TWI662129B - 經誘導的肝細胞以及它們的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示來自於一滋養層幹細胞的經誘導的肝細胞、用於誘導該等細胞的方法,以及它們的組成物。本發明亦揭示藉由利用本發明所揭示的一經誘導的肝細胞來治療一疾病或障礙(例如,肝-關聯性)的方法。

Description

經誘導的肝細胞以及它們的用途
本發明是有關於經誘導的肝細胞以及它們的用途。
無。
發明概要
此處所揭示的所有公開案、專利案以及專利申請案以參考相同範圍而被併入,如同各個個別的公開案、專利案或專利申請案被特定地以及個別地指明要被併入以作為參考資料。如果此處所揭示的一術語與一被併入的參考資料中的一術語之間發生一衝突,此處的術語支配。
在許多方面中的一者,此處所揭示的是一種在活體外(in vitro )誘導一滋養層幹(trophoblast stem, TS)細胞分化成為一經誘導的肝細胞(induced hepatocyte)的方法,其包含有:令該滋養層幹細胞與一條件培養基(conditioned medium)接觸(例如,歷時充分的時間),俾以誘導該滋養層幹細胞分化成為一經誘導的肝細胞,其中該條件培養基包含有一纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、一類固醇(steroid)以及一細胞激素(cytokine)。在某些具體例中,此處所揭示的是一種在活體外誘導一滋養層幹(TS)細胞分化成為一經誘導的肝細胞的方法,其包含有:(a)令該滋養層幹細胞配於一包含有一纖維母細胞生長因子(FGF)、一類固醇以及一細胞激素的條件培養基中而接觸;以及(b)令該細胞培育歷時充分的時間,俾以誘導該滋養層幹細胞分化成為一經誘導的肝細胞。在某些具體例中,該方法進一步包含有在添加該類固醇以及該細胞激素至該條件培養基之前,令該滋養層幹細胞與該FGF接觸。在某些具體例中,在添加該類固醇以及該細胞激素至該條件培養基之前,該滋養層幹細胞被接觸以FGF歷時至少2小時、至少4小時、至少6小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時、至少20小時或至少24小時。在某些具體例中,該方法進一步包含有令該滋養層幹細胞培育歷時至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。在某些具體例中,該類固醇以及該細胞激素被同時地或依序地添加至該條件培養基中。
在某些具體例中,此處的一經誘導的肝細胞是一肝祖細胞(hepatic progenitor cell)。在某些具體例中,FGF向上調控該TS細胞中的miRNA-124a。在某些具體例中,miRNA-124a的升高的位準啟動該TS細胞中的定型內胚層(definitive endoderm, DE)特化。在某些具體例中,該DE特化是與包含有叉頭盒蛋白質A2 (forkhead box protein A2, FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)或同源區蛋白質MIXL1 (Homeodomain protein MIXL1)的生物標記有關聯。在某些具體例中,該DE特化是與SOX17、FOXA2以及GSC的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,升高的表現位準是增加的蛋白質表現位準。在某些具體例中,該DE特化是與MIXL1的一減少的表現位準有關聯。在某些具體例中,該減少的表現位準是一減少的蛋白質表現位準。在某些具體例中,SOX17、FOXA2以及GSC的升高的蛋白質表現位準以及MIXL1的減少的蛋白質表現位準是相對於一尚未經歷DE特化的等效的TS細胞中的SOX17、FOXA2、GSC以及MIXL1的蛋白質表現位準。在某些具體例中,該DE特化是進一步與SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是增加的蛋白質表現位準。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是增加的基因表現位準。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是相對於一尚未經歷DE特化的等效的TS細胞中的SOX2、NANOG以及OCT4的表現位準。在某些具體例中,藉由此處的一方法所誘導的分化包含有下列4種階段中的一或多者:原條至定型內胚層階段[primitive streak to definitive endoderm (DE) stage]、肝特化的內胚層階段(hepatic specified endoderm stage)、肝母細胞階段(hepatoblastic stage)以及胎兒與成人似肝細胞-細胞階段(fetal and adult hepatocyte-like cell stage)。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該4種階段中的一或多者中表現:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α,以及它們的任何組合。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該原條至DE階段表現:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX,以及它們的任何組合。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX在該原條至DE階段的一表現位準相對於在該原條至DE階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表現位準增加高於在該原條至DE階段之前所具者大約1倍以及大約10,000倍。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表現位準增加高於在該原條至DE階段之前所具者大約10倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該肝特化的內胚層階段中會表現:SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、CYP7A1,以及它們的任何組合。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1在該肝特化的內胚層階段的一表現位準相對於在該肝特化的內胚層階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約1倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約10倍以及大約100倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該肝母細胞階段會表現:TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1、BSEP,以及它們的任何組合。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP在該肝母細胞階段的一表現位準相對於在該肝母細胞階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約1倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約10倍以及大約100倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段會表現:HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α,以及它們的任何組合。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的一表現位準相對於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者大約10倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者至少100倍。
在某些具體例中,此處的一滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞。在某些具體例中,該類固醇是地塞松(dexamethasone)。在某些具體例中,該細胞激素是抑瘤素M (oncostatin M)。在某些具體例中,該抑瘤素M是一人類抑瘤素M。在某些具體例中,該人類抑瘤素M是一重組型人類抑瘤素M。在某些具體例中,該條件培養基進一步包含有一骨型態形成蛋白質(bone morphogenetic protein, BMP)。在某些具體例中,該BMP是呈一大約1至100 ng/mL的濃度而存在。在某些具體例中,該BMP是呈一大約1至50 ng/mL (例如,大約20 ng/mL)的濃度而存在。在某些具體例中,該BMP是BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10或BMP15。在某些具體例中,該BMP是BMP4。在某些具體例中,該條件培養基進一步包含有一肝生長因子(hepatic growth factor, HGF)。在某些具體例中,該HGF是呈一大約0.1至50 ng/mL或0.1至25 ng/mL (例如,大約5 ng/mL)的濃度而存在。
在某些具體例中,此處所揭示的一肝細胞是經免疫豁免的(immune privileged)。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現TGFβ1。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞在細胞外基質(extracellular matrix, ECM)中表現TGFβ1、纖維連接蛋白(fibronectin)以及膠原蛋白IV (collagen IV)。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現HLA-G。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現HLA-G以及stem 121。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞募集CD4+ Foxp3+ Treg細胞。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞形成具有一為3-維結構的組織。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞群集或聚集。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞形成一新月形細胞群(crescent cell mass)。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞包含有一周邊腔室(peripheral compartment)以及一中央腔室(central compartment)。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞沿著在該周邊腔室的基底膜(basement membrane)之外的ECM而不規則地分佈。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞從該中央腔室中的基底朝向中央區域而分佈。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:TGFβ1、HLA-G、stem 121、C-kit、CK19、CK18、ALB、α-AFP、β滋養因子(betatrophin)、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2、Cx32,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:TGFβ1、HLA-G、stem 121、C-kit、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、Cx32,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:CPS1、CYP2B6,以及它們的一組合。
在一個方面,此處所提供的是一種由此處所揭示的任何方法所產生的經誘導的肝細胞。在另一個方面,此處所提供的是一種衍生自一滋養層幹細胞之經分離的經誘導的肝細胞。在另一個方面,此處所提供的是一種由一滋養層幹細胞所誘導的經分離的肝細胞。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記:轉變生長因子β1 (transforming growth factor beta 1, TGFβ1)、人類白血球抗原G (human leukocyte antigen G, HLA-G)、分化的群落4 (cluster of differentiation 4, CD4)、叉頭盒P3 (forkhead box P3, Foxp3)、人類細胞質的標記stem 121 (human cytoplasmic marker stem 121)、肥大/幹細胞生長因子受體C-kit (mast/stem cell growth factor receptor C-kit)、β滋養因子、缺脂脂蛋白F (apolipoprotein F, APOF)、乙醇去氫酶-1 (alcohol dehydrogenase-1, ADH1)、胺甲醯基-磷酸合成酶1 (carbamoyl-phosphate synthase 1, CPS1)、GATA轉錄因子4 (GATA transcription factor 4, GATA4)、細胞色素P450家族1亞家族A多肽1 (cytochrome P450 family 1 subfamily A polypeptide 1, CYP1A1)、細胞色素P450 2B6 (cytochrome P450 2B6, CYP2B6)、去唾液酸糖蛋白受體1 (asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1)、第4型C-X-C趨化激素受體(C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)、膽鹽輸出幫浦(bile salt export pump, BSEP)、多重抗藥性蛋白質-2 (multi-drug-resistance protein-2, MRP2)、連結蛋白32 (connexin 32, CX32)、叉頭盒蛋白質A2 (forkhead box protein A2, FOXA2)、SRY-盒17 (SRY-box 17, SOX17)、己醣胺酶Aα多肽(hexosaminidase A alpha polypeptide, HEXA)、造血地表現的同源盒(hematopoietically expressed homeobox, HHEX)、轉甲蛋白(transthyretin, TTR)、白蛋白(albumin, ALB)、酪胺酸轉胺酶(tyrosine aminotransferase, TAT)、細胞色素P450 7A1 (cytochrome P450 7A1, CYP7A1)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6PC)、絲胺酸肽酶抑制劑A支(α-1抗蛋白酶,抗胰蛋白酶)成員1 [serpin peptidase inhibitor clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin) member 1, SERPINA1]、ATP-結合的卡匣亞家族C (ATP-binding cassette sub-family C, ABCC2)、CCAAT-增強子-結合的蛋白質β (CCAAT-enhancer-binding protein beta, C/EBPβ)、肝細胞核因子1-α (hepatocyte nuclear factor 1-alpha, HNF1α)、肝細胞核因子4-α (hepatocyte nuclear factor 4-alpha, HNF4α)、α-1-胎兒蛋白(alpha-1-fetoprotein, AFP)、細胞角質蛋白8 (cytokeratin 8, CK8)、粒線體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2 (phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 mitochondrial, PCK2)、肝醣合成酶2 (glycogen synthase 2, GYS2)、肝細胞核因子6 (hepatocyte nuclear factor 6, HNF6)、乙醇去氫酶1C (第I型) γ多肽[alcohol dehydrogenase 1C (class I) gamma polypeptide, ADH1C]、細胞色素P450 3A4 (cytochrome P450 3A4, CYP3A4)、普洛斯彼羅同源盒1 (prospero homeobox 1, PROX1)、色胺酸2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)、細胞角質蛋白18 (cytokeratin 18, CK18)以及細胞角質蛋白19 (cytokeratin 19, CK19)。
在某些具體例中,此處的一肝細胞是一肝祖細胞。在某些具體例中,FGF向上調控該TS細胞中的miRNA-124a。在某些具體例中,miRNA-124a的升高的位準啟動該TS細胞中的定型內胚層(DE)特化。在某些具體例中,該DE特化是與包含有叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)或同源區蛋白質MIXL1的生物標記有關聯。在某些具體例中,該DE特化是與SOX17、FOXA2以及GSC的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,升高的表現位準是增加的蛋白質表現位準。在某些具體例中,該DE特化是與MIXL1的一減少的表現位準有關聯。在某些具體例中,該減少的表現位準是一減少的蛋白質表現位準。在某些具體例中,SOX17、FOXA2以及GSC的升高的蛋白質表現位準以及MIXL1的減少的蛋白質表現位準是相對於一尚未經歷DE特化的等效的TS細胞中的SOX17、FOXA2、GSC以及MIXL1的蛋白質表現位準。在某些具體例中,該DE特化是進一步與SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是增加的蛋白質表現位準。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是增加的基因表現位準。在某些具體例中,SOX2、NANOG以及OCT4的升高的表現位準是相對於一尚未經歷DE特化的等效的TS細胞中的SOX2、NANOG以及OCT4的表現位準。在某些具體例中,此處所揭示的一肝細胞是處於下列4種階段中的一者:原條至定型內胚層(DE)階段、肝特化的內胚層階段、肝母細胞階段以及胎兒與成人似肝細胞-細胞階段。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該4種階段中的一或多者中表現:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α,以及它們的任何組合。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該原條至DE階段表現:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX,以及它們的任何組合。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX在該原條至DE階段的一表現位準相對於在該原條至DE階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表現位準增加高於在該原條至DE階段之前所具者大約1倍以及大約10,000倍。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表現位準增加高於在該原條至DE階段之前所具者大約10倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該肝特化的內胚層階段中會表現:SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、CYP7A1,以及它們的任何組合。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1在該肝特化的內胚層階段的一表現位準相對於在該肝特化的內胚層階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約1倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約10倍以及大約100倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該肝母細胞階段會表現:TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1、膽鹽輸出幫浦(BSEP),以及它們的任何組合。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP在該肝母細胞階段的一表現位準相對於在該肝母細胞階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約1倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約10倍以及大約100倍。在某些具體例中,一或多種選自於下列所構成的群組中的生物標記在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段會表現:HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α,以及它們的任何組合。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的一表現位準相對於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者是增加的。在某些具體例中,該增加的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者大約10倍以及大約1,000倍。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者至少100倍。在某些具體例中,該滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞。
在某些具體例中,此處的一肝細胞是經免疫豁免的。在某些具體例中,該肝細胞表現TGFβ1。在某些具體例中,該肝細胞在細胞外基質(ECM)中表現TGFβ1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV。在某些具體例中,該肝細胞表現HLA-G。在某些具體例中,該肝細胞表現HLA-G以及stem 121。在某些具體例中,該肝細胞募集CD4+ Foxp3+ Treg細胞。在某些具體例中,該肝細胞形成具有一為3-維結構的組織。在某些具體例中,該肝細胞群集或聚集。在某些具體例中,該肝細胞形成一新月形細胞群。在某些具體例中,該肝細胞包含有一周邊腔室以及一中央腔室。在某些具體例中,該肝細胞沿著在該周邊腔室的基底膜之外的ECM而不規則地分佈。在某些具體例中,該肝細胞從該中央腔室中的基底朝向中央區域而分佈。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:TGFβ1、HLA-G、stem 121、C-kit、CK19、CK18、ALB、α-AFP、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2、Cx32,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:TGFβ1、HLA-G、stem 121、C-kit、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、Cx32,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:CPS1、CYP2B6,以及它們的一組合。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:stem 121、C-kit、CK19、CK18,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:ALB、α-AFP、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1、CYP2B6,以及它們的任何組合。在某些具體例中,該肝細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2、Cx32,以及它們的任何組合。
此處亦被揭示的是一種篩選一供用於治療或預防一病況之治療性化合物(therapeutic compound)的方法,其包含有:令此處所揭示的一經分離的肝細胞與該治療性化合物接觸;以及偵測在該經分離的肝細胞中一生物標記的一表現位準。在某些具體例中,當相較於一沒有被接觸以該治療性化合物之等效的經分離的肝細胞,在該經分離的肝細胞中一生物標記的該表現位準是增加的。在某些具體例中,當相較於一沒有被接觸以該治療性化合物之等效的經分離的肝細胞,在該經分離的肝細胞中一生物標記的該表現位準是減少的。在某些具體例中,該表現位準是一基因表現位準。在某些具體例中,該生物標記包含有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4或CYP7A1。在某些具體例中,該治療性化合物是一小分子藥物(small molecule drug)、一胜肽或一蛋白質。在某些具體例中,該治療性化合物是一合成化學藥物(synthetic chemical drug)。在某些具體例中,該病況是一肝衰竭(liver failure)。在某些具體例中,該病況是一肝-關聯性疾病(liver-associated disease)或障礙(disorder)。在某些具體例中,該肝-關聯性疾病或障礙包含有阿拉吉歐症候群(alagille syndrome)、α1抗-胰蛋白酶缺乏症(alpha 1 anti-trypsin deficiency)、自體免疫肝炎(autoimmune hepatitis)、良性肝腫瘤(benign liver tumors)、膽道閉鎖(biliary atresia)、肝硬化(hepatocirrhosis)、肝臟囊腫病(cystic disease of the liver)、脂肪肝疾病(fatty liver disease)[包括與酒精有關的肝疾病(alcohol-related liver disease)以及非-酒精性脂肪肝疾病(non-alcohol fatty liver disease, NAFLD)]、半乳糖血症(galactosemia)、膽石(gallstones)、捷倍耳氏症候群(Gilbert’s Syndrome)、血色素沉著症(hemochromatosis)、肝臟囊腫(liver cysts)、肝癌(liver cancer)、姙娠肝疾病(liver disease in pregnancy){選擇性地,姙娠急性脂肪肝(acute fatty liver of pregnancy)、姙娠肝內膽汁滯留症(intrahepatic cholestasis of pregnancy)、子癎前症(preeclampsia)或HELLP症候群(HELLP Syndrome)[溶血(hemolysis)、升高的肝指數(elevated liver tests)、低血小板(low platelets)]}、新生兒肝炎(neonatal hepatitis)、原發型膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、吡咯紫質沉著病(porphyria)、雷氏症候群(Reye’s Syndrome)、類肉瘤病(sarcoidosis)、毒性肝炎(toxic hepatitis)、第1型肝醣貯積病(type 1 glycogen storage disease)、酪胺酸血症(tyrosinemia)、病毒性肝炎(viral hepatitis)、威爾森氏症(Wilson disease),或者它們的任何組合。
在一個方面,此處所揭示的是一種組成物[例如,藥學組成物(pharmaceutical composition)],其包含有此處所揭示的任何肝細胞。
在另一個方面,此處所揭示的是一種治療在一個體中的一病況的方法,其包含有將一包含有此處的一經分離的肝細胞之藥學組成物投藥至一個體[呈一有效於肝細胞植入至該個體(例如,至該個體的肝)的數量]。在某些具體例中,該肝細胞是配於一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)中而被投藥。在某些具體例中,該藥學上可接受的載劑包含有一磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffer saline)。在某些具體例中,該肝細胞是配於一含有大約1×106 細胞/mL至大約100×106 細胞/mL、大約1×106 細胞/mL至大約250×106 細胞/mL、大約1×106 細胞/mL至大約500×106 細胞/mL或大約10×106 細胞/mL至大約40×106 細胞/mL的懸浮液中而被投藥。在某些具體例中,該肝細胞是以一大約1 mL至5 mL、1 mL至10 mL、1 mL至50 mL、1 mL至100 mL或10 mL至150 mL的體積而被投藥。在某些具體例中,該個體是一人類。在某些具體例中,該投藥包含有一注射(injection)[例如,靜脈內注射(intravenous injection)]。在某些具體例中,該注射是於一肝靜脈(hepatic vein)之處而被投藥。在某些具體例中,該注射是於一肝動脈(hepatic artery)之處而被投藥。在某些具體例中,該病況是一肝-關聯性疾病或障礙。在某些具體例中,該病況是一肝衰竭。在某些具體例中,該肝-關聯性疾病或障礙包含有阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、肝硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[選擇性地,姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣貯積病、酪胺酸血症、病毒性肝炎、威爾森氏症,或者它們的任何組合。
在另一個方面,此處所揭示的是一包含有此處的一肝細胞之組成物供應用於產生治療性蛋白質(therapeutic protein)的用途。在某些具體例中,該治療性蛋白質包含有主要的血漿蛋白質(major plasma protein)[諸如人類血清白蛋白(human serum albumin)、可溶性血漿纖維連接蛋白(soluble plasma fibronectin)、α-胎兒蛋白(α-fetoprotein)、C-反應蛋白質(C-reactive protein)以及數種球蛋白(globulins)]、涉及止血(hemostasis)以及纖維蛋白分解(fibrinolysis)的蛋白質[諸如涉及凝固級聯(coagulation cascade)的凝固因子(coagulation factor)、α2-大球蛋白(α2-macroglobulin)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)、抗凝血酶III (antithrombin III)、蛋白質S (protein S)、蛋白質C (protein C)、胞漿素原(plasminogen)、α2-抗胞漿素(α2-antiplasmin)以及補體組分3 (complement component 3)]、載體蛋白(carrier protein)[諸如白蛋白(albumin)、銅藍血漿蛋白(ceruloplasmin)、運皮素蛋白(transcortin)、肝球蛋白(haptoglobin)、凝血酵素(hemopexin)、IGF結合的蛋白質(IGF binding protein)、主要的尿蛋白(major urinary protein)、視黃醇結合的蛋白質(retinol binding protein)、性激素-結合的球蛋白(sex hormone-binding globulin)、轉甲蛋白、運鐵蛋白(transferrin)以及維生素D-結合的蛋白質(Vitamin D-binding protein)]、激素[諸如似胰島素生長因子1 (insulin-like growth factor 1)、血小板生成素(thrombopoietin)、鐵調節素(hepcidin)以及β滋養因子]、前激素(prohormone)[諸如血管收縮素原(angiotensinogen)],或者缺脂脂蛋白(apolipoprotein)。
此處亦被揭示的是一包含有此處的一肝細胞之組成物供應用於肝再生(liver regeneration)的用途。在某些具體例中,該肝再生是一活體外(ex vivo )肝再生。在某些具體例中,該活體外肝再生是一生物印刷方法(bioprinting method)。在某些具體例中,該生物印刷方法是一種3維生物印刷方法(3 dimensional bioprinting method)。
在一個方面,此處所揭示的是一包含有此處的一肝細胞之組成物供應用於生物印刷的用途。在某些具體例中,該生物印刷是一種3維生物印刷。
此處亦被揭示的是一如此處的肝細胞供應用於組織支架生成(tissue scaffold generation)的用途。在某些具體例中,該組織支架是一種3維組織支架(3 dimensional tissue scaffold)。
在一個方面,此處所揭示的是一包含有此處的一肝細胞之組成物供應用於基因治療(gene therapy)的用途。在某些具體例中,該基因治療是一活體外基因治療。
在另一個方面,此處所揭示的是一種由此處的肝細胞所生成的人工組織(artificial tissue)。在某些具體例中,該組織是3-維的。在某些具體例中,該組織是經血管化(vascularized)的。
此處亦被揭示的是一種由此處的肝細胞所生成的人工器官(artificial organ)。
在某些具體例中,此處所揭示的一肝細胞、組織或器官產生AFP、ALB、α-1-抗胰蛋白酶、葡萄糖或肝醣。在某些具體例中,該肝細胞、組織或器官代謝一脂質(lipid)、膽固醇(cholesterol)或碳水化合物(carbohydrate)。在某些具體例中,該肝細胞、組織或器官代謝一藥學藥物(pharmaceutical drug)或毒性物質(toxic substance)。在某些具體例中,該肝細胞、組織或器官攝入氨(ammonia)或膽汁酸(bile acid)。
在某些具體例中,此處的一肝細胞具有可比較的表現型(例如,免疫表現型)性質有如一初級肝細胞(primary hepatocyte)。在某些具體例中,此處的一肝細胞具有可比較的形態性質有如一初級肝細胞。在某些具體例中,此處的一肝細胞具有可比較的功能性質有如一初級肝細胞。
在某些具體例中,此處的一肝細胞、組織或器官具有下列功能中的一或多者:脂肪酸、三酸甘油酯(triglycerides)、膽固醇、膽鹽(bile salts)或磷脂(phospholipids)的合成;外源性(exogenous)或內生性(endogenous)化合物[例如,藥物、殺蟲劑(insecticide)、類固醇、氨、重金屬或毒素]的去毒(detoxification)、修飾(modification)以及排出(excretion);碳水化合物代謝;蛋白質[例如,血清白蛋白、纖維連接蛋白、脂蛋白、缺輔基蛋白(apoprotein)、銅藍血漿蛋白、運鐵蛋白、補體或醣蛋白(glycoprotein)]的合成;蛋白質儲存(protein storage);或者膽汁的形成或分泌。在某些例子中,一肝細胞可以是一肝祖細胞[例如,似肝細胞-細胞(hepatocyte-like cell)]或一衍生自一幹細胞的肝細胞;一肝幹細胞(hepatic stem cell);或者一初級肝細胞(例如,是或可相比於得自於一肝臟之新鮮分離的或未經培養的、經低溫保存的肝細胞)。
在某些具體例中,此處所揭示的一滋養層幹細胞是衍生自一子宮外孕團塊(ectopic pregnancy mass)[例如,輸卵管的(tubal)]。在某些具體例中,分離此處的一滋養層幹細胞的方法包含有包含有下列步驟:從一子宮外孕團塊(例如,輸卵管的)中獲得滋養層絨毛(trophoblastic villi);從該滋養層絨毛中收集細胞;以及於一培養基中培養所收集到的細胞,俾以得到該經分離的滋養層幹細胞。在某些具體例中,該方法進一步包含有將該滋養層絨毛切成塊。在某些具體例中,該方法進一步包含有將該滋養層絨毛處理以一酵素。在某些具體例中,該人類滋養層幹細胞被遺傳地修飾,俾以導入一突變至該細胞中。在某些具體例中,妊娠團塊(pregnant mass)是以一未破裂的方式而被獲得。在某些具體例中,妊娠團塊是處於一不大於7或8週的胎齡(gestational age)。在某些具體例中,培養基沒有一餵養層(feeder layer)。在某些具體例中,該方法進一步包含有下列步驟:於培養基中形成胚體(embryonic bodies, EBs);將該等EBs處理以一酵素;以及從酵素-處理的EBs中收集細胞,俾以得到經分離的人類滋養層幹細胞。 發明的詳細說明
此處所揭示的是從一滋養層幹細胞中生成一經誘導的肝細胞的方法、組成物、細胞、製造方法以及套組。在某些具體例中,此處所揭示的是一種在活體外誘導一滋養層幹(TS)細胞分化成為一經誘導的肝細胞的方法,其包含有:(a)令該滋養層幹細胞配於一包含有一纖維母細胞生長因子(FGF)、一類固醇以及一細胞激素的條件培養基中而接觸;以及(b)令該細胞培育歷時充分的時間,俾以誘導該滋養層幹細胞分化成為一經誘導的肝細胞。
此處亦被揭示的是一種衍生自一滋養層幹細胞之經分離的經誘導的肝細胞,其中該經分離的經誘導的肝細胞包含有具有一升高的表現位準之一或多種生物標記,其包含有:第4型C-X-C趨化激素受體(CXCR4)、叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、己醣胺酶A (α多肽)(HEXA)、膽鹽輸出幫浦(BSEP)、轉甲蛋白(TTR)、白蛋白(ALB)、酪胺酸轉胺酶(TAT)、細胞色素P450 7A1 (CYP7A1)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、絲胺酸肽酶抑制劑A支(α-1抗蛋白酶,抗胰蛋白酶)成員1 (SERPINA1)、ATP-結合的卡匣亞家族C (ABCC2)、CCAAT-增強子-結合的蛋白質β (C/EBPβ)、肝細胞核因子1-α (HNF1α)、肝細胞核因子4-α (HNF4α)、α-1-胎兒蛋白(AFP)、角質蛋白8 (keratin 8, KRT8)、粒線體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2 (PCK2)、細胞色素P450 2B6 (CYP2B6)、肝醣合成酶2 (GYS2)、肝細胞核因子6 (HNF6)、粒線體胺甲醯基-磷酸合成酶1 (CPS1)、乙醇去氫酶1C (第I型) γ多肽(ADH1C)、連結蛋白32 (CX32)、細胞色素P450 3A4 (CYP3A4)、普洛斯彼羅同源盒1 (PROX1)、色胺酸2,3-雙加氧酶(TDO2)、缺脂脂蛋白F (APOF)、角質蛋白18 (keratin 18, KRT18)、角質蛋白19 (keratin 19, KRT19),或者染色體19開放閱讀架構80 (chromosome 19 open reading frame 80)[似血管生成素-蛋白質8 (angiopoietin-like protein 8)、肝細胞癌-關聯性基因TD26 (hepatocellular carcinoma-associated gene TD26)、lipasin](β滋養因子)。
此處進一步被描述的是一種篩選一供用於治療或預防一疾病或障礙之化合物的方法,其包含有:(a)令此處的一經分離的經誘導的肝細胞與該化合物接觸;以及(b)偵測在該經分離的經誘導的肝細胞中一生物標記的表現位準。
另外,此處所描述的是包含有此處所揭示的一經分離的經誘導的肝細胞的組成物(例如,藥學組成物)、用於生成一包含有此處所揭示的一經分離的經誘導的肝細胞的組成物(例如,藥學組成物)的製造方法,以及使用此處所揭示的一經分離的經誘導的肝細胞或一包含有此處所揭示的一經分離的經誘導的肝細胞的組成物來治療一疾病或障礙(例如,一肝-關聯性疾病或障礙)的方法。
在某些方面,此處所揭示的是來自於子宮外孕-衍生的人類滋養層(hTS)幹細胞的似肝細胞-細胞的一高效率生成,在肝發育中展現出與初級肝細胞相同的分子、基因以及生物學特性。在某些具體例中,此處所揭示的是一種微RNA-124a (microRNA-124a)在分化期間控制定型內胚層形成的機制。在某些具體例中,似肝細胞-細胞可在細胞培養物中構築出一具有3-D似板狀-結構的肝,表現HLA-G以及分泌TGFβ1,俾以在靜脈內植入之後維持肝組織中CD4+ Foxp3+ Treg細胞以供免疫耐受性(immune tolerance)。在某些具體例中,此處的細胞在帶有CCl4 -誘發的急性肝衰竭的大鼠模型中協助以及促進肝再生。在某些具體例中,此處的hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞可被應用於肝衰竭的緊急管理中或再生醫學(regenerative medicine)中。在某些具體例中,此處所揭示的是在一週內(例如,4至6天)有效率的2-步驟分化hTS細胞成為功能性肝細胞。在某些具體例中,miR-124a在肝臟生成(hepatogenesis)期間控制DE形成。在某些具體例中,此處所揭示的是似肝細胞-細胞構築出帶有模擬初級肝細胞的生物學功能的具有3-D結構的組織。
在某些方面,此處所揭示的是似肝細胞-細胞的靜脈內注入(intravenous infusion)可返位至CCl4 -損害的肝組織,俾以在大鼠動物模型中促進肝再生。在某些具體例中,此處所揭示的是hTS細胞及其衍生的似肝細胞-細胞皆會表現HLA-G,俾以在移植之後獲得免疫耐受性。在某些具體例中,此處所揭示的是返位中的似肝細胞-細胞分泌TGFβ1,俾以在損傷之後藉由形成纖維連接蛋白以及膠原蛋白而協助構築出新的ECMs。在某些具體例中,似肝細胞-細胞-分泌的TGFβ1致使骨髓的纖維細胞(fibrocyte)移動至肝臟,活化肝星狀細胞(hepatic stellate cell)以供肝再生以及維持肝組織中CD4+ Foxp3+ Treg細胞以供免疫耐受性。在某些具體例中,鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)獨自誘導微RNA (miRNA)-124a的活化,因而在早期分化中控制DE特化。在某些具體例中,在特定條件下,DE引起肝內胚層,繼而肝母細胞,以及最終分化成為胎兒/成人似肝細胞-細胞,具有相似於初級人類肝細胞的基因、分子以及生物學特性。
在某些方面,似肝細胞-細胞能夠在活體外構築出一具有3-維(3-D)結構的組織,以及該等細胞的靜脈內注入致使肝返位(hepatic homing)並且保護肝臟免於損害。在某些具體例中,此處所使用的一組織-培養基組成物包含有血清以及培養基。在某些具體例中,該培養基是合成輸卵管液(Synthetic Oviductal Fluid, SOF)、改良的依格氏培養基(Modified Eagle's Medium, MEM)、杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)、RPMI 1640、F-12、IMDM、α培養基(Alpha Medium)或McCoy’s培養基(McCoy’s Medium)。在某些具體例中,該血清是同種異體的血清(allogeneic serum)、自體血清(autologous serum)或異種血清(xenogeneic serum)。在某些具體例中,在DE形成之後(例如,第8小時),hTS細胞是以纖維母細胞生長因子(例如,bFGF)、類固醇(例如,地塞松)、細胞激素(例如,抑瘤素M)、骨型態形成蛋白質(例如,BMP4)以及肝生長因子(HGF)的一組合予以培養。在某些具體例中,所形成的細胞形成分散的似纖維母細胞-細胞(dispersed fibroblast-like cells)。在某些具體例中,所形成的細胞逐步地聚集,俾以形成一新月形細胞群。在某些具體例中,2不同的周邊以及中央腔室構築出一具有3-維(3-D)結構的組織。在某些具體例中,在周邊部位中,許多群集的小細胞在基底膜之外的細胞外基質(ECM)周圍不規則地分佈。在某些具體例中,細胞具有相似於胚胎幹/祖細胞之縮合的核(經常偏心地位於嗜酸性細胞質中)以及大量粒狀與液泡(vacuole)。在某些具體例中,在中央部位中,許多獨立的柱狀ECMs (由位於2側之處的細胞內襯所造成)從基底朝向中央區域而分佈。這些細胞含有模擬表現型肝細胞之大量嗜酸性細胞質以及在具有1或2個顯著的核仁(nucleoli)之單一圓核中之分散的染色質。在某些具體例中,數種雙核細胞(binucleate cells)可形成相似於人類肝臟中的肝板(hepatic plate)。
在某些具體例中,在免疫組織化學上,此處的肝細胞或似肝細胞-細胞展現出下列專一性標記:i)針對人類細胞的人類細胞質標記stem 121TM 、針對肝內生性幹細胞的肥大/幹細胞生長因子受體C-kit 、針對膽管細胞(cholangiocyte)的CK19以及針對肝細胞的CK18;以及(ii)針對肝細胞的細胞質中的白蛋白(ALB)、α-胎兒蛋白(AFP)、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1以及CYP2B6。在某些具體例中,表面標記(包括ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2以及Cx32)的一亞群構築出一相似於初級人類肝細胞的多邊形細胞形狀,例如一相似於初級肝細胞的超微結構(ultrastructure),包括:一大的細胞質相對於細胞核比例、大量的粒線體、充分組織化的內質網(well-organized endoplasmic reticulum)、緊密型連結(tight junction)、許多脂質空泡(lipid vacuole)、肝醣貯積、具有連接複合物(junctional complex)之擴張的膽小管腔(lumen of the bile canaliculus)以及多重ECMs。
藉由Mascot MS/MS離子檢索系統(ESI-QUAD-TOF, Bruker Impact HD, Matrix Science, USA),在細胞培養基中9種新的被向上調控之被分泌的蛋白質之中,蛋白質(第413號)藉由46%的胜肽序列相匹配而明顯地預測會是轉變生長因子-β (TGF-β)-誘導的蛋白質ig-h3前驅物(transforming growth factor-β-induced protein ig-h3 precursor)(TGFβ1)。TGFβ1是一主要的纖維性(fibrogenic)、多功能細胞激素,作用有如自體分泌(autocrine)以及旁分泌(paracrine)方式,俾以在肝星狀細胞(HSCs)中增強纖維連接蛋白以及膠原蛋白形成。在某些具體例中,TGFβ1在ECM中會被表現。在某些具體例中,TGFβ1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV在ECMs中會被共-表現。在某些具體例中,TGFβ1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV組成至少部分具有似肝細胞-細胞的呈3-D結構的組織中ECMs的支架而可支持肝板中的肝細胞的增生與分化。
在某些方面,似肝細胞-細胞可經由一系列的細胞歷程(包括原條、DE形成、肝內胚層、肝母細胞以及最後似肝細胞-細胞)而從多潛能hTS細胞中被有效率地生成。原條分化的起始可藉由GSC、Brachyury以及Mixl1的向上調控而在最初誘導之時(例如,第30分鐘)被證實。被立即減少的Mixl1可在中內胚層祖細胞的內胚層潛能上執行一影響。此外,Sox7-表現的細胞可原始地存在於胚外內胚層(extra-embryonic endoderm)之處而非DE譜系之處。當發育進行時,Sox17以及Foxa2之明顯的向上調控以及Mixl1的向下調控可定義DE的形成,其中Oct4在維持hES細胞-或iPS細胞-衍生的DE的多能性上扮演一有別於Nanog之主要的角色。
在某些方面,一短暫升高的miR-124a可藉由結合至被標靶的mRNAs (典型地在3’UTR中)而後-轉錄地負向調節多重基因表現,俾以控制DE特化。可存在的是在早期肝分化中的功能性默化的miR-124a。其中,在第4小時誘導尖峰之後,被向下調控的miR-124a具有與當細胞移動起始於原腸胚形成(gastrulation)俾以在hES細胞中形成3種胚胎胚層之時相同的狀況。
在某些方面,在DE特化之後肝譜系分化的起始可藉由bFGF、地塞松、抑瘤素M、BMP4以及HGF的一組合而被達成。階段-特異性基因檔案(stage-specific gene profile)在肝特化的內胚層中可顯示一定向步驟(表3,第2欄)。例如,α-胎兒蛋白(AFP)的表現顯示肝內胚層的最初分化以及C/EBPβ與Hnf4α這兩者控制尿素循環(urea cycle)中最初的肝-特異性活性。α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)的表現可保護細胞免於損害並且促進酵素(諸如CYP7A1、CYP3A4以及CYP2B6)的代謝活性。這些事實表示肝內胚層能夠在早期分化之時代謝膽固醇、藥物以及毒素。由於Sox17直接誘導鋅指蛋白202 (zinc finger protein 202, ZFP202),俾以抑制主要的肝基因調節子Hnf4α (master hepatic gene regulator Hnf4α),因此,Sox17的戒斷會促進DE階段之後Hnf4α表現的起始,它依次地鑑定肝祖細胞的特化,控制幹細胞細胞命運(cell fate)。一持續的Foxa2可負責隨後白蛋白、AFP、粒線體蛋白質TAT以及β滋養因子的表現;而β滋養因子表現在促進早期肝分化的β細胞增生以及脂質代謝上反映早期能力。
在某些方面,當分化進行時,許多肝標記開始顯現,包括PROX1、G6PC、Hnf1α、ABCC2與TDO2,以及細胞角質蛋白(諸如CK8、CK18以及CK19)。例如,PROX1被需要用於肝母細胞移動以及它在肝母細胞中的缺損(ablation)造成缺陷的肝細胞特化並且促進膽道細胞定向(biliary cell commitment)。CK8是一中間絲蛋白(intermediate filament protein),與CK18聚合而形成上皮細胞骨架(epithelial cytoskeleton)的一組分並且作用有如一胞漿素原受體(plasminogen receptor)。在介於2與4天分化之間的肝母細胞可表現膽管細胞標記CK19以及肝祖細胞標記CK8與CK18 (表3),模擬在分別分化成為膽上皮細胞(biliary epithelial cell)以及肝細胞時的雙潛在能力。肝細胞-增富的轉錄因子群(包括Foxa2、Hnf1α、Hnf4α以及Hnf6)的表現可代表肝母細胞分化的一里程碑,指引薄壁肝母細胞(parenchymal hepatoblast)成為肝細胞以及促進肝細胞成熟。針對代謝,肝膽排泄轉運蛋白MRP2 (hepatobiliary excretion transporter MRP2)(ABCC2)以及肝隙型連結蛋白質Cx32 (hepatic gap junction protein Cx32)的表現可促進跨越細胞膜的各種不同分子的運輸。然而,HHEX的一向上調控可意味著肝母細胞中造血能力的存在。
在某些方面,在靜脈內移植之後,經植入的hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞可存活,俾以達至一個體的肝。在某些具體例中,此處的細胞具有一返位本能。在某些具體例中,這些細胞可表現HLA-G (一非典型的HLA第I型分子,膜-結合的或可溶的),它強烈地作用於不同免疫細胞類型(NK、T、B、單核球/樹突細胞)上,俾以經由與被表現於免疫細胞的表面的抑制性受體交互作用而抑制先天性以及適應性免疫。此外,在植入後,這些似肝細胞-細胞能夠募集CD4+ Foxp3+ 調節T (Treg)細胞族群,藉由以一調節來抑制前-發炎性T細胞(proinflammatory T cell)以及誘導T細胞而促使一免疫抑制環境的生成。在某些具體例中,hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞具有免疫豁免權。
在某些方面,此處所提供的是用於移植肝細胞或似肝細胞-細胞至個體的組成物以及方法。在某些具體例中,該個體被注射以hTS細胞-衍生的肝細胞[例如,靜脈內地(intravenously)、肌肉內地(intramuscularly)、穿皮地(transdermally)、內視鏡逆行性注射(endoscopic retrograde injection)或腹膜內地(intraperitoneally)]。在某些具體例中,該個體在移植之前沒有以一免疫抑制劑(immunosuppressive agent)予以治療。在某些具體例中,該方法進一步包含有以一免疫抑制劑[例如,FK-506、環孢靈(cyclosporin)或GAD65抗體]來治療病患。特定的專有名詞
除非另外有所定義,此處所使用的所有技術性與科學術語具有有如由熟悉所請求的標的物所屬技藝者所共同瞭解的相同意義。要被瞭解的是:前述的一般說明以及下面的詳細說明僅是示範性以及解釋性的並且不受限於任何所請求的標的物。在本件申請案中,除非另外特別被敘明,單數的使用包括複數。必須被注意到的是,除非上下文另外清楚地指明,有如在說明書以及隨文檢附的申請專利範圍中所使用的,單數形式“一(a)”、“一(an)”以及“該(the)”包括複數指涉。在本件申請案中,除非另外被敘明,“或(or)”的使用意指“和/或(and/or)”。此外,術語“包括(including)”以及其他形式[諸如“包括(include)”、“包括(includes)”以及“被包括(included)”]的使用不受限。
如此處所使用的,範圍以及數量可被表示為“大約(about)”一特定的值或範圍,例如一參考數值的±15%。大約亦包括確切的數量。因此,“大約5 μL”意指“大約5 μL”以及“5 μL”。一般而言,術語“大約(about)”包括一將會被預期在一實驗誤差內的數量。
此處所使用的章節標題僅是用於組織的目的並且不是要被解讀為限制被描述的標的物。概觀
肝臟具有一動態範圍的功能,包括去毒、蛋白質合成、蛋白質儲存以及產生對於消化必要的生物化學組分。它包含有2種主要類型的細胞:薄壁細胞(parenchymal cell)以及非-薄壁細胞(non-parenchymal cell)。薄壁細胞製造肝體積的大約80%並且亦被意指作為肝細胞。非-薄壁細胞促成肝體積的大約6.5%,但是促成肝細胞的總數的大約40%。在某些例子中,非-薄壁細胞包含有肝竇狀內皮細胞(sinusoidal hepatic endothelial cell)、庫弗式細胞(Kupffer cell)以及肝星狀細胞。肝細胞
肝細胞或薄壁細胞是負責肝臟的功能。在某些例子中,肝細胞涉及蛋白質合成,蛋白質儲存,膽固醇、膽鹽以及磷脂的合成,膽汁的形成與分泌,碳水化合物代謝,以及外源性與內生性物質的去毒、修飾以及排出。
在某些例子中,從肝細胞中被合成的蛋白質包括主要的血漿蛋白質(諸如人類血清白蛋白、可溶性血漿纖維連接蛋白、α-胎兒蛋白、C-反應蛋白質以及數種球蛋白);涉及止血以及纖維蛋白分解的蛋白質(諸如涉及凝固級聯的凝固因子、α2-大球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、蛋白質S、蛋白質C、胞漿素原、α2-抗胞漿素以及補體組分3);載體蛋白(諸如白蛋白、銅藍血漿蛋白、運皮素蛋白、肝球蛋白、凝血酵素、IGF結合的蛋白質、主要的尿蛋白、視黃醇結合的蛋白質、性激素-結合的球蛋白、轉甲蛋白、運鐵蛋白以及維生素D-結合的蛋白質);激素(諸如似胰島素生長因子1、血小板生成素、鐵調節素以及β滋養因子);前激素(諸如血管收縮素原);以及缺脂脂蛋白。
除了碳水化合物的形成、分解(breakdown)以及相互轉變(interconversion)之外,在某些例子中,碳水化合物亦涉及糖質新生(gluconeogenesis)、肝醣分解(glycogenolysis)以及肝醣生成(glycogenesis)。糖質新生是從特定的胺基酸、乳酸鹽(lactate)或甘油中合成葡萄糖。肝醣分解是肝醣分解成為葡萄糖。肝醣生成是從葡萄糖形成肝醣。
在某些例子中,在肝細胞內的脂質代謝包括膽固醇合成以及脂質生成(lipogenesis)、三酸甘油酯(triglycerides)或脂肪的產生。
在某些個案中,在損傷[諸如組織損傷(tissue damage)或組織缺損(tissue loss)]之後,肝細胞可重新進入細胞週期,這導致經損傷的部位(諸如經損傷的或缺損的組織)的增生以及隨後的再生。在某些例子中,在移除肝組織之後,剩餘的肝細胞經歷至少一、二、三或多回合的DNA合成,這導致缺損的組織團塊的再生。
在某些具體例中,肝細胞被使用於藥學研究(pharmaceutical research)。在某些具體例中,這些研究包括藥物代謝(drug metabolism)、酵素誘導(enzyme induction)、肝毒性(hepatotoxicity)、肝細胞再生(hepatocyte regeneration)以及移植。
術語肝細胞意指具有下列功能中的一或多者的一肝細胞或肝祖細胞:脂肪酸、三酸甘油酯、膽固醇、膽鹽或磷脂的合成;外源性或內生性化合物(例如,藥物、殺蟲劑、類固醇、氨、重金屬或毒素)的去毒、修飾以及排出;碳水化合物代謝;蛋白質(例如,血清白蛋白、纖維連接蛋白、脂蛋白、缺輔基蛋白、銅藍血漿蛋白、運鐵蛋白、補體或醣蛋白)的合成;蛋白質儲存;或者膽汁的形成或分泌。在某些例子中,一肝細胞可以是一肝祖細胞(例如,似肝細胞-細胞)或一衍生自一幹細胞的肝細胞;一肝幹細胞;或者一初級肝細胞(例如,是或可相比於得自於一肝臟之新鮮分離的或未經培養的、經低溫保存的肝細胞)。
在某些具體例中,一肝幹細胞是一促成肝實質(liver parenchyma)的大約0.5%至2.5%之小上皮細胞黏著分子-表現(epithelial cell adhesion molecule-expressing, EpCAM-expressing)的細胞。在某些具體例中,幹細胞包括,但不限於:胚胎幹細胞(embryonic stem cell)、成人幹細胞(adult stem cell)、誘導型多潛能幹(inducible pluripotent stem, iPS)細胞、單性生殖幹細胞(parthenogenetic stem cell)或滋養層幹細胞。在某些具體例中,該幹細胞是一人類幹細胞。在某些具體例中,該幹細胞是一滋養層幹細胞。在某些具體例中,該滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞。在某些具體例中,該人類滋養層幹細胞是一子宮外孕-衍生的人類滋養層幹細胞。在某些例子中,一衍生自一幹細胞的肝細胞亦被意指作為一經誘導的肝細胞。在某些具體例中,一經誘導的肝細胞是衍生自一人類滋養層幹細胞。在某些具體例中,一經誘導的肝細胞是衍生自一子宮外孕-衍生的人類滋養層幹細胞。在某些具體例中,一經誘導的肝細胞包含有一經歷分化成為一肝細胞之歷程的滋養層幹細胞以及一經分化的滋養層幹細胞。在某些具體例中,一經歷分化成為一肝細胞之歷程的滋養層幹細胞亦被意指作為一不成熟之經誘導的肝細胞。在某些具體例中,一經分化的滋養層幹細胞亦被意指作為一成熟之經誘導的肝細胞。
在某些具體例中,一經誘導的肝細胞作用相似於一初級肝細胞。在某些具體例中,一經誘導的肝細胞包含有被一初級肝細胞展現的細胞功能。在某些具體例中,一經誘導的肝細胞參與諸如下列的細胞功能,例如:蛋白質合成,蛋白質儲存,膽固醇、膽鹽以及磷脂的合成,膽汁的形成與分泌,碳水化合物代謝,以及外源性與內生性物質的去毒、修飾以及排出(它們在一初級肝細胞中被觀察到)。在某些具體例中,此處的肝細胞表現表面標記(包括ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2以及Cx32)的一亞群並且構築出一相似於初級人類肝細胞的多邊形細胞形狀,例如一相似於初級肝細胞的超微結構,包括:一大的細胞質相對於細胞核比例、大量的粒線體、充分組織化的內質網、緊密型連結、許多脂質空泡、肝醣貯積、具有連接複合物之擴張的膽小管腔以及多重ECMs。
在某些例子中,從一經誘導的肝細胞中被合成的蛋白質包括主要的血漿蛋白質(諸如人類血清白蛋白、可溶性血漿纖維連接蛋白、α-胎兒蛋白、C-反應蛋白質以及數種球蛋白);涉及止血以及纖維蛋白分解的蛋白質(諸如涉及凝固級聯的凝固因子、α2-大球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、蛋白質S、蛋白質C、胞漿素原、α2-抗胞漿素以及補體組分3);載體蛋白(諸如白蛋白、銅藍血漿蛋白、運皮素蛋白、肝球蛋白、凝血酵素、IGF結合的蛋白質、主要的尿蛋白、視黃醇結合的蛋白質、性激素-結合的球蛋白、轉甲蛋白、運鐵蛋白以及維生素D-結合的蛋白質);激素(諸如似胰島素生長因子1、血小板生成素、鐵調節素以及β滋養因子);前激素(諸如血管收縮素原);以及缺脂脂蛋白。
在某些具體例中,碳水化合物代謝(諸如碳水化合物的形成、分解以及相互轉變)、糖質新生、肝醣分解、肝醣生成、脂質代謝(包括膽固醇合成以及脂質生成、三酸甘油酯或脂肪的產生)在一經誘導的肝細胞中被觀察到。
在某些具體例中,一經誘導的肝細胞包含有相似於一初級肝細胞的超微結構或細胞構造(cellular makeup)。在某些例子中,這是經由根據穿透電子顯微鏡影像的比較而被達成。
在某些具體例中,一經誘導的肝細胞被使用於藥學研究,諸如藥物代謝、酵素誘導、肝毒性、肝細胞再生以及移植。滋養層幹細胞 (hTS 細胞 )
滋養層幹細胞(TS細胞)是經分化的胎盤細胞(differentiated placenta cell)的先驅。在某些例子中,一TS細胞是衍生自一囊胚極性滋養外胚層(trophectoderm, TE)或一胚外外胚層(extraembryonic ectoderm, ExE)細胞。在某些個案中,TS能夠在一未分化的狀態下在活體外(in vitro )無限的增生,並且能夠在活體外維持潛在的多元性分化能力(potential multilineage differentiation capabilities)。在某些例子中,一TS細胞是一哺乳動物TS細胞。示範性哺乳動物包括小鼠、大鼠、兔子、綿羊、乳牛、貓、狗、猴子、雪貂(ferret)、蝙蝠、袋鼠、海豹、海豚以及人類。在某些具體例中,一TS細胞是一人類TS (hTS)細胞。
在某些例子中,TS細胞是得自於輸卵管(fallopian tube)。輸卵管是受精的位址以及子宮外孕的常見位址,其中有生物事件會發生,諸如內細胞群(inner cell mass, ICM)與滋養外胚層之間的區別以及具有主要的表觀遺傳改變(epigenetic changes)之從全潛能性(totipotency)轉換至多能性。在某些例子中,這些觀察提供有關輸卵管在著床前的階段作為一供用於獲得囊胚-關聯性幹細胞(blastocyst-associated stem cells)的棲位儲存處(niche reservoir)的支持。囊胚是一著床前的早期-階段的胚胎,並且包含有ICM (它隨後形成成為胚胎)以及一外層(被稱為滋養層,它產生胎盤)。
在某些具體例中,一TS細胞是一被用於生成一祖細胞(諸如,例如一肝細胞)的幹細胞。在某些具體例中,一TS細胞是衍生自子宮外孕。在某些具體例中,該TS細胞是一人類TS細胞。在一個具體例中,該衍生自子宮外孕的人類TS細胞不涉及一人類胚胎的破壞。在另一個具體例中,該衍生自子宮外孕的人類TS細胞不涉及一可活性人類胚胎的破壞。在另一個具體例中,該人類TS細胞是衍生自與非-可活性子宮外孕有關聯的滋養層組織。在另一個具體例中,該子宮外孕不能被挽救。在另一個具體例中,該子宮外孕將不會致使一可活性人類胚胎。在另一個具體例中,該子宮外孕威脅母親的生命。在另一個具體例中,該子宮外孕是輸卵管的(tubal)、腹的(abdominal)、卵巢的(ovarian)或子宮頸的(cervical)。
在正常囊胚發育(blastocyst development)的期間,ICM本身接觸或它所衍生的可擴散的“誘導物(inducer)”會引起一在極性滋養外胚層中之高速率的細胞增生(cell proliferation),而導致在整個囊胚期朝向壁區域(mural region)的細胞移動並且甚至在ICM與滋養外胚層的區別之後會持續。覆蓋ICM的壁滋養外胚層細胞能夠保留ICM的一“細胞記憶(cell memory)”。在著床的起始階段,與ICM相對的壁細胞由於來自子宮內膜(uterine endometrium)的機械性限制而停止分裂。然而,在一子宮外孕中,其中胚胎是位於輸卵管內,限制不存在於輸卵管中,這致使極性滋養外胚層細胞的持續分裂而在停滯的囊胚中形成胚外外胚層。在某些例子中,ExE-衍生的TS細胞是呈一增生狀態而存在歷時達至20天。就其本身而論,直到臨床介入發生,該等細胞歷程在著床前的胚胎中可以產生一無限數目的hTS細胞,以及該等細胞可保留來自於ICM的細胞記憶。
在某些例子中,TS細胞具有ICM (例如,OCT4、NANOG、SOX2、FGF4)與滋養外胚層(例如,CDX2、Fgfr-2、Eomes、BMP4)的特定基因,並且表現3種初級胚層[中胚層(mesoderm)、外胚層(ectoderm)以及內胚層(endoderm)]的組分。在某些例子中,TS細胞表現與胚胎幹(例如,人類胚胎幹)細胞有關的表面標記[諸如特異性階段胚胎抗原(SSEA)-1、-3與-4]以及與間質幹細胞有關的標記(mesenchymal stem cell-related marker)[CD44、CD90、CK7以及中間絲蛋白(Vimentin)]。造血幹細胞標記(hematopoietic stem cell markers)[CD34、CD45、α6-整合蛋白(α6-integrin)、E-鈣黏素(E-cadherin)以及L-選擇素(L-selectin)]沒有被表現。經誘導的肝細胞的製備方法
在特定的具體例中,此處所揭示的是一種在活體外誘導一滋養層幹(TS)細胞分化成為一經誘導的肝細胞的方法,其包含有:令該滋養層幹細胞配於一包含有一纖維母細胞生長因子(FGF)、一類固醇以及一細胞激素的條件培養基中而接觸;以及令該細胞培育歷時一充分的時間,俾以誘導該滋養層幹細胞分化成為一經誘導的肝細胞。在某些具體例中,該TS細胞是一人類TS (hTS)細胞。在某些具體例中,該FGF、該類固醇以及該細胞激素是人類FGF、人類類固醇以及人類細胞激素。
在某些具體例中,纖維母細胞生長因子(FGFs)是涉及血管生成(angiogenesis)、傷口癒合(wound healing)、胚胎發育(embryonic development)以及細胞增生與分化歷程的生長因子的一家族。在某些例子中,FGFs是肝素-結合的蛋白質(heparin-binding protein)並且與硫酸乙醯肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans)交互作用。在某些例子中,有22個FGF家族的成員。示範性FGFs包括:FGF1、FGF2 (亦被知曉為鹼性FGF或bFGF或FGF-β)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF15/19、FGF20、FGF21、FGF22以及FGF23。在某些具體例中,該纖維母細胞生長因子是鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF,亦被知曉為FGF2或FGF-β)。在某些具體例中,該bFGF是一人類bFGF。在某些具體例中,該人類bFGF是一重組型人類bFGF或它的一片段。
在某些具體例中,FGF是呈一介於大約0.001以及大約5000 ng/mL、大約0.01以及大約500 ng/mL、大約0.1以及大約100 ng/mL,或者大約1以及大約50 ng/mL之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些例子中,FGF是呈一至少0.001、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,FGF是呈一至多0.001、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,bFGF是呈一介於大約0.001以及大約5000 ng/mL、大約0.01以及大約500 ng/mL、大約0.1以及大約100 ng/mL,或者大約1以及大約50 ng/mL之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些例子中,bFGF是呈一至少0.001、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,bFGF是呈一至多0.001、0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,一纖維母細胞生長因子被引入至包含有hTS細胞的培養基中,俾以起始hTS細胞分化事件。在某些具體例中,該纖維母細胞生長因子是bFGF。在某些具體例中,一類固醇以及一細胞激素在添加FGF (例如bFGF)之後被引入至培養基中。
在某些具體例中,一類固醇是一涉及一廣泛範圍的生理過程(physiological processes)[諸如壓力反應(stress response)、免疫反應(immune response)、發炎的調節(regulation of inflammation)、碳水化合物代謝、蛋白質分解代謝(protein catabolism)、血液電解質位準(blood electrolyte levels)以及行為]的化學品。在某些例子中,類固醇亦包括類固醇激素(steroid hormones),諸如糖皮質素(glucocorticoids)、礦物皮質素(mineralocorticoids)、雄性素(androgens)、雌激素(estrogens)以及助孕素(progestogens)。在某些具體例中,類固醇包括,但不限於:氫化可體松(hydrocortisone)類型[諸如氫化可體松、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、乙酸可體松(cortisone acetate)、巰基氫化可的松特戌酸鹽(tixocortol pivalate)、去氫皮質醇(prednisolone)、甲基去氫皮質醇(methylprednisolone)以及強體松(prednisone)];丙酮化合物(acetonides)[諸如丙酮特安皮質醇(triamcinolone acetonide)、氫可體松粉(triamcinolone alcohol)、莫米松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地索奈德(desonide)、氟洛奈皮質醇(fluocinonide)、丙酮氟洛皮質醇(fluocinolone acetonide)以及哈西奈德(halcinonide)];倍他米松(betamethasone)類型[諸如倍他米松、倍他米松磷酸鈉(betamethasone sodium phosphate)、地塞松、地塞松磷酸鈉(dexamethasone sodium phosphate)以及氟可龍(fluocortolone)];鹵化物(halogenated)[諸如17-氫化可體松戊酸酯(hydrocortisone-17-valerate)、鹵米松(halometasone)、二丙酸安氯皮質醇(alclometasone dipropionate)、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、二丙酸倍他米松(betamethasone dipropionate)、潑尼卡酯(prednicarbate)、17-可洛貝他松丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、17-可洛貝他索丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、己酸氟可龍(fluocortolone caproate)、三甲基乙酸氟可龍(fluocortolone pivalate)以及醋酸氟潑尼定(fluprednidene acetate)];不安定前驅藥酯類(labile prodrug esters)[諸如17-氫化可體松丁酸酯(hydrocortisone-17-butyrate)、17-氫化可體松醋丙酸酯(hydrocortisone-17-aceponate)、17-氫化可體松丁丙酸酯(hydrocortisone-17-buteprate)、環索奈德(ciclesonide)以及潑尼卡酯(prednicarbate)]。在某些具體例中,一類固醇是一經天然地衍生的或經化學地修飾的類固醇。在某些具體例中,一類固醇是地塞松、倍他米松、去氫皮質醇、甲基去氫皮質醇、丙酮特安皮質醇、氫可體松粉或氫化可體松。在某些具體例中,一類固醇是地塞松。如此處所使用的,術語“地塞松(dexamethasone)”意指地塞松或它的衍生物。在某些具體例中,地塞松被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,地塞松結合以另一種試劑被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,該另一種試劑是一細胞激素。
在某些具體例中,一類固醇是呈一介於大約0.001以及大約100 μM、大約0.005以及大約5 μM、大約0.01以及大約1 μM,或者大約0.05以及大約0.5 μM之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些例子中,一類固醇是呈一至少0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 µM或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,一類固醇是呈一至多0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 µM或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,地塞松是呈一介於大約0.001以及大約100 µM、大約0.005以及大約5 µM、大約0.01以及大約1 µM,或者大約0.05以及大約0.5 µM之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,地塞松是呈一至少0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 µM或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,地塞松是呈一至多0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 µM或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,一細胞激素是涉及細胞信號傳遞(cell signaling)之介於大約5至20 Kda的小蛋白質的一種範疇。在某些例子中,細胞激素包括趨化激素、干擾素(interferon)、介白素(interleukin)以及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)。趨化激素可扮演一有如一趨化劑(chemoattractant)的角色,俾以引導細胞的移動,並且可被區分為4亞家族:CXC、CC、CX3C以及XC。示範性趨化激素包括來自於CC亞家族的趨化激素:CCL1、CCL2 (MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5 (RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9 (或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27以及CCL28;CXC亞家族:CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16以及CXCL17;XC亞家族:XCL1以及XCL2;以及CX3C亞家族CX3CL1。
干擾素(IFNs)包含有第I型干擾素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ以及IFN-ω)、第II型干擾素(例如IFN-γ)以及第III型干擾素。在某些具體例中,IFN-α被進一步區分為大約13亞型,包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17以及IFNA21。
介白素是被白血球(leukocytes)或白血球(white blood cells)所表現,並且它們促進T與B淋巴球以及造血細胞(hematopoietic cells)的發育以及分化。示範性介白素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35以及IL-36。
腫瘤壞死因子(TNFs)是一群調節細胞凋亡的細胞激素。在某些例子中,在TNF家族中有大約19成員,包括,不限於:TNFα、淋巴毒素-α (lymphotoxin-alpha, LT-alpha)、淋巴毒素-β (lymphotoxin-beta, LT-beta)、T細胞抗原gp39 (CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L以及與TNF有關的細胞凋亡誘導配位子(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)。
在某些具體例中,地塞松結合以一細胞激素被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些例子中,該細胞激素是一趨化激素、一干擾素、一介白素或一腫瘤壞死因子。在某些例子中,該細胞激素是一介白素。在某些具體例中,地塞松結合以一介白素被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,該介白素是IL-6。在某些例子中,IL-6進一步根據它經由Gp130受體次-單元的交互作用而以額外的細胞激素予以分類。在某些例子中,IL-6群組的額外成員包括抑瘤素M (OSM)、IL-11、睫狀趨神經因子(Ciliary neurotropic factor, CNTF)、心肌營養素-1 (Cardiotrophin-1, CT-1)、似心肌營養素-細胞激素(Cardiotrophin-like cytokine, CLC)以及白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor, LIF)。在某些具體例中,地塞松結合以IL-6被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,地塞松結合以IL-6群組的一成員被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,地塞松結合以OSM、IL-11、CNTF、CT-1、CLC或LIF被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,地塞松結合以OSM被使用於指引一hTS細胞分化成為肝譜系。在某些具體例中,IL-6群組的細胞激素是人類IL-6細胞激素或它們的片段。在某些具體例中,OSM是一人類OSM。在某些具體例中,該人類OSM是一重組型人類OSM或它的片段。
在某些具體例中,一細胞激素是呈一介於大約0.001以及大約5000 ng/mL、大約0.01以及大約500 ng/mL、大約0.1以及大約100 ng/mL,或者大約1以及大約50 ng/mL之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,一細胞激素是呈一至少0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,一細胞激素是呈一至多0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,OSM是呈一介於大約0.001以及大約5000 ng/mL、大約0.01以及大約500 ng/mL、大約0.1以及大約100 ng/mL,或者大約1以及大約50 ng/mL之間的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,OSM是呈一至少0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更高的濃度而被引入至培養基中。在某些具體例中,OSM是呈一至多0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1000 ng/mL或更低的濃度而被引入至培養基中。
在某些具體例中,一纖維母細胞生長因子(例如bFGF)調節在一hTS細胞中的一生物標記的表現。在某些具體例中,該生物標記是一微RNA (miR)。在某些具體例中,該生物標記是miRNA-124a。在某些具體例中,該纖維母細胞生長因子是bFGF。在某些具體例中,bFGF向上調控或活化miRNA-124a。在某些具體例中,bFGF向下調控miRNA-124a。
在某些具體例中,miRNA-124a在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的表現位準被相較於miRNA-124a在一未經處理的滋養層幹細胞中的表現位準。在某些具體例中,miRNA-124a在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的表現位準相對於miRNA-124a在一未經處理的滋養層幹細胞中的表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000倍或更高。在某些具體例中,miRNA-124a在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的表現位準相對於miRNA-124a在一未經處理的滋養層幹細胞中的表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000倍或更低。
在某些具體例中,miRNA-124a的活化或向上調控啟動在滋養層幹細胞中的定型內胚層(DE)特化。在某些具體例中,該DE特化在介於大約0.1以及大約96小時、大約0.5以及大約36小時、大約1以及大約24小時、大約2以及大約18小時、大約4以及大約12小時,或者大約6以及大約10小時之間而發生。
在某些具體例中,該DE特化在以bFGF誘導之後的至少0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72小時或更久而發生。在某些具體例中,該DE特化在以bFGF誘導之後的至多0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72小時或更少而發生。在某些具體例中,該DE特化在以bFGF誘導之後大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18小時而發生。在某些具體例中,該DE特化在以bFGF誘導之後大約6、7、8、9或10小時而發生。
在某些具體例中,該DE特化是與一群生物標記有關聯。在某些具體例中,該等生物標記包括叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)、同源區蛋白質MIXL1、SRY-盒2 (SOX2)、轉錄因子NANOG以及OCT4。在某些具體例中,該DE特化的特徵為選自於下列生物標記的一升高的表現:叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)、同源區蛋白質MIXL1、SRY-盒2 (SOX2)、轉錄因子NANOG以及OCT4。在某些具體例中,該DE特化的特徵為選自於下列生物標記的一升高的表現:叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)、SRY-盒2 (SOX2)、轉錄因子NANOG以及OCT4。在某些具體例中,該DE特化的特徵為選自於下列生物標記的一減少的表現:叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)、同源區蛋白質MIXL1、SRY-盒2 (SOX2)、轉錄因子NANOG以及OCT4。在某些具體例中,該DE特化的特徵為同源區蛋白質MIXL1的一減少的表現。
在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一經bFGF誘導的滋養層幹細胞中的表現位準被相較於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經誘導的滋養層幹細胞中的表現位準。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的蛋白質表現位準。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4的蛋白質表現位準是高於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的蛋白質表現位準介於大約1以及大約20,000倍、大約2以及大約1000倍或大約10以及大約100倍之間。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的蛋白質表現位準相對於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的蛋白質表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000倍或更高。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的蛋白質表現位準相對於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的蛋白質表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000倍或更低。
在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4的基因表現位準是高於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的基因表現位準介於大約1以及大約20,000倍、大約2以及大約1000倍或大約10以及大約100倍之間。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的基因表現位準相對於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的基因表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000倍或更高。在某些具體例中,FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一經bFGF處理的滋養層幹細胞中的基因表現位準相對於FOXA2、SOX17、GSC、MIXL1、SOX2、NANOG以及OCT4在一未經處理的滋養層幹細胞中的基因表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000倍或更低。
在某些具體例中,一類固醇以及一細胞激素的一雞尾酒(cocktail)被用來指引DE分化成為肝譜系。在某些具體例中,該包含有地塞松以及抑瘤素M的雞尾酒被用來指引DE分化成為肝譜系。在某些具體例中,該雞尾酒在添加bFGF之前、之後或同時被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。在某些具體例中,該雞尾酒在介於大約0.5以及大約96小時、大約1以及大約48小時、大約2以及大約36小時、大約3以及大約24小時、大約4以及大約12小時,或者大約6以及大約10小時之間而被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。
在某些具體例中,該雞尾酒在添加bFGF之後的至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72小時或更久而被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。在某些具體例中,該雞尾酒在添加bFGF之後的至多0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72小時或更少而被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。在某些具體例中,該雞尾酒在添加bFGF之後的大約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18小時而被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。在某些具體例中,該雞尾酒在添加bFGF之後的大約6、7、8、9、10、11或12小時而被引入至一包含有hTS細胞的培養基中。
在某些具體例中,一hTS細胞被培育於一包含有bFGF、地塞松以及抑瘤素M的培養基中歷時介於大約0.5以及大約100天、大約1以及大約50天、大約2以及大約30天、大約3以及大約15天,或者大約4以及大約12天。
在某些具體例中,一hTS細胞被培育於一包含有bFGF、地塞松以及抑瘤素M的培養基中歷時至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在某些具體例中,一hTS細胞被培育於一包含有bFGF、地塞松以及抑瘤素M的培養基中歷時至多0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更少。
在某些具體例中,該滋養層幹細胞被區分為4種階段的似肝細胞-細胞發育。在某些具體例中,該4種階段包括原條至DE階段、肝特化的內胚層階段、肝母細胞階段以及胎兒與成人似肝細胞-細胞階段。在某些具體例中,該4種階段中的各者是與一群生物標記有關聯,包含有第4型C-X-C趨化激素受體(CXCR4)、叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)、SRY-盒17 (SOX17)、己醣胺酶A (α多肽)(HEXA)、膽鹽輸出幫浦(BSEP)、轉甲蛋白(TTR)、白蛋白(ALB)、酪胺酸轉胺酶(TAT)、細胞色素P450 7A1 (CYP7A1)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、絲胺酸肽酶抑制劑A支(α-1抗蛋白酶,抗胰蛋白酶)成員1 (SERPINA1)、ATP-結合的卡匣亞家族C (ABCC2)、CCAAT-增強子-結合的蛋白質β (C/EBPβ)、肝細胞核因子1-α (HNF1α)、肝細胞核因子4-α (HNF4α)、α-1-胎兒蛋白(AFP)、角質蛋白8 (KRT8)、粒線體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2 (PCK2)、細胞色素P450 2B6 (CYP2B6)、肝醣合成酶2 (GYS2)、肝細胞核因子6 (HNF6)、粒線體胺甲醯基-磷酸合成酶1 (CPS1)、乙醇去氫酶1C (第I型) γ多肽(ADH1C)、連結蛋白32 (CX32)、細胞色素P450 3A4 (CYP3A4)、普洛斯彼羅同源盒1 (PROX1)、色胺酸2,3-雙加氧酶(TDO2)、缺脂脂蛋白F (APOF)、角質蛋白18 (KRT18)、角質蛋白19 (KRT19),或者染色體19開放閱讀架構80 (似血管生成素-蛋白質8、肝細胞癌-關聯性基因TD26、lipasin)(β滋養因子)。在某些具體例中,該4種階段中的各者是與一群生物標記有關聯,包含有CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α或HNF4α。
在某些例子中,該原條至DE階段是一種階段,其中一hTS細胞尚未進入一肝分化階段或即將進入一肝分化階段。在某些具體例中,在該原條至DE階段的一hTS細胞經歷DE特化。在某些例子中,在誘導以一FGF (例如bFGF)之後,一hTS細胞在該原條至DE階段中維持歷時介於大約0.1以及大約24小時、大約0.5以及大約18小時,或者大約1以及大約12小時。在某些例子中,在誘導以一FGF (例如bFGF)之後,一hTS細胞在該原條至DE階段中維持歷時至多0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小時或更少。在某些例子中,在誘導以一FGF (例如bFGF)之後,一hTS細胞在該原條至DE階段中維持歷時至少0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小時或更久。
在某些例子中,在該原條至DE階段中的一hTS細胞的特徵為一群選自於下列的生物標記:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、G6PC、SERPINA1、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α、AFP、KRT8、PCK2、CYP2B6、GYS2、HNF6、CPS1、ADH1C、CX32、CYP3A4、PROX1、TDO2、APOF、KRT18、KRT19以及β滋養因子。在某些具體例中,該原條至DE階段是與一群選自於下列的生物標記有關聯:CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX。
在某些具體例中,該原條至DE階段是與CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的蛋白質表現位準或一增加的基因表現位準。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的升高的基因表現位準是相對於一尚未進入該原條至DE階段的等效的滋養層幹細胞中的CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的基因表現位準。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的升高的基因表現位準是介於大約0.1以及大約10,000、大約1以及大約5000,或大約2以及大約1000之間。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的升高的基因表現位準相對於一尚未進入該原條至DE階段的等效的hTS細胞中的CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的基因表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更高。在某些具體例中,CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的升高的基因表現位準相對於一尚未進入該原條至DE階段的等效的hTS細胞中的CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX的基因表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更低。
在某些實例中,該肝特化的內胚層是以在肝特化之後上皮細胞的首次出現為特徵。在某些具體例中,該肝特化的內胚層階段是以類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的一雞尾酒的添加而被啟動。在某些例子中,該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒是在介於大約1以及大約48小時、大約2以及大約24小時、大約3以及大約18小時,或者大約4以及大約12小時之間而被添加至培養基。在某些例子中,該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒是在一FGF (例如bFGF)的誘導之後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16小時或更久而被添加至培養基。在某些例子中,該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒是在一FGF (例如bFGF)的誘導之後至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16小時或更少而被添加至培養基。
在某些例子中,在誘導以該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒之後,一hTS細胞在肝特化的內胚層階段維持歷時介於大約1以及大約72小時、大約2以及大約36小時、大約3以及大約24小時,或者大約4以及大約12小時之間。在某些例子中,在誘導以該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒之後,一hTS細胞在肝特化的內胚層階段維持歷時至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36小時,或者更久。在某些例子中,在誘導以該類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒之後,一hTS細胞在肝特化的內胚層階段維持歷時至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36小時,或者更少。
在某些例子中,在該肝特化的內胚層階段中的一hTS細胞的特徵為一群選自於下列的生物標記:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、G6PC、SERPINA1、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α、AFP、KRT8、PCK2、CYP2B6、GYS2、HNF6、CPS1、ADH1C、CX32、CYP3A4、PROX1、TDO2、APOF、KRT18、KRT19以及β滋養因子。在某些具體例中,該肝特化的內胚層是與一群選自於下列的生物標記有關聯:SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1。
在某些具體例中,該肝特化的內胚層是與SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的蛋白質表現位準或一增加的基因表現位準。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的升高的基因表現位準是相對於一尚未進入該肝特化的內胚層階段的等效的滋養層幹細胞的SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準是介於大約1以及大約10,000倍、大約2以及大約1000倍,或者大約2以及大約100倍之間。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準相對於一尚未進入該肝特化的內胚層階段的等效的滋養層幹細胞中的SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更高。在某些具體例中,SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準相對於一尚未進入該肝特化的內胚層階段的等效的滋養層幹細胞中的SOX17、TTR、ALB、TAT以及CYP7A1的基因表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更低。
在某些具體例中,一hTS細胞在一類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒的添加之後介於大約1以及大約36小時、大約3以及大約24小時,或者大約6以及大約12小時而進入該肝母細胞階段。在某些具體例中,一hTS細胞在一類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒的添加之後大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之後而進入該肝母細胞階段。
在某些具體例中,一hTS細胞在該肝母細胞階段維持歷時介於大約1以及大約30天、大約2以及大約12天,或者大約3以及大約7天之間。在某些具體例中,一hTS細胞在該肝母細胞階段維持歷時至多1、2、3、4、5、6、7、8天或更少。在某些具體例中,一hTS細胞在該肝母細胞階段維持歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8天或更久。
在某些例子中,在該肝母細胞階段中的一hTS細胞的特徵為一群選自於下列的生物標記:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、G6PC、SERPINA1、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α、AFP、KRT8、PCK2、CYP2B6、GYS2、HNF6、CPS1、ADH1C、CX32、CYP3A4、PROX1、TDO2、APOF、KRT18、KRT19以及β滋養因子。在某些具體例中,該肝母細胞階段是與一群選自於下列的生物標記有關聯:TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP。
在某些具體例中,該肝母細胞階段是與TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的蛋白質表現位準或一增加的基因表現位準。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的升高的基因表現位準是相對於一尚未進入該肝母細胞階段的等效的hTS細胞中的TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準是介於大約1以及大約10,000倍、大約2以及大約1000倍,或者大約2以及大約100倍之間。
在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準相對於一尚未進入該肝母細胞階段的等效的hTS細胞中的TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000、5000倍或更高。在某些具體例中,TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準相對於一尚未進入該肝母細胞階段的等效的hTS細胞中的TTR、ALB、TAT、CYP7A1以及BSEP的基因表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000、5000倍或更低。
在某些例子中,一hTS細胞在一類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒的添加之後的介於大約1以及大約20天、大約2以及大約10天,或者大約3以及大約6天之間而進入該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段。在某些例子中,一hTS細胞在一類固醇(例如地塞松)以及細胞激素(例如抑瘤素M)的雞尾酒的添加之後大約1、2、3、4、5或6天之後而進入該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段。
在某些具體例中,一hTS細胞在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段維持歷時介於大約1以及大約100天、大約2以及大約50天、大約3以及大約30天、大約4以及大約12天,或者大約6以及大約10天之間。在某些具體例中,在某些具體例中,一hTS細胞在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段維持歷時至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、60天或更少。在某些具體例中,一hTS細胞在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段維持歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、60天或更久。
在某些例子中,在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段中的一hTS細胞的特徵為一群選自於下列的生物標記:CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、G6PC、SERPINA1、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α、AFP、KRT8、PCK2、CYP2B6、GYS2、HNF6、CPS1、ADH1C、CX32、CYP3A4、PROX1、TDO2、APOF、KRT18、KRT19以及β滋養因子。在某些具體例中,該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段是與一群選自於下列的生物標記有關聯:HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α。
在某些具體例中,該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段是與HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的升高的表現位準有關聯。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的蛋白質表現位準或一增加的基因表現位準。在某些具體例中,該升高的表現位準是一增加的基因表現位準。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的升高的基因表現位準是相對於一尚未進入該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的等效的hTS細胞中的HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準是介於大約1以及大約10,000倍、大約2以及大約5000倍,或者大約2以及大約1000倍之間。
在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準相對於一尚未進入該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的等效的hTS細胞中的HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更高。在某些具體例中,HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準相對於一尚未進入該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的等效的hTS細胞中的HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α的基因表現位準是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、5000倍或更低。
在某些具體例中,在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段中的一細胞發展成一經誘導的肝細胞。在某些具體例中,在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段中的一細胞是一經誘導的肝細胞。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞不會進一步分化。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞達到一終末分化階段。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞作為一穩定的細胞維持歷時長達2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100代或更多。在某些具體例中,該經誘導的肝細胞作為一穩定的細胞維持歷時長達7天、10天、14天、21天、30天、60天、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或更久。使用的方法
在特定的具體例中,此處所描述的是使用經誘導的肝細胞以供用於一或多種用途的方法。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於篩選一供用於治療或預防一疾病或障礙的化合物。在某些具體例中,該篩選方法涉及化合物的一或多種研究、酵素誘導以及毒性研究。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被投藥以供治療一肝損傷,諸如由於一肝-關聯性疾病或障礙所造成的一傷害或缺損。在另一個具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生治療性蛋白質(例如激素)、細胞激素、膽固醇、碳水化合物、膽汁,或者它們的一組合。在另一個具體例中,經誘導的肝細胞被使用於肝再生。在額外的具體例中,經誘導的肝細胞被使用作為一用於基因治療的來源。用於篩選一化合物之經誘導的肝細胞
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於篩選一供用於治療或預防一疾病或障礙的化合物。在某些具體例中,該方法包含令一經分離的經誘導的肝細胞與一化合物接觸。在某些具體例中,該方法包含令一經分離的初級肝細胞與該化合物接觸。在另一個具體例中,該方法進一步包含在經誘導的肝細胞中偵測至少一生物標記(例如基因、轉錄本或蛋白質)之活性上的一改變。在另一個具體例中,該方法進一步包含在初級肝細胞中偵測至少一生物標記(例如基因、轉錄本或蛋白質)之位準上的一改變。在某些具體例中,至少一生物標記的位準上的一改變是至少一生物標記的基因表現位準上的一改變。在某些具體例中,該生物標記包含有細胞色素P450超家族(superfamily)的一成員。在某些具體例中,該生物標記包含有細胞色素P450家族:CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP11、CYP17、CYP19、CYP20、CYP21、CYP24、CYP26、CYP27、CYP39、CYP46、CYP51,以及它們各自的亞家族成員。在某些具體例中,該生物標記包含有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4或CYP7A1。
在某些具體例中,一化合物(例如一藥物)是經由肝臟而被代謝。在某些實例中,用於代謝該化合物(例如藥物)的肝臟的主要機制是P450細胞色素酵素系統。在某些例子中,代謝該化合物的速度太快,這可能會減少該化合物的效力。另擇地,若代謝該化合物的速度太慢,這可能會允許毒性在宿主細胞中積累。因此,在某些例子中,一化合物的代謝被評估,諸如,例如它的毒性。
在某些例子中,該化合物作用為關於該細胞色素P450酵素家族的一成員的一誘導物或一抑制劑。在某些例子中,該化合物是一關於該細胞色素P450酵素家族的一成員的誘導物。在某些例子中,一誘導物啟動或增強一酵素(諸如該細胞色素P450酵素家族的一成員)的表現位準。在某些例子中,一誘導物啟動或增強該細胞色素P450酵素家族的一成員的基因表現位準。在某些例子中,一誘導物啟動或增強該細胞色素P450酵素家族的一成員的蛋白質表現位準。在某些例子中,該化合物是一關於該細胞色素P450酵素家族的一成員的抑制劑。在某些例子中,一抑制劑抑制、減少或干擾一酵素(諸如該細胞色素P450酵素家族的一成員)的表現位準。在某些例子中,一抑制劑抑制、減少或干擾該細胞色素P450酵素家族的一成員的基因表現位準。在某些例子中,一抑制劑抑制、減少或干擾該細胞色素P450酵素家族的一成員的蛋白質表現位準。在某些例子中,該酵素(諸如該細胞色素P450酵素家族的一成員)的表現位準是相較於該酵素的一對照表現位準。在某些具體例中,該酵素的對照表現位準是未被該化合物誘導的酵素的表現位準。
在某些例子中,在令一經分離的經誘導的肝細胞與一化合物接觸之後,在該細胞色素P450超家族的一成員的基因表現上的一改變被偵測。在某些例子中,來自於已被接觸以一化合物的一經分離的經誘導的肝細胞的細胞色素P450超家族的一成員的一生物標記的基因表現位準是與來自於未被接觸以該化合物的一等效的經分離的經誘導的肝細胞的細胞色素P450超家族的一生物標記的基因表現位準相比較,或者是與一初級肝細胞相比較。
在某些例子中,在令一經分離的經誘導的肝細胞與一化合物接觸之後,在一選自於下列細胞色素P450家族的生物標記的基因表現位準上的一改變被偵測:CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP11、CYP17、CYP19、CYP20、CYP21、CYP24、CYP26、CYP27、CYP39、CYP46、CYP51,以及它們各自的亞族成員。在某些例子中,一來自於細胞色素P450家族(CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP11、CYP17、CYP19、CYP20、CYP21、CYP24、CYP26、CYP27、CYP39、CYP46、CYP51,以及來自於已被接觸以一化合物之一經分離的經誘導的肝細胞之它們各自的亞家族成員)的生物標記的基因表現位準是與一來自於細胞色素P450家族(CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP11、CYP17、CYP19、CYP20、CYP21、CYP24、CYP26、CYP27、CYP39、CYP46、CYP51,以及一沒有被接觸以該化合物之等效的經分離的肝細胞之它們各自的亞家族成員)的生物標記的基因表現位準相比較,或者是與一初級肝細胞相比較。
在某些例子中,在令一經分離的經誘導的肝細胞與一化合物接觸之後,在一選自於CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4以及CYP7A1的生物標記的基因表現位準上的一改變被偵測。在某些例子中,來自於已被接觸以一化合物之一經分離的經誘導的肝細胞之一選自於CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4以及CYP7A1的生物標記的基因表現位準是與一沒有被接觸以該化合物之等效的經分離的肝細胞之一選自於CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4以及CYP7A1的生物標記的基因表現位準相比較,或者是與一初級肝細胞相比較。
在一個具體例中,此處所提供描述一篩選一具有誘導一細胞中的變化之能力的化合物的方法。在一個具體例中,該方法包含令一經分離的經誘導的肝細胞與該化合物接觸。在另一個具體例中,該方法包含令一經分離的初級肝細胞與該化合物接觸。在另一個具體例中,該方法進一步包含偵測該經誘導的肝細胞(諸如在再生期間)的一變化(例如增生)的誘導。在另一個具體例中,該方法進一步包含偵測該初級肝細胞(諸如在再生期間)的一變化(例如增生)的誘導。
此處亦提供一篩選一具有細胞毒性或調節細胞的化合物的方法,該方法包含令一經誘導的肝細胞與該化合物接觸。在另一個具體例中,該方法進一步包含偵測在該細胞中起因於與該化合物接觸的任何表現型或代謝的改變,以及建立該改變與細胞毒性或在細胞功能或生物化學上的任何其他改變的相關性。在另一個具體例中,分化的藥劑、毒素或潛在調節子的篩選被促進。這些物質(例如,藥劑、毒素,或潛在調節子)可以被添加至培養基。
此處所提供的一個具體例描述一篩選增生因子、分化因子以及藥劑的方法。在一個具體例中,經誘導的肝細胞或初級肝細胞被用來篩選有關影響經誘導的肝細胞或初級肝細胞在培養中的特性的因子(諸如小分子藥物、胜肽、聚核苷酸以及類似之物)或條件(諸如培養條件或操作)。在一個具體例中,此系統具有不會受一由測試化合物所造成的餵養細胞的擾亂而引起的次級效用(secondary effect)所複雜化的優點。在另一個具體例中,生長-影響物質被測試。在另一個具體例中,條件培養基從該培養物中被撤除以及一較簡單的培養基予以取代。在另一個具體例中,不同的井接著被處理以不同的可溶性因子的雞尾酒(它們是用於取代該條件培養基的組分的候選者)。若經處理的細胞被維持並且以一滿意的方式來增生(最佳地與在條件培養基中一樣),各個混合物的效力被決定。潛在的分化因子或條件可以藉由依據測試操作程序來處理細胞而被測試,並且接著決定經處理的細胞是否發展一特定譜系之一經分化的細胞的功能性或表現型特性。
在一個具體例中,該經誘導的肝細胞或初級肝細胞被用來篩選細胞分化的潛在調節子。例如,在一個用於篩選細胞分化的調節子的分析中, 該經誘導的肝細胞或初級肝細胞可在無血清(或隨著情況需要在一調節子的存在下)下被培養,並且在分化上的效用可被偵測。在另一個具體例中,此處所描述的該篩選方法可被用來研究與細胞發育有關聯的條件以及篩選有關該條件的潛在治療劑或矯正的藥物或調節子。例如,在一個具體例中,該經誘導的肝細胞或初級肝細胞的發育是與具有一疾病或病況的細胞的發育相比較。
在一個具體例中,生物標記(諸如基因)以及蛋白質表現可在得自於經誘導的肝細胞或初級肝細胞的不同細胞族群之間而被比較,並且被用來鑑定以及區別在增生的期間被向上調控或被向下調控的因子,以及產生受影響的基因的核苷酸複製品(nucleotide copies)。
在一個具體例中,無餵養(feeder-free)的經誘導的肝細胞或初級肝細胞培養物亦可在藥物研究中被使用於測試藥學化合物。候選藥學化合物的活性的評估通常涉及將該經誘導的肝細胞或初級肝細胞組合以該候選化合物,決定任何所形成的變化,並且接著使該化合物的效用與該被觀察到的改變產生關聯。在另一個具體例中,篩選被完成,例如,因為該化合物被設計要在特定細胞類型上具有一藥理效用,或因為一被設計要在別處具有效用的化合物具有非所欲的副作用。在另一個具體例中,2或多種藥物是被組合地(藉由同時地或依序地與細胞組合)測試,俾以偵測可能的藥物-藥物交互作用效應。在另一個具體例中,化合物最初地針對潛在的毒性而被篩選。在另一個具體例中,細胞毒性是藉由在細胞可活性、存活、形態學上,在特定的標記、受體或酵素的表現或釋放上,在DNA合成或修復上的作用而被決定。
術語“治療(treating)”、“治療(treatment)”,以及類似者在此處被使用來意指獲得一所欲的藥理學的和/或生理學的效用。在某些具體例中,一個體(例如,一被懷疑蒙受一肝-關聯性疾病或障礙和/或基因上對於一肝-關聯性疾病或障礙具有得病傾向的個體)是被預防性治療以此處所描述的經誘導的肝細胞的製劑並且該預防性治療完全地或部分地預防一肝-關聯性疾病或障礙或者它們的徵兆或症狀。在某些具體例中,一個體被治療性治療(例如,當一個體蒙受一肝-關聯性疾病或障礙時),該治療性治療造成對於該疾病或障礙的一部分或完全治癒,和/或逆轉一可歸因於該疾病或障礙的副作用,和/或穩定該疾病或障礙,和/或延遲該疾病或障礙的進展,和/或造成該疾病或障礙的消退。
將經誘導的肝細胞投藥(例如,移植)至有治療需要的區域是藉由,例如不受限地,在手術期間的局部滴注(local infusion)、藉由注射(injection)、藉由一導管(catheter)的方式,或藉由一植入物(implant){該植入物是一多孔性、非孔性或凝膠狀材料,包括膜[諸如矽膠膜(silastic membranes)]或纖維}的方式而被完成。
“移植(transplanting)”一組成物至一哺乳動物中意指藉由在此技藝中所建立的任何方法來將該組成物導入至該哺乳動物的體內。被導入的組成物是“移植物(transplant)”,以及該哺乳動物是“接受者(recipient)”。該移植物以及該接受者可以是同源的(syngeneic)、同種異體的(allogeneic)或異種的(xenogeneic)。此外,該移植可以是一自體移植(autologous transplantation)。
一“有效量(effective amount)”是一治療劑足以達到所欲目的的一數量。例如,一經誘導的肝細胞的有效量是一足以視情況而致使在初級肝細胞數目上的一增加的數量。一用以治療或改善一肝-關聯性疾病或障礙的組成物的一有效量是該組成物足以減少或移除該肝-關聯性疾病或障礙的症狀的一數量。一既定的治療劑的有效量將會隨著因子(諸如試劑的性質、投藥的途徑、要接受治療劑的動物的大小與物種,以及投藥的目的)而變化。
在一個具體例中,此處所進一步所提供的是經基因改造的經誘導的肝細胞。操控改造了細胞的各種不同的性質,例如,使它更適應於或抵抗特定的環境條件,和/或誘導一或多種由該細胞生成的特定物質,該等物質可以,例如增進細胞的可活性。該等基因改變可被執行以使該細胞更適合供用於移植,例如,為了避免該細胞來自於接受者的排斥(有關基因治療操作程序的回顧文獻,參見Anderson, Science, 256:808; Mulligan, Science, 926;Miller, Nature, 357:455; Van Brunt, Biotechnology, 6(10):1149;以及Yu et al., Gene Therapy, 1:13)。
一“載體(vector)”意指一重組型DNA或RNA建構物,諸如一質體、一噬菌體、重組型病毒,或者其它的載體,當導入至一適當的宿主細胞中會致使此處所描述的一祖細胞的一修飾。適當的表現載體是那些本技藝中具有通常技藝者所熟知的,並且包括那些在真核和/或原核細胞中可複製者,以及那些維持游離基因態者或那些合併至宿主細胞基因組內者。
載體的構築是使用下面所描述的技術而被達成,例如,有如在Sambrooket al ., 1989中所描述的。在一個具體例中,經分離的質體或DNA片段是以所欲生成質體的形式而被切割、裁剪以及再接合。若所欲的,為了確認在經構築的質體中的正確序列的分析是使用任何適合的方法而被執行。用於構築表現載體、製備活體外轉錄本、導入DNA至宿主細胞中,以及執行關評估基因表現與功能的分析之適合方法是被知曉的。基因存在、擴增和/或表現是在一樣品中被直接地測量,例如,藉由傳統的南方墨點法、用以定量mRNA的轉錄的北方墨點法、點漬法(dot blotting)(DNA或RNA分析)或原位雜交法(in situ hybridization)(使用可以此處所提供的一序列為基礎的一適當地經標定的探針)。
如此處所使用的,術語諸如“轉染(transfection)”、“轉形(transformation)”以及類似者被意欲要意指將核酸呈功能的形式而轉移至一細胞或生物體。該等術語包括各種不同的將核酸轉移至細胞的方法,包括轉染以CaPO4 、電穿孔(electroporation)、病毒傳導(viral transduction)、脂質轉染(lipofection)、使用脂質體和/或其他輸送載體(delivery vehicles)遞送。用於治療一疾病或障礙的經誘導的肝細胞
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被投藥以供治療一肝損傷。在某些具體例中,肝損傷包括由於外部因子[諸如對宿主的損傷(例如對一個體的損傷)]或由於手術所造成的肝組織的傷害或缺失。在某些具體例中,由於一肝-關聯性疾病或障礙,肝損傷包括肝組織的傷害或缺損。在某些具體例中,該肝-關聯性疾病或障礙是一急性肝疾病或障礙(諸如急性肝衰竭)或是一慢性肝疾病或障礙(諸如肝硬化)。在某些具體例中,該肝-關聯性疾病或障礙是起因於遺傳因子、化學品或病原體的感染。
示範性肝-關聯性疾病或障礙包括,但不限於:阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、肝硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[例如姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣貯積病、酪胺酸血症、病毒性A、B、C型肝炎,以及威爾森氏症。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被投藥以供治療一急性肝疾病或障礙。在另一個具體例中,經誘導的肝細胞被投藥以供治療一慢性肝疾病或障礙。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被投藥以供治療阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、肝硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[例如姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣貯積病、酪胺酸血症、病毒性A、B、C型肝炎、威爾森氏症,或者它們的一組合。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞組合以一額外的治療劑而被投藥以供治療一肝-關聯性疾病或障礙。在某些具體例中,該額外的治療劑包括,但不限於:薑黃素(curcumin)、白藜蘆醇(resveratrol)、沙利竇邁(thalidomide)、銷膽胺(cholestyramine)(Questran)、他克莫司(tacrolimus) (PROGRAF)、熊去氧膽酸(ursodiol)(Actigall)、干擾素(interferons)、利尿劑(diuretics)(諸如環利尿劑),以及肝移植。
在某些具體例中,化學品(它對於肝是有毒的)致使化學品-誘導的肝疾病。在某些具體例中,化學品(它對於肝是有毒的)包括藥物;消耗品(諸如醇、食品添加物,或防腐劑);以及化學與環境毒素。在某些例子中,造成肝損傷的藥物包括,但不限於:乙醯胺苯酚(acetaminophen)、異嘌呤醇(allopurinol)、同化類固醇( anabolic steroids)、丹納唑(danazol)、丹特靈(dantrolene)、伊米帕明(imipramine)、異菸酸酊(isoniazid)、胺甲碟呤(methotrexate)、甲基多巴(methyldopa)、菸鹼酸(nicotinic acid)、硝基呋喃妥因(nitrofurantoin)、硫二苯胺(phenothiazines)、苯妥英(phenytoin)、柳酸酯(salicylates)、他汀(statins)、特比那芬HCL (terbinafine HCl)、涕必靈(thiabendazole)、二氧化釷(thorotrast)、甲苯磺丁尿素(tolbutamide)、氯丙嗪(chlorpromazine)/丙戊酸(valproic acid),以及氯苯磺丙脲(chlorpropamide)/紅黴素(erythro-mycin)。
在某些具體例中,病原體的感染誘導肝-關聯性疾病或障礙。在某些具體例中,一病原體是一病毒、一細菌、一真菌或一寄生蟲。在某些具體例中,該病原體是一病毒。在某些具體例中,一病毒感染誘導肝-關聯性疾病或障礙。
在某些具體例中,一病毒是一DNA病毒或一RNA病毒。在某些例子中,一DNA病毒是一單-股(ss) DNA病毒、一雙-股(ds) DNA病毒,或一含有ss以及ds DNA區域的DNA病毒。在某些例子中,一RNA病毒是一單-股(ss) RNA病毒或一雙-股(ds) RNA病毒。有時,一ssRNA病毒進一步被分類成一正-向(positive-sense) RNA病毒或一負-向RNA病毒。
在某些例子中,一dsDNA病毒是來自下列科:肌尾噬菌體科(Myoviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)、異疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、軟體動物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、脂毛噬菌體科(Lipothrixviridae)、古噬菌體科(Rudiviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、瓶狀病毒科(Ampullaviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、桿狀病毒科(Baculoviridae)、雙尾病毒科(Bicaudaviridae)、Clavaviridae、覆蓋噬菌體科(Corticoviridae)、微小紡錘形噬菌體科(Fuselloviridae)、球狀病毒科(Globuloviridae)、滴狀病毒科(Guttaviridae)、唾液線肥大病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、馬賽病毒科(Marseilleviridae)、擬菌病毒科(Mimiviridae)、線極病毒科(Nimaviridae)、潘多拉病毒科(Pandoraviridae)、乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)、藻類去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、芽生噬菌體科(Plasmaviridae)、多去氧核糖核酸病毒科(Polydnaviruses)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、Sphaerolipoviridae,以及復層噬菌體科(Tectiviridae)。
在某些實例中,一ssDNA病毒是來自下列科:指環病毒科(Anelloviridae)、虹彩病毒科(Bacillariodnaviridae)、雙DNA病毒科(Bidnaviridae)、環狀病毒科(Circoviridae)、聯體病毒科(Geminiviridae)、絲狀噬菌體科(Inoviridae)、微小噬菌體科(Microviridae)、矮化病毒科(Nanoviridae)、小DNA病毒科(Parvoviridae),以及Spiraviridae。
在某些例子中,一含有ss以及dsDNA區域的DNA病毒是來自於pleolipoviruses的群組。在某些例子中,pleolipoviruses包括嗜鹽古菌多形性病毒1型(Haloarcula hispanica pleomorphic virus 1)、鹽幾何菌多形性病毒1型(Halogeometricum pleomorphic virus 1)、鹽紅菌多形性病毒1型(Halorubrum pleomorphic virus 1)、鹽紅菌多形性病毒2型(Halorubrum pleomorphic virus 2)、鹽紅菌多形性病毒3型(Halorubrum pleomorphic virus 3),以及鹽紅菌多形性病毒6型(Halorubrum pleomorphic virus 6)。
在某些例子中,一dsRNA病毒是來自下列科:雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、囊狀噬菌體科(Cystoviridae)、內源核糖核酸病毒科(Endornaviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、Megavirnaviridae、分體病毒科(Partitiviridae)、小雙節病毒科(Picobirnaviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒(Rotavirus)以及整體病毒科(Totiviridae)。
在某些例子中,一正-向ssRNA病毒是來自下列科:α彎曲病毒科(Alphaflexiviridae)、α四病毒科(Alphatetraviridae)、蜂窩狀病毒科(Alvernaviridae)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、桿菌狀核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、β彎曲病毒科(Betaflexiviridae)、雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、卡爾莫四病毒科(Carmotetraviridae)、修道院病毒科(Closteroviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、二順反子病毒科(Dicistroviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、γ彎曲病毒科(Gammaflexiviridae)、傳染性軟化病毒科(Iflaviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、黃症病毒科(Luteoviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、海洋病毒科(Mesoniviridae)、裸露核糖核酸病毒(Narnaviridae)、野田病毒科(Nodaviridae)、Permutotetraviridae、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、桿狀套病毒科(Roniviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、披衣病毒科(Togaviridae)、番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、蕪菁發黃鑲嵌病毒科(Tymoviridae),以及帚狀病毒科(Virgaviridae)。
有時,一負-向ssRNA病毒是來自下列科:玻那病毒科(Bornaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、棒狀病毒科(Rhabdoviridae)、Nyamiviridae、沙狀病毒科(Arenaviridae)、崩芽病毒科(Bunyaviridae)、蛇形病毒科(Ophioviridae),以及正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。
示範性病毒包括,但不限於:阿貝爾森白血病病毒(Abelson leukemia virus)、阿貝爾森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)、阿貝爾森病毒(Abelson’s virus)、急性喉氣管支氣管炎病毒(Acute laryngotracheobronchitis virus)、阿德萊德河病毒(Adelaide River virus)、腺關聯性病毒群(Adeno associated virus group)、腺病毒(Adenovirus)、非洲馬疫病毒(African horse sickness virus)、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus)、AIDS病毒(AIDS virus)、阿留申水貂病小病毒(Aleutian mink disease parvovirus)、α反轉錄病毒屬(Alpharetrovirus)、α病毒(Alphavirus)、與ALV有關的病毒(ALV related virus)、阿馬帕里病毒(Amapari virus)、口蹄疫病毒(Aphthovirus)、水產呼腸孤病毒(Aquareovirus)、節肢足動物攜帶性病毒(Arbovirus)、節肢足動物攜帶性病毒C型(Arbovirus C)、節肢足動物攜帶性病毒A群(arbovirus group A)、節肢足動物攜帶性病毒B群(arbovirus group B)、沙狀病毒群(Arenavirus group)、阿根廷出血熱病毒(Argentine hemorrhagic fever virus)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)、星狀病毒屬(Astrovirus)、侏猴疱疹病毒群(Ateline herpesvirus group)、假性狂犬病病毒(Aujeszky’s disease virus)、奧拉病毒(Aura virus)、奧斯達科病病毒(Ausduk disease virus)、澳洲蝙蝠狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus)、禽類腺病毒(Aviadenovirus)、禽紅血球母細胞增多症病毒(avian erythroblastosis virus)、禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)、禽白血病病毒(avian leukemia virus)、禽白血病病毒(avian leukosis virus)、禽淋巴瘤病病毒(avian lymphomatosis virus)、禽成髓細胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus)、禽副黏液病毒(avian paramyxovirus)、禽肺腦炎病毒(avian pneumoencephalitis virus)、禽網狀內皮症病毒(avian reticuloendotheliosis virus)、禽肉瘤病毒(avian sarcoma virus)、禽C型反轉錄病毒群(avian type C retrovirus group)、禽肝病毒屬(Avihepadnavirus)、禽痘病毒(Avipoxvirus)、B病毒、B19病毒、巴班吉病毒(Babanki virus)、狒狒疱疹病毒(baboon herpesvirus)、桿狀病毒(baculovirus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus)、貝巴魯病毒(Bebaru virus)、貝里馬病毒(Berrimah virus)、β反轉錄病毒屬(Betaretrovirus)、雙核糖核酸病毒(Birnavirus)、比得納病毒(Bittner virus)、BK病毒、黑港渠病毒(Black Creek Canal virus)、藍舌病毒(bluetongue virus)、玻利維亞出血熱病毒(Bolivian hemorrhagic fever virus)、博爾納病病毒(Boma disease virus)、綿羊邊界病病毒(border disease of sheep virus)、博爾納病毒(borna virus)、牛α疱疹病毒1型(bovine alphaherpesvirus 1)、牛α疱疹病毒2型(bovine alphaherpesvirus 2)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus)、牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus)、牛免疫缺乏病毒(bovine immunodeficiency virus)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus)、牛白血病病毒(bovine leukosis 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virus)、絨毛猴肉瘤病毒(woolly monkey sarcoma virus)、傷瘤病毒(wound tumor virus)、WRSV病毒(WRSV virus)、雅巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、尤巴病毒(Yaba virus)、亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)、黃熱病病毒(yellow fever virus),以及尤波病毒(Yug Bogdanovac virus)。
在某些具體例中,一病毒的感染誘導一肝-關聯性疾病或障礙。在某些具體例中,該病毒的感染是一肝炎感染。在某些具體例中,該病毒是一A型肝炎病毒、一B型肝炎病毒、一C型肝炎病毒、一D型肝炎病毒,一E型肝炎病毒、一F型肝炎病毒,或者一G型肝炎病毒。在某些具體例中,一誘導一肝-關聯性疾病或障礙的病毒的感染是由一A型肝炎病毒、一B型肝炎病毒、一C型肝炎病毒、一D型肝炎病毒、一E型肝炎病毒、一F型肝炎病毒,或者一G型肝炎病毒所造成。
在某些具體例中,肝損傷起因於在肝臟內一對於病毒的免疫反應的結果。在某些例子中,肝損傷起因於一部分的全身性宿主感染,其中病毒標靶除了肝臟以外的組織。那些主要標的不是肝臟的示範性病毒包括疱疹病毒,諸如艾司坦氏-巴爾氏病毒、細胞巨大病毒(CMV)或單純疱疹病毒;小病毒;腺病毒;流感病毒;慢病毒,諸如人類免疫缺乏病毒;以及嚴重急性呼吸道症候群(SARS)-關聯性冠狀病毒。在某些例子中,此處所描述的病毒的感染致使肝炎。
在某些具體例中,病原體是一細菌。在某些具體例中,一細菌的感染誘導肝-關聯性疾病或障礙。細菌的實例包括:幽門螺旋桿菌(Helicobacter pyloris )、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi )、退伍軍人嗜肺病菌(Legionella pneumophila )、分枝桿菌屬物種(Mycobacteria spp.)[例如,結核分枝桿菌(M. tuberculosis )、鳥分枝桿菌(M. avium ) 細胞內分枝桿菌(M. intracellulare )、肯薩伊分枝桿菌(M. kansasii )、戈登分枝桿菌(M. gordonae )]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae )、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides )、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes )、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )[A群鏈球菌(Group AStreptococcus )]、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae )[B群鏈球菌(Group BStreptococcus )]、鏈球菌屬(Streptococcus )[草綠色鏈球菌群(viridans group)]、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis )、牛鏈球菌(Streptococcus bovis )、鏈球菌屬(Streptococcus )[厭氧菌屬物種(anaerobic spp.)]、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia )、病原性曲桿菌屬物種(pathogenicCampylobacter sp.)、腸球菌屬物種(Enterococcus sp.)、嗜血桿菌(Haemophilus influenza )、炭疽桿菌(Bacillus anthracis )、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae )、棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium sp.)、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens )、 破傷風桿菌(Clostridium tetani )、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia )、出血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida) 類桿菌屬物種(Bacteroides sp.)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum) 念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis )、梅毒螺旋體(Treponema pallidum )、細弱螺旋體(Treponema pertenue )、鉤端螺旋體屬(Leptospira )以及以色列放線菌(Actinomyces israelii )。
在某些具體例中,病原體是一真菌。在某些具體例中,一真菌的感染誘導肝-關聯性疾病或障礙。真菌的實例包括:新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )、莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum )、粗球孢子菌(Coccidioides immitis )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis )、白色念珠菌(Candida albicans )。其他傳染性生物(亦即原生生物)包括:惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum )以及弓蟲(Toxoplasma gondii )。
在某些具體例中,病原體是一寄生蟲。在某些具體例中,一寄生蟲的感染誘導肝-關聯性疾病或障礙。寄生蟲的實例包括:偽足蟲綱(sarcodina)[例如內阿米巴屬(Entamoeba )]、鞭毛蟲綱(mastigophora)[例如梨形鞭毛蟲屬(Giardia )、利什曼原蟲屬(Leishmania )]、纖毛蟲動物門(ciliophora)[例如纖毛蟲屬(Balantidium )]以及孢子蟲綱(sporozoa)[例如瘧原蟲屬(Plasmodium )、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium )]。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於一缺損肝臟的再生。在某些例子中,經誘導的肝細胞在肝損傷的位址之處被引入。在某些例子中,經誘導的肝細胞作為一細胞懸浮液而被引入或被移植至肝損傷的位址之處。在其他例子中,經誘導的肝細胞作為一組織團塊而被引入或被移植至肝損傷的位址之處。在其他例子中,經誘導的肝細胞被使用於一缺損肝臟的活體外再生。在其他例子中,經誘導的肝細胞在移植至一肝損傷的位址之前被使用於活體外肝生成。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被配方為一用於治療一由於外部因子(諸如對宿主的損傷,例如對一個體的損傷)或由於手術所造成的肝損傷的組成物(諸如一藥學組成物)。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被配方為一用於治療一由於一肝-關聯性疾病或障礙所造成的肝損傷的組成物(諸如一藥學組成物)。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被配方為一用於治療阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[例如姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣貯積病、酪胺酸血症、病毒性A、B、C型肝炎、威爾森氏症,或者它們的一組合的組成物(諸如一藥學組成物)。
在某些具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物進一步包含有一額外的治療劑。在某些具體例中,該額外的治療劑是一用於治療一肝-關聯性疾病或障礙的治療劑。在某些具體例中,該額外的治療劑包括,但不限於:薑黃素、白藜蘆醇、沙利竇邁、銷膽胺(Questran)、他克莫司(PROGRAF)、熊去氧膽酸(Actigall)、干擾素、利尿劑(諸如環狀利尿劑),以及肝移植。
在某些具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物被使用在肝損傷的位址之處以供肝臟的再生。在某些具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物作為一細胞懸浮液而被引入或被移植至肝損傷的位址之處。在某些具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物作為一組織團塊而被引入或被移植至肝損傷的位址之處。在另一個具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物被使用於一缺損肝臟的活體外再生。在另一個具體例中,包含有經誘導的肝細胞的組成物在移植至一肝損傷的位址之前被使用於活體外肝生成。
一經分離的經誘導的肝細胞的投藥的模式包括,但不限於:全身性靜脈內注射(systemic intravenous injection)以及直接注射至所意欲的活性位址[例如,內視鏡逆行性注射(endoscopic retrograde injection)]。該製劑可藉由任何便利的途徑[例如,藉由滴注(infusion)或巨量注射(bolus injection)]而被投藥,並且可與其它生物活性試劑(biologically active agents)一起被投藥。在某些具體例中,該投藥是全身性定位投藥(systemic localized administration)。
在某些具體例中,一包含有經誘導的肝細胞的組成物被配方為一用於靜脈內投藥至一哺乳動物(包括一人類)的藥學組成物。在某些具體例中,用於靜脈內投藥的組成物是呈無菌的等張水性緩衝液(sterile isotonic aqueous buffer)的溶液。在必要時,該組成物亦包括一局部麻醉劑(local anesthetic)俾以改善在注射的位址之處的任何疼痛。在該組成物要藉由滴注而被投藥時,它可使用一含有無菌的藥學等級水或鹽水的滴注瓶而被配藥。在該組成物要藉由注射而被投藥時,一用於注射的無菌水或鹽水的安瓿(ampoule)可被提供而使得該等成分在投藥之前被混合。
在某些具體例中,適合的藥學組成物包含有一治療有效量(therapeutically effective amount)的經誘導的肝細胞以及一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)或賦形劑(excipient)。此一載劑包括,但不限於:鹽水、緩衝的鹽水、右旋糖、水,以及它們的組合。
在某些具體例中,此處所描述的經誘導的肝細胞是藉由一適合用於將細胞標靶至一特定組織的遞送系統而被遞送至一經標靶的位址(例如,一肝臟的缺損部分)。例如,該等細胞被囊封在一輸送載體(delivery vehicle)中,而允許該(該等)細胞在經標靶的位址之處緩慢的釋出。該輸送載體被修飾而使得它被專一性地標靶至一特定的組織。經標靶的遞送系統的表面以各種不同的方式而被修飾。當是一脂質體-標靶的遞送系統(liposomal-targeted delivery system)時,脂質基團(lipid group)被併入至該脂質體的脂雙層(lipid bilayer)中,俾以維持標靶配位子與脂質體雙層呈穩定的相締合。
在其他實例中,一膠體分散系統(colloidal dispersion system)被使用。膠體分散系統包括巨分子複合體(macromolecule complexes)、奈米膠囊(nanocapsules)、微球體(microspheres)、珠粒(beads),以及以脂質為基礎的系統(lipid-based systems)[包括水包油乳化液(oil-in-water emulsions)、微胞(micelles)、經混合的微胞(mixed micelles)以及脂質體]。
此處所描述的經誘導的肝細胞的投藥是藉由下列方式而選擇性地針對一個體來量身訂作:(1)增加或減少被注射的細胞數量;(2)改變注射的數量;或(3)改變該等細胞的遞送方法。
該經誘導的肝細胞製劑是呈一有效於促進在接受者中的細胞植入的數量而被使用。在醫師的裁量下,投藥被調整至滿足最佳的效力以及藥理給藥(pharmacological dosing)。用於產生治療性蛋白質的經誘導的肝細胞
在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生治療性蛋白質(例如激素)、細胞激素、膽固醇、碳水化合物、膽汁或它們的一組合。在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生治療性蛋白質。在某些例子中,治療性蛋白質包括全長蛋白質、它的領域或片段,或者胜肽。在某些例子中,該等蛋白質、它們的領域或片段,或者胜肽含有天然的和/或非天然的胺基酸殘基。在某些例子中,該等治療性蛋白質、它們的片段,或者胜肽包括,但不限於:主要的血漿蛋白質(諸如人類血清白蛋白、可溶性血漿纖維連接蛋白、α-胎兒蛋白、C-反應性蛋白質以及數種球蛋白)、涉及止血以及纖維蛋白分解的蛋白質(諸如涉及凝固級聯的凝固因子、α2-大球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、蛋白質S、蛋白質C、胞漿素原、α2-抗胞漿素以及補體組分3)、載體蛋白質(諸如白蛋白、銅藍血漿蛋白、運皮素蛋白、肝球蛋白、凝血酵素、IGF結合的蛋白質、主要的尿蛋白、視黃醇結合的蛋白、性激素-結合的球蛋白、轉甲蛋白、運鐵蛋白以及維生素D-結合的蛋白質)、激素(諸如似胰島素生長因子1、血小板生成素、鐵調節素以及β滋養因子)、前激素(諸如血管收縮素原),以及缺脂脂蛋白。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生激素或它的片段。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生似胰島素生長因子1、血小板生成素、鐵調節素、β滋養因子、血管收縮素原,或者它們的片段。
在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生細胞激素。如此處在別處所描述的,細胞激素包括趨化激素、干擾素、介白素以及腫瘤壞死因子。在某些具體例中,細胞激素是前-發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)。在某些具體例中,該等細胞激素包括C-X-C以及C-C亞家族的趨化激素:CCL1、CCL2 (MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5 (RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9 (或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16以及CXCL17。在某些具體例中,該等細胞激素包括與生長有關的(GRO)-α、GRO-β、GRO-γ、上皮嗜中性球活化肽-78 [epithelial neutrophile activating peptide-78 (ENA-78)]、RANTES、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF、IFN-α、IFN-β以及細胞激素-誘導的嗜中性白血球趨化劑[cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)]。在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生此處所描述的一或多種細胞激素。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生細胞激素,包括,但不限於:CCL1、CCL2 (MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5 (RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9 (或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、與生長有關的(GRO)-α、GRO-β、GRO-γ、上皮嗜中性球活化肽-78 (ENA-78)、RANTES、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、M-CSF、IFN-α、IFN-β以及細胞激素-誘導的嗜中性白血球趨化劑(CINC)。
在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生或製造膽固醇。如此處所使用的,術語“膽固醇(cholesterol)”包括膽固醇、它的立體異構物(例如nat -膽固醇或ent -膽固醇)、天然存在的膽固醇、經基因改造的膽固醇,或者它們的片段。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生或製造nat -膽固醇或它的片段。在某些具體例中,經誘導的肝細胞被使用於產生或製造ent -膽固醇或它的片段。
在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生或製造碳水化合物。在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於碳水化合物的形成、分解或相互轉變、糖質新生、肝醣分解、肝醣生成、脂質代謝(lipid metabolism)(包括如上面所揭示的膽固醇合成以及脂質生成)。
在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於產生膽汁。
如此處所使用的,一胺基酸殘基可以意指一含有一胺基基團(amino group)以及一羧基基團(carboxyl group)的分子。適合的胺基酸包括,但不限於:天然-存在的胺基酸(naturally-occurring amino acids)的D-與L-異構物這兩者,以及藉由其他代謝途徑而被製備的非-天然存在的胺基酸(non-naturally occurring amino acids)。如此處所使用的,術語胺基酸(amino acid)包括,但不限於:α-胺基酸、天然的胺基酸、非-天然的胺基酸以及胺基酸類似物。
術語“α-胺基酸(α-amino acid)”可意指一被結合至一碳(它被命名為α-碳)之含有一胺基基團以及一羧基基團的分子。
術語“β-胺基酸(β-amino acid)”可意指一呈一β組態(configuration)之含有一胺基基團以及一羧基基團的分子。
“天然存在的胺基酸(Naturally occurring amino acid)”可意指在自然界中所合成的胜肽中常被發現到的以及藉由一個字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y以及V而被知曉的20個胺基酸的任一者。
術語“胺基酸類似物(amino acid analog)”意指一結構上相似於一胺基酸以及可在一肽模擬物大環(peptidomimetic macrocycle)的形成中針對一胺基酸而被替代的分子。胺基酸類似物包括,但不限於:β-胺基酸以及胺基或羧基基團是藉由一相似地反應基團而被替代(例如,以一個二級或三級胺替代一級胺,或者以一酯替代羧基基團)的胺基酸。
術語“非-天然的胺基酸(non-natural amino acid)”意指一不是在自然界中所合成的胜肽中常被發現到的以及藉由一個字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y以及V而被知曉的20個胺基酸的一者之胺基酸。非-天然的胺基酸包括,但不限於:對乙醯苯丙胺酸(p-acetylphenylalanine)、間乙醯苯丙胺酸(m-acetylphenylalanine)、對(3-側氧丁醯基)-l-苯丙胺酸[p-(3-oxobutanoyl)-l-phenylalanine]、對(2-胺基-3-羥乙基)苯丙胺酸[p-(2-amino-3-hydroxyethyl)phenylalanine]、對異丙基硫羰基-苯丙胺酸[p-isopropylthiocarbonyl-phenylalanine]、對乙基硫羰基-苯丙胺酸[p-ethylthiocarbonyl-phenylalanine]、鄰炔丙氧基苯丙胺酸[o-propargyloxyphenylalanine]、對疊氮基苯丙胺酸[p-azidophehylalanine]、phenylselenidylalanine、對苯甲醯基-l-苯丙胺酸[p-benzoyl-l-phenylalanine]或對硼苯丙胺酸[p-boronophenylalanine]。用於肝再生的經誘導的肝細胞
在另一個具體例中,經誘導的肝細胞被使用於肝再生。在另一個具體例中,經誘導的肝細胞被使用於活體外肝再生。在某些例子中,該活體外肝再生使用一活體外灌注系統(ex vivo perfusion system)。在某些例子中,該活體外灌注系統包括活體外灌注生物反應器系統(ex vivo perfusion bioreactor system)(例如一3D灌注生物反應器系統)。在某些例子中,該活體外肝再生使用一生物印刷系統(bioprinting system)。在某些例子中,該生物印刷系統是一種3維(3D)生物印刷系統。在某些例子中,該活體外肝再生使用一種3D生物印刷系統。在某些具體例中,一種3D生物印刷系統包括Organovo’s NovoGEn MMX Bioprinter、EnvisionTEC’s BioPlotter® 、GeSims BioScaffolder 2.1或regenHu’s BioFactory® 。在某些具體例中,一種3D生物印刷系統包括來自於OxSyBio的3D印刷技術。
在某些具體例中,一種3D生物印刷系統包括下面所描述的系統:US8691974、US8691274、US20140052285、US20140012407、US20140099709、US20140093932、US20130304233、US20130004469、US20130017564、US20130164339、US20120089238、US20110250688、US20090208466、EP2679669、WO2014039427、WO2013181375、WO2013040087以及WO2012122105。
在某些具體例中,經誘導的肝細胞是使用一灌注系統(例如一活體外灌注系統)而被使用於肝再生。在某些具體例中,經誘導的肝細胞是使用一活體外灌注生物反應器系統(例如一種3D灌注生物反應器系統)而被使用於肝再生。在某些例子中,經誘導的肝細胞是使用一生物印刷系統(例如一種3D生物印刷系統)而被使用於肝再生。在某些例子中,經誘導的肝細胞是使用Organovo’s NovoGEn MMX Bioprinter、EnvisionTEC’s BioPlotter® 、GeSims BioScaffolder 2.1或regenHu’s BioFactory® 而被使用於肝再生。在某些例子中,經誘導的肝細胞是使用來自於OxSyBio的3D印刷技術而被使用於肝再生。
在某些例子中,經誘導的肝細胞是使用一下面所描述的3D生物印刷系統而被使用於肝再生:US8691974、US8691274、US20140052285、US20140012407、US20140099709、US20140093932、US20130304233、US20130004469、US20130017564、US20130164339、US20120089238、US20110250688、US20090208466、EP2679669、WO2014039427、WO2013181375、WO2013040087或WO2012122105。
在某些例子中,經誘導的肝細胞經由上面所描述的一或多種方法而被使用於組織支架的生成。在某些例子中,該組織支架是一種2維(2D)組織支架或一種3維(3D)組織支架。在某些例子中,該組織支架是一種3D組織支架。在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用於3D組織支架的生成。在某些具體例中,該3D-支架被預-塗覆以一或多種細胞外基質組分(extracellular matrix components),例如:明膠(gelatin)、黏蛋白(laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、膠原蛋白(collagen)、聚離胺酸(polylysine)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)、透明質酸(hyaluronic acid)、玻尿酸水凝膠(hyaluronan hydrogels)、蠶絲纖維蛋白(silk fibroin)、幾丁聚醣(chitosan)或前述的任何一複合物。在某些具體例中,該等細胞以相較於2D培養物更高的密度(諸如高於3倍或高於5倍或高於10倍)被接種在3D支架上。在某些具體例中,該等細胞是在細胞存活因子(諸如一ROCK Rho激酶的抑制劑)的存在下被接種。
在某些方面,一生物可相容的基質被用來生成此處的組織,例如,將細胞在一種3維生物可相容的基質上在一培養基下進行培養。在某些具體例中,該生物可相容的基質包含有一聚合基質。在某些具體例中,該生物可相容的基質是生物可降解的。在某些具體例中,該聚合基質包含有聚(己內酯)[poly(caprolactone) (PCL)]。在某些具體例中,該聚合基質是選自於下列所構成的群組:聚乳酸(polylactic acid, PLA)、聚-L-乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)、聚-D-乳酸(poly-D-lactic acid, PDLA)、聚乙交酯(polyglycolide)、聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)、乳酸交酯-乙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)、聚二氧六環酮(polydioxanone)、聚葡萄糖酸鹽(polygluconate)、聚乳酸-聚氧化乙烯共聚物(polylactic acid-polyethylene oxide copolymers)、修飾纖維素(modified cellulose)、膠原蛋白(collagen)、聚羥丁酸酯(polyhydroxybutyrate)、聚羥丙酸(polyhydroxypropionic acid)、聚磷酸酯(polyphosphoester)、聚(α-羥基酸)[poly(alpha-hydroxy acid)]、聚碳酸酯(polycarbonates)、聚醯胺(polyamides)、多元酸酐(polyanhydrides)、聚胺基酸(polyamino acids)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚縮醛(polyacetals)、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylates)、可降解的胺基甲酸酯(degradable urethanes)、脂族聚酯聚丙烯酸酯(aliphatic polyester polyacrylates)、聚丙烯酸甲酯(polymethacrylate)、醯基取代的乙酸纖維素(acyl substituted cellulose acetates)、不可降解的聚胺甲酸酯(non-degradable polyurethanes)、聚苯乙烯(polystyrenes)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride)、聚氟乙烯(polyvinyl fluoride)、聚乙烯咪唑(polyvinyl imidazole)、氯磺化聚烯(chlorosulphonated polyolefins)、聚氧化乙烯(polyethylene oxide)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、鐵氟龍RTM (teflon RTM)、尼龍矽(nylon silicon)、聚(苯乙烯-嵌段-丁二烯)[poly(styrene-block-butadiene)]、聚降烯(polynorbornene)、水凝膠(hydrogels)、金屬合金(metallic alloys)以及寡(ε-己內酯)二醇[oligo(ε-caprolactone)diol]。在某些具體例中,該生物可相容的基質包含有一合成聚合物。依據本發明中的某些具體例,該生物可相容的基質包含有一天然聚合物。在某些具體例中,該生物可降解的基質是選自於下列所構成的群組:聚(己內酯)(PCL)、聚乙醇酸、(DL-聚乳酸-乙醇酸共聚物)[poly(DL-lactic-coglycolic acid)]、腸線縫合線(cat gut sutures)、棉花(cotton)、纖維素、明膠、葡聚糖(dextran)、藻酸鹽(alginate)、纖維連接蛋白、黏蛋白、膠原蛋白、透明質酸、聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)、聚4羥丁酸酯(poly 4 hydroxybutyrate, P4HB)以及聚葡萄糖酸(polygluconic acid, PGA)。經誘導的肝細胞作為一用於基因治療的來源
在額外的具體例中,經誘導的肝細胞被使用作為一用於基因治療的來源。在某些例子中,該基因治療是一活體外基因治療。在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用作為一用於一肝-關聯性疾病或障礙的基因治療療法的治療劑。在某些例子中,該基因治療療法是一以經誘導的肝細胞為基礎的基因治療。在某些例子中,該以經誘導的肝細胞為基礎的基因治療被使用,諸如,例如:替代缺陷的或遺漏的基因產物、預防異體移植物(allograft)排斥、重建宿主肝臟、有助於生成異種的(xenogeneic)肝細胞,或者量身訂作病患-專一性肝治療或再生。
如此處在別處所描述的,一肝-關聯性疾病或障礙包括阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[例如姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣貯積病、酪胺酸血症、病毒性A、B、C型肝炎,以及威爾森氏症。
在某些例子中,經誘導的肝細胞被使用作為一用於阿拉吉歐症候群、α1抗-胰蛋白酶缺乏症、自體免疫肝炎、良性肝腫瘤、膽道閉鎖、硬化、肝臟囊腫病、脂肪肝疾病[包括與酒精有關的肝疾病以及非-酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)]、半乳糖血症、膽石、捷倍耳氏症候群、血色素沉著症、肝臟囊腫、肝癌、姙娠肝疾病[例如姙娠急性脂肪肝、姙娠肝內膽汁滯留症、子癎前症或HELLP症候群(溶血、升高的肝指數、低血小板)]、新生兒肝炎、原發型膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、吡咯紫質沉著病、雷氏症候群、類肉瘤病、毒性肝炎、第1型肝醣蓄積病、酪胺酸血症、病毒性A、B、C型肝炎、威爾森氏症,或者它們的一組合的基因治療療法的治療劑。
在某些例子中,基因是經由病毒的或非病毒的方法被轉移至經誘導的肝細胞中。在某些例子中,病毒的方法包括載體,諸如來自於鼠白血病反轉錄病毒(murine leukemia retroviruses)與慢病毒、腺關聯性病毒(adenoassociated virus)、T-抗原-刪除的SV40病毒(T-antigen-deleted SV40 virus)、親神經性病毒(諸如單純疱疹病毒)、游離基因態病毒(episomal viruses)以及混種病毒(hybrid viruses)(諸如腺關聯性病毒)。在某些例子中,非病毒的方法包括脂複合體(lipoplexes)、聚複合體(polyplexes)、樹枝狀聚合物(dendrimers)、無機奈米粒子(inorganic nanoparticles)或嵌合載體[諸如病毒顆粒(virosomes),它是一脂質體與一不活化病毒(諸如HIV或流感病毒)的組合]。在某些例子中,額外的非病毒的方法包括裸露DNA的注射、電穿孔(electroporation)、基因槍(gene gun)、聲孔作用(sonoporation)或磁性轉染(magnetofection)。藉由病毒的或非病毒的方法之基因轉移的方法是在此技藝中所熟知的並且被描述於,例如:在Guhaet al . “Hepatocyte-based gene therapy,”J Hepatobillary Pancreat Surg . 8(1):51-57 (2001)中。
如此處所使用的,一基因可含有至少兩個被連結在一起的核苷酸。在某些例子中,一此處所描述的核酸可含有磷酸二酯鍵(phosphodiester bonds)、天然的核酸或非天然的核酸。一天然的核酸包括去氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)這兩者並且藉由一個字母縮寫A、T、G、C,以及U而被知曉。示範性非天然的核酸包括,但不限於:二胺基嘌呤(diaminopurine)、異鳥嘌呤(isoguanine)、異胞嘧啶(isocytosine)、2-胺基-6-(2-噻吩基)嘌呤[2-amino-6-(2-thienyl)purine]、吡咯-2-甲醛(pyrrole-2-carbaldehyde)、2,6-雙(乙硫基甲基)吡啶[2,6-bis(ethylthiomethyl)pyridine]、吡啶-2,6-羰醯胺(pyridine-2,6-dicarboxamide)、4-甲基苯并咪唑(4-methylbenzimidazole)、2,3-二氟甲苯(2,3-difluorotoluene)、d5SICS以及dNaM。診斷方法
用於測定上述所描述的生物標記的表現或存在的方法在本技藝中是被熟知的,並且可以藉由例如流動式細胞測量術(flow cytometry)、免疫組織化學(immunohistochemistry)、西方墨點法(Western Blot)、免疫沉澱法(immunoprecipitation)、磁珠篩選法(magnetic bead selection)以及表現這些細胞表面標記的任一者之細胞的定量而被測量。生物標記RNA表現位準可以藉由RT-PCR、Qt-PCR、微陣列(microarray)、北方墨點法(Northern blot),或其他相似的技術而被測量。
藉由“偵測表現(detecting expression)”或偵測“表現位準(expression levels)”被意欲用於測定在生物樣品中的一生物標記蛋白質或基因的表現位準或存在。因此,“偵測表現”包括其中一生物標記被測定不會被表現、不會被可偵測地表現、呈一低位準而被表現、呈一正常位準而被表現,或被過度表現的例子。
在某些具體例中,此處所描述的一生物標記的表現或存在是在一核酸位準下被測定,使用例如免疫組織化學技術或以核酸為基礎的技術[諸如原位雜交法(in situ hybridization)以及RT-PCR]。在一個具體例中,一或多種生物標記的表現或存在是藉由一用於核酸擴增的方法、一用於核酸定序的方法、一利用一核酸微陣列(DNA以及RNA)的方法,或一使用專一性標定的探針之用於原位雜交法的方法而被執行。
在另一個具體例中,一生物標記的表現或存在的測定是經由膠體電泳(gel electrophoresis)而被執行。在一個具體例中,該測定是經由轉移至一膜以及雜交以一專一性探針而被執行。
在另一個具體例中,一生物標記的表現或存在的測定是藉由一診斷成像技術(diagnostic imaging technique)而被執行。
在又另一個具體例中,一生物標記的表現或存在的測定是藉由一可偵測的固體受質而被執行。在一個具體例中,該可偵測的固體受質是以抗體予以功能化的順磁性奈米粒子(paramagnetic nanoparticles)。
在某些具體例中,一生物標記的表現或存在是呈一RNA (例如mRNA)位準。在某些具體例中,偵測RNA (例如mRNA)位準的技術包括,但不限於:南方或北方墨點分析法、聚合酶鏈反應分析以及探針陣列(probe arrays)。
一用於偵測mRNA位準的方法涉及將經分離的mRNA與一雜交至由要被偵測的基因所編碼的mRNA的核酸分子(探針)接觸。該核酸探針包含,例如:一全-長cDNA或它的一部分,諸如一長度至少為7、15、30、50、100、250或500核苷酸的寡核苷酸以及足以在嚴格的條件下專一性地雜交至一mRNA或編碼一此處所描述的生物標記的基因組DNA。一mRNA與該探針的雜交顯示出該生物標記或其他感興趣的標的蛋白質要被表現。
在一個具體例中,mRNA被固定在一固體表面上並且被接觸以一探針,例如藉由將經分離的mRNA在一瓊脂糖凝膠上進行以及將該mRNA從該凝膠轉移至一膜[諸如硝化纖維素(nitrocellulose)]。在一另擇的具體例中,例如,於一基因晶片陣列(gene chip array)中,該(該等)探針被固定在一固體表面上以及該mRNA被接觸以該(該等)探針。一熟習此技藝者容易適應供用於偵測編碼生物標記或其他感興趣的蛋白質的mRNA位準的已知mRNA偵測方法。
一用於測定一樣品中之一感興趣的mRNA的位準的另擇方法涉及核酸擴增的方法,例如,藉由RT-PCR (參見,例如U.S. Pat. No. 4,683,202)、連接酶鏈反應(ligase chain reaction)(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189 193)、自主序列複製(self-sustained sequence replication)(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、轉錄擴增系統(transcriptional amplification system)(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-Beta複製酶(Q-Beta Replicase)(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)、滾環式複製(rolling circle replication)(U.S. Pat. No. 5,854,033)或任何其他核酸擴增方法,繼而使用那些熟習此技藝者所詳知的技術來偵測該等經擴增的分子。如果該等分子是以非常低的數量存在,這些偵測途徑特別可應用於偵測核酸分子。在某些具體例中,生物標記表現是藉由定量螢光RT-PCR (quantitative fluorogenic RT-PCR)(亦即TaqMan0系統)而被評估。
一感興趣的RNA的表現位準是使用一膜墨點(membrane blot)[諸如在雜交分析(諸如北方、點以及類似者)中被使用]或微井、樣品管、凝膠、珠粒或纖維(或任何包含有被結合的核酸的固態載體)而被監測。參見U.S. Pat. Nos. 5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195以及5,445,934,它們在此被併入本案以作為參考資料。表現的偵測亦包含使用在溶液中的核酸探針。
在某些具體例中,微陣列被用來測定一或多種生物標記的表現或存在。核酸微陣列提供一用於同時測量大量基因的表現位準的方法。各個陣列是由一種再現性的捕捉探針(附接於一固態載體)型態所組成。經標定的RNA或DNA在該陣列上被雜交至互補探針並且接著藉由雷射掃描而被偵測。針對在陣列上的各個探針的雜交強度被測定以及被轉換至一表示相對基因表現位準的定量值。參見U.S. Pat. Nos. 6,040,138、5,800,992以及6,020,135、6,033,860以及6,344,316,它們在此被併入本案以作為參考資料。高-密度寡核苷酸陣列(High-density oligonucleotide arrays)特別可應用於偵測針對在一樣品中的大量RNA的基因表現圖譜。
使用機械合成方法來合成這些陣列的技術被描述於例如U.S. Pat. No. 5,384,261中,以它的整體在此被併入本案以作為參考資料。在某些具體例中,一陣列是在一實質上具有任何形狀的表面或甚至一多樣性的表面上被製造。在某些具體例中,一陣列是一平面的陣列表面。在某些具體例中,陣列包括在珠粒上的胜肽或核酸、凝膠、聚合表面、纖維[諸如光纖(fiber optics)]、玻璃或任何其他合適的受質,參見U.S. Pat. Nos. 5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193以及5,800,992,它們各個在此以其整體被併入以供所有目的。在某些具體例中,陣列以一種能夠供用於一總括式裝置(all-inclusive device)的診斷或其他操作的方式而被包裝。
在某些具體例中,此處所描述的一生物標記的表現或存在是呈一蛋白質位準而被測定,使用例如針對對抗專一性生物標記蛋白質的抗體。這些抗體被使用於各種不同的方法,諸如西方墨點法、ELISA、多工技術、免疫沉澱法或免疫組織化學技術。在某些具體例中,生物標記的偵測是藉由ELISA而被完成。在某些具體例中,生物標記的偵測是藉由電致化學發光[electrochemiluminescence (ECL)]而被完成。
用於專一性鑑定以及定量一在生物樣品中的生物標記的任何方法是被預期的。因此,在某些具體例中,在一生物樣品中的一感興趣的生物標記蛋白質的表現位準是藉由一能夠與該生物標記蛋白質或它的一生物活性變異體專一性地交互作用的結合蛋白而被偵測。在某些具體例中,經標定的抗體、它的結合部分,或其他結合夥伴被使用。當此處的術語“標記(label)”被使用時意指一被直接地或間接地綴合至該抗體俾以生成一“經標定的(labeled)”抗體之可偵測的化合物或組成物。在某些具體例中,該標記是它本身(例如,放射性同位素標記或螢光標記)可偵測的,或者當是一酵素標記時,催化一可偵測的受質化合物或組成物的化學改變。
用於偵測一生物標記蛋白質的抗體在來源上是單株或多株的,或者是被合成地或重組地產生。複合蛋白質的數量[例如,被聯結以結合蛋白質(例如,一專一性地結合至生物標記蛋白質的抗體)的生物標記蛋白質的數量]是使用那些熟習此技藝者所知曉的標準蛋白質偵測方法學而被測定。一免疫學的分析設計、理論以及操作程序的詳細的回顧在本技藝的許多教科書中被發現(參見,例如,Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY);Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.))。
被用來標定該等抗體的標記的選擇將端視於應用而變化。然而,該標記的選擇對熟習此技藝者是容易可決定的。這些經標定的抗體被使用於免疫分析法以及組織學應用中俾以偵測任何感興趣的生物標記或蛋白質的存在。該等經標定的抗體是多株的或者是單株的。此外,供用於偵測一感興趣的蛋白質的抗體被標記以一放射性原子、一酵素、一發色或螢光部分,或者如本案別處所描述的一比色標籤。標籤標記的選擇亦將端視於所欲的偵測限制。酵素分析(ELISAs)通常允許一藉由酵素-標籤的複合物與一酵素受質的交互作用所形成的有色產物的偵測。作用為可偵測的標記的放射核種(Radionuclides)包括,例如:1-131、1-123、1-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212以及Pd-109。作用為可偵測的標記的酵素的實施例包括,但不限於:辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase),以及葡萄糖-6-磷酸去氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)。發色部分包括,但不限於:螢光素(fluorescein)以及玫瑰紅(rhodamine)。該等抗體是藉由本技藝中所知曉的方法而被綴合至這些標記。例如,酵素以及發色分子是藉由偶合劑[諸如二醛類(dialdehydes)、碳化二亞胺(carbodiimides)、二順丁烯二醯亞胺(dimaleimides)以及類似者]而被綴合至該等抗體。另擇地,綴合經由一配位子-受體配對而發生。適合的配位子-受體配對的實例是生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)或生物素-鏈黴抗生物素蛋白(biotin-streptavidin),以及抗體-抗原(antibody-antigen)。
在特定的具體例中,在一生物樣品中的一或多種生物標記或其它感興趣的蛋白質的表現或存在是藉由放射免疫分析法(radioimmunoassays)或酵素-結合免疫分析法(ELISAs)、競爭性結合酵素-結合免疫分析法、點墨點法(dot blot)(參見,例如:Promega Protocols and Applications Guide, Promega Corporation (1991))、西方墨點法(參見,例如:Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vol. 3, Chapter 18 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.))、層析法(chromatography)[諸如高效能液相層析(HPLC)],或者其它本技藝中所知曉的分析而被測定。因此,該等偵測分析涉及步驟諸如,但不限於:免疫墨點法(immunoblotting)、免疫擴散法(immunodiffusion)、免疫電泳法(immunoelectrophoresis)或免疫沉澱法。套組 / 製造的物品
在特定的具體例中,此處所揭示的是供用於此處所描述的一或多種方法以及組成物之套組以及製造的物品。該等套組包括一載體、包裝或容器[它被劃分以容納一或多個容器(諸如小瓶、小管以及類似者),各個容器包含有要被使用於此處所描述的一方法中之分開的元件的一者]。適合的容器包括,例如:瓶、小瓶、注射器以及試管。在一個具體例中,該等容器是由各種不同的材料(諸如玻璃或塑膠)所形成。
此處所提供的製造的物品含有包裝材料。藥學包裝材料的實例包括,但不限於:氣泡包裝、瓶、小管、袋、容器、瓶,以及任何適用於一選擇的配方以及使用的意欲模式的包裝材料。
例如,該等容器包括選擇性地配於一如此處所揭示的組成物中的hTS細胞。該等套組選擇性地包括與此處所描述的方法中的用途有關的一鑑定說明或標籤或操作指南。
典型地,一套組包括列示出內含物和/或供使用之操作指南的標籤,以及具有供使用之操作指南的仿單(package inserts)。典型地,一組操作指南亦將被包括在內。
在某些具體例中,一標籤是在容器上或與其相締合。在一個具體例中,當字母、數字或其它形成該標籤的字元被附著、鑄模或蝕刻到容器本身時,一標籤是在一容器上;一標籤是與一容器相締合的,當它是在一亦可容納該容器的容座(receptacle)或載體中而存在時,例如,作為一仿單。在一個具體例中,一標籤被用來指明該等內含物是要被使用於一特定的治療應用。該標籤亦指明關於諸如在此處所描述的方法中的內含物之使用的指引。
實施例
這些實施例僅被提供用於例示的目的並且不限制此處所提供的申請專利範圍的範疇。實施例 1 細胞培養與分化 (Cell Culture and Differentiation)
未經分化的hTS細胞被維持在補充有10% (v/v)胎牛血清(fetal bovine serum)(SAFC Biosciences)的α-MEM (Gibco)中。培養物手動地於一每2至3天1:3至1:6分裂比下被傳代培養。DE的分化是藉由一含有10% FBS、1 mM 2-巰乙醇(2-mercaptoethanol)、10 mM菸鹼醯胺(nicotinamide)以及10 ng/mL bFGF的條件α-MEM培養基而於37℃、5% CO2 培養箱中被執行歷時8小時。針對肝細胞(hepatocytic)分化,培養基被添加以地塞松(0.1 μM, Sigma)以及重組型人類抑瘤素M (10 ng/mL, Excel-Biomedical Inc)並且被培育歷時一額外的4天或6天。
此研究是由高雄醫學大學附設中和紀念醫院的人體研究以及倫理委員會的機構審查委員會(Institutional Review Board on Human Subjects Research and Ethics Committees, Kaohsiung Medical University Hospital)所認可。該等hTS細胞是於經告知的同意(informed consent)下被獲得。質體 (Plasmids)
MiR-124a前驅物以及抗-miR-124a是購自於System Biosciences。簡言之,miR-124a前驅物(60 pmol)或抗-miR-124a (60 pmol)是使用TransIT-LT1轉染試劑(Mirus, Madison, WI)在12-井培養皿中被轉染至hTS細胞。在轉染之後的第36小時之時,總RNAs被使用於定量miR-124a。標靶PI3K (SASI_Hs01_00233971以及SASI_Hs01_00127787)、AKT1 (SASI_Hs01_00205545)以及AKT2 (SASI_Hs01_00035055)的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)是購自於Sigma。標靶CREB1 (TRCN0000007310、TRCN0000226467以及TRCN0000226468)、SMAD4 (TRCN0000010321、TRCN0000010323以及TRCN0000040032)、AKT3 (TRCN0000001615以及TRCN0000001616)、OCT4 (TRCN0000004879以及TRCN0000004882)、CDX2 (TRCN0000013683以及TRCN0000013686)的小髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)以及對照組shRNA (shGFP;TRCN0000072178、TRCN0000072179以及TRCN0000072183)是購自於台灣的中央研究院國家NRAi核心平台(National RNAi Core platform, Academia Sinica, Taiwan)。轉染是使用呈2 μg siRNA或shRNA以及4 μL轉染試劑而被執行。西方墨點法以及免疫沉澱法 [Western Blot and Immunoprecipitation (IP)]
關於免疫墨點分析,細胞被收穫至補充有蛋白酶以及磷酸酶抑制劑(Roche)的RIPA溶解溶液(lysis solution)(Millipore, Billerica, MA)中。在30 μg溶胞產物在聚丙烯醯胺凝膠上的電泳之後,電轉漬至PVDF膜(Millipore)上被執行。在室溫下藉由5%脫脂奶(配於PBS中)而被封阻(1小時)之後,標的蛋白質是藉由使用一次抗體(primary antibody)而被偵測。全部的膜被培育以化學發光劑(chemiluminescent)(Millipore)以及造影是藉由ChemiDoc XRS系統(Bio-RAD)而被拍攝。所使用的抗體被列示於表1中。數據是藉由AlphaEaseFC (version 4.0.0)系統而被分析。關於IP分析,bFGF-處理的hTS細胞的細胞溶胞產物被收集。藉由培育以蛋白質G-瓊脂糖(Millipore)歷時30分鐘,總蛋白質(100 μg)被處理以表1中所列示的專一性一次抗體隔夜。在處理以蛋白質G-瓊脂糖珠粒(2小時)之後,樣品是使用RIPA溶解緩衝液(lysis buffer)(Millipore)而被清洗3次,繼而添加以蛋白質裝填染劑(loading dye)並且被煮沸歷時5分鐘。樣品是藉由8% SDS-PAGE而被解析並且被進行免疫墨點分析。mRNA miRNA 以及染色質免疫沉澱 [chromatin immunoprecipitation (CHiP)]-qPCR 分析
關於mRNA表現,RNA是使用TRIZOL試劑(Invitrogen)與DNAase I on-column分解(Qiagen, Valencia, CA)在三重複或五重複樣品中而從hTS細胞中被分離。總RNA (500 ng)是使用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)而被用於反轉錄。即時聚合酶鏈反應(qPCR)是使用每反應1/40th 的cDNA以及400 nM前向與反向引子而被執行二重複。比較性即時PCR是使用Power SYBR® Master Mix (Applied BioSystems)與7500即時PCR系統(Applied Biosystems)而被執行至少三重複。全部的基因是使用ΔΔCt 方法而被標準化至GAPDH表現以及被標準化至未經分化的hTS細胞的表現。在此研究中所使用的引子序列被例示說明於表2中。
關於miRNA分析,25 ng的總RNA是使用TaqMan微RNA反轉錄套組(Applied Biosystems)而被反轉錄。qPCR是使用TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)與7500即時PCR系統(Applied Biosystems),使用針對miR-124a或RNU6B 的專一性引子(Applied Biosystems)而被執行至少三重複,包括無模板對照組。U6 snRNA (RNU6B; Applied Biosystems)作用作為一內生性對照組(endogenous control)。
關於ChIP分析,在誘導中所指示的時間之hTS細胞樣品是以一最終濃度為1%的福馬林(formaldehyde)予以固定。在室溫下進行培育(10分鐘)之後,該反應是藉由添加甘胺酸(glycine)(125 mM)而被終止。ChIP分析是使用一與ChIP分析套組(Upstate Biotechnology)有關聯的操作程序而被執行。在廣泛的清洗之後,經染色質免疫沉澱的DNA從珠粒中被洗提出並且藉由qPCR而被分析。螢光酵素報導子分析 (Luciferase Reporter assay)
為了製備螢光酵素-3’UTR報導子質體,來自於hTS細胞的基因組DNA萃取物的3’UTR片段被擴增。3’UTR PCR片段是藉由使用Psi I以及Mfe I (Thermo Scientific, Rockford, IL)而被選殖至pGL4.51載體(Promega, Madison, WI)的螢光酵素基因下游中。針對3’UTR報導子建構物的引子被列示如下:針對CDX2 3’UTR區域:前向5’-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3’以及反向5’-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3’。針對SMAD4 3’UTR區域1:前向5’-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3’以及反向5’-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3’。針對SMAD4 3’UTR區域2:前向5’-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3’以及反向5’-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3’。針對GSK3β 3’UTR區域:前向5’-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3’以及反向5’-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3’。
關於雙重螢光酵素分析(dual luciferase assay),螢火蟲螢光酵素報導子(500 ng)或被共-轉染以pGL4.74與水母螢光酵素質體(500 ng, Promega)以及非-專一性對照組miRNA (30 pmol)或miR-124a前驅物(30 pmol;System Biosciences, Mountain View, CA)的沒有任何3’UTR的空的載體是使用TransIT® -LT1轉染試劑(Mirus Bio LLC, Madison, WI)而被共-轉染至hTS細胞(各個井中1.5×104 細胞)。在轉染(36小時)之後,螢光酵素活性是藉由雙重螢光酵素報導子分析系統(Promega)以及Centro LB 960微盤式冷光儀(Centro LB 960 Microplate Luminometer)(Berthold Technologies, Bad Wildbad,德國)而被分析。用於評估,水母螢光酵素值首先被標準化至螢火蟲螢光酵素活性以及各個3’UTR報導子的經計算的活性被進一步標準化至對照載體。數據表示平均值±SD (n=8),p<0.05作為統計學顯著性。在細胞溶解緩衝液中所製備的完整細胞萃取物使用CDX2、SMAD4、GSK3β以及β-肌動蛋白抗體而被進行免疫墨點分析。免疫螢光染色 (Immunofluorescence Staining)
具有細胞培養物的玻片在室溫下在95% (v/v)乙醇中被固定歷時30分鐘,以PBS清洗3次以及被培育以含有0.1% (wt/v) Triton X-100 (Sigma)以及5% (v/v)標準驢血清(Millipore)的封阻緩衝液PBS歷時60分鐘。一次與二次抗體被稀釋於封阻緩衝液中。一次抗體被培育。在4℃下(24小時)或在室溫下(2小時)培育以專一性一次抗體(配於PBS中)之後,適當的螢光素異硫氰酸鹽(FITC, Invitrogen)或Alexa Fluor 488、594以及647 (Invitrogen)或Dylight 488以及594 (BioLegend)綴合的二次抗體在室溫下被添加(1小時)。核在DAPI染色(5分鐘)之後,在室溫下培育以二次抗體(1小時),以及清洗,樣品被固定以50%甘油。影像是藉由共焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)(LSM700; Zeiss Z1或Olympus FluoView 1000共焦雷射掃描顯微鏡)或TissueFAXS系統(TissueQnostics GmbH, Vienna, Austria)而被拍攝。數據是藉由TissueQuest軟體而被分析。流動式細胞測量分析 (Flow Cytometry)
在轉染以非-專一性shRNA或對抗CDX2、OCT4、SOX2以及NANOG的shRNAs之後,細胞(5´106 細胞/mL)被培育以如被列示於表1中的專一性一次抗體歷時30分鐘。繼而在經調整的稀釋下在4℃下培育以適當的螢光染劑-綴合的一次抗體歷時1小時,樣品被清洗以及被重新散浮於PBS中。在通過具有細胞過濾器蓋(BD Falcon)的聚苯乙烯圓底管之後,樣品被進行流動式細胞測量分析(FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA)。數據是使用Cell-Quest軟體(BD Biosciences)而被分析。電子顯微鏡 (Electron Microscopy)
用於穿透電子顯微鏡,hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞(在誘導之後的第4天之時)在室溫(RT)下被固定於含有3% (wt/vol)甲醛、1.5% (wt/vol)戊二醛以及2.5% (wt/vol)蔗糖的0.1 M二甲胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)中歷時1小時或在4℃下隔夜。樣品在4℃下在含有1% (vol/vol) OsO4 的Palade’s固定劑中鋨酸化(osmication)處理(2小時)之前與之後被清洗以0.1 M二甲胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)。在被處理以單寧酸(tannic acid),被染色以1 %醋酸鈾醯(uranyl acetate),以及透過一梯度-系列的乙醇溶液而被脫水之後,樣品被埋入TABB環氧樹脂(TABB epoxy resin)(Agar Scientific Ltd.)中。超薄切片被染色以醋酸鈾醯以及檸檬酸鉛(lead citrate)並且藉由使用JEM-2000 EXII穿透電子顯微鏡(JEOL,東京)而被分析。LDL 攝入分析 (LDL Uptake Assay)
LDL攝入是藉由使用LDL Uptake Cell-Based分析套組(Cayman Chem Co. Ann Arbor, MI)如製造商的操作指南而被執行。簡言之,5x104 細胞被接種在一個24-井培養皿的各個井中的蓋玻片上。hTS細胞(作為對照組)以及經分化的似肝細胞-細胞(hHLCs)是在5 μg/mL LDL-DyLightTM 549探針處理(4小時,37℃)之後被固定並且接著針對LDL受體藉由兔子抗-LDL以及DyLightTM 488-綴合的山羊抗-兔子抗體而被染色。核是以DAPI而被顯影。最終染色是藉由螢光顯微鏡而被觀察。 - -O 試驗 (Oil-Red-O Test)
關於脂質累積(lipid accumulation)的偵測,經分化的細胞在室溫下(RT)被固定以4%三聚甲醛(20分鐘)以及被清洗以60%異丙醇歷時5分鐘。在室溫下與一被新鮮地製備的60%油紅O溶液(0.5 g油紅O配於100 mL異丙醇中,在使用之前通過一個0.22 μm濾膜)(Sigma)培育(20分鐘)之後,細胞以60%異丙醇予以潤洗以及以蘇木精I (Thermo Scientific)予以對比染色以供用於顯微鏡。肝醣貯積測試 (Glycogen Storage Test)
關於肝醣偵測,經分化的細胞是藉由4%三聚甲醛而被固定。經固定的樣品以0.4% Triton X-100予以通透化。未經分化的對照組細胞在37℃下被培育以糖化酶(1 mg/mL配於PBS中;Sigma)歷時1小時。細胞在室溫(RT)下被培育以過碘酸(0.5 g溶解在100 mL蒸餾水中)歷時5分鐘,以蒸餾水予以清洗,並且被培育以被新鮮地配製的希夫試劑(15分鐘)以及被進行顯微術。白蛋白以及尿素分析 (Albumin and Urea Assays)
在hTS 細胞的培養基中的總蛋白質、白蛋白以及尿素的濃度在誘導之前與之後是藉由一自動分析儀(automatic analyzer)(Hitachi 7080;東京,日本)而被測量。統計學分析 (Statistical Analysis )
全部的實驗是呈三重複而被實施並且有如所指示的被重複2次。從西方墨點分析、qPCR、螢光酵素報導子分析(luciferase reporter assay)以及流動式細胞測量分析中所獲得的數據是藉由史徒登氏t-檢定(Student’s t- test)而被計算。p 值<0.05被認為具有統計學顯著性。一種從 hTS 細胞至 DE 譜系的細胞歷程
人類多潛能幹細胞(human pluripotent stem cells)分化成為似肝細胞-細胞,DE形成是在細胞過程的期間需要被鑑定的第一步驟。被發現到的是,藉由免疫螢光顯微術,在hTS細胞中,bFGF (10 ng/mL)能夠在第8小時誘導之時有效地產生DE,表現專一性生物標記;叉頭盒蛋白質A2 (FOXA2)以及SRY-盒17 (SOX17)、Goosecoid (GSC)以及同源區蛋白質MIXL1 (圖1A至1C)。接著,藉由免疫墨點分析,關於bFGF誘導的該等DE-關聯性標記的一時間軸表現被建立,包括轉錄因子:GSC、brachyury (T)、MIXL1、SOX17以及FOXA2 (圖1D)。被發現到的是,MIXL1、Brachyury以及GSC的位準在起始的15分鐘被顯著地升高,這顯示原條的一個轉變。然而,這些位準在30分鐘之後下降,這意味著從原條至一初生中內胚層的一個轉移。特別地,MIXL1位準從波峰(15分鐘)減少至在第4小時之時的一最低點(低於天然者~50%)並且由此之後,該等位準回復到原始者。這個事實是藉由成像研究(圖1C)以及組織FAX分析(TissueFAX analysis)(圖7)而被支持。這些結果顯示,從中內胚層移動到DE階段的細胞歷程是因為:i) MIXL1 mRNA表現在內胚層是缺少的,而是被侷限於中胚層;以及ii)當MIXL1被特異性地表現於原條中時,MIXL1的缺失對於中內胚層祖細胞的內胚層潛能具有一影響。SOX17位準在第2小時之時被向上調控至波峰(1.5-倍)但在第8小時之時被向下調控;然而一被持續地向上調控的FOXA2在第8小時之時至最高位準(3-倍)(圖1D)。然而,從第30分鐘至第1小時有一GSC的向下調控,但仍被維持在一稍微高於原始的位準(圖1D)。為此目的,這些數據顯示bFGF (10 ng/mL)能夠以一極高效率的方式在第8小時誘導之時藉由向上調控SOX17、FOXA2以及GSC,但向下調控MIXL1來誘導hTS細胞轉分化(transdifferentiation)成為DE譜系。自該處,DE產生肺、食道、胃以及腸的上皮內襯(epithelial lining),以及內分泌腺(諸如肝、胰臟以及甲狀腺)。地塞松以及 SOX17 藉由 HNF4 α 表現驅使分化成為肝命運 (Hepatic Fate)
肝細胞核因子4 (HNF4)是一用於人類肝祖細胞的特化之必要的轉錄因子。因為地塞松(Dexa)誘導HNF4α表現以及細胞激素抑瘤素M涉及胎兒的肝臟發育。被發現到的是,在第8小時誘導之時藉由添加地塞松(0.1 μM)以及抑瘤素M (10 ng/mL)至條件培養基中會致使似肝細胞-細胞的分化,在4天之後藉由免疫染色表現肝標記,例如:白蛋白、α-1-胎兒蛋白(AFP)、膽道轉運蛋白MRP2 (ABCC2)以及膽鹽輸出幫浦(BSEP)(圖1E)。
之後,免疫墨點分析在時程上顯示出FOXA2以及SOX17在將近第24小時皆維持在一較高位準,接著在第2天之時一突然的衰微(圖1F)。有趣地,SOX17可直接地活化在內胚層分化期間抑制HNF4α的鋅指蛋白202 (ZFP202)。在DE階段中,在達到尖峰(第2小時)之後一SOX17位準顯著的減少(圖1D),這可能間接地減少在HNF4α上的抑制效用;藉此而促進地塞松-誘導的HNF4α活化。就上述而論,藉由HNF4α表現,一bFGF、地塞松以及SOX17的組合效用戒斷致力於肝特化的內胚層的起始。此外,白蛋白在第12小時之後表現,支持一分化成為肝內胚層譜系(圖1F)。因此,活性HNF4α可控制肝細胞的形態以及功能的分化;藉此,肝母細胞階段的入口可在誘導的第2天發生。在第3天之時,AFP的出現顯示一胎兒未成熟的肝細胞的細胞歷程。有趣地,一β滋養因子的波峰位準出現在第3天,這表示它涉及營養以及脂質代謝的調控。綜上所述,hTS細胞在一周內可被有效地分化成為似肝細胞-細胞,模擬在胚胎形成(embryogenesis)中的初級肝細胞的細胞歷程。事實上,這些發現顯示:有別於在hES細胞以及iPS細胞中之先前被報導的消耗時間的操作程序,此2-步驟攝生法能夠從hTS細胞生成似肝細胞-細胞。miRNA-124a DE 特化中的調控機制
瞭解bFGF如何誘導DE形成的分子機制是必要的並且被需要用於進一步肝分化。bFGF能夠經由它的受體FGFR1來誘導PI3K/AKT/CREB1信號傳遞途徑(圖8A至8D)。因此,CREB1的活化允許我們集中在微RNAs (miRs)(該等小非-編碼RNAs)的參與,由於兩個原因:i) miR-124a能夠調控在胰臟β-細胞(DE-衍生的肝細胞對應體)中的FOXA2,以及ii)結合至CREB1 基因的位址的miR-124在哺乳動物的CREB1 3’UTR中是保守。一般而言,miRs扮演作為涉及各種不同的生物過程(包括藉由抑制轉譯所造成的幹細胞分化和/或去造成RNA降解)之重要的調節子。為此,被發現到的是,藉由ChIP-qPCR分析,活性CREB1能夠標靶在miR-124a mRNA的啟動子的3個位址俾以促進miR-124a表現(圖2A)。此作用是藉由CREB1的弱化(它會減少miR-124a表現)(圖2B),以及藉由qPCR分析之一在表現上的平行關聯性(圖2B)而被支持。同時,這些結果顯示:在DE階段期間,bFGF能夠誘導該PI3K/AKT/CREB1信號傳遞途徑以及依序地,CREB1會在第4小時誘導之時促進miR-124a表現達到尖峰。
值得注意地,在第4小時誘導之時一介於最高的miR-14a以及最低的MIXL1之間的相關表現吸引我們去檢測在它們之間是否有一關係。藉由螢光酵素報導子分析(圖2D)以及免疫墨點分析(圖2E)而被證實的,藉由序列分析以及螢光酵素報導子分析,miR-124a能夠標靶在Smad4信使RNA (mSmad4)的2個位址,致使防止訊息傳遞蛋白質Smad4的產生。一致性地,miR-124的抑制性Smad4造成MIXL1的一抑制,藉由Smad4的弱化而被支持(圖2F)。這些數據解釋在DE階段中MIXL1的向下調控是歸因於bFGF-誘導的miR-124a的活化。此外,miR-124a亦能夠扮演其它角色,例如,藉由螢光酵素報導子分析,它會抑制肝醣合成酶激酶3β (GSK3β) mRNA (圖2G)而抑制GSK3β的產生(圖2E)。此抑制性GSK3β會致使它的下游受質β-連接素(β-catenin)的核轉位(nuclear translocation)。在核中,藉由ChIP-qPCR分析,β-連接素能夠標靶FOXA2 基因的啟動子,俾以產生FOXA2 (圖2H)。為此目的,FOXA2的表現突顯在DE階段的細胞分化。藉由 OCT4 自我 - 更新的特性的維持
另一方面,miR-124a亦能夠標靶CDX2 mRNA (圖2I)以抑制它的轉譯,而減少CDX2 (一多潛能轉錄因子)的產生(圖2E)。這是藉由被共-轉染的miR-124a以及CDX2質體的存在而被支持(圖2I)。然而,抑制性CDX2經由OCT4與CDX2之間的交互抑制關係而致使一多潛能轉錄因子OCT4的活化(圖2E)。此作用是藉由成像研究(圖2J)以及免疫墨點分析(圖2K)而被反映。藉由免疫墨點分析,OCT4活化可被聯結miR-124a與OCT4的抗-miR-124a抗體所抑制(圖2E)。在將近第8小時之時,多潛能轉錄因子NANOG以及SOX2這兩者的逐步升高(圖2K)顯示出在維持DE譜系的多能性上的一支持性角色(與在hES細胞中所具者是一致的)。因此,這些數據顯示出OCT4主要維持DE的自我-更新的特性,藉由其它核心多潛能轉錄因子NANOG以及SOX2而被支持。此外,藉由ChIP-qPCR分析,活性OCT4能夠標靶在SOX17 mRNA的啟動子的2個位址(圖2L),這誘導SOX17表現在第2小時之時達到尖峰(圖1C)。SOX17表現在DE鑑定上代表另一個里程碑。綜上所述,這些結果顯示:bFGF-依賴型miR-124a在hTS細胞中以一極高效率的方式(第8小時)(不同於在hES細胞中的3-天期間)來誘導DE形成。一示意的調節分子機制說明該DE特化經由miR-124a信號傳遞來向上調控FOXA2、SOX17以及OCT4但向下調控MIXL1;其中OCT4在DE譜系的自我-更新的維持上扮演一主要的角色(圖2L)。基因檔案與肝發育中的階段 - 特異性表現型 (Stage-Specific Phenotypes) 相對應
為了之後指引DE分化成為肝譜系,地塞松以及抑瘤素M在DE階段的完成之後的第8小時被添加。qRT-PCR分析的優點被給予,在一時程圖譜中31種肝發育-關聯性基因的動態表現被探測俾以特徵化可被用來遵循分化過程的mRNA指紋。各個基因的基因檔案在6-天誘導的期間顯示一總計具有4至5個波峰的相似型樣。根據在小鼠模型中的肝發育的細胞歷程,被處理以bFGF以及地塞松與抑瘤素M的雞尾酒的hTS細胞根據它們的基因表現圖譜而被區分為細胞歷程的4種階段:原條至DE (<第8小時)、肝特化的內胚層譜系(第8小時至第1天)、肝母細胞(第2至4天)以及胎兒與成人似肝細胞-細胞(≧第4天)(圖9A至9F)。
因此,這些結果顯示:i)在原條至DE的階段,4種基因(包括CXCR4、FOXA2、SOX17以及HHEX)被主要地表現(>10-至1,000-倍);ii)在肝特化的內胚層,6種基因[包括用於肝芽形成(liver bud formation)以及脂質代謝的SOX17、甲狀腺素-以及視黃醇-結合的蛋白質(thyroxin-and retinol-binding protein) TTR、蛋白質載體白蛋白(ALB)、酪胺酸分解性酵素TAT、SERPINA1以及膽汁酸生物合成酵素CYP7A1]被主要地表現(介於10-與100-倍之間);iii)在肝母細胞階段,有6種基因(包括TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1以及膽鹽輸出幫浦BSEP)被主要地表現(介於10-與100-倍之間);以及iv)在胎兒與成人似肝細胞-細胞階段,有11種基因[包括HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、葡萄糖恆定酵素G6PC、肝膽排泄轉運蛋白MRP2 (ABCC2)、免疫以及正常巨噬細胞調節子C/EBPβ,以及數種肝基因調節子(諸如HNF4α以及HNF1α)]被主要地表現(>100-倍)。此外,α-胎兒蛋白(AFP)的表現出現在胎兒階段(第4天以及第5天),但在成人似肝細胞-細胞階段的第5天之後減少(圖6)。似肝板結構展現出肝細胞的特徵
在肝臟中,肝板系統構成一獨特的組織結構,由被一連續帶有肝纖維囊(Glisson’s capsule)的鞘所圍繞的膽管以及血管所組成。為了特徵化hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞在分化期間的型態改變,被發現到的是,細胞形態從初始似纖維母細胞改變成一較長的紡錘體特徵伴隨著一形成小葉的形狀之趨勢,顯示在第2天以及第3天之時數種多角細胞(polygonal cells)被定位在中央區域(圖3A)。然而,在第4天之後,細胞可能聚集以形成一似板團塊以及此現象端視於被培養的初始細胞數目。細胞群接著被進行進一步的檢測。
組織學上,大多數的細胞排列呈現為一個細胞或兩個細胞厚的嗜酸性細胞質,俾以形成一似板組織;然而,細胞可能聚集在一起,俾以形成一細胞群(圖3A)。免疫組織化學上,這些細胞展現出針對在細胞質隔室(cytoplasmic compartment)中的白蛋白、AFP、β滋養因子、HNF4α、APOF、CPS1、ADH1以及CYP2B6的免疫螢光染色;然而細胞膜標記(包括CXCR4、CX32、MRP2以及BSEP)的一亞群使得該細胞呈一相似於初級肝細胞的多邊形形狀(圖3B)。電子顯微鏡顯示相似於該初級肝細胞的超微結構,例如:大的細胞質相對於細胞核比例、大量的粒線體(mitochondria)、充分組織化的內質網、胞橋小體連接、完整的高基氏體(golgi apparatus),以及特別地,擴張的小管腔以及連接複合物(圖3C)。此外,免疫細胞螢光成像(immunocytofluorescence imaging)顯示一AFP與白蛋白以及ABCC2 (MRP2)與BSEP的共定位(colocalization)(圖1E)。為此目的,被證明的是:這些似肝細胞-細胞具有相似於初級肝細胞的細胞組分或基礎結構(infrastructures)的肝特性。似肝細胞 - 細胞在活體外與活體內作用有如初級肝細胞
肝臟是負責在代謝[諸如白蛋白合成(albumin synthesis)、尿素生成(ureagenesis)、肝醣生成以及去毒]上許多的特定功能之最重要的器官。為了檢測這些似肝細胞-細胞是否能夠作用相似於初級肝細胞,白蛋白以及尿素在細胞中的分泌能力被研究。培養基在第4天誘導之時被收穫並且被進行ELISA分析。結果顯示白蛋白以及尿素這兩者的位準被顯著地增加,這顯示它們在培養基中產生分泌白蛋白以及尿素的能力(圖4A)。接著,在細胞階段或似肝板組織中的糖化酶分解處理之後,肝醣貯積能力測試(glycogen storage capacity test)顯示一陽性過碘酸-希夫(PAS)染色(圖4B)。此作用藉由用於免疫細胞化學以及免疫組織化學這兩者的PAS螢光發射而被進一步確認(圖4B)。此外,LDL攝入分析顯示細胞的LDL攝入的能力在第4天誘導之時的不成熟的肝細胞啟動(圖4C)。油-紅-O染色顯示脂質微滴的存在,顯示脂肪生成(adipogenesis)的某種程度(圖4D)。此外,被檢測的是:藉由qPCR分析,似肝細胞-細胞是否藉由使用細胞色素P450 (CYPs)酵素作為標的而在活體外具有藥物代謝以及去毒的能力。結果顯示:似肝細胞-細胞顯著地表現對代謝專一性藥物反應的CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4以及CYP7A1的活性(圖5A至5I),這顯示這些似肝細胞-細胞可被用於相似於初級肝細胞的藥物篩選以及發現。例如,一肝臟酵素-誘導劑立汎黴素(rifampin)可以促進CYP3A4活性以增加藥物的代謝速率以及CYP3A4的抑制是藥物-藥物交互作用(DDI)(它已被廣泛地使用於臨床情境中)的一主要原因。此外,已被顯示的是:根皮苯乙酮(phloracetophenone)[2,4,6-三羥基苯乙酮(2,4,6-trihydroxyacetophenone, THA)]促進CYP7A1活性以及mRNA表現俾以減少在高膽固醇血症倉鼠(hypercholesterolemic hamsters)中的血漿膽固醇以及三酸甘油酯這兩者,以及THA拮抗鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid, CDCA)在CYP7A1 mRNA表現上的抑制性調控。為此,已被顯示的是:在似肝細胞-細胞中,立汎黴素-誘導的CYP3A4能夠藉由它的抑制劑伊曲康唑(itraconazole)而被減少(圖5H),而THA誘導的CYP7A1 mRNA的上升是藉由CDCA而被減少(圖5I)。從藥理觀點,例如,膽汁酸結合的樹脂被指示用於治療升高的血漿低-密度脂蛋白膽固醇濃度,然而,樹脂治療是危險的。因此,新的藥物已藉由達到CYP7A1的調控而被設計,俾以減少血漿膽固醇並且根據CYP7A1位置的確認作為一用於創新的藥理干預(pharmacological intervention)的焦點。鹼性 FGF 誘導在 hTS 細胞中 PI3K/AKT/CREB1 信號傳遞途徑的活化
hTS細胞在條件培養基中被處理以bFGF (10 ng/ml),並且藉由免疫墨點分析,被顯示的是FGF受體(FGFR)抑制劑PD166866可以阻斷bFGF-誘導的磷脂醯肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)的活化(圖8A),這顯示該抑制作用是經由位在細胞膜之處的FGFR。因此,藉由使用PI3K siRNA而被證實的,下游效應子AKT被磷酸化(圖8B)。為了說明何種蛋白質激酶B (AKT)次單元被活化,對抗3種AKT次單元(AKT1、AKT2以及AKT3)的專一性siRNA是藉由免疫墨點分析而被檢測。結果顯示僅有AKT1磷酸化以及活化它的下游效應子cAMP反應要素-結合蛋白1 (cAMP response element-binding protein 1, CREB1)(圖8C)。此作用是藉由免疫沉澱(IP)分析而被進一步確認(圖8D)。綜上所述,這表示bFGF在第4小時誘導之時會誘導PI3K/AKT1/CREB1信號傳遞途徑的活化。實施例 2 實驗處理程序 細胞培養與分化
此研究是由人體研究以及倫理委員會的機構審查委員會(KMUHIRB-20140071)所認可。該等hTS細胞是有如先前所描述的(Lee et al., 2012, PLoS ONE7 , e52491)於經告知的同意下被獲得,以及在37℃下於含有5% CO2 潮濕的空氣中被維持在補充有10% (v/v)胎牛血清(FBS;SAFC Biosciences)的α-MEM (Gibco)培養基中。關於DE分化,依據實證研究,細胞是藉由一含有10% FBS、2-巰基乙醇(1 mM)、菸鹼醯胺(10 mM)以及bFGF (10 ng/mL)的條件α-MEM培養基而被執行歷時8小時(數據未顯示)。針對在DE形成之後的第8小時的肝細胞分化,細胞培養物被置換至含有bFGF (10 ng/mL)、地塞松(0.1 µM, Sigma)、重組型人類抑瘤素M (10 ng/mL, Excel-Biomedical Inc.)、BMP4 (20 ng/mL)以及HGF (5 ng/mL)的培養基。細胞是在有如用於分析所指示的第4至7天之時被收穫。階段-特異性的譜系的分化的偵測端視於在肝發育中的肝細胞-關聯性標記。動物研究
成年的雄性Sprague-Dawley大鼠(300至350 g)在一為12小時光照/12小時黑暗循環下任意採食地(ad libitum )使用食物以及水而被飼養。實驗研究是由高雄醫學大學的制度動物倫理委員會(IAEC)[Institutional Animal Ethical Committee (IAEC) of Kaohsiung Medical University](IACUC-96009)所認可。關於實驗,大鼠經由腹膜內注射而被麻醉以25%水合氯醛(chloral hydrate)(500 mg/kg)。大鼠被分為2組:假手術(sham operation)作為對照組(n=8)以及其他作為研究組(n=8)。靜脈內血液(0.5 mL)在實驗之前被獲得以作為基準以及兩組在12小時之後皆被腹膜內注射以CCl4 [1 mL/kg,1:1 (v/v)配於玉米油中]。緊接地,研究組是從尾部靜脈而被注射以hTS細胞-衍生的肝細胞(1×106 細胞/200 μL培養基)以及假手術組僅被給予PBS溶液。血清樣品在基準、細胞注射點、第24小時、第48小時以及第72小時之時被取得並且被進行肝功能試驗,亦即天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase)(AST或先前被稱為SGOT)、丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase)(ALT或先前被稱為SGPT)以及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)(ALP)、血清膽紅素(serum bilirubin)。在第4天之時,全部的大鼠被犧牲,俾以獲得用於組織病理學研究的肝臟以及肺臟器官。mRNA miRNA 染色質免疫沉澱 (ChIP)-qPCR 以及 mRNA 微陣列
方法是如先前所描述的(Lee et al., 2012, PLoS ONE7 , e52491)而被執行。關於mRNA表現,RNA是依據製造商的操作指南使用TRIZOL試劑(Invitrogen)與DNAase I on-column分解(Qiagen, Valencia, CA)在三重複或五重複樣品中而從hTS細胞中被分離。總RNA (500 ng)是使用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad)而被用於反轉錄。即時聚合酶鏈反應(qPCR)是使用每反應1/40th 的cDNA以及400 nM前向與反向引子而被執行二重複。比較性即時PCR是使用Power SYBR® Master Mix (Applied BioSystems)與7500即時PCR系統(Applied Biosystems)而被執行至少三重複。除非另有指明,全部的基因是使用ΔΔCt 方法而被標準化至GAPDH表現以及被標準化至未經分化的hTS細胞的表現。在此研究中所使用的引子序列可於表5中被發現到。
關於miRNA分析,25 ng的總RNA是使用TaqMan微RNA反轉錄套組(Applied Biosystems)而被反轉錄。qPCR是使用TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)與7500即時PCR系統(Applied Biosystems),使用針對miR-124a或RNU6B 的專一性引子(Applied Biosystems)而被執行至少三重複,包括無模板對照組。U6 snRNA (RNU6B; Applied Biosystems)作用作為一內生性對照組。
關於ChIP分析,在誘導中所指示的時間之hTS細胞樣品是以一最終濃度為1%的福馬林予以固定。在室溫下進行培育(10分鐘)之後,該反應是藉由添加甘胺酸(125 mM)而被終止。ChIP分析是使用一與ChIP分析套組(Upstate Biotechnology)有關聯的操作程序而被執行。在廣泛的清洗之後,經染色質免疫沉澱的DNA從珠粒中被洗提出並且藉由qPCR而被分析。螢光酵素報導子分析
為了製備螢光酵素-3’UTR報導子質體,來自於hTS細胞的基因組DNA萃取物的3’UTR片段被擴增。3’UTR PCR片段是藉由使用Psi I以及Mfe I (Thermo Scientific, Rockford, IL)而被選殖至pGL4.51載體(Promega, Madison, WI)的螢光酵素基因下游中。針對3’UTR報導子建構物的引子被列示如下:
針對Cdx2 3’UTR區域:前向,5’-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3’以及反向,5’-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3’。
針對Smad4 3’UTR區域1:前向,5’-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3’以及反向,5’-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3’。
針對Smad4 3’UTR區域2:前向,5’-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3’以及反向,5’-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3’。
針對GSK3 β 3’UTR區域:前向,5’-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3’以及反向,5’-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3’。
關於雙重螢光酵素分析,螢火蟲螢光酵素報導子(500 ng)或被共-轉染以pGL4.74與水母螢光酵素質體(500 ng, Promega)以及非-專一性對照組miRNA (30 pmol)或miR-124a前驅物(30 pmol;System Biosciences, Mountain View, CA)的沒有任何3’UTR的空的載體是使用TransIT® -LT1轉染試劑(Mirus Bio LLC, Madison, WI, US)而被共-轉染至hTS細胞(各個井中1.5×104 細胞)。在轉染(36小時)之後,螢光酵素活性是藉由雙重螢光酵素報導子分析系統(Promega)以及Centro LB 960微盤式冷光儀(Centro LB 960 Microplate Luminometer)(Berthold Technologies, Bad Wildbad,德國)而被分析。用於評估,水母螢光酵素值首先被標準化至螢火蟲螢光酵素活性以及各個3’UTR報導子的經計算的活性被進一步標準化至對照載體。數據表示平均值±SD (n=8),p<0.05作為統計學顯著性。在細胞溶解緩衝液中所製備的完整細胞萃取物使用Cdx2、Smad4、GSK3β以及β-肌動蛋白抗體而被進行免疫墨點分析。質體
MiR-124a前驅物以及抗-miR-124a是購自於System Biosciences。簡言之,miR-124a前驅物(60 pmol)或抗-miR-124a (60 pmol)是使用TransIT-LT1轉染試劑(Mirus, Madison, WI)在12-井培養皿中被轉染至hTS細胞。在轉染之後的第36小時之時,總RNAs被使用於定量miR-124a。標靶PI3K (SASI_Hs01_00233971以及SASI_Hs01_00127787)、Akt1 (SASI_Hs01_00205545)以及Akt2 (SASI_Hs01_00035055)的小干擾RNA (siRNA)是購自於Sigma。標靶CREB1 (TRCN0000007310、TRCN0000226467以及TRCN0000226468)、Smad4 (TRCN0000010321、TRCN0000010323以及TRCN0000040032)、Akt3 (TRCN0000001615以及TRCN0000001616)、Oct4 (TRCN0000004879以及TRCN0000004882)、Cdx2 (TRCN0000013683以及TRCN0000013686)的小髮夾RNA以及對照組shRNA (shGFP;TRCN0000072178、TRCN0000072179以及TRCN0000072183)是購自於台灣的中央研究院國家NRAi核心平台。轉染是使用呈2 μg siRNA或shRNA以及4 μL轉染試劑而被執行。LDL 攝入分析
LDL攝入是藉由使用LDL Uptake Cell-Based分析套組(Cayman Chem Co. Ann Arbor, MI)如製造商的操作指南而被執行。簡言之,5x104 細胞被接種在一個24-井培養皿的各個井中的蓋玻片上。hTS細胞(作為對照組)以及經分化的似肝細胞-細胞(hHLCs)是在5 μg/mL LDL-DyLightTM 549探針處理(4小時,37℃)之後被固定並且接著針對LDL受體藉由兔子抗-LDL以及DyLightTM 488-綴合的山羊抗-兔子抗體而被染色。核是以DAPI而被顯影。最終染色是藉由螢光顯微鏡而被觀察。 - -O 試驗
關於脂質累積的偵測,經分化的細胞在RT下被固定以4%三聚甲醛(20分鐘)以及被清洗以60%異丙醇歷時5分鐘。在RT下與一被新鮮地製備的60%油紅O溶液(0.5 g油紅O配於100 mL異丙醇中,在使用之前通過一個0.22 μm濾膜)(Sigma)培育(20分鐘)之後,細胞以60%異丙醇予以潤洗以及以蘇木精I (Thermo Scientific)予以對比染色以供用於顯微鏡。肝醣貯積測試
關於肝醣偵測,經分化的細胞是藉由4%三聚甲醛而被固定。經固定的樣品以0.4% Triton X-100予以通透化。未經分化的對照組細胞在37℃下被培育以糖化酶(1 mg/mL配於PBS中;Sigma)歷時1小時。細胞在RT下被培育以過碘酸(0.5 g溶解在100 mL蒸餾水中)歷時5分鐘,以蒸餾水予以清洗,並且被培育以被新鮮地配製的希夫試劑(15分鐘)以及被進行顯微術。生化參數試驗 (Biochemical Parameter Tests)
肝功能的全部生化參數[包括白蛋白、尿素、天門冬胺酸轉胺酶(AST)以及丙胺酸轉胺酶(ALT)]是藉由使用自動-分析儀(auto-analyzer)(Hitachi 7080,日本)而被測量。功能性細胞色素 p450 分析 (Functional Cytochrome p450 Assay)
為了測試在hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞中CYP酵素誘導的活性,細胞以試劑予以處理歷時24小時,例如,關於CYP1A2試驗,所使用的是立汎黴素(25 μM)/立汎黴素+塞普沙辛(ciprofloxacin)(1 μM);關於CYP2B6試驗使用苯巴比妥(100 μM)/苯巴比妥+氯吡格雷(clopidogrel)(25 μM);關於CYP3A4使用立汎黴素(25 μM)/立汎黴素+伊曲康唑(25 μM);關於CYP7A1使用2,4,6-三羥基苯乙酮(THA, 1 μM)/THA+CDCA (25 μM);關於CYP2C8與CYP2C9使用立汎黴素(25 μM)/立汎黴素+吉非貝齊(25 μM)以及關於CYP2C19使用立汎黴素(25 μM)/立汎黴素+梯可比定(25 μM)。Huh-7細胞被用來作為正對照組。免疫細胞化學以及免疫組織化學 (Immunocytochemistry and Immunohistochemistry)
方法是如先前所描述的(Lee et al., 2012, PLoS ONE7 , e52491)而被執行。簡言之,具有細胞培養物的玻片在室溫下在95% (v/v)乙醇中被固定歷時30分鐘,以PBS清洗3次以及被培育以含有0.1% (wt/v) Triton X-100 (Sigma)以及5% (v/v)標準驢血清(Millipore)的封阻緩衝液PBS歷時60分鐘。一次與二次抗體被稀釋於封阻緩衝液中。一次抗體被培育。在4℃下(24小時)或在室溫下(2小時)被培育以專一性一次抗體(配於PBS中)之後,適當的螢光素異硫氰酸鹽(FITC, Invitrogen)或Alexa Fluor 488、594以及647 (Invitrogen)或Dylight 488以及594 (BioLegend)綴合的二次抗體在室溫下被添加(1小時)。核在DAPI染色(5分鐘)之後,在室溫下培育以二次抗體(1小時),以及清洗,樣品被固定以50%甘油。影像是藉由共焦雷射掃描顯微鏡(LSM700;Zeiss Z1或Olympus FluoView 1000共焦雷射掃描顯微鏡)或TissueFAXS系統(TissueQnostics GmbH, Vienna, Austria)而被拍攝。數據是藉由TissueQuest軟體而被分析。電子顯微鏡
用於穿透電子顯微鏡,方法是如先前所描述的(Lee et al., 2012, PLoS ONE7 , e52491)而被執行。簡言之,hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞(在誘導之後的第4天之時)在室溫(RT)下被固定於含有3% (wt/vol)甲醛、1.5% (wt/vol)戊二醛以及2.5% (wt/vol)蔗糖的0.1 M二甲胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)中歷時1小時或在4℃下隔夜。樣品在4℃下在含有1% (vol/vol) OsO4 的Palade’s固定劑中鋨酸化處理(2小時)之前與之後被清洗以0.1 M二甲胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)。在被處理以單寧酸,被染色以1 %醋酸鈾醯,以及透過一梯度-系列的乙醇溶液而被脫水之後,樣品被埋入TABB環氧樹脂(Agar Scientific Ltd.)中。超薄切片被染色以醋酸鈾醯以及檸檬酸鉛並且藉由使用JEM-2000 EXII穿透電子顯微鏡(JEOL,東京)而被分析。免疫墨點法以及免疫沉澱法 (IP)
方法是如先前所描述的(Lee et al., 2012, PLoS ONE7 , e52491)而被執行。關於免疫墨點分析,細胞被收穫至補充有蛋白酶以及磷酸酶抑制劑(Roche)的RIPA溶解溶液(Millipore, Billerica, MA)中。在30 μg溶胞產物在聚丙烯醯胺凝膠上的電泳之後,電轉漬至PVDF膜(Millipore)上被執行。在室溫下藉由5%脫脂奶(配於PBS中)而被封阻(1小時)之後,標的蛋白質是藉由使用一次抗體而被偵測。全部的膜被培育以化學發光劑(Millipore)以及造影是藉由ChemiDoc XRS系統(Bio-RAD)而被拍攝。所使用的抗體被列示於表4中。數據是藉由AlphaEaseFC (version 4.0.0)系統而被分析。關於IP分析,bFGF-處理的hTS細胞的細胞溶胞產物被收集。藉由培育以蛋白質G-瓊脂糖(Millipore)歷時30分鐘,總蛋白質(100 μg)被處理以表4中所列示的專一性一次抗體隔夜。在處理以蛋白質G-瓊脂糖珠粒(2小時)之後,樣品是使用RIPA溶解緩衝液(Millipore)而被清洗3次,繼而添加以蛋白質裝填染劑並且被煮沸歷時5分鐘。樣品是藉由8% SDS-PAGE而被解析並且被進行免疫墨點分析。用於二維膠體電泳 [2-Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE)] 的樣品製備
2種樣品被獲得:細胞培養基(5-天,作為研究組)以及純的培養基(作為對照組)。樣品是如先前所描述的(Chou et al., 2015)而被製備。簡言之,樣品(0.1 mL)在-20℃下被培育以含有11%三氯乙酸(trichloroacetic acid)(TCA, w/v)以及20 mM DTT的1 mL冰-冷的丙酮歷時30分鐘。在離心(12,000 rpm,10分鐘,4℃)之後,蛋白質沉澱物是以含有20 mM DTT的1 mL冷的丙酮予以清洗2次,繼而風乾俾以移除丙酮。接著,適當的復水緩衝液(7M尿素、2M硫脲、2% CHAPS、0.5% IPG緩衝液、20 mM DTT)被添加以及經濃縮的樣品是藉由Bradford方法而被測量。關於2-DE分析,一總量為150 μg的蛋白質被培育以含有5M尿素、2M硫脲、3% (w/v) CHAPS、具有一為3至10的非線性pH的1%經固定的pH梯度(IPG)、100 mM DeStreak試劑以及微量的溴酚藍的緩衝液。在連續的處理過程之後,該樣品是使用Ettan IPGphor杯-裝填(Ettan IPGphor cup-loading)(Amersham Biosciences)而被杯-裝填在IPG條的陽極附近以及蛋白質聚焦是依據製造商的操作指南使用IEF參數而被完成。在第一維電泳之後,等電聚焦IPG條在一含有1% (w/v) DTT的條件平衡緩衝液(15分鐘),以及繼而在含有2.5% (w/v)碘乙醯胺(iodoacetamide)的相同溶液(15分鐘)中被振盪。該條被轉移至12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)上。第二維分離是藉由一恆定的75 V (30分鐘)以及100 V (16小時)而被執行。該2-DE凝膠被銀染以及使用Typhoon 9410掃描器(Amersham Biosciences)而被偵測。該等點是藉由使用Image Master 2D Platinum系統(Amersham Biosciences)而被比較與被定量。用於蛋白質鑑定以及定量的電噴霧離子化 - 四極棒 - 飛行時間串聯式質譜法 (Electrospray Ionization-Quadrupole-Time of Flight Tandem Mass Spectrometry, ESI–Q-TOF–MS/MS)
為了鑑定所觀察到的2D凝膠蛋白質,樣品是藉由胰蛋白酶而被分解,繼而進行如先前所描述的(Chou et al., 2015)用於蛋白質鑑定的奈流液相層析(nanoflow liquid chromatography)以及Waters-Micromass ESI–Q-TOF (Waters, Manchester, UK)。為了獲得對應的波峰清單,各個前驅物的個別片段的MS/MS譜是藉由MassLynx 4.0軟體(Manchester, UK)而被製造以及該等波峰清單檔案被上傳至一用於蛋白質鑑定的內部的Mascot伺服器(in-house Mascot server)。統計學分析
全部的實驗是呈三重複而被實施並且有如所指示的被重複2次。從西方墨點分析、qPCR、螢光酵素報導子分析以及流動式細胞測量分析中所獲得的數據是藉由史徒登氏t-檢定而被計算。在動物研究中,成對ANOVA檢定被統計學地使用。p 值<0.05被認為具有統計學顯著性。結果 1)bFGF 單獨誘導在 hTS 細胞中的 DE 分化
從幹細胞到肝譜系的路徑由一漸進系列的細胞歷程所組成,特別地包括在DE形成中所需要以及必要的步驟。hTS細胞最初被處理以bFGF (10 ng/mL)以及DE-關聯性標記隨著時間的位準藉由免疫墨點分析而被測量。結果顯示:在誘導的最初15分鐘,轉錄因子[諸如goosecoid (Gsc)、Brachyury (T)、同源區蛋白質Mixl1 (Mixl1)、SRY-盒17 (Sox17)、叉頭盒蛋白質A2 (Foxa2,亦被知曉為Hnf3β)以及原始內胚層標記Sox7 ]被顯著地向上調控,在介於第30分鐘與第1小時之間達到尖峰(圖10A)。這些數據意味著一從hTS細胞至媒介可與在早期胚胎發生(embryogenesis)中的肝發育相容的原條階段之新生中內胚層的快速轉變。之後,Sox17位準持續地升高至第4小時並且下降;而Foxa2以及Brachyury升高至第8小時,但Sox7表現在誘導的第15分鐘之後成為新生的。值得注意地,藉由TissueFAX分析所測量的,Mixl1的強度從波峰(第15分鐘)向下調控至在第4小時之時的一最低點(低於天然者~50%)並且在第8小時之時回復至原始位準(圖10AS)。它們在表現上的改變亦藉由免疫螢光成像而被證明(圖10B)。這些結果顯示:bFGF能夠單獨經由原條與模擬胚胎肝發育的中內胚層而快速地分化hTS細胞成為DE階段。2)PI3K/Akt/CREB1 信號傳遞途徑促進 MiR-124a 表現
bFGF能夠經由它在hTS細胞中的受體FGFR1來誘導PI3K/Akt/CREB1信號傳遞途徑。hTS細胞在條件的培養基中被處理以bFGF (10 ng/mL)。藉由免疫墨點分析,FGF受體(FGFR)抑制劑PD166866可阻斷bFGF-誘導的磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)的活性(圖10BS),這顯示該抑制作用是經由位在細胞膜之處的FGFR。因此,藉由使用PI3K siRNA而被證實的,下游效應子AKT被磷酸化(圖10CS)。為了說明何種蛋白質激酶B (AKT)次單元被活化,對抗3種AKT次單元(AKT1、AKT2以及AKT3)的專一性siRNA是藉由免疫墨點分析而被檢測。結果顯示僅有AKT1磷酸化以及活化它的下游效應子cAMP反應要素-結合蛋白1 (CREB1)(圖10DS)。此作用是藉由免疫沉澱(IP)分析而被進一步確認(圖10ES)。綜上所述,這表示bFGF在第4小時誘導之時會誘導PI3K/AKT1/CREB1信號傳遞途徑的活化。
微RNA (miR)-124 (一小非-編碼的RNA)涉及在胰臟β-細胞(一種腹側前腸內胚層的衍生物)中的Foxa2表現。之後,藉由ChIP-qPCR分析,在核中,經活化的CREB1直接地標靶在miR-124a 的啟動子的3個位址,俾以在第4小時誘導之時誘導miR-124a表現(圖10C)以及CREB1的弱化減少它的表現(圖10FS)。藉由qPCR分析,CREB1以及miR-124隨著時間的表現呈現一平行的相關性(圖10D)。這些結果顯示:bFGF-誘導的PI3K/Akt/CREB1信號傳遞途徑能夠在hTS細胞的早期分化之時時空地向上調控miR-124a。3)MiR-124a 指引 DE 特化
與肝臟生成有關的數種基因被篩選以及被構築,藉由螢光酵素報導子分析,數種訊息傳遞蛋白質被測量,包括母體抗生物皮膚生長因子同源子4 (mothers against decapentaplegic homolog 4, Smad4)(圖11A)、肝醣合成酶激酶3β (GSK3β)(圖11B)以及同源盒轉錄因子Cdx2 (圖11C)。miR-124a的抑制性作用包括:i)標靶在Smad4 信使RNA (Smad4 mRNA)的啟動子以防止Smad4產生(圖11A,下方)。因此,抑制性Smad4造成Mixl1的抑制,藉由Smad4的弱化而被驗證(圖11AS)。此機制說明在DE階段中Mixl1的向下調控(圖10A)以及原腸胚形成期間的移行細胞命運的轉變;ii)標靶在GSK3β mRNA的啟動子以抑制它的轉譯(圖11B,下方),藉此,致使下游受質鈣黏素-關聯性蛋白質β-1 (cadherin-associated protein β-1)(β-連接素)的核轉位(nuclear translocation)。在核中,β-連接素標靶Foxa2 基因的啟動子俾以產生Foxa2 (圖11D),突顯在DE階段的分化。有趣地,此增加的Foxa2依次地誘導c19orf80 基因轉錄,編碼β滋養因子蛋白質表現(圖11E)。β滋養因子是一在肝臟中產生的激素,控制胰臟β細胞增生;iii)標靶在尾型-相關的同源盒轉錄本Cdx2 mRNA俾以抑制它轉譯成多潛能轉錄因子Cdx2 (圖11C,下方)。這些全部的分子事件發生在第4小時誘導之時,藉由免疫墨點分析,藉由使用miR-124a以及抗-miR-124a抗體而被確認(圖11F)。
之後,藉由免疫螢光成像研究,減少的Cdx2促進多潛能轉錄因子Oct4的向上調控(圖11G)。藉由免疫墨點分析,Oct4的過度表現是使用抗-miR-124a抗體藉由miR-124a的弱化而被進一步驗證(圖11F)。介於Cdx2與Oct4之間的這種交互抑制關係是藉由免疫墨點分析而被證實(圖11BS,上方)。此外,被觀察到的是在第8小時誘導之時多潛能轉錄因子Nanog顯著地逐步升高(圖11BS,下方)。這些結果顯示:Oct4在維持DE譜系的多潛能特性上扮演主要的角色;然而Nanog可能扮演有如一與在hES細胞中所具者一致的支持性的角色。重要地,藉由ChIP-qPCR,經活化的Oct4依次地標靶在Sox17 基因的啟動子(圖11H)而促進Sox17表現(圖10A)。Sox17的表現代表在DE分化中的另一個里程碑。共同地,圖11I是一描述調節性分子機制的示意說明,藉此bFGF誘導啟動在hTS細胞中媒介miR-124a的DE形成。4) 3-D 組織結構中的似肝細胞 - 細胞的生成
接著,在DE形成之後(第8小時),細胞是以bFGF (10 ng/mL)、地塞松(Dexa;0.1 μM)、抑瘤素M (OSM;10 ng/mL)、骨型態形成蛋白質4 (BMP4;20 ng/mL)以及肝生長因子(HGF;5 ng/mL)的一組合予以培養。意外地,細胞形態可能展現有如分散的似纖維母細胞-細胞或逐步地聚集,俾以形成一新月形細胞群,端視於在培養中的接種密度(圖12A。插入物以及圖12AS)。細胞群的組織學檢測顯示出2不同的周邊以及中央腔室,構築出一具有3-維(3D)結構的組織。在周邊部位中,許多群集的小細胞在基底膜之外的細胞外基質(ECM)周邊不規則地分佈。細胞具有相似於胚胎幹/祖細胞之縮合的核(經常偏心地位於嗜酸性細胞質中)以及大量粒狀與液泡(圖12AS)。在中央部位中,許多獨立的柱狀ECMs (由位於2側之處的細胞內襯所造成)從基底朝向中央區域而分佈(圖12A)。這些細胞含有模擬表現型肝細胞之大量嗜酸性細胞質以及在具有1或2個顯著的核仁之單一圓核中之分散的染色質。數種雙核細胞可被看見。此特徵是相似於被知曉為在人類肝臟中的肝板。
免疫組織化學上,這些似肝細胞-細胞展現出下列專一性標記:i)針對人類細胞的人類細胞質標記stem 121TM 、針對肝內生性幹細胞的肥大/幹細胞生長因子受體C-kit 、針對膽管細胞的CK19以及針對肝細胞的CK18 (圖12B);以及ii)在免疫組織化學上針對肝細胞的細胞質中的白蛋白(ALB)、α-胎兒蛋白(AFP)、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1以及CYP2B6 (圖12C)。表面標記(包括ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2以及Cx32)的一亞群構築出一相似於初級人類肝細胞的多邊形細胞形狀(圖12C)。此外,電子顯微鏡顯示一相似於初級肝細胞的超微結構,包括:一大的細胞質相對於細胞核比例、大量的粒線體、充分組織化的內質網、緊密型連結、許多脂質空泡、肝醣貯積、具有連接複合物之擴張的膽小管腔以及多重ECMs (圖12D)。5)TGF β 1 促使在肝 ECMs 中的纖維連接蛋白以及膠原蛋白 IV 支架的形成
藉由Mascot MS/MS離子檢索系統 (ESI-QUAD-TOF, Bruker Impact HD, Matrix Science, USA),在細胞培養基中9種新的被向上調控之被分泌的蛋白質之中,蛋白質(第413號)成為一有吸引力的標的,因為它藉由46%的胜肽序列相匹配而明顯地預測會是轉變生長因子-β (TGF-β)-誘導的蛋白質ig-h3前驅物(TGFβ1)(圖13A,紅色;圖13AS)。TGFβ1是一主要的纖維性、多功能細胞激素,作用有如自體分泌以及旁分泌方式,俾以在肝星狀細胞(HSCs)中增強纖維連接蛋白以及膠原蛋白形成。因此,為了鑑定TGFβ1的存在,藉由免疫組織化學,免疫組織化學被用來證明免疫反應TGFβ1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV在ECMs中的共表現(圖13B)。這些結果顯示:TGFβ1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV組成至少部分具有似肝細胞-細胞的呈3-D結構的組織中ECMs的支架而可支持肝板中的肝細胞的增生與分化。6) 轉錄表現特徵化階段 - 特異性肝分化
42種肝發育-關聯性基因被分析,這顯示分化細胞在細胞歷程期間可能共有一在基因表現上的重疊態樣。有如被提及的,從多潛能hTS細胞至原條(15至30分鐘)以及中內胚層(<1小時)的轉變,GSC、Brachyury (T)以及Sox7的一升高的表現伴隨一逐步增加的Mixl1、Foxa2以及Sox17被觀察到(圖10A)。Sox7被主要地表現在原條、內臟內胚層(visceral endoderm)以及體壁內胚層(parietal endoderm)中,但不是DE (Kanai-Azuma et al., 2002)。在DE階段(第1至8小時),高度轉錄表現的持續性維持(包括CXCR4、Foxa2、Sox17、HHEX以及Sox7)並且在之後下降(表3)。當細胞歷程進入肝內胚層階段(第8小時至第1天)時,一核心群組的內胚層轉錄因子(包括Sox17 以及Foxa2 )依次地調控一會將細胞導向內胚層譜系的基因級聯。在肝特化不久之後,上皮開始表現與肝芽有關聯的基因(包括白蛋白、AFP 以及Hnf4 α )。大量的肝母細胞-關聯性基因表現出現俾以定向細胞分化成為雙能性肝母細胞(第2天至第4天)。肝母細胞由此表現與胎兒肝細胞(例如AFP )、成人肝細胞(例如ALB 以及Hnf4α )以及膽上皮細胞(biliary epithelial cells)(例如細胞角質蛋白-19)有關聯的特定的基因,允許分化俾以到達胎兒/成人肝細胞階段(>4天)。共同地,這些漸進的轉錄表現與在肝發育中的細胞歷程一致,有如在表3中所列示的。7) 似肝細胞 - 細胞展現出肝功能
肝功能的維護在多潛能幹細胞-衍生的肝細胞中是必要的要求。為此,細胞培養基被收集以及被進行酵素-結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。結果證明:在誘導之後的白蛋白、NHCl4 -誘導的尿素以及CCl4 -誘導的GOT、GPT以及ALP在培養基中升高的位準(圖14A)。LDL攝入分析顯示:這些細胞含有LDL攝入的能力(圖14B)。油-紅-O染色顯示脂質微滴的存在,這顯示在脂肪生成(adipogenesis)上的能力(圖14C)。此外,肝醣貯積測試顯示一陽性過碘酸-希夫(PAS)染色(藉由糖化酶分解以及PAS螢光發射試驗在細胞學或組織學中被支持)(圖14D)。接著,qPCR分析顯示細胞色素P450 (CYPs)酵素(包括CYP3A4、CYP7A1、CYP2B6、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6以及CYP2E1)對各種不同的代謝專一性藥物的反應的能力(圖14E)。在功能上,例如,立汎黴素(rifampin)-誘導的CYP3A4 mRNA是藉由它的抑制劑伊曲康唑而被減少;然而2,4,6-三羥基苯乙酮(THA)-誘導的膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1) mRNA是藉由鵝去氧膽酸(CDCA)而被減少。這些結果分別顯示在異生物質(xenobiotics)的氧化以及膽汁酸與膽固醇代謝上的能力。8) 功能性似肝細胞 - 細胞具有幹細胞返位的特性
動物研究被設計來模擬在急性肝衰竭中的臨床場景,四氯化碳(CCl4 )的腹膜內注射由此於Sprague Dawley大鼠中被給予,繼而hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞的靜脈內注射(尾部靜脈)。目的是為了測驗這些異種移植物(xenografts)藉由返位至該大鼠的肝臟中是否可以存活以及這些細胞扮演何種角色。血清樣品在第0、1、2、4以及7天被收集俾以測量AST以及ALT位準。大鼠在第2、4以及7天被犧牲俾以得到用於組織病理學研究的肝臟樣品。生化研究顯示:與對照組(僅有CCl4 )相較之下,細胞治療組(CCl4 + 細胞)中的血清AST以及ALT隨著時間的位準看來是顯著地較高的(圖15A)。為了闡明這不明確的觀察,肝組織被組織病理學地檢查。
使用人類細胞質標記stem 121TM (Stem Cell Technologies. Inc. WA)作為一指標,在hTS細胞中一陽性免疫反應的stem 121表現被鑑定(圖15B),繼而確認在植入之後的第4天,在肝組織中stem 121-陽性似肝細胞-細胞的存在(圖15C)。此觀察顯示:似肝細胞-細胞的靜脈內投藥能夠返位至肝組織。有趣地,這些stem 121陽性 肝細胞也經歷如免疫組織化學性的退化(圖15C)。這個事實說明,與僅有CCl4 -處理組相較之下,在細胞治療組中AST以及ALT位準的一極高提升是因為CCl4 (在血液中24小時半衰期)的一附加效應(它造成該等經植入的似肝細胞-細胞的退化)。hTS細胞-衍生的似肝細胞-細胞的靜脈內注入可到達以及存在於CCl4 損傷肝組織。9) 似肝細胞 - 細胞藉由表現 HLA-G TGF β 1 以及 CD4+ Foxp3+ Treg 細胞的募集能力而具有免疫豁免權
在免疫組織化學上,由於在植入後的第4天之時在肝組織中有stem 121以及HLA-G的一共表現,經植入的似肝細胞-細胞表現人類白血球抗原G (HLA-G)(圖15D),這顯示一免疫豁免的特性。HLA-G (膜-結合的或可溶的)強烈地作用於不同免疫細胞類型(NK、T、B、單核球/樹突細胞)上,俾以經由與被表現於免疫細胞之表面的抑制性受體交互作用而抑制先天性以及適應性免疫。
此外,似肝細胞-細胞能夠分泌TGFβ1至ECMs中(圖13B)。TGFβ1是一胸腺T細胞發育的關鍵調節子並且在免疫反應期間的周邊T細胞恆定、對自體抗原的耐受性以及T細胞分化中是一關鍵性的角色。同時,在免疫細胞化學上,CD4+ Foxp3+ T調節性(Treg)細胞是存在於肝竇狀隙(hepatic sinusoids)(圖15E),顯示募集Treg細胞至對經植入的細胞反應的肝臟。藉由細胞激素TGFβ1或CD4+ Foxp3+ Treg細胞所造成的主動免疫抑制扮演一周邊T細胞耐受性的重要機制。經植入的似肝細胞-細胞藉由表現HLA-G與TGFβ1以及募集CD4+ Foxp3+ Treg細胞至肝臟以控制周邊T細胞耐受性而具有免疫豁免權。 表1. 所使用的抗體,例如,在實施例1中 表2. 所使用的引子,例如,在實施例1中 表3. 在肝分化期間的轉錄基因檔案 標誌:NA,無;(-)表示表現<2-倍,(+) >2-倍,(++) >10-倍,(+++) >100-倍,以及(++++) >1,000-倍。 表4. 所使用的抗體,例如,在實施例2中 表5. 所使用的引子,例如,在實施例2中
此處所描述的實施例以及具體例僅供例示說明的目的並且被建議給熟習此技藝者之各種不同的修飾或變化將被包括在本申請案的精神與範圍以及隨文檢附的申請專利範圍的範疇之內。
圖1A至1F說明DE譜系的免疫反應標記(immunoreactive markers)。圖1A至1D顯示在bFGF誘導的第4小時,與對照組相較之下,以免疫細胞化學法(immunocytochemistry)去偵測hTS細胞中的FOXA2以及SOX17 (圖1A)、GSC (圖1B)以及MIXL1 (圖1C)。圖1D顯示在bFGF誘導的最初的8小時,與DE有關的轉錄因子(包括GSC、Brachyury、MIXL1、SOX17以及FOXA2)在時程上的西方墨點法。誤差槓(Error bars)表示平均值的標準偏差(standard deviation, SD)。N=3,*:p <0.05作為統計學顯著性。圖1E顯示肝細胞-關聯性標記的共定位(colocalization),其顯示在誘導之後的第4天的AFP與白蛋白(上區)以及ABCC2與BSEP (下區)。圖1F顯示一種用於似肝細胞-細胞分化的2-步驟攝生法,其顯示藉由西方墨點分析,在hTS細胞中各種不同的肝細胞-專一性標記。α-微管蛋白(α-tubulin)作為加載對照組(loading control)。
圖2A至2M說明用於DE特化的調節性分子機制。圖2A顯示miR-124a分析(ChIP-qPCR),它鑑別CREB1標靶在miR-124a mRNA的啟動子的3個位址。一致性miR-124a結合位址的一示意圖(上區)。C:作為無-抗體對照組。誤差槓表示3重複的SD。圖2B說明藉由免疫墨點分析,CREB1的弱化(knockdown)減少bFGF-誘導的miR-124a表現。誤差槓表示3重複的SD。*:p <0.05。圖2C顯示藉由qPCR分析,bFGF誘導的磷酸(p)-CREB1以及miRNA-124a在8小時誘導期間的表現。誤差槓表示4重複的SD。圖2D顯示藉由螢光酵素報導子分析(luciferase reporter assay),Smad4的ChIP-qPCR,它鑑別miR-124a藉由標靶啟動子的2個位址而抑制Smad4表現。一致性miR-124a結合位址的示意圖(上區)。空的載體作為對照組;pSmad4表示Smad4質體,誤差槓表示3重複的SD。*:p <0.05。圖2E顯示藉由西方墨點法,bFGF、miR-124a以及抗-miR-124a抗體在與DE有關的轉錄因子的表現上的作用。β-肌動蛋白(β-actin)被用來作為加載對照組。圖2F顯示藉由西方墨點法,使用shRNAs而弱化Smad4會抑制Smad4以及MIXL1的表現。β-肌動蛋白被用來作為加載對照組。圖2G以及圖2H顯示ChIP-qPCR分析,它藉由螢光酵素報導子分析而鑑定在第4小時誘導由miR-124a所導致的抑制性GSK3β (圖2G);而qPCR分析顯示由β-連接素(β-catenin)所導致的一抑制性FOXA2 (圖2H)。一致性miR-124a結合位址的示意圖(G,上區)。空的載體作為對照組;pGSK3β表示GSK3β質體,誤差槓表示3重複的SD。*:p <0.05。圖2I顯示ChIP-qPCR分析,它藉由螢光酵素報導子分析而鑑定由miR-124a所導致的抑制性CDX2。一致性miR-124a結合位址的一示意圖(上區)。空的載體作為對照組;pCDX2表示CDX2質體,誤差槓表示3重複的SD。*:p <0.05。圖2J顯示成像,它顯示在bFGF誘導的第4小時,在hTS細胞中介於CDX2以及OCT4之間的一交互抑制性機制。圖2K顯示在DE分化期間,多潛能轉錄因子CDX2與OCT4 (上區)以及NANOG與SOX2 (下區)在時間軸上的西方墨點法。誤差槓表示3重複的SD。*:p <0.05。圖2L顯示ChIP-qPCR分析,它鑑定OCT4在SOX17 基因的啟動子的2位址之處的結合。誤差槓表示3重複的SD。圖2M顯示在hTS細胞分化朝向DE譜系中bFGF誘導的一圖式說明。
圖3A至3C說明似肝細胞-細胞的組織分化(morphogenesis)。圖3A顯示細胞分化的型態改變,在誘導的第6至8天形成一似板狀-組織結構。圖3B顯示電子顯微照片,其顯示基礎結構:大的細胞質/細胞核比例,大量的粒線體(m)、高基氏體(Gi)、充分組織化的內質網(RER)、連接複合物(junctional complex)(白色箭頭),俾以形成膽小管腔(bile canaliculus lumen, Cn),以及該等連接複合物(雙箭頭)封閉剩餘的細胞外間隙(extracellular space)、位於細胞質的層狀包涵體(lamelleted inclusion body)以及胞橋小體連接(desmosome junction)(箭頭)的間隙。圖3C顯示似肝板-組織的免疫組織化學,其顯示肝細胞的免疫反應細胞膜標記:CXCR4、CX32、BSEP與MRP2 (ABCC2),以及細胞質標記:β滋養因子、HNF4α、白蛋白、AFP、CYP2B6、APOF、CPS1以及ADH1。
圖4A至4D說明經分化的似肝細胞-細胞的肝功能。圖4A顯示經分化的似肝細胞-細胞(4天),其在介質(諸如白蛋白以及尿素)中展現出由一自動分析儀(automatic analyzer)(Hitachi 7080;東京,日本)所測量的蛋白質分泌能力。誤差槓表示3重複的SD。**:p <0.01。圖4B以及圖4C顯示一LDL攝入分析,它說明免疫反應LDL受體(LDLR,左區)與LDL染色(中間區)(圖4B)以及油-紅-O (Oil-Red-O)測試顯示在經分化的似肝細胞-細胞中的脂肪微滴(fat droplet)(圖4C)。圖4D顯示藉由糖化酶(diastase)去分解肝醣而被證明的,藉由似肝細胞-細胞(左3區)與似肝板-組織(右區)中的過碘酸-希夫(PAS)染色[periodic acid-Schiff (PAS) staining](上區)以及藉由螢光PAS染色(下區)所證實的,肝醣貯積測試鑑定細胞中肝醣的存在。
圖5A至5I說明在經分化的似肝細胞-細胞中各種不同的CYP 450酵素活性。第I至II期CYP450酵素[包括CYP1A2 (圖5A)、CYP2B6 (圖5B)、CYP2C8 (圖5C)、CYP2C9 (圖5D)、CYP2C19 (圖5E)、CYP2D6 (圖5F)、CYP2E1 (圖5G)、CYP3A4 (圖5H)以及CYP7A1 (圖5I)]活性是藉由藥物-藥物交互作用(drug-drug interaction)以及去毒測試(誘導劑、抑制劑)而被評估。立汎黴素(rifampin, Rif)與塞普沙辛(ciprofloxacin, Cip)、苯巴比妥(phenobarbital, phen)與Cip、Rif與吉非貝齊(gemfibrozil, Gem)、Rif與Gem、Rif與梯可比定(ticlopidine, Tico)、僅有Rif作為誘導劑、僅有Rif作為誘導劑、Rif與伊曲康唑(itraconazole, Itra),以及2,4,6-三羥基苯乙酮(2,4,6-trihydroxyacetophenone, THA)與鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid, CDCA)分別被用來作為誘導劑以及抑制劑。hTS表示hTS細胞,hTHL表示人類滋養層-衍生的似肝細胞-細胞;以及Huh7表示人類肝腫瘤Huh7細胞。
圖6說明一表格,其顯示在一肝細胞分化的不同階段期間的生物標記表現(例如mRNAs)。
圖7說明藉由TissueFAX分析,DE形成的細胞歷程(cellular processes)。藉由MIXL1的向上調控(upregulation)所表示的(黑色),bFGF (10 ng/mL)被用來誘導hTS細胞分化成為中內胚層(mesendoderm)。隨後,該中內胚層在大約第4小時誘導之時分化成為DE譜系,表現MIXL1的一向下調控(downregulation)(灰色)。n表示被計數的細胞的總數目。
圖8說明此處所描述的生物標記的表現位準分析。圖8A說明使用β-肌動蛋白作為一加載對照組,FGFR抑制劑(PD166866)阻斷bFGF-誘導的PI3K。圖8B說明PI3K siRNA抑制PI3K以及p-AKT的表現。被轉染以非-專一性shRNA的細胞被用來作為對照組。β-肌動蛋白被用來作為一加載對照組。圖8C顯示對抗AKT次單元的siRNAs抑制bFGF-誘導的p-AKT以及p-CREB1的表現。被轉染以非-專一性shRNA的細胞被用來作為對照組。β-肌動蛋白被用來作為一加載對照組。圖8D顯示藉由IP分析,AKT直接與CREB1交互作用。
圖9說明藉由qPCR分析,在hTS細胞中的肝發育-關聯性31種基因在誘導之後的基因波動圖譜(genetic fluctuation profiles)。
圖10A至10D以及10AS至10FS說明在DE形成期間的免疫反應標記。(10A)在最初的誘導之時(第8小時)原條以及DE標記的代表性標記在時程上的西方墨點分析。數據表示平均值±SD (n=3),*:p <0.05作為統計學顯著性。(10B) Foxa2與Sox17 (左區)、Gsc (中間區)以及Mixl1 (右區)在bFGF誘導的第4小時的免疫細胞化學。(10C)藉由ChIP-qPCR,CREB1標靶在miR-124a的啟動子的3位址之處(上區)俾以增加miR-124a的位準之鑑定。C:作為對照組。數據表示平均值±SD (n=3),*:p <0.05作為統計學顯著性。(10D)藉由qPCR分析,bFGF誘導磷酸(p)-CREB1與miRNA-124a之間的一平行表現。數據表示平均值±SD (n=4),*:p <0.05作為統計學顯著性。(10AS)藉由TissueFAX分析,在4小時誘導內細胞中平均Mixl1強度的一調動。空白區域(blank area)作為對照組,藍色區域作為中內胚層階段,紅色區域作為DE階段。(10BS)藉由西方墨點法,FGFR抑制劑(PD 166866))阻斷bFGF-誘導的PI3K。β-肌動蛋白被用來作為加載對照組。(10CS) PI3K siRNA抑制PI3K以及p-Akt的表現。被轉染以非-專一性shRNA的細胞被用來作為對照組。β-肌動蛋白被用來作為加載對照組。(10DS)對抗Akt次單元的siRNAs抑制bFGF-誘導的p-Akt以及p-CREB1的表現。被轉染以非-專一性shRNA的細胞被用來作為對照組。β-肌動蛋白被用來作為加載對照組。(10ES)藉由IP分析,Akt直接與CREB1交互作用。(10FS) bFGF-誘導的miR-124a是藉由使用CREB1 shRNAs而被抑制。數據表示平均值±SD (n=3),*:p <0.05作為統計學顯著性。
圖11A至11I以及11AS至11CS說明關於DE特化的分子機制。(11A、11B、11C) miR-124a藉由標靶基因的啟動子(上區)而抑制Smad4質體(pSmad4)(A)、pGSK3β (B)以及pCdx2 (C)的表現之螢光酵素報導子分析。空的載體:對照組,數據表示平均值±SD (n=3),*:p <0.05作為統計學顯著性。(11D)藉由ChIP-qPCR分析,β-連接素隨著時間結合至Foxa2 基因的啟動子的區域(-2.1 kb)。誤差槓表示3重複的SD。(11E)藉由ChIP分析,Foxa2標靶β滋養因子的啟動子,顯示在第12小時誘導之時產生β滋養因子(箭頭)。輸入:完整的細胞作為正對照組。IgG作為負對照組。(11F)藉由西方墨點分析,對miR-124a以及抗-miR-124a抗體反應的各種不同的轉錄因子在bFGF誘導的第4小時的表現。β-肌動蛋白:加載對照組。(11G)免疫細胞化學地,在bFGF誘導的第4小時介於Cdx2 (綠色)以及Oct4 (紅色)之間的一交互抑制作用。(11H)藉由ChIP-qPCR分析,Oct4在bFGF誘導的第2小時結合至Sox17 基因的啟動子的2區域(-1以及-1.8 kb)。誤差槓表示3重複的SD。(11I) hTS細胞在DE分化中的分子調控的圖式說明。(11AS)藉由免疫墨點分析,Smad4 shRNAs抑制Mixl1的表現。(11BS)在DE形成期間,Oct4、Cdx2、Nanog以及Sox2在時程上的表現。數據表示平均值±SD (n=3),*:p <0.05。(11CS)免疫反應白蛋白(ABL)以及AFP在似肝細胞-細胞中會表現。
圖12A至12D以及12AS說明似肝細胞-細胞的生物學特性。(12A)新月形細胞群(左區,插入物)的H&E染色。許多群集的細胞在含有大量具有縮合的核(condensed nuclei)的似小胚胎祖細胞-細胞(small embryonic progenitor-like cell)的外周邊層之處不規則地分佈(右下)。沿著從周邊層散發至中央區域的似肝細胞-細胞內襯的似柱狀樹-ECMs (右上)。(12B)在CCl4 -損害的肝組織中的似肝細胞-細胞,顯示免疫反應stem 121-陽性細胞(左上)、C-kit 陽性細胞(右上,箭頭)、CK19 (左下,箭頭)以及CK18 (右下,箭頭)。組織學上,在肝發育期間各種不同的專一性免疫反應標記在新月形細胞群中被觀察到。細胞表面標記製造在小插入物中所看到的具有多邊形的肝細胞。(12D)代表性電子顯微照片顯示:在上面的顯微照片中,一大的細胞質/細胞核比例,大量的粒線體(m)、內質網(rer)、脂質微滴(lipid droplets)、狄賽氏隙(space of Disse, SD)、細胞外基質(ecm)、核(n)以及竇狀隙(sinusoid),在左下的顯微照片中,具有玫瑰花狀形成(紅色的圓)的肝醣(gly)貯積,以及右下的顯微照片顯示膽小管腔(bc)與連接複合物(上方)以及緊密型連結(tight junction)(下方)。(12BS)在hTS細胞分化成為似肝細胞-細胞期間在時程上的型態改變。
圖13A至13B以及13AS說明在似肝細胞-細胞培養基中的分泌蛋白體學(secretomics)。(13A)在細胞培養之前(作為對照組,左區)以及在5-天細胞培養之後(右區)的培養基之蛋白質體學分析(proteomic analysis),其顯示一新形成的蛋白質(被命名為第413號,圓)。(13B)在誘導之前(上區)以及在誘導歷時5-天之後免疫反應TGFβ1、膠原蛋白IV (COL4)以及纖維連接蛋白(FN)不會在hTS細胞中表現,它們的共表現在呈3-D結構的似肝細胞-細胞之間分佈有如柱狀ECMs (下區)。(13AS) Mascot MS/MS離子檢索系統分析20151001_LiP_413 (Mascot MS/MS ions search system analysis 20151001_LiP_413),轉變生長因子-β-誘導的蛋白質ig-h3前驅物(transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor)[智慧人(Homo sapiens)]。
圖14A至14E說明似肝細胞-細胞的功能性特徵。(14A)藉由自動分析儀(Hitachi 7080;東京,日本),似肝細胞-細胞分泌白蛋白(左)以及尿素[右;藉由5 mM氯化銨(ammonium chloride)的刺激歷時1-天]至培養基中。誤差槓表示3重複的SD。**:p <0.01。(14B) LDL攝入分析顯示在細胞中的免疫反應LDL (紅色,左)、LDL受體(LDLR,綠色,中間)以及它們(右)顯現的影像。(14C)油-紅-O測試顯示在細胞中的脂肪微滴(紅色)。(14D)藉由糖化酶處理,藉由過碘酸-希夫(PAS)染色(上區)以及亦藉由螢光PAS染色(下區),肝醣貯積測試鑑定肝醣的存在(粉紅色以及紅色)。(14E)藉由qPCR分析,在似肝細胞-細胞中對誘導劑以及抑制劑在第24小時處理之時反應的各種不同的第I至II期CYP 450酵素活性。縮寫:立汎黴素(Rif);塞普沙辛(Cip);伊曲康唑(Itra);苯巴比妥(Phen);吉非貝齊(Gem);2,4,6-三羥基苯乙酮(THA);鵝去氧膽酸(CDCA);以及梯可比定(Tico)。
圖15A至15F說明被似肝細胞-細胞靜脈內移植(intravenous transplantation)的反應。(15A)與對照組(僅有CCl4 ;n=8)相較之下,細胞治療組(CCl4 + 細胞;n=8)中的血清AST以及ALT隨著時間的位準是較高的。數據表示平均值± s.e.m.,n=8,史徒登氏檢定(Student test)。(15B)在hTS細胞(上方)中以及存在於肝組織中的似肝細胞-細胞(下方)中的免疫反應stem 121的表現。(15C)在CCl4 -損害的肝組織中Stem 121-陽性肝細胞之具有細胞退化的表現特性(插入物)。PT表示肝門三體(portal triad)。(15D)在被植入的似肝細胞-細胞中免疫反應Stem 121以及HLA-G的共表現。比例尺:20 μm。(15E、15F)在CCl4 -損害的肝細胞周圍的免疫反應CD4+ Foxp3+ Treg細胞(免疫細胞化學)(15E)以及在一中央靜脈(central vein)附近的免疫反應CD4+ 細胞(紅色)(免疫組織化學)(15F)的分佈。

Claims (27)

  1. 一種肝譜系細胞,它是藉由一包含下列步驟之方法而被製得:令一滋養層幹細胞與一鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)接觸,俾以誘導該滋養層幹細胞分化成為一定型內胚層譜系細胞;以及令該定型內胚層譜系細胞與一含有bFGF、地塞松以及抑瘤素M的培養基接觸,俾以誘導該定型內胚層譜系細胞分化成為一肝譜系細胞,其中,該肝譜系細胞是處於下列3種階段中的一者:肝特化的內胚層階段、肝母細胞階段以及胎兒與成人似肝細胞-細胞階段,該肝譜系細胞在肝特化的內胚層階段會表現SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1以及CYP7A1;在肝母細胞階段會表現TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1以及膽鹽輸出幫浦(BSEP);以及在胎兒與成人似肝細胞-細胞階段會表現HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α以及HNF4α。
  2. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該肝譜系細胞是一肝祖細胞。
  3. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記在該肝特化的內胚層階段的一表現位準相對於在該肝特化的內胚層階段之前所具者是增加的。
  4. 如請求項3的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約1倍至大約1,000倍。
  5. 如請求項3的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該肝特化的內胚層階段之前所具者大約10倍至大約100倍。
  6. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記在該肝母細胞階段的一表現位準相對於在該肝母細胞階段之前所具者是增加的。
  7. 如請求項6的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約1倍至大約1,000倍。
  8. 如請求項6的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該肝母細胞階段之前所具者大約10倍至大約100倍。
  9. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段的一表現位準相對於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者是增加的。
  10. 如請求項9的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者大約10倍至大約1,000倍。
  11. 如請求項9的肝譜系細胞,其中該一或多種生物標記的表現位準增加高於在該胎兒與成人似肝細胞-細胞階段之前所具者至少100倍。
  12. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該滋養層幹細胞是一人類滋養層幹細胞。
  13. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該肝譜系細胞是經免疫豁免的。
  14. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞表現TGF β 1。
  15. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞在細胞外基質(ECM)中表現TGF β 1、纖維連接蛋白以及膠原蛋白IV。
  16. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞表現HLA-G。
  17. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞表現HLA-G以及stem 121。
  18. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞募集CD4+Foxp3+ Treg細胞。
  19. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞形成具有一為3-維結構的組織。
  20. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞群集或聚集。
  21. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞形成一新月形細胞群。
  22. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞包含有一周邊腔室以及一中央腔室。
  23. 如請求項22的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞沿著在該周邊腔室的基底膜之外的ECM而不規則地分佈。
  24. 如請求項22或23的肝譜系細胞,其中該胎兒與成人似肝細胞-細胞從該中央腔室中的基底朝向中央區域而分佈。
  25. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該肝譜系細胞表現一或多種選自於下列所構成的群組中的標記:TGF β 1、HLA-G、stem 121、C-kit、CK19、CK18、ALB、α-AFP、β滋養因子、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2、Cx32,以及它們的任何組合。
  26. 如請求項1的肝譜系細胞,其中該滋養層幹細胞是衍生自一子宮外孕團塊。
  27. 一種藥學組成物,其包含有一如請求項1至25中任一項的肝譜系細胞。
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