例如，藉由bFGF)，一時程分析(例如，歷時4、8、16、24、32、40或48小時)可被實施去監測鑑別細胞分化發育的級聯階段(cascading stage)的轉錄因子的位準。在某些具體例中，降低Mixl1以及高位準的T與Gsc可能暗示一從哺乳動物滋養層幹細胞至中內胚層的轉變。在某些具體例中，在各個分化階段的優勢多潛能轉錄因子包括關於中內胚層的Cdx2、關於DE的Oct4或Nanog、關於原腸內胚層的Cdx2或Nanog，或關於胰臟祖細胞的Sox2。在某些具體例中，FGF(例如，bFGF)在DE階段經由上升調控Oct4、Sox17或Foxa2但下降調節Smad4或Mixl1誘導miR-124a的多方面功能。

在某些具體例中，對於標的經分化的細胞具有特性的蛋白質或激素的位準亦使用一時程分析(例如，歷時4、8、16、24、32、40或48小時)而被測量。例如，β滋養因子、C-胜肽以及胰島素被測量(例如，使用qPCR分析)以供胰臟祖細胞生成。

在某些具體例中，一生長因子於此處被用來誘導一哺乳動物滋養層幹細胞的分化。在一個實例中，該生長因子是FGF(例如，bFGF)、骨型態形成蛋白質(bone morphogenetic protein,BMP)或血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。在某些具體例中，一有效量的一生長因子沒有大於大約100ng/mL(例如，大約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 、80、90或100ng/mL)。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

在某些具體例中，此處去分化一哺乳動物滋養層幹細胞的一培養基可進一步包含有一有效量的一第二試劑(它與一第一試劑協同地作用以誘導分化成為一中內胚層方向)。在某些具體例中，該第一與第二試劑是不同的生長因子。在某些具體例中，該第一試劑在該第二試劑之前被添加至培養基。在某些具體例中，該第二試劑在該第一試劑之前被添加至培養基。在一個實例中，該第一試劑是FGF(例如，bFGF)。在某些具體例中，該第二試劑是BMP(例如，BMP2、BMP7或BMP4)，在該第一試劑之前或之後被添加。在某些具體例中，一有效量的一BMP沒有大於大約100ng/mL(例如，大約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100ng/mL)。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

在某些具體例中，此處去分化一哺乳動物(例如，人類)滋養層幹細胞的一培養基可包含有餵養細胞(feeder cell)。餵養細胞是一種類型的細胞，它與另一種類型的細胞共-培養，以提供一第二類型的細胞可生長於其中的環境。

在某些具體例中，此處所使用的一培養基沒有或實質上沒有餵養細胞。

在某些具體例中，一GSK-3抑制劑被用來誘導一哺乳動物(例如，人類)滋養層幹細胞的分化。

藥學組成物(pharmaceutical composition)以及投藥

在某些具體例中，此處所提供的是一種組成物，其包含有此處的經分化的細胞。在一個實例中，該組成物進一步包含有一緩衝溶液或一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)[它被提供來維持該哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)的生物活性]。例如但不限制的，該緩衝溶液是鹽水、PBS(磷酸緩衝的鹽水溶液)或FBS(胎牛血清)緩衝液。

在某些具體例中，此處的組成物進一步包含有一治療性化合物。例如但不限制的，該治療性化合物是一化學品或抗體或它的片段。

此處的組成物可藉由注射、移植或外科手術而被投藥。

在某些具體例中，病患是一哺乳動物。在某些具體例中，此處的哺乳動物是一嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子、人猿(例如，黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩)或人類。在一個實例中，病患是人類。

在某些具體例中，此處所提供的是一種用於治療或預防糖尿病的組成物，其包含有一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)或如上所述的經分化的細胞。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)是從子宮外孕的胚胎中被獲得。糖尿病是第一型糖尿病、第二型糖尿病或潛伏性成人自體免疫糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults,LADA)。

在某些具體例中，此處所提供的是一種用於治療或預防一神經系統疾病(nervous system disease)的組成物，其包含有一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)或該經分化的細胞。在一個實例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是從一子宮外孕的胚胎中被獲得。該神經系統疾病是神經退化疾病。神經退化疾病可意指特徵為在一個體的中樞神經系統中由於細胞死亡所造成的神經元的進行性缺失的任何病況。在一個實例中，神經退化疾病是巴金森氏症(Parkinson’s disease)、杭丁頓氏症(Huntington’s disease)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多重系統萎縮(multiple system atrophy)、路易氏體失智(Lewy body dementia)、周邊感覺神經病變(peripheral sensory neuropathies)，或者脊髓損傷(spinal cord injuries)。在一個實例中，神經退化疾病是巴金森氏症。

此處所描述的一經分離的幹細胞製劑的投藥的模式包括，但不限於：全身性靜脈內注射(systemic intravenous injection)以及直接注射至所意欲的活性位址。該製劑可藉由任何便利的途徑[例如，藉由滴注(infusion)或巨量注射(bolus injection)]而被投藥，以及可與其它生物活性試劑(biologically active agents)一起被投藥。在一個實例中，投藥是全身性定位投藥(systemic localized administration)。

在某些具體例中，一幹細胞製劑或組成物被配方為一適用於靜脈內投藥至哺乳動物(包括人類)的藥學組成物。在一個實例中，一用於靜脈內投藥的組成物是呈無菌的等張水性緩衝液(sterile isotonic aqueous buffer)的溶液。在必要時，該組成物亦包括一局部麻醉劑(local anesthetic)以改善在注射的位址之處的任何疼痛。在該組成物要藉由滴注而被投藥時，它可使用一含有無菌的藥學等級水或鹽水的滴注瓶(infusion bottle)而被配藥。在該組成物要藉由注射而被投藥時，一用於注射的無菌水或鹽水的安瓿(ampoule)可被提供而使得該等成分在投藥之前被混合。

在某些具體例中，適合的藥學組成物包含有一治療有效量的祖幹細胞(progenitor stem cell)以及一藥學上可接受的載劑或賦形劑(excipient)。此一載劑包括，但不限於：鹽水、緩衝的鹽水(buffered saline)、右旋糖(dextrose)、水，以及它們的組合。

在某些具體例中，經分離的幹細胞是藉由一適合用於將細胞標靶至一特定組織的遞送系統而被遞送至一經標靶的位址(例如，胰臟、腦、脊髓或任何其它神經損傷和/或退化的位址)。例如，該等細胞被囊封在一輸送載體(delivery vehicle)中，而允許該等細胞在經標靶的位址之處緩慢的釋出。該輸送載體被修飾而使得它被專一地標靶至一特定的組織。經標靶的遞送系統的表面以各種不同的方式而被修飾。當是一脂質體-標靶的遞送系統 (liposomal-targeted delivery system)時，脂質基團(lipid group)被併入至該脂質體的脂雙層(lipid bi-layer)中，俾以維持標靶配位子與脂質體雙層(liposomal bi-layer)呈穩定的相締合。

在另一個實例中，一膠體分散系統(colloidal dispersion system)被使用。膠體分散系統包括大分子複合體(macromolecule complexes)、奈米膠囊(nanocapsules)、微球體(microspheres)、珠粒(beads)以及以脂質為基礎的系統[包括水包油乳化液(oil-in-water emulsions)、微胞(micelles)、經混合的微胞(mixed micelles)以及脂質體]。

此處所描述的幹細胞的投藥是藉由下列方式而選擇性地針對一個體來量身訂作：(1)增加或減少被注射的細胞數量；(2)改變注射的數量；(3)改變該等細胞的遞送方法；或(4)改變細胞的來源，例如藉由基因工程細胞或來自活體外細胞培養物。

幹細胞製劑是呈一有效於促進在接受者中的細胞植入的數量而被使用。在醫師的裁量下，投藥被調整至滿足最佳的效力以及藥理給藥(pharmacological dosing)。

篩選的方法

此處所提供的是篩選一供用於治療或預防一疾病之化合物的方法。在一個實例中，該方法包含有令一經分離的哺乳動物滋養層幹細胞或它的一經分化的細胞與該化合物接觸。在另一個實例中，該方法進一步包含有偵測在該哺乳動物滋養層幹細胞或經分化的細胞中至少一基因、轉錄本或蛋白質的活性上的一改變。在另一個實例中，該方法進一步包含有偵測在該哺乳動物滋養層幹細胞或經分化的細胞中至少一轉錄本或蛋白質的位準上的一改變。在另一個實例中，該方法包含有偵測在該哺乳動物滋養層幹細胞或經分化的細胞中至少一基因、轉錄本或蛋白質的活性上的一改變。在某些具體例中，該疾病是與胰島素疾病(例如，糖尿病)有關聯。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。在某些具體例中，該經分化的細胞是一胰臟祖細胞。在某些具體例中，該經分化的細胞是一胰島素-生成細胞。

此處所提供的一個實例描述一種篩選一具有能力去調節在一細胞中的改變的化合物的方法。在另一個實例中，該方法包含有令一經分離的哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)與該化合物接觸並且偵測一該哺乳動物滋養層幹細胞的生長與分化的誘導。在一個實例中，該方法包含有令此處的一經分化的細胞(例如，祖細胞)與該化合物接觸並且偵測在細胞增生或細胞功能上的改變。在某些具體例中，該經分離的祖細胞是一胰臟祖細胞。在某些具體例中，該經分離的祖細胞是一胰島素-生成細胞。

在某些具體例中，此處所提供的是一種篩選一具有能力去調節胰臟細胞功能(例如，β-細胞功能)的化合物的方法，其包含有將該化合物組合以此處的一胰臟祖細胞或經分化的細胞，決定細胞中的任何表現型或代謝的改變，以及建立該改變與一去調節胰島素、升糖素或β滋養因子的化合物之能力的相關性。

此處亦被提供的是一種篩選一具有細胞的細胞毒性之化合物的方法，該方法包含有令此處的一經分化的細胞與該化合物接觸。在另一個實例中，該方法進一步包含有決定在細胞中任何起因於與該化合物接觸的表現型或代謝的改變，以及建立該改變與細胞毒性或任何其他在細胞功能或生物化學上的改變之相關性。在另一個實例中，分化的治療性化合物、毒素或潛在調節子的篩選被促進。這些物質(例如，治療性化合物、毒素或潛在調節子)可以被添加至培養基。

此處亦被提供的是一種篩選增生因子(proliferation factors)、分化因子(differentiation factors)以及治療性化合物的方法。在一個實例中，哺乳動物滋養層幹細胞被用來篩選有關影響哺乳動物滋養層幹細胞或經分化的細胞在培養中的特性的因子[諸如小分子藥物、胜肽、聚核苷酸(polynucleotides)以及類似之物]或條件(諸如培養條件或操作)。在一個實例中，此系統具有不會受一由測試化合物所造成的餵養細胞的擾亂而引起的次級效用(secondary effect)所複雜化的優點。在另一個實例中，生長-影響物質被測試。在另一個實例中，條件培養基(conditioned medium)從該培養物中被撤除以及一較簡單的培養基予以取代。在另一個實例中，不同的井接著被處理以不同的可溶性因子的雞尾酒(cocktails)(它們是用於取代該條件培養基的組分的候選者)。若經處理的細胞被維持並且以一滿意的方式來增生(最佳地與在條件培養基中一樣)，各個混合物的效力被決定。潛在的分化因子或條件可以藉由依據測試操作程序來處理細胞而被測試，並且接著決定經處理的細胞是否發展一特定譜系之一經分化的細胞的功能性或表現型特性。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)被用來篩選細胞分化的潛在調節子。在一個實例中，該細胞分化是胰臟分化。例如，在一個用於篩選細胞分化的調節子的分析中，該哺乳動物滋養層幹細胞可在無血清、低密度條件(隨著情況需要在LIF的存在或缺少下、在調節子的存在下，以及在RA的存在或缺少下)下而被培養，並且在分化上的效用可被偵測。在另一個實例中，此處所描述的篩選方法可被用來研究與細胞發育有關聯的條件以及篩選有關該條件的潛在治療劑或矯正的藥物或調節子。例如，在一個實例中，正常的哺乳動物滋養層幹細胞的發育是與具有該條件的細胞的發育相比較。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

在某些具體例中，基因以及蛋白質表現可在得自於哺乳動物滋養層幹細胞(例如，hTS細胞)的不同細胞族群之間而被比較，並且被用來鑑定以及區別在分化的期間被上升調節或被下降調節的因子，以及生成受影響的基因的核苷酸複製品(nucleotide copies)。

在某些具體例中，無餵養的哺乳動物滋養層幹細胞培養物亦可在藥物研究中被使用於測試藥學化合物(pharmaceutical compounds)。候選藥學化合物的活性的評估通常涉及將此處的經分化的細胞組合以該候選化合物，決定任何所形成的改變，並且接著使該化合物的效用與被觀察到的改變產生關聯。在另一個實例中，篩選被完成，例如，因為該化合物被設計要在特定的細胞類型上具有一藥理作用(pharmacological effect)，或因為一被設計要在別處具有效用的化合物具有非所欲的副作用。在另一個實例中，2或多種藥物是被組合地(藉由同時地或依序地與細胞組合)測試，俾以偵測可能的藥物-藥物交互作用效應(interaction effects)。在另一個實例中，化合物最初地針對潛在的毒性而被篩選。在另一個實例中，細胞毒性是藉由在細胞可活性(cell viability)、存活、形態學(morphology)上，在特定的標記、受體或酵素的表現或釋放上，在DNA合成或修復上的作用而被決定。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

疾病的治療

在一個方面，此處所提供的是一種治療或預防在一需要它的哺乳動物中的一疾病的方法，其包含有將此處的一細胞(例如，一經分離的祖細胞)投藥至需要它的哺乳動物。在一個實例中，該細胞是經免疫豁免的。在一個實例中，該細胞具有低位準的CD33表現和/或CD133表現。在一個實例中，該投藥包含有注射、植入或外科手術。在一個實例中，該疾病是一胰島素疾病。在一個實例中，該疾病是糖尿病(例如，第一型糖尿病或第二型糖尿病)。在一個實例中，該需要它的哺乳動物是一嚙齒類、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或人猿。在某些具體例中，此處的一嚙齒類是一小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠。在某些具體例中，此處的一人猿是黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩。在一個實例中，該需要它的哺乳動物具有一或多種與糖尿病有關聯的症狀[例如，多尿症(頻繁的排尿)、多渴症(增加的口渴)、多食症(增加的飢餓)、體重減少、視覺模糊、瘙癢、周圍神經系病、復發性陰道感染、疲勞、傷口或瘡的癒合慢，以及它們的任何組合。

在一個方面，此處所提供的是一種用於治療或預防一疾病或一病況的方法，其包含有將一有效量的一經分離的哺乳動物滋養層幹細胞或使用此處所揭露的標的方法所製備的經分化的細胞投藥至一需要它的個體。在一個實例中，該疾病是一免疫缺乏疾病(immunodeficient disease)、一神經系統疾病、一造血疾病(hemopoietic disease)、一癌症，或者糖尿病。

在某些具體例中，此處所提供的是一種用於產生胰島素-分泌的細胞以治療糖尿病患的方法，例如使用此處的經分離的哺乳動物滋養層幹細胞或經分化的細胞。

在某些具體例中，此處的糖尿病可意指任何在碳水化合物(例如，葡萄糖)的生成以及利用上的代謝缺陷或任何胰島素疾病。

在某些具體例中，糖尿病患蒙受第一型糖尿病、第二型糖尿病、妊娠糖尿病(gestational diabetes)或潛伏性成人自體免疫糖尿病(LADA)。在第一型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)中，病患生成少的或沒生成胰島素(調控葡萄糖利用的激素)。在第二型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus,NIDDM)中，相較於非糖尿病個體，病患通常具有相同的或甚至經升高的血漿胰島素位準，但已逐漸產生一在主要的胰島素-敏感組織(它為肌肉、肝臟以及脂肪組織)中葡萄糖以及脂質代謝上的胰島素刺激作用的抗性，以及當血漿胰島素位準被升高時，是不足以克服顯著的胰島素抗性的。妊娠糖尿病[或妊娠性糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)]可為一病況，在該病況中沒有事先被診斷有糖尿病的婦女在懷孕期間展現出高血糖位準。潛伏性成人自體免疫糖尿病(LADA)可為一病況，在該病況中第一型糖尿病患於成人中。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可被使用於治療或預防糖尿病[例如，糖尿病(diabetes mellitus)、糖尿病腎病變(diabetic nephropathy)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、糖尿病血管病變與微血管病變(diabetic angiopathy and microangiopathy)]、高血糖症(hyperglycemia)、肥胖(obesity)、一脂質病症(lipid disorder)[例如，異常血脂症(dyslipidemia)、高脂血症 (hyperlipidemia)、高三酸甘油脂血症(hypertriglyceridemia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)、低HDL、高HDL、代謝症候群(metabolic syndrome)(異常血脂症)]、全身性以及肺張力過強(systemic and pulmonary hypertonia)、心血管疾病(cardiovascular disease)[例如，心肌梗塞之後的心肌纖維組織形成(cardiac fibroses after myocardial infarction)、心肥大(cardiac hypertrophy)以及心臟機能不全(cardiac insufficiency)、動脈硬化(arteriosclerosis)]、腎臟疾病(kidney disease)[例如，腎小球硬化(glomerulosclerosis)、腎硬化(nephrosclerosis)、腎炎(nephritis)、腎病變(nephropathy)、電解質排泄障礙(electrolyte excretion disorder)]和/或纖維組織形成(fibroses)以及發炎過程(inflammatory processes)[例如，肝硬化(liver cirrhosis)、肺纖維化(pulmonary fibrosis)、纖維變性(fibrosing pancreatitis)、風濕病(rheumatism)與關節病(arthroses)、克隆氏病(Crohn's disease)、慢性支氣管炎(chronic bronchitis)、放射性纖維化(radiation fibrosis)、硬化性皮炎(sclerodermatitis)、囊腫纖維化(cystic fibrosis)、結瘢(scarring)、阿茲海默症]。此處的細胞、組成物以及方法亦可抑制癌症、腫瘤細胞的生長以及腫瘤轉移並且因此適合用於腫瘤治療。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可被使用於治療一具有第二型糖尿病或耐糖不良 (impaired glucose tolerance)或具有一糖尿病的家族史的個體中之胰島素抗性症候群(insulin resistance syndrome)以及至少一個下列的病況：異常血脂症、高血壓(hypertension)、高尿酸血症(hyperuricemia)、促凝血狀態(pro-coagulant state)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)以及軀幹性肥胖(truncal obesity)。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可被使用於治療或預防一或多種糖尿病-相關的疾病，包括代謝症候群[X症候群(Syndrome X)或經升高的血糖、高血壓、肥胖、異常血脂症]、高血糖症、高胰島素血症(hyperinsulinemia)、耐糖不良、空腹血糖異常(impaired fasting glucose)、胰島素抗性、肥胖、動脈粥狀硬化疾病(atherosclerotic disease)、心血管疾病、腦血管病(cerebrovascular disease)、周邊血管疾病(peripheral vessel disease)、狼瘡(lupus)、多囊胞性卵巢症候群(polycystic ovary syndrome)、癌形成(carcinogenesis)、糖尿病神經病變、糖尿病腎病變、糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)、糖尿病性黃斑部水腫(diabetic macular edema)以及增生(hyperplasia)。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可被使用於治療或預防一或多種疾病、病症以及病況，包括(1)高血糖症；(2)低葡萄糖耐受性(low glucose tolerance)；(3)胰島素抗性；(4)肥胖；(5)脂質病症；(6)異常血脂症；(7)高脂血症；(8)高三酸甘油脂血症：(9)高膽固醇血症；(10)低HDL位準；(11)高HDL位準；(12)動脈粥樣硬化與它的後遺症；(13)血管再狹窄(vascular restenosis)；(14)刺激性腸症候群(irritable bowel syndrome)；(15)發炎性腸病(inflammatory bowel disease)，包括克隆氏病以及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)；(16)其它發炎性病況；(17)胰臟炎(pancreatitis)；(18)腹部肥胖(abdominal obesity)；(19)神經退化疾病；(20)視網膜病；(21)腎病變；(22)神經系病；(23)X症候群；(24)卵巢雄性素過多症(ovarian hyperandrogenism)[多囊性卵巢症候群(polycystic ovarian syndrome)]以及其它病症，其中胰島素抗性是一要素。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可與例如抗高血脂劑(antihyperlipidemic agent)組合而被使用來治療或預防心血管疾病(CVD)。抗高血脂劑的實例包括他汀化合物(statin compounds)，它為具有一個三酸甘油酯(triglyceride)降低功能的膽固醇合成抑制劑[例如，西立伐他汀(cerivastatin)、普伐他丁(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、伊伐他汀(itavastatin)或它們的鹽類等]、角鯊烯合成酶抑制劑(squalene synthase inhibitor)或纖維酸化合物(fibrate compound)[例如，本那非泊(bezafibrate)、克氯吩貝(clofibrate)、雙貝特(simfibrate)、克利貝特(clinofibrate)]以及類似之物。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可與例如降血壓劑(hypotensive agent)組合而被使用來治療或預防異常血管生長以及由高胰島素位準所造成的腎的鈉存留(renal sodium retention)並且藉此減緩高血壓。降血壓劑的實例包括血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor)[例如，卡特普(captopril)、伊那拉普利(enalapril)、地拉普利(delapril)]、血管收縮素II拮抗劑(angiotensin II antagonist)[例如，坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、洛沙東(losartan)、依普羅沙坦(eprosartan)、纈沙坦(valsantan)、替米沙坦(termisartan)、艾比沙坦(irbesartan)、他索沙坦(tasosartan)]、鈣拮抗劑(calcium antagonist)[例如，曼尼待平(manidipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼卡地平(nicardipine)、安洛待平(amlodipine)、依福地平(efonidipine)]以及可樂定(clonidine)。

在某些具體例中，此處的細胞、組成物以及方法可與例如抗肥胖劑組合而被使用。抗肥胖劑的實例包括作用於中樞神經系統上的抗肥胖藥物[例如，右芬氟拉明(dexfenfluramine)、氟苯丙胺(fenfluramine)、芬他命(phentermine)、西布曲明(sibutramine)、安非拉酮(anfepramone)、右旋苯丙胺(dexamphetamine)、馬引朵(mazindol)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、氯苄雷司(clobenzorex)]、胰脂酶抑制劑(pancreatic lipase inhibitor)[例如，奧利司他(orlistat)]、β-3促效劑(例如， CL-3 16243、SR-5861 1-A、UL-TG-307、SB-226552、AJ-9677、BMS-196085、AZ-40140)、抑制食慾胜肽[例如，瘦素(leptin)]、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)以及膽囊收縮素促效劑(cholecystokinin agonist)[例如，林替曲特(lintitript)、FPL-1 5849]。

在某些具體例中，此處所提供的是一種用於治療一神經退化疾病的方法，其包含有對一病患投藥以一有效量的滋養層幹細胞或它們的經分化的細胞。該哺乳動物滋養層幹細胞是從子宮外孕的輸卵管之處的滋養層絨毛中被獲得。在一個實例中，該神經退化疾病是巴金森氏症、杭丁頓氏症、阿茲海默症或化學品-誘導的神經元損傷(chemical-induced neuron damage)。

在某些具體例中，此處所提供的是一種治療一病症的方法，其中該方法包含有將一純的神經元的族群或一由此處的一方法所產生的特定神經幹細胞族群的複合體移植至一需要它的病患。在一個實例中，該病患被診斷有一神經性疾病(neurological disease)。在另一個實例中，該病患被診斷有一神經精神疾病(neuropsychiatric disorder)。在另一個實例中，該病患被診斷有一神經退化障礙(neurodegenerative disorder)。在另一個實例中，純的神經元的族群包含有多巴胺神經元(dopaminergic neuron)。

在一個實例中，該疾病是一神經性疾病。在另一個實例中，該疾病是一神經退化疾病或障礙。神經障礙(neurological disorder)的非-限制性實例包括巴金森氏症、阿茲海默症、杭丁頓氏症、縮性脊髓側索硬化症、弗利德來運動失調(Friedreich’s ataxia)、路易氏體症(Lewy body disease)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、多重系統萎縮、痴呆(dementia)、精神分裂症(schizophrenia)、麻痺(paralysis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、脊髓損傷、腦損傷(brain injuries)[例如，中風(stroke)]、腦神經障礙(cranial nerve disorders)、周邊感覺神經病變、癲癇(epilepsy)、病原性蛋白顆粒障礙(prion disorders)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)、亞爾培氏症(Alper's disease)、小腦/脊髓小腦退化(cerebellar/spinocerebellar degeneration)、巴登氏病(Batten disease)、皮質基底核退化(corticobasal degeneration)、伯耳氏癱(Bell’s palsy)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)、皮克氏症(Pick's disease)以及自閉症(autism)。

在某些具體例中，此處所描述的方法可被用來改善或改進一神經性疾病或障礙的一症狀。與神經性疾病或障礙有關聯的症狀的非-限制性實例包括震顫(tremor)、步態病變(gait disorder)、不良性步態(maldispositional gait)、痴呆(dementia)、過度腫脹(excessive swelling)[水腫(edema)]、肌無力(muscle weakness)、下肢萎縮(atrophy in the lower extremity)、運動障礙(movement disorder)[舞蹈病(chorea)]、肌肉僵直(muscle rigidity)、物理運動的一慢化[運動遲緩(bradykinesia)]、物理運動的缺失(運動失能症)、健忘(forgetfulness)、認知(智能)損傷[cognitive(intellectual)impairment]、辨識的缺失(loss of recognition)[失識症(agnosia)]、經損傷的功能(諸如決策與計畫)、半面臉部麻痺(hemifacial paralysis)、感覺缺失(sensory deficits)、麻木(numbness)、刺痛感(tingling)、四肢的疼痛感覺異常(painful paresthesias in the extremities)、虛弱(weakness)、腦神經麻痺(cranial nerve palsies)、語言障礙(difficulty with speech)、眼球運動(eye movements)、視野障礙(visual field defects)、失明(blindness)、出血(hemorrhage)、分泌物(exudates)、近端肌肉失用(proximal muscle wasting)、運動困難症(dyskinesia)、四肢肌肉張力的異常(abnormality of tonus in limb muscles)、肌強直減少(decrease in myotony)、運動失調(incoordination)、在手指-手指測試或手指-鼻測試中錯誤的指示、辨距不良(dysmetria)、霍-斯二氏現象(Holmes-Stewart phenomenon)、不完全的或完全的全身性麻痹(incomplete or complete systemic paralysis)、視神經炎(optic neuritis)、視物顯多症(multiple vision)、眼球運動障礙(ocular motor disturbance)[諸如眼球震顫(nystagmus)]、痙攣性麻痺(spastic paralysis)、痛苦的強直發作(painful tonic seizure)、Lhermitte氏綜合症(Lhermitte syndrome)、失調症(ataxia)、語言困難(mogilalia)、膀胱直腸障礙(vesicorectal disturbance)、起立性低血壓 (orthostatic hypotension)、運動功能的減少(decrease in motor function)、尿床(bed wetting)、貧乏的言語表達(poor verbalization)、不充足的睡眠型態(poor sleep patterns)、睡眠障礙(sleep disturbance)、食慾障礙(appetite disturbance)、體重改變(change in weight)、心理動作激動或遲滯(psychomotor agitation or retardation)、經減少的活力(decreased energy)、無價值的感受或過度或不適當的內疚、思考或全神貫注之困難、反復的死亡意圖或者自殺的意念或企圖、害怕(fearfulness)、焦慮(anxiety)、興奮增盛(irritability)、沉思的或強迫性沉思(brooding or obsessive rumination)、過度擔心身體健康(excessive concern with physical health)、恐慌發作(panic attacks)以及恐懼症(phobias)。

在某些具體例中，此處的方法可被使用於治療或預防癌症，其中該癌症是癌(carcinoma)。進一步地，該癌是腺癌(adenocarcinoma)或絨毛膜癌(choriocarcinoma)。在一個實例中，絨毛膜癌是惡性融合細胞瘤(syncytioma malignum)。

胰島素、C-胜肽、β滋養因子蛋白質以及β滋養因子mRNA的生產

在一個方面，此處所提供的是一種生產胰島素的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種用來活化miR-124的試劑接觸，藉此產生一對葡萄糖刺激反應而分泌胰島素的祖細胞。在另一個方面，此處所提供的是一種生產β滋養因子蛋白質和/或β滋養因子mRNA的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞與一或多種用來活化miR-124的試劑接觸，藉此產生一生產β滋養因子蛋白質和/或β滋養因子mRNA的胰臟祖細胞。在一個實例中，該β滋養因子蛋白質或β滋養因子mRNA是在誘導之後的大約12-28小時之間(例如，在誘導之後的大約12-16、16-20、20-24或24-28小時)被生產。在一個實例中，該祖細胞是一胰臟祖細胞。在一個實例中，該祖細胞生產C-胜肽和/或胰島素。

在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞是來自於嚙齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠或松鼠)、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或人猿(例如，黑猩猩、大猩猩或紅毛猩猩)。

在某些具體例中，該miR-124是在一定型內胚層階段(例如，在定型內胚層階段的大約1小時至大約8小時之間)被時空地活化。在某些具體例中，該miR-124的表現被提高。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一蛋白質或類固醇激素，例如，一生長因子。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一FGF[例如，FGF1、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9或FGF10]。在某些具體例中，該FGF(例如，bFGF)沒有大於大約200ng/mL(例如，從大約100-200ng/mL)。在某些具體例中，該FGF(例如，bFGF)沒有大於大約100 ng/mL(例如，從大約0.1至1ng/mL，或從大約1至大約100ng/mL)。在某些具體例中，此處所使用的FGF(例如，bFGF)的濃度是大約從0.1至1、1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100ng/mL。在某些具體例中，此處所使用的FGF(例如，bFGF)的濃度是大約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90ng/mL。在某些具體例中，該FGF(例如，bFGF)是大約10ng/mL。在某些具體例中，該一或多種試劑進一步包含有一抗氧化劑或還原劑，例如，2-巰乙醇。在某些具體例中，該一或多種試劑進一步包含有一維生素，例如，菸鹼醯胺。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被接觸以FGF(例如，bFGF)、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺。在某些具體例中，該抗氧化劑或還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度沒有大於大約10mmol/L(例如，從大約0.1至大約10mmol/L)。在某些具體例中，該抗氧化劑或還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約從0.1至1、1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9或9至10mmol/L。在某些具體例中，該抗氧化劑或還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在某些具體例中，該抗氧化劑或還原劑(例如，2-巰乙醇)的濃度是大約1mmol/L。在某些具體例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度沒有大於大約100mmol/L(例如，從大約1至大約100mmol/L)。在某些具體例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約從1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、50至70、80至90或90至100mmol/L。在某些具體例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在某些具體例中，維生素(例如，菸鹼醯胺)的濃度是大約10mmol/L。

在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞被接觸以一或多種試劑來調控cAMP反應要素結合蛋白1(CREB1)的活性或表現位準(例如，CREB1磷酸化)。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一維生素代謝物，例如，視黃酸。在某些具體例中，該一或多種試劑包含有一CREB1-結合蛋白質。在某些具體例中，該一或多種試劑調控一或多種選自於下列所構成的群組中之因子：mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2以及GSK3 β。

在某些具體例中，此處的miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e(例如，miR-124a)。在某些具體例中，該miR-124a是智慧人miR-124a(hsa-miR-124a)[例如，hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段]。在某些具體例中，該miR-124包含有一選自於表1、表2以及圖式中的序列或它的一片段。

再生醫學研究與治療(Regenerative Medicine Research and Therapies)

在某些具體例中，此處的一哺乳動物滋養層幹細胞(例如，一hTS細胞)或它的一經分化的細胞可被使用於一器官和/或組織的生長和/或產生。在一個實例中，該哺乳動物滋養層幹細胞可被使用於產生一器官或一組織或它的一建構物(construct)，而不用一支架(scaffold)或於一支架[例如，一天然組織的一支架，或一由一生物降解材料(bio-degradable material)所製造的支架]上。此處的一生物支架中的材料可為一水凝膠(hydrogel){例如，第一型膠原蛋白(Collagen Type I)、膠原蛋白/纖維蛋白(Collagen/Fibrin)、纖維蛋白、Extracel^TM水凝膠、Extracel^TM UV、酪胺取代的透明質酸(Tyramine substituted hyaluronic acid)[(TS-NaHy)-Corgel^TM]、甲基纖維素-玻尿酸(Methylcellulose-Hyaluronan,MC-HA)、幾丁聚醣(Chitosan)、幾丁聚醣/膠原蛋白、藻酸(Alginate)、藻酸/明膠(Alginate/Gelatin)、聚乙二醇二丙烯酸酯(Polyethylene Glycol Diacrylate,PEGDA)或它們的任何組合}。在一個實例中，此處的哺乳動物滋養層幹細胞可使用一3D細胞生物印刷技術(3D cell bioprinting technique)而被使用於產生一器官和/或組織。該3D細胞生物印刷技術包括那些於美國專利案公開號20130017564、2012/0190078、2012/0116568、2011/0250688、 2011/0136162以及2009/0263849中所揭露的。在一個實例中，該3D細胞生物印刷技術可維持高細胞可活性和/或多能性，和/或產生相同大小的球體(spheroid)。在一個實例中，此處的哺乳動物滋養層幹細胞可被用來產生胰臟組織。在一個實例中，此處的哺乳動物滋養層幹細胞可被用來產生一功能性胰臟。在某些具體例中，該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1A-1C是一系列說明從hTS細胞至胰臟祖細胞之途徑的圖式：圖1A顯示一在hTS細胞分化至胰臟祖細胞期間胰臟發育-相關的轉錄因子的時程圖表，數據表示平均值±SD(n=3獨立的實驗)，^★：p<0.05(t檢定)；圖1B顯示在DE形成期間Mixl1強度的改變；圖1C顯示將中內胚層分離成2細胞族群：一者表現關於中胚層的Pdx1⁺ Mixl1⁺以及另一者表現關於內胚層的Pdx1⁺ Mixl1^-；圖2A-2C是一系列顯示在胰臟分化中多潛能轉錄因子的動態圖表之圖式：圖2A顯示在各個階段-特異性的細胞階段唯一多潛能轉錄因子的轉變，數據表示平均值±SD(n=3個獨立的實驗)，^★：p<0.05(t檢定)；圖2B顯示在DE的轉變期間Mixl1、Cdx2以及Oct4的免疫螢光影像；圖2C顯示帶有DE階段的代表性標記的Oct4的螢光影像；圖3A-3M是一系列說明miR-124a的生合成(biogenesis)以及多方面的功能之圖式：圖3A是一關於DE形成的調控以及β滋養因子活化的機制說明；圖3B顯示一隨著時間所觀察到的在miR-124a與p-CREB1表現之間的關聯性以及活性PI3K/Akt/CREB1信號傳遞途徑標靶miR-124a的不同位址；圖3C顯示一藉由qPCR分析的p-CREB1以及miR-124a的平行表現；圖3D-3F顯示用於螢光酵素報導子分析(luciferase reporter assay)的質體的構築：圖3D顯示關於Smad4的pGL4.51-Luc報導子建構物；圖3E顯示關於Cdx2的pGL4.51-Luc報導子建構物；以及圖3F顯示關於GSK3 β的pGL4.51-Luc報導子建構物；數據表示平均值±SD(n=5)，^★：p<0.05(t檢定)；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為正對照組；空的載體被使用作為負對照組；圖3G顯示在誘導之後miR-124a或抗-miR-124a的預-轉染在Smad4、Mixl1、Cdx2、GSK3 β以及Oct4的表現上之效用；圖3H顯示Oct4標靶Sox17基因以在第4小時之時生成Sox17(箭頭)；輸入：正對照組；IgG：負對照組；圖3I顯示在ChIP分析中β-連接素(β-catenin)標靶Foxa2基因以顯著地生成Foxa2(箭頭)(4小時)；輸入：正對照組；IgG：負對照組；圖3J-M顯示β滋養因子的合成與調控：圖3J顯示藉由ChIP分析，Foxa2標靶C19或f80基因以生成β滋養因子(箭頭)；以及圖3K顯示從一qPCR分析中β滋養因子mRNA在第16小時之時的一短暫的升高[以甘油醛-3-磷酸去氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)而被標準化]；圖3L是一系列的西方墨點分析數據，其顯示一β滋養因子、C-胜肽以及胰島素之間的平行關聯性；數據表示平均值±SD(n=3)，^★：p<0.05(t檢定)；圖3M顯示藉由24小時的誘導，β滋養因子以及胰島素的免疫螢光共表現；圖4A-4E是一系列顯示hTS細胞-衍生的胰臟祖細胞的特性之圖式：圖4A-4C顯示活體外功能性葡萄糖刺激測試；圖4A顯示藉由ELISA分析，細胞對高葡萄糖濃度(15mM，灰色柱)反應以產生免疫反應胰島素(immunoreactive insulin)；圖4B是一系列的影像的代表性摘錄，其顯示藉由一電腦-顯微鏡-視訊系統(Olympus,IX-81,DP30,MIU-IBC-IF-2)所記錄的形態變化以及一陽性DTZ染色；圖4C顯示藉由放射免疫分析(radioimmunoassay)，高葡萄糖(2 5mM)刺激分別產生具有7.6ng/小時/10⁶細胞的C-胜肽(被表示於上面的線中)以及具有393.8μIU/小時/10⁶細胞的胰島素(被表示於下面的線中)，數據藉由曲線下面積(area under curve)而被測量並且表示平均值±SD(n=5)，^★：p<0.05(t檢定)；圖4D是在高葡萄糖刺激之後，一系列的似-葡萄細胞群的超微結構顯微圖，在中間的影像中的白色箭頭：胞橋小體連接(desmosome junction)；下方的箭頭：β-胰島素細顆粒(β-insulin granules,β-G)；2上方的箭頭：α-升糖素細顆粒(α-glucagon granules,α-G)；N：核；Im-G：未成熟的細顆粒；M：粒線體；RER：粗糙內質網；比例尺：1μm；圖4E顯示在bFGF誘導之後在hTS細胞中胰臟祖細胞標記在第24小時之時的免疫螢光染色，對照染色未被顯示；圖5是一長條圖，其顯示藉由免疫螢光分析所測量的來自於hTS細胞的胰島素-表現細胞藉由各種不同的因子[包括bFGF、2-巰乙醇(2-ME)以及菸鹼醯胺]的組合所造成的誘導效力；圖6A是一系列的TissueQuest分析影像，其顯示藉由胰島素以及Ngn3的共-表現，bFGF在生產來自於hTS細胞的胰島素-表現細胞上的劑量-效應；圖6B是一長條圖，其表示圖6A中的數據在三重複測定下的平均值±SD；圖7是一TissueQuest分析影像，其顯示藉由胰島素以及升糖素的共-表現，bFGF(10ng/mL)達至胰島素-表現細胞的相似百分比；圖8是一系列來自於一代表性免疫墨點分析的影像，其說明在不同細胞歷程期間轉錄因子隨著時間在位準上的動態；短線框表示DE狀態；β-肌動蛋白被使用作為對照組；數據表示平均值±SD(n=3)，^★：p<0.05；圖9是一示意圖，其說明在bFGF-誘導的細胞歷程中，多潛能轉錄因子(Nanog、Sox2、Cdx2以及Oct4)之間的負向自動調控反饋迴路(negative autoregulatory feedback loop)；圖10是一系列的流動式細胞測量影像，其顯示一Cdx2(左方)與Oct4(右方)之間的相互抑制關係；非-專一性shRNA被使用作為對照組；圖11是一系列的西方墨點影像，其顯示Cdx2的弱化(knockdown)上升-調節Oct4；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組(loading control)；圖12是一系列的流動式細胞測量影像，其顯示Oct4的弱化上升-調節Nanog(左方)以及反之亦然(右方)；圖13是一系列的流動式細胞測量影像，其顯示Nanog的弱化上升-調節Sox2(右方)以及反之亦然(左方)；圖14是一示意圖，其說明一多潛能轉錄因子之間的相互抑制的自動調控迴路(autoregulatory loop)；圖15是一系列的西方墨點分析影像，其顯示FGFR抑制劑(PD 166866)阻斷bFGF-誘導的PI3K；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖16是IP分析數據，其顯示Akt直接與CREB1交互作用；圖17是一系列的西方墨點分析影像，其顯示PI3K siRNA抑制PI3K以及p-Akt的表現；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖18是一系列的西方墨點分析影像，其顯示對抗Akt次單元的siRNAs抑制bFGF-誘導的p-Akt以及p-CREB1的表現；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖19是一長條圖，其顯示當含有miR-124a或抗 -miR-124a cDNA的質體被轉染至hTS細胞中以供分析中的實驗設定時相對的miR-124a表現，數據表示平均值±SD(n=5)；圖20是一長條圖，其顯示被單獨誘導以bFGF的hTS細胞以及被轉染以CREB1 shRNAs的bFGF-誘導的hTS細胞的相對的miR-124a表現；非-專一性shRNA被使用作為對照組；數據表示平均值±SD(n=3)，^★：p<0.05；圖21是一系列的西方墨點分析影像，其顯示藉由使用Smad4 shRNAs，bFGF-誘導的Mixl1抑制被抑制；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖22是一系列的西方墨點分析影像，其顯示藉由使用Oct4 shRNAs，bFGF-誘導的Oct4以及Sox17表現被抑制；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖23是一系列的西方墨點分析影像，其顯示在bFGF誘導之後的1-4小時之間的一抑制性GSK3 β，致使在相同期間一β-連接素的堆積；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖24是一系列的一西方墨點分析影像，其顯示在對抗Foxa2的shRNAs的存在下，bFGF-誘導的Foxa2表現被弱化；被轉染以非-專一性shRNA的細胞被使用作為對照組；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；圖25是一系列的西方墨點分析影像，其顯示在bFGF 誘導之後的第24小時之前β滋養因子、C-胜肽以及胰島素之中在表現上的一動態關聯；在第28小時之時，在β滋養因子位準上有一下降的趨勢，而C-胜肽以及胰島素的位準維持在較高的位準；β-肌動蛋白被使用作為加載對照組；以及圖26是一系列的免疫細胞化學影像，其顯示在bFGF-誘導的胰臟祖細胞中β滋養因子(淺色的點)以及胰島素(深色的點)的共表現。

實施例

下面的實施例是非-限制性的並且僅為本發明的各種不同方面以及特徵的代表。

實施例1. hTS細胞的分離

此實驗是由高雄醫學大學附設中和紀念醫院的人體研究以及倫理委員會的機構審查委員會(Institutional Review Board on Human Subjects Research and Ethics Committees,Kaohsiung Medical University Hospital)所認可。子宮外孕-衍生的hTS細胞是從具有經告知的同意(informed consent)的捐贈者中被獲得。由人體研究以及倫理委員會的機構審查委員會所認可的，胚胎絨毛膜絨毛是從帶有子宮外孕的婦女(胎齡：5-7週)中的輸卵管的未破裂的著床前胚胎中被獲得。微小的絨毛組織在無血清α-MEM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中被徹底地切碎以及在顯微鏡下被鑑別，繼而使用0.025%胰蛋白酶/EDTA (Sigma-Aldrich)胰蛋白酶化歷時15分鐘以及藉由添加含有10% FBS的α-MEM以終止反應。貼附的細胞是在條件α-MEM、10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素中(在37℃下，在5% CO₂中)被獲得與被培養。在傳代2代之後，藉由一商業套組(Dako,Carpinteria,CA)所測量的，hCG的位準會變成偵測不到。

實施例2. 藉由調節miR-124a在活體外分化hTS細胞成為胰臟祖細胞

含有5.5mM葡萄糖、1mmol/L β-巰乙醇(ME)、10mmol/L菸鹼醯胺、20% FBS以及10ng/mL bFGF的α-MEM培養基的組合相較於其它表現2.1%以及1.9%的胰島素-陽性的細胞族群的組合產生11.2%的最高之免疫反應性胰島素-陽性的細胞族群(圖5)。bFGF誘導使用各種不同位準的bFGF(亦即10、20、40以及80ng/mL)以及FBS(亦即無血清的、1%、5%、10%以及20%)。結果顯示不同劑量的bFGF分別產生8.6%、2.2%以及0.6%的胰島素⁺/Ngn3⁺細胞(圖6)。一相似的結果是藉由使用免疫反應性胰島素⁺/升糖素⁺細胞(8.5%)作為指標而被達成(圖7)。關於胰島素⁺升糖素⁺-表現的細胞的總細胞數=1,232細胞。關於胰島素⁺Ngn3⁺-表現的細胞的總細胞數=502細胞(bFGF 10ng/mL)、712細胞(bFGF 20ng/mL)、485細胞(bFGF 40ng/mL)以及571細胞(80ng/mL)。西方墨點分析顯示一在bFGF誘導期間FBS與胰島素位準的正相關。

關於bFGF誘導，一時程分析顯示一鑑別胰臟發育的級聯階段的轉錄因子的動態圖表(圖1A以及圖8)。在誘導起始之時，似Mix 1同源盒蛋白質(Mix-like 1 homeobox protein,Mixl1)(一中內胚層-相關的蛋白質)在誘導之後的第15分鐘之時升高。與經升高的Brachyury(T)或Goosecoid(Gsc)結合，證據顯示一移動的新生中內胚層的階段。Mixl1在第1小時之時下降，然而T以及Gsc維持於高位準，這暗示一從hTS細胞至中內胚層的早期轉變。

在第1-8小時之時，Mixl1位準在第4小時之時降至一最低點以及在第8小時之時回復至原始位準。此結果可能造成內胚層中的細胞在原腸胚形成(gastrulation)期間維持平穩。Mixl1強度在第1-4小時之時的改變(圖1B)導致中內胚層分隔成為2細胞族群：一者表現關於中內胚層的Pdx1⁺Mixl1⁺以及另一者表現關於內胚層的Pdx1⁺Mixl1^-(圖1C)。Mixl1 mRNA表現被局限於中胚層，但內胚層是缺少的。SRY同源盒17(SRY homeobox 17,Sox17)、叉頭盒蛋白質A2(forkhead box protein A2,Foxa2)以及胰臟與十二指腸的同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1,Pdx1)的上升調節標記胰芽的生長。Sox17被需要去起始分隔成一Pdx1⁺腹胰以及一Sox17⁺膽原基(biliary primordium)，但沒有肝臟。Foxa2以及Pdx1的共-表現增強分化成為不同的胰臟細胞亞型。Pdx1的過度表現決定胰臟特化，但沒有誘導胰島素生成，即使在分化的晚期。

在第8-16小時之時，SRY同源盒9(SRY homeobox 9,Sox9)以及Pdx1(前腸胰臟內胚層的標記)被升高。Sox9維持多潛能胰臟祖細胞。然而Pdx1的基因缺損致使在腸器官形成(gut organogenesis)期間的胰臟、胃尾部(caudal stomach)以及十二指腸上的缺陷。證據顯示分化成前腸胰臟內胚層階段。

在第16-24小時之時，神經元素-3(neurogenin 3,Ngn3)以及Nkx6同源盒1(Nkx6 homeobox 1,Nkx6.1)的位準維持在高位準，但T、Sox17、Foxa2、Pdx1、Sox9以及Ptf1a的位準逐漸降低，指引細胞分化朝向胰臟祖細胞。Pdx1調節Ngn3以供內胚層細胞轉成為內分泌細胞以經由在間葉(mesenchyme)中表現升糖素以及體抑素(somatostatin)而形成胰島。Nkx6.1的升高增加β-細胞增生。共同地，這些結果顯示bFGF在24小時內誘導hTS細胞經由DE形成以及原腸內胚層分化朝向胰臟祖細胞。

圖2A以及圖9顯示Cdx2、Oct4、Nanog以及Sox2在一時程分析中的一動態圖表。在各個分化階段的優勢多潛能轉錄因子包括關於中內胚層的Cdx2、關於DE的Oct4以及Nanog、關於原腸內胚層的Cdx2以及Nanog，以及關於胰臟祖細胞的Sox2。免疫細胞化學研究顯示一在細胞轉變期間(圖2B、圖14)的相互負向自動調控反饋迴路(圖10-13)，這與hES細胞中的研究結果相符。圖2C顯示Oct4伴隨Sox17、Foxa2、Pdx1以及Gsc在第4小時之時的免疫細胞化學過度表現，確認Oct4在DE階段。這些結果顯示多潛能轉錄因子的一獨特的相互作用以及表現型改變，這決定胰臟分化期間的細胞命運(cell fate)。

圖3A說明經由miR-124a的關於DE特化的分子途徑。免疫墨點分析顯示bFGF經由FGFR1活化PI3K/Akt途徑以及它的下游效應子cAMP反應要素結合蛋白1(CREB1)(圖15-18)。一miR-124a以及p-CREB1表現之間的關聯隨著時間被觀察(圖3B)，顯示CREB1促進miR-124a的生成(圖3C、圖19-20)。這些結果顯示bFGF經由CREB1的磷酸化誘導miR-124a的生合成。

miRNAs是基因的後-轉錄調節子，其標靶3’未轉譯區域(3’untranslated region,3’UTR)內的mRNA序列以抑制轉譯和/或造成RNA降解。透過序列分析以及螢光素酶報導子分析(luciferase reporter assay)，miR-124a抑制Smad4(圖3D)、Cdx2(圖3E)以及GSK3 β(圖3F)。證據藉由miR-124a以及抗-miR-124a的預-轉染確認這些結果(圖3G)。與報導一致的，Smad4的弱化抑制Mixl1(圖21)，這解釋在DE轉變期間Mixl1的下降調節。Cdx2的抑制接著促進Oct4活化。染色質免疫沉澱(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析顯示Oct4標靶Sox 17的啟動子(圖3H)以供Sox 17表現(圖22)。依次地，GSK3 β在第1-4小時之時的抑制致使細胞質中β-連接素的穩定以及堆積(圖23)。β-連接素的核轉位(nuclear translocation)標靶Foxa2基因(圖3I)以供Foxa2表現(圖8)。miR-124a先前被報導去調控β-細胞株中的Foxa2。為此目的，bFGF在DE階段經由上升調節Oct4、Sox17以及Foxa2但下降調節 Smad4以及Mixl1而誘導miR-124a的多方面功能。

β滋養因子(一蛋白質激素)主要地被表現於肝臟中以及功能性地誘導高的胰臟β-細胞增生速率。Foxa2標靶C19orf80基因的啟動子以在第12小時之時生成β滋養因子(圖3J、圖24)。qPCR分析顯示一β滋養因子mRNA在第12小時之時起始的時空升高，在第16小時之時達至大約100%尖峰，以及於此之後朝向24小時下降(圖3K)。β滋養因子、C-胜肽以及胰島素之間在20-28小時期間的一平行表現被觀察到，覆蓋原腸內胚層以及胰臟祖細胞階段這兩者(圖3L、圖25)。免疫細胞化學地，hTS細胞-衍生的胰臟祖細胞共-表現β滋養因子以及胰島素(圖3M、圖26)。沒有被束縛於任何特定的理論，被相信的是β滋養因子亦可能在胰臟發育期間調節胰臟祖細胞增生。

實施例3. hTS細胞-衍生的胰臟祖細胞分泌胰島素而對葡萄糖刺激反應

胰臟祖細胞藉由分泌免疫反應性胰島素至培養基中而監測葡萄糖位準(圖4A)。有趣地，使用一陽性雙硫腙染色[dithizone(IDTZ)staining](一用於β-細胞的專一性染色)，證據顯示細胞的一快速聚集以形成3D似葡萄細胞群(grape-like cell mass)。在高葡萄糖的戒斷之後，細胞群回復至似纖維母細胞特徵(圖4B)。細胞歷程是藉由一電腦-顯微鏡-視訊系統被記錄。

放射免疫分析測量免疫反應性C-胜肽以及胰島素這兩者的位準對高葡萄糖(25mM)刺激反應的一顯著的升高(圖4C)。DTZ-陽性細胞群的超微結構研究顯示具有一大的細胞質對於核的比例的圓形細胞、細胞間橋(intercellular bridge)(胞橋小體連接)、大量的粒線體、未成熟的顆粒(immature granule)以及模仿那些胰臟的α-與β-細胞所具有的分泌性顆粒(secretory granule)的存在(圖4D)。

hTS細胞-衍生的胰臟祖細胞免疫細胞化學地表現各種不同的標記，包括Sox2、Nkx6.1、Ptf1a、Ngn3、Pdx1、Sox9、β滋養因子以及內分泌組分[諸如胰島素(β-細胞)、體抑素(δ-細胞)、升糖素(α-細胞)、胰臟多肽(PP-細胞)、葡萄糖代謝性轉運蛋白(glucose metabolic transporter)Glut2以及催化酵素澱粉酶](圖4E)。全部的證據顯示胰臟祖細胞的存在以及它們藉由表現C-胜肽以及胰島素而對葡萄糖刺激測試作出正向地反應。

於實施例2-3中所描述的用於實驗的材料與方法細胞培養與分化：

未經分化的hTS細胞被維持於補充有10%(v/v)胎牛血清(SAFC Biosciences)的α-MEM(Gibco)中。培養物手動地於一每2-3天1：3-1：6分裂比下被傳代培養。胰臟祖細胞的分化是藉由一含有20% FBS、1mM 2-巰乙醇、10mM菸鹼醯胺以及10ng/mL bFGF的條件α-MEM培養基而於37℃、5% CO₂培養箱中被執行歷時24小時。分化的攝生法是藉由如圖5-7中所顯示的經驗性經驗而被決定。階段-特異性的譜系的分化被意指如先前所描述的各種不同的細胞標記(M.Borowiak,Rev.Diabet.Stud. 7,93-104(2010)；K.A.D’Amour,et al.,Nat.Biotech. 23,1534-1541(2005)；E.Kroon,et al.,Nat.Biotech. 26,443-452(2008))。細胞是於有如用於不同分析所指示的時間下被收穫。

試劑：

DTZ(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)；bFGF(Sigma)；螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate,FITC)；德州紅594(Texas Red 594)(Invitrogen)；DyLight 488-、DyLight 594-(Thermo Scientific)；藻紅素(PE)-綴合的二次抗體[phycoerythrin(PE)-conjugated secondary antibody](Jackson ImmunoResearch,Baltimore,MD)。shRNAs是購自於台灣的中研院國家NRAi核心設施(National RNAi Core Facility,Academia Sinica,Taiwan)。

西方墨點分析：

此分析的方法於先前被描述(T.T.Y.Lee,et al.,PLoS ONE 7,e52491(2012))。簡言之，細胞被收穫至補充有蛋白酶以及磷酸酶抑制劑(Roche)的RIPA溶解溶液(Millipore,Billerica,MA)中。在30-μg溶胞產物在聚丙烯醯胺凝膠上的電泳之後，電轉漬至PVDF膜(Millipore)上被執行。在室溫下被封阻於5%脫脂奶粉(配於PBS中)中歷時1小時之後，標的蛋白質是藉由使用一次抗體而被偵測。全部的膜被培育以化學發光劑 (chemiluminescent)(Millipore)以及造影是藉由ChemiDoc XRS系統(Bio-RAD)而被拍攝。所使用的抗體被列示於表S1中。數據是藉由AlphaEaseFC(version 4.0.0)而被分析。

免疫螢光：

具有細胞培養物的玻片在室溫下在95%(v/v)乙醇中被固定歷時30分鐘，以PBS清洗3次以及被培育以含有0.1%(wt/v)Triton X-100(Sigma)以及5%(v/v)標準驢血清(Millipore)的封阻緩衝液PBS歷時60分鐘。一次與二次抗體被稀釋於封阻緩衝液中。一次抗體在4℃下被培育歷時24小時或在室溫下被培育歷時2小時。在培育以專一性一次抗體(配於PBS中)之後，適當的螢光素異硫氰酸鹽(FITC,Invitrogen)或Alexa Fluor 488、594、647(Invitrogen)或Dylight 488、594(BioLegend)綴合的二次抗體在室溫下被添加歷時1小時。藉由4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色，核(5分鐘)細胞被進行顯微鏡法。繼而在室溫下培育以二次抗體(1小時)以及清洗，玻片被固定以50%甘油。影像是於共焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)(LSM700；Zeiss Z1或Olympus FluoView 1000共焦雷射掃描顯微鏡)或TissueFAXS系統(TissueQnostics GmbH,Vienna,Austria)下被拍攝以及數據如先前所描述的藉由TissueQuest軟體而被分析(T.T.Y.Lee,et al.,PLoS ONE 7,e52491(2012))。

TaqMan miRNA以及定量即時PCR分析(Quantitative Real-time PCR Assay)：

RNA是依據製造商的操作指引使用TRIZOL試劑(Invitrogen)與DNAase I on-column分解(Qiagen,Valencia,CA)在三重複或五重複樣品中而從hTS細胞中被分離。總RNA(500ng)是使用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)而被用於反轉錄。PCR是使用每反應1/40^th的cDNA以及400nM前向與反向引子而被執行二重複。用於miRNA莖-環(stem-loop)qPCR，單管TaqMan miRNA分析是根據製造商的操作指南(Applied Biosystems)而被使用。全部的RT反應(包括無模板對照組以及無RT對照組)是於一GeneAmp PCR 9700熱循環器(Applied Biosystems)中被執行。比較性即時PCR是使用針對miR-124或RNU6B的專一性引子(Applied Biosystems)而被執行三重複或五重複，包括無模板對照組。U6 snRNA(RNU6B；Applied Biosystems)作用作為一內生性對照組(endogenous control)。相對表現是使用SDS2.2.2軟體(Applied Biosystems)而被計算，被使用於比較性△C _t分析。被使用於β滋養因子mRNA的引子的序列：引子1，前向：5’-acatctccctccccagactc-3’(序列辨識編號：120)以及反向：5’-tgctctgtgctcagaagtgg-3’(序列辨識編號：121)；引子2，前向：5’-ctgtcggctgagggtttccat-3’(序列辨識編號：122)以及反向：5’-gagtctggggagggagatgt-3’(序列辨識編號：123)。

免疫沉澱(IP)分析：

bFGF-處理的hTS細胞的細胞溶胞產物被收集。藉由培育以蛋白質G-瓊脂糖(Minipore)歷時30分鐘，總蛋白質(100μg)被處理以表S1中所列示的專一性一次抗體隔夜。在處理以蛋白質G-瓊脂糖珠粒歷時2小時之後，樣品是使用RIPA溶解緩衝液(Minipore)而被清洗3次，繼而添加以蛋白質裝填染劑(protein loading dye)以及煮沸歷時5分鐘。樣品是藉由8% SDS-PAGE而被解析以及被進行免疫墨點分析。

染色質免疫沉澱(ChIP)分析：

ChIP分析是藉由使用ChIP分析套組(Millipore)如製造商的操作指南而被執行。簡言之，經免疫沉澱的DNA片段是從hTS細胞(1×10⁶)中被萃取以及抗-CREB1或抗-Oct4或抗-β-連接素抗體是有如先前所描述的而被使用(T.T.Y.Lee,et al.,PLoS ONE 7,e52491(2012))。專一性引子被用來擴增miR-124a或Sox17或Foxa2的啟動子區域之處的守恆結合位址(conserved binding site)以及被列示如下：針對miR124-2的啟動子：前向5’-tctgcggctctttggtttca-3’(序列辨識編號：124)以及反向5’-tctgccttcagcacaagagg-3’(序列辨識編號：125)；以及前向5’-gcggctctttggtttcaagg-3’(序列辨識編號：126)，反向5’-ctgccttcagcacaagagga-3’(序列辨識編號：127)。針對miR124-3的啟動子：5’-cccgcagttctcaaggacac-3’(序列辨識編號：128)以及反向5’-agaagggagccaggcaagtc-3’(序列辨識編號：129)。針對Sox17的啟動子： 5’-ttgtagattgctctctctcctcc-3’(序列辨識編號：130)以及反向5’-gtgaagccttggctagggg-3’(序列辨識編號：131)。針對Foxa2的啟動子：5’-cccatcattgattcctggat-3’(序列辨識編號：132)以及反向5’-ttgggaggctgagatttgtc-3’(序列辨識編號：133)。針對β滋養因子的啟動子：5’-gtcagccctccctgactgat-3’(序列辨識編號：134)以及反向5’-catgtggatttccagcctgc-3’(序列辨識編號：135)。

雙重-螢光酵素分析(Dual-luciferase Assay)：

為了製備螢光酵素-3’UTR報導子質體，經擴增的3’UTR片段是從hTS細胞的基因組DNA萃取物中被擴增。3’UTR PCR片段是藉由使用PsiI以及MfeI(Thermo Scientific,Rockford,IL)而被選殖至pGL4.51載體(Promega,Madison,WI)的螢光酵素基因下游中。針對3’UTR報導子建構物的引子被列示如下：針對Cdx2 3’UTR：前向5’-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3’(序列辨識編號：136)以及反向5’-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3’(序列辨識編號：137)。針對Smad4 3’UTR區域1：前向5’-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3’(序列辨識編號：138)以及反向5’-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3’(序列辨識編號：139)。針對Smad4 3’UTR區域2：前向5’-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3’(序列辨識編號：140)以及反向5’-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3’(序列辨識編號：141)。針對GSK3 β 3’UTR：前向 5’-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3’(序列辨識編號：142)以及反向5’-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3’(序列辨識編號：143)。

關於雙重螢光酵素分析，螢火蟲螢光酵素報導子(500ng)或被共-轉染以pGL4.74水母螢光酵素質體(500ng；Promega)以及非-專一性對照組miRNA(30pmol)或miR-124a前驅物(30pmol；System Biosciences,Mountain View,CA)的沒有任何3’UTR的空載體是使用TransIT®-LT1轉染試劑(Mirus Bio LLC,Madison,WI,US)而被共-轉染至hTS細胞(各個井中1.5×10⁴細胞)。在轉染(36小時)之後，螢光酵素活性是藉由雙重螢光酵素報導子分析系統(Promega)以及Centro LB 960微盤式冷光儀(Centro LB 960 Microplate Luminometer)(Berthold Technologies,Bad Wildbad，德國)而被分析。用於評估，水母螢光酵素值首先被標準化至螢火蟲螢光酵素活性以及各個3’UTR報導子的經計算的活性被進一步標準化至對照載體所具者。數據表示平均值±SD(n=8)，p<0.05作為統計學顯著性。在細胞溶解緩衝液中所製備的完整細胞萃取物使用Cdx2、Smad4、GSK3 β以及β-肌動蛋白抗體而被進行免疫墨點分析。

miR-124a前驅物或抗-miR-124a的轉染：

miR-124a前驅物以及抗-miR-124a是購自於System Biosciences。簡言之，miR-124a前驅物(60pmol)或抗-miR-124a(60pmol)是使用TransIT-LT1轉染試劑 (Mirus,Madison,WI)在12-井培養皿中被轉染至hTS細胞。在轉染之後的第36小時之時，總RNAs被使用於定量miR-124a。

C-胜肽以及胰島素的放射免疫分析：

在葡萄糖刺激測試中，高葡萄糖(25mM)在bFGF處理之後在超過80%匯聚的細胞下被添加至α-MEM培養基(5mL)中。培養基在不同的時間(5、10、20、30、60以及120分鐘)之時被收集。經收集的培養基藉由冷凍乾燥機(VirTis,Warminster,PA)被凍乾以及使用無菌水(400μL)而被復水以供放射免疫分析。在培養基中的C-胜肽以及胰島素位準是分別藉由C-PEP II-RIA-CT(DIAsource ImmunoAssays S.A.Belgium)以及Coat-A-Count胰島素(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.LA,CA)而被測定。n=5，p<0.05作為統計學顯著性。

流動式細胞測量分析：

在轉染以非-專一性shRNA或對抗Cdx2或Oct4或Sox2或Nanog的shRNAs之後，細胞(5×10⁶細胞/mL)被培育以專一性一次抗體(被列示於表S1中)歷時30分鐘。藉由在經調整的稀釋下在4℃下培育以適當的螢光染劑-綴合的一次抗體歷時1小時，樣品在流動式細胞測量分析(FACScan,BD Biosciences,San Jose,CA)之前被清洗以及被重新散浮於PBS中，繼而通過具有細胞過濾器蓋(BD Falcon)的聚苯乙烯圓底管。數據是使用Cell-Quest軟體(BD Biosciences)而被分析。

穿透電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy)：

在高葡萄糖刺激之後，培養皿上的hTS細胞-衍生的似胰島細胞群是使用鎢針(wolfram needle)而被切割。用於穿透電子顯微鏡，細胞叢在室溫下被固定於含有3%(wt/vol)甲醛、1.5%(wt/vol)戊二醛以及2.5%(wt/vol)蔗糖的0.1M二甲胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)中歷時1小時以及在4℃下隔夜。樣品在4℃下在含有1%(vol/vol)OsO₄的Palade’s固定劑中鋨酸化(osmication)的2小時之前與之後被清洗以二甲胂酸鈉緩衝液，被處理以單寧酸(tannic acid)、被染色以醋酸鈾醯(uranyl acetate)、透過一梯度-系列的乙醇溶液而被脫水，以及被埋入TABB環氧樹脂(TABB epoxy resin)(Agar Scientific Ltd.)中。超薄切片被染色以醋酸鈾醯以及檸檬酸鉛(lead citrate)，並且使用JEM-2000 EXII(JEOL，東京)而被檢測。囊泡顆粒(vesicle granule)的造影被參照於先前所描述的(K.A.D’Amour,et al.,Nat.Biotech. 23,1534-1541(2005))。

統計學分析：

全部的實驗是呈三重複而被實施並且被重複2次或有如所指示的。從西方墨點分析、qPCR、螢光酵素分析以及流動式細胞測量分析中所獲得的數據是藉由史徒登氏t-檢定(Student’s t-test)而被計算。p值<0.05被認為具有統計學顯著性。

當適合時，此處所揭露的一或多種具體例、實例或方面可被組合以此處所揭露的任何其它具體例、實例或方面。

當某些具體例已於此處被顯示以及被描述，該等具體例僅被提供作為例示。許多的變化、改變以及替換可在不背離本發明之下發生。應被瞭解的是此處所描述的本發明的具體例的各種不同的替代方式可被使用於實施本發明。

<110> 加速生物科學有限公司

<120> 藉由調節MIR-124來將幹細胞分化的方法

<130> miR-124以及Smad4 shRNA的啟動子序列

<160> 145

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智慧人

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 智慧人

<400> 2

<210> 3

<211> 85

<212> RNA

<213> 智慧人

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 埃及斑蚊

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 綠色蜥蜴

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 綠色蜥蜴

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 甘比亞瘧蚊

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 黑蜘蛛猴

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 義大利蜂

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 碗豆蚜

<400> 10

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 豬蛔蟲

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 豬蛔蟲

<400> 12

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 佛羅里達文昌魚

<400> 13

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 佛羅里達文昌魚

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 馬來血絲蟲

<400> 15

<210> 16

<211> 23

<212> RNA

<213> 家蠶

<400> 16

<210> 17

<211> 23

<212> RNA

<213> 歐洲牛

<400> 17

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 歐洲牛

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 布里吉沙耶隱桿線蟲

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> RNA

<213> 鯉魚

<400> 20

<210> 21

<211> 22

<212> RNA

<213> 鯉魚

<400> 21

<210> 22

<211> 23

<212> RNA

<213> 線蟲

<400> 22

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> 線蟲

<400> 23

<210> 24

<211> 21

<212> RNA

<213> 家犬

<400> 24

<210> 25

<211> 22

<212> RNA

<213> 灰倉鼠

<400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 玻璃海鞘

<400> 26

<210> 27

<211> 22

<212> RNA

<213> 玻璃海鞘

<400> 27

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 玻璃海鞘

<400> 28

<210> 29

<211> 19

<212> RNA

<213> 熱帶家蚊

<400> 29

<210> 30

<211> 20

<212> RNA

<213> 腐生水果線蟲

<400> 30

<210> 31

<211> 22

<212> RNA

<213> 海鞘

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> RNA

<213> 海蠕蟲

<400> 32

<210> 33

<211> 23

<212> RNA

<213> 嗜鳳梨果蠅

<400> 33

<210> 34

<211> 23

<212> RNA

<213> Drosophila erecta

<400> 34

<210> 35

<211> 23

<212> RNA

<213> 翅膀帶有黑白斑的果蠅

<400> 35

<210> 36

<211> 23

<212> RNA

<213> 黑腹果蠅

<400> 36

<210> 37

<211> 23

<212> RNA

<213> 黑腹果蠅

<400> 37

<210> 38

<211> 23

<212> RNA

<213> Drosophila mojavensis

<400> 38

<210> 39

<211> 23

<212> RNA

<213> Drosophila persimilis

<400> 39

<210> 40

<211> 23

<212> RNA

<213> 擬暗果蠅

<400> 40

<210> 41

<211> 23

<212> RNA

<213> 蚤狀蚤

<400> 41

<210> 42

<211> 22

<212> RNA

<213> 斑馬魚

<400> 42

<210> 43

<211> 23

<212> RNA

<213> 賽昔爾果蠅

<400> 43

<210> 44

<211> 23

<212> RNA

<213> 擬果蠅

<400> 44

<210> 45

<211> 23

<212> RNA

<213> 黑果蠅

<400> 45

<210> 46

<211> 23

<212> RNA

<213> 魏氏果蠅

<400> 46

<210> 47

<211> 23

<212> RNA

<213> 參考果蠅

<400> 47

<210> 48

<211> 20

<212> RNA

<213> 家馬

<400> 48

<210> 49

<211> 21

<212> RNA

<213> 胞生絛蟲

<400> 49

<210> 50

<211> 23

<212> RNA

<213> 胞生絛蟲

<400> 50

<210> 51

<211> 20

<212> RNA

<213> 胞生絛蟲

<400> 51

<210> 52

<211> 21

<212> RNA

<213> 多包絛蟲

<400> 52

<210> 53

<211> 20

<212> RNA

<213> 多包絛蟲

<400> 53

<210> 54

<211> 22

<212> RNA

<213> 紅鰭東方魨

<400> 54

<210> 55

<211> 22

<212> RNA

<213> 雞

<400> 55

<210> 56

<211> 22

<212> RNA

<213> 雞

<400> 56

<210> 57

<211> 21

<212> RNA

<213> 雞

<400> 57

<210> 58

<211> 22

<212> RNA

<213> 大猩猩

<400> 58

<210> 59

<211> 22

<212> RNA

<213> 捻轉胃蟲

<400> 59

<210> 60

<211> 22

<212> RNA

<213> 紅帶袖蝶

<400> 60

<210> 61

<211> 23

<212> RNA

<213> 肩胛真壁蝨

<400> 61

<210> 62

<211> 21

<212> RNA

<213> 笠貝

<400> 62

<210> 63

<211> 22

<212> RNA

<213> 絨毛猴

<400> 63

<210> 64

<211> 22

<212> RNA

<213> 灰短尾負鼠

<400> 64

<210> 65

<211> 22

<212> RNA

<213> 恆河獼猴

<400> 65

<210> 66

<211> 22

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 66

<210> 67

<211> 20

<212> RNA

<213> 小鼠

<400> 67

<210> 68

<211> 21

<212> RNA

<213> 煙草天蛾

<400> 68

<210> 69

<211> 23

<212> RNA

<213> 寄生蜂

<400> 69

<210> 70

<211> 22

<212> RNA

<213> 鴨嘴獸

<400> 70

<210> 71

<211> 21

<212> RNA

<213> 鴨嘴獸

<400> 71

<210> 72

<211> 22

<212> RNA

<213> 異體住囊蟲

<400> 72

<210> 73

<211> 22

<212> RNA

<213> 異體住囊蟲

<400> 73

<210> 74

<211> 19

<212> RNA

<213> 青鱂

<400> 74

<210> 75

<211> 21

<212> RNA

<213> 青鱂

<400> 75

<210> 76

<211> 22

<212> RNA

<213> 海七鰓鰻

<400> 76

<210> 77

<211> 21

<212> RNA

<213> 海七鰓鰻

<400> 77

<210> 78

<211> 22

<212> RNA

<213> 牙鮃

<400> 78

<210> 79

<211> 22

<212> RNA

<213> 牙鮃

<400> 79

<210> 80

<211> 22

<212> RNA

<213> 侏儒黑猩猩

<400> 80

<210> 81

<211> 20

<212> RNA

<213> 圓形線蟲

<400> 81

<210> 82

<211> 20

<212> RNA

<213> 紅毛猩猩

<400> 82

<210> 83

<211> 22

<212> RNA

<213> 紅毛猩猩

<400> 83

<210> 84

<211> 22

<212> RNA

<213> 黑猩猩

<400> 84

<210> 85

<211> 22

<212> RNA

<213> 溝鼠

<400> 85

<210> 86

<211> 20

<212> RNA

<213> 溝鼠

<400> 86

<210> 87

<211> 25

<212> RNA

<213> 日本住血吸蟲

<400> 87

<210> 88

<211> 21

<212> RNA

<213> 日本住血吸蟲

<400> 88

<210> 89

<211> 22

<212> RNA

<213> 囊舌蟲

<400> 89

<210> 90

<211> 22

<212> RNA

<213> 囊舌蟲

<400> 90

<210> 91

<211> 23

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 91

<210> 92

<211> 21

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 92

<210> 93

<211> 23

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 93

<210> 94

<211> 22

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 94

<210> 95

<211> 22

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 95

<210> 96

<211> 21

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 96

<210> 97

<211> 23

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 97

<210> 98

<211> 21

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 98

<210> 99

<211> 21

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 99

<210> 100

<211> 21

<212> RNA

<213> 紫海膽

<400> 100

<210> 101

<211> 21

<212> RNA

<213> 豬

<400> 101

<210> 102

<211> 22

<212> RNA

<213> 擬榖盜

<400> 102

<210> 103

<211> 23

<212> RNA

<213> 擬榖盜

<400> 103

<210> 104

<211> 21

<212> RNA

<213> 斑胸草雀

<400> 104

<210> 105

<211> 21

<212> RNA

<213> 斑胸草雀

<400> 105

<210> 106

<211> 22

<212> RNA

<213> 金娃娃

<400> 106

<210> 107

<211> 22

<212> RNA

<213> 二點葉蟎

<400> 107

<210> 108

<211> 21

<212> RNA

<213> 二點葉蟎

<400> 108

<210> 109

<211> 22

<212> RNA

<213> 二點葉蟎

<400> 109

<210> 110

<211> 22

<212> RNA

<213> 異渦蟲

<400> 110

<210> 111

<211> 22

<212> RNA

<213> 熱帶爪蟾

<400> 111

<210> 112

<211> 21

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 112

<210> 113

<211> 23

<212> RNA

<213> 真渦蟲

<400> 113

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 114

<210> 115

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> Smad4 shRNA的髮夾式序列

<400> 115

<210> 116

<211> 21

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 116

<210> 117

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> Smad4 shRNA的髮夾式序列

<400> 117

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 118

<210> 119

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> Smad4 shRNA的髮夾式序列

<400> 119

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子mRNA的前向引子1

<400> 120

<210> 121

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子mRNA的反向引子1

<400> 121

<210> 122

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子mRNA的前向引子2

<400> 122

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子mRNA的反向引子2

<400> 123

<210> 124

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-2的啟動子的前向引子1

<400> 124

<210> 125

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-2的啟動子的反向引子1

<400> 125

<210> 126

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-2的啟動子的前向引子2

<400> 126

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-2的啟動子的反向引子2

<400> 127

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-3的啟動子的前向引子

<400> 128

<210> 129

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的miR124-3的啟動子的反向引子

<400> 129

<210> 130

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Sox17的啟動子的前向引子

<400> 130

<210> 131

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Sox17的啟動子的反向引子

<400> 131

<210> 132

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Foxa2的啟動子的前向引子

<400> 132

<210> 133

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Foxa2的啟動子的反向引子

<400> 133

<210> 134

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子的啟動子的前向引子

<400> 134

<210> 135

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的β滋養因子的啟動子的反向引子

<400> 135

<210> 136

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Cdx2 3'UTR的前向引子

<400> 136

<210> 137

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Cdx2 3'UTR的反向引子

<400> 137

<210> 138

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Smad4 3'UTR區域1的前向引子

<400> 138

<210> 139

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Smad4 3'UTR區域1的反向引子

<400> 139

<210> 140

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Smad4 3'UTR區域2的前向引子

<400> 140

<210> 141

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的Smad4 3'UTR區域2的反向引子

<400> 141

<210> 142

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的GSK3 β 3'UTR的前向引子

<400> 142

<210> 143

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於PCR的GSK3 β 3'UTR的反向引子

<400> 143

<210> 144

<211> 109

<212> RNA

<213> 智慧人

<400> 144

<210> 145

<211> 87

<212> RNA

<213> 智慧人

<400> 145

Claims

一種將一哺乳動物滋養層幹細胞分化的方法，其包含有：令該哺乳動物滋養層幹細胞同時與一用來活化miR-124的試劑、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺接觸，以誘導該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為一胰臟祖細胞，其中，該用來活化miR-124的試劑是選自於由下列所構成的群組：鹼性纖維母細胞生長因子、CREB1-結合蛋白質，以及它們的組合。
如請求項1的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞(hTS細胞)。
如請求項1的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞是來自於一嚙齒類、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或人猿。
如請求項1的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞的miR-124是於一定型內胚層階段而被時空地活化。
如請求項1的方法，其中該用來活化miR-124的試劑是鹼性纖維母細胞生長因子。
如請求項5的方法，其中鹼性纖維母細胞生長因子的濃度沒有大於大約100ng/mL。
如請求項1的方法，其中2-巰乙醇的濃度沒有大於大約10mmol/L。
如請求項1的方法，其中菸鹼醯胺的濃度沒有大於大約100mmol/L。
如請求項1的方法，其中該用來活化miR-124的試劑調控一或多種因子，其包含有mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2或GSK3 β。
如請求項1的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞的miR-124的啟動子之順-調控要素(CRE)TGACGTCA被調節。
如請求項1的方法，其中該miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e。
如請求項11的方法，其中該miR-124是miR-124a。
如請求項12的方法，其中該miR-124a是智慧人miR-124a(hsa-miR-124a)。
如請求項13的方法，其中該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或它的一片段。
如請求項13的方法，其中該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段。
如請求項1的方法，其中該miR-124包含有一選自於表1以及表2中的序列或它的一片段。
如請求項1的方法，其中在該接觸開始之後的一天內該哺乳動物滋養層幹細胞分化成為該胰臟祖細胞。
一種生產胰島素的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞同時與一用來活化miR-124的試劑、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺接觸，藉此產生一對葡萄糖刺激反應而分泌胰島素的胰臟祖細胞，其中，該用來活化miR-124 的試劑是選自於由下列所構成的群組：鹼性纖維母細胞生長因子、CREB1-結合蛋白質，以及它們的組合。
一種生產β滋養因子蛋白質或β滋養因子mRNA的方法，其包含有令一哺乳動物滋養層幹細胞同時與一用來活化miR-124的試劑、2-巰乙醇以及菸鹼醯胺接觸，藉此產生一生產β滋養因子蛋白質或β滋養因子mRNA的胰臟祖細胞，其中，該用來活化miR-124的試劑是選自於由下列所構成的群組：鹼性纖維母細胞生長因子、CREB1-結合蛋白質，以及它們的組合。
如請求項19的方法，其中該胰臟祖細胞生產C-胜肽或胰島素。
如請求項18或19的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞是一hTS細胞。
如請求項18或19的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞是來自於一嚙齒類、兔子、乳牛、綿羊、豬、狗、貓、猴子或人猿。
如請求項18或19的方法，其中該哺乳動物滋養層幹細胞的miR-124是於一定型內胚層階段而被時空地活化。
如請求項18或19的方法，其中miR-124的活化包含有提高miR-124表現。
如請求項18或19的方法，其中該用來活化miR-124的試劑是鹼性纖維母細胞生長因子。
如請求項25的方法，其中鹼性纖維母細胞生長因子的濃度沒有大於大約100ng/mL。
如請求項18或19的方法，其中2-巰乙醇的濃度沒有大於大約10mmol/L。
如請求項18或19的方法，其中菸鹼醯胺的濃度是等於或小於大約100mmol/L。
如請求項18或19的方法，其中該用來活化miR-124的試劑調控一或多種選自於由下列所構成的群組中的因子：mixl1、Cdx2、Oct4、Sox17、Foxa2以及GSK3 β。
如請求項18或19的方法，其中該miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR-124e。
如請求項30的方法，其中該miR-124是miR-124a。
如請求項31的方法，其中該miR-124a是智慧人miR-124a(hsa-miR-124a)。
如請求項32的方法，其中該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-5p(序列辨識編號：1：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或它的一片段。
如請求項32的方法，其中該hsa-miR-124a是hsa-miR-124-3p(序列辨識編號：2：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或它的一片段。
如請求項18或19的方法，其中該miR-124包含有一選自於表1以及表2中的序列或它的一片段。