JP5784296B2 - 神経細胞の製造方法及び神経細胞分化促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、胚様体から神経細胞を製造する方法に関する。また、本発明は前記製造方法に用いうる神経細胞分化促進剤に関する。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、生体に存在する様々な細胞に分化する能力（分化多能性）を有した状態で長期にわたり継代培養することができるという性質をもつ。したがって、細胞移植が有効な治療方法として期待される白血病、パーキンソン病等の治療にこれらの幹細胞を用いることが期待されている。

多能性幹細胞を用いた細胞移植療法においては、多能性幹細胞を目的とする細胞又はその前駆細胞に分化誘導した上で移植する必要がある。例えば、パーキンソン病の治療にあたっては、多能性幹細胞を神経細胞又はその前駆細胞へと分化誘導し、これを患者に移植することになる。これまで多能性幹細胞の分化誘導には、主に遺伝子導入や遺伝子改変といった分子生物学的手法が報告されているが（例えば、非特許文献１）、分化誘導された細胞の安全性が懸念され、実用化には至っていない。また、上記分子生物学的手法は熟練した技術と高価な試薬類を要する一方、多能性幹細胞の分化誘導速度は比較的緩やかである。

Ｐｌｏｓ ＯＮＥ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９ Ｖｏｌ．４ Ｉｓｓｕｅ １２ ｅ８２６２

本発明者らは、従来の遺伝子導入や遺伝子改変手法を用いずに、薬剤を用いて多能性幹細胞の分化誘導を行うことができれば、より簡便にしかも安価に分化誘導ができ、治療上の安全性にも優れた実用性の高い細胞を創出できると考えた。
本発明は、薬剤を用いて多能性幹細胞を神経細胞へと迅速に分化させることを含む、安全性に優れた神経細胞を製造する方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、多能性幹細胞を安全性に優れた神経細胞へと迅速に分化誘導しうる薬剤を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来する胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢ）と硫酸化阻害物質とを接触させると、該胚様体を神経細胞へと迅速に分化誘導できることを見い出した。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。

本発明の課題は下記の手段により達成された。
［１］胚様体と塩素酸塩とを接触させ、該胚様体中における糖鎖の硫酸化を抑制して該胚様体の神経細胞への分化を促進することを含む神経細胞の製造方法であって、
さらに胚様体とレチノイン酸とを接触させる工程を含む、製造方法。
［２］塩素酸塩を含有する培地で胚様体を培養することにより胚様体と塩素酸塩とを接触させる、［１］に記載の製造方法。
［３］胚様体が哺乳類のＥＳ細胞又は哺乳類の人工多能性幹細胞に由来する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］塩素酸塩及びレチノイン酸を有効成分として含有する神経細胞分化促進剤。

本発明の製造方法によれば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に由来する胚様体から神経細胞を簡便に、しかも迅速に得ることができる。また、本発明の神経細胞分化促進剤は、硫酸化阻害物質を有効成分とするものであり、遺伝子のように細胞内に組み込まれて細胞分裂と共に複製される性質のものではない。したがって、細胞から神経細胞分化促進剤を容易に取り除くことができ、安全性の高い神経細胞の提供することができる。

塩素酸ナトリウムとの接触から１日経過後（ＥＢ形成から３日後）のｍＥＳＣ由来のＥＢにおけるＨＳ及びＣＳの硫酸化度合の変化をＦＡＣＳにより分析した結果を示す図である。図１中、ａは塩素酸ナトリウムと接触させていないＥＢのＦＡＣＳ分析結果を示し、ｂは塩素酸ナトリウムと接触させたＥＢのＦＡＣＳ分析結果を示す。ａ及びｂ以外のプロットは一次抗体としてＩｇＭアイソタイプコントロールを用いたときの結果である。 ｍＥＳＣ由来のＥＢにおいて、中胚葉分化のマーカー遺伝子であるＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄ、並びに外胚葉分化のマーカーであるＰａｘ６及びＭａｓｈ１のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。縦軸はβアクチンのｍＲＮＡに対する相対量を示し、単位は［１０００／βアクチンのｍＲＮＡ量］である。横軸の１〜６の数字は、１：ＥＢ形成から０日後のＥＢ、２：ＥＢ形成から２日後のＥＢ、３：塩素酸ナトリウムと接触させていないＥＢ形成から３日後のＥＢ、４：塩素酸ナトリウムと接触させたＥＢ形成から３日後のＥＢ、５：塩素酸ナトリウムと接触させていないＥＢ形成から４日後のＥＢ、６：塩素酸ナトリウムと接触させたＥＢ形成から４日後のＥＢ、を示す。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｍＥＳＣ由来のＥＢにおいて、神経細胞分化のマーカー遺伝子であるＮｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、ＮｅｕｒｏＤ１及びＮｅｕｒｏＤ２のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。縦軸は塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢにおける各遺伝子のｍＲＮＡ量を１としたときの相対値を示す。グラフ中の各遺伝子のｍＲＮＡ量を示す３つの棒は、左から順に、塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ、レチノイン酸のみと接触させたＥＢ、塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方と接触させたＥＢ、を示す。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｈｉＰＳＣ由来のＥＢにおいて、神経細胞分化のマーカー遺伝子であるＮｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、Ｓｏｘ１及びＮＣＡＭ１並びに未分化細胞のマーカーであるＯｃｔ３／４のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示すグラフである。縦軸はＥＢ形成後０日目における各遺伝子のｍＲＮＡ量を１としたときの相対値を示す。グラフ中の各遺伝子のｍＲＮＡ量を示す４つの棒は、左から順に、ＥＢ形成後０日目のＥＢ、塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ形成から５日後のＥＢ、レチノイン酸のみと接触させたＥＢ形成から５日後のＥＢ、塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方と接触させたＥＢ形成から５日後のＥＢ、を示す。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｍＥＳＣ由来のＥＢにおいて、抗βIII−チューブリン抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。図５中、ａは塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ、ｂはレチノイン酸のみに接触させたＥＢ、ｃは塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方と接触させたＥＢ、を示す。写真中の白い繊維状のものがβIII−チューブリンである。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｈｉＰＳＣ由来のＥＢにおいて、抗βIII−チューブリン抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す顕微鏡写真である。図６中、ａは塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ、ｂはレチノイン酸のみに接触させたＥＢ、ｃは塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方と接触させたＥＢ、を示す。写真中の白い繊維状のものがβIII−チューブリンである。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｍＥＳＣ由来のＥＢにおいて、抗βIII−チューブリン抗体を用いて免疫ブロットを行った結果を示す図である。縦軸は、βアクチンに対するβIII−チューブリンの相対量（βIII−チューブリンの量／βアクチンの量）を示す。横軸の１〜３の番号は、１：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ、２：レチノイン酸のみに接触させたＥＢ、３：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方に接触させたＥＢ、を示す。 塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｈｉＰＳＣ由来のＥＢにおいて、抗βIII−チューブリン抗体を用いて免疫ブロットを行った結果を示す図である。縦軸は、βアクチンに対するβIII−チューブリンの相対量（βIII−チューブリンの量／βアクチンの量）を示す。横軸の１〜３の番号は、１：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ、２：レチノイン酸のみに接触させたＥＢ、３：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方に接触させたＥＢ、の結果を示す。 塩素酸ナトリウムとの接触から１日後（ＥＢ形成から３日後）及び塩素酸ナトリウムとの接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）のｍＥＳＣ由来のＥＢについて、βカテニンとｐ−Ｓｍａｄ１のタンパク質量を免疫ブロットで解析した結果を示す図である。グラフの縦軸は、ラミンＢ１に対するβカテニンの相対量、及びβアクチンに対するｐ−Ｓｍａｄ１の相対量を表わす。横軸の番号１〜５は、１：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ形成から３日後のＥＢ、２：塩素酸ナトリウムに接触させたＥＢ形成から３日後のＥＢ、３：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸のいずれにも接触させていないＥＢ形成から５日後のＥＢ、４：レチノイン酸のみに接触させたＥＢ形成から５日後のＥＢ、５：塩素酸ナトリウムとレチノイン酸の双方に接触させたＥＢ形成から５日後のＥＢ、の結果を示す。

以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
［本発明の製造方法］
本発明に用いる胚様体とは、多能性幹細胞を浮遊培養したときに形成されうる初期胚に似た構造をもつ球状の細胞塊である。本発明に用いる胚様体を形成する多能性幹細胞の種類に特に制限はないが、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であることが好ましい。前記多能性幹細胞は三胚葉性動物に由来する限り特に制限はない。例えば、哺乳類、鳥類等に由来する多能性幹細胞を用いることができるが、哺乳類に由来する多能性幹細胞を好適に用いることができる。前記哺乳類としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
上記多能性幹細胞は、通常の方法で調製することができる。また、寄託機関等に寄託されているセルライン等の分譲により得ることもできる。

本発明に用いる胚様体は通常の方法で調製することができる。例えば、マウスＥＳ細胞であれば、細胞吸着能の低い培養皿で、ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）無しのＥＳＣ培地等で浮遊培養することで得ることができる。また、ヒトｉＰＳ細胞であれば、細胞吸着能の低い培養皿で、ｂＦＧＦ無しのｉＰＳｅｌｌｏｎ培地等で浮遊培養することで得ることができる。これらの具体的な培養方法は後述の実施例で詳述する。
胚様体を形成させるための温度、ＣＯ_２濃度等は通常の条件を採用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で多能性幹細胞から胚様体を形成させることができる。
本発明に用いる胚様体の調製方法に特に制限はなく、胚様体を形成しうる方法であればいずれの方法で調製したものを用いてもよい。

本発明に用いる硫酸化阻害物質とは、細胞に取り込まれて細胞内で少なくとも糖鎖の硫酸化を抑制しうる物質である。本発明において「糖鎖の硫酸化を抑制する」とは、糖鎖の硫酸化を完全に阻害することの他、糖鎖の硫酸化を部分的に阻害することも含む概念である。「糖鎖の硫酸化を部分的に阻害する」とは、糖鎖に硫酸基が結合してはいるが、通常よりも硫酸基の数が少ない状態にすることをいう。本発明に用いる硫酸化阻害物質により、例えば、細胞膜や細胞内に存在するヘパラン硫酸（ＨＳ）やコンドロイチン硫酸（ＣＳ）といった硫酸化グリカンの硫酸基の数が減少しうる。
本発明に用いる硫酸化阻害物質は、細胞内において糖鎖の硫酸化を阻害する作用を有すれば特に制限はないが、塩素酸塩を好適に用いることができる。塩素酸塩の種類に特に制限はなく、例えば、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、塩素酸リチウム、塩素酸アンモニウム、塩素酸カルシウム等が挙げられる。本発明に用いる硫酸化阻害物質は、通常の方法で合成して得ることもできるし、市販品を用いてもよい。

本発明において、胚様体と硫酸化阻害物質とを接触させる方法に特に制限はない。硫酸化阻害物質を含む培地で胚様体を培養することで、胚様体と硫酸化阻害物質とを容易に接触させることができる。該培地は液体培地であることが好ましい。胚様体が生存できる環境であれば、培地の種類に特に制限はなく、例えば、マウスＥＳ細胞由来の胚様体であれば上記のＬＩＦ無しのＥＳＣ培地等を、ヒトｉＰＳ細胞由来の胚様体であれば上記のｂＦＧＦ無しのｉＰＳｅｌｌｏｎ培地等を好適に用いることができる。
胚様体と硫酸化阻害物質との接触の開始時期は、迅速に分化誘導を促進する観点から、胚様体の形成後０〜５日後であることが好ましく、０〜４日後であることがより好ましく、０〜３日後であることがさらに好ましく、１〜２日後であることがさらに好ましく、２日後であることが特に好ましい。
胚様体と硫酸化阻害物質との接触時間に特に制限はないが、硫酸化阻害物質が細胞内に取り込まれて生理作用を発揮するために、少なくとも１日間接触させることが好ましく、１〜５日間接触させることがより好ましく、１〜４日間接触させることがさらに好ましく、１〜３日間接触させることがさらに好ましく、２〜３日間接触させることが特に好ましい。
胚様体に接触させる硫酸化阻害物質の量に特に制限はないが、硫酸化阻害物質を含む培地で胚様体を培養する場合には、培地中の硫酸化阻害物質の濃度が０．１〜５００ｍＭであることが好ましく、１〜５００ｍＭであることがより好ましく、１〜３００ｍＭであることがさらに好ましく、１〜２００ｍＭであることがさらに好ましく、１０〜１００ｍＭであることが特に好ましい。

胚様体を神経細胞へと効率的に分化誘導するために、さらに胚様体とレチノイン酸とを接触させることが好ましい。レチノイン酸は従来から多能性幹細胞の神経細胞への分化誘導に用いられている物質である。胚様体とレチノイン酸とを接触させる方法に特に制限はないが、レチノイン酸を含む培地で胚様体を培養することで、胚様体とレチノイン酸とを容易に接触させることができる。該培地は液体培地であることが好ましい。胚様体が生存できる環境であれば、培地の種類に特に制限はなく、例えば、マウスＥＳ細胞由来の胚様体であれば上記のＬＩＦ無しのＥＳＣ培地等を、ヒトｉＰＳ細胞由来の胚様体であれば上記のｂＦＧＦ無しのｉＰＳｅｌｌｏｎ培地等を好適に用いることができる。胚様体とレチノイン酸との接触の開始時期は、胚様体と硫酸化阻害物質との接触を開始する前であっても後であってもよく、胚様体と硫酸化阻害物質との接触の開始と同時に胚様体とレチノイン酸との接触を開始させてもよい。胚様体とレチノイン酸との接触の開始時期は、胚様体の形成後０〜５日後であることが好ましく、１〜５日後であることがより好ましく、１〜４日後であることがさらに好ましく、２〜４日後であることがさらに好ましく、３〜４日後であることが特に好ましい。
胚様体とレチノイン酸との接触時間に特に制限はないが、レチノイン酸が細胞内に取り込まれて生理作用を発揮するために、少なくとも５時間接触させることが好ましく、５〜７２時間接触させることがより好ましく、１２〜４８時間接触させることがさらに好ましく、２０〜３０時間接触させることが特に好ましい。
胚様体に接触させるレチノイン酸の量に特に制限はないが、レチノイン酸を含む培地で胚様体を培養する場合には、培地中のレチノイン酸の濃度が０．１〜１０μＭであることが好ましく、０．５〜５μＭであることがより好ましく、０．５〜２μＭであることがさらに好ましい。
レチノイン酸は、生理機能を発揮させるために通常はトランス体（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）が用いられる。

胚様体は硫酸化阻害物質及び／又はレチノイン酸の存在下で神経細胞への分化誘導を継続させてもよいが、通常には、上記の好ましい接触時間硫酸化阻害物質及び／又はレチノイン酸と接触させた後、硫酸化阻害部物質及び／又はレチノイン酸との接触を終了させる。
胚様体と硫酸化阻害物質及び／又は胚様体とレチノイン酸との接触を終了するには、胚様体の培養環境中から硫酸化阻害物質やレチノイン酸を取り除けばよい。例えば、胚様体を硫酸化阻害物質やレチノイン酸を含まない培地に移して培養することで、胚様体と硫酸化阻害物質及び／又は胚様体とレチノイン酸との接触を終了させることができる。
胚様体は、硫酸化阻害物質やレチノイン酸との接触を終了させた後も、適当な培養条件で培養することで神経細胞へと分化が進む。当該培養に使用する培地に特に制限はないが、例えば、Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２等が挙げられる。また、培地は定期的に交換することが好ましい。

胚様体を培養する温度、ＣＯ_２濃度等は通常の条件を採用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養することができる。

胚様体の分化には、Ｗｎｔ、ＢＭＰ及びＦＧＦ等を介したシグナル伝達が関与していることが知られており、Ｗｎｔ及びＢＭＰは神経細胞への分化を阻害し、中胚葉への分化を促すことも示唆されてきている（例えば、Ｐｌｏｓ ＯＮＥ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９ Ｖｏｌ．４ Ｉｓｓｕｅ １２ ｅ８２６２参照）。また、上記シグナル伝達には細胞膜に存在する硫酸化グリカンが関与しうることも報告されてきている。
本発明に用いる硫酸化阻害物質は、細胞内で糖鎖の硫酸化を阻害する作用を有する。したがって、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸等の細胞膜及び／又は細胞内に存在する硫酸化グリカンの硫酸基の数を減少させ、これによりＷｎｔ及びＢＭＰのシグナル伝達を阻害し、胚葉体の神経細胞への分化を促進すると考えられる。
これまで、糖鎖の硫酸化に関与する特定の遺伝子の働きを抑制することで、胚様体の神経細胞への分化を誘導したことの報告はあるが（Ｐｌｏｓ ＯＮＥ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９ Ｖｏｌ．４ Ｉｓｓｕｅ １２ ｅ８２６２参照）、胚葉体と硫酸化阻害物質とを接触させるだけで、胚様体の神経細胞への分化誘導に成功した例は知られていない。
本発明により、これまでにない簡便な手法で、しかも迅速に胚様体を神経細胞へと迅速に分化させて神経細胞を得ることが可能になる。また、本発明に用いる硫酸化阻害物質は、培地から該硫酸化阻害物質を除去することで分化した神経細胞から該硫酸化阻害物質を取り除くことができる。したがって、本発明の方法に分化誘導された神経細胞は安全性に優れ、細胞移植療法等への実用化が期待される。
なお、本発明において「神経細胞」には神経細胞及び神経細胞の前駆細胞の双方が含まれる。

［本発明の神経細胞分化促進剤］
本発明の神経細胞分化促進剤は、胚様体の神経細胞への分化を促進するための薬剤であり、有効成分として上記の硫酸化阻害物質を含有する。本発明の神経細胞分化促進剤は、上述の本発明の製造方法における硫酸化阻害物質の供給源として用いることができる。すなわち、本発明の神経細胞分化促進剤と、多能性幹細胞を浮遊培養して得られうる上記胚様体とを接触させることで、該胚様体細胞を神経細胞へと迅速に分化させることができる。

本発明の神経細胞分化促進剤は、硫酸化阻害物質の他にレチノイン酸を含有していてもよい。レチノイン酸は、生理機能を発揮させるために通常はオールトランス体である。また、本発明の神経細胞分化促進剤はさらに栄養素、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤、乳化剤等の他の成分を含有していてもよい。

本発明の神経細胞分化促進剤の剤形に特に制限はなく、各成分が溶解又は分散した液状であっても良いし、粉末状であっても良い。また、タブレット等の錠剤の形状であってもよい。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限りこれらに限定されるものではない。

［セルラインの維持］
マウスＥＳ細胞（ｍＥＳＣ）として、Ｒ１セルライン（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）８４２４−８４２８に記載、自然科学研究機構 生理学研究所 分子神経生理研究部門 より供与）及びＥ１４ＴＧ２ａセルライン（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１（１９８７）１−９に記載、東京大学大学院理学系研究科より供与）を使用した。各々の細胞を、１０００Ｕ／ｍＬの濃度でＬＩＦ（ケミコン社製）を加えたＥＳＣ培地（１５質量％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１質量％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社製）及び０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加したＤＭＥＭ）中において、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシン Ｃ（シグマ社製）で不活化したマウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ）上で維持した。

また、ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）として、ＭＲＣ−ｈｉＰＳ＿Ｆｅｔｃｈ（細胞番号：ＮＩＨＳ０６０４）及びＭＲＣ−ｈｉＰＳ＿Ｔｉｃ（細胞番号：ＪＣＲＢ１３３１）（いずれもＥｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１５（２００９）２７２７−２７４０に記載、国立生育医療センターから入手）を使用した。各々の細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの濃度でｂＦＧＦ（和光純薬社製）を加えたｉＰＳｅｌｌｏｎ（Ｃｅｌｌ−Ｓｉｇｈｔ社製）中において、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシン Ｃ（シグマ社製）で不活化したＭＥＦｓ上で維持した。

［胚様体の形成］
上記ｍＥＳＣ及びｈｉＰＳＣをＬｏｗ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ６０ｍｍ ｄｉｓｈｅｓ（Ｎｕｎｃ社製）に移し、ｍＥＳＣについてはＬＩＦを含まない上記のＥＳＣ培地で、ｈｉＰＳＣについてはｂＦＧＦを含まないｉＰＳｅｌｌｏｎでそれぞれ浮遊培養することで胚様体（ＥＢ）を形成させた。なお、ｈｉＰＳＣは、ＥＢ形成前にゼラチンコートされたディッシュに移してフィーダー細胞を除去した。
本発明においては、上記の浮遊培養の開始した時点をＥＢ形成時とする。したがって、例えば、「ＥＢ形成から１日後」とは、多能性幹細胞について上記の浮遊培養を開始してから１日後を意味する。

［胚様体の神経細胞への分化誘導］
ＥＢ形成から２日後に、培地中の最終濃度が５０ｍＭとなるように、硫酸化阻害物質としての塩素酸ナトリウム（シグマ社製）を添加した。さらにその２日後（ＥＢ形成から４日後）、培地中の最終濃度が１μＭとなるようにオールトランス−レチノイン酸（以下、ＲＡと呼ぶことがある。シグマ社製）を添加した。ＲＡを添加してから１日経過後（ＥＢ形成から５日後）、ＥＢをＰＤＬ／ｌａｍｉｎｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ６０ｍｍ ｄｉｓｈｅｓ（ベクトンディッキンソン社製）に移し、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２中で培養した。この操作により培養液中から硫酸化阻害物質とＲＡが除かれた。

［ＦＡＣＳ分析］
ｍＥＳＣであるＲ１セルライン由来のＥＢにおいて、硫酸化阻害物質の添加によるグリカンの硫酸化度合の変化を調べるために、抗ＨＳ抗体又は抗ＣＳ抗体（いずれもマウス由来ＩｇＭ）をプライマリー抗体として用いたＦＡＣＳ分析を行った。上記抗ＨＳ抗体としては１０Ｅ４又はＨｅｐＳＳ−１（いずれも商品名、生化学工業社製）を用い、上記抗ＣＳ抗体としては２Ｈ６（商品名、生化学工業社製）を用いた。また、上記抗体にかえてマウスＩｇＭアイソタイプ（ケミコン社製）を用いたケースをコントロールとした。具体的な実験方法は以下のとおりである。
硫酸化阻害物質との接触から１日経過後（ＥＢ形成から３日後）の細胞塊をＥＤＴＡで処理した後、この細胞懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５質量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１質量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液）で希釈した上記プライマリー抗体溶液中でインキュベートした。洗浄後、細胞懸濁液を上記ＦＡＣＳ緩衝液で希釈したＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＭ抗体（シグマ社製）溶液中でインキュベートした。洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用いてＦＡＣＳ分析を行った。
結果を図１に示す。

ＨＳ及びＣＳは細胞の分化に重要な役割を担う硫酸化グリカンであり、ｍＥＳＣではＥＢ形成後少なくとも８日目まで発現することが知られている。図１に結果から、培地に硫酸化阻害物質を加えたＥＢ（図１中のａ）では、硫酸化阻害物質を加えていないＥＢ（図１中のｂ）と比較して抗ＨＳ抗体及び抗ＣＳ抗体の結合量が少なく（蛍光強度が小さく）なっており、糖鎖に結合した硫酸基の量が減少していることがわかる。図１の結果は、ＥＢと硫酸化阻害物質の接触後わずか１日で糖鎖の硫酸化が顕著に抑制されたことを示している。

［リアルタイムＰＣＲ分析］
ｍＥＳＣであるＲ１セルライン由来のＥＢにおいて、硫酸化阻害物質がＥＢの外胚様（神経細胞）への分化を誘導することを、特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを指標にして調べた。具体的には、中胚葉分化のマーカーであるＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄ、並びに外胚葉分化のマーカーであるＭａｓｈ１及びＰａｘ６の各遺伝子について、それらのｍＲＮＡの発現量をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いたリアルタイムＰＣＲにより定量した。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２００８）の第３５９７頁右欄第３行目〜１５行目に記載の方法に基づき、下記の塩基配列のプライマーセットとプローブとを用いて定量を行った。
プライマーセット プローブ
Ｔ ： 配列番号１及び配列番号２ 配列番号３１
Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ ： 配列番号３及び配列番号４ 配列番号３２
Ｍａｓｈ１ ： 配列番号５及び配列番号６ 配列番号３３
Ｐａｘ６ ： 配列番号７及び配列番号８ 配列番号３４
βアクチン ：配列番号１９及び配列番号２０ 配列番号４０
なお、プローブは５’末端をレポーター色素の３ＦＡＭ、３’末端をクエンチャー色素のＴＡＭＲＡで標識されたものをアプライドバイオシステム社から購入した。
結果を図２に示す。

図２の結果から、硫酸化阻害物質と接触させたＥＢでは、硫酸化阻害物質と接触していないＥＢに比べて中胚葉マーカーであるＴ及びＧｏｏｓｅｃｏｉｄのｍＲＮＡレベルが抑制されている一方、外胚葉マーカーであるＭａｓｈ１及びＰａｘ６のｍＲＮＡレベルは顕著に増加していることがわかる（図２中、横軸の番号３と４との比較、及び番号５と６との比較）。上記各遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化は、ＥＢと硫酸化阻害物質との接触後わずか１日で生じており（横軸の番号３と４の比較）、硫酸化阻害物質の分化誘導作用が極めて迅速であることを示している。

同様に、ｍＥＳＣであるＲ１セルライン由来のＥＢにおいて、硫酸化阻害物質がＥＢの神経細胞への分化を誘導していることを、硫酸化阻害物質との接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）の細胞を用いて調べた。具体的には、神経細胞分化のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、ＮｅｕｒｏＤ１及びＮｅｕｒｏＤ２の各遺伝子について、それらのｍＲＮＡの発現量を、下記の塩基配列のプライマーセットとプローブとを用いて上記と同様にリアルタイムＰＣＲにより調べた。
プライマーセット プローブ
Ｎｅｓｔｉｎ ： 配列番号９及び配列番号１０ 配列番号３５
Ｍｕｓａｓｈｉ−１：配列番号１１及び配列番号１２ 配列番号３６
Ｍａｓｈ１ ： 配列番号５及び配列番号６ 配列番号３３
Ｍａｔｈ１ ：配列番号１３及び配列番号１４ 配列番号３７
ＮｅｕｒｏＤ１ ：配列番号１５及び配列番号１６ 配列番号３８
ＮｅｕｒｏＤ２ ：配列番号１７及び配列番号１８ 配列番号３９
なお、プローブは５’末端をレポーター色素の３ＦＡＭ、３’末端をクエンチャー色素のＴＡＭＲＡで標識されたものをアプライドバイオシステム社から購入した。
結果を図３に示す。

図３の結果から、硫酸化阻害物質と接触させたＥＢでは、硫酸化阻害物質と接触していないＥＢに比べて、硫酸化阻害物質を添加して３日後（ＥＢ形成から５日後）のＥＢにおいて、神経細胞分化のマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルが顕著に増加していることがわかった。

続いて、ｈｉＰＳＣであるＦｅｔｃｈ及びＴｉｃ由来のＥＢについても上記と同様に、硫酸化阻害物質との接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）の細胞について、神経細胞分化のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ＮＣＡＭ１及びＳｏｘ１、並びに非分化細胞のマーカーであるＯｃｔ３／４の各遺伝子のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲにより調べた。なお、ｈｉＰＳＣ由来ＥＢのリアルタイムＰＣＲ分析には、プローブを用いずに、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ（ロシュ社製）を用いた定量分析を行った。用いたプライマーセットの塩基配列は下記のとおりである。
プライマーセット
Ｎｅｓｔｉｎ ： 配列番号２１及び配列番号２２
Ｍｕｓａｓｈｉ−１ ： 配列番号２３及び配列番号２４
Ｓｏｘ１ ： 配列番号２５及び配列番号２６
ＮＣＡＭ１ ： 配列番号２７及び配列番号２８
Ｏｃｔ３／４ ： 配列番号２９及び配列番号３０
結果を図４に示す。

図４の結果から、硫酸化阻害物質と接触させたＥＢでは、硫酸化阻害物質と接触していないＥＢに比べて、神経細胞分化のマーカー遺伝子の発現量が顕著に増加していることがわかった。すなわち、硫酸化阻害物質は、ｈｉＰＳＣ由来のＥＢに対しても優れた神経細胞分化誘導能を示すことがわかる。

［免疫染色分析]
上述のように硫酸化阻害物質と接触させたＥＢについて、硫酸化阻害物質との接触から３日後（ＥＢ形成から５日後）に、ＰＬＬ／ラミニンコートしたガラスチャンバースライド（Ｉｗａｋｉ社製）上に移して培養し、その２日後の細胞について神経細胞への分化を免疫染色により分析した。具体的には、上記ガラスチャンバースライド上の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、０．１％サポニンで透過性とした。これを洗浄後ブロッキング処理を行い、抗βIII−チューブリン抗体（マウスＩｇＧ、ケミコン社製）を反応させた。さらにこれを洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコン社製）を反応させ、続いてプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で対比染色を行った。ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて免疫蛍光画像を得た。ｍＥＳＣ細胞（Ｒ１セルライン）由来のＥＢから分化した細胞の結果を図５に、ｈｉＰＳＣ（Ｆｅｔｃｈ及びＴｉｃ）から分化した細胞の結果を図６に示す。

図５及び図６の結果から、硫酸化阻害物質と接触させたＥＢから分化した細胞において、神経細胞分化の指標となるβIII−チューブリンの量がタンパク質レベルで著しく増加していることがわかる（すなわち、ＥＢが神経細胞へと構造的に大きく変化していることがわかる。）。この構造的な変化は、ＥＢをＰＬＬ／ラミニンコートしたガラスチャンバースライド（Ｉｗａｋｉ社製）上に移してわずか２日後（ＥＢ形成から７日後）で観察されることから、硫酸化阻害物質とＥＢとを接触させることによるＥＢの神経細胞への構造的変化は極めて迅速であるといえる。
なお、Ｐｌｏｓ ＯＮＥ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９ Ｖｏｌ．４ Ｉｓｓｕｅ １２ ｅ８２６２には、硫酸化に関与する遺伝子をノックアウトして胚様体を神経細胞へと分化させたことが記載されている。それによれば、ＥＢ形成から１４日後の細胞でも、上記図５及び図６に示される量と同程度かそれ以下の量のβIII−チューブリンの発現が確認できるに過ぎない。

［免疫ブロット分析］
上記免疫染色分析で確認したβIII−チューブリンの発現量の増加をより定量的に測定するために、免疫ブロットを実施した。上記のようにＰＬＬ／ラミニンコートしたガラスチャンバースライド（Ｉｗａｋｉ社製）上に移して２日経過した細胞を溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭＮ_３ＶＯ_４、１０ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビター（シグマ社製）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）で溶解した。この細胞溶解液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）にトランスファーした。このメンブレンをブロッキング後、プライマリー抗体として上記の抗βIII−チューブリン抗体（マウスＩｇＧ、ケミコン社製）を、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）をそれぞれ反応させた。洗浄後、メンブレン上のペルオキシダーゼをＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて発色させた。なお、抗βアクチン抗体（シグマ社製）をβIII−チューブリンの発現量の変化を分析するためのコントロール抗体として用いた。結果を図７及び図８に示す。

図７及び図８の結果から、硫酸化阻害物質と接触したＥＢでは、ｍＥＳＣ由来のものでβIII−チューブリン量が約１０倍にも上昇しており、ｈｉＰＳＣ由来のものでもβIII−チューブリン量が２倍以上に上昇していることがわかった。なお、図７及び８のグラフは、免疫ブロットのバンド強度をＮＩＨｉｍａｇｅで測定した結果である。

続いて、細胞の中胚葉分化への関与が報告されているＷｎｔシグナル及びＢＭＰシグナルに係わるタンパク質の発現量についても免疫ブロットにより分析した。
硫酸化阻害物質との接触から１日経過後（ＥＢ形成から３日後）及び３日経過後（ＥＢ形成から５日後）のＲ１由来細胞を上記溶解緩衝液で溶解して細胞溶解液を調製した。また、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２００８）の第３５９６頁右欄第３行目〜１８行目に記載の方法に沿って核抽出液を調製した。上記細胞溶解液はＢＭＰシグナル伝達経路の下流で働くリン酸化Ｓｍａｄ１（ｐ−Ｓｍａｄ１）の発現量の分析に用い、上記核抽出液はＷｉｎｔシグナル伝達経路において、核内で標的遺伝子の発現を促進する役割を果たすβ−カテニンの発現量の分析に用いた。
細胞溶解液又は核抽出液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）にトランスファーし、このメンブレンをブロッキング処理後、プライマリー抗体である抗ｐ−Ｓｍａｄ１抗体（Ｓｅｒ４６３／４６５、ウサギＩｇＧ、セルシグナリングテクノロジー社製）又は抗βカテニン抗体（ウサギＩｇＧ、セルシグナリングテクノロジー社製）を反応させ、続いて２次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）と反応させた。なお、細胞溶解液については抗βアクチン抗体（マウスＩｇＧ、シグマ社製）を、核抽出液については抗ラミンＢ_１抗体（マウスＩｇＧ、Ｚｙｍｅｄ社製）を、それぞれｐ−Ｓｍａｄ１及びβカテニンの発現量の変化を分析するためのコントロール抗体として用いた（この場合、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた）。洗浄後、メンブレン上のペルオキシダーゼをＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて発色させた。結果を図９に示す。

図９の結果から、ＥＢと硫酸化阻害物質とを接触させることで、βカテニン及びｐ−Ｓｍａｄ１のいずれの発現量も減少していることがわかる。この結果は、硫酸化阻害物質により、ＥＢを中胚葉分化へと導くＷｉｎｔシグナル伝達やＢＭＰシグナル伝達が抑制され、その結果、ＥＢの神経細胞への分化が促進されていることを示唆するものである。

なお、上記の実験結果のうち、ｍＥＳＣのＲ１セルラインを用いた実験結果は、別のｍＥＳＣのセルラインであるＥ１４ＴＧ２ａでも再現することを確認した。

Claims (4)

1. 胚様体と塩素酸塩とを接触させ、該胚様体中における糖鎖の硫酸化を抑制して該胚様体の神経細胞への分化を促進することを含む神経細胞の製造方法であって、
   さらに胚様体とレチノイン酸とを接触させる工程を含む、製造方法。
2. 塩素酸塩を含有する培地で胚様体を培養することにより胚様体と塩素酸塩とを接触させる、請求項１に記載の製造方法。
3. 胚様体が哺乳類のＥＳ細胞又は哺乳類の人工多能性幹細胞に由来する、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 塩素酸塩及びレチノイン酸を有効成分として含有する神経細胞分化促進剤。