JP2022511385A - 幹細胞由来ヒトミクログリア細胞、作製する方法および使用方法 - Google Patents

幹細胞由来ヒトミクログリア細胞、作製する方法および使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ａ）幹細胞をウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と最大約２４時間接触させるステップ；ｂ）細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤および少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させて、分化細胞の集団を得るステップであって、分化細胞が少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ステップ；ならびにｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップを含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／７３８，１７６号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、優先権が主張される。
序論
本開示は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）に由来するミクログリア細胞を生成するための方法、そのような方法から得られたミクログリア細胞ならびにそれを含む組成物、ミクログリア関連障害を疾患モデリングするためおよび処置するためのそのようなミクログリア細胞の使用に関する。
ミクログリア（すなわち、ミクログリア細胞）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織常在マクロファージであり、初期胚発生中に脳にコロニーを形成する（Ｐｒｉｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１４）； １５， ３００－３１２）。これらの食細胞は、細胞破片の除去、シナプス接続を媒介するためのニューロンおよびアストロサイトへのシグナル伝達、およびＣＮＳホメオスタシスの維持を含む、中枢神経系における多くの役割に関与する。ミクログリア生物学に関する最新の文献では、齧歯動物モデルにおいてのみ調査されている（Ｂｅｃｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１３）； ７， ３２；Ｂｉａｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１３）； １６， １７７３－１７８２；Ｂｉｌｉｍｏｒｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． （２０１５）； １６１７， ７－１７；Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３）； ８； ４８；Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （２０１２）；１０９；Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１２）； ７４， ６９１－７０５；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． （２０１０）； ８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１５）；３６， ６０５－６１３；Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１４）； １７， ４００－４０６）。
マウスは、ヒト病状との類似点を示すための強力な哺乳動物系であるが、マウスミクログリアとヒトミクログリアとの間に顕著な違いが存在する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１６）； ８９， ３７－５３）。これらとしては、マウスでのみ発現するがヒトでは発現しない基本的な受容体、例えばマクロファージＦ４／８０受容体、ならびに薬物処置に対する応答における機能的な違いがある（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１４）； ３７， １２５－１３５）。更に、ある特定の神経発達疾患は、マウスでは発現しない遺伝子、例えば統合失調症は補体構成成分Ｃ４Ａ対立遺伝子と、強く関連する（Ｈａｖｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ （２０１２）； ７０， ３５－４２； Ｓｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２０１６）；５３０， １７７－１８３）。しかし、ヒト初代ミクログリアは高価であり、死後の組織から入手することは困難であり、培養物中で増殖せず、疾患モデリングを行うことが極めて困難となる（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉａ． （２０１６）； ６４（１１）：１８５７－６８１）。代替物のヒト不死化ミクログリア細胞株は、鍵となる遺伝子を初代ミクログリアと共有していない（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉａ． （２０１６）； ６４（１１）：１８５７－６８１）。
ヒト多能性幹細胞（すなわち、ｈＰＳＣ）由来ミクログリアは、患者の細胞から発生的に導出されるミクログリアの供給を可能にし、これは患者の脳に認められるミクログリアと同じ機能を有する。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（すなわち、ＥＳ細胞）か人工多能性幹細胞（すなわち、ｉＰＳ細胞）から自己複製可能な細胞であり、身体の任意の細胞タイプに分化する能力を有する。典型的には、ｉＰＳ細胞は、特定の疾患に罹患した個体の体細胞に由来する。ｈＰＳＣ由来ミクログリアは、疾患をモデリングする場合にニューロンとミクログリアとの間の非細胞自律相互作用を探索するために使用することができ、これらは潜在的な薬物標的をスクリーニングするために使用することができる（Ｈｏｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１２）；１１， ６２０－６３２）。更に、ｈＰＳＣ由来ミクログリアは、神経発達および神経変性疾患、ならびにＣＮＳ脳腫瘍のための潜在的な細胞療法として使用することができる。
ミクログリアは唯一の組織常在マクロファージであり、これは卵黄嚢先駆体から直接発生するが、他のものは、最初に肝臓に移動する先駆体から発生する（Ｈｏｅｆｆｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１５）； ４２， ６６５－６７８）。その結果、初期の卵黄嚢一次造血（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）をモデル化してミクログリアを生成することは重要である。
ヒトミクログリアをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための現存する戦略は、この発生パラダイムに従っておらず、一次造血を最初に開始することに失敗している。これらの戦略は、二次造血（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）から生じ、したがってミクログリアをｉｎ ｖｉｖｏで得られなかった末梢の単球から開始するか（Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． （２０１４）； ４０， ６９７－７１３；Ｏｈｇｉｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１４）； ４， ４９５７）、または一次造血に関して予めパターン化されておらず、したがって発生細胞の運命決定に関してはブラックボックスである胚様体アプローチを使用することによって開始する（Ｅｔｅｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１２）； ２０９， ７９－８９；Ｈｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍ． （２０１２）； ９， １２；Ｌａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１５）；４， ２８２－２９６；Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． （２０１４）； ４０， ６９７－７１３；Ｏｈｇｉｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１４）； ４， ４９５７；ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３）； ８．；Ｍｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１６）； ２２（１１）， １３５８－１３６７；Ｂａｈｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１５）；５， ７９８９）。これらの戦略が、ミクログリアの真の先駆体である初期の赤血球骨髄球系先駆体（ＥＭＰ）を経由するのか、二次造血をもたらす後期のＥＭＰを経由するのかを判定することは困難である。したがって、ヒトミクログリア細胞を生成するための新規な方法が必要とされている。
Ｂｅｃｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１３）； ７， ３２ Ｂｉａｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１３）； １６， １７７３－１７８２ Ｂｉｌｉｍｏｒｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． （２０１５）； １６１７， ７－１７；Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３）； ８； ４８ Ｐａｓｃｕａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （２０１２）；１０９ Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１２）； ７４， ６９１－７０５；Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． （２０１０）； ８ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１５）；３６， ６０５－６１３ Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１４）； １７， ４００－４０６
図１Ａおよび１Ｂは、本開示のある特定の実施形態による分化方法を図示する。図１Ａは、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋二重陽性一次造血先駆体が得られたＷｎｔ阻害および活性化の組合せを示す。ＷｎｔアゴニストのＣｈｉｒ０９９０２１によってＷｎｔを１８時間活性化すると、免疫蛍光によれば、ブラキュリ（Ｔ）を特徴とする初期の中胚葉がもたらされた。これらの細胞は、フローサイトメトリーによれば、分化の４日目まではＫＤＲ＋およびＣＤ２３５ａ＋（一次造血先駆体）でもあった。図１Ｂは、ＣｈｉＲ曝露のタイミングを示す。分化スキームにおけるＣｈｉｒ０９９０２１曝露の濃度およびタイミングを最適化し、３μＭで１８時間曝露し、続いてＩＷＰ２を介して３μＭでＷｎｔ阻害した場合に、フローサイトメトリーによれば一次造血先駆体（ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋）の最も高いパーセンテージが得られた。 同上。
図２は、造血性内皮細胞および造血細胞発生のスケジュールを示す。造血性内皮細胞は、選別されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋一次造血先駆体を再播種してから１日後に発生した。これらの細胞は、培養物中で７日にわたって懸濁液中に造血細胞をもたらし、培養物中で徐々に増加するようになった。
図３は、ＶＥ－カドヘリン＋染色による造血性内皮細胞の検証を示す。選別後１日目に、細胞は、免疫蛍光によればＶＥ－カドヘリンに関して陽性であり、これらが造血性内皮細胞であり、懸濁液中の細胞が造血細胞の特徴的な小さな核を有していたことが確認された。
図４は、発生上の中間体：Ｋｉｔ＋、Ｋｉｔ＋ＣＤ４５＋を介して進行した円形細胞培養物を示す。再播種してから５日目に、一次造血先駆体のＫｉｔ＋細胞が出現し、これはミクログリアの先駆体である初期の赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）であった。次いでこれらの細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４５＋に到達し、造血コミットメントが完了したことが示された。
図５は、ｈＰＳＣ－ミクログリアを導出するための戦略を示す。ＥＭＰの段階から、ニューロンと少なくとも４日間直接共培養するか、またはマクロファージに個別に成熟させ、次いでニューロンと少なくとも１１日間共培養することによってミクログリアを導出することができる。
図６は、ＥＭＰ／ｐＭａｃの小サブセットに存在するマクロファージマーカー（円形細胞、先駆体）を示す。培養物を選別後８日目に、ＥＭＰの混合集団が存在した場合、これらの細胞は、成熟マクロファージではなく、ミクログリアおよびマクロファージ前駆体として同定された。少ない割合のマクロファージのみが、成熟マクロファージマーカー、例えばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、Ｃｄ１１ｂ、およびＭＲＣを発現した。大部分の細胞は、ＣＤ４５を発現したが、これらが造血系統にコミットしたことが示された。全てのマーカーはフローサイトメトリーによって確認した。
図７は、ｐＭａｃをニューロンと培養すると、共培養の４日目までにＩｂａ１＋Ｐｕ．１＋細胞がもたらされたことを示す。選別後８日目に、ｐＭａｃを含む懸濁液中の細胞をニューロンと培養すると、共培養のわずか４日目までに初期のミクログリア細胞をもたらした。これらの細胞は、Ｉｂａ１＋およびＰｕ．１＋染色を用いて同定された。ＣＤ４５＋であった全ての細胞はＰｕ．１＋でもあり、培養物中で存続したどの造血細胞（ＣＤ４５＋で表される）も、骨髄／ミクログリア系統（ＰＵ．１で表される）にコミットしたことが示された。これは免疫蛍光によるこの戦略が非常に効率的であることを示す。
図８は、Ｉｂａ１＋細胞が培養物中で安定であったことを示す。ミクログリア細胞（免疫蛍光によるＩｂａ１＋）は、皮質ニューロンとの共培養から１４日後に、共培養物中で依然として持続されたままであった。
図９は、Ｉｂａ１＋細胞が培養物中で安定であったことを示す。ミクログリア細胞（免疫蛍光によるＩｂａ１＋、ＰＵ．１＋）は、培養物中で２１日後に、ニューロンとの共培養物中で依然として持続されたままであった。
図１０は、ＲＰＭＩ＋１０％血清、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４における培養物ｐＭａｃを示す。ミクログリアを生成するための第２の戦略では、ＥＭＰを、１０％血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４を用いてマクロファージに成熟させた。これらは、培養物中で４日目までに成熟マクロファージマーカーＣＤ１１ｂを、１１日目までに成熟紡錘体形態を発生した。
図１１は、成熟マクロファージを示す１１日後に大部分の細胞に存在するマクロファージマーカーを使用して検出されたマクロファージの効率的な誘導を示す。１１日後に血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４中の培養物において持続された全ての細胞はＣＤ４５＋であり、これらが全て造血性であったことを示す。大部分は、フローサイトメトリー分析によれば、成熟マクロファージマーカー、例えばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびデクチンに関しても陽性でもあった。
図１２は、ＩＭＤＭ／Ｆ１２／Ｎ２／Ｂ２７＋Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４中の培養物であるｐＭａｃに関する無血清方法を提供する。ｐＭａｃは、血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４の代わりにＩＭＤＭ／Ｆ１２／Ｎ２／Ｂ２７を使用して、血清なしでマクロファージに成熟することもできる。Ｍ－ＣＳＦにＩＬ－３４を添加すると、細胞分裂を促進することによって収率が増加した。ＧＭ－ＣＳＦを添加すると、細胞が同様に分裂したが、得られた細胞は、より顆粒状であり活性化されたように見えた。
図１３は、マクロファージ様細胞とニューロンとの共培養は、強力なＩｂａ１およびＰｕ．１発現を示すことを示す。マクロファージ細胞をニューロンと共培養すると、分岐した形態を伴い、Ｉｂａ１免疫蛍光染色が増加したミクログリア細胞が得られた。Ｉｂａ１は、マクロファージからのミクログリア細胞において増加したため、細胞は、ニューロンとの共培養を介してミクログリアアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に移行していた。
図１４は、共培養されたｐＭａｃ由来ミクログリア（ＥＭＰ共培養物）およびｐＭａｃ－マクロファージ由来ミクログリア（ＥＭＰ－マクロファージ共培養物）は、鍵となるミクログリア遺伝子の発現をヒト胎児ミクログリアと共有することを示す。ミクログリアを導出するための２つの異なる戦略からのＲＮＡの定量的ＰＣＲは、鍵となるミクログリア遺伝子のパネルの遺伝子発現を、ヒト胎児ミクログリア（市販の原料）からのＲＮＡと共有した。対照的に、末梢のマクロファージを表す単球由来マクロファージは、これらのマーカーを発現しなかった。注目するべきことに、ＥＭＰ由来マクロファージを単独で培養した場合、これらは鍵となるミクログリア遺伝子ＴＭＥＭ１１９およびＳＡＬＬ１を下方制御し、共培養が、ミクログリアアイデンティティを維持するために必要であったことが示された。
図１５は、ニューロン、ミクログリアおよびアストロサイトの１４日目のトリ培養物を示す。本開示由来のミクログリア細胞はアストロサイトと共培養して、ＣＮＳ：ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの３つの構成成分を含む系を構築することができる。免疫蛍光によって、ミクログリアはＲＦＰで、アストロサイトはＧＦＡＰ＋でタグ付けした。
図１６は、ニューロン、ミクログリアおよびアストロサイトの３０日目のトリ培養物を示す。本開示由来のミクログリア細胞はアストロサイトと共培養して、ＣＮＳ：ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの３つの構成成分を含む系を構築することができる。免疫蛍光によって、ミクログリアはＲＦＰで、アストロサイトはＧＦＡＰ＋でタグ付けした。
図１７は、細胞タイプ間で相互作用を研究するために使用することができるトリ培養系を示す。炎症性刺激、または炎症性刺激を誘導する疾患状況は、クロストークを有するミクログリアとアストロサイトの両方に影響を及ぼす。このクロストークは、フィードバックまたはフィードフォワードループであり、その後、ニューロンに毒性をもたらす場合がある。この相互作用は、ｈＰＳＣ由来アストロサイトおよびニューロンを含むトリ培養物中のここで開示されるｈＰＳＣ由来ミクログリアを使用して研究して、完全なヒト系をｉｎ ｖｉｔｒｏで検討することができる。
図１８は、トリ培養物中でのＬＰＳ刺激は、反応性サイトカインの放出をもたらしたことを示す。１μｇ／ｍＬのＬＰＳを、ミクログリア、アストロサイト、およびニューロンを含むトリ培養物中の細胞に、またはミクログリアおよびニューロンのみ、またはアストロサイトおよびニューロンのみ、またはニューロンのみを含む培養物に添加した。ミクログリアはＬＰＳに対する受容体（ＴＬＲ４）を発現する唯一の細胞タイプであったために、それを含む培養物のみがＬＰＳに応答したが、トリ培養物では、ミクログリアおよびニューロンのみの培養物と比較するとＣ３の放出が増加した。その効果は、活性化ミクログリアからの反応性サイトカインがアストロサイトにフィードバックし、それらの反応性およびアストロサイトのＣ３の放出をもたらすことに起因する場合がある。ＬＰＳで刺激されたトリおよびミクログリア／ニューロンのみの培養物は、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１Ｂ、およびＩＦＮγを含む他の反応性サイトカインも分泌した。サイトカインはＥＬＩＳＡを介して測定した。
図１９は、Ｈ９対照と比較すると、アルツハイマーニューロンを含むトリ培養物は、Ｃ３増強およびＣ３放出の増加を示したことを示す。家族性アルツハイマー病に関する遺伝モデルであるＡＰＰ／ＳＷｅ突然変異体ニューロンと共培養したトリ培養物は、ミクログリアおよびニューロンのみの培養物と比較するとＣ３の増加を示し、レベルは、ニューロンがＨ９対照胚性幹細胞株由来であった培養物と比較すると増加した。対照的に、Ｃ３レベルは、Ｈ９対照におけるミクログリア／ニューロン培養物と比較して、トリ培養物において増加せず、Ｃ３増強が、疾患刺激なしでは生じなかったことを示す。Ｃ３はＥＬＩＳＡを介して測定した。
図２０は、ＧＭ－ＣＳＦは、アルツハイマーとＨ９共培養物の両方においてＣ３放出を減少させたという結果を示す。ＧＭ－ＣＳＦは、アルツハイマーと対照の両方の全ての培養物中でＣ３放出を減少させた。免疫蛍光による細胞数はまた、ＧＭ－ＣＳＦ添加条件と対照条件との間で同等であり、この効果は、ミクログリア細胞の減少によるものではなかったことを示す。
図２１は、アミロイド－βの負荷は、アミロイド－４２ペプチドに対する選択性を伴うミクログリア共培養物において減少したことを示す。ミクログリア細胞とアルツハイマーニューロンとの共培養物は、総アミロイドベータの減少を、ＥＬＩＳＡを介して示し、４０および３８ペプチドと比較した場合に、特にアミロイド－ベータ４２ペプチドの減少を示した。
図２２は、ミクログリア細胞内部の４２－４８８の蛍光の増加は、取り込みの増加を示していたことを示す。ミクログリア細胞がアミロイド－ベータを貪食するかどうかをアッセイするために、蛍光標識アミロイド－ベータ４２ペプチドをａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８８とともに使用し、２時間後、ミクログリア細胞の大部分がアミロイドベータ４２をその中に含んでいたことを免疫蛍光によって見出した。一方、アミロイド－ベータ４０（５５５によって標識された）では、ミクログリア細胞内でそれほど明るくは見出されず、効率的に貪食されなかったことを示す。このことは、ミクログリア細胞によるアミロイドベータ４２に対する選択性を実証した。
図２３は、フルオロフォアを切り替えると、アミロイド－ベータ４２がミクログリア細胞によってより多く取り込まれたという同様の結果が得られたことを示す。アミロイド４２および４０を表すフルオロフォアを切り替えると、細胞内の４２の輝度の増加の効果は、技術的なフルオロフォア輝度の効果によるものではなかったことが確実になった。切り替えたフルオロフォアを用いても、この実験では４２が５５５に、４０が４８８に標識されているが、免疫蛍光によればミクログリア細胞内に更に４２の輝度が存在し、ミクログリア細胞がアミロイド－ベータ４２を選択的に貪食したという以前の結果が裏付けられた。
図２４は、ベースライン時のアミロイド－４２に対する選択性、およびＧＭ－ＣＳＦ処置時の取込みの増加を示すＦＡＣＳ分析を提供する。ＧＭ－ＣＳＦ処置によって、ミクログリア細胞におけるアミロイド－ベータ４２ならびに４０の食作用を増加させ、その中にアミロイド－ベータペプチドを有する細胞数を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。
図２５は、ＡＬＳミクログリアおよびアストロサイトが、ベースライン時の補体Ｃ３放出を増加させたことを示す。ＳＯＤ１突然変異体ｉＰＳＣ由来ＡＬＳアストロサイトおよびミクログリアを単独でまたは一緒に培養し、ＥＬＩＳＡによって定量化した同系野生型対照細胞株由来アストロサイトまたはミクログリアに対してＣ３レベルが高いことが示された。これは、Ｃ３反応性が、アルツハイマーに特有ではなく、ここで開示される系は、ミクログリアとアストロサイトとニューロンとの間にもループが存在する可能性が高い他の神経変性疾患を研究するためにも使用することができることを示す。
図２６Ａ～２６Ｄは、一次造血に向けたパターン形成が、発生上の狭い期間中に生じたことを示す。図２６Ａは、一次造血細胞をｈＰＳＣから分化させるための例示的なここで開示される方法の概略図を示す。図２６Ｂは、ＷＮＴ阻害は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋血管芽細胞を効果的に生成するために、ＷＮＴ活性化から１８時間後に開始する必要があることを示す。図２６Ｃは、最適化されたＷＮＴの活性化、それに続く阻害によって、３日目までに３０％のＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋集団が生成したことを示す。図２６Ｄは、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋フラクションのみが、分化の６日目までにＣＤ４３＋ＣＤ２３５Ａ＋ＣＤ４１＋ＥＭＰを、１０日目までにＣＤ４５＋マクロファージ先駆体を産生したことを示す。 同上。
図２７Ａ～２７Ｆは、単一細胞ＲＮＡシークエンシングによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化内でのミクログリア発生の段階が実証されたことを示す。図２７Ａは、６日目および１０日目の培養物からの統合データを拡散マッピングした後のＴ－分布型確率的近傍埋め込み法（ＴＳＮＥ）によって、異なる造血性内皮細胞（ＨＥ）、赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）、赤血球（ＥＲＹ）、巨核球（ＭＫ）、および初期のマクロファージ（ＰＭＡＣ）クラスターが明らかにされることを示す。図２７Ｂは、Ｐａｌａｎｔｉｒ分析を示し、ＨＥクラスターが最も分化が少なく、ＥＭＰ中間体を経由して進行し、疑似時間にわたって赤血球（ＥＲＹ）、巨核球（ＭＫ）、および骨髄（ＭＹ）集団の３つの個別の分化軌跡に向かって分岐していることを示す。図２７Ｃは、個別の分化のアーム（ＥＲＹ、ＭＫ、およびＭＹ）が、疑似時間にわたって、ＥＲＹ、ＭＫ、およびＭＹアイデンティティの鍵となるマーカーを次第に発現したことを示す。図２７Ｄは、マウス卵黄嚢ＥＭＰおよびＰＭＡＣ遺伝子シグネチャーと比較した疑似時間にわたる骨髄軌跡に沿った細胞からの遺伝子発現データのヒートマップを示し（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５３（６３０４） ａａｆ４２３８）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＥＭＰクラスターに対応するＥＭＰ遺伝子に関しては、０．１６～０．７７の間の疑似時間で豊富であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＰＭＡＣクラスターに対応するＰＭＡＣ遺伝子に関しては、０．８～１．０の間の疑似時間で豊富であることを示す。図２７Ｅは、マウス原腸陥入データへのｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトデータのマッピングが、ヒトＰＭＡＣクラスターとマウスＭｙ（骨髄）クラスターとの間で類似性を示すことを提供する。図２７Ｆは、マウス発生のＥ８．５の間に存在するクラスターを用いて最も密接にマッピングされたｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトｐＭＡＣクラスターを示す。 同上。 同上。
図２８Ａ～２８Ｊは、ｉｎ ｖｉｖｏミクログリアと分子的にかつ機能的に同様であるＰＭＡＣ段階からｈＰＳＣ－ミクログリアを導出するための２つの異なる方法を示す。図２８Ａは、ＰＭＡＣからミクログリアを導出するための２つの方法に関する概略図を示す。図２８Ｂは、１０日目の前駆体をｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと直接共培養すると、共培養の４日目までに分枝状のＩＢＡ１＋細胞が得られたことを示す。図２８Ｃは、共培養物中で細胞の３０％超が、共培養の４日目にＣＸ３ＣＲ１＋を発現したことを示す。図２８Ｄは、ｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと６日間共培養したＧＦＰ＋１０日目の前駆体は５０％超のＣＤ４５＋であり、その８０％超がＣＸ３ＣＲ１＋であったことを示す。ＣＤ４５－陰性（ＣＤ４５－）である約１０％のＧＦＰ＋集団は、約５０％のＣＤ４１＋ＣＤ２３５Ａ＋（ＥＭＰ）からなり、約５０％はコミットしなかった。図２８Ｅは、ニューロンを含まないＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦにおいて１０日目の前駆体を成熟させると、培養物中で１１日までにＣＤ１１Ｂ（約９９％）およびＣＸ３ＣＲ１（＞８５％）を発現する原始マクロファージの漸進的に純粋な集団が得られることを示す。並行して成熟したＰＢＭＣは、ＣＤ１１Ｂ（１００％）を発現するが、ＣＸ３ＣＲ１＋は発現しない。図２８Ｆは、原始マクロファージをｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと培養すると、分枝状のＩＢＡ１＋ミクログリア様細胞が得られたことを示す。図２８Ｇは、共培養されたミクログリア細胞がＣＸ３ＣＲ１の発現を維持しており、皮質ニューロンと共培養され、ＣＸ３ＣＲ１を発現せず、ＣＤ４５の発現が高いＰＢＭＣ成熟マクロファージよりもＣＤ４５の発現が低く、鍵となるミクログリア特異的遺伝子を上方制御したことを示す。図２８Ｈは、どちらの方法から生成されたｈＰＳＣ－ミクログリアも、ヒト胎児ミクログリア（市販の原料からのＲＮＡ）と類似しているミクログリア特異的遺伝子の鍵となるパネルを発現し、一方、ＰＢＭＣ由来マクロファージは発現しなかったことを示す。ＴＭＥＭ１１９およびＳＡＬＬ１の発現は、単独で培養したミクログリアと比較して共培養物中で増加した。ｎ＝２。図２８Ｉは、２つの異なる方法に由来する成体ミクログリアのバルクＲＮＡシークエンシングデータの遺伝子発現を示す。１群当たりｎ＝３。図２８Ｊは、シナプスタンパク質の封入体を含むｄ７０のｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと共培養したミクログリアの共焦点イメージング（４０×）を示し（パネルｉ）；ＲＦＰで標識された一般的な神経物質を含む封入体を定量化すると、シナプスタンパク質を含む封入体よりも体積が多かったことを示す（パネルｉｉ）。１群当たりｎ＝４。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２９Ａ～２９Ｋは、ｈＰＳＣ由来アストロサイトおよびニューロンを用いて培養したｈＰＳＣ由来ミクログリアは、機能的ヒトトリ培養系を構築し、これによってｉｎ ｖｉｖｏで神経炎症軸（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｘｉｓ）のモデリングが可能になることを示す。図２９Ａは、トリ培養分化の概略図を示す。図２９Ｂは、ｈＰＳＣ由来アストロサイトはＧＦＡＰ＋であり、一部はＡＱＰ４＋であったことを示す。図２９Ｃは、ｈＰＳＣ由来ニューロンが終脳のものであり、ＦＯＸＧ１を維持したことを示す。図２９Ｄは、Ｄ５０ｈＰＳＣ由来ニューロンがＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２の皮質層マーカーを発現したことを示す。図２９Ｅは、ＭＡＰ２＋ニューロンと相互作用したＩＢＡ１＋ミクログリアおよびＧＦＡＰ＋アストロサイトを示すトリ培養物を表す。図２９Ｆは、ＣＣ３＋によって測定された細胞死が最小限のトリ培養物を表す。図２９Ｇは、ＬＰＳ処置時に悪化したミクログリア／ニューロン（Ｍ／Ｎ）培養と比較して、トリ培養（ＴＲＩ）においてＣ３タンパク質の分泌が増加したことを示し、これらはＥＬＩＳＡで測定した。アストロサイト／ニューロン（Ａ／Ｎ）およびニューロンのみ（Ｎ）の培養物中でＣ３は分泌されなかった。１群当たりｎ＝４、ＡＮＯＶＡ、シダックの事後検定。図２９Ｈは、ＬＰＳ刺激によって、他の炎症性サイトカインの分泌が誘導されたことを示す。図２９Ｉは、ＥＬＩＳＡによって、Ｃ３ ＫＯミクログリアがＣ３タンパク質を分泌しなかったことを示す。図２９Ｊは、Ｃ３ＫＯＡ培養では、野生型（ｗｔ）トリ培養物と比較してＣ３放出が減少したが、Ｍ／Ｎ培養よりもＣ３を多く分泌したことを示す。Ｃ３ＫＯＭ培養では、最小限のＣ３放出レベルが低かった。Ｃ３ＫＯＡ培養におけるＣ３放出は、ＬＰＳ処置によって、トリ培養物と比較して減少し；Ｃ３ＫＯＭでは、他の群と比較してＣ３放出が少なかった。図２９Ｋは、アストロサイトへのミクログリアシグナル伝達によって開始され、ミクログリアにシグナル伝達を返してＣ３放出を増加させた、トリ培養物における神経炎症性ループを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３０Ａ～３０Ｈは、アルツハイマー病（ＡＤ）のトリ培養物モデルが、アストロサイトへのミクログリアシグナル伝達によって引き起こされる、ＡＤトリ培養物におけるＣ３放出の増加を示したことを図示する。図３０Ａは、同系ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンが終脳のマーカーＦＯＸＧ１を発現したことを示す。図３０Ｂは、ＣＴＩＰ２およびＴＢＲ１の皮質層マーカーを示す。図３０Ｃは、Ｄ５０同系ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンおよびＷＴ対照によって分泌されたアミロイドの総量を示す。ｎ＝２、スチューデントｔ検定。図３０Ｄは、ｄ８０ニューロン（ＭＡＰ２＋）、野生型ｈＰＳＣ由来ミクログリア（ＩＢＡ１＋）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ＋）を含む同系ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物を示す。図３０Ｅは、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養が、同系対照トリ培養よりも多くのＣ３を分泌したことを示す。ｎ＝３、シダックの事後検定を用いたＡＮＯＶＡ。図３０Ｆは、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンを含むＣ３ＫＯＡトリ培養物は、野生型アストロサイトを含むＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物と比較してＣ３分泌が低いことを示したことを提供する。Ｃ３ＫＯＭ ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養では、分泌されたＣ３レベルが低かった。１群当たりｎ＝３、シダックの事後検定を用いたＡＮＯＶＡ。図３０Ｇは、ミクログリアを含むＡＰＰＳＷＥ＋／＋培養が同系対照培養と比較して高レベルのＣ１ＱＡ沈着を発現したことを示す。図３０Ｈは、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンがミクログリアを活性化し、それがアストロサイトを活性化し、Ｃ３放出の増加を引き起こした、ＡＤのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける神経炎症性ループを示す。 同上。
図３１Ａ～３１Ｃは、造血アイデンティティ細胞の生成を示す。図３１Ａは、６日目からエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加すると、分化の１０日目にＣＤ２３５Ａ＋赤血球の発生が可能になることを示す。図３１Ｂは、円形造血細胞が１０日目までに半懸濁液において漸進的に増殖することを示す。図３１Ｃは、ＶＥ－カドヘリン＋造血性内皮細胞が分化培養物中に存在したことを示す。
図３２Ａ～３２Ｂは、ＧＰＩ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰｈＰＳＣ系統からのＧＦＰ＋造血細胞の生成を示す。図３２Ａは、遺伝子座のＰＣＲの際に、ＧＦＰを含む標的となる系統が、Ｈ２Ｂの後に１ｋｂの産物を産生したことを示す。図３２Ｂは、多能性段階におけるＧＰＩ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰｈＰＳＣ系統が全ての細胞においてＧＦＰを発現したことを示す。
図３３Ａ～３３Ｃは、ミクログリア細胞の代表的な明視野および免疫蛍光画像を示す。図３３Ａは、血清または無血清条件下でのＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦにおける培養物の１１日までの全ての分化細胞が付着し、細胞は細長い形態を示したことを示す。図３３Ｂは、全ての細胞が骨髄性転写因子ＰＵ．１を発現したことを示す。図３３Ｃは、ミクログリア細胞が共培養した際にＩＢＡ１を上方制御し、分枝状の形態に発達したことを示す。
図３４Ａ～３４Ｂは、共培養されたｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞の単一細胞ＲＮＡシークエンシングの結果を示す。図３４Ａは、ミクログリア試料中の細胞間のペアワイズ距離が均質な単峰型分布に入ったことを示す。図３４Ｂは、不均質な１０日目試料における細胞間のペアワイズ距離が複数のピークを有していたことを示す。 同上。
図３５Ａ～３５Ｂは、酵母－抗原ザイモサンをチャレンジした場合の細胞の食作用を示す。図３５Ａは、４時間以内に封入体としてザイモサンコンジュゲート蛍光ビーズを示すミクログリア細胞を示す。図３５Ｂは、アストロサイト対照が蛍光ビーズ封入体を示さなかったことを示す。
図３６Ａ～３６Ｂは、ｈＰＳＣ由来皮質ニューロンのプレ－シナプスおよびポストシナプス遺伝子発現を示す。図３６Ａは、Ｄ７０でのｈＰＳＣ由来皮質ニューロンを示し、プレ－シナプスＳＹＮＩおよびポストシナプスＨＯＭＥＲ１の点状分布、ならびに両方を並べた場合の推定上のシナプスを示す（白色矢印）。図３６Ｂは、Ｄ７０のｈＰＳＣ由来皮質ニューロンが、点状分布においてポストシナプスマーカーＰＳＤ９５を発現したことを示す。
図３７Ａ～３７Ｃは、異なる条件下でのトリ培養物におけるＣ３分泌を示す。図３７Ａは、播種されたアストロサイトの数が増加した（５０Ｋ）トリ培養物は、７日目においてミクログリア細胞が少なかった（ＩＢＡ１＋）ことを示す（５×）。図３７Ｂは、トリ培養ＮＢ／ＢＡＧＣおよびＮＢ：Ｎ２基礎培地製剤におけるＣ３の分泌が、すべての被検細胞培養の中で最も低かったことを示す。図３７Ｃは、７０％メタノールで３０分間インキュベートすることによって殺傷されたｈＰＳＣ由来ニューロンは明るいＣＣ３＋を示し、生存細胞は示さなかったことを示す。 同上。 同上。
図３８Ａ～３８Ｃは、ハイコンテントイメージング顕微鏡を使用した免疫蛍光によるＩＢＡ＋細胞の定量化を示す。図３８Ａは、ウェルの９フィールドのＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓ顕微鏡を使用して、ミクログリア／ニューロン（Ｍ／Ｎ）のＭ／Ｎ培養物における％ＩＢＡ１＋／ＤＡＰＩの細胞スコアリングが、７日目におけるトリ培養物と比較して高く評価されたことを示す。図３８Ｂは、ＤＡＰＩおよびＩＢＡ１染色を示す細胞スコアリング用のウェルの９フィールドの定量化の代表的な画像を示す。図３８Ｃは、異なるトリ培養物（ＴＲＩ、Ｃ３ＫＯＭ、Ｃ３ＫＯＡ）間で同数のＩＢＡ１＋ミクログリアおよびＧＦＡＰ＋アストロサイトを示す細胞スコアリングを示す。
本開示は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）に由来するミクログリア細胞を生成するための方法、そのような方法から得られたミクログリア細胞ならびにそれを含む組成物、ミクログリア関連障害を疾患モデリングするためおよび処置するためのそのようなミクログリア細胞の使用に関する。
本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、ａ）幹細胞をウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と最大約２４時間接触させるステップ；ｂ）細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤および少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させて、分化細胞の集団を得るステップであって、分化細胞が少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ステップ；ならびにｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップを含む。
ある特定の実施形態では、ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップは、分化細胞をニューロンと少なくとも約５日間培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップは、分化細胞をニューロンと４日間培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップは、分化細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと少なくとも約５日間接触させるステップ；および細胞をニューロンと少なくとも約５日間培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞をニューロンと少なくとも４日間培養するステップを含む。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と１８時間接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約１日から最大約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも１日から最大４日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約２日間接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日から最大約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも３日から最大１１日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと７日、８日、９日、１０日、または１１日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、ニューロンと約５日間培養する。ある特定の実施形態では、細胞は、ニューロンと４日または５日間培養する。
ある特定の実施形態では、幹細胞をＷｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と接触させるステップは、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞を生成する。ある特定の実施形態では、前記少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーは、ブラキュリ、ＫＤＲおよびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞をＷｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と接触させるステップは、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞を生成する。ある特定の実施形態では、前記少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーは、ＫＤＲ、ＣＤ２３５Ａ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞を少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させるステップは、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞をさらに生成する。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日から最大約５日および／または最大約１０日間接触させて、少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞を生成する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＥＭＰマーカーが、Ｋｉｔ、ＣＤ４１、ＣＤ２３５Ａ、ＣＤ４３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞はＣＤ４５を発現しない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーは、ＣＤ４５、ＣＳＦ１Ｒ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞は、Ｋｉｔを発現しない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーは、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＵ．１、ＣＤ４５、ＩＢＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＳＡＬＬ１、ＧＰＲ３４、Ｃ１ＱＡ、ＣＤ６８、ＣＤ４５、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのマクロファージマーカーは、ＣＤ１１Ｂ、デクチン、ＣＤ１４、ＰＵ．１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ４５およびこれらの組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ－１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、ＷＡＹ－３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４、ＤＣＡ、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＩＷＲ１、ペプチド（Ｎｉｌｅらのペプチド（Ｎｉｌｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１８ Ｊｕｎ；１４（６）：５８２－５９０））、ポーキュパイン（ｐｏｒｃｃｕｐｉｎｅ）阻害剤、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＥＴＣ－１５９、Ａｎｔ１．４Ｂｒ／Ａｎｔ１．４Ｃｌ、ニクロサミド、アピクラレン、バフィロマイシン、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ピルビニウム、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ジアミノ－キナゾリン、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ＰＫＦ１１５－５８４、ＢＣ２０５９、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤はＩＷＰ２である。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、インターロイキン、ＴＰＯ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ－６、ＩＬ－３、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＦＧＦはＦＧＦ２である。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインは、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４およびこれらの組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１μＭから約６μＭの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１μＭから約１０μＭの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団であって、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が、本明細書において開示する分化の方法による幹細胞に由来する細胞集団を提供する。そのような細胞集団を含む組成物も提供する。
別の態様では、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤；（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子；（ｃ）少なくとも１つの造血促進サイトカイン；および（ｄ）ニューロンを含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ｅ）少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、キットは、幹細胞を少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞にする分化を誘導するための説明書をさらに含む。
別の態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、集団に含まれる細胞の少なくとも約５０％が少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現し、集団に含まれる細胞の約２５％未満が、幹細胞マーカー、中胚葉前駆体マーカー、一次造血先駆体マーカー、ＥＭＰマーカー、プレマクロファージマーカー、マクロファージマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、対象における神経変性疾患を予防および／または処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、以下のもののうちの１つを対象に投与するステップを含む：（ａ）本明細書において開示する分化ミクログリア細胞の集団；（ｂ）本明細書において開示する組成物；および（ｃ）本明細書において開示する組成物。ある特定の実施形態では、方法は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）を対象に投与するステップを含む。
ある特定の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。ある特定の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
ある特定の実施形態では、ＣＳＦは、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびＭ－ＣＳＦからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＣＳＦはＧＭ－ＣＳＦである。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の予防および／または処置における使用のためのＣＳＦを提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患を予防および／または処置するための医薬を製造するためのＣＳＦの使用を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）請求項３４に記載の分化ミクログリア細胞の集団を被検化合物と接触させるステップであって、ミクログリア細胞が、神経変性疾患を有する対象から得られた幹細胞に由来する、ステップ；および（ｂ）ミクログリア細胞の機能的活性を測定するステップを含み、ミクログリア細胞の機能的活性における変化が、被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す方法を提供する。
ある特定の実施形態では、変化は、減少または増加である。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞の機能的活性は補体Ｃ３の放出を含む。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞から放出された補体Ｃ３における減少は、治療用化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞の機能的活性は、ミクログリア細胞によるアミロイド－ベータ食作用を含む。ある特定の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）被検化合物を本明細書において開示する分化ミクログリア細胞、アストロサイトの集団、およびニューロンの集団を含む組成物と接触させるステップ；ならびに（ｂ）ニューロンの神経毒性を測定するステップを含み、被検化合物と接触させた後のニューロンの神経毒性における減少が、被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す方法を提供する。ある特定の実施形態では、神経変性疾患はＡＬＳ疾患である。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、ニューロンに対する神経毒性を誘導する反応性アストロサイトを誘導する。
本開示は、卵黄嚢の一次造血を再現し、マクロファージに成熟する前のプレ－マクロファージ（ｐＭａｃ）を単離し、これらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで神経ニッチで培養して、真正なヒトミクログリア細胞をわずか１６日で生成する段階的な発生パラダイムを提供する。
本開示を明確にするために、限定を目的とするものではないが、詳細な説明を以下の副項目に分けることにする：
５．１定義；
５．２幹細胞を分化させる方法；
５．３ミクログリアを含む組成物；
５．４処置方法；および
５．５キット
５．６治療用化合物をスクリーニングする方法
５．１定義
本明細書において使用する用語は、本発明の文脈内でおよび各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野でのそれらの通常の意味を概して有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれを作製および使用するための方法の説明において施術者に追加の指導を提供するために、以下でまたは本明細書における他の箇所で説明する。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される特定の値に関して許容される誤差範囲内を意味し、これは、どのように値が測定されたかまたは判定されたかに、すなわち、測定システムの制限に一部依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従って、３標準偏差以内または３標準偏差を超えることを意味していてもよい。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味していてもよい。あるいは、特に生体系またはプロセスに関しては、その用語は、値の一桁の範囲内、例えば、５倍の範囲内、または２倍の範囲内を意味していてもよい。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関連する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質に結合するリガンドまたは一部の他の刺激によって活性化されるか、そうでなければ影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＳＭＡＤ、ウィングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質があり、ベータ－カテニン、ＮＯＴＣＨ、転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質を含む。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質に関しては、リガンド－受容体相互作用は、細胞の応答に直接関連しない。リガンド活性化受容体は、細胞内部の他のタンパク質と最初に相互作用してから、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じることがある。多くの場合、いくつかの相互作用細胞タンパク質の鎖の挙動は、受容体が活性化または阻害された後に変化する。受容体活性化によって誘導された一連の細胞変化全体を、シグナル伝達機序またはシグナル伝達経路と称する。
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞構造および機能における変化を制御する内部および外部因子を指す。これらは本質的に化学的または物理的であり得る。
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、ＴＦＧβ、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。
本明細書で使用される場合、「阻害剤」は、分子または経路のシグナル伝達機能に干渉する（例えば、低下させる、減少させる、抑制する、排除する、またはブロックする）化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、１つの例として、Ｗｎｔシグナル伝達に直接接触すること、Ｗｎｔ ｍＲＮＡに接触すること、Ｗｎｔの立体配座に変化をもたらすこと、Ｗｎｔタンパク質レベルを低下させること、またはシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書において記載するものを含む）とのＷｎｔ相互作用に干渉すること、およびＷｎｔ標的遺伝子（例えば本明細書において記載するもの）の発現に影響を与えることを介して、指定されたタンパク質（シグナル伝達分子、指定されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定された関連分子、例えば、ウィングレス（Ｗｎｔ））（例えば、これらに限定されないが、本明細書において記載するシグナル伝達分子がある）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であってもよい。阻害剤としては、上流シグナル伝達分子（例えば、細胞外ドメイン内の、シグナル伝達分子の例）を遮断することによってＷｎｔ生物活性を間接的に制御する分子もある。阻害剤は、指定されたシグナル伝達分子から上流の分子に結合し、影響を与え、指定された分子の阻害をもたらすことによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を除外するまたは減少させるような様式で活性部位に結合する）およびアロステリック（ａｌｌｏｓｔｅｎｃ）阻害（タンパク質の活性部位への化合物の結合に干渉する様式でタンパク質の立体配座を変化させる方法でタンパク質に結合する）の観点から記載されている。阻害剤は、シグナル伝達標的に実際に接触させることによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接阻害剤」であってもよい。
本明細書で使用される場合、「活性化因子」は、分子または経路、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達、またはＦＧＦシグナル伝達の活性化シグナル伝達機能を増加させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、または強化する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、同様のコア構造を有する化学化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００個の細胞を含む場合がある。集団は、１つの細胞タイプを含む純粋な集団であってもよい。あるいは、集団は、１つを超える細胞タイプ、例えば、混合細胞集団を含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養物中で無期限に分裂し、特殊な細胞をもたらす能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトからの幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、着床前段階の胚由来の原始（未分化）細胞を指し、培養物中で、長期間分化することなく分裂することができ、３つの主要な胚葉の細胞および組織に発達することが公知である。ヒト胚性幹細胞は、ヒトからの胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、胚盤胞段階までの初期段階のヒト胚由来の多能性幹細胞（「ＰＳＣ」）のタイプを指し、培養物中で、分化することなく長期間分裂することができ、３つの主要な胚葉の細胞および組織に発達することが公知である。
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞株」という用語は、最大数日、数カ月から数年まで分化せずに増殖を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
本明細書で使用される場合、「全能性」という用語は、身体の全ての細胞タイプに加えて、胚体外組織、例えば胎盤を占める細胞タイプの全てをもたらす能力を指す。
本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、身体の１つを超える細胞タイプに発達する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む生物の３つの発生胚葉に発達する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞と同様の多能性幹細胞のタイプを指し、ある特定の胚遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６， ６６３－６７６ （２００６）を参照のこと）を体細胞、例えばＣＩ４、Ｃ７２などに導入することによって形成される。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵子または精子）以外の身体内の任意の細胞を指し；ときとして「成体」細胞と称される。
本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、自己複製（実験室での）と分化の両方に関する能力が限られている、多くの臓器および分化組織で認められる比較的稀な未分化細胞を指す。そのような細胞は、その分化能力が異なるが、起源の臓器における細胞タイプに通常は限定される。
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体およびその突起－軸索および少なくとも１つの樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数における増加を指す。
本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、特殊な細胞タイプにまだ発達していない細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化されていない胚細胞が特殊な細胞、例えば心臓、肝臓、または筋肉細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれているタンパク質が関与するシグナル伝達経路を介して、細胞の遺伝子と細胞外の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。
本明細書で使用される場合、「定向分化」という用語は、特定の（例えば、所望の）細胞タイプ、例えばＥＭＰへの分化に誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。
本明細書で使用される場合、幹細胞に関連する「定向分化」という用語は、多能性状態からより成熟したまたは特殊な細胞運命（例えばｐＭａｃ、マクロファージ、ミクログリアなど）への幹細胞の移行を促進するための小分子、増殖因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
本明細書で使用される場合、細胞に関連する「分化の誘導」という用語は、初期状態の細胞タイプ（遺伝子型および／または表現型）を非初期状態の細胞タイプ（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、「幹細胞における分化の誘導」は、幹細胞とは異なる特性、例えば遺伝子型（例えば、遺伝的分析、例えばマイクロアレイによって判定されるような遺伝子発現における変化）および／または表現型（例えば、タンパク質、例えばミクログリアマーカーの発現における変化）を有する子孫細胞に分裂するように幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、研究または医療的処置のための人工培地中でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、培養容器、例えばペトリ皿、マルチウェルプレートなどの中の細胞を覆い、細胞に栄養を与えて支持するための栄養素を含む液体を指す。培養培地は、細胞において所望の変化を産生するために添加される増殖因子を含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、細胞を化合物（例えば、少なくとも１つの阻害剤、活性化因子、および／または誘導物質）と「接触させること」という用語は、細胞に触れることを可能にするであろう位置に化合物を置くことを指す。接触させることは、任意の好適な方法を使用して達成してもよい。例えば、接触させることは、化合物を細胞の管に添加することによって達成することができる。接触させることは、化合物を、細胞を含む培養培地に添加することによって達成することもできる。それぞれの化合物（例えば、本明細書において開示する阻害剤、活性化因子、および誘導物質）は、溶液（例えば、濃縮溶液）のままで細胞を含む培養培地に添加することができる。あるいはまたはさらに、化合物（例えば、本明細書において開示する阻害剤、活性化因子、および誘導物質）ならびに細胞は、製剤化された細胞培養培地中に存在していてもよい。
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、これらに限定されるものではないが、試験管および細胞培養を例示したものである。
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関する「発現すること」という用語は、アッセイ、例えばマイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどを使用して観察することができるｍＲＮＡまたはタンパク質を作製することを指す。
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞タイプを同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に関するマーカーは、１つのマーカーに限定されない場合があり、マーカーは、マーカーの指定されたグループが別の細胞または細胞タイプから細胞または細胞タイプを同定できるような、マーカーの「パターン」を指していてもよい。
本明細書で使用される場合、本明細書において開示する任意の細胞に言及する場合、「に由来する」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、任意の操作、例えば、限定するものではないが、単一細胞の単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線を使用した処置および／または突然変異誘発、ウイルスを用いた感染、モルフォゲンなどを用いたＤＮＡ配列のトランスフェクション、培養された親細胞中に含まれる任意の細胞の選択（例えば連続培養によって）を使用して、細胞株、組織（例えば、解離した胚）または体液中の親細胞から得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。由来細胞は、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などに対する応答によって混合集団から選択してもよい。
本明細書において、「個体」または「対象」は、脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、霊長目、家畜、スポーツ動物、齧歯動物およびペットがある。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、およびモルモット；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；および非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルがある。
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織、または臓器の正常な機能にダメージを与えるかまたは干渉する任意の状態または障害を指す。
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、処置される個体または細胞の疾患の進行を変化させるための試みにおける臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床的病状の進行中に行ってもよい。処置の治療効果としては、限定するものではないが、疾患の出現または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状況の改善または緩和、および寛解または予後の改善がある。疾患または障害の進行を予防することで、罹患したもしくは診断された対象または障害を有する疑いがある対象における障害に起因する悪化を処置によって予防することができるだけではなく、障害の危険性があるかまたは障害を有する疑いがある対象における障害の発症または障害の症状が処置によって予防される場合がある。
５．２．幹細胞を分化させる方法
本開示は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定的な例としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、原始胚細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆ－クラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的分化ができる任意の他の細胞がある。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。
本開示は、幹細胞由来ミクログリア細胞を対象とする。ある特定の実施形態では、幹細胞のミクログリア細胞への分化としては、幹細胞の少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、少なくとも１つのプレマクロファージ（マクロファージ先駆体としても公知である）を発現する細胞（ｐＭａｃ）マーカーへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、および少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞の少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化がある。ある特定の実施形態では、幹細胞のミクログリア細胞への分化としては、さらに、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞の少なくとも１つのマクロファージマーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、および少なくとも１つのマクロファージマーカーを発現する細胞の少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化がある。
ある特定の実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を誘導するための方法であって、ａ）幹細胞をウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と接触させるステップ；ｂ）細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤および少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させて、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞、およびこれらの組合せからなる群から選択される分化細胞の集団を得るステップ；ならびにｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップは、分化細胞をニューロンと培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への分化細胞の分化を誘導するステップは、分化細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと接触させるステップ；および細胞をニューロンと培養するステップを含む。
５．２．１．幹細胞の中胚葉前駆体への分化
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）をＷｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）（「Ｗｎｔ活性化因子」と称される）と接触させることによって幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤、例えば、ＢＭＰ分子（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）とさらに接触させる。
中胚葉前駆体マーカーの非限定的な例としては、ブラキュリ、ＫＤＲおよびこれらの組合せがある。
本明細書で使用される場合、リガンドに関連する「Ｗｎｔ」または「ウィングレス」という用語は、Ｗｎｔ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリー内の受容体と相互作用することができる分泌タンパク質のグループ（すなわちヒトにおけるＩｎｔ１（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ １））を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関連する「Ｗｎｔ」または「ウィングレス」という用語は、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成され、β－カテニンの有無にかかわらず介在されるシグナル経路を指す。本明細書において記載する目的に関しては、好ましいＷｎｔシグナル伝達経路としては、β－カテニン、例えば、ＷＮＴ／－カテニンによる介在がある。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。したがって、Ｗｎｔ活性化因子はＧＳＫ３β阻害剤であってもよい。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｄｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００６；１１９：３９５－４０２；Ｋｉｋｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ２００７；１９：６５９－６７１を参照されたい。本明細書で使用される場合、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００３；１１６：１１７５－１１８６を参照されたい。
Ｗｎｔ活性化因子またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例は、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓ （２０１２）、およびＣａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１５ Ａｕｇ １９；３５（３３）：１１４６２－８１で開示されており、これらは、その全体が参照により組み込まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。
「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３－［３－（２－カルボキシエチル）－４－メチルピロール－２－メチリデニル］－２－インドリノン」としても公知である）は、以下の式を有するＩＵＰＡＣ名６－（２－（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。
Figure 2022511385000002
ＣＨＩＲ９９０２１は高選択的であり、関連および非関連キナーゼのパネルに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭ、齧歯動物ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。
Ｗｎｔ活性化因子の非限定的な例としては、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ－１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、ＷＡＹ－３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４、ＤＣＡ、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、これらの誘導体、およびこれらの組合せがある。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。
ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性薬剤はＢＭＰ分子である。ＢＭＰの非限定的な例としては、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、これらの誘導体、およびこれらの混合物がある。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性薬剤はＢＭＰ４である。
アクチビンタンパク質の非限定的な例としては、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＣ、これらの誘導体、およびこれらの組合せがある。ある特定の実施形態では、アクチビンタンパク質はアクチビンＡである。
幹細胞を少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、幹細胞をＷｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と最大約１０時間、最大約１５時間、最大約２０時間、または最大約２５時間接触させてもよい。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と最大約２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、または少なくとも約２５時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１０時間から約２５時間の間、約１０時間から約１５時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１５時間から約２５時間の間、または約１５時間から約２０時間の間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１０時間から約２０時間の間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１５時間から約２０時間の間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１０時間、約１５時間または約２０時間、または約２５時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１５時間または約２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、または２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と１８時間接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、幹細胞を少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）とさらに接触させてもよい。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔ活性化因子、ＢＭＰ活性剤およびアクチビンタンパク質と同時にまたは付随して接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質と同時に最大約１０時間、最大約１５時間、最大約２０時間、または最大約２５時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、または少なくとも約２５時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に約１０時間から約２５時間の間、約１０時間から約１５時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１５時間から約２５時間の間、または約１５時間から約２０時間の間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に約１５時間から約２０時間の間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質と同時に約１５時間または約２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＷｎｔ活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質と同時に１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間，１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、または２５時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に約２０時間接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に１８時間接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１μＭから約１００μＭ、約１μＭから約２０μＭ、約１μＭから約１５μＭ、約１μＭから約１０μＭ、約１μＭから約６μＭ、約６μＭから約１０μＭ、約６μＭから約１５μＭ、約１５μＭから約２０μＭ、約２０μＭから約３０μＭ、約３０μＭから約４０μＭ、約４０μＭから約５０μＭ、約５０μＭから約６０μＭ、約６０μＭから約７０μＭ、約７０μＭから約８０μＭ、約８０μＭから約９０μＭ、または約９０μＭから約１００μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１μＭから約６μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約３μＭの濃度で接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌから約７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌから約８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌから約９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約２０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌから約７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌから約８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌから約９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約７．５ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。
５．２．２．中胚葉前駆体の一次造血先駆体への分化
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞は、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞をＷｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤（「Ｗｎｔ阻害剤」と称される）（例えば、ＩＷＰ２）と接触させることによって少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ分子、例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）とさらに接触させる。一次造血先駆体マーカーの非限定的な例としては、ＫＤＲ、ＣＤ２３５Ａ、およびこれらの組合せがある。
「Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤」または「Ｗｎｔ阻害剤」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｗｎｔタンパク質の正常機能を直接阻害することによって作用し得る任意の薬剤だけではなく、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、したがってＷｎｔの機能を再現する任意の薬剤を指す。Ｗｎｔ阻害剤の例としては、ＸＡＶ９３９（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４６１：６１４－６２０ （２００９））、ビタミンＡ（レチノイン酸）、リチウム、フラボノイド、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）（ＷＯ２００９／１３１１６６）、およびβ－カテニンに対するｓｉＲＮＡがある。
Ｗｎｔ阻害剤の非限定的な例としては、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ化合物、ＩＷＰ化合物（例えば、ＩＷＰ－２）、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質１）、ＩＷＲ１、ペプチド（Ｎｉｌｅらのペプチド（Ｎｉｌｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１８ Ｊｕｎ；１４（６）：５８２－５９０））、ポーキュパイン阻害剤、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＥＴＣ－１５９、Ａｎｔ１．４Ｂｒ／Ａｎｔ１．４Ｃｌ、ニクロサミド、アピクラレン、バフィロマイシン、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ピルビニウム、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ジアミノ－キナゾリン、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ＰＫＦ１１５－５８４、ＢＣ２０５９、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ、これらの誘導体、およびこれらの組合せがある。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤はＩＷＰ２である。
Ｗｎｔ阻害剤は、ＷＯ０９１５５００１およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：１００－７ （２００９）に記載のものであってもよく、これらは、その全体が参照により組み込まれる。
ＸＡＶ９３９は強力なタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）１および２の小分子阻害剤であり、１１および４ｎＭのＩＣ５０値をそれぞれ有する。Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４６１：６１４－６２０ （２００９）。ＴＮＫＳ活性を阻害することによって、ＸＡＶ９３９は、アキシン－ＧＳＫ３β複合体のタンパク質レベルを増加させ、ＳＷ４８０細胞におけるβ－カテニンの分解を促進する。公知のＷｎｔ阻害剤としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、Ｗｎｔ阻害性因子１（ＷＩＦ－１）、およびＳｏｇｇｙもある。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質ファミリー（Ｄｋｋ－１から４）のメンバーは分泌タンパク質であり、２つのシステインリッチドメインを有し、リンカー領域によって分離されている。Ｄｋｋ－３および－４は、１つのプロキネチシンドメインも有する。Ｄｋｋ－１、－２、－３、および－４は、ＬＲＰ５／６に結合することによって標準的なＷｎｔシグナル伝達のアンタゴニストとして機能し、ＬＲＰ５／６のＷｎｔ－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ複合体との相互作用を予防する。Ｄｋｋ－１、－２、－３、および－４は、細胞表面Ｋｒｅｍｅｎ－１または－２にも結合し、ＬＲＰ５／６の内部移行を促進する。Ｄｋｋ－３の拮抗活性は実証されていない。Ｄｋｋタンパク質は、成体および胚組織において異なる発現パターンを有し、組織発生および形態形成に対して広範囲の影響を有する。
Ｄｋｋファミリーとしては、Ｓｏｇｇｙもあり、これはＤｋｋ－３と相同であるが他のファミリーメンバーとは相同ではない。ｓＦＲＰは、膜結合Ｆｒｉｚｚｌｅｄと類似している５つのＷｎｔ－結合糖タンパク質のファミリーである。Ｗｎｔ阻害剤の最大のファミリーであるこれらは、２つのグループを含み、１つ目はｓＦＲＰ１、２、および５からなり、２つ目はｓＦＲＰ３および４を含む。全てが分泌され、特有の遺伝子由来であり、全てＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの代替のスプライス形態ではない。各ｓＦＲＰは、Ｎ－末端システインリッチドメイン（ＣＲＯ）を含む。他のＷｎｔ阻害剤としては、Ｗｎｔタンパク質に結合し、その活性を阻害する分泌タンパク質であるＷＩＦ－１（Ｗｎｔ阻害性因子１）がある。
「ＩＷＰ２」または「ＷＮＴ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－２阻害剤」は、以下の式を有するＩＵＰＡＣ名Ｎ－（６－メチル－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－２－［（４－オキソ－３－フェニル－６，７－ジヒドロチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセトアミド」を指す：
Figure 2022511385000003
ＩＷＰ－２は、経路活性化因子ポーキュパインのレベルでＷＮＴ経路を阻害する（ＩＣ５０＝２７ｎＭ）。ポーキュパインは、ＷＮＴタンパク質をパルミトイル化する膜結合型アシルトランスフェラーゼであり、ＷＮＴ分泌およびシグナル伝達能力をもたらす。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約１日、または少なくとも約２日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約２日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と最大約１日、最大約２日、最大約３日、または最大約４日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と最大４日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１日から約５日の間、約１日から約４日の間、約１日から約３日の間、または約１日から約２日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と２日から約５日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と１日から３日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１日間、約２日間、約３日間、または約４日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と１日、２日、３日、または４日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約２日間接触させる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞を少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞を少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）とさらに接触させてもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、Ｗｎｔ阻害剤、ＢＭＰ活性剤およびアクチビンタンパク質と同時にまたは付随して接触させる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、または少なくとも約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に最大約１日、最大約２日、最大約３日、最大約４日、または最大約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１日から約５日の間、約１日から約４日の間、約１日から約３日の間、または約１日から約２日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に１日から約３日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に１日、２日、３日、４日、または５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤（例えば、ＢＭＰ４）、および少なくとも１つのアクチビンタンパク質（例えば、アクチビンＡ）と同時に約２日間接触させる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１μＭから約１００μＭ、約１μＭから約２０μＭ、約１μＭから約１５μＭ、約１μＭから約１０μＭ、約１μＭから約５μＭ、約５μＭから約１０μＭ、約５μＭから約１５μＭ、約１５μＭから約２０μＭ、約２０μＭから約３０μＭ、約３０μＭから約４０μＭ、約４０μＭから約５０μＭ、約５０μＭから約６０μＭ、約６０μＭから約７０μＭ、約７０μＭから約８０μＭ、約８０μＭから約９０μＭ、または約９０μＭから約１００μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１μＭから約１０μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１μＭから約５μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約２μＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と上述の濃度のうちのいずれか１つで毎日、隔日または２日ごとに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約２μＭの濃度で毎日接触させる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌから約７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌから約８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌから約９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約３０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と上述の濃度のうちのいずれか１つで毎日、隔日または２日ごとに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＢＭＰ活性剤と約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日接触させる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌから約７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌから約８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌから約９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と上述の濃度のうちのいずれか１つで毎日、隔日または２日ごとに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのアクチビンタンパク質と約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日接触させる。
５．２．３．一次造血先駆体のＥＭＰ、ｐＭａｃ、およびこれらの組合せの細胞集団への分化
ある特定の実施形態では、分化細胞の細胞集団は、細胞を少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させることによって少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化し、分化細胞は、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、造血促進サイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、ＶＥＧＦおよびＦＧＦシグナル伝達活性化因子がある。ある特定の実施形態では、造血促進サイトカインとしては、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２がある。
ある特定の実施形態では、分化は、２つの段階：（１）一次造血先駆体の赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）への分化；および（２）ＥＭＰのｐＭａｃへの分化を伴う。ある特定の実施形態では、分化の両方の段階を誘導する分子は造血促進サイトカインである。例えば、第１の段階に関与する造血促進サイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、ＶＥＧＦおよびＦＧＦシグナル伝達活性化因子がある。ある特定の実施形態では、第１の段階に関与する造血促進サイトカインとしては、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２がある。第２の段階に関与する造血促進サイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）がある。ある特定の実施形態では、第２の段階に関与する造血促進サイトカインとしては、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、およびＴＰＯがある。
ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－細胞とＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞の両方の集団を含む未選別の試料は、選別されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋集団とほぼ同じ効率で造血細胞を産生することが発見され、これは造血細胞の強力な産生のために、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞を精製することを必要としないことを裏付ける。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現しない細胞を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞は、細胞集団を少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させる前に、細胞集団から選別または単離されていない。
ＥＭＰマーカーの非限定的な例としては、Ｋｉｔ、ＣＤ４１、ＣＤ２３５Ａ、ＣＤ４３、およびこれらの組合せがある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞は、ＣＤ４５を発現しない。
プレマクロファージ（ｐＭａｃ）マーカーの非限定的な例としては、ＣＤ４５、ＣＳＦ１Ｒおよびこれらの組合せがある。
造血促進サイトカインの非限定的な例としては、ＶＥＧＦ、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子、ＳＣＦ、インターロイキン、ＴＰＯおよびこれらの組合せがある。ＦＧＦシグナル伝達活性化因子（「ＦＧＦ活性化因子」と称される）の非限定的な例としては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、これらの誘導体、およびこれらの混合物がある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＦＧＦ活性化因子はＦＧＦ２である。インターロイキンの非限定的な例としては、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、およびＩＬ－１５がある。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ６、ＩＬ－３、これらの誘導体、およびこれらの混合物である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＴＰＯ、またはこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、およびＴＰＯを含む。
少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞を少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞を少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、または少なくとも約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと最大約１日、最大約２日、最大約３日、最大約４日、または最大約５日、または最大約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと最大約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１日から約５日の間、約１日から約１０日の間、または約５日から約１０日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１日から約５日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと５日から約１０日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間、または約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約２日または約５日、または約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと２日間、６日間または８日間接触させる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦシグナル伝達活性化因子、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２を含む。
少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞を少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるために、少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞を少なくとも１つの造血促進サイトカインと最大約２日、最大約３日、最大約４日、最大約５日、または最大約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと最大約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと最大６日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、または少なくとも約６日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約２日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約２日から約１０日の間、約２日から約５日の間、または約５日から約１０日の間、約２日から約３日の間、約３日から約６日の間、または約３日から約５日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約２日から約５日の間、または約５日から約１０日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約２日、約３日、約４日、約５日、または約６日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約５日間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと４日または６日間接触させる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＳＣＦ、インターロイキン、およびＴＰＯを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、およびＴＰＯを含む。
ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約３００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌから約７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌから約８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌから約９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約５ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約５０ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと上述の濃度のうちのいずれか１つで毎日、隔日または２日ごとに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの造血促進サイトカインと約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、または約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日接触させる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの造血促進サイトカインは、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＴＰＯ、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は約１５ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＦＧＦ２の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＦＧＦ２の濃度は約５ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＳＣＦの濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＳＣＦの濃度は約１００ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＳＣＦの濃度は約２００ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－６の濃度は、約２ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－６の濃度は約１０ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－６の濃度は約２０ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－３の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－３の濃度は約３０ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＴＰＯの濃度は、約３ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＴＰＯの濃度は約３０ｎｇ／ｍｌである。
５．２．４．ＥＭＰおよび／またはｐＭａｃのミクログリア細胞への分化
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞は、分化細胞をニューロンと培養することによって第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞は、（例えば、少なくとも１つのマクロファージマーカーを発現する細胞、例えば、マクロファージを生成するために）分化細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと接触させること；および細胞（例えば、マクロファージ）をニューロンと培養することによって、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのマクロファージマーカーを発現する細胞（例えば、マクロファージ）としては、少なくとも１つの原始マクロファージマーカーを発現する細胞（例えば、原始マクロファージ）がある。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞の純粋で同調した集団は、細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと接触させ、細胞をニューロンと培養することによって産生／生成される。ある特定の実施形態では、細胞集団における細胞の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％は、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する。ある特定の実施形態では、細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと接触させ、次いで細胞をニューロンと培養すると、細胞をもう１つのマクロファージ促進サイトカインと接触させずに細胞をニューロンと培養するのと比較してより高い純度のミクログリア細胞の集団が得られる。
ミクログリアマーカーの非限定的な例としては、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＵ．１、ＣＤ４５、ＩＢＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＳＡＬＬ１、ＧＰＲ３４、Ｃ１ＱＡ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ４５、およびこれらの組合せがある。
マクロファージマーカーの非限定的な例としては、ＣＤ１１Ｂ、デクチン、ＣＤ１４、ＰＵ．１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ４５、およびこれらの組合せがある。
原始マクロファージマーカーの非限定的な例としては、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１１Ｂ、およびこれらの組合せがある。
ニューロンの非限定的な例としては、皮質投射ニューロン、運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、介在ニューロン、および末梢感覚ニューロンがある。
マクロファージ促進サイトカインの非限定的な例としては、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３＿およびこれらの組合せがある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインは、Ｍ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４を含む。
ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）およびマクロファージをニューロンと少なくとも約５日間、少なくとも約１０日、または少なくとも約１５日培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと少なくとも約５日、例えば、４日間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと最大約５日、最大約１０日、または最大約１５日間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと最大約１０日または約１５日間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと約５日から約１０日の間、約１０日から約１５日の間、または約５日から約１５日の間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと約５日から約１０日の間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと約５日、または約１０日、または約１５日間培養する。ある特定の実施形態では、分化細胞およびマクロファージをニューロンと４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日間培養する。
ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと少なくとも約５日、少なくとも約１０日（例えば、少なくとも９日または少なくとも１１日）、または少なくとも約１５日間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと少なくとも約５日または少なくとも約１０日間（例えば、少なくとも１１日）接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと最大約５日、最大約１０日、または最大約１５日間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと最大約１０日または最大約１５日間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約５日から約１５日の間、約５日から約１０日の間、または約１０日から約１５日の間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約５日から約１０日の間または約１０日から約１５日の間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約７日から約１１日の間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約５日間、または約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日間接触させる。
ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌ、または約１５０ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌから約２５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌから約６０ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、または約８０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと上述の濃度のうちのいずれか１つで毎日、隔日または２日ごとに接触させる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日接触させる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインは、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、Ｍ－ＣＳＦの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、Ｍ－ＣＳＦの濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－３４の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌの間である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－３４の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌである。
ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインが添加された無血清培養培地中で培養する。ある特定の実施形態では、無血清培養培地は、約７５％のＩＭＤＭ（イスコープの改変ダルベッコ培地）、約２５％のＦ１２培地を含む。ある特定の実施形態では、無血清培養培地は、Ｂ２７、Ｌ－グルタミンをさらに含む。
ある特定の実施形態では、第５．２．３項に記載の方法に従って得られた分化細胞（すなわち、少なくとも１つのｐＭａｃマーカーを発現する細胞および／または少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞）は、血清および少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインが添加された培養培地中で培養する。
細胞培養培地
ある特定の実施形態では、上述の阻害剤、活性化因子、およびサイトカインは、本明細書において開示する細胞を含む細胞培養培地に添加する。好適な細胞培養培地としては、これらに限定されるものではないが、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、Ｎ２培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（例えば、Ｎ２およびＢ－２７（登録商標）サプリメントが添加されたＮＢ培地）がある。ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、Ｅ８／Ｅ６培地およびＮＢ培地は市販されている。
ＫＳＲ培地は、培養物中の未分化ｈＥＳＣ細胞を成長させ、維持するために最適化された定義済みの無血清製剤である。ＫＳＲ培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２で開示されている。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｌ－グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ、および１３－メルカプトエタノールを含む。ある特定の実施形態では、１リットルのＫＳＲ培地は、８２０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、１５０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１０ｍＬの２００ｍＭＬ－グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ、および５５μΜの１３－メルカプトエタノールを含み得る。
Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大を支えるフィーダー不含および異種不含培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞の再プログラミングを支えることが立証されている。更に、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣを培養するためのカスタム培地を製剤化するためのベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の１つの例は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１１ Ｍａｙ；８（５）：４２４－９に記載されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。Ｅ８／Ｅ６培地の１つの例は、ＷＯ１５／０７７６４８で開示されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が活性ＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まないという点において、ＫＳＲ培地とは異なる。
Ｎ２サプリメントは、培養物中の未分化神経幹細胞および前駆細胞を拡大するために使用する、化学的に定義済みの動物不含サプリメントである。Ｎ２サプリメントは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地での使用を意図する。Ｎ２培地の構成成分はＷＯ２０１１／１４９７６２で開示されている。ある特定の実施形態では、Ｎ２培地は、グルコース、重炭酸ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびインスリンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。ある特定の実施形態では、１リットルのＮ２培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末を含む、９８５ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏ、１．５５ｇのグルコース、２．００ｇの重炭酸ナトリウム、プトレシン（１００ｍＬの蒸留水中に溶解した１．６１ｇのアリコート１００μＬ）、プロゲステロン（１００ｍＬの１００％エタノール中に溶解した０．０３２ｇのアリコート２０μＬ）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中の０．５ｍＭの溶液６０μＬのアリコート）、１００ｍｇのトランスフェリン、および５ｍＭのＮａＯＨ １０ｍＬ中の２５ｍｇのインスリンを含む。
５．３ミクログリア細胞を含む組成物
本開示は、本明細書の例えば、第５．２項で記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化方法によって産生された分化ミクログリア細胞の集団を含む組成物を提供する。
さらに、ここで開示される主題は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、集団に含まれる細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）は、少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現し、集団に含まれる細胞の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）は、幹細胞マーカー、中胚葉前駆体マーカー、一次造血先駆体マーカー、ＥＭＰマーカー、プレマクロファージマーカー、マクロファージマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する組成物を提供する。
幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３がある。
中胚葉前駆体マーカーの非限定的な例としては、ブラキュリ、ＫＤＲ、およびこれらの組合せがある。
一次造血先駆体マーカーの非限定的な例としては、ＫＤＲ、ＣＤ２３５Ａおよびこれらの組合せがある。
ＥＭＰマーカーの非限定的な例としては、Ｋｉｔ、ＣＤ４１、ＣＤ２３５Ａ、ＣＤ４３、およびこれらの組合せがある。
プレマクロファージマーカーの非限定的な例としては、ＣＤ４５、ＣＳＦ１Ｒおよびこれらの組合せがある。
ミクログリアマーカーの非限定的な例としては、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＵ．１、ＣＤ４５、ＩＢＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＳＡＬＬ１、ＧＰＲ３４、Ｃ１ＱＡ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ４５、およびこれらの組合せがある。
マクロファージマーカーの非限定的な例としては、ＣＤ１１Ｂ、デクチン、ＣＤ１４、ＰＵ．１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ４５、およびこれらの組合せがある。
ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４から約１×１０１０、約１×１０４から約１×１０５、約１×１０５から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０６、約１×１０５から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０８、約１×１０７から約１×１０８、約１×１０８から約１×１０９、約１×１０８から約１×１０１０、または約１×１０９から約１×１０１０のここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０５から約１×１０７のここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞を含む。
ある特定の実施形態では、前記組成物は凍結される。ある特定の実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの凍結保護物質、例えば、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはこれらの組合せをさらに含んでいてもよい。
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生体適合性スキャフォールドまたはマトリックス、例えば、細胞が対象に移植またはグラフトされた場合に、組織再生を促進する生体適合性３次元スキャフォールドをさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性スキャフォールドは、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含むポリサッカライド、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、それらの全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。組成物は、末梢神経系（これ以降「ＰＮＳ」とする）および／または中枢神経系（これ以降「ＣＮＳ」とする）を再生して、ミクログリア細胞関連障害を予防および／または処置するために使用することができる。
ここで開示される主題は、本明細書において開示する分化細胞またはそれを含む組成物を含むデバイスも提供する。デバイスの非限定的な例としては、シリンジ、微細ガラス管、定位針およびカニューレがある。
５．４処置方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ミクログリア細胞は、神経変性疾患を処置するために使用することができる。本開示は、神経変性疾患を予防および／または処置するための方法を提供する。神経変性疾患の非限定的な例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン疾患、統合失調症、膠芽腫、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症（ＭＳ）がある。
ある特定の実施形態では、方法は、有効量の次のもの：（ａ）本明細書において記載する分化ミクログリア細胞の集団；および（ｂ）そのような分化ミクログリア細胞を含む組成物のうちの少なくとも１つを対象に投与するステップを含む。
さらに、ここで開示される主題は、神経変性疾患を予防および／または処置するための次のもの：（ａ）本明細書において記載する分化ミクログリア細胞の集団；および（ｂ）そのような分化ミクログリア細胞を含む組成物のうちの少なくとも１つの使用を提供する。
ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、対象に全身的にまたは直接的に投与しても提供してもよい。ある特定の実施形態では、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、目的の臓器（例えば、ミクログリア細胞欠損関連障害の影響を受けた臓器）に直接注射する。ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、これらに限定されないが脳を含む、有効な神経を有する対象の身体の任意の部分に直接投与（注射）してもよい。
ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、任意の生理学的に許容されるビヒクルで投与してもよい。薬学的に許容される担体およびここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞を含む医薬組成物も提供される。ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物、または薬学的に許容される担体は、局所注射、同所（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ）（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与してもよい。ある特定の実施形態では、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、局所注射を介して対象に投与される。
ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物は、好都合には、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供してもよく、これらは選択されたｐＨに緩衝してもよい。液体調製物は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製するのが通常は容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与が多少好都合である。一方、粘性組成物は、特定の組織との接触時間を長くするような適切な粘度範囲内で製剤化してもよい。液体または粘性組成物は、担体を含んでいてもよく、これは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。無菌注射用溶液は、必要に応じて、ここで開示される主題の組成物、例えばここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞を含む組成物を、必要な量の適切な溶媒中にさまざまな量の他の成分とともに組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどを含む添加混合物であってもよい。組成物はまた、凍結乾燥してもよい。組成物は、投与経路および所望の調製物に応じて、補助物質、例えば湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度強化添加物、防腐剤、香味剤、着色剤などを含んでいてもよい。標準的なテキスト、例えば“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”， １７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８５を、過度の実験を行うことなく好適な調製物を調製するために参照してもよく、このテキストは参照により本明細書に組み込まれる。
抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を強化するさまざまな添加物を添加してもよい。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射可能な医薬品形態の持続吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ ｉｎｕｒｎ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチンを使用することによって得てもよい。しかし、ここで開示される主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加物は、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞またはそれを含む組成物に適合しなくてはならないことになる。
当業者であれば、組成物の構成成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞の生存率または有効性に影響を与えないことになる点を認識するであろう。これは、化学的および医薬品原理の当業者であれば問題はないか、または本開示および本明細書において列挙した文書から、標準的なテキストを参照することによってもしくは簡単な実験（過度の実験を伴わない）によって問題を容易に回避することができる。
ある特定の非限定的な実施形態では、本明細書において記載するミクログリア細胞は、組成物中に含まれ、その組成物は、生体適合性スキャフォールドまたはマトリックス、例えば、細胞が対象に移植またはグラフトされる場合に、組織再生を促進する生体適合性３次元スキャフォールドをさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性スキャフォールドは、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含むポリサッカライド、および／またはヒドロゲルを含む（例えば、それらの全体が参照により組み込まれる、米国特許第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと）。
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置時に有益なまたは所望の臨床的結果に影響を与えるのに十分な量である。有効量は、少なくとも１回の用量で対象に投与してもよい。処置に関しては、有効量は、神経変性疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転もしくは遅延させるか、あるいは神経変性疾患の病理学的結果を低下させるのに十分な量である。有効量は、ケースバイケースで医師によって、かつ当業者の技術の範囲内で一般的に判定される。有効量に達するための適切な投薬量を判定する場合に、いくつかの要因が典型的には考慮される。これらの要因としては、対象の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度がある。
ある特定の実施形態では、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞の有効量は、神経変性疾患を予防するのに十分な量、および／または神経変性疾患を処置する（例えば、症状の進行を遅延させる、症状を軽減するおよび／または低下させる）のに十分な量である。投与されることになるここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞の量は、処置される対象ごとに異なることになる。ある特定の実施形態では、約１×１０４から約１×１０１０、約１×１０４から約１×１０５、約１×１０５から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０６、約１×１０５から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０８、約１×１０７から約１×１０８、約１×１０８から約１×１０９、約１×１０８から約１×１０１０、または約１×１０９から約１×１０１０のここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞が対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０５から約１×１０７のここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞が対象に投与される。有効用量と考えられることになるものの正確な判定は、特定の対象のそのサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む、各対象に対する個々の要因に基づいていてもよい。投薬量は、本開示および当技術分野の知識から当業者によって容易に確認することができる。
ある特定の実施形態では、神経変性疾患を予防および／または処置する方法は、有効量のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を対象に投与するステップを含む。さらに、ここで開示される主題は、神経変性疾患を予防および／または処置するためのＣＳＦの使用を提供する。
ＣＳＦの非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４がある。ある特定の実施形態では、ＣＳＦはＧＭ－ＣＳＦであり、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても公知である。
ＣＳＦは、ミクログリア細胞から放出された補体Ｃ３を減少させることができる。その結果、ＣＳＦは、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を予防および／または処置するために使用することができる。
５．５キット
ここで開示される主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤；（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子；（ｃ）少なくとも１つの造血促進サイトカイン；および（ｄ）ニューロンを含む。ある特定の実施形態では、キットは、
（ｅ）少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインをさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｆ）幹細胞を少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞にする分化を誘導するための説明書をさらに含む。
ある特定の実施形態では、説明書は、幹細胞を、本開示の方法に記載するような阻害剤、活性化因子サイトカインおよび分子と接触させることを含む（上記第５．２項を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、本開示は、有効量のここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞の集団またはそれを含む組成物を単位投薬形態で含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、治療的組成物を含む無菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、袋、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の好適な容器形態であってもよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または他の医薬を保持するのに好適な材料から作製することができる。
ある特定の実施形態では、キットは、ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞の集団またはそれを含む組成物を、神経変性疾患に罹患した対象に投与するための説明書を含む。説明書は、神経変性疾患を処置および／または予防するための細胞または組成物の使用についての情報を含む場合がある。ある特定の実施形態では、説明書は、少なくとも次のもの：治療剤の説明；神経変性疾患またはその症状を処置または予防するための投薬スケジュールおよび投与；使用上の注意；警告；適応；禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）；過剰投薬情報；副作用；動物薬理；臨床研究；および／または参考文献の説明うちの１つを含む。説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷しても、容器に貼付するためのラベルとして、または容器内にもしくは付属の個別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダとして印刷してもよい。
５．６治療用化合物をスクリーニングする方法
ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞は、神経変性疾患（例えばアルツハイマーおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））をモデリングするために使用することができる。
ここで開示される幹細胞由来ミクログリア細胞はまた、疾患の細胞表現型を克服することができる候補化合物をスクリーニングするためのプラットフォームの役割を果たすことができる。神経変性疾患を軽減するための候補化合物の能力は、神経変性疾患をもたらす生理学的なまたは細胞の欠陥を救済するための候補化合物の能力をアッセイすることによって判定してもよい。
ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）ここで開示されるミクログリア細胞の集団を被検化合物と接触させるステップであって、ミクログリア細胞が神経変性疾患を有する対象から得られた幹細胞に由来する、ステップ；および（ｂ）ミクログリア細胞の機能的活性を測定するステップを含み、ミクログリア細胞の機能的活性における変化は、被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す。変化は、減少または増加であってもよい。ある特定の実施形態では、変化は減少である。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、被検化合物と少なくとも約２４時間（１日）、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、被検化合物と少なくとも約２４時間（１日）接触させる。
ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞の機能的活性は、補体Ｃ３の放出を含む。ある特定の実施形態では、変化は減少である。補体Ｃ３の増加は、アルツハイマーのマウスモデルにおいて示されており、疾患状況におけるシナプスの異常な刈り込みに関与している。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞から放出された補体Ｃ３における減少は、被検化合物が神経変性疾患、例えばアルツハイマー病またはＡＬＳを処置することができる可能性が高いことを示す。
本発明者らは、野生型幹細胞由来ミクログリア細胞は、無害なアミロイド－ベータ－４０よりも病原性アミロイド－ベータ－４２に対して選択性を有することを見出した。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞の機能的活性は、ミクログリア細胞によるアミロイド－ベータ食作用を含む。ある特定の実施形態では、変化は増加である。ある特定の実施形態では、ミクログリア細胞によるアミロイド－ベータ食作用における増加は、被検化合物が神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を処置することができる可能性が高いことを示す。
本発明者らは、ミクログリア細胞が、初期発症型のＡＬＳの遺伝的遺伝型において突然変異した遺伝子である最高レベルのＣ９ＯＲＦ２２を発現することを発見した。発明者らは、補体Ｃ３放出が、Ｃ９ＯＲＦ２２突然変異体幹細胞由来ミクログリア細胞において増加することも発見した。活性化ミクログリアは、運動ニューロンの神経毒性を誘導する場合がある神経毒性反応性アストロサイトを誘導することがある。Ｌｉｄｄｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ”， Ｎａｔｕｒｅ （２６ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１７）；５４１：４８１－７ ４８７を参照されたい。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）被検化合物をここで開示されるミクログリア細胞、アストロサイトの集団、およびニューロンの集団を含む組成物と接触させるステップ；および（ｂ）ニューロンの神経毒性を測定するステップを含み、被検化合物と接触させた後のニューロンの神経毒性における低下または減少が、被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す。ある特定の実施形態では、ニューロンは運動ニューロンであり、方法は、ＡＬＳを処置するための化合物をスクリーニングするために使用する。ニューロンの神経毒性の非限定的な例としては、シナプス損失、軸索変性、およびアポトーシスがある。ある特定の実施形態では、組成物は、被検化合物と少なくとも約２４時間（１日）、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、または約１０日間接触させる。ある特定の実施形態では、組成物は、被検化合物と少なくとも約４日間接触させる。
ここで開示される主題は、限定を目的とするものではないが、ここで開示される主題の例示として提供される以下の例を参照することによってより理解されるであろう。
６．１ （実施例１） ミクログリアのヒト幹細胞からの分化
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害すると、後部原始線条から初期の中胚葉細胞にバイアスがかかり、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋一次造血先駆体が生成される（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）；３２， ５５４－５６１）。これらの先駆体は、卵黄嚢において一次造血を開始し、初期のＥＭＰをもたらすことになる。このミクログリア分化スキームでは、本例は、単層戦略においてｈＰＳＣから一次造血を誘導するためにＷｎｔ阻害を適用した。特に、ＷｎｔアゴニストのＣｈｉｒ０９９０２１によってＷｎｔを１８時間活性化すると、免疫蛍光によってブラキュリ（Ｔ）を特徴とする初期の中胚葉がもたらされたことが本例によって示された（図１Ａ）。これらの細胞は、フローサイトメトリーによれば、分化の４日目まではＫＤＲ＋およびＣＤ２３５ａ＋（一次造血先駆体）でもあった。分化スキームにおけるＣｈｉｒ０９９０２１曝露の濃度およびタイミングを最適化し、３μＭで１８時間曝露し、続いてＩＷＰ２を介して３μＭでＷｎｔ阻害した場合、フローサイトメトリーによれば一次造血先駆体（ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋）の最も高いパーセンテージが得られた（図１Ｂ）。次に、本例は、造血内皮細胞および造血細胞のスケジュールを開発した。造血内皮細胞は、選別されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋一次造血先駆体を再播種してから１日後に発生した。これらの細胞は、培養中の７日にわたって懸濁液中に造血細胞をもたらし、培養物中で徐々に増加するようになった（図２）。ＶＥ－カドヘリン＋染色によって造血内皮細胞を検証するために、選別後１日目に、細胞が、免疫蛍光によればＶＥ－カドヘリンに関して陽性であり、これらが造血内皮細胞であり、懸濁液中の細胞が造血細胞の特徴的な小さな核を有していたことを確認した（図３）。再播種してから５日目に、一次造血先駆体のＫｉｔ＋細胞が出現し、これはミクログリアの先駆体である初期の赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）であった。次いでこれらの細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４５＋に到達し、造血コミットメントが完了したことが示された（図４）。培養物を選別後８日目にＥＭＰの混合集団が存在した場合、これらの細胞は成熟マクロファージではなく、ミクログリアおよびマクロファージ前駆体として同定された（図６）。ほんのわずかな割合のもののみが、成熟マクロファージマーカー、例えばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、Ｃｄ１１ｂ、およびＭＲＣを発現した。大部分の細胞はＣＤ４５を発現したが、これらが造血系統にコミットしたことを示した。全てのマーカーは、フローサイトメトリーによって確認した。
選別後８日目に、ｐＭａｃを含む懸濁液中の細胞をニューロンと培養すると、共培養のわずか４日目までに初期のミクログリア細胞が得られた（図７）。これらの細胞は、Ｉｂａ１＋およびＰｕ．１＋染色を用いて同定された。ＣＤ４５＋であった全ての細胞はＰｕ．１＋でもあり、培養物中で存続したどの造血細胞（ＣＤ４５＋で表される）も骨髄／ミクログリア系統（ＰＵ．１で表される）にコミットしたことが示された。これは、免疫蛍光によるこの戦略が非常に効率的であることを示す。ミクログリア細胞（免疫蛍光によるＩｂａ１＋）は、皮質ニューロンとの共培養から１４日後に、共培養物中で依然として持続されたままであり、Ｉｂａ１＋細胞が培養物中で安定であったことを示す（図８）。ミクログリア細胞（免疫蛍光によるＩｂａ１＋、ＰＵ．１＋）は、培養物中で２１日後にニューロンとの共培養を依然として持続したままであった（図９）。
ミクログリアを生成するための第２の戦略では、ＥＭＰを、１０％血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４を用いてマクロファージに成熟させた。これらは、培養物中で４日目までには成熟マクロファージマーカーＣＤ１１ｂを、１１日目までには成熟紡錘体形態を発生した（図１０）。１１日後に血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４中の培養物において持続された全ての細胞はＣＤ４５＋であり、これらが全て造血性であったことを示す。大部分は、フローサイトメトリー分析によれば、成熟マクロファージマーカー、例えばＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびデクチンに関しても陽性であった（図１１）。ｐＭａｃは、血清およびＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３４の代わりにＩＭＤＭ／Ｆ１２／Ｎ２／Ｂ２７を使用して、血清なしでマクロファージに成熟することもできる（図１２）。Ｍ－ＣＳＦにＩＬ－３４を添加すると細胞分裂を促進することによって収率が増加した。ＧＭ－ＣＳＦを添加すると、細胞が同様に分裂したが、得られた細胞は、より顆粒状であり活性化されたように見えた。マクロファージ細胞をニューロンと共培養すると、分岐した形態を伴い、Ｉｂａ１免疫蛍光染色が増加したミクログリア細胞が得られた（図１３）。Ｉｂａ１は、マクロファージからのミクログリア細胞において増加したため、細胞は、ニューロンとの共培養を介してミクログリアアイデンティティに移行していた。共培養されたｐＭａｃ由来ミクログリア（ＥＭＰ共培養）およびｐＭａｃ－マクロファージ由来ミクログリア（ＥＭＰ－マクロファージ共培養）は、鍵となるミクログリア遺伝子の発現をヒト胎児ミクログリアと共有する（図１４）。ミクログリアを導出するための２つの異なる戦略からのＲＮＡの定量的ＰＣＲは、鍵となるミクログリア遺伝子のパネルの遺伝子発現を、ヒト胎児ミクログリア（市販の原料）からのＲＮＡと共有した。対照的に、末梢のマクロファージを表す単球由来マクロファージは、これらのマーカーを発現しなかった。注目するべきことに、ＥＭＰ由来マクロファージを単独で培養した場合、これらは鍵となるミクログリア遺伝子ＴＭＥＭ１１９およびＳＡＬＬ１を下方制御し、共培養が、ミクログリアアイデンティティを維持するために必要であったことが示された。
要約すると、本例は、単層戦略においてＷｎｔ阻害を適用して、一次造血をｈＰＳＣから誘導した（図５）。最初に、本例は、ｈＰＳＣを、小分子ＣＨＩＲ９９０２１によるＷｎｔ活性化を用いてブラキュリ＋（Ｔ＋）後部原始線条初期中胚葉細胞にパターン化した。次いで、本例は、これらの細胞を、小分子阻害剤であるＩＷＰ２によってＷｎｔシグナル伝達をブロックすることによりＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋一次造血先駆体を強力に生成するように誘導した。本例は、ＣＨＩＲ９９０２１を用いて１８時間厳密に処置し、続いてＩＷＰ２処置を行うことは、相当な割合のＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞を発生させる唯一の条件であることを判定した。すでに発表されている論文では、中胚葉細胞を誘導するためにＷｎｔ活性化が使用されているが、その後この中胚葉をＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋先駆体に向けてパターン化することに挑戦しておらず、その結果、この集団を形成するための潜在力が大幅に低下することが本例で判定されている１８時間の処置期間に限定していない。さらに、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋先駆体が一次造血先駆細胞であることが同定された以前の研究では、著者は、この集団が、内因性シグナル伝達が大きな役割を果たす胚様体方法によって生じ、したがってＷｎｔ阻害単独で使用することができることを認めている（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１４）； ３２， ５５４－５６１）。その結果、本例は、最初に１８時間のＷｎｔ活性化処置を使用して中胚葉を誘導し、続いてＷｎｔ阻害を行うことによって、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋一次造血先駆体をｈＰＳＣから誘導しており、定義済みの単層系における新規な方法である。
次に、本例はＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋一次造血先駆体を駆動して、造血促進サイトカインのカクテルを添加することによってＥＭＰを形成する：８日にわたって段階的な様式で、最初にＶＥＧＦ／ＦＧＦ２を添加して、ＶＥ－カドヘリン＋造血内皮細胞を誘導し、次いでＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、およびＴＰＯを添加して、ＣＤ３４＋、続いてＣＤ４５＋造血細胞へ移行するのを促進する。次いで、浮遊ＣＤ４５＋ｐＭａｃを培養８日目に採取して、ニューロンと共培養してミクログリアに直接移行させるか、またはマクロファージに成熟させ、次いでニューロンと共培養してミクログリアに移行させた。最初の方法は、ミクログリア細胞が、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ発生のように、ニューロンと共培養した場合に４日以内に初期ｐＭａｃから直接発生することができることを示す唯一の方法であるという点において特に新規である（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５３（６３０４） ａａｆ４２３８）。
ヒトミクログリア細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための現存する戦略は、この発生パラダイムに従っておらず、一次造血先駆体に向けた最初のパターン化に失敗している。これらの戦略は、二次造血から生じる末梢の単球から開始しており（Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． （２０１４）； ４０， ６９７－７１３；Ｏｈｇｉｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１４）； ４， ４９５７）、その結果、ミクログリア細胞がｉｎ ｖｉｖｏで得られないか、または一次造血に関して予めパターン化されていない胚様体アプローチを使用し、発生細胞の運命の決定に関してはブラックボックスである（Ｅｔｅｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１２）； ２０９， ７９－８９；Ｈｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍ． （２０１２）； ９， １２；Ｌａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１５）；４， ２８２－２９６；Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． （２０１４）； ４０， ６９７－７１３；Ｏｈｇｉｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１４）； ４， ４９５７；ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１３）； ８．；Ｍｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１６）； ２２（１１）， １３５８－１３６７；Ｂａｈｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． （２０１５）；５， ７９８９）。ミクログリア様細胞をｈＰＳＣから導出するための単層プロトコールのうち（Ａｂｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ， （２０１７）； ９４（２）， ２７８－２９３；Ｔａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． （２０１７）； ４７（１）， １８３－１９８）、細胞はこの場合も、一次造血ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞に向けてパターン化されておらず、その結果、これらの戦略が、ミクログリアの真の先駆体である初期のＥＭＰを通過するのか、または二次造血の先駆体である後期のＥＭＰを通過するのかを判定する方法は存在しない。さらに、全てのこれらの戦略は、ニューロンと共培養する前にＣＤ４５＋ｐＭａｃから完全に分化したマクロファージを最初に生成しており（仮に共培養したとしても）、その結果、脳に最初にコロニー形成して組織常在ミクログリアに発生する先駆細胞（ｐＭａｃ）のｉｎ ｖｉｖｏでの発生上の軌跡を表すものではない（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）；３５３（６３０４）， ａａｆ４２３８）。本戦略は、卵黄嚢の一次造血を再現し、マクロファージに成熟する前のｐＭａｃを単離し、これらの細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで神経ニッチで培養して、真正なヒトミクログリア細胞をわずか１６日で生成する、段階的な発生パラダイムを使用するという点において新規である。
ミクログリアをヒト幹細胞から分化させるための例示的なプロトコールを以下に示す：
段階Ｉ：ｐＭａｃ産生（無血清）
１）０日目：ＥＳ細胞を、１：３０マトリゲルで被覆した２４ウェルまたは６ウェルのいずれかの組織培養プレート中のＡＢＣ＊培地において６０，０００細胞／ｃｍ＾２＋Ｙで播種する。
２）１日目：１８時間後、培地をＡＢｉ培地に交換する。細胞はＴ＋（ブラキュリ＋）であるはずである。
３）２日目：培地をＡＢｉ＋ＦＧＦ２に交換する。
４）３日目：マトリゲル上のＶＥＧＦ／ＦＧＦ２培地＋Ｙ中に６０，０００細胞／ｃｍ＾２で細胞を分割し、播種する。細胞の少なくとも３０％はＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋であるはずである。
５）４日目：Ｙ－薬物を取り出し、ＶＥＧＦ／ＦＧＦ２をそのままにしておく。
６）５日目：Ｃｙｔｏ １培地を添加する。細胞の１０～２０％はＫｉｔ＋（ＥＭＰ）であるはずである。
７）６日目：小さな円形細胞コロニーが形成されているかどうかを確認する。
８）７日目：Ｃｙｔｏ ２培地を添加する。
９）８日目：円形細胞はコンフルエントであるはずである。懸濁液中の細胞を収集し、スピンダウンする。培養物は、ＶＥ－カドヘリン＋造血内皮細胞、およびＫｉｔ＋（ＥＭＰ）またはＫｉｔ－ＣＤ４５＋ＣＳＦ１Ｒ＋（ｐＭａｃ）である円形細胞の懸濁液を含むはずである。
段階ＩＩａ．神経共培養（無血清）物を用いたミクログリア細胞への直接変換
１）８日目の培養物から懸濁細胞のみを収集し、スピンダウンする。
２）懸濁細胞をニューロンと、ミクログリア培地＃１に１：５の比率で播種する。
３）１日おきに培地を交換する。
４日後、多くのＰｕ．１＋ＣＤ４５＋、Ｉｂａ１＋、ＣＸ３ＣＲ１＋ミクログリア細胞は、すでに培養物中に存在するはずである。
４）細胞は、共培養物において１０～１４日後にアッセイする準備ができているはずである。
ＣＸ３ＣＲ１＋で選別した場合、ミクログリア細胞はＰ２ＲＹ１２＋、Ｔｍｅｍ１１９＋、Ｓａｌｌ１＋、ＧＰＲ３４＋、およびＣ１ＱＡ＋であるはずである。
段階ＩＩｂ．マクロファージ細胞への分化、次いでニューロンとの共培養
１）懸濁細胞を、ＴＣ－処置プラスチック上のＲＰＭＩ培地に１：２で播種する。
２）培地を１日おきに交換すると（Ｍ－Ｗ－Ｆ）週末に培地で残すことができる。
３）１１日後に、細胞は、細長く、顆粒状に見えるはずである。細胞にアキュターゼを１０分間行い、ニューロンとともに１：５の比率で播種する。
細胞は、Ｃｄ１１ｂ＋、デクチン＋、ＣＤ１４＋（成熟マクロファージ）であるはずである。
４）ミクログリア共培養培地でニューロンとともに培養し、１０～１４日後にアッセイを行う。
表１は、本例において使用される細胞培養培地中のある特定の構成成分の濃度および濃度範囲を提供する。
Figure 2022511385000004
Figure 2022511385000005
 ６．２ （実施例２）：生成したミクログリア細胞の適用
本発生的戦略によって導出したｈＰＳＣ由来ミクログリアは、疾患モデリング中にミクログリアとニューロンとの間の相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで調べることに有用であろう。これらの混合培養物は、個々の細胞タイプ単独よりはむしろ細胞の交換が標的となるマルチ細胞タイプの薬物スクリーニングのために利用してもよい（Ｈｏｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１２）；１１， ６２０－６３２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （２０１５）； １１２（４０）， １２５１６－２１）。
本開示から導出されたミクログリア細胞は、アストロサイトと共培養して、ＣＮＳ：ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの３つの構成成分を含む系を構築することができる。免疫蛍光によってミクログリアはＲＦＰで、アストロサイトはＧＦＡＰ＋でタグ付けした（図１５および１６）。トリ培養系は、細胞タイプ間で相互作用を研究するために使用することができる。炎症性刺激、または炎症性刺激を誘導する疾患状況は、クロストークを有するミクログリアとアストロサイトの両方に影響を及ぼす（図１７）。このクロストークは、フィードバックまたはフィードフォワードループであり、その後、ニューロンに毒性をもたらす場合がある。この相互作用は、ｈＰＳＣ由来アストロサイトおよびニューロンを含むトリ培養物中のここで開示されるｈＰＳＣ由来ミクログリアを使用して研究して、完全なヒト系をｉｎ ｖｉｔｒｏで検討することができる。トリ培養物中でのＬＰＳ刺激は、反応性サイトカイン放出をもたらした（図１８）。１μｇ／ｍＬのＬＰＳを、ミクログリア、アストロサイト、およびニューロンを含むトリ培養物中の細胞に、またはミクログリアおよびニューロンのみ、またはアストロサイトおよびニューロンのみ、またはニューロンのみを含む培養物に添加した。ミクログリアはＬＰＳに対する受容体（ＴＬＲ４）を発現する唯一の細胞タイプであったために、それを含む培養物のみがＬＰＳに応答したが、トリ培養物では、ミクログリアおよびニューロンのみの培養物と比較するとＣ３の放出が増加した。その効果は、活性化ミクログリアからの反応性サイトカインがアストロサイトにフィードバックし、それらの反応性およびアストロサイトのＣ３の放出をもたらすことに起因する場合がある。ＬＰＳで刺激されたトリおよびミクログリア／ニューロンのみの培養物は、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１Ｂ、およびＩＦＮγを含む他の反応性サイトカインも分泌した。サイトカインはＥＬＩＳＡを介して測定した。
ミクログリアは、神経発達と神経変性の両方の多くの疾患（いくつかの例は統合失調症、アルツハイマー、パーキンソン、膠芽腫である）の病態形成に関与するため、これは強力なツールを提供する。さらに、本ミクログリア細胞はまた、患者の脳へ移植してさまざまな疾患を処置するために使用してもよい。
ｈＰＳＣ由来ミクログリアは、アルツハイマーおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の２つの神経変性疾患をモデル化するために使用した。ｈＰＳＣ由来ミクログリアおよびアルツハイマーｉＰＳＣ由来ニューロンを混合培養すると、特に補体Ｃ３放出が増加したことに関して、疾患培養物においてミクログリア活性化が観察された。本例は、Ｈ９対照と比較すると、アルツハイマーニューロンを含むトリ培養物は、Ｃ３増強およびＣ３放出の増加を示したことを見出した（図１９）。家族性アルツハイマー病に関する遺伝モデルであるＡＰＰ／ＳＷｅ突然変異体ニューロンと共培養したトリ培養物は、ミクログリアおよびニューロンのみの培養物と比較するとＣ３の増加を示し、レベルは、ニューロンがＨ９対照胚性幹細胞株由来であった培養物と比較すると増加した。対照的に、Ｃ３レベルは、Ｈ９対照におけるミクログリア／ニューロン培養物と比較して、トリ培養物において増加せず、Ｃ３の増強が、疾患刺激なしでは生じなかったことを示す。Ｃ３はＥＬＩＳＡを介して測定した。さらに、ＧＭ－ＣＳＦは、アルツハイマーと対照の両方の全ての培養物中でＣ３放出を減少させた（図２０）。免疫蛍光による細胞数はまた、ＧＭ－ＣＳＦ添加条件と対照条件との間で同等であり、この効果は、ミクログリア細胞の減少によるものではなかったことを示す。アミロイド－βの負荷は、アミロイド－４２ペプチドに対する選択性を伴うミクログリア共培養物において減少した（図２１）。ミクログリア細胞とアルツハイマーニューロンとの共培養物は、総アミロイドベータの減少をＥＬＩＳＡを介して示し、４０および３８ペプチドと比較した場合に、特にアミロイド－ベータ４２ペプチドの減少を示した。ミクログリア細胞内部の４２－４８８の蛍光の増加は、取り込みの増加を示していた（図２２）。ミクログリア細胞がアミロイド－ベータを貪食するかどうかをアッセイするために、蛍光標識アミロイド－ベータ４２ペプチドをａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８８とともに使用し、２時間後、ミクログリア細胞の大部分がアミロイドベータ４２をその中に含んでいたことを免疫蛍光によって見出した。一方、アミロイド－ベータ４０（５５５によって標識された）では、ミクログリア細胞内でそれほど明るくは見出されず、効率的に貪食されなかったことを示す。このことは、ミクログリア細胞によるアミロイドベータ４２に対する選択性を実証した。フルオロフォアを切り替えると、アミロイド－ベータ４２がミクログリア細胞によってより多く取り込まれたという同様の結果が得られた（図２３）。アミロイド４２および４０を表すフルオロフォアを切り替えると、細胞内の４２の輝度の増加の効果は、技術的なフルオロフォア輝度の効果によるものではなかったことが確実になった。切り替えたフルオロフォアを用いても、この実験では４２が５５５に、４０が４８８に標識されているが、免疫蛍光によればミクログリア細胞内にさらに４２の輝度が存在し、ミクログリア細胞がアミロイド－ベータ４２を選択的に貪食したという以前の結果が裏付けられた。ＦＡＣＳ分析によって、ベースライン時のアミロイド－４２に対する選択性、およびＧＭ－ＣＳＦ処置時の取り込みの増加が示された（図２４）。ＧＭ－ＣＳＦ処置によって、ミクログリア細胞におけるアミロイド－ベータ４２ならびに４０の食作用を増加させ、その中にアミロイド－ベータペプチドを有する細胞数を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。
要約すると、補体Ｃ３の増加は、アルツハイマーのマウスモデルにおいて示されており、疾患状況でのシナプスの異常な刈り込みに関与している。本例は、本共培養物中のミクログリアからのＣ３におけるこの増加を抑制することができるサイトカインを調べ、ＧＭ－ＣＳＦを潜在的な候補として同定した。本例はまた、ｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞によるアミロイド－ベータ食作用を研究した。本例では、野生型ｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞は、無害なアミロイド－ベータ－４０よりも病原性アミロイド－ベータ－４２に関して選択性を有することを見出し、本例は、ミクログリア受容体ＴＲＥＭ２のＣＲＩＳＰＲノックアウトを生成して、それがこの選択性に関与しているかどうかを確認した。本例は、候補免疫遺伝子および細胞表面受容体のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを行い、どの遺伝子および経路がアミロイド－ベータ食作用に最も密接に関与するかを判定することを計画している。
ｈＰＳＣ由来ミクログリアを使用した本第２の疾患モデルが、ＡＬＳである。本例は、ＡＬＳミクログリアおよびアストロサイトが、ベースライン時の補体Ｃ３放出の増加を示したことを見出した（図２５）。ＳＯＤ１突然変異体ｉＰＳＣ由来ＡＬＳアストロサイトおよびミクログリアを単独でまたは一緒に培養し、ＥＬＩＳＡによって定量化した同系対野生型対照細胞株由来アストロサイトまたはミクログリアに対してＣ３レベルが高いことが示された。これは、Ｃ３反応性が、アルツハイマーに特有ではなく、ここで開示される系は、ミクログリアとアストロサイトとニューロンとの間にループも存在する可能性が高い他の神経変性疾患を研究するために使用することができることを示す。
本例は、ミクログリア細胞が、初期発症型のＡＬＳの遺伝的遺伝型において突然変異した遺伝子である最高レベルのＣ９ＯＲＦ２２を発現したことに注目した。本例はまた、補体Ｃ３放出が、Ｃ９ＯＲＦ２２突然変異体ｉＰＳＣ－由来ミクログリア細胞において増加したことに注目し、本例は、これらの細胞が、ｉＰＳＣ由来アストロサイトと関連して、ｉＰＳＣ由来運動ニューロンに対して神経毒性があるかどうかを試験した。本例は、ＡＬＳモデルにおいて本ｉＰＳＣ由来ミクログリア、アストロサイト、およびニューロンのトリ培養系を使用した薬物スクリーニングを行って、ニューロン単独よりもむしろ神経炎症系に作用することによってこの神経毒性を救済することができる候補を見出すことを計画している。
６．３ （実施例３）：完全に定義されたヒトＰＳＣ－由来ミクログリアおよびトリ培養系は、アルツハイマー病のモデルにおける補体産生の細胞タイプ特異的増強を明らかにする。
中枢神経系（ＣＮＳ）における異常な炎症は、ヒト神経変性疾患の病態形成における主要なプレーヤーとして関与している。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでの神経炎症軸への各細胞タイプの特定の貢献は、依然として不明なままであり、課題をさらに複雑にする鍵となるシグナル伝達経路における特異的種差を伴う。
近年では、神経炎症は、さまざまな神経変性障害、例えばアルツハイマー（Ｄｅｃｚｋｏｗｓｋａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ １７３， １０７３－１０８１ （２０１８）； Ｋｅｒｅｎ－Ｓｈａｕｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ １６９ （２０１７））、パーキンソン（Ｌｅｃｏｕｒｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２ （２０１８）；Ｏｌａｎｏｗ， Ｃ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ １４２， １６９０－１７００ （２０１９））、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（Ｇｅｌｏｓｏ， Ｍ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９ （２０１７））の進行においてならびに老化においてますます関与している。ミクログリアは、脳における炎症状況を引き起こす鍵となるプレーヤーであると考えられており、疾患病状を促進または悪化させる場合がある。他のグリア細胞、例えばアストロサイトは、ミクログリアと相互作用し、異常な炎症にさらに寄与する場合があり、神経毒性をもたらす（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ５４１， ４８１－４８７ （２０１７）；Ｒｏｓｔａｌｓｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３ （２０１９））。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞クロストークを解析し、神経炎症応答の特異的種差を理解することは（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３７， １２５－１３５ （２０１４））、その分野における主要な課題であった。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）技術は、これら両方の課題を克服し、神経炎症を研究するための、定義されスケーラブルな完全なヒトのプラットフォームを提示する潜在力を有する。そのようなｈＰＳＣベースのモデルに関する必須要件は、同調的、効率的、および適時な様式でミクログリア、アストロサイト、およびニューロンの純粋な集団を再現可能に生成することができる分化戦略である。デュアルＳＭＡＤ阻害に基づいたプロトコール（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ２７５－２８０ （２００９）；Ｑｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３５， １５４－１６３ （２０１７））は、ｈＰＳＣからの高度に純粋な神経先駆体および有糸分裂後ニューロンの効率的な産生を可能にする。同様に、ｈＰＳＣからのアストロサイトの純粋な集団を急速に導出するための戦略が近年報告された（Ｔｃｈｉｅｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７， ２６７－２７５ （２０１９））。対照的に、ｈＰＳＣからミクログリア様細胞を生成するためのいくつかのプロトコールが公開されているが（Ｍｕｆｆａｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２２， １３５８－１３６７ （２０１６）；Ａｂｕｄ， Ｅ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ９４， ２７８－２９３．ｅ２７９ （２０１７）；Ｄｏｕｖａｒａｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８， １５１６－１５２４ （２０１７）；Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８， １７２７－１７４２ （２０１７）；Ｔａｋａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７， １８３－１９８．ｅ１８６ （２０１７）；Ｐａｎｄｙａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０， ７５３－７５９ （２０１７）；Ｂｒｏｗｎｊｏｈｎ， Ｐ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０， １２９４－１３０７ （２０１８））；これらのアプローチは、胚様体の形成に通常依存し、個体発生に関しては十分に定義されておらず（Ｍｕｆｆａｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２２， １３５８－１３６７ （２０１６）；Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８， １７２７－１７４２ （２０１７））、操作、例えばパターン形成のための低酸素状態を必要とするか（Ａｂｕｄ， Ｅ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ ９４， ２７８－２９３．ｅ２７９ （２０１７）、または純度に関する細胞選別を必要とする（Ｄｏｕｖａｒａｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８， １５１６－１５２４ （２０１７））。重要なことには、いずれのミクログリア分化プロトコールも、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋血管芽細胞の誘導によって定義されるような一次造血に向けた明確なパターン形成を実証していない（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２， ５５４－５６１ （２０１４））。ミクログリアはその系統が一次造血に完全にさかのぼるという点において特有であるため、これらの初期の発生上のステップをｉｎ ｖｉｔｒｏで再現することは重要である（Ｇｉｎｈｏｕｘ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０， ８４１－８４５ （２０１０））。
神経炎症を研究するための完全なヒトプラットフォームを構築するために、ミクログリア個体発生を明確に再現する、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からミクログリアを導出するための新規なアプローチを、発生中のマウスミクログリアのデータセットに対する単一細胞ＲＮＡシークエンシングおよび段階特異的マッピングによって同定し、実証した。これらの細胞を使用して、神経炎症軸に沿って細胞クロストークをｉｎ ｖｉｔｒｏで分析するためのｈＰＳＣ由来ミクログリア、アストロサイト、およびニューロンの純粋な集団を含む最初に定義された完全なヒトトリ培養系を構築した。トリ培養系を生成して、アルツハイマー病における炎症を、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋突然変異を有する同系ｈＰＳＣを使用してモデル化した。ここで開示されるデータによって、炎症性条件下で増加し、シナプス損失に関与するタンパク質である補体Ｃ３の産生は、トリ培養条件下で強化され、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物中でさらに強化されたことが明らかになった。細胞タイプ特異的切除研究を使用して、Ｃ３の増強は、ミクログリアが鍵となる開始剤であり、アストロサイトを活性化して過剰なＣ３を生成した神経炎症性ループの存在に起因することが認められた。ここで開示される研究によって、ＡＤにおけるＣ３の増加に貢献する主要な細胞プレーヤーが定義され、ヒト疾患における神経炎症を研究するための広範に適用可能なプラットフォームが提示された。
ここで開示される戦略は、ｈＰＳＣがミクログリア先駆体に分化するように設計した（図２６Ａ）。最初に、細胞をＧＳＫ３ｂ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１で処置し（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （２００６）； １３３， ３７８７－３７９６）、ＷＮＴシグナル伝達を活性化することによって原始線条中胚葉に向けてパターン化した。次いで、ＷＮＴ阻害をポーキュパイン阻害剤ＩＷＰ２によって誘導し、Ｎｏｄａｌシグナル伝達を同時に活性化し、アクチビンＡに曝露することによって模倣した。これらの条件は、（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１４）； ３２， ５５４－５６１）に提案されたパラダイムに従って、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋一次造血血管芽細胞対ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－二次造血先駆体の生成にバイアスをかけた。ＷＮＴ阻害は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋集団を効率的に生成するために、ＷＮＴ活性化後１８時間に制限された発生上の非常に狭い期間内で生じているはずであることが認められた（図２６Ｂ）。細胞密度および小分子曝露に関する条件を最適化した後（材料および方法を参照のこと）、１８時間のＷＮＴ活性化、続いて２日間のＷＮＴ阻害およびノーダル活性化によって、分化の３日目までに約３０％のＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞が得られる（図２６Ｃ）。次に、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋血管芽細胞対ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－二次先駆体が、これらの培養条件下で造血細胞を生成したかどうかを判定した。選別されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋血管芽細胞集団は、最小限の造血サイトカインの存在下で、再播種後３日以内（ｈＰＳＣ分化の６日目）にＣＤ４１＋ＣＤ２３５Ａ＋ＣＤ４３＋造血細胞を産生したことが観察された（図２６Ｄ）。対照的に、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－血管芽細胞集団は、造血細胞を産生しなかった（図２６Ｄ）。ここで開示されるデータによって、二次先駆体は、低酸素条件下で、または追加の造血サイトカインの存在下で、分化の後期段階において造血細胞のみを生成したことが実証された。再播種後７日目までに、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋フラクションによって、４１％のＣＤ４５＋細胞が得られ、これは後期にミクログリアを産生した集団であった。他の細胞集団は、コミットされなかったＣＤ４１＋ＣＤ２３５Ａ＋ＣＤ４３＋赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）、ＣＤ４１＋巨核球、およびＣＤ２３５Ａ＋赤血球（エリスロポエチンで処置した場合のみ）を含んでいた（図３１Ａ）。ＥＭＰ、巨核球、および赤血球は、全てが一次造血中に産生された系統であった（Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （２０１６）； ５９０， ３９６５－３９７４）（図２６Ｄ）。二次ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－集団は、それでも造血細胞を産生せず、これは、分化の１０日目までに産生された全ての造血細胞が、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋血管芽細胞由来であったことが実証された。興味深いことに、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ－集団とＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋集団の両方を含む未選別の試料は、選別されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋集団とほぼ同じ効率で造血細胞を産生した。これらの結果は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５Ａ＋細胞が造血細胞の強力な産生のために精製することを必要としないことを示唆する（図２６Ｄ）。この発見によって、細胞選別ステップを除去し、代わりに造血サイトカインの存在下で３日目に混合集団の簡単な再播種を可能にすることによって分化プロセスが簡素化される。分化の１０日目における細胞のおよそ６０％は、ＶＥ－カドヘリン＋造血内皮細胞上の半懸濁液での造血アイデンティティ形成浮遊コロニーのものであった（Ｒａｆｆｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ （２０１３）； １２１， ７７０－７８０）（図３１Ｂおよび３１Ｃ）。
次に、単一細胞ＲＮＡシークエンシング実験を分化の６日目および１０日目に行って、細胞の不均質性を完全に特徴付け、現在の文献におけるヒト一次造血に対するデータが不足していることを考慮し、移行細胞状態の発生上の軌跡を同定した。分化の組成および軌跡を、ｉｎ ｖｉｖｏマウス発生由来のものと比較して、ここで開示される方法が、皿上で一次造血を実際に産生するかどうかを立証した。プールされた６日目および１０日目の単一の細胞のＲＮＡシークエンシングデータを、拡散マッピング分析後に定義された軌跡に沿って個別のクラスターに分離した（図２７Ａ）。赤血球（ＥＲＹ）、巨核球（ＭＫ）、およびマクロファージ先駆体（ＰＭＡＣ）のより成熟した造血集団が、共通のＥＭＰ集団から生じる３つの異なるアームから出現し、一次造血の軌跡を模倣した。細胞の分化の潜在力を、Ｐａｌａｎｔｉｒアルゴリズムを使用して軌跡に沿って疑似時間にわたって計算し（Ｓｅｔｔｙ ｅｔ ｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１９）； ５７， ４５１－４６０）、結果によって、最も高い分化能が、マップの中心の造血内皮クラスターおよびＥＭＰ様細胞内にあり、最も低いものが、３つのアームの末端のより成熟した造血クラスターにあったことが示された（図２７Ｂ）。鍵となる遺伝子の発現も、各アームの軌跡に沿って疑似時間にわたって計算した（図２７Ｃ）。赤血球アームは、胚性ヘモグロビン（ＨＢＥ１）およびＧＹＰＡのシグネチャー遺伝子を発現し、巨核球アームは、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、およびＧＰ１ＢＡの鍵となる巨核球遺伝子を発現し、マクロファージ先駆体アームは、ＣＳＦ１Ｒ、ＰＴＰＲＣ、およびＣＸ３ＣＲ１を発現した（Ｋｉｅｒｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１３）； １６， ２７３－２８０）。軌跡をマクロファージ先駆体アームのみに沿って単離し、その遺伝子発現を、マウスミクログリア発生のｉｎ ｖｉｖｏプロファイリング由来のＥＭＰおよびプレ－マクロファージ（ＰＭＡＣ）遺伝子シグネチャーと比較した（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５３）（図２７Ｄ）。初期のＥＭＰおよびＥＭＰ／ＰＭＡＣクラスターに対応する０．４４～０．８の疑似時間において、ここで開示されるデータは、マウスＥＭＰシグネチャーに富んでおり、成熟ＰＭＡＣ１／２クラスターに対応する０．８４およびそれを超える疑似時間において、データはマウスｐＭＡＣシグネチャーに富んでいた（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５３）。しかし、マウスＥＭＰおよびｐＭＡＣシグネチャーにそれぞれに存在する９０および５１個の遺伝子のうち、８１および４９個の遺伝子は、ここで開示されるｓｃＲＮＡｓｅｑデータセットに存在し、これらの遺伝子のサブセットのみが、ヒトＥＭＰまたはｐＭＡＣクラスターにおいて個別に発現し、一部の遺伝子は両方で発現し（図２７Ｄ）、おそらくヒトとマウスとの差を表していた。これらのデータを、マウス原腸陥入単一細胞ＲＮＡシークエンシングデータ全体にもマッピングし（Ｐｉｊｕａｎ－Ｓａｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２０１９）； ５６６， ４９０－４９５）、造血細胞のクラスターがマウス造血細胞と密接に一致したことに注目した。特に、ＰＭＡＣクラスターはマウス原腸陥入骨髄性クラスター付近にマッピングされた（図２７Ｅ）。発生中のマウス原腸陥入の複数の時点から得られたデータと比較した場合、ここで開示されるデータは、ミクログリア先駆細胞をマウス脳に最初に播種した１日前のＥ８．５において出現したものに最も類似している集団を含んでいた（図２７Ｆ）。まとめると、これらのデータによって、ここで開示される培養物におけるＥＭＰおよびＥＭＰ由来ｐＭａｃの存在は、初期のミクログリア発生時におけるマウス骨髄性細胞と密接に一致することが実証され、ここで開示されるヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系は、ミクログリア発生に関する仮定された発生上のロードマップに従っていることを示す。
ＥＭＰまたはｐＭａｃのいずれかをミクログリアに機能的に成熟させてもよい２つの別の方法を本開示において確立した（図２８Ａ）。最初の方法は、ミクログリア先駆体を脳に播種し、神経環境内でミクログリアに発生させ、ｉｎ ｖｉｖｏ発生軌跡を模倣した（Ｐｉｊｕａｎ－Ｓａｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６； ３５３）。このパラダイムを再現するために、懸濁液中の細胞を１０日目に採取し、ミクログリアの生存および成熟に重要なサイトカインであるＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦの存在下で３０日目のｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと直接共培養した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１２）；１３， ７５３－７６０）（図２８Ａ、パネルｉ）。懸濁液中の５０，０００個の細胞を３００，０００個の皮質ニューロンごとに播種し、播種時に１培養物あたり約１６％の造血細胞を得た。注目すべきことには、共培養の４日以内にＩＢＡ１およびＰＵ．１を発現する、付着性、分枝状、かつミクログリア様の細胞が出現した（図２８Ｂ）。これらの細胞はＣＸ３ＣＲ１＋も発現し、共培養物の３０％超を構成し、ミクログリア系統に向かう分化と並行した継続中の細胞増殖を示していた（図２８Ｃ）。他の一次造血系統がこれらの共培養物において出現するかどうかに取り組むために、ＧＰＩ－Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ ｈＰＳＣ系統からのＧＦＰ＋造血細胞を生成し（図３２Ａ～３２Ｂ）、これらをｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと共培養した。共培養の６日目では、ＧＦＰ＋細胞の大部分はＣＤ４５＋であり、これらが、巨核球または赤血球軌跡よりもむしろミクログリアに沿って分化したことを示していた。これらのＣＤ４５＋細胞の８２％はＣＸ３ＣＲ１を発現し、大部分のＣＤ４５＋細胞はミクログリア運命に移行していたことを示唆する（図２８Ｄ）。ＧＦＰ＋細胞のおよそ１０％はＣＤ４５＋ではなかった。これらの細胞の半分は未成熟ＣＤ４１＋ＣＤ２３５Ａ＋ＥＭＰであり、一方残りの半分はこれらのマーカーに関して陰性であり、おそらくさらに初期の造血系統を示していた。これらのデータは、１０日目のＥＭＰおよびＰＭＡＣを皮質ニューロンと共培養すると、４日以内にミクログリア細胞の集団が得られるが、コミットされなかった造血細胞の小さな集団が残る場合があることを実証する。
前駆体段階からミクログリアを成熟させる第２の戦略は、ミクログリアの完全に純粋で同調した集団を導出するように開発した（図２８Ａ、パネルｉｉ）。造血細胞のバルク集団を１０日目に懸濁液中にプールし、続いて７～１１日間、血清含有培地（ＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦが添加されたＲＰＭＩ＋１０％血清）に曝露するか、または定義済みの無血清条件（ＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦが添加されたＩＭＤＭ／Ｆ１２）を使用した。培養の４日に、細胞の半分が、原始マクロファージ段階に移行し、５０～６０％がＣＤ１１Ｂ（成熟マクロファージ／ミクログリアマーカー）およびＣＸ３ＣＲ１（組織常在マクロファージ、例えばミクログリアに限定される）を発現していた。培養の１１日までに、細胞の９９％近くがＣＤ１１Ｂを発現し、８５％超がＣＸ３ＣＲ１を発現した（図２８Ｅ）。この段階で、全ての細胞が付着し、細長い形態を示し、ＰＵ．１＋であった（図３３Ａおよび３３Ｂ）。対照的に、初代ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、同じ培養条件下で並行して成熟させ、ＣＤ１１Ｂが発現したが、ＣＸ３ＣＲ１の発現はほぼなかった（図２８Ｅ）。得られた原始マクロファージの純粋な集団を、ｈＰＳＣ由来皮質ニューロンと共培養して、これらの細胞をミクログリア運命に完全に移行させた。共培養の４日後、ミクログリア細胞は、分枝を示し、ＩＢＡ１を上方制御した（図２８Ｆおよび図３３Ｃ）。ニューロンと共培養された成熟ＰＢＭＣと比較した場合、ミクログリア様細胞はＣＤ４５のレベルが低く、ＣＸ３ＣＲ１の発現を維持し、一方、ＰＢＭＣ由来細胞は、ＣＸ３ＣＲ１非存在下でＣＤ４５を発現した（Ｇｒｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１５）； ６）（図２８Ｇ）。転写アイデンティティを判定するために、ｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞を、共培養を開始してから２週間後にＣＤ４５＋ＣＸ３ＣＲ１＋を使用して選別した。ヒト胎児ミクログリアと同様のレベルでシグネチャーミクログリア遺伝子の発現が観察された（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１４）；１７， １３１－１４３； Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． （２０１６）； １１３， Ｅ１７３８－１７４６）（図２８Ｈ）。興味深いことに、ＴＭＥＭ１１９およびＳＡＬＬ１は、神経共培養時に著しく増加した（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１７）； ３５６）（図２８Ｈ）。共培養されたｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞の単一細胞ＲＮＡシークエンシングによって、細胞が未分化先駆体がない均質な細胞集団を示したことが明らかになった（図３４Ａ～３４Ｂ）。ミクログリア試料中の細胞間の計算されたペアワイズ距離は、きれいな単峰型分布に入り、細胞間の分散がほぼないことを示していた（図３４Ａ）。対照的に、共培養前の１０日目に細胞間で計算されたペアワイズ距離は分布において複数のピークを示し、細胞の不均質な特徴を示していた（図３４Ｂ）。次に、２つの導出方法のうちのどちらが、初代ヒトミクログリアと転写的により類似している細胞を得られるのかを判定した。皮質ニューロンと共培養してから１４日後に、ミクログリア細胞を、ＣＤ４５＋ＣＸ３ＣＲ１＋を使用して選別し、その遺伝子発現を、バルクＲＮＡシークエンシングを介して初代成体ヒトミクログリアと比較した。教師なし階層的クラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）後、どちらの方法でも、死後の皮質脳組織（前頭および側頭、年齢６０～７７歳）から得られる初代ヒトミクログリアにクラスター化するミクログリア細胞が得られた（図２８Ｉ）。しかし、どちらの方法も、おそらく細胞の年齢（胚対年齢）に起因しておよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の結果として、初代ヒトミクログリアとして同じサブ分岐に厳密には入らなかった。
ｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏミクログリアと機能的類似性を共有した。ニューロンと共培養したｈＰＳＣ由来ミクログリア細胞がその突起を縮めたり延ばしたりしてその環境を調査して、ｉｎ ｖｉｖｏでの恒常性ミクログリアと同様に周囲のニューロンをサンプリングすることが観察された（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００５）；３０８， １３１４－１３１８）。酵母－抗原ザイモサンをチャレンジした場合、細胞は、アストロサイト対照と比較して、より効率的な食作用を行うことができた（Ｗａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｌｉａ Ｂｉｏｌ （２０１１）； ７， １－３）（図３５Ａ～３５Ｂ）。最後に、ミクログリア細胞の別の役割は、発生中の脳におけるシナプスを刈り込むことである（Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２００７）；１３１， １１６４－１１７８）。シナプスを形成した成熟ｈＰＳＣ由来ニューロン（Ｄ７０およびそれ以前（図３６Ａ～３６Ｂ））と共培養した場合、ミクログリア細胞は、共焦点イメージング時にシナプス材料含む封入体を示した（図２８Ｊ、パネルｉ）。ＲＦＰで標識された一般的な神経材料を含む封入体が存在したが、シナプス材料から特に構成される封入体の数は１～２％であった（図２８Ｊ、パネルｉｉ）。この数は、ホメオスタシス間の初代ミクログリア細胞に関して報告されたシナプス取り込みのベースレベルと一致した（Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ （２０１２）； ７４， ６９１－７０５）。
その主な対応物と一致する特性を有するほぼ純粋なミクログリアを分化の２１日以内に生成する能力は、ヒトアストロサイト（Ｔｃｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１９）； ３７， ２６７－２７５）および皮質ニューロン（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００９）； ２７， ２７５－２８０；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１７）； ３５， １５４－１６３）の同様に純粋な集団と組み合わせたヒトミクログリアから構成される機能的で完全にｈＰＳＣ由来のトリ培養プラットフォームを構築するための段階に設定した（図２９Ａ）。ｈＰＳＣ由来アストロサイトを近年記載されたとおりに生成し（Ｔｃｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１９）； ３７， ２６７－２７５）、全てがＡＱＰ４＋を発現するサブセットとともにＧＦＡＰ＋を発現した（図２９Ｂ）。同様に、純粋なｈＰＳＣ由来ニューロンを生成したここで開示される例は、ＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２の皮質層マーカーを発現する皮質ニューロンアイデンティティのものであり、終脳のマーカーであるＦＯＸＧ１が生成された（図２９Ｃおよび２９Ｄ）。トリ培養プラットフォームを確立するための各細胞タイプの最適な比率は、最初の播種で２：１：８と同定され、１ｃｍ２あたり５０，０００ミクログリア：２５，０００アストロサイト：２００，０００ニューロンであった。これらの条件は、アストロサイト数が増加するとミクログリア細胞の付着に干渉するために、アストロサイトの存在下で頑強なミクログリア細胞の付着および生存を可能にした（図３７Ａ）。ＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦの存在下での基礎培地培養条件を、補体Ｃ３産生に焦点を合せたベースライン炎症性サイトカインの産生を減少させるためにさらに最適化した（図３７Ｂ）。ＮＢ／ＢＡＧＣ（方法を参照のこと）条件は、非常に低いベースラインＣ３誘導をもたらし、ニューロンの優れた生存および維持を伴っていた（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１７）； ３５， １５４－１６３）。１週間後、トリ培養物は、分枝状のＩＢＡ１＋ミクログリア細胞およびＭＡＰ２＋皮質ニューロンと相互作用する多くのＧＦＡＰ＋アストロサイト突起を示した（図２９Ｅ）。トリ培養物は、任意のアポトーシスがほぼなく、ＣＣ３＋細胞は、３つの細胞タイプ全ての優れた生存が確認された（図２９Ｆおよび図３７Ｃ）。
トリ培養系はミクログリアとアストロサイトとニューロンとの間に神経炎症軸を再現することができるかどうかを試験するために、代理マーカーとしての補体Ｃ３の産生を測定した。最初に、Ｃ３分泌をさまざまな共培養条件下：ニューロンのみ（２００，０００細胞／ｃｍ２）、アストロサイトおよびニューロン（２５，０００＋２００，０００細胞／ｃｍ２）ミクログリアおよびニューロン（５０，０００＋２００，０００細胞／ｃｍ２）、およびトリ培養（５０，０００ミクログリア／ｃｍ２＋２５，０００アストロサイト／ｃｍ２＋２００，０００ニューロン／ｃｍ２）でＥＬＩＳＡによって評価した。ベースラインでは、Ｃ３は、ミクログリアを含む培養物のみに存在し、同時にＣ３レベルはアストロサイト／ニューロン共培養物中で極めて低く、ニューロンのみの培養物において検出されなかった。興味深いことに、トリ培養では、ベースラインＣ３レベルは、ミクログリア／ニューロンのみの培養におけるものよりも劇的に高く、ミクログリアとアストロサイトの両方の存在下で細胞のクロストークを介したＣ３分泌の増強を示唆していた（図２９Ｇ）。培養物を炎症性タンパク質リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激して、神経炎症状況を薬理学的にモデル化した後に、Ｃ３分泌を測定した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１２）； ３２， １１７０６－１１７１５）。ＬＰＳ処置後、Ｃ３のレベルは、ミクログリアを含む全ての培養物において増加したが、トリ培養条件下でもやはり大幅に増強された（図２９Ｇ）。そのような増強が、ミクログリア数の増加を単に反映し得る可能性を除外するために、ＩＢＡ＋細胞を、ハイコンテントイメージング顕微鏡を使用して、免疫蛍光によって定量化した。興味深いことに、ＩＢＡ１＋陽性細胞は、トリ培養物対ミクログリア／ニューロン共培養物中で実際に減少し、高いＣ３レベルの原因としてのミクログリア数の増加は除外された（図３８Ａおよび３８Ｂ）。ＬＰＳ刺激は、Ｃ３分泌を超えた炎症状況を誘導し、ＥＬＩＳＡによる古典的炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－６、ＴＮＦ、およびＩＬ－１０のレベルは増加した（図２９Ｈ）。
Ｃ３産生の完全な欠如を示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、Ｃ３ ＫＯｈＰＳＣ系統を生成した（図２９Ｉ）。この系統は、Ｃ３ ＫＯアストロサイトおよびＣ３ ＫＯミクログリアに分化し、Ｃ３ ＫＯアストロサイト、野生型ミクログリア、およびニューロン（Ｃ３ＫＯＡ）または野生型アストロサイト、Ｃ３ ＫＯミクログリア、およびニューロン（Ｃ３ＫＯＭ）を含むトリ培養物が生成された。％ＩＢＡ１／ＤＡＰＩによってスコア化されたミクログリアの数および％ＧＦＡＰ／ＤＡＰＩによってスコア化されたアストロサイトの数は、野生型トリ培養物、Ｃ３ＫＯＡ、およびＣ３ＫＯＭ培養物全体で類似していた（図３８Ｃ）。ベースラインでは、Ｃ３ＫＯＡ培養物は、ＷＴトリ培養物と比較してＣ３レベルの減少を示したが、ミクログリア／ニューロン培養物より高レベルであった（図２９Ｊ）。興味深いことに、Ｃ３ＫＯＭ培養物ではＣ３レベルは非常に低く、トリ培養物中でアストロサイトを効果的に誘導してＣ３を産生するために、ミクログリアはＣ３を発現するはずであることを示す（図２９Ｊ）。このミクログリアＣ３は、アストロサイトに直接作用するのかまたはミクログリアの自己分泌刺激を介して間接的に作用するのかはまだ判定されていない。ＬＰＳ刺激の後に相当する結果を得た。ＬＰＳで刺激されたＣ３ＫＯＡ培養物は、ＬＰＳで刺激されたＷＴ培養物よりも低いＣ３レベルを示すが、ＬＰＳで刺激されたミクログリア／ニューロンのみの培養物のものよりも高レベルである。ＬＰＳで刺激されたＣ３ＫＯＭ培養物は、非常に低いＣ３レベルを示す（図２９Ｊ）。これらのデータは、ベースライン時に両方とも存在し、神経炎症状況の薬理学的誘導時に悪化する炎症性ループにおける、ミクログリアとアストロサイトとの間の細胞クロストークを特徴付ける（図２９Ｋ）。このループでは、Ｃ３産生ミクログリアは、アストロサイトにシグナルを送ってＣ３を産生する開始細胞である。Ｃ３ＫＯＡ結果によって、アストロサイトがミクログリアを再誘導して、さらにＣ３を産生することが示される。
神経炎症軸の細胞構成成分を解き明かすここで開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏトリ培養系の能力を考慮して、このプラットフォームを疾患状況であるアルツハイマー病における神経炎症をモデル化するために適用した。ＡＰＰＳＷＥ＋／＋突然変異を含む、標的となる同系ヒトＥＳＣ系統を使用した（Ｐａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２０１６； ５３３， １２５－１２９）。分化ＡＤ－および同系対照ｈＰＳＣ由来ニューロンは、ＦＯＸＧ１およびＭＡＰ２発現ならびに皮質アイデンティティに関するＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によって実証された（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンは、アルツハイマー病のＡＰＰＳＷＥモデルの特徴であるアミロイド－ベータ産生の増加を示した（Ｐａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２０１６； ５３３， １２５－１２９）（図３０Ｃ）。成熟した８０日目のＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンまたは同系対照ニューロンを含む共培養物におけるＷＴ分化アストロサイト（ＧＦＡＰ＋）およびＷＴ分化ミクログリア（ＩＢＡ１＋）を播種して、トリ培養物を構築した（図３０Ｄ）。トリ培養の８日目に、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンを含むトリ培養物対同系対照ニューロンを含むものにおけるＣ３レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。興味深いことに、Ｃ３レベルは、同系対照由来のものと比較した場合、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物において高かった（図３０Ｅ）。Ｃ３は高レベルで産生されなかったか、またはＡＰＰＳＷＥ＋／＋アストロサイト／ニューロンおよびＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンのみの培養対同系対照アストロサイト／ニューロンおよびニューロンのみの培養で増加せず、ミクログリアが頑強なＣ３産生のために培養物中に存在しなくてはならないことを示す。
ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物において増加したＣ３の原料が、アストロサイトまたはミクログリアに起因するかどうか判定するために、Ｃ３ ＫＯ ｈＰＳＣからのミクログリアおよびアストロサイトを生成し、Ｃ３ ＫＯアストロサイト、野生型ミクログリア、およびＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンまたは同系対照ニューロン（Ｃ３ＫＯＡ）、または野生型アストロサイト、Ｃ３ ＫＯミクログリア、およびＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンまたは同系対照ニューロン（Ｃ３ＫＯＭ）を含むトリ培養物を作製した。注目すべきことには、Ｃ３ＫＯＡＡＤトリ培養物では、同系対照トリ培養物のものに相当する大幅に低下したＣ３レベルが観察された（図３０Ｆ）。しかし、Ｃ３ＫＯＡ ＡＤトリ培養物は、Ｃ３ＫＯＡ同系トリ培養物と比較して、増加したＣ３レベルをさらに示した。Ｃ３ＫＯＭ培養物では、Ｃ３産生のレベルは低く、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋トリ培養物においてＣ３発現を誘導するために、Ｃ３発現ミクログリアが存在しなければならない（図３０Ｆ）。
次に、Ｃ１Ｑ沈着レベルをウエスタンブロットによって評価した。Ｃ１Ｑは、Ｃ３の上流の補体タンパク質であり、補体Ｃ３の開裂産物と複合体を形成し、クリアランスのためにシナプス材料にタグ付けもする（Ｈｏｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５２， ７１２－７１６）。驚くべきことに、ＡＰＰＳＷＥ＋／＋培養物において認められるＣ１Ｑタンパク質は増加し、Ｃ１Ｑは、ミクログリアを含む培養物中にのみ存在した（図３０Ｇ）。Ｃ１Ｑは、ＡＤにおいてｉｎ ｖｉｖｏで蓄積することが示されており（Ｈｏｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５２， ７１２－７１６； Ａｆａｇｈ， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． （１９９６）； １３８， ２２－３２）、ここでは、ＡＤのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるこの表現型を再現した。Ｃ１Ｑレベルが、どちらもＡＰＰＳＷＥ＋／＋と同系対照培養物である、ミクログリア／ニューロン、Ｃ３ＫＯＡ、およびＣ３ＫＯＭの培養物と比較して、トリ培養物において低下したことが注目された（図３０Ｇ）。これは、高レベルのＣ３を含む培養物（トリ培養物）は、低レベルＣ３を含む培養物（ミクログリア／ニューロン、Ｃ３ＫＯＭ、Ｃ３ＫＯＡ）と比較して低レベルのＣ１Ｑを示したために、Ｃ３レベルとＣ１Ｑとの間にネガティブフィードバックが存在する可能性があることを示唆する、。しかし、この逆の関係に関する正確な機序は将来の研究で判定する必要がある。
ここで開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏトリ培養系からの結果に基づいて、補体Ｃ３に焦点を当てたアルツハイマー病における神経炎症への細胞が寄与するモデルを提案した（図３０Ｈ）。ＡＤにおけるＣ３レベルは、同系対照トリ培養物と比較して増加し、この増加は、ミクログリアによるアストロサイトのＣ３誘導ならびにアストロサイトによるミクログリアのＣ３再誘導に起因すると解釈することができる。結果によって、ミクログリアをもたらして、ミクログリアとアストロサイトとの両方の間の互いの相互作用を誘導するＡＰＰＳＷＥ＋／＋ニューロンが関与する炎症性ループが示される。さらに、ＡＤ培養物においてＣ１Ｑの沈着の増加はミクログリアの存在下のみで検出され、そのＣ３状況とは無関係であった。
ここで開示されるトリ培養系は、遺伝子操作による細胞のクロストークの分析を可能にし、ＬＰＳ刺激時およびＡＤモデルにおいて、トリ培養物中での補体Ｃ３産生の増加のメカニズムの研究を可能にする。近年の文献で老化の間に（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２０１５）； ３５， １３０２９－１３０４２）および神経変性障害、例えばＡＤにおいて（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． （２０１９）； ２８， ２１１１－２１２３；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ． （２０１８）； １４， １５８９－１６０１）増加し、Ｃ３は異常なシナプス刈り込みをもたらすことに関与する（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５２， ７１２－７１６； Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． （２０１７）； ９）ことが示唆されたためにＣ３に焦点が当てられた。しかし、この技術は、他の疾患関連神経炎症性標的経路を研究するために容易に適合さることができる。ヒトにおける神経炎症軸に寄与する鍵となる細胞プレーヤーの同定は、指向性の細胞タイプ特異的治療的戦略の開発を可能にするはずである。実際、ｈＰＳＣ由来トリ培養系は、アルツハイマー病または他の神経変性障害におけるミクログリアとアストロサイトとニューロンとの間のクロストークを特に標的とする、治療用化合物のスクリーニングするためのスケーラブルなプラットフォームの役割を果たすことができる。
材料および方法
ｈＰＳＣからのミクログリアの導出
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で維持されたｈＰＳＣを、アキュターゼによって解離して、単一細胞懸濁液を得た。６０，０００細胞／ｃｍ２を、マトリゲル－被覆プレート上のアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ３３８－ＡＣ）（７．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）（３μＭ）、およびＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）（１０μＭ）を含むＥ８培地中に播種した。１８時間後、培地を、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（４０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＷＰ－２（Ｓｅｌｌｅｃｋ）（２μＭ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地に交換した。２日目に、培地を、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（４０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＷＰ－２（２μＭ）、およびＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ）（２０ｎｇ／ｍＬ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地に交換した。３日目に、培養物をアキュターゼで解離し、６０，０００細胞／ｃｍ２で、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）（１５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）（１０μＭ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地中に再播種した。４日目に、ＲＯＣＫ阻害剤を除去し、培地を、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６に交換した。５および６日目に、培養物に、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－６（２０ｎｇ／ｍＬ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地を加えた。７および９日目に、培地を、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－３（３０ｎｇ／ｍＬ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６に交換した。１０日目に、懸濁液中の細胞を収集し、１）皮質ニューロンとＢ２７、Ｌ－グルタミン、およびＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、およびＩＬ－３４（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中で５日間共培養してミクログリアへ直接移行させるか、または２）１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、およびペニシリン／ストレプトアビジン、およびＩＬ－３４（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中で、細胞が付着し、細長くなるまで７～１１日間培養して、原始マクロファージに移行させた。無血清培養に関しては、１０日目の懸濁液中の細胞を採取し、Ｂ２７、Ｌ－グルタミン、およびＩＬ－３４（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を含む７５％ＩＭＤＭ、２５％Ｆ１２培地中で７～１１日間培養した。次いで移行したマクロファージを皮質ニューロンと、ＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦを添加して７日間共培養して、ミクログリア特異的マーカーを上方調節した。
皮質ニューロンプロトコール
ｈＰＳＣを、アキュターゼを用いて解離し、２００，０００細胞／ｃｍ２で、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）（１０μＭ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中のマトリゲル被覆プレート上に播種した。細胞を、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地で１２日間処置し、ＸＡＶ９３９（２μＭ）を分化の最初の４日間添加した。培養物に、Ｎ２培地およびＢ２７サプリメントを１：１０００でさらに１週間加えて、神経前駆細胞（ＮＰＣ）を発生させた。次いでＮＰＣを解離し、ポリオルニチン／フィブロネクチン／ラミニン被覆プレート上に再播種し、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、Ｌ－グルタミン、およびＢ２７サプリメント中で維持して、神経の分化および成熟を行った。
アストロサイトプロトコール
ｈＰＳＣを、Ｔｃｈｉｅｕらに従ってアストロサイトに分化させた。簡潔には、皮質神経幹細胞に、誘導性レンチウイルス構築物を介してＮＦＩＡを５日間パルスし、その後ＣＤ４４＋前駆体を選別し、再播種し、Ｎ２、ＨＢ－ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むアストロサイト誘導培地中で最低４週間維持した。
ＦＡＣＳ分析
細胞を、アキュターゼを用いて２０分間解離し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０μｇ／ｍＬ ＤＮＡｓｅ ＩおよびＮｏｒｍｏｃｉｎを含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞を洗浄し、抗体を含む選別緩衝剤中、暗所、氷上、４セルシウス度で３０分間インキュベートした。ゲーティングおよびその後の分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行った。
液滴ベースのｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリーの調製およびシークエンシング
４つの試料を調製して、ミクログリア分化の異なる日：分化の６日目の「６日目」、分化の１０日目の「１０日目」、分化の１０日目の懸濁液中の細胞のみを含む「１０日目懸濁液」、および１４日間ニューロンと培養された最終段階のミクログリア細胞を含む「ミクログリア」において、単一細胞シークエンシングを行った。「６日目」および「１０日目」の試料を、培養物を、アキュターゼを用いて２０分間処置することによって調製して、単一細胞懸濁液を得た。「１０日目懸濁液」を、４０μＭフィルターに通して懸濁液中の細胞を収集し、染色することによって調製して、単一細胞懸濁液を得た。「ミクログリア」は、ミクログリア－神経共培養物をＣＸ３ＣＲ１＋に関して選別することによって調製した。全ての試料を、ＦＡＣＳ緩衝液中に１０００細胞／μＬで再懸濁してから、シークエンシングを行った。単一細胞シークエンシングを、製造業者のプロトコールに従って、１０×ゲノミクスＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｌｉｂｒａｒｙ ＆ Ｇｅｌ ｂｅａｄ Ｋｉｔ Ｖ２を使用して行った。８，７００細胞の入力を、各１０×チャネルへ追加した。ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑデバイス上でシークエンスを決定した。
ｓｃＲＮＡｓｅｑデータのプレプロセッシング
ｓｃＲＮＡｓｅｑデータは、ＳｅＱＣプロセシングパイプラインを使用して処理した（Ａｚｉｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１８）； １７４， １２９３－１３０８）。ＳｅＱＣは、アラインメント、マルチマッピングリード分解能、細胞バーコードおよびＵＭＩ補正を読み取った後に、細胞×遺伝子カウントマトリックスを生成する。ＳＥＱＣには、１）１バーコード当たりの分子カウントの累積分布に基づいた推定上の空の液滴、２）ミトコンドリア由来の分子の２０％超に基づいた推定上のアポトーシス細胞、および（３）検出された分子が遺伝子の小サブセットにアラインされた場合に細胞として同定された低複雑性細胞の除去、を除去する最初のフィルタリングステップが含まれていた。ＳＥＱＣプロセシング後の１試料あたりの細胞数は：５２５３、４３２０、５５５５、および４９６１であった。ライブラリーサイズの中央値は、１細胞あたり１９、１９５、４０３９、１０、１２６および１６，７１６分子であった（６日目、ミクログリア、１０日目、１０日目の懸濁液でそれぞれ）。カウントは、各遺伝子分子カウントを細胞内で検出された分子の総数で割り、次いで１０，０００を掛けて元のカウントを１０，０００あたりの転写産物に変換することによってライブラリーサイズに対して正規化した。次いでデータを、自然対数および疑似カウント１を使用して対数変換した。Ｓｃａｎｐｙプラットフォーム（ｖ１．４）を使用して、データ分析を行った（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． （２０１８）； １９， １５）。
細胞フィルタリング
各試料に関しては、細胞を、ＰｈｅｎｏＧｒａｐｈクラスタリングアルゴリズムを使用してクラスター化した（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１５）； １６２， １８４－１９７）。検出された遺伝子の数が少なく（約２００）およびミトコンドリアＲＮＡ含有量が少ないかまたは全くない細胞のクラスターを、推定上の空の液滴として除去した。ミトコンドリアＲＮＡが多く、検出された遺伝子数が少ないクラスターを推定上の死滅細胞として除去した。ＭＥＳＰ１およびＰＤＧＦＲＡを低レベルで発現したがＫＤＲ、ＰＥＣＡＭ１、またはＣＤＨ５は発現しなかった２つの初期中胚葉クラスター、ならびにＮＫＸ２．５およびＩＳＬ１を発現する心臓系統に属する１つのクラスターを含む、造血分化に関連しない３つのクラスターを除去した。
最近傍グラフの構築
主要な構成成分を使用して、細胞間のユークリッド距離を計算した。適応ガウスカーネルを使用して、Ｈａｇｈｖｅｒｄｉらが記載しているように、細胞のｋ近傍法間のユークリッド距離を親和性に変換した（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２０１５）； ３１， ２９８９－２９９８）。ガウスカーネルを使用することによって、細胞間の親和性は、それらの距離とともに指数関数的に減少し、その結果、元のユークリッド距離と比較して近傍細胞との親和性が増加し、遠位の細胞に対する親和性が低下する。さらに、細胞に適合した幅のカーネルを使用することによって、データマニホールドの領域にわたる密度における差が考慮される。最近傍グラフを、力指向グラフレイアウトおよび拡散マップ埋め込みのベースとして使用した。
クラスタリングおよび力指向グラフレイアウト
６日目、１０日目、および１０日目懸濁液試料からのデータをプールして軌跡モデリングを行った。主要な構成成分分析をデータに対して行い、最初の２０個の主要な構成成分を選択してさらなる分析を行って、ｓｃＲＮＡｓｅｑにおける高度のドロップアウトに起因するノイズを減少させた（Ｓｔｅｇｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． （２０１５）；１６， １３３－１４５）。力指向グラフレイアウトを、上述のように構築されたデータの３０最近傍グラフに基づいて、Ｆｏｒｃｅアトラス２アルゴリズムを使用して計算した（Ｊａｃｏｍｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１４）； ９， ｅ９８６７４）。クラスタリングを、ＰｈｅｎｏＧｒａｐｈを用い、初期状態のパラメータ設定を使用して行った（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１５）；１６２， １８４－１９７）。
拡散マップ埋込
分化軌跡を表す低次元データマニホールドを近似させるために、拡散マップ埋込を、適応ガウスカーネルベースの最近傍グラフを使用して構築した（ｋ＝２０、上記）（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２０１５）； ３１， ２９８９－２９９８）。拡散マップの構築は、高次元観測に内在する低次元構造を再現するための非線形方法である。拡散マップの最初の４つの拡散構成成分を選択して軌跡モデリングを行った。その後、細胞間の拡散距離、すなわち「拡散マップ空間」内の細胞間のユーグリット距離を、Ｈａｇｈｖｅｒｄｉらが記載しているように、個々の細胞間の疑似時間距離に変換した（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１６）； １３， ８４５－８４８）。標準的な拡散マップ内の距離は、「親和性グラフ」のエッジに沿った長さ１のランダムマルコフ歩行と関連するが、マルチ規模空間内の拡散距離は、全ての長さのランダム歩行にわたって全般化され、その結果、細胞間の類似性および距離が良好にキャプチャされる（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１６）； １３， ８４５－８４８）。
軌跡特性評価
軌跡をさらに特徴付けるために、Ｐａｌａｎｔｉｒ（Ｓｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１９）； ３７， ４５１－４６０）を使用した。Ｐａｌａｎｔｉｒは、疑似時間距離を使用して、分化細胞のデータ内の軌跡のエンドポイントを同定し、細胞表現型におけるエントロピーをさらに測定して、その塑性および特定の細胞運命へのコミットメントを測定するツールである。Ｐａｌａｎｔｉｒ軌跡の入力近似開始細胞として、高ＣＤＨ５、高ＫＤＲ、および高ＰＥＣＡＭ１の造血内皮細胞クラスターからのランダム細胞を使用した。近傍数をｋ＝２０に設定し、拡散構成成分数を４に設定した。全ての他のパラメータに関しては、初期状態の設定を使用した。
疑似時間にわたる遺伝子傾向の計算
疑似時間にわたる個々の遺伝子の発現傾向を回収するために、ＭＡＧＩＣを使用して処理したカウントマトリクスを最初に代入した（ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２０１８）；１７４， ７１６－７２９）。ＭＡＧＩＣは、データ拡散を介して類似している細胞にわたり情報を共有することによって、細胞計数マトリクスのノイズを除去し、ドロップアウトに起因する０を満たすための方法である。ＭＡＧＩＣを近傍数ｋ＝４０、ランダム歩行長ｔ＝６、および初期状態のさらなる設定で実行した。代入したカウントマトリクスに基づいて、Ｓｅｔｔｙらが記載しているように一般化加法モデル（ＧＡＭ）を使用して遺伝子傾向を計算した。
分岐遺伝子モジュールの定義
他の全ての分岐および初期のクラスターと比較して、１つの分岐が上方制御された遺伝子のモジュールを同定するために、ＭＡＳＴを使用して、ｐＭＡＣクラスター（「ＰＭＡＣ１」、「ＰＭＡＣ２」）、赤血球クラスター（「ＥＡＲＬＹ ＥＲＹ」、「ＬＡＴＥ ＥＲＹ」）、巨核球クラスター（「ＭＫ」）および造血内皮細胞クラスター（「ＨＥ１」、「ＨＥ２」）間で差時限的発現分析を行った（Ｆｉｎａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． （２０１５）； １６， ２７８）。他の群とそれぞれ比較して、分岐モジュールのクラスターにおいて少なくとも０．２５のｌｏｇ２の倍率増加を有する遺伝子（ボンフェローニ補正ｐ値＜０．０５）が分岐モジュール中に含まれていた。
分岐遺伝子モジュールの初期および後期モジュールへの分割
各分岐に関しては、全ての分岐モジュール遺伝子の疑似時間にわたって遺伝子傾向を前述のように計算した。傾向は、軌跡の出発点から検討中のモジュール分岐の末端細胞までを計算した。各遺伝子の「活性化点」、すなわち遺伝子がその発現の増加を開始する疑似時間における点を同定するために、コンピューターで計算した遺伝子傾向を、０から１の間の発現の範囲に対して最初に正規化した。次いで、遺伝子傾向が、０．８の傾き（最初の導関数）を示した疑似時間における最初の点を計算し：これを活性化点と考えた。各遺伝子モジュールを「初期の遺伝子」（初期に活性化される遺伝子）および後期遺伝子に分割するために、Ｐａｌａｎｔｉｒによって同定されたように、細胞が出発分岐確率から０．０２５を超えて分枝する、疑似時間における最も早い瞬間（０から１の範囲）を特定した。この３分岐点で、細胞は３つの細胞運命のうちの１つに向けて分化するのを開始する。３分岐の前に少なくとも０．３疑似時間で活性化された遺伝子を、初期の遺伝子と考えた（すなわち骨髄性アームに関しては疑似時間＝０．４０）。全ての他の遺伝子を後期と考えた。
マウス遺伝子シグネチャーとの比較
ＥＭＰおよびｐＭａｃのすでに発表されているマウスシグネチャー（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１６）； ３５３）と比較するために、１対１のマウスヒトオルソログを有するシグネチャーマウス遺伝子名（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＢｉｏＭａｒｔｓ（Ｋｉｎｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｄａｔａｂａｓｅ （Ｏｘｆｏｒｄ） （２０１１））によって定義されたような）をヒト遺伝子名に翻訳した。全ての他の遺伝子を分析から除外した。さらにここで開示されるデータにおいて転写産物が検出されなかった遺伝子を除外した。シグネチャー遺伝子の疑似時間発現傾向を示すヒートマップ（図２７Ｄおよび図２８Ｉ）は、代入した発現値に基づいていた。代入した遺伝子発現を、０から１の間の範囲で各遺伝子に対して正規化した。最小の骨髄性分岐確率が０．１の全ての細胞がヒートマップ内に含まれていた。細胞を疑似時間の順で並べ、遺伝子を、重心クラスタリングを使用してクラスター化した。マクロファージ遺伝子シグネチャーに関しては、ミクログリア試料からの細胞を軌跡細胞に追加し、１．１の人工的疑似時間を得た。
単一細胞マウス胚形成アトラスへの統合
軌跡データを、マウス原腸陥入および初期器官形成の近年公開された単一細胞トランスクリプトミクスアトラスに統合するために（Ｐｉｊｕａｎ－Ｓａｌａ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （２０１９）；５６６， ４９０－４９５）、データセット内で血液－内皮系統として注釈が付けられた全ての細胞のデータを使用した（１５８７５個の細胞）。１対１のマウス－ヒトオルソログを含む遺伝子（前述のような）のみが分析に含まれていた。生物関連バイアスをさらに制限するために、遺伝子セットを、参照マウスデータにおいて高度に可変であった遺伝子に限定した。高度に可変な遺伝子をＳａｔｉｊａら（Ｓａｔｉｊａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１５）； ３３， ４９５－５０２）に記載されているように定義した。含まれる遺伝子の最終的な数は１，３５６個であった。さらなるバッチ補正を行うために、相互近傍法バッチ補正の高速実装（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１８）３６， ４２１－４２７）を使用した。ｆａｓｔＭＮＮ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｄｒｒ．ｉｏ／ｇｉｔｈｕｂ／ＬＴＬＡ／ｂａｔｃｈｅｌｏｒ／ｍａｎ／ｆａｓｔＭＮＮ．ｈｔｍｌ）は、遺伝子発現マトリクスの代わりに主要な構成成分マトリクスに対してバッチ補正を実行する。プールされたデータの最初の２０個の主要な構成成分を、バッチ補正のために使用した。バッチ補正は、同じ時点の範囲内からの試料間で最初に行い、その後時点間でバッチ補正を行った。ｆａｓｔＭＮＮに使用した試料の順序は：後期から初期のマウスデータ、次いでヒト１０日目および１０日目懸濁液試料（プールされた）、最後に６日目試料であった。力指向グラフレイアウトを前述のように計算した。マウスおよびヒトデータのクラスターのグラフを、ＰＡＧＡを使用して構築した（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． （２０１９）； ２０， ５９）。グラフの力指向レイアウトに関しては、重みが０．２またはそれを超えるグラフエッジのみを使用した（Ｊａｃｏｍｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１４）；９， ｅ９８６７９）。
免疫組織化学、生存／死滅アッセイ、およびハイコンテントイメージング
細胞を４％ＰＦＡ中、室温で１０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを用いて５分間透過処置し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０で５分間洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０中の５％ロバ血清を用いて３０分間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、試料と４度で一晩インキュベートした。二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８、５５５、および６４７）をブロッキング溶液で希釈し、試料と室温で４５分間インキュベートした。ＤＡＰＩ染色を使用して、細胞核を同定した。生存／死滅アッセイを、ＣＣ３を用いて行い、ｈＰＳＣ由来皮質ニューロンの対照を７０％メタノールと３０分間インキュベートした。ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓマイクロ共焦点ハイコンテントイメージングシステムを使用して、培養物中のミクログリア細胞数を定量化した（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００９）； ２７， ２７５－２８０）。フィールドを５×倍率で撮影して、９６ウェル培養ウェル全体をスキャンした。
シナプスタンパク質の貪食のイメージング
ミクログリアを、Ｄ７０＋ニューロンとｉｂｉｄｉ培養皿上で最大３０日間共培養し、ＰＳＤ９５およびＩＢＡ１を用いて画像染色した。培養物を、白色光レーザー技術および標準的なアルゴンレーザー（４５８、４７６、４８８、４９６および５１４ｎｍ）を備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡で４０×倍率で画像化した。データを処理し、Ｉｍａｒｉｓを用いて分析した：表面体積マスクがＩＢＡ１チャネルにおいて生成され、その中でＰＳＤ９５チャネルに関する別のマスクが生成されて、所与のＺスタックにおけるＰＳＤ９５封入体の体積／ＩＢＡ１の体積を判定した。
食作用アッセイおよび測量アッセイ
食作用アッセイに関しては、ミクログリア細胞またはアストロサイト対照を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とコンジュゲートしたザイモサンＡ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓと、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖｉｖａｖｉｅｗ蛍光インキュベーター顕微鏡中で５時間インキュベートした。測量アッセイに関しては、ミクログリア細胞を、ＧＦＰを発現するレンチウイルス構築物に感染させ、Ｄ５０皮質ニューロンと７日間共培養し、次いでＯｌｙｍｐｕｓ Ｖｉｖａｖｉｅｗ蛍光インキュベーター顕微鏡中で１６時間インキュベートした。タイムラプスイメージングを２分／フレームでコンパイルした。
ＲＮＡシークエンシング
３つの異なるｈＰＳＣ系統Ｈ１、Ｈ９、およびｉＰＳＣ系統ＳＡ２４１－１からの５０，０００～１００，０００個のｈＰＳＣ由来ミクログリアを、ＣＸ３ＣＲ１＋によって神経共培養物から選別した。ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ ＲＮＡマイクロＫｉｔを使用して抽出した。初代ヒトミクログリアからのＲＮＡを、年齢６０～７７歳の患者からの前頭葉および側頭葉から死後の組織を選別した後に得た。全ての試料をペアエンドＳＭＡＲＴＥＲシークエンシングおよび３０００万～４０００万リード用にＭＳＫＣＣ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅに提出した。分析は、ＭＳＫＣＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｒｅを介した標準的なパイプラインを用いて行った。
トリ培養系およびＬＰＳアッセイ
皮質ニューロンを、ポリオルニチン／フィブロネクチン／ラミニンで被覆したプレート上でｈＰＳＣから１５０，０００細胞／ｃｍ２で分化させ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、およびｃＡＭＰ（ＮＢ／ＢＡＧＣ）を含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ中で５０～７０日間成熟させた。ｈＰＳＣから分化したアストロサイトを、アキュターゼを用いて２０～３０分間解離し、次いでニューロンの上に２５，０００細胞／ｃｍ２で播種し、ＮＢ／ＢＡＧＣ中で４日間静置させた。次いで、ｈＰＳＣから分化したミクログリアを、アキュターゼを用いて１０分間解離し、次いでＩＬ－３４（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を含むＮＢ／ＢＡＧＣ中で、アストロサイト／ニューロン培養物上に５０，０００細胞／ｃｍ＾２で播種した。培地は、ＩＬ－３４およびＭ－ＣＳＦを新たに添加して１日おきに交換した。トリ培養物を最低７日間培養した後に、ＬＰＳを培養物に１μｇ／ｍＬで７２時間添加した。培養物培地を収集し、２０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、上澄みを、さらなる分析が行われるまで－８０セルシウス度で凍結した。
サイトカインＥＬＩＳＡ
培養上澄みを、ＦｌｅｘＭａｐ ３ＤシステムのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキットを使用してＣ３に関して分析した。＋／－ＬＰＳアッセイからの上澄みも、Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに発送して、ヒト高感度Ｔ細胞発見アレイ１４プレックスを使用した１４種類の炎症性サイトカインの多重分析を行った。
Ｃ３のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＫＯ
ＰＸ４５８ベクターをＨ１ｈＥＳＣにヌクレオフェクトした。細胞を、ＧＦＰ発現に基づいて選別し、ｃｌｏｎｅＲサプリメントを含むＥ８培地中で単一細胞クローンとして培養した。クローンを複製プレート上に取り出し、ゲノムＤＮＡを、Ｂｒａｄｌｅｙ Ｌｙｓｉｓ緩衝剤およびプロテイナーゼＫ処置を使用して抽出した。４５０ｂｐのＰＣＲ産物は、ｇＲＮＡ切断部位の周辺で増幅させた。次いでＰＣＲ産物を元のプラスミドにライゲーションし、クローンを、サンガーシークエンシングによってインデルに関してスクリーニングした。その後、インデルを有するクローンを取り出し、拡大し、核型を決定し、ミクログリアに分化させて、ＥＬＩＳＡによってＣ３タンパク質分泌の欠損に関するさらなる検証を行った。
ここで開示される主題の実施形態
前述の説明から、変更および修正を、ここで開示される主題に行って、さまざまな使用法および条件にそれを採用してもよいことは明白であろう。そのような実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書における可変の任意の定義における要素のリストの列挙は、リストされた要素の任意の単一のエレメントまたは組合せ（または下位組合せ）としてのその可変の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態としてのまたは任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせたその実施形態を含む。
本明細書において述べた全ての特許および刊行物は、各独立した特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示された場合と同程度に、参照によりここに組み込まれる。

Claims (59)

  1. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、
    ａ）幹細胞をウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と最大約２４時間接触させるステップ；
    ｂ）細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤および少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させて、分化細胞の集団を得るステップであって、前記分化細胞が、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞、少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ステップ；ならびに
    ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への前記分化細胞の分化を誘導するステップ
    を含む方法。
  2. ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への前記分化細胞の分化を誘導するステップが、前記分化細胞をニューロンと少なくとも約５日間、必要に応じて４日間培養するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ｃ）少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞への前記分化細胞の分化を誘導するステップが、前記分化細胞を少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと少なくとも約５日間接触させること；および前記細胞をニューロンと少なくとも約５日間培養する、必要に応じて前記細胞を前記ニューロンと少なくとも４日間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約２０時間、必要に応じて１８時間接触させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記細胞を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約１日から最大約５日間、必要に応じて少なくとも１日から最大４日間接触させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記細胞を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と少なくとも約２日間接触させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記細胞を、前記少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日から最大約１０日間、必要に応じて少なくとも３日から最大１１日間接触させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記細胞を、前記少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと７日、８日、９日、または１１日間接触させる、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞を、前記ニューロンと約５日間、必要に応じて４日または５日間培養する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記幹細胞を前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と接触させるステップが、少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーを発現する細胞を生成する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの中胚葉前駆体マーカーが、ブラキュリ、ＫＤＲ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記細胞を前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と接触させるステップが、少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーを発現する細胞を生成する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つの一次造血先駆体マーカーが、ＫＤＲ、ＣＤ２３５Ａ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記細胞を前記少なくとも１つの造血促進サイトカインと接触させるステップが、少なくとも１つの赤血球骨髄球系前駆体（ＥＭＰ）マーカーを発現する細胞をさらに生成する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記細胞を、前記少なくとも１つの造血促進サイトカインと少なくとも約１日から最大約５日または最大約１０日間接触させて、前記少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞を生成する、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つのＥＭＰマーカーが、Ｋｉｔ、ＣＤ４１、ＣＤ２３５Ａ、ＣＤ４３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つのＥＭＰマーカーを発現する細胞が、ＣＤ４５を発現しない、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つのプレマクロファージマーカーが、ＣＤ４５、ＣＳＦ１Ｒ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つのプレマクロファージマーカーを発現する細胞が、Ｋｉｔを発現しない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つのミクログリアマーカーが、ＣＸ３ＣＲ１、ＰＵ．１、ＣＤ４５、ＩＢＡ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＴＭＥＭ１１９、ＳＡＬＬ１、ＧＰＲ３４、Ｃ１ＱＡ、ＣＤ６８、ＣＤ４５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 少なくとも１つのマクロファージマーカーが、ＣＤ１１Ｂ、デクチン、ＣＤ１４、ＰＵ．１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ４５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ－１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、ＷＡＹ－３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４、ＤＣＡ、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤が、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＩＷＲ１、ペプチド（Ｎｉｌｅらのペプチド（Ｎｉｌｅ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１８ Ｊｕｎ；１４（６）：５８２－５９０））、ポーキュパイン阻害剤、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＥＴＣ－１５９、Ａｎｔ１．４Ｂｒ／Ａｎｔ１．４Ｃｌ、ニクロサミド、アピクラレン、バフィロマイシン、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ピルビニウム、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ジアミノ－キナゾリン、ケルセチン、ＩＣＧ－００１、ＰＫＦ１１５－５８４、ＢＣ２０５９、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤がＩＷＰ２である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記少なくとも１つの造血促進サイトカインが、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、インターロイキン、ＴＰＯ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記インターロイキンが、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＦＧＦが、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインが、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記細胞を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子と約１μＭから約６μＭの間の濃度で接触させる、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤と約１μＭから約１０μＭの間の濃度で接触させる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記細胞を、前記少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記細胞を、前記少なくとも１つの造血促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約４００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記細胞を、前記少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインと約１ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で接触させる、請求項３から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団であって、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法による幹細胞に由来する細胞集団。
  37. 請求項３６に記載の細胞集団を含む組成物。
  38. 幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
    （ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの阻害剤；
    （ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子；
    （ｃ）少なくとも１つの造血促進サイトカイン；および
    （ｄ）ニューロン
    を含むキット。
  39. （ｅ）少なくとも１つのマクロファージ促進サイトカインをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
  40. 幹細胞を少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現する細胞にする分化を誘導するための説明書をさらに含む、請求項３８または３９に記載のキット。
  41. ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、前記集団に含まれる前記細胞の少なくとも約５０％が少なくとも１つのミクログリアマーカーを発現し、前記集団に含まれる前記細胞の約２５％未満が、幹細胞マーカー、中胚葉前駆体マーカー、一次造血先駆体マーカー、ＥＭＰマーカー、プレマクロファージマーカー、マクロファージマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する組成物。
  42. 対象における神経変性疾患を予防および／または処置する方法であって、以下：
    （ａ）請求項３６に記載の分化ミクログリア細胞の集団；
    （ｂ）請求項３７に記載の組成物；および
    （ｃ）請求項４１に記載の組成物
    のうちの１つを対象に投与するステップを含む方法。
  43. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項４２に記載の方法。
  44. 神経変性疾患を予防および／または処置する方法であって、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）を対象に投与するステップを含む方法。
  45. 前記ＣＳＦが、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３４からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＣＳＦがＧＭ－ＣＳＦである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 神経変性疾患の予防および／または処置における使用のためのＣＳＦ。
  49. 神経変性疾患を予防および／または処置するための医薬を製造するためのＣＳＦの使用。
  50. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項４９に記載の使用。
  51. 神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）請求項３４に記載の分化ミクログリア細胞の集団を被検化合物と接触させるステップであって、前記ミクログリア細胞が、前記神経変性疾患を有する対象から得られた幹細胞に由来する、ステップ；および
    （ｂ）前記ミクログリア細胞の機能的活性を測定するステップを含み、
    前記ミクログリア細胞の前記機能的活性における変化が、前記被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す方法。
  52. 前記変化が減少または増加である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ミクログリア細胞の前記機能的活性が補体Ｃ３の放出を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記ミクログリア細胞から放出された前記補体Ｃ３における減少が、前記治療用化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ミクログリア細胞の前記機能的活性が、前記ミクログリア細胞によるアミロイド－ベータ食作用を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  56. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 神経変性疾患を処置するための治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、
    （ａ）被検化合物を請求項３４に記載の分化ミクログリア細胞、アストロサイトの集団、およびニューロンの集団を含む組成物と接触させるステップ；ならびに
    （ｂ）前記ニューロンの神経毒性を測定するステップを含み、
    前記被検化合物と接触させた後の前記ニューロンの前記神経毒性における減少が、前記被検化合物が神経変性疾患を処置することができる可能性が高いことを示す方法。
  58. 前記神経変性疾患がＡＬＳ疾患である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ミクログリア細胞が、ニューロンに対する神経毒性を誘導する反応性アストロサイトを誘導する、請求項５７または５８に記載の方法。

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IL (1) IL281871A (ja)
WO (1) WO2020069515A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024071375A1 (ja) * 2022-09-30 2024-04-04 富士フイルム株式会社 ヒトアストロサイト細胞集団、細胞集団培養物、ヒトアストロサイト細胞集団の製造方法、および被験物質の評価方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019347876A1 (en) * 2018-09-28 2021-05-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Stem cell-derived human microglial cells, methods of making and methods of use
KR20210077634A (ko) * 2019-12-17 2021-06-25 코아스템(주) 인간 만능 줄기세포로부터 3d 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법
US20240309322A1 (en) * 2021-07-06 2024-09-19 Keio University Microglial progenitor cells, method for manufacturing microglia, and manufactured microglial progenitor cells and microglia
JP2024533351A (ja) * 2021-09-10 2024-09-12 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド 人工多能性幹細胞由来細胞の組成物及びその使用方法
WO2023215455A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 University Of Rochester Dual macroglial-microglial approach towards therapeutic cell replacement in neurodegenerative and neuropsychiatric disease
CN115908243B (zh) * 2022-09-23 2023-08-18 江西博钦纳米材料有限公司 一种无损检测图像的分割方法、装置、设备及存储介质
WO2024137677A1 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 FUJIFILM Holdings America Corporation Extracellular vesicle-enriched secretome composition derived from induced pluripotent stem cell derived-microglia and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018503375A (ja) * 2015-01-16 2018-02-08 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 多能性幹細胞のマクロファージへの分化

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2126045A4 (en) * 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
US9132168B2 (en) * 2008-08-05 2015-09-15 University Of South Florida Methods of treating cognitive impairment
EP2424977B1 (en) * 2009-04-28 2013-06-12 Life & Brain GmbH Microglial precursor cells for the treatment of malignant neoplasms of the central nervous system
CN103732240B (zh) * 2011-07-25 2015-12-09 健能隆医药技术（上海）有限公司 G-csf二聚体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用
TWI493034B (zh) * 2011-12-14 2015-07-21 Nat Univ Chung Hsing Neuronal epithelial cells differentiated by universal stem cells and the medium used and their differentiation methods
MX2015017103A (es) * 2013-06-11 2016-11-07 Harvard College Celulas beta derivadas de células madre ( sc-beta ) y composiciones y métodos para generarlas.
US10081792B2 (en) * 2014-12-31 2018-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Derivation of human microglia from pluripotent stem cells
US11136548B2 (en) * 2015-06-24 2021-10-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods
WO2017152081A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 New York Stem Cell Foundation, Inc. Microglia derived from pluripotent stem cells and methods of making and using the same
US20200239844A1 (en) * 2017-02-28 2020-07-30 The Regents Of The University Of California Differentiation and use of human microglia-like cells from pluripotent stem cells and hematopoietic progenitors
AU2019347876A1 (en) * 2018-09-28 2021-05-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Stem cell-derived human microglial cells, methods of making and methods of use
CN113924362A (zh) * 2019-03-29 2022-01-11 新加坡科技研究局 小胶质细胞充足的脑类器官

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018503375A (ja) * 2015-01-16 2018-02-08 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 多能性幹細胞のマクロファージへの分化

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAZUYUKI TAKATA; ET AL: "INDUCED-PLURIPOTENT-STEM-CELL-DERIVED PRIMITIVE MACROPHAGES PROVIDE A PLATFORM FOR 以下備考", IMMUNITY, vol. VOL:47, NR:1, JPN5021013389, 18 July 2017 (2017-07-18), pages 183 - 198, ISSN: 0005142075 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024071375A1 (ja) * 2022-09-30 2024-04-04 富士フイルム株式会社 ヒトアストロサイト細胞集団、細胞集団培養物、ヒトアストロサイト細胞集団の製造方法、および被験物質の評価方法

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